ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОГО ВОЗРАСТА ПРОГЕРИЙНЫХ БОЛЬНЫХ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОГО ВОЗРАСТА ПРОГЕРИЙНЫХ БОЛЬНЫХ
ПО УРОВНЮ ТРАНСЛОКАЦИЙ, ВЫЯВЛЯЕМЫХ FISH МЕТОДОМ В
КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ЛИМФОЦИТАХ КРОВИ
И. Е. Воробцова¹, В .М. Михельсон²
¹ Федеральное государственное учреждение Центральный научно-исследовательский
рентгенорадиологический институт Росздрава, Санкт-Петербург, 197758
и ² Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, 194064
Частота стабильных хромосомных аберраций (СХА), определяемых методом
флуоресцентной гибридизации in situ в лимфоцитах здоровых доноров, увеличивается с
возрастом. У лиц, подвергшихся воздействию малых доз ионизирующей радиации
(ликвидаторы последствий аварии на ЧАЭС, участники испытания ядерного оружия и
др.), процесс накопления СХА ускорен. При наследственной форме преждевременного
старения – синдроме Вернера уровень СХА в лимфоцитах двух больных календарного
возраста 26 и 30 лет соответствовал возрасту, оцененному по кривой возраст-эффект для
здоровых доноров 56±4лет и 48±4 лет соответственно. Таким образом, частоту СХА в
лимфоцитах крови человека можно рассматривать в качестве показателя биологического
возраста у облученных людей и лиц, страдающих одной из форм преждевременного
старения – синдромом Вернера.
Человек, лимфоциты, стабильные хромосомные аберрации, низкодозное облучение,
прогерия Вернера.
Введение
Частота стабильных хромосомных аберраций (СХА), т.е. аберраций, не
препятствующих прохождению митоза и сохраняющихся в ряду клеточных поколений,
рассматривается как объективный показатель биологического возраста человека [1, 2].
Возможно, и само накопление СХА играет определенную роль в развитии процессов
старения [12]. В настоящей работе исследовалась возрастная динамика накопления
транслокаций, являющихся СХА, в лимфоцитах периферической крови человека в норме,
у лиц, подвергавшихся неконтролируемому воздействию небольших доз ионизирующей
радиации (ликвидаторы аварии на Чернобыльской АЭС, участники испытаний ядерного
оружия, и др.), а также при одной из форм наследственного преждевременного старения –
синдроме Вернера.
Материал и методики
В работе использованы краткосрочные культуры лимфоцитов периферической
крови 150 здоровых доноров в возрасте от 3 до 85 лет и 110 лиц от 8 до 85 лет,
подвергавшихся в разные сроки до взятия крови облучению относительно небольшими
(неконтролируемыми) дозами ионизирующей радиации при Чернобыльской аварии в
1986-88 гг., при испытаниях ядерного оружия на Семипалатинском полигоне в 1960-е гг. и
на предприятии «Маяк» на Южном Урале в 1950-е гг. Исследовали также двух больных с
наследственной формой преждевременного старения – синдромом Вернера. Больной А.Г.
– мужчина в возрасте 26 лет и больная Л.Ф., женщина в возрасте 30 лет имели внешние
признаки ускоренного старения. Больной А.Г. был обследован ранее клиническими,
цитологическими и молекулярно-биохимическими методами для уточнения диагноза [4],
больная Л.Ф. имела верифицированный диагноз синдрома Вернера.
2
Частоту СХА определяли методом флуоресцентной гибридизации in situ – FISHметодом [6, 10]. Использовали биотинилированные ДНК-зонды, специфичные к цельным
хромосомам человека 1, 4 и 12, а также меченные дигоксигенином ДНК-зонды к
центромерным участкам хромосом. Хромосомы-мишени окрашивали конъюгатом
стрептавидин-флуоресцеин-изотиоцианата (FITC), усиливая окраску последовательными
сменами FITC и биотинилированного антистрептавидина. Для контрастирования
использовали пропидиум иодид (PI) в растворе, предотвращающем быстрое выцветание
препарата при микроскопировании в УФ лучах. Панцентромерные зонды выявляли с
помощью последовательной обработки препаратов мышиными антидигоксигениновыми
антителами, крысиным антимышиным IgG, меченным метил-курамин-3-уксусной
кислотой (AMCA), и мышиным антикрысиным IgG, меченым АМСА. Анализ препаратов
проводили на флуоресцентном микроскопе Axioplan (Carl Zeiss, Германия) с набором
фильтров, позволяющим одновременно выявлять флуоресценцию FITC и PI, а также FITC
и АМСА, либо только PI-флуоресценцию. В результата гибридизации гомологичные пары
хромосом 1, 4 и 12 выглядели на препаратах желтыми на фоне остальных красных
хромосом, окрашенных PI. Центромерные участки всех хромосом окрашивались в
голубой цвет. Обмен участками регистрировали по появлению двухцветных структур:
транслокаций, инсерций и дицентриков, различающихся по числу голубых центромерных
участков; ацентрические фрагменты не содержали голубой окраски. Поскольку при FISHанализе регистрируется лишь часть обменных событий, для сопоставления зависимостей
возраст – эффект для транслокаций, выявляемых этим методом, производили перерасчет
наблюдаемой частоты обменных аберраций с участием хромосом-мишеней на геномную
частоту (Fg), для чего наблюдаемое количество транслокаций относили к «клеточному
эквиваленту», рассчитываемому по формуле Лукаса [7]: N ·2fp(1-f p), где N – число
проанализированных клеток, f p – доля ДНК генома, которую покрывают хромосомымишени [8]. При этом исходили из того, что участие каждой хромосомы в обменах
случайно и пропорционально содержанию в ней ДНК. Статистический анализ полученных
данных проводили на компьютере с помощью статистических пакетов с использованием
дисперсионного и регрессионного анализов.
Результаты и обсуждение.
В клетках здоровых доноров частота СХА, выявляемых FISH-методом,
увеличивалась с возрастом (табл.1).
Аналогичная возрастная динамика частоты СХА наблюдалась и в лимфоцитах лиц,
подвергавшихся в прошлом (от 15 до 40 лет назад) неконтролируемому действию
ионизирующей радиации (табл.2).
Видно, что во всех возрастных группах облучавшихся в прошлом лиц частота СХА
достоверно выше, чем в соответствующих контрольных (не облучавшихся) группах.
Регрессионный анализ полученных данных методом наименьших квадратов показал, что
динамика возрастного накопления СХА удовлетворительно описывается квадратичной
функцией и имеет следующий вид:
для контрольной выборки – y = (0.23±0.04)+(0.31±0.04)*10^-3х^2;
для облученной выборки – y = (0.42±0.11)+(0.51±0.06)*10^-3х^2,
где у – геномная частота СХА в процентах, х – возраст донора в годах. Квадратичный
характер зависимости частоты СХА от возраста свидетельствует о том, что хромосомные
повреждения, в том числе и индуцируемые радиационным воздействием, не просто
накапливаются с возрастом, ибо в этом случае зависимость должна была быть линейной.
По-видимому, с возрастом происходит прогрессирующее снижение стабильности
хромосомного аппарата, а предшествующее облучение ускоряет этот процесс. Медико-
Таблица 1. Возрастная динамика СХА в лимфоцитах здоровых доноров.
Возраст, лет
Количество
Количество клеток
обследованных
Количество СХА
Геномная частота
СХА,%
0-19
20-29
30-39
40-49
50-59
60-85
11
115
146
196
174
118
0.15±0.05
0.43±0.04
0.75±0.06
0.89±0.06
1.09±0.08
1.53±0.14
18
38
29
28
24
13
7296
26780
19463
21959
16024
7695
Таблица 2. Возрастная динамика СХА в лимфоцитах людей, подвергшихся неконтролируемому облучению в малых дозах.
Возраст, лет
Количество
Количество клеток
Геномная частота
Отличие от контроля
обследованных
СХА,%
0-19
20-29
30-39
40-49
50-59
60-76
6
38
29
28
24
13
1923
26780
19463
21959
16024
7695
0.65±0.16
0.80±0.08
1.00±0.08
1.44±0.12
1.72±0.25
2.85±0.31
р<0.05
р<0.05
р<0.05
р<0.05
р<0.05
р<0.05
биологические данные, полученные на ликвидаторах последствий аварии на ЧАЭС,
свидетельствуют о том, что у них раньше, чем в среднем по популяции, возникают
тклонения в состоянии здоровья, рассматриваемые как старческие – атеросклероз, болезни
опорно-двигательного аппарата, аутоиммунные заболевания и др. [3, 5]. Если, как следует
из представленных результатов по контрольной выборке, частота СХА является
показателем биологического возраста, то можно также прийти к выводу о том, что
облучённые люди одинакового с необлучёнными календарного возраста, оказываются
«старше». В литературе имеется лишь несколько публикаций по возрастной зависимости
частоты СХА, выявляемых FISH-анализом, в ходе естественного старения [9, 11]. Эти
работы были выполнены на меньших по величине выборках и в более узком возрастном
диапазоне.
Если частота СХА увеличивается с возрастом, логично было предположить, что она
будет повышена у людей с синдромами наследственного преждевременного старения.
Результаты, полученные на лимфоцитах больных прогерией Вернера представлены в
табл.3. Частота СХА в лимфоцитах 28-летнего больного А.Г. с синдромом Вернера,
оцененная по контрольной кривой возраст-эффект, соответствует возрасту 56±4 года. В
клетках иммортализованной лимфобластоидной линии, полученной от 30-летней больной
Л.Ф. с тем же синдромом, но более легким течением, частота СХА соответствует возрасту
48±4 года.
Таким образом, частота СХА в лимфоцитах человека может использоваться в
качестве показателя биологического, а не календарного, возраста в случаях ускоренного
старения, вызываемого экзогенными (облучение) и наследственными (прогерия)
факторами.
Таблица 3. Частота СХА при различных синдромах наследственного преждевременного старения.
Форма прогерии
Хромосомы-мишени
Количество клеток
Количество клеточных
эквивалентов
Синдром Вернера (А.Г.)
1, 4, 12
2342
637
Синдром Вернера (Л.Ф.) 1, 4, 12
2061
639
СХА, %
1.88±0.54
0.94±0.38
Литература
1.
Воробцова И.Е., Тимофеева Н.М., Богомазова А.Н., Семенов А.В.
Возрастная зависимость частоты стабильных хромосомных аберраций, определяемых
методом FISH, в лимфоцитах здоровых доноров и лиц, подвергшихся неконтролируемому
облучению в малых дозах // Успехи геронтологии. 1999. Т. 3. С. 88-93.
2.
Воробцова И.Е., Такер Дж.Д., Тимофеева Н.М. и др. Влияние возраста и
облучения на частоту транслокаций и дицентриков, определяемых методом FISH в
лимфоцитах человека // Радиационная биология, радиоэкология. 2000. Т. 40. № 2. С. 142148.
3.
Заманова Л.В. Организационно-методические основы мониторинга за
состоянием здоровья участников ликвидации последствий аварии на Чернобыльской
атомной электростанции в условиях мегаполиса // Автореф. дис. канд. мед. наук. СПб.
1999. 22 стр.
4.
Ковина М.В., Хавинсон В.Х., Стрекалов Д.Л. и др. Цитологические и
молекулярные изменения при нетипичном случае ускоренного старения человека //
Цитология. 2002. Т. 44. № 10. С. 930-935.
5.
Никифорова И.Д., Шантырь И.И., Тютин Л.А. и др. Заболеваемость
костно-мышечной системы и минеральная плотность костной ткани у ликвидаторов
аварии на Чернобыльской АЭС // Медицинская радиология и радиационная безопасность.
2000. Т. 45. № 6. С. 14-20.
6.
Bauchinger M., Schmid E., Zitzelsberger H. et al. Radiation-induced
chromosome aberrations analysed by two-color fluorescence in situ hubridisation with composite
whole chromosome-specific DNA probes and a pancentromeric DNA probe // Int.J.Radiat.Biol.
1993. V. 64. P. 179-184.
7.
Lucas J.N., Awa A., Straume T. et al. Rapid translocation frequency analysis in
humans decades after exposure to ionizing radiation // Int.J.Radiat.Biol. 1992. V. 62. P. 53-63.
8.
Mendelsohn M.L., Mayall B.H., Bogart E. et al. DNA content and DNA-based
centromeric index of the 24 human chromosomes // Science. 1973. V. 179. P. 1126-1129.
9.
Ramsey M.J., Moore II D.H., Briner J.F. et al. The effects of age and lifestyle
factors on the accumulation of cytogenetic damage as measured by chromosome painting //
Mutat. Res. 1995. V. 338. P. 95-106.
10.
Schmid E., Zitzelsberger H., Braselmann et al. Radiation-induced chromosome
aberrations analysed by fluorescence in situ Hybridisation with a triple combination of
composite whole chromosome-specific DNA probes // Int.J.Radiat.Biol. 1992. V. 62. P. 673678.
11.
Tucker J.D., Lee D.A., Ramsey M.J. On the frequency of chromosome
exchanges in a control population measured by chromosome painting // Mutat. Res. 1994. V.
313. P. 193-202.
12.
Tucker J.D., Preston. Chromosome aberrations, micronuclei, aneuploidy, sister
chromatid exchanges, and cancer risk assessment // Mutat.Res. 1996. V. 365. P. 147-159.
Ирина Евгеньевна Воробцова
Служебный адрес: 197758, г. Санкт-Петербург, Песочная-2, ул. Ленинградская, д. 70/4
Домашний адрес: 194223, г. Санкт-Петербург, пр. Мориса Тореза, д.35, к.1, кв.191
Телефон служебный: (812)5968779
Факс: (812)5968779
E-mail: radgen@IV9171.spb.edu
Виктор Михайлович Михельсон
Служебный адрес: 194064, г. Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4
Домашний адрес: 191002, г. Санкт-Петербург, наб. Фонтанки, д.64, кв.4
Телефон служебный: (812)2471213
Факс: (812)2471213
E-mail: mikhels@mail.cytspb.rssi.ru
Автор, с которым будет вестись переписка – Ирина Евгеньевна Воробцова