Воробьёв Дмитрий Владимирович

На правах рукописи
Воробьев Дмитрий Владимирович
ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА
МЕТАЛЛОВ У РЫБ В СОВРЕМЕННЫХ БИОГЕОХИМИЧЕСКИХ
УСЛОВИЯХ ДЕЛЬТЫ р. ВОЛГИ
03.00.13 – физиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Астрахань, 2008
Работа выполнена на кафедре физиологии и морфологии человека и
животных Астраханского государственного университета.
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук,
профессор
Давид Львович Теплый
Александр Николаевич Неваленный
доктор медицинских наук, профессор,
заслуженный деятель науки РФ
Вячеслав Федорович Киричук
Ведущая организация: Саратовский государственный университет им.
Н.Г.Чернышевского
Защита состоится «___» «____________» 2008г. в ___ часов на заседании
диссертационного
совета
ДМ
212.009.01
при
Астраханском
государственном университете по адресу: 414000, г. Астрахань, пл.
Шаумяна 1. Естественный институт АГУ.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке АГУ по адресу: 414000,
Астрахань, пл.Шаумяна, 1.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор биологических наук
Ю.В. Нестеров
2
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Возрастающее влияние антропогенных
факторов на континентальные водоемы привело к повышению уровня
металлов в водных экосистемах, в т. ч. в воде Волго-Каспийского
бассейна, где в последние годы, например, содержание цинка увеличилось
и достигло 2-3 ПДК (Сокольский, 1995; Костров, 1999; Щербакова, 2004;
Шипулин, 2006; Воробьев и др., 2007 и др.)
С одной стороны цинк, медь, марганец, кобальт, железо и другие
элементы относятся к жизненно важным факторам, необходимым в
определенных количествах для нормального функционирования порядка
90 ферментов, части гормонов, витаминов, биосинтеза РНК и ДНК,
влияющим на все виды обмена веществ в организме (Войнар, 1960;
Ковальский, 1974; Школьник, 1974; Воробьев, 1979, 1982, 1993;
Абдурахманов и др.,2003; Скальный, 2004; Кузьмина, 2005; Неваленный,
1998 и др.), а с другой - находясь в больших количествах в воде и корме,
они могут оказывать отрицательное (токсическое) влияние на рыб
(Лукъяненко, 1967, 1980; Сокольский, 1995; Абдурахманов и др., 2003;
Абдурахманов, Зайцев, 2004; Bury et al., 2003; Calta, Cappolat, 2006; Buzy,
Grosell, 2003; Fahzenfort et al., 2006; Wirum et al., 2006; Крючков, 2004,
2007 и др.).
В связи с повышенным уровнем металлов в воде возникает
необходимость исследования физиологического состояния рыб в
естественных водоемах Нижней Волги и, в первую очередь, определить
динамику металлов в органах и тканях производителей различных видов,
исследовать их гематологические параметры, аминокислотную картину,
выяснить пути поступления и выведения микроэлементов из организма, а
также изучить влияние различного уровня кальция, цинка и температуры
воды на физиологическое состояние рыб Волго-Каспийского региона, где
в последнее десятилетие произошло катастрофическое снижение
численности осетровых и других ценных видов рыб в естественных
водоемах, в то время как естественный нерест белуги, осетра и севрюги на
р.Волге почти прекратился (Иванов, 2000, 2001, 2002; Иванов и др., 1995,
1999; Власенко и др., 2003; Распопов, 2001).
Таким образом, актуальность исследований предопределена
необходимостью изучения влияния различных дозировок металлов,
условий среды на рыб, получения данных о физиолого-биохимических
параметрах различных видов половозрелых особей в современных
биогеохимических условиях, а также разработкой новых методов и
подходов, физиологических тестов с целью функциональной оценки
производителей при искусственном воспроизводстве различных видов
рыб (осетровые, карповые и другие) для восполнения рыбных запасов
Волго-Каспийского бассейна.
3
Цель исследования:
Изучить функциональные особенности динамики металлов в органах и
тканях осетровых, карповых и окуневых рыб, а также исследовать влияние
ионных и температурных факторов среды на метаболические процессы в
организме белого амура, выращиваемого в поликультуре в рыбоводных
хозяйствах западно-подстепных ильменей дельты р. Волги, где ежегодно
наблюдается широкий диапазон концентраций цинка, кальция в воде и ее
значительные температурные колебания.
Для достижения этой цели были поставлены задачи:
1) Изучить динамику распределения различных физиологически важных
элементов – железа, марганца, цинка и меди (в отдельных случаях –
алюминия, кобальта и др.) в органах и тканях производителей белуги,
осетра, севрюги, стерляди, сазана, леща, жереха, красноперки, белого
амура, пестрого толстолобика, судака и их физиолого-биохимические
параметры на фоне биогеохимической обстановки, сложившейся в
последние десятилетия XX – и начале XXI веков, - повышенного уровня
отдельных металлов в воде дельты р.Волги.
2) Исследовать толерантность белого амура к различным концентрациям
цинка в воде, а также в эксперименте при его введении per os рыбам,
определить пути поступления и выведения цинка из организма
растительноядных рыб. Выяснить роль пищеварительной системы и жабр
в выделении металла и обмена цинка в организме.
3) Изучить влияние температуры воды и различного уровня кальция в ней
на тканевый и органный обмен цинка в организме белого амура.
Научная новизна:
На единой методологической (физиолого-биогеохимической)
основе
комплексно
рассмотрены
физиологические
особенности
содержания микроэлементов в органах и тканях различных семейств рыб:
осетровые, карповые и окуневые, их физиологические показатели;
выяснены пути поступления и выведения цинка у растительноядных рыб.
Впервые изучено влияние различных уровней цинка и его
антагониста - кальция, а также температурного фактора на обменные
процессы белого амура. Установлено, что повышение температуры воды
при широком диапазоне концентрации в ней цинка влечет за собой не
только утилизацию, но и выведение цинка из организма белого амура.
Показано, что рыбы могут регулировать обмен цинка в организме
за счет изменения интенсивности всасывания металла кишечной стенкой и
абсорбции жабрами, депонирования элемента кожей и костной тканью, и
путем выведения его выделительными органами, в основном
пищеварительной системой, жабрами, и, отчасти, почками.
Впервые, на примере белого амура обнаружена обратная связь
между абсорбцией цинка из воды и концентрацией в ней кальция на фоне
тканевого перераспределения металла в организме.
4
Впервые разработан физиологический тест- содержание цинка в
форменных элементах крови- для определения обеспеченности им
организма различных рыб.
Положения, выносимые на защиту:
Обмен железа, марганца, цинка и меди в органах и тканях у
осетровых,
карповых
и
окуневых
рыб
предопределяется
биогеохимической обстановкой экосистем и существенно зависит от
вида, пола и физиологического состояния гидробионтов.
2. Увеличение уровня кальция в воде (до известных пределов) снижает
утилизацию цинка органами и тканями растительноядных рыб.
3. Температура воды, концентрация в ней цинка и пероральное введение
его белому амуру обуславливают и утилизацию, и выведение металла
из организма рыб, в основном, с помощью пищеварительной системы
и жабр, и, отчасти, почками.
4. Повышение уровня цинка в воде и пероральное его введение белому
амуру вызывает увеличение количества металла в форменных
элементах крови, что позволяет использовать этот показатель
метаболизма
в
качестве
физиологического
теста
оценки
функционального состояния растительноядных рыб в условиях
аквакультуры.
Теоретическая значимость определяется установлением общих
тенденций, видовых особенностей и полового диморфизма динамики
физиологически важных металлов в органах и тканях производителей
различных рыб и их физиолого-биохимических показателей, выяснением
уровня тканевого и органного метаболизма и изучением путей
поступления и выведения цинка у растительноядных рыб под влиянием
различных концентраций цинка, кальция и колебаний температуры воды.
Практическое значение состоит в рекомендации определения
содержания конкретного химического элемента в форменных элементах
крови,
как
объективного
и
методически
легко
доступного
физиологического теста обеспеченности организма рыб металлом, при их
выращивании в различных биогеохимических условиях; применения
исследованных нами физиологических параметров различных видов рыб,
взятых из естественных водоемов, в качестве ориентира «нормального»
функционального состояния производителей, при их выращивании и
содержании в биогеохимических условиях рыбоводных предприятий и
многократном (осетровые, карповые) использовании для получения
молоди и товарной продукции. Материалы диссертации используются в
лекционных курсах по физиологии и этологии животных, токсикологии,
экологии и охране окружающей среды в Астраханском государственном
университете.
1.
5
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы
доложены на: Всероссийской научно-практической конференции молодых
ученых «Молодые ученые: новые идеи и открытия» (г.Курган, 14-16 июня
2006г.); III Международной научно-практической конференции «Тяжелые
металлы и радионуклиды в окружающей среде», Семипалатинск, 2006г.;
Международной
научно-практической
конференции.
«Экология
биосистем: проблемы изучения, индикации и прогнозирования»,
Астрахань, 2007г.; I Международной интерактивной конференции
«Современные аспекты экологии, физиологии и физиолого-экологического
образования», 16-19 мая, Москва-Астрахань, 2007 г.; II Всероссийской
научной конференции «Экологические проблемы природных и
урбанизированных территорий», Астрахань, 2008 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, 6 из которых –
в изданиях перечня ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 160
страницах, включает 11 таблиц и 63 рисунка. Состоит из введения,
литературного обзора, 6-ти глав, заключения, выводов, списка
используемой литературы, включающего 216 источников, в т. ч. 150
зарубежных.
Материал и методы исследования.
Исследования проведены в 2003-2008 гг. на различных видах рыб,
находящихся в биогеохимических условиях субрегиона дельты р.Волги.
Анализу были подвергнуты 4 экземпляра белуги – Huso huso L., 5 - осетра
– Acipenser queldenstaedtii Brant, 5 – севрюги – Acipenser stellatus pallas, 12
– стерляди – Acipenser ruthanus L., 192 - белого амура – Ctenopharyngodon
idella Val., 36 - пестрого толстолобика – Aristichtus nobilis Rich, 41- леща –
Abramis brama L., 42 – сазана – Cyprinus carpio L., 32 – жереха– Aspius
aspius L., 145 - красноперки – Scardinius eritrophal L., 39 - судака –
Lucioperca Cucioperca L.
Рыбу и других гидробионтов, а также грунты и воду отбирали на
тонях «9-я Огневка» и «Чкаловская» Главного банка (ВКК) р.Волги, а
также (растительноядных) в пресных западно-подстепных ильменях (Карабулак, Власов, Б. Лата) Лиманского района Астраханской области.
Модельные опыты на двухлетках белого амура проводили в аквариумах
емкостью 80л. с водой, взятой из лиманских ильменей. Критерием оценки
физиологического состояния рыб служили гематологические параметры,
определяемые по общепринятым методикам, и аминокислотный спектр
рыб, который оценивался с помощью автоматического анализатора 1200Е
(Чехословакия). Металлы в грунтах (180 проб), воде (212 проб), в
планктоне (81 проба), бентосе (69 проб), макрофитах (257 проб), органах и
тканях рыб (2898 проб) определялись атомно-абсорбционным методом
(Прайс, 1976; Брицке, 1982) на спектрофотометрах AAS-1 и «HITACHI» 6
180-50. Анализ результатов исследований проведен с использованием
программного
пакета
по
стандартной
программе
обработки
статистического материала «D\STAT», Microsoft Excel 97 Pro, Statqraf,
Statistica. Достоверность различий оценивали по t-критерию Стьюдента
(при уровне значимости 0.01-0.05).
Результаты исследований и их обсуждение
Функциональные особенности динамики Fe, Zn, Cu, Mn в органах и
тканях различных видов рыб в биогеохимических условиях дельты
р.Волги.
Микроэлементы в водных экосистемах являются одним из
регуляторов метаболизма рыб, и только комплексное физиологобиогеохимическое исследование, включающее в себя изучение содержания
микроэлементов в грунтах, воде, планктоне, бентосе, макрофитах и
органах и тканях рыб, позволяет сделать выводы об обеспеченности
водных экосистем микроэлементами, физиологическом состоянии рыб и
их метаболизме в конкретных биогеохимических условиях (Ковальский,
1974; Воробьев, 1982, 1993, 2007).
В настоящее время металлы в грунтах водоемов дельты р.Волги
выстраиваются в следующий убывающий ряд: Fe, Zn, Mn, Cu, Ni, V, Cd,
Hg, а в воде-Fe, Zn, Cu, Mn, Ni, V, Со, Cd. В грунтах водоемов р.Волги
установлены сезонные колебания элементов, а наибольшее количество
металлов обнаружено в слоях 0-5см и 15-20см. Нами выявлена тенденция
увеличения микроэлементов от весны к осени, что объясняется не только
обогащением илов отмирающими организмами, но и повышением
активности грунтовых вод к осеннему периоду. Количество цинка в
волжской воде значительно выросло относительно 60х -70х гг. ХХ века
(Зайцев,1979, Андреев, 1980, Воробьев, 1982) и колеблется от 3 до
140мкг/л, в среднем – 32,1±2,6мкг/л, а в водоемах западно-подстепных
ильменей дельты р.Волги – соответственно: 8,2-151мкг/л и 30,9±2,8мкг/л,
что в несколько раз превышает ПДК. Количество меди – от 2,0 до 40мкг/л,
а в среднем – 9,3±0,4мкг/л, причем, весной оно было выше, чем летом.
Марганца обнаружено, в среднем, 9,8±0,7мгк/л, что в 1,5-2 раза выше
средних величин для рек России (Патин, Морозов, 1981; Воробьев, 1993).
В зоопланктоне металлы располагаются так: Fe>Mn>Zn>Co>Cu. Как
правило, организмы планктона и бентосной фауны содержат исследуемые
элементы, в зависимости от их количества в грунтах и воде (r=+0,87),
обладая при этом видовой дифференциацией и хорошей способностью
утилизации элементов из окружающей среды. Количество металлов у
макрофитов зависит от биогеохимической обстановки водоемов, их
физиологического состояния и вида растений - пищи белого амура.
7
Осетровые.
Изучение функциональных особенностей обмена металлов в
органах и тканях белуги, осетра, севрюги и стерляди позволило выявить
межвидовые различия уровня металлов у рыб. Установлено, что
депонирование металлов органами и тканями у стерляди и севрюги
(мирные рыбы) отличается от количества элементов у белуги (хищник).
Физиологическая роль железа в организме объясняется его участием в
аэробном метаболизме, нарушения которого могут иметь серьезные
последствия. В организме осетровых рыб железо присутствует в
значительных количествах относительно других микроэлементов. Большие
концентрации его обнаружены в органах, обильно снабженных кровью,
где накопление этого металла происходит главным образом за счет
геминного железа (Войнар, 1960; Воробьев, 1993, 2007 и др.). Медь в
наибольшем количестве – 45,2±1,3 и 39,8±1,4 мг/кг утилизируется у
самцов и самок рыб в селезенке. У всех рыб больше всего металлов
содержится в печени , а меньше- в мышцах. У производителей осетровых
рыб на IV стадии зрелости икры выявляются видовые и половые (СОЭ)
отличия гематологических показателей (табл.1).
Таблица 1.
Гематологические показатели осетровых
Вид рыб
Концентрация
гемоглобина, г %
Число
эритроцитов
самцы
самки
Число
лейкоцит.
тыс/мм3
Белуга
Осетр
Севрюга
Стерлядь
9,1±0,82
8,3±0,11
9,3±0,65
7,9±0,08
0,92±0,05
0,71±0,03
1,13±0,03
1,21±0,17
5,8±0,31
6,2±0,57
3,3±0,06
3,0±0,06
7,3±0,22
8,1±0,04
6,1±0,07
4,7±0,22
79±2,72
67±3,88
62±5,19
81±9,95
СОЭ, мм/ч
Карповые.
Органы и ткани сазана, леща, жереха и красноперки по содержанию
железа и меди располагаются так: печень > селезенка > чешуя > гонады >
почки > жаберные лепестки > кровь > мышцы. В печени на единицу массы
микроэлементов в несколько раз больше, чем в мышцах. В крови самцов
сазана меди больше, чем у самок (р0,05). Для марганца убывающий ряд
выглядит следующим образом: чешуя, жаберные лепестки, печень, гонады,
почки, кровь, селезенка, мышцы. При этом самки леща содержали в
жаберных лепестках больше марганца, чем самцы (р0,05), что
свидетельствует о половом диморфизме рыб. У леща чешуя достоверно
лучше (р0,05) обогащена цинком, чем у сазана. В сравнении с лещом и
жерехом, мышцы красноперки лучше обеспечены железом. Летом печень,
почки и жаберные лепестки аккумулируют меди больше, чем весной,
8
причем количество меди в печени и селезенке самцов в это время больше,
чем у самок (р0,05). Гематологические параметры всех изучаемых рыб
находились в пределах физиологической нормы. У леща число
эритроцитов составило 1,37±0,24 млн., лейкоцитов – 22,9±2,11 тыс.,
гемоглобина – 4,8±0,44 г/%, СОЭ – 2,7±0,16мл., общий белок сыворотки
крови – 6,22±0,5, а у жереха и красноперки – соответственно: 1,48±0,09,
21,1±1,1, 6,1±0,8, 2,6±0,12, 5,78±0,6% и 1,62±0,54, 23,1±0,9, 8,6±1,1,
2,80,09, 6,99±0,71 перед нерестом. В период нагула достоверно
увеличивается (р0,05) число эритроцитов (на 12%), гемоглобина (на
8,9%) и общего белка сыворотки крови (на 11%), что не выходит за
пределы литературных данных (Оскаров, 1990 и др.). В мышцах, и
особенно, в печени леща свободных аминокислот больше, чем у сазана,
что служит, видимо, отражением видовой специфичности. Установленный
нами высокий уровень аминокислот в печени рыб в сравнении с их
содержанием в мышцах, согласуется с результатами других
исследователей, изучающих аминокислоты пресноводных (щука, налим) и
морских рыб (Ананичев, 1963; Петренко, 1998). В мышцах сазана и леща
преобладающими компонентами является лизин, гистидин, аспарагиновая
кислота, серин и α-аланин, лейцин, цистеин, что определяется
функциональными различиями печеночной и мышечной ткани и,
соответственно, специфической направленностью в них процессов
метаболизма (табл.2).
Таблица 2.
Содержание свободных аминокислот у сазана и леща, мг %
Название аминокислот
Цистеин
Цистин
Лизин
Гистидин
Аргенин
Аспарагиновая к-та
Серин
Глицин
Глутаминовая к-та
Треонин
α-аланин
Пролин
Тирозин
Метионин
Валин
Фенилаланин
Триптофан
Лейцин + Изолейцин
Сумма аминокислот
Сазан (n=12)
мышцы
печень
8,62±1,15
47,27±2,08
35,07±2,72
29,21±4,76
11,55±1,25
10,53±2,07
2,89±0,06
4,01±0,07
3,32±0,03
10,77±094
1,33±0,04
1,23±0,12
0,30±0,02
1,79±0,03
1,74±0,03
169,01±6,98
22,35±4,1
22,74±1,04
26,91±3,08
15,01±0,85
21,35±1,43
18,06±2,24
5,42±0,08
38,98±4,32
14,9±1,34
28,07±2,58
4,85±0,46
8,36±1,41
3,67±0,71
31,03±2,38
37,06±4,14
298,76±12,4
9
Лещ (n=14)
мышцы
печень
5,01±0,07
41,03±2,67
37,19±2,37
16,07±2,26
11,11±1,87
8,86±0,68
2,09±0,06
14,06±0,78
8,77±0,66
9,81±1,84
2,04±0,09
2,36±0,12
1,07±0,24
7,02±0,38
5,09±0,16
171,58±10,2
27,97±5,26
13,09±1,37
79,6±4,85
54,01±5,48
67,03±7,85
24,69±3,41
28,04±3,06
24,66±3,08
55,01±5,28
42,9±1,03
107,07±5,21
24,57±3,23
32,01±1,69
87,34±19,21
68,66±3,28
736,65±17,2
Мы обнаружили различия аминокислотных спектров у самок и самцов
белого амура (табл.3). Наибольшее количество свободных аминокислот
содержится в мышцах самок, что говорит о преобладании процессов
распада мышечного белка в их организме в период начала формирования
половых продуктов. У пестрого толстолобика, имеющего более значимые
показатели весового роста, в крови достоверно больше эритроцитов,
гемоглобина и общего белка, чем у белого амура (р0,05).
Таблица 3.
Содержание свободных аминокислот у двухлеток белого амура, мг. %
Наименование
аминокислот
Самки (n=10)
Самцы (n=9)
мышцы
печень
гонады
кровь
мышцы
печень
гонады
кровь
Цистин
59,15
33,82
57,05
23,60
58,93
82,92
187,32
42,85
Лизин
159,57
14,87
30,25
12,08
-
34,52
26,85
11,43
Гистидин
274,83
28,89
51,04
33,36
11,01
-
24,09
49,65
Аргенин
195,85
21,72
36,21
23,29
166,61
28,72
38,84
21,99
Аспарагинов
ая к-та
41,38
47,25
50,13
67,83
193,21
31,63
43,39
90,82
Серин
42,24
27,14
34,57
18,01
23,34
23,89
32,88
22,80
Глицин
25,54
5,15
12,01
17,88
14,72
20,45
15,79
20,84
Глутаминовая к-та
52,78
18,55
46,47
41,81
73,97
42,65
144,08
62,00
Треонин
35,72
8,48
22,38
17,09
25,89
16,01
27,48
20,15
α-аланин
32,81
29,36
23,95
20,02
42,43
43,08
10,15
41,81
Пролин
16,97
12,49
17,24
19,86
10,28
12,86
17,15
13,54
Тирозин
11,32
31,68
-
-
21,27
24,25
-
12,86
Метионин
-
13,77
-
-
-
23,38
11,3
20,58
Триптофан
-
-
-
-
-
-
-
38,96
Валин
10,01
10,06
15,84
22,81
10,58
13,64
18,57
28,37
Фенилаланин
25,82
25,08
44,09
60,06
33,92
33,25
47,55
75,86
Лейцин
12,61
12,88
26,68
36,86
18,77
20,48
82,51
42,16
Изолейцин
13,92
10,14
26,87
38,85
19,84
22,09
81,02
44,25
Сумма
свободных
аминокислот
1010,49
351,33
494,78
453,41
724,77
445,1
852,36
660,92
10
По
содержанию
микроэлементов
органы
и
ткани
растительноядных рыб располагаются в следующей последовательности:
по железу: печень > кровь > жаберные лепестки > почки > кишечная
стенка > мышцы; по меди: печень > почки > жаберные лепестки > стенка
кишечника > мышцы > кровь; по цинку: печень > жаберные лепестки >
кровь > почки > мышцы > стенка кишечника; по марганцу: жаберные
лепестки > стенка кишечника > печень > почки > мышцы > кровь.
Обмен микроэлементов в организме всех исследуемых видов рыб
тесно связан с факторами пищевых цепей рыб. Так, в июле — сентябре
наблюдается процесс накапливания железа и марганца мышцами белого
амура, что согласуется с хорошей кормовой базой нагульных прудов и
увеличением скорости синтеза мышечной ткани при значительных
количествах всех элементов в печени и, как следствие этого, высоким
уровнем окислительно-восстановительных процессов, протекающих в это
время. У толстолобика довольно высокое содержание железа, меди,
марганца и цинка обнаружено в печени в середине июля, когда он активно
питался
планктоном,
ассимилирующим
большие
количества
микроэлементов, количество которого в этот период было самым большим
за сезон. Следует отметить, что пестрый толстолобик, чья пищевая цепь
наиболее обогащена микроэлементами, аккумулирует в своем организме
самые большие количества железа, меди, марганца и цинка, что
согласуется с наиболее высоким темпом роста этого вида относительно
белого амура. У планктофага выявлена очень сильная связь между
количеством цинка и железа в печени (r=+0,917), марганца и меди в
мышцах (r=+0,981), цинка и марганца в мышцах (r=+0,902). Установлена
достоверная отрицательная коррелятивная связь по меди в мышцах и
печени белого амура (r = -0,770).
Окуневые.
В порядке убывающей последовательности по содержанию
марганца органы и ткани производителей судака располагаются
следующим образом: чешуя, жаберные лепестки, печень, гонады, почки,
кровь, селезенка, мышцы; по цинку: печень, жаберные лепестки, почки,
гонады, кровь, мышцы. Депонирование печенью цинка в преднерестовый
и, особенно, в посленерестовый периоды свидетельствует о высоком
уровне процессов метаболизма у хищника в этом органе. Характерно, что в
преднерестовый период гонады самцов и самок содержали достоверно
больше цинка (Р<0,05), чем в посленерестовый. Такая закономерность
наблюдалась нами и у осетровых, и карповых рыб, что, видимо, следует
считать общим физиологическим свойством всех изучаемых семейств рыб.
Накопление меди гонадами в период нереста, также как и цинка, связано с
присутствием в этих органах высокоактивных металлоорганических
комплексов, содержащих медь и цинк, необходимых для нормального
созревания половых продуктов и дальнейшего процесса эмбриогенеза.
11
Суммарное содержание свободных аминокислот оказалось наибольшим в
печени судака (347±15,1 мг%), где происходят активные процессы
переаминирования и дезаминирования аминокислот, а в мышцах их в два
раза меньше, чем в печени и в два раза больше, чем в крови (79,1±6,12
мг%). Микроэлементные, гематологические показатели и аминокислотный
спектр у производителей судака не выходили за пределы интервалов
аналогичных параметров, приводимых другими авторами (Воробьев,
Шкодин,1980; Воробьев, 1982,1993). Это свидетельствует о нормальном
физиологическом состоянии всех изучаемых рыб, взятых из естественных
водоемов дельты р. Волги, и может быть использовано в практике
аквакультуры в качестве физиологических тестов для оценки
производителей различных видов рыб, находящихся в водоемах
рыбоводных хозяйств.
Влияние различных уровней цинка в воде на его обмен в органах и
тканях белого амура.
Учитывая биогеохимическую ситуацию западно-подстепных
ильменей, колебание содержания цинка в воде и его и физиологическую
роль в организме, мы испытали воздействие различных концентрации
этого элемента на организм белого амура, который составляет
значительную часть продукции изучаемых водоемов. Установление
корреляционных зависимостей между элементами, видами рыб и их
органами и тканями по содержанию металлов позволяет подвести
определенную теоретическую базу под разработку вопроса о воздействии
на физиологические параметры растительноядных рыб различных макрои микроэлементов, выявляя синергические и антагонистические
отношения между химическими элементами.
В наших модельных опытах участвовали двухлетки белого
амура, помещенные в аквариумы, в воду которых добавляли Zn SO4 так,
чтобы количество цинка составило 50мкг/л, 100мкг/л и 150мкг/л на
металл. В контроле (ильменная вода) цинка присутствовало 32,1±1,7мкг/л,
а содержание кальция составило 51мг/л, кислорода – 9,01 мг/л, pH – 7,1
температура воды – 180С, Mg+2 – 0,48мг/л, Na+ + К+ - 80-155мг/л, Cl- 110мг/л, SO2- - 70мг/л, НСО3 – 115мг/л, жесткость воды – 32,8, Н0. В
период эксперимента рыбы корм не получали. При такой постановке
опыта основным местом поступления цинка в организме рыб могут быть
только жабры и кожный покров. Мы обнаружили, что количество цинка в
жабрах во всех опытных группах возрастает и не зависит от времени
пребывания, а определяется содержанием металла в воде (рис.1). В то же
время в форменных элементах крови (рис.2) содержание цинка
увеличивалось по мере пребывания рыб в среде с повышенным уровнем
металла. Количество цинка в почках, печени, кишечнике и мышечной
ткани белого амура повышалось лишь при его концентрации в воде,
12
равной 100-150мкг/л (р0,05). Следовательно, рыбы могут усваивать ионы
цинка непосредственно из воды, при этом уровень его утилизации в
организме зависит от концентрации этого металла в среде обитания. Нас
интересовал вопрос не только сравнительной оценки биогенной миграции
120
100
80
мкг/кг
3 сутки
60
5 сутки
40
10 сутки
20
0
Zn 32,1
Zn 50,0
мкг/л
мкг/л
Zn 100
мкг/л
Zn 150
мкг/л
концентрация цинка в воде
Рисунок 1. Влияние содержания цинка в воде на его концентрацию в
жабрах белого амура
90
80
70
60
мг%
50
Zn 38,1 мкг/л
Zn 50,0 мкг/л
Zn 100 мкг/л
40
Zn 150 мкг/л
30
20
10
0
1 сутки
3 сутки
5 сутки
10 сутки
Рисунок 2. Влияние содержания цинка в воде на его концентрацию в
форменных элементах крови белого амура
13
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
мг/кг
Контроль
3 часа
12 часов
24 часа
Жабры Кожа Мыш ццы Гонады
Печень
Почки
ФЭК
Рисунок 3. Влияние высокого (25 мг/л) содержания сульфата цинка в воде
на распределение цинка в органах и тканях белого амура.
металлов в органах и тканях разных видов рыб при встречающихся
количествах цинка в воде дельты р.Волги, но и физиология поведения
белого амура в воде с летальной (Bengtsson, 1974; Лукъяненко, 1967, 1990;
Winum et al, 2006) дозировкой цинка, равной, по мнению авторов - 20мг/л.
Мы решили несколько увеличить дозировку металла до 25мг/л воды.
Bengtsson (1974) наблюдал гибель морских рыб от острого отравления
цинком, обусловленного резким снижением проницаемости жаберного
эпителия для кислорода. Наш опыт продолжался 10 дней. Рыб на анализ
брали через 3, 12 и 24 часа. Оказалось, что выбранная на основании
литературных данных и, даже несколько увеличенная доза цинка не
привела белого амура к летальному исходу, хотя воздействие цинком на
рыб мы наблюдали до 10 дней. В первые часы у опытных амуров резко
повысилась двигательная активность, участились дыхательные движения,
усилилась слизеобразовательная функция кожных покровов и слизистых
клеток жабр, участились кашлевые рефлекторные движения. Через 6-7
часов все это прекратилось, кроме кашлевого рефлекса, который
наблюдался до 16 часов нахождения рыб в опыте. Максимум утилизации
металла в органах рыб достигал к концу первых суток, превышая контроль
лишь в два раза. Исключение составили почки и форменные элементы
крови (рис.3), что свидетельствует о существовании у растительноядных
рыб физиологического механизма регуляции содержания цинка в
организме, который препятствует чрезмерному накоплению металла у
белого амура. Вполне вероятно, что при высоком уровне цинка в воде
барьерную функцию могут выполнять жабры, о чем свидетельствует
кашлевой рефлекс у опытных белых амуров при помещении их в воду с
высоким уровнем цинка, что как раз отражает, видимо, эту защитную
реакцию.
По-видимому,
у рыб
существует
разная
видовая
чувствительность к высоким дозам цинка в воде, тем более, что в
материнских водоемах растительноядных рыб (реки Дальнего Востока и
14
Китая) вода содержит в 5-7 раз больше цинка, чем вода р.Волги, поэтому,
вероятно, белый амур и проявил такую(возможно генетически
закрепленную) устойчивость к цинку.
Зависимость обмена цинка в организме белого амура от различного
содержания ионов кальция в воде.
Известно, что токсическое действие цинка на теплокровных
животных снижается при увеличении содержания ионов кальция в среде
обитания (Walravens, 1994). Предполагается, что защитное действие
кальция предопределяется снижением проницаемости тканей для
поступления цинка в организм животных(Guyot et. al, 2000). В наших
опытах двухлеток белого амура содержали в аквариумах, где уровень
140
120
100
50 мг/л
80
100 мг/л
60
150 мг/л
300 мг/л
40
20
0
мкг/кг
1 2 6
Печень
1 2 6
Почки
1 2 6
1 2 6
Жабры
Кишечник
1 2 6
1 2 6
сутки
Кожа
Мышечная
ткань
Рисунок 4. Распределение цинка в печени, почках, кишечнике, жабрах,
мышцах и коже белого амура, содержащегося в воде с разной
концентрацией кальция.
мг%
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Са 50 мг/кг
Са 100 мг/кг
Са 150 мг/кг
Са 300 мг/л
сутки
1
2
6
Сыворотка
1
2
6
Форменные
элементы
Рисунок 5. Влияние различных концентраций кальция в воде на
содержание цинка в периферической крови белого амура.
15
кальция в воде доводили до 50, 100, 150 и 300 мг/л при естественном
уровне цинка – 32,1±1,2 мкг/л, температура воды колебалась от 18 до
19,50С. Следует отметить, что при низких концентрациях кальция в воде в
органах и тканях белого амура накапливалось больше цинка, чем при
повышенных (300мг/л). Это справедливо для печени, почек, кожи,
мышечной ткани, форменных элементов и жабр (рис.4,5). Нами
установлено, что существует обратная зависимость между концентрацией
кальция в воде и накоплением цинка в тканях белого амура. Эта
закономерность, однако, проявлялась лишь в том случае, если содержание
кальция не превышало 150мг/л. При более высоком количестве кальция
(300мг/л) выявлено парадоксальное явление - концентрация цинка в ряде
органов и тканей (печень, кишечная стенка, жабры и кожа) достигала
уровня, который отмечался у белого амура при его пребывании в воде с
низким содержанием кальция. Механизм такого явления становится
объяснимым, если исходить из результатов исследований В. Д.
Соломатиной и Т. Г. Гребенкиной (1978), которые показали, что
интенсивность поглощения кальция карпом пропорциональна его
концентрации в воде только в диапазоне от50 до 200 мг/л. При 400мг/л
содержание кальция в органах карпа снижалась, что авторы связывают с
нарушением всасывания кальция жабрами. Вероятно уменьшение
количества кальция в тканях рыб в наших условиях сопровождается
повышенной утилизацией ими цинка. Такое допущение вполне вероятно
поскольку снижение уровня цинка мышцах, почках и тенденция к
уменьшению его количества в форменных элементах крови
свидетельствуют о меньшем поступлении цинка в организм (рис.4,5). Из
этого можно заключить что накопление цинка в организме белого амура
зависит от содержания ионов кальция в воде и органах и тканях рыб.
Влияние температуры на обмен цинка при его пероральном
поступлении в организм белого амура.
Опыты проводили при температуре воды 180С, 250С и 280С в
аквариумах, при содержании цинка в воде – 31,8±1,6мкг/л. Рыб в опыте (5
суток) не кормили и ежедневно вводили водный раствор ZnSO4 per os
зондом один раз в сутки в кишечник в дозах 150,250 и 400 мкг по металлу
на 1 кг массы тела белых амуров. Контрольные рыбы дополнительно цинк
не получали.
16
мкг/кг400
350
300
Zn 150 мкг/кг
250
Zn 250 мкг/кг
Zn 400 мкг/кг
200
Контроль
150
100
50
0
t0C
18 25 28
1-е сутки
18 25 28
2-е сутки
18 25 28
5-е сутки
Рисунок 6. Влияние температуры воды и количества вводимого per os
цинка на его содержание в стенке кишечника белого амура.
мкг/кг 300
250
Zn 150 мг/кг
200
Zn 250 мг/кг
Zn 400 мг/кг
150
Контроль
100
50
t0C
0
18 25 28
1-е сутки
18
25 28
2-е сутки
18 25 28
5-е сутки
Рисунок 7. Влияние температурного фактора и перорального введения
цинка на его содержание в жабрах белого амура.
Введение per os цинка влекло за собой повышение его количества
в кишечной стенке (рис.6), относительно контроля, при всех изучаемых
температурах воды и зависело ещё от времени пребывания белых амуров в
эксперименте. Следует подчеркнуть, что при температуре воды, равной
250С, в стенке кишечника содержалось наибольшее количество цинка при
его пероральном введении во всех изучаемых дозировках. При повышении
температуры до 280С и при дозе цинка, равной 250мкг, утилизация его
стенкой кишечника была ниже и не превышала уровня цинка в условиях
меньших нагрузок (150мкг). Следовательно, на усвоение цинка кишечной
стенкой оказывает влияние и уровень поступающих солей и, что весьма
существенно, температура окружающей рыб среды. Количество цинка в
крови белого амура при t=250С было тем выше, чем больше была доза
получаемого рыбой металла. Аналогичная картина наблюдалась и для
17
печени, почек, кожи и мышц. Концентрация цинка в жабрах возрастает с
увеличением дозы цинка per os (рис.7). Причем, при пероральном
введении металла его количество в жабрах больше, чем при добавлении
цинка в воду. Следовательно можно сделать вывод о возможной экскреции
этого элемента жаберным эпителием Высокая температура (280С)
приводила к обеднению цинком некоторых органов. Если при
относительно низких температурах воды пониженная утилизация тканями
цинка может быть результатом его замедленного поступления в организм,
то при достаточно высоких температурных условиях это может
происходить за счет более интенсивного расходования цинка. Видимо, в
это время повышается и потребность белого амура в цинке.
На примере контрольных рыб мы изучили влияние различных
температур на выделение цинка из организма белого амура при
непосредственной усвояемости цинка из воды. Выяснено, что при
мкг/сут
60
50
Zn 150 мг/кг
40
Zn 250 мг/кг
30
Zn 400 мг/кг
Контроль
20
10
t0C
0
18
25
28
1-е сутки
18
25
28
2-е сутки
18
25
28
5-е сутки
Рисунок 8. Суточное выделение цинка с фекалиями у белого амура при
пероральном введении микроэлемента под влиянием температурного
фактора.
мкг/сут0,4
0,35
0,3
Zn 150 мг/кг
0,25
Zn 250 мг/кг
Zn 400 мг/кг
0,2
Контроль
0,15
0,1
0,05
t 0C
0
18 25 28
1-е сутки
18
25 28
2-е сутки
18 25 28
5-е сутки
Рисунок 9. Суточное выделение цинка с мочой у белого амура при
пероральном введении микроэлемента под влиянием температурного
фактора.
18
мкг/мл
40
35
30
25
Zn 150 мг/кг
Zn 250 мг/кг
20
Zn 400 мг/кг
15
Контроль
10
5
t0C
0
18 25 28
1-е сутки
18 25 28
2-е сутки
18
25 28
5-е сутки
Рисунок 10. Влияние температурного фактора и перорального введения
цинка на его концентрацию в желчи белого амура.
относительно небольших количествах цинка в воде контрольных рыб
(31,8±1,6 мкг/л) повышение ее температуры приводило к увеличению
(р<0,05) экскреции металла с калом (250С-280С) и мочой (250С) в 1,5-2 раза
(рис.8,9), что свидетельствует о связи метаболизма цинка с общим
уровнем обмена веществ белого амура.
Мы полагаем, что часть выделяемого с фекалиями микроэлемента
поступает в кишечник рыб с желчью, что подтверждается увеличением в
ней цинка (рис.10) при повышенных температурах. Преимущественное
выделение цинка (рис.10) пищеварительной системой, а не почками,
вероятно связано с образованием комплексных соединений микроэлемента
с белками и другими крупномолекулярными структурами крови(Войнар,
1960; Абдурахманов и др., 2004) неподдающимися фильтрации в почечных
клубочках, что и предопределяет невысокий уровень экскреции с мочой
этого металла (рис.9), что согласуется с данными об увеличении
концентрации цинка в желчи уже через несколько часов после его влияния
на рыб.
Изучение количества цинка в жабрах показало, что оно зависит и
от температурного фактора, и от количества металла, поступающего в
организм белого амура. Следовательно, у рыб цинк выводится в,
основном, с фекальными массами и, вероятно, в какой-то мере – жабрами
и лишь очень незначительная его часть – с мочой.
19
ВЫВОДЫ
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Обмен цинка, марганца, железа и меди в органах и тканях различных
рыб (осетровые, карповые и окуневые) зависит от уровня содержания
металла в основных компонентах экосистем дельты р. Волги и, прежде
всего, от содержания их в воде и пище рыб, а также от вида, пола,
физиологического состояния и функциональных особенностей органов
и тканей. Физиологические параметры изучаемых видов рыб
находились в пределах нормы и могут быть использованы в качестве
критериев оценки производителей в аквакультуре.
Растительноядные рыбы могут регулировать обмен цинка в организме
как путем изменения интенсивности усвоения его кишечной стенкой,
так и с помощью жаберного аппарата, утилизацией металла мышцами,
кожей, костной тканью и выведением микроэлементов экскреторными
органами, где главное место занимает пищеварительная система.
Поступление, распределение и усвоение цинка органами и тканями
белого амура находится в прямой зависимости от содержания
микроэлемента в воде и от количества перорального поступления
металла в организм растительноядных рыб.
Между усвоением белым амуром цинка из воды и содержанием в ней
кальция существует обратная связь, проявляющаяся на фоне
биогенной миграции
микроэлемента в органах и тканях
растительноядных рыб.
Повышение температуры воды влечет за собой не только усиление
усвоения тканями цинка, но и увеличение выведения его из организма
белого амура при более высокой (280С) температуре воды.
Показателем уровня цинка в организме рыб служит количество
металла в форменных элементах крови, что может использоваться в
качестве физиологического теста при оценке функционального
состояния рыб в практике аквакультуры.
20
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Воробьев Д.В. Динамика микроэлементов в онтогенезе осетра в
условиях Волго-Каспийского бассейна / Воробьев Д.В., Воробьев В.И.,
Щербакова Е.Н //. Международная конференция «Тяжелые металлы и
радионуклиды в окружающей среде», - Семипалатинск; СГПИ, 2006, т.2 –
С.25-30.
2. Воробьев Д.В. Биогенная миграция микроэлементов в онтогенезе
белуги (Huso huso L.) в условиях Нижней Волги / Каниева Н.А., Воробьев
Д.В., Осипова Л.А //. Вестник Астраханского государственного
технического университета, №3 (32) /, 2006, май-июнь, Астрахань, изд.
АГТУ. С.125-130.
3. Воробьев Д.В. Влияние различных уровней цинка в воде на обмен
металлов в органах и тканях белого амура /Воробьев Д.В.//.
Международная научная производственная конференция «Экология
биосистем: проблемы изучения, индикации и прогнозирования», Астрахань.
Издательский
дом
Астраханского
государственного
университета, ч.2, 2007, - С.173-174.
4. Воробьев Д.В. Зависимость биогенной миграции микроэлементов
в организме белого амура от различных количеств Ca+2 в воде / Воробьев
Д.В. //. Международная научная производственная конференция
«Экология
биосистем:
проблемы
изучения,
индикации
и
прогнозирования». Астрахань, т. 2, 2007, С.174-175.
5. Воробьев Д.В. Биогенная миграция металлов в грунтах, воде и
растениях Нижней Волги /Воробьев Д.В., Андрианов В.А., Осипов Б.Е.//
Сб. статей (Составители: В.П. Пилипенко и А.В. Федотова). Астрахань.
Издательский дом Астраханского госуниверситета, ч.II. 2007. С. – 16-22.
6. Воробьев Д.В. Толерантность животных и растений к тяжелым
металлам. / Воробьев Д.В. // Сб. статей «Современные проблемы
агрокомплекса Астраханской области» / составители: В.Н. Пилипенко,
А.В. Федотова. – Астрахань. Издательский дом Астраханского
госуниверситета, ч.II. 2007. С. – 22-24.
7. * Воробьев Д.В. Зависимость биогенной миграции цинка в организме
белого амура от различного содержания кальция в воде / Воробьев Д.В.,
Теплый Д.Л. // Естественные науки. Журнал фундаментальных и
прикладных исследований №1 (18). Астрахань, 2007, С.37-38.
8. * Воробьев Д.В. Влияние различных уровней цинка в воде на его
обмен в органах и тканях белого амура / Воробьев Д.В. // Естественные
науки. Журнал фундаментальных и прикладных исследований №1 (18).
Астрахань, 2007, С.38-40.
9. Воробьев Д.В. Биогенная миграция металлов в экосистемах западноподстепных ильменей Астраханской области / Воробьев Д.В., Воробьев
В.И. // Современные аспекты экологии и экологического образования.
21
18
Доклады первой международной научной конференции Федерального
Агентства по образованию РФ 16-19 мая 2007 г., Астрахань, С. 42-48.
10. * Воробьев Д.В. Динамика тяжелых металлов в основных компонентах
экосистем дельты р.Волги. / Воробьев Д.В. // Естественные науки. Журнал
фундаментальных и прикладных исследований №3 (20). Астрахань, 2007,
С.11-16.
11. * Воробьев Д.В. Адаптация рыб и растений к тяжелым металлам /
Воробьев Д.В., Воробьев В.И. // Естественные науки. Журнал
фундаментальных и прикладных исследований №4 (21). Астрахань, 2007,
С.16-18.
12. Воробьев Д.В. Физиолого-биогеохимические основы применения
микроэлементов в аквакультуре. / Воробьев Д.В., Искра Т.Д., Кириллов
В.Н., Воробьев В.И. // Изд. ООО ЦНТЭБ. Астрахань, 2008., С.360.
13. * Воробьев Д.В. Влияние температуры на физиологический механизм
обмена цинка при его различном поступлении в организм белого амура. /
Воробьев Д.В. // Естественные науки. Журнал фундаментальных и
прикладных исследований №1 (22). Астрахань, 2008, С.12-15.
14. * Воробьев Д.В. Физиологическая характеристика карповых рыб в
условиях дельты р.Волги / Воробьев Д.В., Воробьев В. И. // Естественные
науки. Журнал фундаментальных и прикладных исследований №1 (22).
Астрахань, 2008, С.15-17.
15. Воробьев Д.В. Динамика некоторых микроэлементов в донных
отложениях прудов, в воде и рыбе осетровых рыбоводных заводов
Астраханской области / Воробьев Д.В., Воробьев В.И., Щербакова Е.Н. //
Альманах современной науки и образования: Изд-во «Грамота», вып.
5(12), г.Тамбов, 2008. С.31-33
16. Воробьев
Д.В.
Функциональные
особенности
организма
растительноядных рыб под влиянием цинка, кальция и температуры воды
в современных биогеохимических условиях дельты р.Волги / Воробьев
Д.В. // Материалы II Всероссийской научной конференции
«Экологические проблемы природных и урбанизированных территорий».
Издательский дом «Астраханский государственный университет».
Астрахань, 2008. С.74.
* - публикации в печатных изданиях перечня ВАК РФ
22