НШ-7623.2006.4 - Управление Научных Исследований СПбГУ
advertisement
АННОТАЦИЯ К отчету по гранту НШ-7623.2006.4 Тема: Роль организации и экспрессии генетического материала в наследственной и ненаследственной изменчивости Руководитель: акад. РАН Инге-Вечтомов С.Г. Работа была основана на использовании обширных генетических коллекций кафедры генетики и селекции СПбГУ: дрожжей, ржи, дрозофилы, редиса и др. Целью работы было выяснение роли организации и экспрессии генетического материала в наследственной и ненаследственной изменчивости. В рамках этой цели было сформулировано три основные задачи: изучить структуру генетического материала и механизмов наследственной изменчивости; изучить экспрессию генов и механизмов эпигенетической наследственности и изменчивости; изучить проблемы экологической генетики. Работа проводилась с использованием генетических, молекулярно- биологических, цитогенетических методов. В ходе выполнения НИР по трем основным разделам получены следующие результаты: 1) «Структура генетического материала и механизмы наследственной изменчивости»: С помощью молекулярных маркеров у ржи установлена хромосомная локализация гена эмбриональной летальности Eml и картированы три cинаптические мутации sy1, sy9 и sy19. Показано, что негомологичность синапсиса у мутанта sy10 сопровождается эктопической рекомбинацией. Амплифицированы и частично секвенированы фрагменты генов ржи RAD51 и DMC1. У двух из трех изученных гибридов F2-3 обнаружены и картированы локусы, отвечающие за старение семян. Отработаны методы и проведен поиск генов редиса, вовлеченных в регуляцию развития, по гомологии с соответствующими генами арабидопсиса - ARR5, STM, WUS: Проведено сравнение и выявлены различия у опухолевых и безопухолевых линий редиса по экспрессии цитокинин-регулируемых генов семейства ARR, а также меристемных генов STM и WUS. Нами впервые показано, что гену sbr D.melanogaster соответствует несколько транскриптов (3.5, 2.8 и 5.1 т.н.), из них два являются тканеспецифичными: транскрипт 2.8 т.н. присутствует только в семенниках, а длинный – 5.1. т.н. –нейроспецифичным. В тканях головы имаго этот транскрипт представлен даже в относительно большем количестве, чем конститутивный транскрипт 3.5 т.н. Полученные нами антитела, использованные при проведении Вестерн-блот анализа, выявляют белок 76 кДа, соответствующий по молекулярной массе белку SBR, как в образцах, полученных из семенников, так и из голов имаго. Белок 76 кДа является конститутивным, присутствуя во всех проанализированных нами образцах. Кроме того, только при анализе белков, выделенных из семенников, выявляется дополнительная полоса, соответствующая по молекулярной массе белку 64 кДа. Проведена локализация гена убиквитин- ассоцииированного белка на хромосомах курицы – показана локализация UBAP2W на GGAW. Полученные результаты дают дополнительный аргумент о синтенности коротких плеч GGAZ и HSA9. Однако на основе положения UBAP2Z относительно ACO1 и B4GALT1 предполагается, что порядок генов в HSA9 и GGAZ не консервативен.Изучено влияние на чувствительность дрожжей к токсическому и мутагенному действия ГАП и АГАП инактивации генов, контролирующих биосинтез АМФ de novo, а также ключевых генов, контролирующих процессы транспорт и утилизациюи и взаимопревращения пуринов. Установлено, что наиболее существенный вклад в метаболизм ГАП и АГАП вносят гены ADE12, ADE13, ААН1, НАМ1 и АPT1. 2) "Экспрессия генов и механизмы эпигенетической наследственности и изменчивости". Сравнение нонсенс-мутантов по генам SUP45 и SUP35 содержания восьми тРНК: не выявило предпочтительного увеличения количества тРНК, способных к неканоническому прочтению стоп-кодона. Большинство из изученных мутаций приводит к увеличению уровня всех исследованных тРНК. Обсуждаются механизмы, обеспечивающие жизнеспособность нонсенс-мутантов по жизненно важным генам SUP45 и SUP35. Изучение особенности процесса индукции и воспроизведения нестабильных [PSI+]-подобных факторов, возникающих в клетках дрожжей при экcпрессии химерных белков, включающих прионизующий домен белка Sup35 (Sup35NM), показало, что процесс агрегации химерных белков Sup35NMS.cerevisiae – CP.methanolica (Sup35SP) и Sup35NMAde2 является независимым от присутствия эндогенного приона [PIN+], в то же время включение интактного белка Sup35 в агрегаты является [PIN+]-зависимым. Получены данные свидетельствующие в пользу различия молекулярной природы эпигенетических антисупрессорных факторов [ASP+] и [ISP+] у S.cerevisiae. В плане разработки системы массового тестирования соединений, регулирующих и блокирующих агрегацию белка PrP млекопитающих был начат скрининг последовательностей из кДНК библиотеки мозга мыши. Проанализировано 5500 клонов [PrPS+] штамма на фоне экспрессии кДНК последовательностей мыши. Элиминация [PrPS+]-фактора не отмечена. Показано, что другой гибридный белок PrP-GFP агргегирует в дрожжевой цитоплазме. Сверхпродукция дрожжевого шаперона Ssa1 не оказывает эффекта на конформацию PrP-GFP, тогда как и сверхпродукция и инактивация Hsp104 резко усиливает прионоподобную агрегацию этого белка. 3) "Экологическая генетика. Создана коллекции агробактериальных штаммов с отдельными генами биосинтеза стеринов в смысловой и анти-смысловой ориентациях, получены трансгенные растения табака и картофеля с использованием созданных штаммов.При оценке устойчивости 94 инбредных линий ржи к бурой ржавчине пшеницы выявлено 39 устойчивых линий, 16 восприимчивых и 39 линий гетерогенных по устойчивости. На основании изученного материала создается модель для изучения генетики нехозяйской устойчивости ржи к патогену пшеницы. В рамках изучения влияния экологически значимых внешних факторов окружающей среды на генетические процессы изучали влияние феромонов домовой мыши на иммунологические, цитогенетические и поведенческие процессы выявлено зависимое от генотипа иммуносупрессивное, мутагенное и аттрактивное влияние феромонов домовой мыши. В русле экологической тематики были проведены исследования степени загрязненности некоторых точек побережья Белого и Баренцева морей и некоторых пресных водоемов Санкт-Петербурга и Ленинградской области. Показана достаточная чувствительность представителей равноногих рачков для тестирования мутагенности антропогенных воздействий на окружающую среду. Показано, что дрожжевая тест-система для генотоксикологии (α-теста). является высокочувствительной для выявления и оценки действия мутагенных факторов среды. Ее эффективность увеличивается при нарушении пути рекомбинационной репарации, вызванном мутациями в генах RAD50 или RAD52, которое может приводить к повышению частоты первичных и фиксированных изменений ДНК. Проводятся работы по оформлению патента на ключевой элемент тест-системы для скрининга факторов, блокирующих агрегацию Аβ-пептида – гибридный ген Аβ-SUP35MC (заявка на патент Российской Федерации №2004 131970).. Проводятся работы по патентованию тест-системы для генетической токсикологии с генетически и эпигенетически модифицированной репарацией у дрожжей S.cerevisiae (альфа-тест). Разработка перечисленных направлений служит основой для прикладных исследований в области селекции, моделирования элементарных эколого-генетических систем, защиты растений, поисков путей лечения и диагностики нейродегенеративных заболеваний человека и животных. Разработанные тест-системы используются для тестирования факторов окружающей среды и химических препаратов на генетическую активность. Проводимые исследования служат базой для подготовки бакалавров, магистров, аспирантов и докторантов по специальности «генетика». Кафедра генетики и селекции СПбГУ предоставила коллекционный материал (Drosophila melanogaster) для ряда научно-исследовательских коллективов и вузов России и стран ближнего зарубежья. Полученные результаты могут быть использованы в фундаментальных научных исследованиях, в селекции микроорганизмов, животных, растений, в медицине (диагностика и лечение нейродегенеративных заболеваний), окружающей среды по генетически активным факторам. при мониторинге
