Экология растений и фотосинтез - Кабардино
advertisement
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «КАБАРДИНО-БАЛКАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. Х.М. БЕРБЕКОВА» ЭКОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ И ФОТОСИНТЕЗ Методические указания к лабораторным занятиям Для специальности 020201 – Биология НАЛЬЧИК 2009 УДК 581.5 ББК 28.557 Рецензент: кандидат биологических наук, доцент кафедры ботаники Кабардино-Балкарской государственной сельскохозяйственной академии Н.Л. Цепкова Составитель: Слонов Л.Х. Экология растений и фотосинтез: Методические указания лабораторным занятиям. – Нальчик: Каб.-Балк. ун-т, 2009. – 38 с. к Издание содержит методические указания к лабораторным занятиям. Рассматриваются методы изучения образования и расходования органического вещества растениями, влияние экологических факторов на различные процессы растений, устойчивость растительных организмов к действию неблагоприятных факторов внешней среды, загрязнение пищевых продуктов нитратами и биоиндикационный метод определения состояния окружающей среды. Предназначено для студентов специальности «Биология». Рекомендовано РИС университета УДК 581.5 ББК 28.557 Кабардино-Балкарский государственный университет, 2009 2 ВВЕДЕНИЕ Научно-технический прогресс и всё усиливающееся влияние человека на природу нарушают естественные комплексы, взаимосвязь явлений природы. В связи с необходимостью охраны окружающей среды сильно возросла роль экологии и она стала интегральной наукой, связанной почти со всеми естественными и техническими дисциплинами, преподаётся во всех учебных заведениях Российской Федерации. В этой связи важнейшее значение имеет подготовка экологически грамотных специалистов, способных не только охранять природу, рационально использовать её естественные ресурсы, но и решать качественно новые задачи: прогнозировать изменение состояния окружающей среды и управлять ею. Такой уровень знаний студенты могут получить при рациональном сочетании чтения теоретического курса с проведением практических занятий. Однако из-за отсутствия необходимого количества специального методического руководства для проведения лабораторных работ трудно сочетать теорию с практикой, с помощью которой студенты не только углубляют свои познания, но и получают практические навыки. Данная работа содержит методические указания по изучению процессов образования и расходования органического вещества растениями, влияния экологических факторов на протекание различных жизненных процессов в растениях, степени устойчивости растительных организмов к действию неблагоприятных факторов внешней среды, биоиндикационный метод определения состояния окружающей среды и др. 3 Работа № 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ ОРГАНИЧЕСКОГО ВЕЩЕСТВА В ЛИСТЬЯХ РАСТЕНИЙ В ПРОЦЕССЕ ФОТОСИНТЕЗА (по содержанию углерода) Фотосинтез – основной процесс аккумуляции вещества и энергии на Земле, в результате которого из СО2 и H2O образуются органические вещества (в данной формуле – глюкоза): 6СО2 + 6H2O + энергия света С6Н12О6+ 6О2 Один из способов измерения интенсивности фотосинтеза заключается в определении образования органического вещества в растениях по содержанию углерода, который определяется методом мокрого сжигания, разработанным И. В. Тюриным для почв и модифицированный для древесных растений Ф. 3. Бородулиной (Баславская, Трубецкова, 1964; Практикум... 1972). Во взятом образце листьев определяется содержание углерода, затем листья выдерживаются 2-3 ч и более на свету и снова определяется содержание углерода. Разница между вторым и первым определением, выраженная на единицу поверхности листа в единицу времени, показывает количество образовавшегося органического вещества. В процессе сжигания углерод листьев окисляется 0,4 н раствором бихромата калия в серной кислоте. Реакция протекает по следующему уравнению: 2K2Сr2О7 + 8H2SО4 + 3С = 2K2SО4 + 2Cr2(SO4)3 + 8Н2О + 3СО2 Неизрасходованное количество бихромата обратным титрованием 0,2 н раствором соли Мора: калия устанавливают 6FeSО4 . (NH4)2SО4 + К2Сr2О7 + 7H2SО4 = = Cr2(SO4)3 + 3Fe2(SО4)3 + 6(NH4)2SО4+ К2SО4+ 7H2О В качестве индикатора применяют бесцветный раствор дифениламина, который при окислении переходит в дифенилбензидинвиолет сине-фиолетового цвета. Бихромат калия окисляет дифениламин и смесь приобретает красно-бурую окраску. При титровании солью Мора шестивалентный хром восстанавливается в трёхвалентный. В результате цвет раствора переходит в синий, а к концу титрования – в сине-фиолетовый. Когда же хром будет оттитрован, последующее добавление соли Мора вызывает переход окисленной формы индикатора в восстановленную (бесцветную); появляется зеленая окраска, которую придают раствору ионы трехвалентного хрома. Четкому переходу сине-фиолетовой окраски в зеленую мешают ионы трехвалентного железа, появляющиеся в процессе реакции. Чтобы сделать более ясным конец 4 реакции титрования ее проводят в присутствии ортофосфорной кислоты, которая связывает ионы Fe3+ в бесцветный комплексный ион [Fe[PO4)2]3- и предохраняет дифениламин от окисления. Оборудование, реактивы, материалы 1) конические колбы на 250 мл; 2) термостойкие конические колбы на 100 мл; 3) маленькие стеклянные воронки, используемые как обратные холодильники; 4) бюретки; 5) 0,4 н раствор бихромата калия (в разбавленной серной кислоте (1:1)); 6) 0,2 н раствор соли Мора; 7) дифениламин; 8) 85 %ая ортофосфорная кислота; 9) пробочное сверло или другое приспособление для выбивания дисков диаметром 1 см; 10) мерный цилиндр; 11) вегетирующие растения с симметричной широкой и тонкой листовой пластинкой (герань, фуксия, листья древесных растений). Ход работы Лист вегетирующего растения делят на две половинки вдоль главной жилки и на одной из них вырезают пробочным сверлом 3 диска диаметром 1 см, помещают на дно конической термостойкой колбочки объемом 100 мл, куда наливают 10 мл 0,4 н раствора К2Сr2О7. Колбу закрывают маленькой воронкой носиком вниз и ставят на электроплитку с закрытой спиралью в вытяжной шкаф. Когда раствор закипит, добиваются слабого кипения в течение 5 мин, иногда слегка взбалтывают колбу круговым движением, чтобы диски были хорошо покрыты жидкостью. По верху колбы (не закрывая горлышко) укрепляют поясок из нескольких слоев плотной бумаги, который предотвратит ожог рук при помешивании содержимого колбы и при ее перестановке. Затем колбу снимают с нагрева, ставят на керамическую плитку и охлаждают. Жидкость должна быть буроватого цвета. Если окраска ее зеленоватая, то это указывает на недостаточное количество бихромата калия, взятого для окисления органического вещества. В этом случае определение нужно повторить с большим количеством реактива или меньшим количеством высечек. К охлажденному раствору небольшими порциями в несколько этапов приливают 150 мл дистиллированной воды, затем эту жидкость постепенно переливают в колбу на 250 мл, куда добавляют 3 мл 85 %-ой ортофосфорной кислоты и 10 капель дифениламина. Взбалтывают содержимое и оттитровывают 0,2 н раствором соли Мора. Одновременно проводят контрольное определение (без растительного материала), тщательно соблюдая все указанные выше операции. Соль Мора сравнительно быстро теряет титр, поэтому раствор необходимо периодически проверять перед началом определения. 5 Количество углерода органического вещества, содержащегося в 1 дм 2 листовой поверхности, рассчитывают по формуле: 6 х (a b) k 0,6 100 , s где a – количество соли Мора в мл, израсходованное на титрование контрольного раствора; b – количество соли Мора в мл, пошедшее на титрование опытного раствора; k – поправка к титру соли Мора; 0,6 – миллиграммы углерода, соответствующие 1 мл точно 0,2 н раствора соли Мора; s – площадь высечек, см2. Схема записи результатов Объект Время определения Взято К2Сr2О7 (мл) Расход соли Мора (мл) конт. опыт конт. опыт Площадь высечек (см2) Количество углерода (мг/дм2) Интенсивность фотосинтеза (мг углерода на дм2 в час) Начало опыта После двухчасового пребывания на свету Пример расчета количества углерода: 1. В начале опыта: а = 19мл, b = 9мл, k = 1, S = r2 .3 = (3,14 . 12) . 3 = 9,4 см2 (19 9) 1 0.6 100 600 63,82 мг/см2 или 6382 мг/дм2 9,4 9,4 В конце опыта: 6530 мг/дм2 6500 – 6382 = 118 мг/дм2 за два часа или 59 мг/ч. Приготовление растворов 1. 0,4 н раствор К2Сr2О7 в разбавленной (1:1) серной кислоте. 20 г измельченного в ступке кристаллического К2Сr2О7 растворяют в 250-300 мл дистиллированной воды (можно с подогреванием), фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу емкостью 500 мл. Доводят до метки дистиллированной водой и переливают в колбу на 1 л. К этому раствору небольшими порциями (по 50 мл) добавляют 500 мл Н2SO4 (пл. 1,84) при 7 перемешивании. При этом происходит сильное разогревание жидкости, поэтому операцию лучше проводить в сосуде из термостойкого стекла. Не рекомендуется использовать толстостенную посуду, т.к. она не выдерживает резкого повышения температуры. Во всех случаях разумнее обертывать сосуд полотенцем. Сосуд закрывают воронкой или стеклом, оставляют стоять до полного охлаждения, перемешивают еще раз и переливают в бутыль с притертой пробкой из темного стекла, хранят в темном месте. Порцию реактива можно уменьшить, исходя из потребностей анализа. 2. 0,2 н раствор соли Мора (NH4)2SO4 • FeSO4 • 6H2O 40 г соли помещают в колбу, заливают 1н раствором Н2SO4 примерно на 2/3 объема колбы. При этом используют только голубые кристаллы, побуревшие отбрасывают. Для повышения устойчивости соли Мора раствор должен быть сильно подкислен, поэтому можно к 40 г соли Мора добавить 10 мл концентрированной Н2SO4 и довести все дистиллированной водой до 500 мл. Раствор взбалтывают до полного растворения соли, фильтруют через двойной складчатый фильтр, добавляют дистиллированную воду до метки, хорошо перемешивают. Раствор хранят в бутыли, изолированном от воздуха. Соль Мора очень быстро теряет титр, поэтому его проверяют перед каждым определением. 3. Раствор дифениламина. 0,5 г дифениламина растворяют в 100 мл Н2SO4, (пл. 1,84); к раствору постепенно, с большой осторожностью добавляют 20 мл дистиллированной воды. 4. Определение нормальности соли Мора. Нормальность раствора соли устанавливают и проверяют по 0,1 н раствору КМnO4. В коническую колбу емкостью 250 мл вливают 1 мл Н2SO4 (пл. 1,84), отмеряют бюреткой 10 мл соли Мора, прибавляют 50 мл дистиллированной воды и титруют 0,1 н раствором КМnO4 на холоде до слабо-розовой окраски, исчезающей в течение 1 мин. Титрование повторяют три раза. Для приготовления КМnO4 используют фиксанал. Нормальность раствора соли Мора N1 вычисляют по формуле: N1= N 2 V2 , V1 где V1 – объем соли Мора; V2 – объем КМnO4; N2 – его нормальность. Работа № 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НАКОПЛЕНИЯ ОРГАНИЧЕСКОГО 8 ВЕЩЕСТВА В БИОМАССЕ РАСТЕНИЙ И В ПОЧВЕ Органическое вещество образуется и накапливается на Земле неравномерно. Наибольшее его количество образуют тропические леса (70 % запасов углерода), чуть меньше – северные леса и наименьшее количество – тундры и пустыни. В лесных экосистемах наибольшее количество органических веществ накапливается в древесине (от 90 до 99 % от сухой массы дерева), меньше – в листьях и коре. В почве в виде гумуса содержится от 1 до 15 % органического вещества, которое является тысячелетним хранителем энергии. Метод определения органического вещества в различных частях дерева заключается в сухом сжигании образца в муфельной печи, определении в нем золы и органической части (последняя рассчитывается в процентах к сухому образцу). При сжигании растительного материала и почвы углерод, азот и водород улетучиваются в виде углекислого газа, воды и окислов азота. Оставшийся нелетучий остаток (зола) содержит элементы, называемые зольными. Разница между массой всего сухого образца и зольным остатком составляет массу органического вещества. Содержание золы и органического вещества у растений (% от сухого вещества) по Б.А. Рубину (1976) Травянистые растения Орган % % органич. растения золы вещества семена 3 97 стебель 4 96 корни 5 95 листья 15 85 Древесные растения орган % % органич. растения золы вещества стебель 3 97 древесина 1 99 кора 7 93 листья 11 89 Оборудование, реактивы, материалы 1) аналитические или точные технохимические весы; 2) муфельная печь; 3) тигельные щипцы; 4) электроплитка с закрытой спиралью; 5) фарфоровые тигли или испарительные чашки; 6) препаровальные иглы; 7) эксикатор; 8) спирт; 9) дистиллированная вода; 10) хлористый кальций; 11) высушенная до абсолютно сухой массы стружка древесины, измельченная кора, листья, гумусированная почва. Ход работы Сухие и измельченные образцы древесины, коры, листьев, а также почвы (3 г и более), отобранные методом средней пробы, взвешиваются до 0,01 г на кальке. Их помещают в прокаленные и взвешенные фарфоровые 9 тигли или испарительные чашки (диаметром 5-7 см), подписанные 1 %-м раствором хлорного железа, которое при нагревании буреет и при прокаливании не исчезает. Тигли с органическим веществом ставят на разогретую электроплитку в вытяжной шкаф и прогревают до обугливания и исчезновения черного дыма. При этом при наличии большего количества растительного материала возможно его дополнение из предварительно взвешенного образца. Затем тигли ставят в муфельную печь при температуре 400-450 °С и сжигают еще 20-25 мин до того состояния, когда зола станет серо-белой. При более высокой температуре прокаливания могут быть существенные потери серы, фосфора, калия и натрия. Может также наблюдаться сплавление с кремниевой кислотой, что мешает полному озолению. В этом случае прокаливание прекращают, охлаждают тигель и добавляют в него несколько капель горячей дистиллированной воды; подсушивают на плитке и продолжают прокаливание. Возможны следующие варианты цвета золы: красно-бурый (при большом содержании в образце окислов железа), зеленоватый (в присутствии марганца), серо-белый. При отсутствии муфельной печи сжигание можно проводить в учебных целях на электроплитке под тягой. Для создания более высоких температур надо оградить плитку железным листом в виде бортика высотой 5-7 см от полотна плитки, а также прикрыть сверху куском асбеста. Сжигание проводится 30-40 мин. При сжигании необходимо периодическое помешивание материала препаровальной иглой. Сжигание также проводится до белой золы. В случае медленного сжигания в охлажденные тигли наливается небольшое количество спирта и поджигается. В золе не должно быть заметно черных частичек угля. В противном случае пробы обрабатывают 1 мл дистиллированной воды, помешивают и повторяют прокаливание. Схема записи результатов Название части растения или почв Масса, г абсолютно сухой навески с тиглем А Древесина Листья Кора Почва (чернозем) 10 % тигля с золой органического вещества органического вещества золы В N X У После того, как сжигание будет окончено, тигли охлаждают в эксикаторе с крышкой и взвешивают. õ 100 (A B) , Y 100 X, N где X – процент органического вещества; У – процент золы; А – абсолютно сухая масса навески растительного материала или почвы с тиглем; В – масса золы с тиглем; N – масса органического вещества. Каждый студент исследует какой-либо один объект, а затем все данные группы записываются в общую ведомость, вычерченную на доске. Работа № 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАСХОДА ОРГАНИЧЕСКОГО ВЕЩЕСТВА РАСТЕНИЯМИ ПРИ ДЫХАНИИ Любое сообщество живых организмов на Земле характеризуется его продуктивностью и устойчивостью. Продуктивность определяется, в частности, как разность между накоплением и расходованием органического вещества при таких кардинальных процессах, как фотосинтез и дыхание. В первом процессе органическое вещество синтезируется из углекислого газа и воды с выделением кислорода, во втором – разлагается за счет окислительных процессов, проходящих в митохондриях клеток с поглощением кислорода. Разные растения сильно различаются по соотношению этих процессов. Так, у С4 растений (кукуруза, сорго, сахарный тростник, мангровые деревья) наблюдается высокая интенсивность фотосинтеза при небольшом световом дыхании, что обеспечивает их высокую продуктивность по сравнению с С3 растениями (пшеница, рис). Аэробное дыхание (с участием кислорода) – процесс обратный фотосинтезу. В этом процессе синтезированные в клетках органические вещества (сахароза, органические и жирные кислоты) разлагаются с высвобождением энергии: С6Н12O6 + 6O2 6СO2 + 6Н2O + энергия. Все растения и животные получают энергию для поддержания своей жизнедеятельности с помощью дыхания. 11 Метод определения интенсивности дыхания у растений основан на учете количества выделяемого растениями углекислого газа, который поглощается баритом: Ва(ОН)2 + СO2 = ВаСO3 + Н2O. Избыток барита, не прореагировавшего с СО2, оттитровывают соляной кислотой: Ва(ОН)2 + 2HC1 = ВаС12 + Н2O. Оборудование, реактивы, материалы 1) широкогорлые конические колбы емкостью 250 мл; 2) резиновые пробки с просверленными отверстиями, в которые вставляется стеклянная трубка; в трубке протягивается тонкая проволока длиной 12-15 см; 3) весы технохимические; 4) разновесы; 5) черная светонепроницаемая бумага; 6) бюретки с раствором Ва(ОН)2 и пробкой сверху, в которую вставлена трубка с натронной известью; 7) 0,1 н раствор Ва(ОН) 2; 8) 0,1 н раствор HCl; 9) 1 %-ый раствор фенолфталеина в капельнице; 10) зеленые листья, только что сорванные в природной обстановке или листья комнатных растений. Ход работы 58 г зеленых, только что сорванных листьев растений взвешивают с черешками на технохимических весах, черешки скрепляют одним концом проволоки, которую протягивают через отверстие пробки (рис. 1). Предварительно рекомендуется провести пробную установку, опуская материал в колбу и закрывая колбу пробкой. Обратить внимание на то, чтобы пробка плотно закрывала колбу, пучок листьев располагался в верхней части колбы и расстояние между баритом и пучком было достаточно велико. Все отверстия между колбой, пробкой и трубочкой рекомендуется заделать пластилином, а в месте верхнего выхода проволоки из трубки изолировать систему кусочком Рис. 1. Смонтированная колба фольги. для определения интенсивности В опытные колбы наливается из дыхания: 1 – проволока; бюретки по 10 мл 0,1 н раствора 2 – стеклянная трубка; Ва(ОН)2, помещается материал и 3 – резиновая пробка; 4 – пучок листьев; 5 – барит 12 изолируется вышеуказанным способом. Контроль (без растений) ставится в 2-3-кратной повторности. Все колбы закрывают черной светонепроницаемой бумагой для исключения фотосинтеза и идентичности всех колб, отмечается время начала опыта, который длится 1 ч. Во время опыта следует периодически осторожно покачивать колбы, чтобы разрушить пленку ВаСО3, образующуюся на поверхности барита и препятствующую полноте поглощения СО2. Через один час приоткрыть пробку и извлечь из колб материал путем быстрого выдергивания проволоки с листьями. Немедленно закрыть пробку, изолировав верх трубочки фольгой. Перед титрованием добавить в каждую колбу по 2-3 капли фенолфталеина: раствор окрашивается в малиновый цвет. Оттитровать свободный барит 0,1 н НСl. При этом первыми оттитровывают контрольные колбы. Вывести среднее, а затем оттитровать опытные колбы. Титровать растворы следует осторожно до обесцвечивания. Результаты записать в таблицу (на доске и в тетради). Исследуемый объект Исследуемый объект Навеска, г Время начало конец опыта опыта Продолжительность опыта, мин Интенсивность дыхания, мг СО2,г/ч Интенсивность дыхания рассчитать по формуле: (a b) 2,2 60 l мг СО2 /г/ч , pt где а – количество 0,1 и НСl, израсходованное на титрование контрольных колб, мл; b – количество 0,1 и НСl, израсходованное на титрование опытной колбы, мл; 2,2 – количество СО2, соответствующее 1 мл 0,1 н НСl, мг; р – навеска листьев, г; t – продолжительность опыта, мин; 60 – коэффициент для перевода минут в час. В выводах указать, какие растения из взятых дышат сильнее. Почему? Разведение реактивов 0,1 н НCl. Используется фиксанал или берется 8,2 мл концентрированной НСl плотностью 1,19, доводится до 1 л дистиллированной водой. 0,1 н Ва(ОН)2 • 8Н2О. Берется 15,77 г щелочи, растворяется в дистиллированной воде и доводится до 1 л. 13 Объем растворов можно уменьшить в зависимости от цели опытов. Растворы не рекомендуется готовить заранее. 14 Работа № 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ К ВЫСОКИМ ТЕМПЕРАТУРАМ Температура – один из основных экологических факторов на Земле. Она меняется в широком диапазоне в зависимости от природных зон и конкретных условий (вулканическая деятельность, горячие источники, выброс тепла энергетическими установками и др.). Разные типы растений поразному относятся к этому фактору. Так, С4 растения выдерживают более высокие температуры, чем С3 растения. В пределах последней группы также имеются большие различия. Работа проводится с группой древесных растений различных видов, встречающихся в озеленительных посадках данной местности. Это дает возможность построить ряд древесных видов по степени устойчивости к высоким температурам, выявить наиболее устойчивые из них, что очень важно для создания озеленительных зон предприятий, уличных посадок в районах с жарким летом. В связи с этим студентам дается задание принести по 5-6 свежих листьев от различных древесных пород, обернув концы черешков в мокрую вату, фольгу, а все листья поместив в целлофан. В крайнем случае можно использовать комнатные растения. Принцип метода предложен Ф.Ф. Майковым и основан на установлении порога повреждения живых клеток от экстремальных температур. Если подвергнуть листья действию высокой температуры, а затем погрузить в слабый раствор соляной кислоты, то поврежденные и мертвые клетки побуреют вследствие свободного проникновения в них кислоты, которая вызовет превращение хлорофилла в феофитин (бурого цвета), тогда как неповрежденные клетки останутся зелеными. У растений, имеющих кислый клеточный сок, феофитинизация может произойти и без обработки соляной кислотой, т.к. при нарушении полупроницаемости тонопласта органические кислоты проникают из клеточного сока в цитоплазму и вытесняют магний из молекулы хлорофилла. Данную работу лучше проводить в первой половине вегетации, когда не наблюдается естественного разрушения хлорофилла у древесных пород. Оборудование, реактивы, материалы 1) водяная баня; 2) термометр; 3) пинцет; 4) чашки Петри (5 шт.); 5) стакан с водой; 6) тонкая проволока; 7) карандаш по стеклу; 8) 0,2 н раствор соляной кислоты; 9) свежие листья древесных растений. В период вынужденного покоя (февраль – апрель) их можно получить путем прогрева веток в теплой воде и дальнейшего распускания листьев в воде комнатной температуры. Можно также использовать набор листьев разных видов комнатных растений. 15 Ход работы Перед занятием нагреть водяную баню до 40 °С, в самом начале занятия погрузить в нее пучок из 5 одинаковых листьев исследуемых растений, скрепив черешки проволочкой. Выдержать листья в воде в течение 30 мин, поддерживая температуру на уровне 40 °С. Затем взять первую пробу: оторвать по одному листу каждого вида растений и поместить в чашку Петри с холодной водой. После охлаждения взять лист пинцетом и перенести в чашку с соляной кислотой. Поднять температуру в водяной бане до 50 °С и через 10 мин после этого извлечь из нее еще по одному листу, повторив операцию и перенеся охлажденный в воде лист в новую чашку Петри с HC1. Так постепенно довести температуру до 80 °С, беря пробы через каждые 10 мин при повышении температуры на 10 °С. Через 20 мин после погружения листа в HC1 учесть степень повреждения по количеству бурых пятен. Результаты записать в таблицу, обозначив отсутствие побурения знаком «-», слабое побурение «+», побурение более 50 % площади листа «++» и сплошное побурение << + + + ». Записать результаты по разным древесным растениям в общую таблицу на доске. Объект Степень повреждения листьев 40 °С 50 °С 60 °С 70 °С 80 °С Построить ряд термостойкости древесных пород или комнатных растений по степени убывания. Сделать соответствующие выводы. Работа № 5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕМПЕРАТУРНОГО ПОРОГА КОАГУЛЯЦИИ БЕЛКОВ ЦИТОПЛАЗМЫ КЛЕТОК РАЗНЫХ РАСТЕНИЙ Клетки разных растений имеют неодинаковую устойчивость к повышенным температурам. Цель работы: показать эту разницу на ряде древесных растений. При этом предлагаются два метода определения коагуляции белка цитоплазмы (по Вигорову, 1961 и Генкелю, 1971). Определение по П.А. Генкелю 16 Температура, при которой в течение 10 мин полностью коагулируют белки цитоплазмы, считается условной границей жаростойкости растений. Гибель клеток устанавливается по потере ими способности плазмолизировать. Оборудование, реактивы, материалы 1) микроскоп; 2) стаканы химические большие (6 шт.); 3) пробирки (5 шт.); 4) большая колба; 5) электроплитка; 6) термометр; 7) острая бритва; 8) препаровальная игла; 9) кисточка; 10) предметные и покровные стекла; 11) кусочки фильтровальной бумаги; 12) карандаш по стеклу; 13) 1 М раствор сахарозы; 14) 0,02 %-ый раствор «нейтрального красного»; 15) свежие листья разных древесных растений, растущих во дворах (без влияния газов автотранспорта). Ход работы Острой бритвой приготовить по 12 срезов эпидермиса листьев разных древесных растений, поместить по два среза в пробирки, в которые налито небольшое количество водопроводной воды. Нагреть в большой колбе воду. Смешивая горячую воду с холодной, приготовить в шести химических стаканах водяные бани с температурой 48, 50, 52, 54, 56 и 58°С. Одеть на пробирку поясок из бумаги, где записать температуру. Погрузить одновременно в водяные бани пробирки со срезами, поддерживая установленную температуру путем осторожного подливания в стаканы горячей воды. Через 10 мин извлечь срезы кисточкой из пробирок, перенести на предметные стекла, снабженные надписями. Если клетки не содержат пигмента, следует их окрасить, выдержав в растворе «нейтрального красного» в течение 10-15 мин, затем отсосать раствор краски фильтровальной бумагой, нанести на срезы по капле 1М раствора сахарозы, закрыть покровными стеклами и через 15- 20 мин рассмотреть в микроскоп. Обозначить знаком « + » плазмолиз у клеток и знаком «-» его отсутствие. Наличие плазмолиза показывает, что клетки живые, отсутствие – мертвые. Запись результатов Название растения Температура, 0 С 48 50 52 54 56 58 Построить ряд устойчивости разных растений по температурному порогу коагуляции цитоплазмы. Определение по Л.И. Вигорову Оборудование, реактивы, материалы 17 1) ступки с пестиками; 2) воронки; 3) вата; 4) центрифуга; 5) термостойкий стакан; 6) термометр; 7) битое стекло (мелкое); 8) листья разных древесных растений. Ход работы Взвесить 3-5 г листьев разных древесных растений. Растереть в ступке с 4 мл воды (в случае трудностей при растирании добавить битое стекло). При смыве ступки добавляют еще 6 мл воды. Отделить более крупные частицы разрушенной ткани фильтрованием через вату или центрифугированием. Можно применить стеклянный фильтр и насос. Поместить зеленый раствор в пробирку и, медленно нагревая жидкость в стакане с водой или бане, отметить температуру, при которой произойдет коагуляция белков, извлеченных из разрушенных клеток. Установить ряд устойчивости разных видов древесных растений к высоким температурам. Работа № 6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ КЛЕТОК РАЗЛИЧНЫХ РАСТЕНИЙ К ОБЕЗВОЖИВАНИЮ В условиях жаркого сухого климата, а также городских экосистем явление обезвоживания органов (и, соответственно, клеток) у древесных растений встречается очень часто. Особенно это выражено на освещенных сторонах улиц, когда водообмен затруднен из-за малого проникновения в почву осадков, а полив не производится. Это явление выражается в потере тургора, колоколообразности листьев, пожелтении, появлении некрозов. Предлагаемая работа основана на свойствах серной кислоты обезвоживать клетки листа, что часто встречается в условиях антропогенного загрязнения, когда попавший через устьица в растение сернистый газ превращается в протоплазме клетки в серную кислоту (весьма гигроскопичное вещество), вызывая потерю листом тургора, повреждение и гибель клеток. В другом варианте серная кислота, содержащаяся в воздухе больших городов, образует туман из мельчайших капелек. Попадая на растение в больших концентрациях, она вызывает ожоги, а в малых очень быстро проникает через устьица внутрь межклетников, энергично отнимает воду от углеводов, образующихся в процессе фотосинтеза, вызывая гибель клеток и обугливание тканей листа: С12Н22О11 HSO 12С + 11Н2О. 2 4 Живая клетка отличается от мертвой хорошо выраженным плазмолизом. Оборудование, реактивы, материалы 18 1) микроскоп; 2) предметные и покровные стекла; 3) эксикатор; 4) бритва; 5) концентрированная серная кислота, разведенная дистиллированной водой (1:1); 6) 1 М раствор сахарозы; 7) листья разных древесных растений. 19 Ход работы Берут листья разных древесных растений, растущих в относительно чистой зоне, но встречающихся в уличных посадках города. Из листа растения вырезают пластинки размером 2-4 см2 и кладут в эксикатор над серной кислотой, разбавленной в соотношении 1:1. Пластинки выдерживают в течение 2-3 часов, затем делают срезы, окрашивают «нейтральным красным» и плазмолизируют молярным раствором сахарозы, просасывая его между предметными и покровными стеклами. Просматривают под микроскопом в разных полях зрения и подсчитывают оставшиеся живыми клетки по возникшему плазмолизу. Чем больше осталось живых клеток, тем лучше растение выносит обезвоживание. Строят ряд устойчивости клеток разных растений к обезвоживанию (устойчивости к сернистому газу). Можно одновременно определить и содержание воды в вырезанных пластинках листа. В этом случае можно узнать не только число оставшихся живых клеток, но и при каком содержании воды устойчивость выше. В случае отсутствия древесных растений можно использовать комнатные. Работа № 7. ВЛИЯНИЕ НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУР НА КОАГУЛЯЦИЮ БЕЛКОВ У РАСТЕНИЙ Большинство растений средних и северных широт подвергается действию низких температур. Устойчивость к этому фактору определяется генетическими свойствами растений, их физиологическим состоянием. Особенно сильно страдают южные интродуценты в ботанических садах, также сельхозкультуры, ввезенные из южных широт в более северные (кукуруза, томаты, перец, в отдельные годы – картофель). Это выражается в обратимой или необратимой потере листьями тургора, частичной или полной гибели ассимилирующей поверхности. Страдают в первую очередь молодые листья, плохо одревесневшие побеги. Это явление сглаживается при наличии в клеточном соке защитных веществ (криопротекторов), роль которых выполняют сахара, свободные аминокислоты, соли органических и неорганических кислот. Сахара образуются в процессе фотосинтеза и их накопление у определенных групп растений смягчает или предотвращает коагуляцию белков. Оборудование, реактивы, материалы 1) центрифуга; 2) центрифужные пробирки; 3) термометр; 4) ступки с пестиками; 5) смесь; снег-соль (3:1); 6) сахароза; 7) дистиллированная вода; 8) листья различных растений. 20 Ход работы 1. Взвесить 2-3 г молодых листьев акации белой или катальпы (неморозостойкие породы), тополя черного (морозостойкая порода) или листья комнатных растений, растереть в ступке с 4 мл воды, добавив 6 мл при смывании, отделить обрывки тканей центрифугированием и разлить зеленый раствор хлорофилл-протеида в пробирки. Следует отметить, что у комнатных растений зимой белок образуется плохо, поэтому надо увеличивать навеску до 3-5 г. Заморозить растворы во всех пробирках в смеси снег – соль или лед – соль, рассматривая их через каждые 5 мин; отметить разницу в замерзании растворов от разных растений. Растопить образовавшийся лед и подвергнуть растворы центрифугированию. Отметить разницу в величине осадка, представляющего коагулированный хлорофилл-белковый комплекс. Опыт показывает разное время замерзания растворов и разную степень коагуляции белков у различных растений при замораживании. 2. Подготовить растертый образец, как указано выше, и до замораживания добавить в пробирку сахарозу до полного ее растворения при встряхивании и перемешивании. Заморозить растворы хлорофилл-белкового комплекса с сахарозой и без нее, проследить коагуляцию белка и защитное действие сахарозы. Использовать следующую градацию; 1. Начало замерзания (гомогенная масса с кристаллами льда) – «+». 2. Частичное замерзание (множественные кристаллы льда, но не сплошной слой) – «++». 3. Полное замерзание (появление сплошного слоя льда; при перевертывании пробирки вода не выливается) – « + + + ». Результаты записать в таблицу Вариант Величина осадка, мм Время, мин 5 10 15 20 25 30 Приготовление охладительной смеси К трем частям снега или битого льда добавить одну часть поваренной соли, тщательно перемешать лопаточкой (температура должна быть –20 °С). Изолировать смесь в ведерке плотной бумагой. Лед предварительно наморозить в морозилке и сложить в 2-3-литровый широкогорлый термос. 21 Для охлаждения можно пользоваться и сухим льдом, однако его нельзя хранить в замкнутом пространстве (термосе), т.к. при освобождении газа может быть взрыв. Работа № 8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ К ЗАСОЛЕНИЮ ПОЧВЫ И ВОЗДУХА На территории нашей страны и сопредельных государств встречаются засоленные почвы, которые особенно характерны для засушливых районов. Наиболее широко распространены засоленные почвы в Казахстане, на юге Западной Сибири, Среднем и Нижнем Поволжье, на юге Украины, СевероВосточном Предкавказье, Среднеазиатских государствах. Это почвы, содержащие в своем профиле легкорастворимые соли в токсичных количествах. Влияние таких солей на растения – мощный экологический фактор, сдерживающий их нормальный рост. В основном засоление почвы в той или иной степени вызывается следующими солями: NaCl, Na2SO4, Na2CO3, MgCl2, MgSO4. В районах широкого распространения соленых озер и солончаков (озерные системы Аральского региона Туркмении, озера Тувы, Хакасии) большую роль в переносе солей играют ветровые процессы. При переносе солей ветром на поверхности суши может отлагаться (по подсчетам Ф. Кларка) от 2 до 20 т легкорастворимых солей на 1 км2. Для степных экосистем и полупустынь Закавказья приводится цифра 47 т на км2 в год (Ковда, 1973). Эти соли попадают на растения и воздействуют на них в виде солевой пыли, в виде растворов (с утренней росой), переносятся на огромные расстояния и выпадают в виде солевых осадков. Из почвенных растворов засоленных почв растения с трудом извлекают минеральные вещества и воду для своей жизнедеятельности. Соли также применяются (преимущественно NaCl) на улицах городов для борьбы с гололедом, их растворы проникают в почву и наносят большой вред растениям. В данной работе приводятся три опыта, охватывающие все вышеприведенные случаи повреждения растений. При этом они могут ставиться как отдельно, так и вместе в зависимости от цели и продолжительности занятия (2 или 4 часа). В опытах могут использоваться соли тяжелых металлов, являющиеся сильными загрязнителями биосферы. Оборудование, реактивы, материалы 1) большие пробирки или цилиндры на 100 мл; 2) штативы к пробиркам; 3) мерные пробирки или цилиндры; 4) технохимические весы; 5) разновесы; 6) острая бритва; 7) соли NaCl, Na2CO3; 8) вода; 9) веточки разных растений с 3-4 одинаковыми небольшими листьями (березы, тополя, яблони и др.). 22 Опыт 1 Влияние опудривания растений солями на их устойчивость Опыт иллюстрирует влияние на растения ветровых отложений солей. Ход работы Ветки разных древесных растений взвешивают и уравнивают (путем подрезания) до одинаковой массы, выдерживают в воде 15 мин до их насыщения влагой, вынимают, обсушивают фильтровальной бумагой, обрабатывают смачивателем (1-2 %-й раствор зеленого мыла или ОП-7, ОП10). Роль смачивателя в естественной обстановке выполняют растворы некоторых солей, образующих гель, гуминовые и фульвокислоты, содержащиеся в эоловых переносах, а главное – выделения самих растений. После этого срез ветки быстро обновляют бритвой и ставят в сосуд (большую пробирку или цилиндр) со строго дозированным количеством водопроводной отстоянной воды. Отверстие сосуда плотно закрывают листочком станиоля, пробирки надписывают. Соли (NaCl, Na2CO3) растирают в ступке до мелкодисперсного состояния. Кусочки ваты рыхло накручивают на палочку, затягивают ниткой и используют как кисточку, которой опудривают равномерно листья, черешки, кору подопытных растений солями. Контролем служат растения без опудривания. Ветки выставляют на рассеянный свет на 1-2 недели, избегая сильного их нагревания. Затем учитывают такие признаки, как потеря тургора, появление инфильтрационных просвечивающих пятен, появление некрозов (отмершей ткани), подсыхание краев листа, их скручивание и др. Одновременно измеряют поглощение воды из пробирок (цилиндров), используя мерную пробирку. В результате решаются следующие задачи. 1. Определяются степень и характер повреждения листьев разными солями, при этом определяется на глаз (в процентах от всей площади листьев) площадь, занятая некрозами. 2. Сравнивается степень поглощения воды ветками разных растений при опудривании различными солями. 3. Проводится сравнительная оценка солеустойчивости разных растений к разным видам солей. Опыт 2 Опыт имитирует влияние солевых осадков на лист (или выпавшей росы на солевой покров листа), т.е. действие на лист раствора солей. 23 Ход работы Ветки разных видов древесных растений с одинаковым числом листьев выравнивают путем взвешивания, как и в предыдущем опыте, выдерживаются путем полного погружения в 5 %-е растворы солей (NaCl, Na2CO3) в течение 15, 30, 45 минут. Контрольные ветви выдерживают в воде. Для опыта требуется не менее четырех веток каждого вида. После этого срезы быстро обновляют бритвой и ветви ставят в воду (одинаковое количество во всех опытах и контрольных вариантах). Испарение воды из пробирок предотвращают изолированием фольгой. Через 1-2 недели производится оценка состояния растений и измерение поглощенной воды по схеме, предложенной в предыдущем опыте. Делаются соответствующие выводы. Опыт 3 Опыт имитирует состояние растений и поглощение ими растворов из засоленных почв, которое вызвано близко лежащими к поверхности засоленными грунтовыми водами. Данные о содержании солей в грунтовых водах разных географических зон взяты из работы В. А. Ковды (1973). Так, для степи максимальная минерализация 50-100 г/л (5-10 %), для лесостепи – 10-100 г/л (1-10 %). Ход работы Приготавливают серию растворов разных солей (NaCl, Na2CO3): 1,3,5,7,10, 20 %. Наливают равное количество этих растворов в большие пробирки. Контролем служит вода. Ветви растений взвешивают и уравнивают путем подрезания так же, как и в предыдущих опытах. Сосуды изолируют фольгой чтобы не было испарения воды. Условия опыта и снятие результатов аналогичны опытам 1 и 2. Схема записи результатов Растение Состав соли % от контроля (100%) % соли в растворе 1 3 5 7 10 20 Ответить на следующие вопросы 1. Какая соль наиболее сильно влияет на поглощение растворов? 2. Какие растения поглощают растворы сильнее? 3. Какие растения имеют наименьшие повреждения от поглощения солевых растворов? 24 Работа № 9. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ К СЕРНИСТОМУ ГАЗУ (А), ХЛОРУ (Б) И АММИАКУ (В). ВЫЯВЛЕНИЕ БИОИНДИКАТОРОВ А. Определение устойчивости к сернистому газу Сернистый газ – самый распространенный загрязнитель воздуха. Он выделяется всеми энергетическими установками при сжигании органического топлива. Сернистый газ может также выделяться предприятиями металлургической промышленности (источник – коксующиеся угли), а также рядом химических производств (например, производство серной кислоты). Он образуется при разложении содержащих серу аминокислот, входивших в состав белков древних растений, образовавших залежи угля, нефти, горючих сланцев. Воздействие сернистого газа на растения приводит к резкому снижению фотосинтеза, повреждению листового аппарата, что выражается в появлении хлорозов, некрозов, резком подавлении роста. В данной работе ставится задача – выяснить сравнительную устойчивость древесных пород к сернистому газу и определить наиболее чувствительные биоиндикаторы. Может ставиться и более сложная задача – расчет ПДК для растений-биоиндикаторов. В литературе есть указания, что сернистый газ повреждает древесные растения уже в концентрации 0,05 мг/м3 (Николаевский, 1988). Для получения сернистого газа используется сульфит (Na2SO3) и серная кислота (Н2SO4). Реакция идет по следующему уравнению: Na2SO3+ Н2SO4 = SO2 + Na2SO4 + H2O. Согласно этому уравнению можно рассчитать навеску соли для получения того или иного количества сернистого газа с учетом объема колбы; однако это более трудная задача, которая может быть решена в ходе дипломных исследований. Оборудование, реактивы, материалы 1) колбы конические на 750 мл (камеры); 2) плотные пробки к ним; 3) пластилин; 4) небольшие одинаковые тигли; 5) длинные пробирки, достигающие дна колбы, или стеклянные трубки, у которых изолировано калькой одно отверстие; 6) мерные пробирки; 7) длинные пинцеты; 8) реактивы: Na2SO3, Н2SO4 (конц.); 9) листья древесных или комнатных растений с черешками. Ход работы В длинные пробирки насыпают равное количество сульфита. На пробирку надевают колбу донышком вверх так, чтобы пробирка касалась 25 дна. Затем колбу переворачивают и пробирку вынимают. На дне колбы остается небольшая горка сульфита. Рядом с сульфитом на дно осторожно устанавливают длинным пинцетом тигелек с серной кислотой. Берут пучок листьев (5-7 г) определенной древесной породы, черешки обвязывают ниткой, опускают в колбу таким образом, чтобы листья висели, не соприкасаясь с реактивами. Колбу закрывают пробкой так, чтобы нитка оказалась между пробкой и горлышком колбы. Пробка должна быть изолирована пластилином. Затем резким движением колбы опрокидывают тигелек с серной кислотой на сульфит, отмечая время начала химической реакции. Производят постоянные наблюдения за изменениями листьев растений. Через определенный срок (2-3 часа) растения вынимают и описывают все повреждения (хлорозы, некрозы, изменения растений после помещения их в воду). Устанавливают сравнительную устойчивость растений к сернистому газу, определяют наиболее чувствительные растения, которые могут быть биоиндикаторами. Б. Определение устойчивости к хлору Хлор выделяется рядом промышленных предприятий по производству моющих средств. В лабораторном опыте в качестве источника хлора используется HC1. Реакция идет по следующим уравнениям: 1) 2КМnO4 + 16HC1 = 5С12 + 2KCl + 2МnС12 + 8Н2O или 2) КСlO3 + 6HC1 = 3С12 + KCl + 3Н2O. Оборудование, закладка опыта, его проведение, снятие результатов аналогичны предыдущему, лишь используются другие реактивы: 2КМnO4 или КСlO3. В. Определение устойчивости к аммиаку Аммиак в небольших количествах присутствует в выбросах многих предприятий. В природной обстановке – это продукт распада органических веществ: он выделяется из почвы. Особенно большое количество аммиака образуется при распаде мочи животных в больших животноводческих комплексах, где собранная моча используется как эффективное азотное удобрение. Все такие комплексы должны иметь защитную зеленую полосу из древесных растений, которые должны быть устойчивы к аммиаку. Ход работы Комочек (0,7 см3) гигроскопической ваты увлажняют 5 %-ым аммиаком, опускают длинным пинцетом на дно конической колбы–камеры. Пучок листьев подготавливают и помещают в колбу методом, указанным в предыдущих опытах с газом. Колбу закрывают пробкой и герметично заделывают пластилином. Снятие результатов производится путем 26 постоянного наблюдения, а также после выемки растений через 2-3 часа в чашку Петри и описания всех повреждений. Устанавливают сравнительную устойчивость разных древесных пород к аммиаку. Выделяют растениябиоиндикаторы. 27 Работа № 10. ВЛИЯНИЕ СОЛЕЙ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА ПЛАЗМОЛИЗ ПРОТОПЛАЗМЫ РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ Соли тяжелых металлов в водной среде распадаются на ионы. Все ионы металлов могут быть разделены на две группы: биогенные (Сu, Zn, Со, Mn, Fе и др.) и небиогенные (Pb, Hg, Sn, Ni, Al, Cd, Sr, Cs и др.). Среди последней группы ионы стронция и цезия действуют как биогенные при замене в органических веществах кальция на стронций и калия на цезий. Биогенные ионы входят в состав ферментных систем, которые обеспечивают регуляцию всех процессов в клетке и организме. Поэтому их ПДК значительно выше, чем у небиогенных. При поступлении в растения воздушным (через устьица) или капельным (роса, туман, слабые осадки) путями определенная доза биогенных тяжелых металлов включается в состав ферментных систем, что стимулирует метаболические процессы. Так, медь входит в состав ферментов, участвующих в процессах темновых реакций фотосинтеза, способствует поглощению других элементов; цинк входит в состав ферментов, расщепляющих белки, увеличивает устойчивость растений к жаре, засухе, болезням. Лишь при более высоких концентрациях они действуют как токсиканты. На рис. 2 показано биологическое действие биогенной (Сu) и небиогенной (Cd) солей на живые тест-системы. В малых концентрациях Сu оказывает отрицательное влияние (недостаток микроэлементов). С повышением концентрации появляется стимулирующий эффект, который усиливается, достигая своего оптимума, а затем снижается и, переходя точку ПДК (стрелка), оказывает отрицательное действие. Cd ведет себя иначе. В очень малых концентрациях он оказывает нейтральный эффект, затем его токсическое действие усиливается, достигая точки ПДК (пунктирная стрелка), наступает перелом с усилением токсического эффекта. Целью работы является выявление действия биогенных и небиогенных тяжелых металлов на плазмолиз протоплазмы растительной клетки. Рис. 2. Схема биологического действия ионов меди (Сu2-) 28 и кадмия (Cd2-) (по Скурлатову с соавт., 1994) Оборудование, реактивы, материалы 1) микроскоп; 2) предметные и покровные стекла; 3) препаровальная игла; 4) бритвы; 5) пипетка на 1-3 мм; 6) стаканы с дистиллированной водой; 7) кусочки фильтровальной бумаги; 8) 5 %-ые растворы солей CuSO4. Pb(NO3)2, HgNO3 и др.; 9) луковица синего лука или фиолетовые листья традесканции. Ход работы С поверхности сильноокрашенной синей луковицы сделать несколько срезов эпидермиса, состоящего из 1-2 слоев окрашенных клеток, содержащих антоциан. Поместить срезы по отдельности и капли воды на предметные стекла, закрыть покровными стеклами и рассмотреть в микроскоп. Клетки с окрашенным клеточным соком зарисовать; найти и рассмотреть устьица. А. Определить начало и характер плазмолиза клетки под действием одинаковых концентраций биогенных и небиогенных солей. Для этого: заменить воду в препаратах 5 %-ым раствором CuSO4 на одном предметном стекле и таким же раствором Pb(NO3)2 на другом. Эта замена производится способом 4-5-кратного накалывания раствора соли с одной стороны покровного стекла и отсасывания кусочком фильтровальной бумаги с другой до полной замены воды раствором соли. Оставить клетки в растворе солей на 15 мин, когда плазмолиз будет хорошо заметен, рассмотреть в микроскоп. Зарисовать и сделать выводы относительно действия солей биогенных и небиогенных тяжелых металлов на характер плазмолиза клетки. Б. Выявить комплексное действие повышенной температуры и одной из наиболее токсичных солей. Для этого препараты, в которых вода заменена на раствор соли, выдерживают 10 мин на водяной бане при температуре 40 °С, а потом рассматривают в микроскоп и зарисовывают. При этом часто наблюдается усиление плазмолиза и почернение содержимого некоторых клеток. Очевидно, соли свинца при реакции с сероводородными группами белков дают этот черный цвет. Работа № 11. ВЛИЯНИЕ СОЛЕЙ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА КОАГУЛЯЦИЮ РАСТИТЕЛЬНЫХ БЕЛКОВ Работа наглядно показывает действие солей биогенных и небиогенных тяжелых металлов на животные и растительные белки, выявляет разницу в реакции тех и других. Белки с тяжелыми металлами образуют комплексы, нерастворимые в воде. 29 Оборудование, реактивы, материалы 1) пробирки – 16 шт.; 2) пузырьки из-под пенициллина – 8 шт.; 3) стаканчик – 1 шт.; 4) пипетка на 1 мл – 1 шт.; 5) пипетка аптечная – 2 шт.; 6) стеклограф; 7) фильтровальная бумага; 8) 5 %-й раствор CuSO4; 9) 5 %-ый раствор Pb(NO3)2; 10) дистиллированная вода; 11) животный белок (куриного яйца); 12) растительный белок (зернового гороха). Ход работы Приготовить в пузырьках от пенициллина серию растворов сульфата меди CuSO4 и нитрата свинца Pb(NO3)2 из исходного 5 %-го раствора (2,5 %; 1,25 %; 0,62 %). В 8 пробирок пипеткой внести по 1 мл животного белка, а в другие 8 – по 1 мл растительного белка (для обеих солей всего 8 растворов). В каждую пробирку добавить по 2 капли одного из указанных растворов испытуемой соли. Все пробирки пометить стеклографом. Рассмотреть характер коагуляции на темном фоне (кусочек черной бумаги, доска и др.). Схема записи результатов Название соли Концентрация раствора 5 % 2,5 % 1,25 % 0,62 % Определить концентрацию раствора соли, при которой происходит коагуляция белка (при разном виде солей и при разном типе белков). Ответить на следующие вопросы. 1. На какой из видов белков (животный или растительный) сильнее всего действует: a) CuSO4 и б) Pb(NO3)2? 2. Какая соль (свинца или меди) сильнее действует: а) на животный белок, б) на растительный белок. Почему? Приготовление растворов белков. А. У куриного яйца отделить белок в мерный стаканчик, размешать его стеклянной палочкой в дистиллированной воде в соотношении 1:10. Затем профильтровать. Б. Зерновой вызревший горох перемолоть в муку в кофемолке, развести в соотношении: 10 г гороховой муки на 50 мл 10 %-го раствора на NaCl или КCl. Профильтровать. 30 Работа № 12. ЗАГРЯЗНЕНИЕ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ НИТРАТАМИ И ИХ ОПРЕДЕЛЕНИЕ В РАЗЛИЧНЫХ ОВОЩНЫХ КУЛЬТУРАХ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВИДА, СОРТА, ОРГАНА, ТКАНИ Нитраты – неотъемлемая часть всех наземных и водных экосистем, поскольку процесс нитрификации, ведущий к образованию окисленных неорганических соединений азота, носит глобальный характер. В то же время, в связи с применением в больших масштабах азотных удобрений, поступление неорганических соединений азота в растения возрастает. Избыточное потребление азота удобрений не только ведет к аккумуляции нитратов в растениях, но и способствует загрязнению водоемов и грунтовых вод остатками удобрений, в результате чего территория загрязнения сельхозпродукции нитратами расширяется. Однако накопление нитратов в растениях может происходить не только от переизбытка азотных удобрений, но и при недостатке других их видов (фосфорных, калийных и др.) путем частичной замены недостающих ионов нитрат-ионами при минеральном питании, а также при снижении у ряда растений активности фермента нитратредуктазы, превращающего нитраты в белки. Ввиду этого наблюдается четкое различие видов и сортов растений по накоплению и содержанию нитратов. Существуют, например, виды овощных культур с большим и малым содержанием нитратов. Так, накопителями нитратов являются семейства тыквенных, капустных, сельдерейных. Наибольшее их количество содержится в листовых овощах: петрушке, укропе, сельдерее (табл. 1), наименьшее – в томатах, баклажанах, чесноке, зеленом горошке, винограде, яблоках и др. И между отдельными сортами существуют в этом отношении сильные различия. Так, сорта моркови «шантанэ», «пионер» отличаются низким содержанием нитратов, а «нантская», «лосиноостровская» – высоким. Зимние сорта капусты мало накапливают нитратов по сравнению с летними. Наибольшее количество нитратов содержится в сосущих и проводящих органах растений – корнях, стеблях, черешках и жилках листьев. Так, у капусты наружные листья кочана содержат в 2 раза больше нитратов, чем внутренние. А в жилке листа и кочерыжке содержание нитратов в 2-3 раза больше, чем в листовой пластинке. У кабачков, огурцов и т.п. плодов нитраты убывают от плодоножки к верхушке. В результате употребления продуктов, содержащих повышенное количество нитратов, человек может заболеть метгемоглобинией. При этом заболевании ион NO3 взаимодействует с гемоглобином крови, окисляя железо, входящее в гемоглобин, до трехвалентного, а образовавшийся в результате этого метгемоглобин не способен переносить кислород и человек испытывает кислородную недостаточность: задыхается при физических нагрузках. 31 Таблица 1 Содержание нитратов в сельскохозяйственной продукции и их допустимые уровни (мг/кг сырой массы по нитрат-иону)* Вид растения Арбузы Содержание нитратов 40-600 Баклажаны 80-270 Брюква 400-550 Допустимые уровни для для открытого закрытого грунта грунта 60 400 Горошек зеленый 20-80 Дыни 40-500 90 Капуста белокочанная 600-3000 900 Капуста кольраби 160-2700 400 Кабачки 400-700 400 Картофель 40-980 250 Кресс-салат 1300-4900 2000 3000 Лук зеленый 40-1400 600 800 Лук репчатый 60-900 80 Морковь 160-2200 400 Огурцы 80-560 150 400 Перец сладкий 40-330 200 400 Петрушка (зелень) 1700-2500 1800 Редька черная 1500-1800 1300 Редис 400-2700 1500 Репа 600-900 700 Салат 400-2900 2000 Свекла столовая 200-4500 1400 Томаты Укроп Фасоль 400 3000 10-180 150 300 400-2200 2000 3000 20-900 Чеснок 40-300 Шпинат 600-4000 Щавель 240-400 1200 * 1. Атлас распределения нитратов в растениях (Институт почвоведения и фотосинтеза РАН), Пущино, 1989; 2. Методические указания по определению нитратов в продукции растениеводства, утвержденные агропромом СССР за № 4228/86 от 24.11.86 и дополнения к ним. 32 В желудочно-кишечном тракте избыточное количество нитратов под действием микрофлоры кишечника превращается в токсичные нитриты, а далее возможно превращение их в нитрозоамины – сильные канцерогенные яды, вызывающие опухоли. В связи с этим при употреблении в пищу растений – накопителей нитратов важно нитраты разбавлять и употреблять в малых дозах. Содержание нитратов можно уменьшить вымачиванием, кипячением продуктов (если отвар не используется), удалением тех частей, которые содержат большое количество нитратов. Допустимые нормы нитратов (по данным ВОЗ) составляют 5 мг (по нитрат-иону) в сутки на 1 кг массы взрослого человека, т.е. при массе 50-60 кг – это 220-300 мг, а при 60-70 кг – 300-350 мг. В предлагаемой работе изложен метод определения нитратов у различных видов, сортов, тканей и частей овощной продукции, который основан на хорошо известной реакции нитрат-иона с дифениламином. При этом описываются два варианта: с использованием выжатого сока и целых растений. В конце работы кратко описан очень простой и быстрый метод количественного определения нитратов в овощах и фруктах при наличии ионо-селективного электрода на нитрат-ион и потенциометра (рН-метра). А. Определение нитратов в соке растений Оборудование, реактивы, материалы 1) ступки малые с пестиками; 2) предметные стекла; 3) марлевые салфетки; 4) мелкие емкости – пузырьки из-под пенициллина с пробками; 5) пипетки химические на 5 мл; 6) пипетки медицинские; 7) скальпели; 8) 1 %-ый раствор дифениламина в концентрированной серной кислоте; 9) исходный раствор NaNO3 для построения калибровочной кривой; 10) дистиллированная вода; 11) термостойкий химический стакан на 0,5-1 л для кипячения овощей; 12) электроплитка; 13) части различных овощей, содержащих наибольшее количество нитратов, с неокрашенным соком (капуста, огурцы, кабачки, картофель, дыня и др.). Ход работы За несколько дней до занятия студентам дается задание принести различные овощи, купленные в магазине или с собственного участка. Овощи следует вымыть и обсушить. В один из пузырьков наливают 10 мл исходного раствора NaNO3, соответствующего по концентрации максимальному содержанию нитратов в овощах (см. табл. 1) – 3000 мг на кг. Следует отметить, что в отдельных органах растений встречаются и значительно большие концентрации. 33 Готовят серию калибровочных растворов путем разбавления пополам предыдущего (например, к 3 мл исходного раствора прибавляется 3 мл дистиллированной воды, взбалтывается и т.д.) Получают серию растворов с разным содержанием нитратов: 3000, 1500, 750, 375, 188, 94, 47, 23 мг/кг. Под предметное стекло подкладывается лист белой бумаги, на стекло капают две капли изучаемого раствора и две такие же капли дифениламина в трехкратной повторности. Описывают реакцию согласно следующей градации, которую можно использовать как для калибровочных растворов, так и для двух типов анализов (по Церлинг, 1965). Баллы 6 Содержание нитратов, мг/кг Сок или срез окрашиваются быстро и интенсивно в >3000 иссиня-черный цвет. Окраска устойчива и не пропадает Характер окраски Сок или срез окрашиваются в темно-синий цвет. Окраска сохраняется некоторое время Сок или срез окрашиваются в синий цвет. Окраска наступает не сразу Окраска светло-синяя, исчезает через 2-3 минуты 3000 2 Окраска быстро исчезает, образом проводящие пучки 250 1 Следы голубой, быстро исчезающей окраски 0 Нет ни голубой, ни синей окраски. На целых растениях возможно порозовение 5 4 3 окрашиваются главным 1000 500 100 0 Следует отметить, что основой для определения содержания нитратов в соке должны быть собственные исследования, а не вышеприведенная таблица, т.к. окраска может варьироваться в зависимости от качества реактивов, срока их годности, температуры в помещении и др. Овощи и плоды расчленяют на части: зона, примыкающая к плодоножке, кожура, периферийная часть, серединная часть, кочерыжка (у капусты), жилки, лист без жилок. Вырезанные части мелко режут ножом и быстро растирают в ступке, сок отжимают через 2-3 слоя марли. 2 капли сока капают на чистое предметное стекло, положенное на белую бумагу, добавляют 2 капли дифениламина. Быстро описывают все наблюдаемые реакции согласно схеме. Повторность опыта 3-кратная. В случае сомнений в содержании нитратов в той или иной части овощной продукции капают рядом калибровочный раствор с известной концентрацией вещества и повторяют реакцию с дифениламином. Анализ начинают с сока капусты и картофеля, затем помещают эти овощи в термостойкий химический стакан с кипящей дистиллированной водой и кипятят 10-15 мин, после чего анализируют и отварные овощи, и отвар. За время варки делают анализ различных частей других овощей и 34 плодов (не менее четырех видов за занятие). Записывают в общую таблицу на доске и в частную – в тетради. Схема записи Содержание нитратов в различных овощах и плодах Исследуемое растение Часть Картофель свежий а) под кожурой б) серединная часть Картофель отварной те же части Капуста а) жилки б) кочерыжка в) лист Капуста отварная те же части Баллы Содержание нитратов в мг/кг - Отвар Б. Определение нитратов в целых растениях Отрезают у свежих растений части в виде толстых срезов: куски стеблей, черешков, плодов. Кладут их на полоску восковой бумаги. Капают на различные части среза по несколько капель 1 %-го раствора дифениламина в серной кислоте, отмечают окрашивание согласно вышеприведенной шкале. При этом в случае малых концентраций нитратов в продукции и при отсутствии синей окраски может наступить порозовение ткани, вследствие её обугливания от H2SO4 в реактиве дифениламина. Указанный метод дает возможность оценить и сравнить разные ткани овощных и других растений прямо в поле. Он проверен и хорошо действует на хлебных злаках, картофеле, корнеплодах, овощах, бобовых, многолетних травах для оценки обеспеченности различных сельхозкультур азотом. Показано, что нитраты исчезают в фазе цветения, но их много в период вегетационного роста, который и должен быть использован для оценки. Нитраты сразу утилизируются (не проявляются в анализах) в меристимах и почках, бутонах и цветках различных сельхозкультур. В. Определение нитратов методом ионоселективных электродов На 10 г свежеразмолотых плодов или овощей наливают 50 мл 1 %-го раствора алюмокалиевых квасцов. Анализ проводят в стаканчиках на 100 мл, взбалтывают 3-5 мин. Определяют ионоселективными электродами на нитратион с использованием потенциометра (рН-метра). Калибровку делают по KNO3. Приготовление реактивов 35 1. 1 %-ый раствор дифениламина в серной кислоте 1 г дифениламина растворяют в 99 г концентрированной серной кислоты (плотностью 1,84). Это соответствует приблизительно 54 мл Н2SO4. Расчет: m m ; V = 53,8мл, V где – плотность, m – масса, V – объем. 2. Исходный раствор NaNO3 для построения калибровочной кривой. Если растворить 1 г NaNO3 в 1 л воды, то это будет соответствовать 729 мг/кг нитратов (по нитрат-иону): 85 – 1000 мг (1 г) 62 – Х 62 1000 X= = 729 мг/кг , 85 где 85 – молекулярный вес NaNO3, 62 – молекулярный вес нитрат-иона (NO3-). Однако, согласно табл. 1, наибольшее содержание нитратов в распространенных видах овощей – 3000 мг/кг. 729 – 1000 мг (1 г) 3000 – X 3000 1000 Х= = 4,11 г, 729 то есть надо растворить 4,11 г соли в литре дистиллированной воды. Однако при небольшом количестве анализов в учебных целях достаточно и 100 мл, то есть 411 г NaNO3 нужно растворить в100 мл воды. Работа № 13. УМЕНЬШЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ХЛОРОФИЛЛА В ЛИСТЬЯХ РАСТЕНИЙ – БИОИНДИКАЦИОННЫЙ ПРИЗНАК НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ УСЛОВИЙ СРЕДЫ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХЛОРОФИЛЛА ФОТОМЕТРИЧЕСКИ Сведения относительно использования содержания хлорофилла (и других пигментов) как биоиндикационных признаков в литературе противоречивы. Ряд немецких ученых считает этот признак недостаточно информативным и специфичным (Биоиндикация загрязнений… 1988), хотя первой стадией видимых хлорозов листьев как раз и является разрушение 36 хлорофилла под влиянием неблагоприятных факторов. В то же время другие исследователи, в том числе русские и украинские, показали, что у чувствительных к загрязнению видов (липы, клена) наблюдается снижение содержания хлорофилла еще до появления видимых изменений и это может служить достаточно надежным неспецифическим биоиндикационным признаком. Неспецифичность этого индикатора в том, что недостаток в почве азота, а также железа и других элементов, быстро сказывается на окраске листьев в результате разрушения хлорофилла в них и, этот признак очень часто используется для оценки низкого плодородия почв. Это надо учитывать и использовать этот показатель при биоиндикации в сочетании с другими признаками. По нашим данным, для оценки степени загрязнения наземных экосистем или их составляющих листья следует собирать из средней части кроны в первой половине вегетации, учитывая условия произрастания (освещенность, минеральное питание, обводненность и др.). В качестве биоиндикаторов в городской среде рекомендуется использовать следующие газочувствительные виды: липу мелколистную, клен платанолистый, каштан конский, ель обыкновенную, сосну обыкновенную. Метод основан на извлечении хлорофилла из листьев растворителями (спирт, ацетон) и определении его количества на фото-элекроколориметре или спектрофотометре. Оборудование, реактивы, материалы 1) торзионные весы; 2) фотоэлектроколориметр – ФЭК; 3) насос Камовского или электрический; 4) колба Бунзена с пробкой и стеклянным фильтром № 2, № 3; 5) ступки малые с пестиками; 6) стеклянные палочки; 7) ножницы; 8) толченое и просеянное стекло; 9) мерные колбы на 100 и 50 мл; 10) калька; 11) вазелин; 12) фильтровальная бумага; 13) медный купорос CuSO4 • 5Н2О; 14) биохромат калия К2Сr2О7, 15) 7 %-ый раствор аммиака; 16) листья растений-индикаторов, собранные в «загрязненной» и «чистой» зонах. Для учебной работы можно использовать и комнатные растения, выращенные специально в сосудах на гумусной почве с поливом водой и на малоплодородной почве с поливом раствором соли какого-либо тяжелого металла. P.S. В случае отсутствия колбы Бунзена, стеклянных фильтров и насоса, их можно заменить центрифугированием вытяжки хлорофилла. Ход работы 37 Определение хлорофилла в листьях можно проводить как на свежем, так и на фиксированном материале. Фиксацию осуществляют текучим паром (5 мин) или сухим жаром (при 105 °С в течение 5-10 мин). Т.Н. Годнен (1963) предложил следующий способ фиксации для сохранения хлорофилла: листья нарезают мелкими кусочками, заворачивают в марлю и погружают в кипящий насыщенный раствор поваренной соли на 1-2 минуты. За это время материал обезвоживается и ферменты убиваются. Затем материал промывают проточной водой в течение 0,5 минуты, встряхивают для удаления влаги. Высушивают в тени не менее 2-х суток или в термостате при температуре не выше 40 °С. Н.А. Шлык (1971) считал, что лучшие результаты дает сочетание фиксации материала горячим паром (2 мин) с проведением быстрой экстракции на холоде. При работе с сухим материалом берут навеску 0,5-1 г, со свежим – 1-2 г. Предварительно определяют влажность листьев. Навеску растительного материала (исключая жилки) тщательно измельчают в фарфоровой ступке с битым стеклом, добавляя мел или углекислый магний. Извлечение хлорофилла из сухого материала можно производить 90 %-ым спиртом или 80-85 %-ым ацетоном, а из свежего – 96-98 %-ым спиртом или абсолютным ацетоном. К растертому растительному материалу прибавляют немного растворителя и материал продолжают растирать вместе с растворителем. В колбе Бунзена в отверстии пробки закрепляют стеклянный фильтр № 2 или № 3 (диаметр фильтра должен соответствовать количеству исследуемого материала). Колбу соединяют с насосом и производят отсасывание жидкости. Жидкость из ступки сливают по стеклянной палочке в воронку-фильтр, предварительно смазав вазелином снаружи носик ступки. В ступку приливают 4-5 мл растворителя и вновь растирают в течение минуты, затем опять сливают в воронку. Эту манипуляцию повторяют 2-3 раза, затем переносят на фильтр всю растертую массу, уплотняют ее палочкой и отсасывают. Ступку ополаскивают несколько раз растворителем, выливая его на уплотненный материал в воронку, где ему дают постоять 2-3 минуты, после чего отсасывают. Промывание ведут до тех пор, пока стекающий раствор не станет бесцветным. Затем экстракт переносят в мерную колбу на 50 мл, ополаскивая несколько раз Бунзеновскую колбу и выливая в мерную. Вытяжку доводят до черты растворителем. Колориметрирование раствора производят на фотоэлектроколориметре с красным светофильтром. Если жидкость окрашена в интенсивно зеленый цвет, ее необходимо разбавить, так как при больших концентрациях величины на ФЭКе могут выходить за пределы разрешающей способности прибора. Для пересчета хлорофилла на стандартные величины используют раствор Гетри, который готовится следующим образом: 1) 1 %-ый раствор CuSO4 • 5Н2О (берут только синие кристаллы), 2) 2 %-ый раствор К2Сr2О7, 3) 7 %-ый раствор аммиака (на 7 мл 18 %-го аммиака надо взять 11 мл воды). 38 Для изготовления стандарта в мерную колбу емкостью 100 мл точно отмеривают растворы (CuSO4 • 5Н2О – 28,5 мл, К2Сr2О7 – 50 мл, NH4ОH – 10 мл), доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Раствор Гетри по окраске колориметрически эквивалентен раствору кристаллического хлорофилла по содержанию последнего 85 г в литре. Методом разбавления стандартного раствора строят калибровочную кривую, где по оси абсцисс откладывают содержание хлорофилла (мг/л), а по оси ординат – оптическую плотность. Калибровочную кривую строят от концентрации 0,085 мг/л (1 мл исходного раствора и 99 мл воды) до 7,65 мг/л (90 мл исходного раствора и 10 мл воды). Измерения на ФЭКе производят несколько раз, затем вычисляют среднее. По полученным данным определяют концентрации хлорофилла в опытных образцах по калибровочной кривой. Затем вычисляют количество хлорофилла в мг/г листа (по сырой или сухой массе). В насаждениях сосны оно колеблется от 0,08 до 0,14 мг/г. Можно также выразить количество хлорофилла в процентах (0,3-1,3 % абсолютно сухой массы листа). Схема записи результатов анализов Опыт Навеска, мг Объем Показавытяжки, ния ФЭКа мл Количество хлорофилла по калибровочной кривой мг/50 мл Содержание хлорофилла в листьях мг/г % 39 Литература 1. Практикум по физиологии растений / Под ред. И.И. Гунара. – М.: Колос, 1972. 2. Клейн Р.М., Клейн Д.Т. Методы исследования растений. – М.: Колос, 1974. 3. Фёдорова А.И. и др. Практикум по экологии и охраны окружающей среды. – М.: Гуманит. изд. центр Владос, 2001. 4. Биохимические методы. – М.: Наука, 1980. 40 СОДЕРЖАНИЕ Введение …………………………………………………………….. Работа № 1. Определение образования органического вещества в листьях растений в процессе фотосинтеза (по содержанию углерода) ……………………………………………………………. Работа № 2. Определение накопления органического вещества в биомассе растений и в почве ……………………………………….. Работа № 3. Определение расхода органического вещества растениями при дыхании …………………………………………… Работа № 4. Определение устойчивости растений к высоким температурам ………………………………………………………... Работа № 5. Определение температурного порога коагуляции белков цитоплазмы клеток разных растений ……………………… Работа № 6. Определение устойчивости клеток различных растений к обезвоживанию …………………………………………. Работа № 7. Влияние низких температур на коагуляцию белков у растений ……………………………………………………………… Работа № 8. Определение устойчивости растений к засолению почвы и воздуха …………………………………………………… Работа № 9. Определение устойчивости растений к сернистому газу (А), хлору (Б) и аммиаку (В). Выявление биоиндикаторов … Работа № 10. Влияние солей тяжелых металлов на плазмолиз протоплазмы растительной клетки ………………………………… Работа № 11. Влияние солей тяжелых металлов на коагуляцию растительных белков ……………………………………………….. Работа № 12. Загрязнение пищевых продуктов нитратами и их определение в различных овощных культурах в зависимости от вида, сорта, органа, ткани ………………………………………….. Работа №13. Уменьшение содержания хлорофилла в листьях растений – биоиндикационный признак неблагоприятных условий среды. Определение хлорофилла фотометрически ………….. Литература …………………………………………………………... 3 4 7 10 13 14 16 17 19 22 24 25 27 32 36 41 УЧЕБНОЕ ИЗДАНИЕ Слонов Людин Хачимович ЭКОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ И ФОТОСИНТЕЗ Методические указания к лабораторным занятиям Для специальности 020201 – Биология Редактор Л.З. Кулова Компьютерная верстка Е.Л. Шериевой Корректор Е.Г. Скачкова В печать 20.05.2009. Формат 60х84 1/16. Печать трафаретная. Бумага офсетная. 2.32 усл.п.л. 2.0 уч.-изд.л. Тираж 100 экз. Заказ № Кабардино-Балкарский государственный университет. 360004, г. Нальчик, ул. Чернышевского, 173 Полиграфический участок ИПЦ КБГУ 360004, г. Нальчик, ул. Чернышевского, 173. 42
