Возможность использования планарий Schmidtea mediterranea и

Возможность использования планарий Schmidtea mediterranea и
Girardia tigrina в качестве модельных объектов для изучения влияния
различных веществ на организм человека.
Ежегодно
при
разработке
новых
лекарственных
препаратов
используется огромное количество позвоночных животных. Эксперименты
на них необходимы при тестировании влияния этих препаратов на организм
человека. В то же время остро стоит вопрос о гуманном отношении к
животным, в том числе и к подопытным. В Европе с каждым годом
запрещается всё больше тестов, проводимых на лабораторных животных.
Налицо противоречие: без исследования на высших животных обойтись
нельзя и в тоже время требуется снизить отрицательную составляющую
работы экспериментаторов с точки зрения биоэтики. Кроме того содержание
экспериментальных млекопитающих и работы с ними очень дорогостоящи и
занимают в затратах на разработку новых лекарственных средств около 10%.
В этих условиях актуальной проблемой является поиск адекватной
биологической модели среди низших животных. Многие исследователи
считают, что пресноводные плоские черви планарии по многим параметрам
могут
соответствовать
современным
требованиям
экспериментальной
биологии к модельному организму (10, 13, 14). Эти животные обладают
уникальной высокой способностью к регенерации с помощью стволовых
клеток – необластов (13, 14, 15). Следовательно на них можно изучать
стволовые клетки (их процентное содержание в организме планарий очень
велико), тканевой гамеостаз, механизмы регуляции пролиферации и
дифференцировки клеток организма, и механизмы возникновения раковых
опухолей (некоторые исследования показали, что возникновение рака
связано с нарушением деления стволовых клеток) (13, 15). Начальные этапы
репаративной регенерации планарий разворачиваются так же, как у
позвоночных животных и у человека (рис. 1). В дополнение к выше
перечисленному секвенирование геномов Schmidtea miditerranea и Girardia
Tigrina показало, что белки, играющие ключевую роль в регуляции
Последовательность событий
при репарации у человека:
-травма;
-воспаление и фагоцитоз повреждённых элементов;
-активация клеточного материала для регенерации;
-миграция дедифференцированных эпителиальных
клеток на поверхность грануляции;
-мобилизация внеклеточного матрикса в качестве
субстрата для регенерации;
-рост числа клеток, непосредственно участвующих в
регенерации;
-дифференцировка регенерирующей ткани;
-морфогенез.
Рисунок 1.
процессов пролиферации и дифференцировки клеток, морфогенеза, имеют
высокую степень гомологии с аналогичными белками у высших животных и
человека
(64%
генома
планарий
гомологичны
геному
позвоночных
животных, и только 36% геному беспозвоночных; все 116 генов,
кодирующих нервную систему планарий представлены у человека). (10, 11).
Очень ценно, что планарии восстанавливают и свою нервную систему, что
может позволить изучать влияние разных факторов на процессы, связанные с
восстановлением нервной ткани (7, 14, 16). Интерес к планариям связан
также с высокой экономичностью работ с ними и получением результатов в
более короткие сроки. Однако вопрос адекватности и возможности
экстраполяции получаемых на уровне планарий биологических эффектов на
сходные процессы у высших животных и человека требует разноплановых
экспериментальных доказательств.
Для получения этих доказательств мы решили выяснить, будет ли
ускоряться регенерация у планарий в ответ на введение в среду
культивирования
веществ,
физиологических
или
прописываемых
восстановительных
людям
для
ускорения
регенеративных
процессов.
Наличие корреляции между реакцией планарий на данные вещества и
ускорением регенерации у человека (9) даст возможность сделать вывод
(конечно очень предварительный) о сопоставимости физиологической
реакции на различные вещества у планарий и у человека.
Целью нашей работы было выяснение и сравнение возможности
использования планарий двух видов Schmidtea mediterranea и Girardia tigrina
в качестве модельных тест-системы для изучения влияния различных
факторов на организм человека. В связи с этим нашей задачей стало
изучение и сравнение зависимости скорости регенерации головной части
после её удаления у данных двух видов планарий
от препаратов,
используемых для ускорения восстановительных процессов в организме
человека, при добавлении их в среду культивирования планарий.
Объекты и методы исследования
На предварительном этапе нами были освоены следующие методики:
- культивирование планарий в лабораторных условиях: температурный
режим, состав воды, кормление;
- определение физиологической концентрации действующих веществ,
оказывающих влияние на скорость регенерации головной части планарий;
- работа с программами Plana 4.4 и Adobe Photoshop CS5 для
проведения прижизненной морфометрии регенерирующих планарий;
- работа с программой SigmaPlot v11.2 для статистической обработки
результатов;
- фотографирование и съёмка видеофрагментов с использованием
цифрового окуляра DCM130 для бинокулярного микроскопа и цифрового
зеркального фотоаппарата Canon EOS 50D с макро объективом.
Исследование проводилось на бесполых расах двух видов пресно-водных
плоских червей - планарий - Girardia tigrina и Shmidtea mediterranea
(Platyhelmintes, Tricladida). Планарий содержали в минеральной воде из
французских Альп “Evian” с общей минерализацией 300мг/л при комнатной
температуре и кормили 2 раза в неделю живыми науплиусами artemia. Для
экспериментов отбирали животных длиной около 8 - 10 мм и прекращали их
кормление за 7 суток до опытов. Регенерация вызывалась ампутацией 1/5
части тела планарий, содержащей головной ганглий, в области
непосредственно за аурикулами («ушами»). Регенерирующие планарии
помещались в стерильные одноразовые пластиковые чашки Петри или
планшеты (по 1 в чашку или лунку), содержащие по 10 мл минеральной воды
(в контрольных повторностях) или по 10 мл минеральной воды плюс
исследуемые вещества в концентрациях от 10-3 до 10-6 г/л для
«Мильгаммы», витаминов С, В1, В6 и В12 и разведение от10-5 до 10-7
стоковых растворов алоэ, прополиса, мумиё, зверобоя.
Для оценки динамики роста регенерационной почки (бластемы) в
экспериментальных
и
контрольных
животных
использовали
метод
прижизненной морфометрии (6).
В основе метода использованы следующие особенности биологии и
морфогенеза планарий:
1) сохранение у регенерантов способности к достаточно длительному
однонаправленному движению в горизонтальной плоскости, что важно для
получения стандартных изображений в проекции сверху;
2) отсутствие на поверхности бластемы пигментного эпителия, что
позволяет четко определять границу между бластемой и пигментированной
остаточной частью тела (рисунки 2 и 3).
С помощью программ Adobe Photoshop CS5 и Plana 4.4 определялась
площадь бластемы и площадь остального тела планарии. Программами
предусмотрено ручное оконтуривание изображения и вычисление площади.
Граница бластемы и остального тела вводится оператором вручную с
помощью отрезков прямых линий. После этого программа разделяет
граничный контур на две части и вычисляет площадь бластемы.
В нашей работе в качестве количественного критерия роста
использован индекс регенерации R=s/S, где s - площадь бластемы, S площадь
всей планарии в данный момент времени. Каждое из измеряемых значений R
как в опыте, так и в контроле является результатом усреднения измерений на
20 животных. Изменение индекса регенерации в эксперименте по сравнению
с контролем определялась по формуле:
R 
( RЭ  RК )
100%
RК
- где R - разница (%) между величинами индекса
регенерации в экспериментальных RЭ и контрольных RК образцах.
Данная методика оценки скорости регенерации планарий была
разработана в институте экспериментальной и теоретической биофизики
РАН (Пущино-на-Оке). Объекты исследования были любезно предоставлены
сотрудниками института экспериментальной и теоретической биофизики
РАН (Пущино-на-Оке) и использовались нами в проектной работе (6).
Результаты и обсуждения.
В ходе экспериментов обнаружены следующие влияния исследуемых
веществ на два модельных объекта. S. mediterranea показывает ускорение
регенерации головной части во всех случаях, но с разной интенсивностью
(диаграмма 1). Наибольший эффект оказали витамин С (107,87%), прополис
(104,72%), зверобой (91,84%). За ними следуют пиридоксин (84,25%), тиамин
(73,27%), спирулина (67,72%), алоэ (57,48%). Более низкий уровень влияния
показали мильгамма (39,37%), мумиё (33,86%) и витамин В12 (20,47%).
На G. tigrina получены и отрицательные влияния трёх из исследуемых
веществ и гораздо менее выраженные положительные эффекты остальных
веществ (диаграмма 2). Самый большой положительный эффект оказал
пиридоксин (36,21%). Примерно на одном уровне находятся влияния
зверобоя (17,3%), тиамина (18,38%), алоэ (16,22%), мумиё (14,59%) и
спирулины (10,81%). Негативное влияние на скорость образования бластемы
оказали витамин С (-45,95%) и прополис (-13,82%). Очень слабо выражено
отрицательное влияние мильгаммы (-2,16%). Мы считаем, что последний
результат можно отнести к нейтральным, то есть не оказавшим влияние на
скорость образования бластемы.
Первое, что мы хотим отметить, это то, что два исследуемых объекта
показали различные результаты. Это может быть связано с тем, что хотя оба
вида
относятся
к
одному
подотряду,
они
различаются
по
своим
биологическим характеристикам: требованиям к среде обитания (степень
минерализации воды и её pH), скоростью роста и регенерации, различной
степенью ослизнения при опасности (7, 12). В связи с этим становится
понятна реакция на внесение в среду культивирования витамина C, который
привёл к снижению pH среды, что создало неблагоприятные условия для
протекания процессов жизнедеятельности у G.tigrina, в том числе и для
регенерации её головной части.
Отрицательное влияние прополиса скорее всего объясняется не самим
веществом, а растворителем (этанолом), наличие которого в среде
культивирования привело к нарушению регенерации более требовательной к
Диаграмма 1. Влияние исследуемых веществ на скорость регенерации
у Shmidtea mediterranea.
Диаграмма 2. Влияние исследуемых веществ на скорость регенерации
у Girardia tigrina.
среде G.tigrina. Менее выраженный положительный эффект остальных
веществ на скорость образования бластемы у G. tigrina, чем у S. mediterranea
объясняется и сравнительно меньшей
скоростью роста и регенерации у
данного вида, чем у S. mediterranea. Большее количество слизи на
поверхности тела G. tigrina тоже снижает эффект, так как уменьшает
поступление веществ из среды культивирования в организм червя. При
данных характеристиках вида достаточно сложно подобрать действующие
физиологические концентрации препаратов. К неудобствам работы с
G. tigrina можно отнести и бОльшую её активность в движении и изменении
формы тела. Так как мы проводили прижизненную морфометрию и не могли
зафиксировать червя, то нам приходилось долго ловить момент, когда
положение тела планарии позволит нам сделать снимок для именно
корректной морфометрии.
На скорость образования бластемы у S. mediterranea самое большое
положительное
регенерации
влияние
оказывают
растительного
и
неспецифические
животного
происхождения.
стимуляторы
Ускорение
регенерации у S. mediterranea при внесении исследуемых препаратов в среду
культивирования соответствует эффекту, оказываемому данными средствами на организм человека.
Реакция у G. tigrina на введение в среду культивирования веществ,
стимулирующих регенеративные процессы у человека, отличается по
некоторым веществам и не столь выражена по остальным. Из чего мы
заключаем, что представители планарий могут быть использованы в качестве
модельных объектов (тест-систем) на начальных этапах изучения влияния
различных лекарственных препаратов на человека, но к выбору конкретного
вида планарий необходимо относиться очень внимательно, так как различные
планарии обладают видоспецифическими качествами, которые могут
повлиять на результаты тестов.
Выводы.
Полученные результаты по влиянию веществ, стимулирующих
регенерацию, на Shmidtea mediterranea демонстрируют корреляцию с
ускорением восстановительных процессов в организме человека.
Реакция Girardia tigrina на стимуляторы регенерации не может быть
полностью экстраполирована на таковую у человека.
Представители планарий могут быть использованы как модельные
тест-системы для изучения влияния различных веществ на организм
человека, но в каждом конкретном эксперименте необходимо тщательно
подбирать определённый вид планарий и концентрации препаратов в среде
их культивирования, исходя из биологических видоспецифических
особенностей модельных объектов.
В данном случае предпочтительным объектом для исследования
влияния препаратов, стимулирующих процессы регенерации у человека,
является Shmidtea mediterranea.
Список литературы.
1. Догель В. А. Зоология беспозвоночных: учебник для ун-тов. – 7-е
издание., перераб. и доп. – М.: Высшая школа, 1981. – 606 с.
2. Ермакова О. Н., Ермаков А. Н., Тирас Х. П., Леднев В. В.
Ретиноевая
кислота
как
регулятор
морфогенеза
планарий.
Онтогенез, 2009, том 40, №6, с. 449-455.
3. Ермакова О. Н., Ермаков А. Н., Тирас Х. П., Леднев В. В. Влияние
мелатонина на регенерацию планарий Girardia tigrina. Онтогенез,
2009, том 40, №6, с. 466-469.
4. Карагодин В. П., Черткоева З. А. Возможность использования
биотестирования для предварительной оценки эффективности БАД.
"БАД-Бизнес", октябрь 2006.
5. Под редакцией В. Вестхайде и Р. Ригера. Зоология беспозвоночных
в двух томах. Том 1: от простейших до моллюсков и артропод.
Перевод с немецкого под ред. А. В. Чесунова. М.:Т-во научных
изданий КМК. 2008.
6. Тирас
Х.П.,
Сахарова
Н.Ю.
Прижизненная
морфометрия
регенерации планарий // Онтогенез. 1984. Т. 15. № 1. С. 41–48.
7. Шейман, И. М. Процесс регенерации у планарий разных видов /
И. М. Шейман, Н. Д. Крещенко, М. В. Нетреба // Онтогенез. - 2010. Т. 41, N 2. - С. 114-119.
8. Ярыгин В. Н. Лекции по регенеративной биологии и регенеративной
медицины.
9. www.rlsnet.ru
10.Alejandro Sanchez Alvarado, Panagiotis A. Tsonis. Bridging the
regeneration gap: genetic insights from diverse animal models. Nature
reviews: genetics. V 7. November 2006.
11.A. Sánchez Alvarado, P. W. Reddien, P. A. Newmark, Chad
NusbaumB. Proposal for the Sequencing of a New Target Genome:
White Paper for a Planarian Genome Project.
12.Alejandro Sánchez Alvarado. Quick guide Planarians. Current Biology.
V. 14. № 18.
13. Alejandro Sánchez Alvarado, Phillip A. Newmark, Sofia M. C. Robb
and Réjeanne Juste. The Schmidtea mediterranea database as a molecular
resource for studying platyhelminthes, stem cells and regeneration.
Development. 2002. V. 129. P. 5659-5665.
14. Alejandro Sanchez Alvarado The freshwater planarian Schmidtea
mediterranea: embryogenesis, stem cells and regeneration. Current
Opinion in Genetics & Development. 2003, 13:438–444.
15. Baguñà J, Saló E, Romero R, García-Fernández J, Bueno D, MuñozMármol A, Bayascas-Ramirez J, Casali A. 1994. Regeneration and
pattern formation in planarians: Cells, molecules and genes. Zool Sci.
11:781-795.
16. Scott
F.
Gilbert.
Developmental
Biology,
2003. Sinauer Associates, Inc., Sunderland.
Seventh
Edition.
Рисунок 2. Schmidtea mediterranea с образующейся бластемой
Рисунок 3. Girardia tigrina с образующейся бластемой.