Метод. указания к Лаб. раб. 040501

Министерство образования и науки РФ
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Новгородский государственный университет имени Ярослава Мудрого»
Институт сельского хозяйства и природных ресурсов
___________________________________________________________
Кафедра биологии и биологической химии
ХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ
ПРОЦЕССОВ
Дисциплина для направления
04.05.01 – Фундаментальная и прикладная химия
Методические указания к лабораторным работам
РАЗРАБОТАЛ:
Профессор кафедры ББХ
_______ Н. Н. Севостьянова
«____»__________ 2015 г.
Принято на заседании КББХ
Протокол № _____________
зав. кафедрой ББХ
__________Н. Н. Максимюк
«____»___________ 2015 г.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1
Тема: «Природа и свойства ферментов. Активаторы и ингибиторы ферментов»
Цель: Уметь применять знания о свойствах ферментов и их структуре, специфичности,
влиянии на активность ферментов рН, температуры, концентрации, активаторов и
ингибиторов; для последующего изучения основных реакций метаболизма в клетках
организма.
1. Влияние неспецифических факторов на активность ферментов
Действие неспецифических факторов изучается на ферменте сахаразе, которая
катализирует гидролитическое расщепление сахарозы с образованием глюкозы и
фруктозы.
Принцип метода:
CH2OH
H
CH2OH
OH
OH
CH2OH
O
H
O
H2O
CH2OH
OH
OH
HO
H
OH H
Сахароза
OH
CH2OH
O
F
H OH
H
HO
H
H
H
H
OH
OH
HO
HO
CH2OH
OH H
Глюкоза
F-сахараза
H
Фруктоза
Активность фермента сахаразы оценивают по наличию в среде продуктов реакции:
свободной глюкозы и фруктозы. Свободная глюкоза дает положительную реакцию
Троммера вследствие наличия в молекуле глюкозы свободного полуацетального
гидроксила. Сахароза этой реакции не дает, т. к. полуацетальный гидроксил в ней
отсутствует.
Ход работы: В 4 пробирки наливают по 0,5 мл дрожжевого экстракта, содержащего
фермент сахаразу. Одну пробирку нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин.,
во вторую добавляют 2 капли 10% р-ра NaOH, в третью - 2 капли 1% СdС12, четвертую
используют для определения активности нативного фермента (контроль). Через 5 минут
во все пробирки добавляют по 1 мл р-ра сахарозы (субстрат) и выдерживают их в
термостате при 38° С 15 минут. После этого присутствие свободной глюкозы выявляется
во всех пробирках с помощью реакции Троммера: к пробе добавляют 5 капель 10% NaOH
и 1 каплю 1% CUSO4. Пробу нагревают на водяной бане в течение 2-5 мин.
Положительную реакцию отмечают по появлению красно-бурого осадка закиси меди
(Си2О). В этой окислительно-восстановительной реакции медь восстановилась, а глюкоза
окислилась до глюконовой кислоты.
№ пробы
Фермент
сахараза, 0,5
мл
Воздействие неспецифических
факторов
100 С
1-я
2-я
3-я
4-я (контр.)
+
+
+
+
+
-
10 %
NaOH
+
-
Субстрат
сахароза
1 мл
1 % CdCl2
+
-
+
+
+
+
Результат
реакции
Троммера (+)
или (-)
2. Влияние температуры на активность ферментов
О степени расщепления крахмала амилазой слюны судят по его реакции с раствором
йода. При оптимальных условиях расщепление крахмала произойдет полностью, и
реакция на крахмал с йодом будет отрицательная (желтая), но по мере изменения условий
расщепление крахмала произойдет только частично, до стадии декстринов, которые дадут
с йодом красно-бурую или фиолетовую окраску, или же крахмал совсем не будет
расщепляться, и реакция с йодом будет положительной (синее окрашивание).
Ход работы:
1) Наливают в 4 пробирки по 0,5 мл раствора крахмала. Еще в 4 пробирки наливают по
0,5 мл слюны (разбавленной в 10 раз).
2) Берут первую пару пробирок (одна с ферментом, другая – с крахмалом) и помещают
в баню со льдом. Вторую пару оставляют при комнатной температуре. Третью пару
пробирок помещают в термостат (40° С), а четвертую – в кипящую баню.
3) Через 10 минут содержимое каждой пары пробирок сливают вместе, тщательно
перемешивают и оставляют стоять еще 10 мин. В тех же условиях.
4) Из третьей пробирки отбирают 3 капли жидкости и проделывают реакцию с каплей
йода на стекле. Если появляется синее окрашивание, растворы оставляют стоять
еще 10 мин. и после этого повторяют реакцию с йодом на стекле. Затем добавляют
2 капли раствора йода во все пробирки и наблюдают за появлением окрашивания.
Результаты работы:
№ пробирки
Температура инкубации,
ºС
1
2
3
4
0
20
40
100
Окрашивание с йодом
Вывод:
3. Влияние реакции среды на активность ферментов и определение оптимума
рН для амилазы слюны
Для разных ферментов существует свой оптимум рН в кислой, щелочной и
нейтральной среде, при которой фермент наиболее активен. Например, для ферментов
желудочного сока (пепсина) оптимум рН 1,5 - 2,5, для фермента печени (аргиназы)
оптимум рН 9,5 и т.д. Для амилазы слюны оптимум рН 6,8; в кислой и щелочной среде
активность амилазы снижается. Оптимум рН для амилазы слюны можно определить при
взаимодействии ее с крахмалом при различных значениях рН среды.
Ход работы: Слюну предварительно разводят в 100 раз. Берут 6 пробирок и в каждую из
них наливают по 2 мл буферного раствора с различным значением рН: 6,0; 6,4; 6,8; 7,2;
7,6; 8,0. Затем приливают по 1мл 0,5% раствора крахмала и по 1 мл разведенной слюны (в
зависимости от активности слюны ее можно разводить не в 100, а в 50 раз).
Перемешивают содержимое пробирок и помещают их в термостат при температуре
38° С на 10 минут. Затем во все пробирки приливают по 1 капле раствора йода,
перемешивают, наблюдают окраску и отмечают рН (оптимум рН), при котором амилаза
действует наиболее активно. Целесообразно в каждую пробирку добавить немного воды,
перемешать и окраска будет более наглядной.
Результаты работы:
№ пробы
РН
Окрашивание с
йодом
1
2
3
4
5
6
Вывод:
4. Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы слюны
Активаторы стимулируют действие ферментов, но в отличие от коферментов не
принимают участия в реакции.
Ход работы: В 3 пробирки наливают по 1 мл слюны, разведенной в 40 раз. В зависимости
от активности слюны ее можно разводить в 10, 20, 30, 40, 50 раз. В первую пробирку
добавляют 2 капли воды, во вторую - 2 капли 1% раствора NaCl, в третью - 2 капли 1%
раствора CUSO4 . После этого в каждую пробирку добавляют по 10 капель крахмала.
Пробирки ставят в термостат с температурой 37°С на 5 минут. Затем во все пробирки
добавляют по одной капле раствора йода, перемешивают, наблюдают окраску и
определяют, в какой пробирке действует активатор или ингибитор. Можно в каждую
пробирку добавить воды (примерно 2 мл) и перемешать (окраска будет нагляднее).
Результаты работы:
№ пробы
Окрашивание с йодом
Вывод:
1. H2O
2. NaCl
3. CuSO4
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2
Тема: «Количественное определение витамина С в различных овощах и
фруктах»
Биологическая роль аскорбиновой кислоты в организме многообразна. Она
принимает участие в окислительно – восстаноновительных процессах и связана с
системой глютатиона. Аскорбиновая кислота участвует в синтезе стероидных гормонов в
коре надпочечников и катехоламинов в мозговом слое надпочечников и необходима для
процесса гидроксилирования как кофактор для проявления действия ферментов
гидроксилаз, например дофамингидроксилаза и др. Она участвует в образовании
тетрагидрофолиевой кислоты из фолиевой кислоты, в гидроксилировании лизина в
оксилизин, пролина в оксипролин, необходимых для образования коллагеновых волокон;
ускоряет всасывание железа, активизирует фермент желудочного сока пепсиноген, что
особенно важно при недостатке соляной кислоты в желудочном соке.
Ход работы: отвешивают 1 г продукта на роговых весах, растирают в ступке со
стеклянным порошком, добавляют 2 мл 10% раствора хлористоводородной кислоты,
приливают 8 мл воды и фильтруют. Отмеривают для титрования 2 мл фильтрата,
добавляют 10 капель 10% раствора соляной кислоты и титруют 2,6 –
дихлорфенолиндофенолом до розовой окраски, сохраняющейся в течение 30 сек в двух
повторностях. Вычисляют среднее содержание аскорбиновой кислоты в 100 г продукта по
формуле.
0.0088  A  Г 100

БВ
где
Х – содержание аскорбиновой кислоты в мг на 100 г продукта;
0,0088 – содержание аскорбиновой кислоты, мг;
А – результат титрования 0,0001Н раствором 2,6 – дихлорфенолиндофенола, мл;
Б – объем экстракта, взятый для титрования, мл;
В – количество продукта, взятое для анализа, г;
Г – общее количество экстракта, мл;
100 – пересчет на 100 г продукта.
В 100 г капусты содержится аскорбиновой кислоты 25 – 60 мг, в 100 г шиповника 500 –
1500 мг, а в хвое 200 – 400 мг.
Вывод: сравнить количество аскорбиновой кислоты в исследованных продуктах.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3
Тема: «Тканевое дыхание и окислительное фосфорилирование»
Цель:
1) Изучить реакции, лежащие в основе окисления субстратов, состав и
последовательность ферментов дыхательной цепи;
2) Усвоить понятие окислительное фосфорилирование,
3) Усвоить понятие разобщение окисления и фосфорилирования,
4) Убедиться, что энергетическая эффективность окисления зависит от субстрата
окисления.
Приготовление тканевого гомогената
2 г ткани тщательно измельчить, хорошо растереть в ступке, добавив щепотку
стеклянного порошка, добавить постепенно 20 мл дистиллированной воды, отфильтровать
через марлю, отжать. Содержимое марли перенести в пробирку и суспендировать
стеклянной палочкой с 8 мл воды. 2 мл полученного гомогената перелить в другую
пробирку и прокипятить. Охладить и использовать содержимое пробирок для опытов № 1,
№ 2, № 3, № 4.
1. Изучение активности сукцинатдегидрогеназы
Принцип метода: Сукцинатдегидрогеназа окисляет янтарную кислоту. Конечным
акцептором ионов водорода служит 2,6 дихлорфенолиндофенол (2,6 ДХФИ). Если
фермент активен, окраска исчезает.
Схема постановки опыта:
Содержимое пробирки
Янтарная кислота 1%, мл
2,6 ДХФИ 0,1%
Н2О, мл
Суспензия митохондрий, мл
Прокипяченная суспензия митохондрий, мл
Окраска реакционной смеси
Продукты реакции
Образец 1
1,0
2-4 капли
0,5
1,0
-
Образец 2
1,0
2-4 капли
0,5
1,0
Инкубация при комнатной температуре 10 минут.
2. Изучение активности малатдегидрогеназы
Принцип метода: Малатдегидрогеназа окисляет яблочную кислоту. В качестве конечного
акцептора атомов водорода используется 2,6 ДХФИ. Если фермент активен, то окраска
ослабевает.
Схема постановки опыта.
Содержимое пробирки
Буферный раствор рН = 7,4. мл
Раствор яблочной кислоты, мл
Раствор ДХФИ
Суспензия митохондрий, мл
Прокипяченная суспензия митохондрий, мл
Окраска реакционной смеси
Продукты реакции
Контроль
1,0
0,5
2-4 капли
0,5
Опыт
1,0
0,5
2-4 капли
0,5
-
Инкубация при комнатной температуре 10 минут:
Вывод: Написать уравнения реакций. По результатам исследования действия
сукцинатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы оценить, какое количество молей АТФ
будет синтезироваться при окислении янтарной кислоты и при окислении яблочной
кислоты в ЦПЭ.
3. Изучение активности цитохромоксидазы мышц
Принцип метода: Цитохромоксидаза окисляет диметилпарафенилендиамин и ά-нафтол
(реактив НАДИ). При окислении образуется цветной продукт -индофеноловый голубой.
Акцептором ионов водорода служит кислород.
Схема постановки опыта: опыт выполняется на фильтровальной бумаге
Реактив
Реактив НАДИ, мл
Суспензия
митохондрий
(подсушенная
между листками фильтровальной бумаги),
мл
Прокипяченная суспензия (подсушенная
между листками фильтровальной бумаги),
мл
Окраска реакционной смеси
Продукты реакции
Контроль
1-2 капли
Опыт
1-2 капли
-
0,5
0,5
-
Инкубация при комнатной температуре 5-10 минут.
Вывод: сравнить активность цитохромоксидазы в нативных MX и прокипяченных MX.
4. Исследование окислительного фосфорилирования в митохондриях
Принцип метода: В процессе окисления различных субстратах в дыхательной цепи
освобождается энергия. Часть этой энергии используется для этерификации
неорганического фосфата в процессе окислительного фосфорилирования:
АДФ + Фн = АТФ.
О процессе окислительного фосфорилирования судят по убыли Фн в исследуемой
среде.
Определение неорганического фосфата основано на способности молибдата
аммония в кислой среде присоединять фосфорную кислоту с образованием фосфата
аммония, который посте восстановления дает продукты, окрашенные в синий цвет
(молибденовая синь). Интенсивность молибденовой окраски пропорциональна
содержанию фосфора в исследуемом объекте.
Схема постановки опыта:
Содержимое пробирки
Инкубационная смесь, мл
Физиологический раствор,
мл
1,0
1
1,0
№ пробирки
2
1,0
3
1,0
0,5
-
-
-
Контроль
Р-р винной кислоты, мл
Р-р янтарной кислоты, мл
Р-р аскорбиновой кислоты +
цитохром С, мл
Суспензия митохондрий, мл
-
0,5
-
0,5
-
-
-
-
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
1,0
1,0
0,5
0,5
Инкубация 10 минут при комнатной температуре
Р-р трихлоруксусной кислоты ТХУ,
мл
1,0
1,0
Отфильтровать через влажный фильтр
Р-р молибдата аммония, мл
0,5
0,5
Результаты (окраска):
Вывод: объяснить энергетическое значение (кол-во молей АТФ синтезированных в ЦПЭ)
при окислении различных субстратов и при полном ингибировании процесса в
присутствии ТХУ кислоты.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 4
Тема: «Определение глюкозы в биологических жидкостях глюкозооксидазным
способом»
Цель: Определить содержание глюкозы в сыворотке крови глюкозооксидазным методом.
Принцип метода: Определение
глюкозооксидазой:
глюкозы
основано
на
реакции,
катализируемой
глюкозооксидаза
Глюкоза +O2−−−−−−−−−−−→ глюколактон + H2О2
Образующаяся в ходе данной реакции перекись водорода вызывает окисление
субстратов пероксидазы с образованием окрашенного продукта.
Ход работы: В 2 пробирки вносят по 2 мл рабочего реактива (фосфатный буфер,
субстраты пероксидазы + глюкозооксидазы в отношении 40:1). В одну из пробирок вносят
0,05 мл стандартного раствора глюкозы концентрации 10 ммоль/л. В другую - 0,05 мл
сыворотки крови. Растворы встряхивают и инкубируют при комнатной температуре 20
минут.
После инкубации измеряют оптическую плотность растворов на ФЭК при длине
волны X =490 нм. Кювета с длиной оптического пути, равной L = 5 мм. Раствор сравнения
- рабочий реактив.
Расчет концентрации глюкозы:
С
Ео
10 ммоль / л
Ест
где Ео - оптическая плотность в образцах сыворотки;
Ест - оптическая плотность стандартного раствора глюкозы.
Вывод:
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 5
Тема: «Определение общего холестерина в сыворотке крови»
Цель: научиться определять содержание
фотоэлектроколориметрическим методом.
холестерина
в
сыворотке
крови
Предостережение
Все пробирки, пипетки, кюветы должны быть сухими. Рабочий реагент
представляет собой смесь концентрированных кислот.
Схема постановки опыта
Сыворотка, мл
Калибратор, мл
Вода, мл
Рабочий реагент, мл
Опытная проба
0,02
2,0
Калибратор
0,02
2,0
Контроль
0,02
2,0
Перемешать реактивы и инкубировать 20 мин при температуре 20-25 °С.
Измерить оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной
пробы в кювете с толщиной поглощающего слоя 5 мм при длине волны 500 нм (зеленый
светофильтр).
Расчет. Содержание холестерина в сыворотке крови рассчитывается по формуле:
С = (Е опытн.пробы : Е калибратора) ∙ 5,17 (ммоль/л),
где С - концентрация холестерина в исследуемом образце (ммоль/л),
Е опытной пробы - оптическая плотность исследуемого образца,
Е калибратора - оптическая плотность калибратора,
5,17 ммоль/л - содержание общего холестерина в калибраторе.
Результаты анализа:
Выводы:
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 6
Тема: «Количественное определение активности аланинаминотрансферазы
(АлАТ) в сыворотке крови»
Цель: Изучить активность аланинаминотрансферазы (АлАТ) в сыворотке крови.
Принцип метода: Аминотрансферазы или трансаминазы катализируют межмолекулярный
перенос аминогруппы с амнокислот на кетокислоты. Коферментом трансаминаз является
фосфопиридоксаль, который служит непосредственным переносчиком аминогрупп с
аминокислоты на кетокислоту. АлАТ катализирует реакцию переаминирования между
аланином и -кетоглутаровой кислотой:
COOH
COOH
CH2
CH3
CH2
CH
C
O
NH2
CH2
CH3
CH2
C
CH
COOH
COOH
NH2
O
COOH
COOH
α-кетоглутарат
Аланин
Глутамат
Пируват
По количеству образовавшейся пировиноградной кислоты можно судить об
активности
фермента.
Количество
пировиноградной
кислоты
определяется
колориметрическим путем по цветной реакции с 2,4-динитрофенилгидразином, при
которой развивается красно-бурое окрашивание:
H2N
NH
CH3
C
CH3
NO2
O
COOH
C
N
NH
COOH
H2O
NO2
NO2
NO2
Пируват
2,4-ДНФГ
2,4-ДНФ-гидразон пирувата
Схема постановки опыта
Контрольная проба
Опытная проба
Реагент 1 (АлАТ, субстрат), мл
0,25
0,25
Дистиллированная вода, мл
0,05
–
Сыворотка, мл
–
0,05
Перемешать и инкубировать 30 мин
Реагент 2 (динитрофенилгидразин),
0,25
0,25
мл
Перемешать и оставить при комнатной температуре на 20 мин
NaOH (С = 0,4 моль/л), мл
2,5
2,5
Перемешать и через 10 минут измерить оптическую плотность пробы против
контрольной пробы при длине волны 540 нм, кювета с толщиной слоя 5 мм. Активность
АлАТ в опытной пробе определить по калибровочному графику в нмоль/сл.
Калибровочный график для определения активности АлАТ
Оптическая плотность
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Активность АлАТ, нмоль/с л
Результат анализа:
Вывод:
450
500
550
600