lekciya_6_lyuminescenciya_biologicheskih_sistem

Лекция № 6
ЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМ
В люминесцентном исследовании биологических систем наибольшее значение
имеют фото- и химиолюминесценция. При этом важно помнить, что флуоресценция и
фосфоресценция, как два вида фотолюминесценции, различаются не только
длительностью свечения, но и механизмами происхождения. Зная о существовании
синглетных (S) и триплетных (T) возбужденных состояний, нетрудно понять из схемы
электронных переходов в биомолекуле (рис. 22), что испускание квантов
флуоресценции имеет место в тех случаях, когда молекула переходит из синглетного
возбужденного состояния (S*) в основное (S0): S1* → S0+hvфл.
С определенной вероятностью в молекуле могут иметь место и другие процессы
преобразования избыточной энергии с возбужденного уровня S*0:
• образование тепловой энергии S* → S0;
• фотохимическая реакция;
• передача энергии возбуждения другой молекуле;
• переход в триплетное состояние (T) с обращением спина (без излучения):
S*1 → T.
Рис. 22. Энергетические уровни биомолекулы и возможные переходы между
ними.
Переход молекулы из возбужденного триплетного состояния (T) в основное
состояние S0 может сопровождаться испусканием кванта фосфоресценции по схеме: T→
S0 + hvфосфоресц, но длительность фосфоресценции гораздо больше длительности
флуоресценции, так как этот переход запрещен правилами отбора, и в природе она
встречается гораздо реже, чем флуоресценция.
Кроме фосфоресценции, существуют и другие процессы превращения избыточной
энергии молекулы с триплетного уровня:
• безызлучательный переход с обращением спина: T→ S0;
• фотохимическая реакция;
• передача возбужденной молекулой избыточной энергии другой молекуле.
1
Из сказанного следует, что в люминесценции отображаются процессы
превращения энергии в молекулах, поэтому люминесцентный анализ биообъектов
служит одним из способов экспериментального изучения биоэнергетики.
Одной из важнейших характеристик флуоресценции является спектр
излучения, т. е. распределение интенсивности излучаемого света по частотам (v) или
длинам волн (  ): I = f(  ) или I =f(v), где I − интенсивность флуоресценции (Вт·м2
).
Обычно спектр флуоресценции состоит из относительно широких сплошных
полос и при этом наблюдается характерное изменение спектрального состава
испускаемого света по сравнению с поглощенным.
В большинстве случаев выполняется правило Стокса: длина волны
флуоресценции больше, чем длина волны возбужденного света, т. е. спектр
фотолюминесценции сдвинут в сторону длинных волн относительно спектра
светового излучения, возбудившего эту люминесценцию.
Другой характеристикой флуоресценции служит спектр возбуждения, т. е.
зависимость интенсивности флуоресценции от длины волны возбуждающего света.
Важнейшими параметрами флуоресценции являются ее квантовый (φ) и
энергетический (η) выходы.
Квантовый выход флуоресценции представляет собой величину, равную
отношению числа испущенных квантов писп к числу поглощенных квантов ппогл, а
энергетический выход η равен отношению энергии флуоресценции Wфл к поглощенной
энергии возбуждения Wnогл :
(32)
Энергетический выход флуоресценции пропорционален квантовому выходу, но в
отличие от него зависит от длины волны возбуждающего света.
Флуоресценция обусловлена переходами внешних валентных электронов, за
счет которых образуются химические связи между атомами и молекулами. Поэтому
возникновение новых связей в молекуле и динамика ее взаимодействия со средой
приводят к изменениям энергетических уровней, в силу чего существует тесная
зависимость основных характеристик флуоресценции от физико-химического
состояния молекул вещества. Характеристики и параметры флуоресценции
изменяются при сдвигах температуры, рН и ионной силы среды, в которой находятся
излучающие молекулы. С этим обстоятельством связана высокая информативность
флуоресцентного анализа молекулярной структуры вещества и ее динамики.
Ткани организма содержат вещества (витамины, сложные белки с
хромофорными коферментными группировками и т. д.), способные флуоресцировать
под действием света. Такая флуоресценция называется собственной.
Наряду с исследованием собственной флуоресценции клеток и тканей широко
используется метод флуоресцентных зондов. Он основан на том, что существует ряд
люминесцентных
красителей
(люминофоров),
которые
избирательно
взаимодействуют с определенными компонентами клетки, не нарушая их
функционирования. Комплекс флуоресцентного зонда и выявляемого с его помощью
вещества имеет более интенсивную флуоресценцию, чем сам краситель. Свечение
этого комплекса под действием света называют вторичной флуоресценцией.
Применение вторичной флуоресценции позволило, в частности, изучить
распределение ионов кальция в клетке и в различных органах, а также его изменение в
процессе жизнедеятельности организма. Широкое распространение в качестве
2
флуоресцентного зонда на кальций нашел хлортетрациклин. Он образует сложный
комплекс с ионами кальция, связанными биомембранами, который флуоресцирует
тем интенсивнее, чем больше кальция адсорбировано на биомембранах. Есть
красители (например, фура), которые выявляют цитозольную фракцию Са2+.
Синтезированы флуоресцентные зонды на нуклеиновые кислоты, белки, липиды и
многие другие вещества. С помощью флуоресцентных зондов оценивают
поверхностные заряды клеточных мембран.
Собственную и вторичную флуоресценцию биологических систем не следует
смешивать с биолюминесценцией (или биохимиолюминесценциеи). Под этим термином
понимают те виды люминесценции живых тканей, которые не связаны с явным
воздействием на ткань какой-либо внешней энергии. Биолюминесценция обусловлена
определенными химическими процессами, протекающими в живых клетках, и,
следовательно, является разновидностью химиолюминесценции.
Собственная флуоресценция биомолекул и живых тканей. При облучении
клеток позвоночных и беспозвоночных животных, а также растений и
микроорганизмов коротковолновым ультрафиолетом (  = 250−280 нм) можно
зарегистрировать флуоресценцию с максимумом в области 330−350 нм.
Собственная ультрафиолетовая флуоресценция живых тканей обусловлена,
главным образом, свечением белков, причем этот процесс в различных
ультраструктурах клетки имеет характерные отличия в разных органах и тканях.
Изучение флуоресценции белков в растворах показало, что их ультрафиолетовая
флуоресценция, как и поглощение ими излучения в области 240−300 нм, определяется
ароматическими аминокислотами: триптофаном, тирозином и фенилаланином.
В клетках человека и животных содержится много белков, в состав которых входят
триптофан, тирозин и финилаланин. Это актин, миозин, ферменты типа дегидрогеназ,
фосфатаз, оксидаз, некоторые гормоны, ферменты пищеварительной системы,
альбумины и глобулины плазмы крови и другие вещества. Собственная ультрафиолетовая
флуоресценция этих белков зависит, главным образом, от содержания в них
триптофана. Для нейтрального водного раствора триптофана при комнатной
температуре характерна флуоресценция с максимумом около 350 нм и квантовым
выходом φ = 0,2. Спектры флуоресценции указанных выше белков сдвинуты в
коротковолновую область на 10−25 нм относительно спектра флуоресценции раствора
триптофана. Разные белки имеют максимум свечения при неодинаковых длинах волн,
хотя разница между ними невелика (в пределах 10−15 нм). Есть различия и в квантовом
выходе флуоресценции триптофансодержащих белков.
Белки, содержащие тирозин и фенилаланин, в отсутствие триптофана,
флуоресцируют примерно так же, как тирозин. Такие спектры флуоресценции
свойственны РНКазе, коллагену, инсулину и ряду других веществ. Их максимум
излучения приходится на ту же длину волны, при которой имеет место максимум
флуоресценции водного раствора тирозина (  = 304 нм). Квантовый выход
флуоресценции таких белков порядка 0,04−0,05.
Свечение фенилаланина выявляется только у некоторых уникальных белков,
содержащих его в значительных количествах при отсутствии других ароматических
аминокислот. Примером таких белков являются кальцийсвязывающие миогены,
содержащиеся в мышцах рыб. Молярный показатель поглощения ультрафиолета
фенилаланином в 30 раз меньше, чем у триптофана, и почти в 7 раз меньше, чем у
тирозина.
Спектры собственной ультрафиолетовой флуоресценции различных клеток
имеют сходную форму (рис. 23), хотя одни из них светятся сильнее, другие − слабее.
3
Вместе с тем неодинаково флуоресцируют разные ультраструктурные компоненты
одной и той же клетки. Наиболее яркая ультрафиолетовая флуоресценция присуща
сократительному аппарату клетки, митохондриям и ядрышкам.
Рис. 23. Спектры ультрафиолетовой флуоресценции мышечных волокон (1),
нейронов (2), эритроцитов (3).
Для живых тканей характерна также флуоресценция в красной, желто-зеленой и
синей областях видимой части спектра. Флуоресценция в красной области присуща
прежде всего порфиринам. Порфириновая структура свойственна цитохромам,
пероксидазе, каталазе, гемоглобину, миоглобину. Однако в гемопорфиринах
флуоресценция «потушена» атомами железа, что ограничивает возможности ее
исследования в живых тканях. При обработке ткани некоторыми веществами атом
железа отрывается от простетической группы внутриклеточных гемопорфиринов, и
тогда выявляется характерная красная флуоресценция порфиринов. Этим приемом
пользуются судебные медики для обнаружения отдельных эритроцитов по их
порфириновой флуоресценции после обработки исследуемого объекта серной
кислотой.
Флуоресценция живых тканей в синей и желто-зеленой областях связана с наличием в клетках восстановленной формы пиридиннуклеотидов (НАДН и
НАДФН) и окисленной формы флавопротеидов (ФП). Эти вещества участвуют в
таких процессах, как гликолиз, пентозный цикл, цикл Кребса, окисление жирных
кислот и, что особенно важно, клеточное дыхание.
Поэтому практически любые сдвиги в клеточном метаболизме отображаются в
динамике флуоресценции НАДН и ФП, а она, в свою очередь, может быть выявлена
при люминесцентном анализе живых тканей.
НАДН обладает характерным спектром поглощения, включающим две полосы
поглощения в ультрафиолетовой части спектра с максимумом в области 260 нм и
340 нм, а также собственной синей флуоресценцией с максимумом в интервале
465−480 нм. Переход НАДН в окисленное состояние сопровождается потерей одной
полосы (при  = 340 нм) в спектре поглощения и утратой способности
флуоресцировать (рис. 24).
Среди флавопротеидов наибольший интерес представляют собой производные
рибофлавина. В окисленном состоянии флавопротеиды обладают характерным
спектром поглощения и собственной желто-зеленой флуоресценцией с максимумом в
области 530 нм, обусловленной рибофлавином (рис. 25). При восстановлении
флавопротеиды утрачивают собственную флуоресценцию.
4
Неодинаковая флуоресценция пиридиннуклеотидов и флавопротеидов в
восстановленной и окисленной формах лежит в основе использования
флуоресцентного анализа для количественной оценки клеточного дыхания живых
тканей.
Усиление клеточного дыхания сопровождается изменением соотношения
восстановленных и окисленных форм компонентов дыхательной цепи в сторону
преобладания вторых над первыми. Угнетение дыхания приводит к
противоположному эффекту.
Рис. 24. Структурные формулы (а) и спектры поглощения (б) и
флуоресценции (в) никотинамидадениндинуклеотида: окисленной формы
(сплошная линия) и восстановленной формы (пунктирная и штрих-пунктирная
линии)
5
Рис. 25. Спектры поглощения (а) и флуоресценции (б) флавопротеидов:
окисленной формы (сплошная линия) и восстановленной формы (пунктирная
линия)
Поэтому при усиленном дыхании клетки в ней нарастает желто-зеленая и
затухает синяя флуоресценция, тогда как для ослабления дыхания характерно
усиление синего свечения НАДН и угасание желто-зеленой флуоресценции ФП.
Важным достоинством флуориметрического исследования клеточного
дыхания является возможность его проведения в любом органе, к которому можно
подвести свет, возбуждающий флуоресценцию, и отвести на регистрирующий прибор
возникающее in situ свечение. Так удается установить пороги действия на организм
различных раздражителей, вникнуть в механизмы этих реакций. Этот метод дал
возможность установить не только неспецифические проявления ответов
биологических систем на стимуляцию, но также и характерные закономерности
метаболических сдвигов при некоторых патологических состояниях.
Биолюминесценция. Живым организмам, наряду с флуоресценцией, присуща
и биолюминесценция, которая является самопроизвольной, т. е. не связанной с явным
воздействием какой-либо энергии от внешнего источника. Самопроизвольное
свечение живых организмов в видимой области спектра наблюдали невооруженным
глазом Аристотель и Плиний Старший. С тех пор довольно интенсивную
биолюминесценцию обнаружили у 40 видов бактерий, грибов, беспозвоночных
животных, рыб. Высшим растениям, птицам, млекопитающим такое свечение не
свойственно. В силу уникальности этого явления его иногда называют «экзотической»
биолюминесценцией. При ее изучении французский ученый Р. Дюбуа (1887)
установил, что в вытяжке фотофоров светлячков содержатся два вещества, смесь
которых дает биолюминесценцию. Одно из них, представляющее собой субстрат
реакции, получило название люциферина, а второе оказалось ферментом реакции
окисления люциферина и было названо люциферазой. Люциферин и люцифераза
позднее были выделены и из других светящихся организмов (ракушечного рачка
ципридины, различных видов светящихся рыб). Реакция окисления люциферина
воспроизведена в пробирке.
В ходе ферментативного окисления люциферина выделяется значительная
энергия (170−340 кДж·моль-1), под действием которой промежуточный продукт
реакции переходит в возбужденное состояние. Возвращаясь в основное состояние, его
молекула излучает квант света. В целом «экзотическая» люминесценция возникает как
следствие двухступенчатого процесса:
А + В люцифераза → С* + D, С*→ С + hv (люминесценция).
Вместе с тем биолюминесценция присуща многим представителям животного и
растительного миров, но, в отличие от «экзотической», она очень слаба по
интенсивности (обнаруживается не визуально, а только при помощи
высокочувствительных приборов) и простирается за пределы видимого света в
инфракрасную и ультрафиолетовую области.
6