Document 345279

www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
Содержание
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...4
Введение...5
Обзор литературы...9
1. общая характеристика рода flav1virus...9
1.1 Химические и физические свойства флавивирусов...9
1.2 Структура генома флавивирусов...9
1.3 Функциональные характеристики белков...10
1.4 Проникновение вириона в клетку...12
1.5 Трансляция и протеолиттеский процессинг...12
1.6 Репликация РНК...13
/. 7 Сборка и освобождение вирусных частиц из инфицированных клеток...13
1.8 Антигенная классификация...14
1.9 Роль структурных и неструктурных белов в иммунном ответе...15
2. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ВИРУЛЕНТНОСТИ И ТРОПИЗМА ФЛАВИВИРУСОВ...17
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
2.1 Мутации в 5' u3'NTR, влияющие на вирулентность и тропизм...17
2.2 Мутации в поверхностном гликопротеине Е, влияющие на вирулентность, тропизм и связывание с
моноклинальными антителами...19
2.3 Мутации, влияющие на вирулентность флавивирусов, в других структурных белках...27
2.4 Влияние на вирулентность флавивирусов мутаций в последовательности неструктурных
белков...28
3. Способы профилактики клещевого энцефалита...30
4. история получения и изучения вариантов живой вакцины пютив вируса клещевого энцефалита...31
5. новешие исследования в области получения живой вакцины против вкэ...40
6. Критерии отбора и методы оценки предложенных аттенуированных вариантов живых вакцин
против вкэ...43
6.1 Критерии безопасности...43
6.2 Стабильность свойств и генетическая стабильность...50
6.3 Оценка возможной персистенции аттенуированных вирусов...53
6.4 Способы оценки эффективности вакцин...56
Материалы и методы...61
1. Вирусы...61
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
2. эксперименты на обезьянах...62
3. Приготовление образцов органов обезьян для гистологического и вирусологического анализов...62
4. гистологическое исследование цнс...63
5. эксперименты на мышах...64
6. Приготовление образцов крови...66
7. Определение виремии в сгустках крови обезьян с помощью титрования на мышах...66
8. Определение титров штамма Абсеттаров ВКЭ в органах и в сыворотках или сгустках
КРОВИ МЕТОДОМ БЛЯШЕК...67
9. Определение титров химеры ТР21/DEN4 методом бляшек...67
10. АКТИВАЦИЯ ПЕРСИСТЕНТНОЙ ИНФЕКЦИИ У МЫШЕЙ...68
П. Проведение пассажей TP21/DEN4 на VERO...68
12. Выявление вирусной РНК в мозге мышей...68
13. Секвенирование последовательностей РНК вирусов, полученных в результате пассажей химеры
на vero...69
14. иммуноферментный анализ (ифа)...71
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
15. Реакция нейтрализации...71
16. ИММУНОПРЕЦИПИТАЦИЯ ВИРУССПЕЦИФИЧЕСКИХ БЕЛКОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
ПРОТЕИН-А-СЕФАРОЗЫ...72
17. ОПЫТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КЛЕЩЕЙ...73
Результаты собственных исследований...75
1. Оценка степени аттенуации химеры ТР21 /DEN4 в экспериментах на лабораторных
МЫШАХ...75
/. /. Сравнение степени вирулентности химеры TP21/DEN4 с высоковирулентным штаммом
Абсеттаров ВКЭ и родительским штаммом ТР21 вируса Лангат...75
1.2 Разработка метода выявления вирусной РНК в мозге незаболевших мышей после i/p, Ус или i/sp
введения TP21/DEN4...76
1.3. Нейровирулентность химеры TP21/DEN4 в опытах по Ус
заражению сосунков... х 78
1.4. Сравнение уровня репродукции химеры TP21/DEN4, вируса Лангат и штамма Абсеттаров ВКЭ
при Ус введении лабораторным мышам линии BALB/c весом 10-12г...78
1.5. Степень вирулентности и скорость распространения по ЦНС химеры TP21/DEN4 в сравнении с
вирусами Лангат и КЭ при Уяр введении мышам...80
1.6. Периферическая вирулентность TP21/DEN4 на мышах...83
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
1.7. Оценка возможности персистенции химеры в организме мышей BALB/c (12-14 г) после Ур,
Ус и ysp введений...84
2. ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ ХИМЕРНОГО ВИРУСА TP21/DEN4HA МОДЕЛИ ОБЕЗЬЯН...87
2.1 Периферическая вирулентность TP21/DEN4 в экспериментах на обезьянах по сравнению с высоко
вирулентным штаммом Абсеттаров ВКЭ...87
2.2 Оценка остаточной нейровирулентности химеры TP21/DEN4 в экспериментах на зеленых
мартышках (Cercopithecus aethiops) при интрацеребральном введении...94
3. ОЦЕНКА СТАБИЛЬНОСТИ ВИРУСА TP21/DEN4 ПРИ ПАССАЖАХ НА КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК
VERO И ЧЕРЕЗ МОЗГ ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШЕЙ...101
3.1 Оценка стабильности химеры при пассажах на культуре клеток VERO...101
3.2 Оценка стабильности химеры при пассажах через мозг лабораторных мышей.../05
4. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ИММУНИЗАЦИИ ХИМЕРОЙ TP21/DEN4 ДЛЯ ЗАЩИТЫ
ПРОТИВ ВИРУСОВ КОМПЛЕКСА ВКЭ В ОПЫТАХ НА ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШАХ...107
4.1. Оценка протективной эффективности и формирование иммунного ответа при различных схемах
и способах иммунизации...107
4.2. Длительность защиты против ВКЭ при Ур иммунизации химерой в сравнении с
инактивированными вакцинами производства ФГУП ПИПВЭ u "FSM-IMMUN inject" (Immuno AG,
Австрия)...ПО
4.3. Протективная активность химеры TP21/DEN4 против других штаммов ВКЭ и вируса ОГЛ при Ур
иммунизации в сравнении с инактивированной вакциной производства ИПВЭ...114
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
5. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ИММУНИЗАЦИИ ХИМЕРОЙ TP21/DEN4 ПРОТИВ ВКЭ В
ОПЫТАХ НА ОБЕЗЬЯНАХ...116
5.1. Оценка иммуногенности химеры при s/c иммунизации...116
5.2. Оценка эффективности s/c иммунизации химерой против s/c разрешения ВКЭ...118
5.3. Оценка эффективности s/c иммунизации химерой против Ус разрешения ВКЭ...121
6. ОЦЕНКА ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ХИМЕРЫ TP21/DEN4 В ОПЫТАХ НА
КЛЕЩАХ...122
6.1. Моделирование передачи вирусов КЭ и химеры TP21/DEN4 иксодовым клещам при питании на
зараженных мышах...122
6.2. Изучение фенотипических и генетических свойств вируса, выделенного из взрослой самки I.
persulcatus при питании на мыши, зараженной химерой...126
6.3. Изучение способности химеры TP21/DEN4 к репродукции в иксодовых клещах 128
Обсуждение...130
1. БЕЗОПАСНОСТЬ ХИМЕРЫ TP21/DEN4 НА МОДЕЛИ ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШЕЙ И
ОБЕЗЬЯН...130
2. ОЦЕНКА ПРОТЕКТИВНОСТИ ХИМЕРЫ TP21/DEN4 НА МОДЕЛИ ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШЕЙ
И ОБЕЗЬЯН...140
3. ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ И ФЕНОТИПИЧЕСКОЙ СТАБИЛЬНОСТИ СВОЙСТВ ХИМЕРЫ
TP21/DEN4 ПРИ ПАССАЖАХ НА КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК VERO И ЧЕРЕЗ МОЗГ МЫШЕЙ...144
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
4. ХАРАКТЕРИСТИКА МУТАЦИЙ, НАЙДЕННЫХ В ГЕНОМЕ ХИМЕРЫ TP21/DEN4, ПРИ
ПАССАЖАХ НА КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК VERO И ЧЕРЕЗ МОЗГ МЫШЕЙ...149
5. ОЦЕНКА ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ХИМЕРЫ TP21/DEN4 В ОПЫТАХ НА
КЛЕЩАХ...151
6. РАЗРАБОТКА КРИТЕРИЕВ ОЦЕНКИ АТТЕНУИРОВАННЫХ ШТАММОВ -КАНДИДАТОВ В
ЖИВУЮ ВАКЦИНУ ПРОТИВ ВКЭ...153
Выводы...155
Список литературы...157
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
Введение
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Желтая лихорадка (ЖЛ)
Японский энцефалит (ЯЭ)
Клещевой энцефалит (КЭ)
Вирус КЭ (ВКЭ)
Открытая рамка считывания (open reading frame - ORF)
Нетранслируемая область (nontranslated region - NTR)
Гемагглютинирующая активность (ГА)
Гликозаминогликаны (glycosaminoglycans - GAGs)
Гепарин сульфат (heparan sulfate - HS)
Эндоплазматический ретикулюм (ER)
Омская гемморагическая лихорадка (ОГЛ)
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
Энцефалит Долины Мюррей (MVE)
Louping ill или шотландский энцефаломиелит овец (ШЭО)
Западный Нил (ЗН)
Киассанурская Лесная болезнь (КЛБ)
Оральная полиомиелитная вакцина (ОПВ)
s/c - субкутанно
i/sp - интраспинально
i/m - внутримышечно
i/c - интрацеребрально
i/p - внутрибрюшинно
Циклофосфан (ЦФ)
Метод флуоресцирующих антител (МФА)
Иммуно-ферментный анализ (ИФА)
Обратная транскрибция (RT) или (ОТ)
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
Полимеразная цепная реакция (PCR) или (ПЦР)
Культуральная жидкость (КЖ)
Культура клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ)
Перевиваемая культура клеток почек зеленых мартышек (VERO)
Цитопатическое действие (ЦПД)
Оптическая плотность (ОП)
Реакция нейтрализации (РН)
ВВЕДЕНИЕ
Клещевой энцефалит (КЭ) является природно-очаговой арбовирусной инфекцией с высокой 2-7 %
смертностью. Около 30% заболеваний оканчиваются инвалидизацией. В настоящее время
заболеваемость клещевым энцефалитом (КЭ) регистрируется в Австрии, Германии, Польше, Чехии,
Словакии, Финляндии, прибалтийских государствах, России, Италии, Швейцарии. Максимальные
показатели заболеваемости отмечаются в России и Австрии. В Российской Федерации клещевой
энцефалит распространен в европейской части страны, в Сибири и на Дальнем Востоке.
Эпидемиологическая обстановка по КЭ во многих областях и регионах с каждым годом ухудшается,
поскольку значительно снизилась интенсивность противоклещевых мероприятий и вакцинирования.
Ведущим фактором, определяющим заболеваемость в последние годы, является посещение очагов
неиммунными жителями городов, которые болеют в 2,5 раза чаще сельских жителей. В 1996 году через 5 лет после запрещения проведения акарицидных обработок с применением ДДТ и на фоне
резкого снижения охвата населения вакцинацией - было зарегистрировано более 10000 больных КЭ
(6,8 на 100 тысяч населения). В 2001-2002 годах отмечается снижение заболеваемости за счет
увеличения вакцинации и возобновления противоакарицидных мероприятий — 3,57-4,38 больных на
100 тысяч населения. В настоящее время для профилактики КЭ существует несколько эффективных
препаратов инактивированной концентрированной очищенной вакцины. Основным недостатком
этих препаратов является необходимость ревакцинаций с интервалом в три года и возможность
аллергических реакций. Необходимы дополнительные разработки по усовершенствованию вакцин,
направленные на увеличение длительности индуцируемого иммунитета, широты спектра действия
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
вакцин и снижения стоимости их производства. В связи с этим в течение многих лет ведутся
разработки по получению живых вакцин. В 60-е и 70-е годы в СССР, США и Чехословакии
проводились исследования по получению живой вакцины против КЭ. В это же время вырабатывались
и критерии отбора аттенуированных вирусов - кандидатов в вакцинные штаммы. Восемь вариантов
вирусов комплекса КЭ успешно прошли испытания на
ограниченном контингенте добровольцев (9 - 2500 человек). Одна из вакцин на основе штамма
Еланцев вируса Лангат была изучена в расширенном эпидемиологическом опыте на 649479 человек.
Эффективность ее была признана высокой. Однако, было зарегистрировано 35 случаев
вакциноассоциированных осложнений - лихорадящее заболевание, менингоэнцефалит, хронический
клещевой энцефалит. Прогресс в молекулярной биологии и биотехнологии привел к появлению
новых стратегий получения вакцин, таких как химеризация разных флавивирусов, специфический
мутагенез вирусных детерминант вирулентности и другие. На данный момент активно
разрабатываются живые аттенуированные флавивирусные вакцины для защиты от вирусов Денге и
вируса Западного Нила (ЗН). Разработана живая вакцина против Японского энцефалита (ЯЭ). Живая
аттенуированная вакцина против вируса желтой лихорадки на основе штамма 17D является одной из
самых безопасных и наиболее эффективных вакцин. Этот штамм активно используется для создания
химерных вирусов для защиты от вирусов ЗН и ЯЭ.
В последнее время в нескольких лабораториях мира проводятся исследования по получению
аттенуированных вирусов, которые предполагается использовать в качестве живой вакцины для
защиты от вируса КЭ. Исследования в этой области ведутся в основном в двух направлениях. Первый
подход заключается в создании химер флавивирусов, которые содержат структурные белки РгМ и Е
вирусов комплекса КЭ, второй подход направлен на выявление аттенуирующих мутаций в геноме
ВКЭ и Лангат, и получение с помощью мутагенеза вирусов, несущих эти мутации. В обоих случаях
кандидат в вакцинный штамм является вирусом, полученным генно-инженерным путем. При
создании новой живой вакцины помимо получения аттенуированного иммуногенного вируса
необходима разработка критериев его оценки, поскольку предложенные ранее требования к
вакцинным штаммам могут не учитывать специфику генно-инженерных вирусов.
Американскими учеными (Pletnev et al., 1998) была сконструирована жизнеспособная химера
TP21/DEN4, содержащая гены PreM-Е штамма ТР21 вируса Лангат, относящегося к комплексу КЭ, и
остальную последовательность РНК вируса Денге 4 типа. На модели данного химерного вируса мы
попытались определить критерии оценки аттенуированных вакцинных штаммов.
Цель и задачи работы. Целью данной работы было изучение свойств химеры флавивирусов Лангат и
Денге 4, TP21/DEN4 и на модели этого вируса уточнить критерии оценки аттенуированных штаммов кандидатов в живую вакцину против КЭ. Для этого необходимо было решить следующие задачи:
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
1. Определить степень аттенуации химерного вируса ТР21 /DEN4 и оценить возможность его
персистенции на модели лабораторных мышей.
2. Оценить уровень вирулентности химеры TP21/DEN4 при периферическом и интрацеребральном
(i/c) введении обезьянам.
3. Охарактеризовать степень иммуногенности химерного вируса, эффективность и длительность
защиты против вирусов комплекса КЭ по сравнению с инактивированными вакцинами производства
ФГУП ПИПВЭ им М.П.Чумакова и "FSM-IMMUN inject" (Immuno AG, Австрия) на модели лабораторных
мышей и обезьян.
4. Изучить генетическую стабильность вирусной популяции и стабильность аттенуированных свойств
посевного вируса TP21/DEN4 после пассажей в культуре клеток VERO и через мозг мышей.
5. Оценить экологическую безопасность химерного вируса TP21/DEN4 в опытах на иксодовых клещах.
6. Использовать данные, полученные на модели химерного вируса ТР21/DEN4, для выработки
критериев оценки безопасности и эффективности аттенуированных вирусов - кандидатов в
вакцинный штамм для защиты от КЭ. Научная новизна.
Химера TP21/DEN4 является уникальным генно-инженерным вирусом, поэтому все исследования по
изучению свойств этого вируса проводились впервые или существенно дополняли данные об этом
вирусе, полученные ранее.
1. Проведено всестороннее изучение свойств и уровня аттенуации химерного вируса TP21/DEN4 в
экспериментах на мышах разного возраста и обезьянах двух видов при i/c и периферическом
введении.
2. Изучены иммуногенность химеры, уровень и длительность протективного иммунитета,
индуцируемого химерой TP21/DEN4, в экспериментах на мышах и обезьянах для защиты от
высоковирулентных штаммов ВКЭ, относящимся к разным субтипам, и вируса омской
геморрагической лихорадки (ОГЛ).
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
3. Показана стабильность аттенуации посевного вируса TP21/DEN4 при пассажах в культуре клеток
VERO и определены мутации в генах структурных белков ргМ и Е и 3"NTR, связанные с адаптацией к
культуре клеток VERO и репродукцией в ЦНС мышей. Получена новая информация по
функциональному картированию белка Е.
4. Впервые показана возможность передачи химерного вируса клещу Ixodes ricinus в лабораторных
условиях при питании на зараженной мыши, а также возможность медленной элиминации
химерного вируса TP21/DEN4 в организме клеща Ixodes ricinus.
Научно-практическая значимость работы. Проведен первый этап изучения свойств химеры
TP21/DEN4 и показана его перспективность, как кандидата в вакцинный штамм для защиты от КЭ с
точки зрения уровня аттенуации и иммуногенности.
1. В результате работы на примере аттенуированного химерного вируса TP21/DEN4 уточнены
критерии для оценки безопасности и эффективности аттенуированных вирусов - кандидатов в
вакцинный штамм для защиты от КЭ.
2. Показано, что для химерных вирусов наиболее информативными являются эксперименты по
изучению уровня аттенуации и протективности на обезьянах и подобран вид обезьян для этих
исследований.
3. Для химерных вирусов показана необходимость проведения экспериментов по экологической
безопасности.
4. В экспериментах на мышах получены следующие новые данные по протективности
инактивированнои цельновирионнои вакцины производства ФГУП ПИПВЭ им М.П. Чумакова:
- преимущество i/m иммунизации по сравнению со стандартно применяемой s/c,
- длительность протективного иммунитета более 1 года (то есть практически пожизненный
иммунитет),
- эффективность иммунизации вакциной против вируса ОГЛ.
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. Общая характеристика Рода Flavivirus
Род Flavivirus включает 73 вируса, из которых 34 переносятся комарами, 17 переносятся клещами, 22
распространяются грызунами или летучими мышами и имеют неизвестный членистоногий вектор. 40
флавивирусов связаны с человеческими заболеваниями. Наиболее важные из них: лихорадка Денге,
желтая лихорадка (ЖЛ), японский энцефалит (ЯЭ) и клещевой энцефалит (КЭ). 8 вирусов — патогенны
для домашних или диких ^ животных, имеющих экономическое значение (Burke & Monath, 2001).
1.1. Химические и физические свойства флавивирусов.
Вирионы флавивирусов сферической формы диаметром 40-60 нм состоят из сферического
рибонуклеопротеинового ядра, окруженного липопротеидной оболочкой с маленькими
поверхностными выступами (Murphy et al., 1980). Зрелые вирионы содержат три структурных белка:
нуклеокапсидный С (12 kd), негликозилированный мембранный белок М (8 kd) и белок оболочки Е
(53 kd), который обычно гликозилирован. Белки М и Е связаны с липидной оболочкой гидрофобными
мембранными якорями. Е белок — главный компонент вирионной поверхности, он содержит
важные антигенные детерминанты, индуцирующие иммунный ответ у инфицированного хозяина
(Heinz et al., 1986).
1.2. Структура генома флавивирусов
Геном флавивирусов представлен однонитевой РНК примерно в 11 тысяч нуклеотидных оснований
(и.о.). Геномная РНК на 5'конце имеет САР 1-го типа (m'GpppAmp), а перед ним идут консервативные
для флавивирусов динуклеотидные последовательности AG. Геном вирусов, переносимых комарами
и клещами, не имеет З'концевых полиадениновых последовательностей и чаще всего кончается
динуклеотидом CU. Однако, некоторые штаммы ВКЭ содержат поли А тракт внутри
З'нетранслируемой области (nontranslated region -NTR) (Mandl et al., 1991; Wallner et al., 1995).
Большая часть геномной РНК состоит из одной открытой рамки считывания (open reading frame - ORF)
длиной более чем 10000 оснований. Перед и после этой рамки находятся 5' (95-132 основания) и 3'
(114-624) NTR, несущие консервативные последовательности
РНК, которые могут служить в качестве cis- активных элементов, направляющих процессы
амплификации генома, трансляции и упаковки (Lindenbach & Rice, 2001). Вариабельная длина 3TvfTR
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
объясняется присутствием делеций или повторяющихся последовательностей. Кодирующие и
некодирующие области РНК флавивирусов эволюционировали связанно, но длина 3'NTR не зависела
от этих связей. Предполагают, что вариабельный район изначально приобрелся во время событий
рекомбинаций и дуплекаций, но позднее в течение эволюции различные части этого района были
снова утрачены, что и проявилось в гетерогенности З'-NTR (Wallner et al., 1995).
1.3 Функциональные характеристики белков
Белок С (1 lkd) формирует структурные компоненты нуклеокапсида. Гомология в последовательности
белка С среди флавивирусов низка, но районы гидрофобных и гидрофильных аминокислот
консервативны (Lindenbach & Rice, 2001). Белок Е играет ключевую роль на разных стадиях
репродукции вируса, включая сборку, связывание с рецептором, слияние с мембраной, и является
главной мишенью для антител. Мутации в этом белке имеют большое значение для патогенности
вируса. Все 12 цистеиновых остатков в эктодомене белка Е строго консервативны и вовлечены в
образование внутримолекулярных дисульфидных мостиков, обеспечивающих стабильность
структуры белка у всех флавивирусов. Е белок у некоторых флавивирусов гликозилирован и роль Nгликозилирования в функциях белка не ясна. Будучи главным компонентом поверхности, Е белок
играет доминирующую роль в генерации нейтрализующих антител и индукции иммунного ответа
(Lindenbach & Rice, 2001).
Белок prM (26kd) - гликозилированный предшественник структурного белка М (8kd). Белок РгМ
подвергается отсроченному расщеплению в форму М и N-копцевой сегмент, секретируемый во
внеклеточное пространство. Это расщепление осуществляется в аппарате Гольджи фурин-подобной
клеточной протеазой незадолго до или одновременно с высвобождением зрелого вириона,
поскольку ргМ и М обнаруживаются во внутриклеточных и внеклеточных вирионах соответственно.
Расщепление в некоторых случаях может быть неполным, и ргМ может функционировать как
дополнительная мишень для нейтрализующих антител (Lindenbach & Rice, 2001). Гликопротеин NS1
существует в связанной с клетками, поверхностной и внеклеточной невирионной форме. Белок NS1
имеет 12 строго консервативных цистеиновых остатков, от 1 до 3 сайтов гликозилирования и участки
с высоко консервативными
10
последовательностями. Секретируемая форма NS1, полученная из клеток, инфицированных ВКЭ, или
из клеток, инфицированных дефектным рекомбинантным аденовирусом, несущим ген NS1,
встречается, главным образом, в виде пентамера или гексамера и редко в виде декамера или
додекамера. Внутриклеточная форма этого белка, однако, встречается только в виде димера (Crooks
et al, 1994). Результаты мутагенеза позволяют предположить, что С-концевая часть NS1 важна для
стабильности димера и секреции NS1. Изучение мутантов, содержащих температурочувствительные
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
повреждения в NS1, показывает роль этого белка в ранних стадиях репликации, поскольку при
непермиссивной температуре вирусная РНК не накапливается. В инфицированном хозяине
невирионный антиген NS1 циркулирует в крови и может вызывать иммунный ответ в процессе
инфицирования людей и экспериментальных животных (Lindenbach & Rice, 2001).
Белок NS3 (68-70 kd) консервативен среди флавивирусов. Является энзиматическим компонентом
РНК-репликативной машины. Белок NS3, по крайней мере, трифункционален, обладая протеазной,
хеликазной и РНК-трифосфотазной активностью. N-концевая треть NS3 содержит каталитический
домен NS2B-3 протеазы, что было показано с помощью выравнивания последовательности NS3 с
последовательностями известных сериновых протеаз трипсинового семейства, анализа делеций,
мутагенеза предполагаемой триады аминокислот (His-53, Asp-77, Ser-138 для NS3 вируса ЖЛ) и
анализа субстратсвязывающего кармана (Lindenbach & Rice, 2001). Белок NS3 содержит значительные
участки гомологии с семейством DEAD РНК-хеликаз. Была продемонстрирована РНК-трифосфатазная
активность очищенного NS3 и его 50kd-С-концевого участка, полученного протеолизом. Этот
фрагмент, скорее всего, вовлечен в образование САР-структуры на 5' конце РНК флавивирусов
(Lindenbach & Rice, 2001). Белок NS5 (103-104kd) является наиболее консервативным для
флавивирусов. Это РНК-зависимая РНК полимераза. Это предположение основано на присутствии
высококонсервативного участка внутри последовательности белка NS5, включающего
последовательность GDD (в NS5 вируса ЖЛ - 666-668), которая является характерной для известных
или предполагаемых РНК- зависимых РНК полимераз вирусов с позитивной РНК. N-концевой домен
NS5 (60-145) гомологичен участку метилтрансфераз, вовлеченных в связывание Sаденозилметионина. Было высказано предложение, что этот домен вовлечен в метилирование
5'САР-структуры (Lindenbach & Rice, 2001). NS4A и NS4B (16 kd и 27 kd, соответственно) гидрофобные
белки, ассоциированные с мембраной. Основываясь на распределении в клетке и взаимодействии с
NS1,
11
можно ожидать, что NS4A, скорее всего, участвует в репликации РНК, путем заякоривания
компонентов репликазы в клеточных мембранах, NS4B также локализуется в предположительных
сайтах репликации РНК (Lindenbach & Rice, 2001). NS2B (14 kd) - ассоциированный с мембраной
белок, содержащий 2 гидрофобных домена, окружающих консервативный гидрофильный район. Он
формирует комплекс с NS3, и является кофактором для протеолитических функций NS3. С помощью
делеционного анализа было показано, что 40-аминокислотный район в центральном
консервативном домене NS2B отвечает за NS2B-3 протеолитическую активность, т. к. мутации в
центральном домене дестабилизируют взаимодействия с NS3 (Lindenbach & Rice, 2001). Белок NS2А
(24 kd) может связываться с NS3 и NS5, а также с 3' нетранслируемой областью РНК-транскриптов и,
таким образом, может иметь функциональную роль в наборе матриц РНК к мембран-связанной
репликазе. С-концевой участок неструктурного белка NS2A может ингибировать расщепление между
NS1 и NS2A, но точная роль NS2A в процессинге не ясна (Lindenbach & Rice, 2001).
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
1.4. Проникновение вириона в клетку.
Проникновение вириона внутрь клетки происходит путем рецепторно-опосредованного эндоцитоза.
Несколько поверхностных белков клетки являются возможными кадидатами для участия в рецепции
флавивирусов (Тимофеев и др., 1990; Maldov et al., 1992; Kimura-Kuroda et al., 1994; Marianneau et al.,
1996; Salas-Benito & del Angel, 1998). Кроме того, белок Е может взаимодействовать с высоко
сульфатированными гликозаминогликанами (glycosaminoglycans - GAGs). Экспрессия гепарин
сульфата (heparan sulfate - HS) на поверхности клеток млекопитающих может отвечать за
эффективность инфекции (Chen et al., 1997, Hung et al., 1999, Mandl et al., 2001). После проникновения
вирионы обнаруживаются в раздетых эндосомальных везикулах, где при кислых рН (6,4) происходит
слияние мембраны вирусной оболочки и мембраны везикулы, что приводит к освобождению
нуклеокапсида в цитоплазму. Структурные детерминанты белка Е вовлечены в связывание вирионов
с клеточными рецепторами и во внутриэндосомальное слияние при кислых рН. Инфекционность
вируса и гемагглютинирующая активность (ГА) наиболее устойчивы при рН 8,4-8,8 (Lindenbach & Rice,
2001).
1.5. Трансляция и протеолитический процессинг
12
Инициация трансляции начинается на первом AUG кодоне в ORF, но может также
начинаться и на втором AUG кодоне у флавивирусов, переносимых комарами. Главный
продукт трансляции нарезается как во время, так и после трансляции протеазами хозяина
и вирусными протеазами. Порядок разрезания полипротеина: NH2-C-prM(M)-E-NS 1 -
NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-COOH (Rice et al., 1985).
Трансляция происходит на мембране эндоплазматического ретикулюма (ER). Во время
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
трансляции некоторые части полипротеина транслоцируются во внутреннее пространство
(люмен), тогда как другие остаются на цитоплазматической стороне ER (рисунок 1)
(Lindenbach & Rice, 2001).
Рисунок 1. Схема трансляции полипротеина флавивирусов (Lindenbach & Rice, 2001).
ER LUMEN
ГС
CYTOPLASM
1.6. Репликация РНК
После трансляции геномной мРНК репликация РНК начинается с синтеза комплиментарных
негативных нитей, на которых затем синтезируются позитивные нити путем полуконсервативного
механизма с привлечением репликативных интермедиатов (RIs) и репликативных форм (RFs).
Позитивные нити могут быть использованы для трансляции структурных и неструктурных белков,
синтеза негативных нитей или образования вирионов. Основываясь на данных о локализации
двухнитевой РНК и изучении фракций инфицированных клеток можно сделать заключение, что
синтез РНК, скорее всего, идет на мембране перинуклеарного ЭР (Lindenbach & Rice, 2001).
1.7. Сборка и освобождение вирусных частиц из инфицированных клеток
Ультраструктурные исследования показали, что морфогенез вириона происходит в ER (Murphy et al.,
1980). В транспорт нарождающихся вирионов из аппарата Гольджи к клеточной мембране, где
происходит экзоцитоз, вовлечен везикулярный механизм транспорта клетки. Расщепление ргМ
происходит непосредственно перед высвобождением зрелых вирионов. Хотя ингибирование
расщепления ргМ не нарушает
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
13
освобождение вирионов, оно необходимо для получения высокоинфекционных вирусных частиц.
Функция ргМ в гетеродимерах заключается в защите белка Е от конформационных изменений во
время продвижения незрелых вирусных частиц через внутриклеточные компартменты с более
низким значением рН (Guirakhoo et al., 1991; Heinz et al., 1994). После расщепления ргМ
взаимодействие ргМ и Е дестабилизируется, происходит перестройка гетеродимеров в димеры
белка Е. После этого белок Е приобретает фьюзогенную активность. Гемагглютинирующая активность
флавивирусов, зависящая от низких рН, возможно, связана с фьюзогенной активностью белка Е.
1.8. Антигенная классификация
Все члены рода Flavivirus имеют общие антигенные сайты. Поскольку белок Е является вирусным
геммагглютинином и основной мишенью для нейтрализующих антител, данные по перекрестной
нейтрализации и реакции торможения ГА отражают различия в антигенной структуре именно этого
белка. На основе реакции перекрестной нейтрализации с использованием поликлональных
гипериммунных антисывороток было показано присутствие у флавивирусов группо-, серокомплекс- и
типоспецифических антигенных детерминант (Casals et al., 1954,1957; De Madrid et al., 1974; Heinz et
al., 1983; Calisher et al., 1989; Kuno et al., 1998), а с помощью моноклональных антител к белку Е субкомплекс, субтип, штаммовая и субштаммовая специфичности (Schlesinger et al., 1983; Roehrig et
al., 1986; Heinz et al., 1986,1991; Calisher et al., 1988; Barrett et al., 1990). Эта классификация также
связана с основными биологическими и эпидемиологическими характеристиками флавивирусов.
Моноклональные антитела также открыли антигенные взаимоотношения на эпитопном уровне,
которые объединяют различные антигенные комплексы (рисунок 2). Было показано очень близкое
антигенное родство флавивирусов, входящих в единый антигенный комплекс (Burke & Monath, 2001).
Комплекс КЭ включает 17 антигенно-близкородственных вирусов, 13 из которых вызывают
заболевания человека (Burke & Monath, 2001). Определенные в последние годы полные или
частичные нуклеотидные последовательности большого числа флавивирусов позволили
классифицировать их с помощью построения эволюционных деревьев. Сравнение аминокислотных
последовательностей белка Е и других белков показало, что классификация по последовательностям
совпадает с серокомплексами флавивирусов, определенными с использованием поликлональных
иммунных сывороток (Blok et al., 1992; Brinton et al., 1988; Lewis et al., 1993) (рисунок 2).
14
Рисунок 2. Корреляция между % гомологии аминокислотных последовательностей белка Е
флавивирусов и группированием флавивирусов в серокомплексы с помощью поликлональных
сывороток (Burke & Monath, 2001).
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
SEROCOMPLEXES
100-
90-
80-
оя
2ш
60-50-40-
PEN
ТВЕ
POW LGT U ТВЕ
СЕЕ RSSE
V
4044
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
Комплекс клещевого энцефалита и вирус желтой лихорадки наиболее удалены друг от друга с 4044% гомологией последовательностей (зависимой от пары сравниваемых вирусов). Несколько более
тесные связи существуют между членами серокомплекса Японского энцефалита (ЯЭ) и Денге (4653%). Различные типы вируса Денге имеют 62-77% сходства по аминокислотной последовательности
(Rico-Hesse et al., 1990; Lewis et al., 1993). Внутри вирусов ЯЭ и ВКЭ уровень нуклеотидной гомологии
как минимум 72 и 77% соответственно.
1.9. Роль структурных и неструктурных белков в иммунном ответе
Будучи главным компонентом поверхности вириона, белок Е играет доминирующую роль в
генерации нейтрализующих антител и индукции иммунного ответа. Это показано путем активной
иммунизации животных очищенными субвирионными компонентами, рекомбинантными белками,
путем пассивной защиты с помощью поликлональной сыворотки и специфических моноклональных
антител к белку Е (Bray et al., 1989; Heinz et al., 1990; Konishi et al., 1992 и другие).
15
Для вирусов Денге показано, что специфические ненейтрализующие антитела и нейтрализующие при
субнейтрализующих концентрациях могут опосредовать феномен антителозависимого усиления
флавивирусной инфекции (Schlesinger et al., 1983; Liprandi & Walder, 1983; Phillpotts et al., 1985).
Антитело-зависимое усиление включает повышение связывания вируса с клетками,
экспрессирующими рецепторы к Fc иммуноглобулинов, после опсонизации антителами (Schlesinger
et al., 1983). Этот механизм может встречаться in vivo и способствовать усилению патогенеза, часто
наблюдаемого при вторичных инфекциях вирусом Денге другого типа (Halstead et al., 1988; Rothman
et al., 1999).
Низкий титр нейтрализующей активности и значительный уровень пассивной защиты на мышах
наблюдался с моноклональными антителами к ргМ белку вирусов Денге 3 и Денге 4 (Kaufman et al.,
1989). Некоторый уровень защиты был показан на мышах, иммунизированных ргМ или М (Bray et al.,
1991). По-видимому, расщепление ргМ в некоторых случаях может быть неполным и ргМ
функционирует как дополнительная мишень для нейтрализующих антител.
На поверхности инфицированных клеток экспрессируется неструктурный гликопротеин NS1, который,
кроме того, секретируется, и в этой форме был определен как растворимый комплементсвязывающий антиген (Falker et al., 1973; Cardiff et al., 1976; Falconar et al., 1990; Schlesinger et al.,
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
1990). Белок NS1 вызывает иммунный ответ в процессе инфицирования млекопитающих. Хотя
антитела к NS1 не реагируют с вирионом и не обладают нейтрализующей активностью, пассивное
внесение антител к этому белку оказывает защитное действие против вирусов Денге и ЖЛ у
экспериментальных животных (Schlesinger et al., 1986; Gould et al., 1986; Henchal et al., 1988). В
экспериментах по иммунизации очищенным белком NS1 или рекомбинантным NS1 был
продемонстрирован протективный иммунный ответ у экспериментальных животных против
гомологичного разрешения вирусами КЭ, Денге и ЖЛ (Schlesinger et al., 1986, 1987; Jacobs et al., 1992).
Рекомбинантный дефектный аденовирус Rad 51, несущий ген, кодирующий белок NS1 ВКЭ,
индуцировал протективный иммунный ответ против нескольких штаммов ВКЭ, вируса ОГЛ и вируса
Негиши в экспериментальной модели на мышах (Timofeev et al., 1998). При иммунизации
димерьШ81 были предпочтительнее мономеров (Falconar et al., 1991), более высокая степень
защиты наблюдалась при иммунизации растворимым NS1 по сравнению с мембранассоциированной формой. Предполагается, что защита может быть связана с иммунологическим
распознованием и уничтожением инфицированных клеток, экспрессирующих NS1 (Schlesinger et al.,
1992).
16
Хотя сообщалось, что существует пассивная защита моноклинальными антителами против
неструктурного белка NS3 вируса Денге 1 у мышей (Tan et al., 1990), основная иммунологическая
роль неструктурных белков (исключая NS1) по-видимому, заключается в их функционировании как
мишеней дляцитотоксических Т-лимфоцитов (Hill et al., 1993; Rothman et al., 1993).
2. Генетические маркеры вирулентности и тропизма флавивирусов 2.1 Мутации в 5' и 3' NTR,
влияющие на вирулентность и тропизм
5' нетранслируемая область флавивирусов слабо консервативна, но имеет вторичную структуру,
влияющую на эффективность трансляции генома. В 5' NTR находятся нуклеотидные остатки, обратно
комплиментарные цепям в 3'NTR минус цепей РНК, которые формируют сайты для инициации
синтеза плюс цепей. Группой исследователей (Cahour et al., 1995) было показано, что мутации в 5'
NTR, мешающие складыванию протяженных стеблевых районов, летальны, а делеции в петлях и
коротких стеблевых районах снижают инфекционность вируса. Вирус Денге, восстановленный из
делеционного мутанта по позициям 82-87, был не способен формировать бляшки в клетках комаров
и реплицироваться в комарах после интраторакальной инокуляции, что предполагает потенциальные
взаимодействия в этом районе с хозяйскими специфическими факторами. Leitmeyer с коллегами
(1999) изучали генетические отличия между Южно-азиатским и Американским генотипами Денге-2,
вызывающими разные заболевания у людей. Американский генотип вызывает только лихорадку
(DF), а азиатский - DF и Денге шок-синдром (DHF). Первые 68 н.о. 5' NTR двух генотипов оказались
идентичны, но Американский генотип имел замены по 69 и 77 позициям, что приводило к
изменению вторичной структуры.
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
3' NTR, предположительно функционирует как промотор для синтеза негативных цепей РНК и
проявляет дивергенцию в последовательностях и гетерогенность в размерах. Однако, в 3'NTR есть
участки, общие для всех флавивирусов, либо консервативные внутри таксономических групп. У
флавивирусов, переносимых комарами, в 3'NTR расположены 2 короткие консервативные
последовательности - CS1 и CS2. Последовательность CS1 имеет 26 нуклеотидов в длину и
располагается непосредственно у 3'концевой вторичной структуры. Часть CS1 комплиментарна
консервативной последовательности в районе, кодирующем белок С (5' CS), и, как предполагается,
включена в циркуляризацию вирусного генома. Комплиментарность в предполагаемом
17
Список литературы