Document 339606
advertisement
ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙУНИВЕРСИТЕТ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГОРАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ БАКТЕРИОФАГИ Учебно-методическое пособие для студентов медицинских вузов Казань, 2012 ББК 52.669.3 УДК 578.81 Печатается по решению Центрального координационно-методического совета Казанского государственного медицинского университета Составители: профессор, доктор медицинских наук Поздеев Оскар Кимович, доцент, кандидат медицинских наук Федорова Елена Романовна, ассистент, кандидат медицинских наук Валеева Юлия Владимировна. Рецензенты: проректор по научной работе и инновациям, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии, иммунологии ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ, доктор медицинских наук, профессор П.В.Калуцкий, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО «СанктПетербургская государственная педиатрическая медицинская академия» Минздравсоцразвития РФ, доктор медицинских наук, профессор А.М. Королюк. Бактериофаги (строение, свойства, практическом применение). Учебнометодическое пособие для студентов/ Поздеев О.К., Федорова Е.Р., Валеева Ю. В. - Казань: КГМУ, 2012. – 50с. Предназначено для самостоятельной работы студентов всех факультетов. Учебно-методическое пособие содержит сведения о строении, свойствах бактериофагов и их практическом применении, вопросы для самоконтроля, тесты задания и задачи по теме: «Бактериофаги». Казанский государственный медицинский университет, 2012 Оглавление Введение……………………………………………………………....................4 История открытия и изучения бактериофагов………………..…..………..……4 Химический состав фагов……………………………………….………............7 Антигенные свойства фагов………………………………………………..........7 Морфология бактериофагов…………………………………………...…..........8 Репродукция бактериофагов………………………………………………..........8 Феномен лизогении………………………………………………………….….…8 Лизогенная конверсия………………………………………………………..….14 Оценка действия литических бактериофагов……………………………........18 Методы изучения вирулентных фагов…………………………………..….….19 Методы выделения фагов…………………………………………………….....24 Практическое применение фагов………………………………………….…....24 Лечебно – профилактическое применение бактериофагов……………….…...30 Коммерческие препараты бактериофагов………………………………...…….33 Практическое занятие………………………………………………………..…..41 Вопросы для самоподготовки…………………………………………….….….42 Тестовые задания……………………………………………………………..….43 Ситуационные задачи………………………………………………….….……..44 Эталоны ответов…………………………………………………….…………...45 Оснащения занятия………………………………………………………….…..46 Литература…………………………………………………………………..……48 Приложение………………………………………………………………..……..49 4 Бактериофаги [от «бактерия», + греч. phagein, поедать] - группа вирусов, паразитирующих в бактериальных клетках. Чаще репродукция дочерних популяций бактериофагов внутри бактерий вызывают их разрушение. Бактериофаги, или фаги, широко распространены в природе — их выделяют из воды, почвы, организмов различных животных и человека. В настоящее время известны фаги, лизирующие клетки микроорганизмов, принадлежащих ко всем систематическим группам, как патогенным для человека, животных и растений, так и сапрофитам, а также для актиномицетов (актинофаги) и сине-зелёных водорослей. Сравнительно недавно обнаружены фаги, активные против грибков родов Penicillium, Aspergillus и др. В природных условиях фаги встречаются в тех местах, где есть чувствительные к ним бактерии. Чем богаче тот или иной субстрат (почва, вода, выделения человека и животных и т.д.) микроорганизмами, тем в большем количестве в нем встречаются соответствующие фаги. Так, фаги, лизирующие клетки всех видов почвенных микроорганизмов, находятся в почвах. Особенно богаты фагами черноземы и почвы, в которые вносились органические удобрения. Фаги, активные против разных видов кишечной, дизентерийной, тифозной и паратифозной палочек, часто встречаются в содержимом кишечника человека и животных, сточных водах и загрязненных водоемах. Фаги фитопатогенных микроорганизмов успешнее всего выделяются из остатков растений, пораженных этими микробами. Принципы классификации бактериофагов аналогичны подходам к систематике вирусов вообще. В основу классификации положены тип нуклеиновой кислоты, морфология фагов, спектр действия, антигенная структура, химический состав и др. Большинство фагов относится к ДНК-вым вирусам, с нуклеокапсидом, организованным по принципу смешанной симметрии. По спектру действия выделяют типовые фаги (Т-фаги), лизирующие бактерии отдельных типов внутри вида, моновалентные фаги, лизирующие бактерии одного вида, и поливалентные фаги, лизирующие бактерии нескольких видов. История открытия и изучения бактериофагов. В 1896 году Эрнест Хэнкин установил наличие выраженной антибактериальной активности воды из Ганга и Джамны в отношении холерного вибриона. Эти свойства сохранялись после пропускания через бактериальные фильтры, но исчезали при кипячении. Хэнкин предположил, что подобные свойства воды из этих рек ограничивают распространения эпидемий холеры, но не смог объяснить этот феномен. Впервые перевиваемый лизис бактерий (сибиреязвенной палочки) наблюдал Н.Ф. Гамалея (1898). При изучении свойств фильтратов сибиреязвенных бацилл, он установил его способность лизировать свежие культуры этих бактерий. В 1915 году Фредерик Туорт наблюдал аналогичные дегенеративные изменения колоний золотистого стафилококка, получившее название «стеклистое перерождение колоний». Под действием некоего фактора 5 белые или желтые, непрозрачные колонии бактерий становились прозрачными и исчезали. Исследователи установили способность фильтратов переродившихся колоний заражать и убивать новые колонии бактерий. Это явление получило название «феномена Туорта», но его природа оставалась неизученной. Истинным открывателем бактериофагов стал Феликс д'Эрель, выделивший от больных дизентерией «анти-шигеллезный микроорганизм» (1915). Именно Ф. д'Эрель, канадский сотрудник Института Пастера в Париже, ввел в практику термин «бактериофаги» - используя суффикс «фаг» не в прямом смысле «поглощать, поедать», а в смысле развития за счет чего-то. Он исследовал действие фильтратов испражнений больных дизентерией на шигеллы. После культивирования в термостате культура бактерий обычно вырастала, но однажды она не выросла, а растворилась, что совпало, по времени, с началом выздоровления больного. Это позволило Ф. д'Эрелю сделать вывод, что бактерии растворяет некий живой агент, проходящий через бактериальные фильтры, то есть вирус. Путем многочисленных пассажей на культурах шигелл в качестве «клеток-хозяев», Ф. д'Эрель размножил популяцию бактериофагов и установил их способность образовывать зоны лизиса культурах шигелл, засеянных «газоном» на чашках Петри. Лишь после создания электронного микроскопа была доказана вирусная природа бактериофагов и изучена их морфология. Открытие Ф. д'Эреля привлекло внимание врачей и позволило использовать фаги для лечения и профилактики ряда инфекционных болезней. В 1934-1935 гг. д'Эрель работал в Тифлисе (Тбилиси, Грузия), помогая в организации Международного Института Бактериофагов. С самого начала, одним из главных направлений практического применения фагов было фаготипирование - идентификация бактерий путем определения спектра их чувствительности к специфическому набору фагов. Высокая эффективность метода обусловлена высокой специфичностью многих бактериофагов в отношении их хозяев и его широко используют во всем мире. Не менее широко в лечении самых разнообразных инфекций использовалась фаготерапия. Фаги наносили непосредственно на место поражения, вносили внутрь, внутрикожно, внутримышечно, внутривенно, внутрибрюшинно либо применяли в виде аэрозолей или клизм. Их даже вводили внутрь легких, в сонную артерию и перикард. В 40-х годах ХХ века началась эпоха антибиотикотерапии и везде, исключая СССР, разработки новых бактериофагов вычеркнуты из числа перспективных исследований. Однако, уже в 80-е годы ХХ заговорили о снижении эффективности лечения антибиотиками вследствие выработки бактериями лекарственной устойчивости и интерес к фаготерапии возобновился. В начало 2000-х годов Гленн Моррис - сотрудник Мэрилендского Университета (США) совместно с НИИ бактериофагов, микробиологии и вирусологии в Тбилиси наладил испытания фаговых препаратов для получения 6 лицензии на их применение в США, а в июле 2007 г. бактериофаги были одобрены для использования в США. На протяжении нескольких последних лет исследования свойств бактериофагов проводят в России, Грузии, Польше, Франции, Германии, Финляндии, Канаде, США, Великобритании, Мексике, Израиле, Индии, Австралии и т.д. В 1940–1950 гг. работы, проведенные Г.Дельбрюком, С.Луриа, А.Дерманомм, Р.Херши и А.Львоффом по изучению структуры и физиологии взаимодействий «хозяин-фаг», заложили основание для развития молекулярной биологии, которая, в свою очередь, стала фундаментом для целого ряда новых направлений биотехнологии. В настоящее время фаги широко используют в медицинской практике и при различных биологических исследованиях. В настоящее время изучением и применением бактериофагов занимаются бактериологи, вирусологи, биохимики, генетики, биофизики, молекулярные биологи, экспериментальные онкологи, специалисты по генной инженерии и биотехнологии. По сравнению с бактериями, бактериофаги более устойчивы к воздействию различных химических и физических факторов. Они устойчивы в пределах рН 5,0-8,0, большинство из них резистентны к действию холодных водных растворов глицерина и этанола, а также цианидов, фторидов, динитрофенола, хлороформа, тимола и фенола. Бактериофаги хорошо сохраняются в лиофилизированном состоянии, но разрушаются при кипячении, под действием УФ облучения, кислот, химических дезинфектантов и формалина. Они хорошо сохраняются при низких температурах (до - 200 оС в глицерине), но быстро инактивируются при 65-70 С. Вследствие отсутствия чувствительности к антибиотикам, тимолу, хлороформу и ряду других веществ, уничтожающих сопутствующую микрофлору, эти вещества используют при выделении и сохранении фагов. Химический состав фагов. Основными компонентами фагов являются белки и нуклеиновые кислоты. Важно отметить, что фаги, как и другие вирусы, содержат только один тип нуклеиновой кислоты - ДНК или РНК и, в зависимости от типа нуклеиновой кислоты, их разделяют на ДНК-овые и РНКовые. Нуклеиновая кислота находится в головке. Внутри головки фагов обнаружено также небольшое количество белка (около 3%). Содержание белков и нуклеиновых кислот у разных фагов варьирует. У некоторых их содержание почти одинаковое и каждый из компонентов составляет около 50%. У других фагов соотношение между этими основными компонентами может быть различно. Кроме указанных основных компонентов, фаги содержат в небольших количествах углеводы и, некоторые, преимущественно нейтральные жиры. Антигенные свойства фагов. Все бактериофаги обладают антигенными свойствами, т.е. способны вызывать развитие тех или иных видов иммунного ответа. После введения фагов в организм опытного животного в сыворотке крови можно обнаружить специфические антитела, способные взаимодействовать только с конкретными фагами. Препараты таких сывороток 7 называют антифаговыми. После взаимодействия фага с антителами, содержащимися в антифаговой сыворотке, происходит инактивация фага - он теряет способность инфицировать и вызывать лизис чувствительных к нему микробов. Поскольку действие каждой антифаговой сывороток строго специфично, то их можно успешно применять для идентификации и классификации фагов, а также очистки микробных культур от фагов. С помощью фаговых антисывороток удалось доказать, что белки оболочки фага отличаются от белков чехла отростка, базальной пластинки и ее нитевидных образований, что говорит о сложности строения фаговой частицы. Морфология бактериофагов. Внешне большинство бактериофагов напоминают сперматозоиды или головастиков, но среди них встречают и другие формы, на основании чего выделяют пять основных типов бактериофагов (рис.1). Рисунок 1 - Различные морфологические типы бактериофагов а. Фаги 1 типа; представлены ДНК-овыми нитевидными фагами, лизирующими бактерии, содержащие F-плазмиды. б. Фаги 2 типа; представлены головкой и рудиментом хвоста. Геном большинства из них образован молекулой РНК и лишь у фага jc174 — однонитевой ДНК. в. Фаги 3 типа; имеют короткий хвост: например, Т-фаги 3 и 7. г. Фаги 4 типа; включают фаги с несокращающимся хвостом и двухнитевой ДНК: например, Т-фаги 1 и 5. д. Фаги 5 типа; представлены ДНК-выми вирусами с сокращающимся чехлом хвоста, который заканчивается базальной пластиной: например, Тфаги 2 или 4. 8 Строение бактериофагов наиболее полно охарактеризовано на основе изучения Т-фагов кишечной палочки (см. рисунок 2). Головка Т-фагов образована из однотипных субъединиц, организованных по принципу кубической симметрии, и может достигать размеров 100 нм. Капсомеры головки состоят из белковых молекул, построенных преимущественно из аспарагиновой и глутаминовой кислот, а также лизина. Содержание белка и ДНК в головке примерно одинаково. Геном большинства фагов образует спирально упакованная двойная нить ДНК. Число фагов, содержащих одноцепочечную молекулу ДНК или РНК, незначительно. У некоторых фагов (например, Т2) в головке находится внутреннийбелок, содержащий полиамины (спермин и путресцин) и обеспечивающий суперспирализацию большой молекулы ДНК. В таком виде она может упаковываться в сравнительно небольшом объёме. В составе фаговой ДНК обнаружены необычные азотистые основания (например, оксиметилцитозин). Рисунок 2 - Фаг Т4 кишечной палочки до контакта с бактерией (А) и в момент введения фаговой ДНК (Б) Хвост, или отросток, Т - фагов может достигать 250 нм в длину и 25 нм в ширину. Он включает полый стержень (сконструирован по принципу спиральной симметрии) и сократительный чехол, присоединяющийся к воротничку, окружающему стержень около головки. Чехол образован 120–140 белковыми молекулами, каждая из которых связывает одну молекулу АТФ и ионы Са 2+. В дистальном отделе стержня расположена шестиугольная базальная пластина с шестью шипами и шестью нитями (фибриллами). У чётных фагов (например, у Т2) окончания фибрилл опущены вниз, а у нечётных - загнуты вверх. У некоторых Т-фагов в дистальной части хвоста находится лизоцим (эндолизин). 9 Репродукция бактериофагов. В большинстве случаев бактерии, инфицированные бактериофагами, погибают, т.к. размножение и выход дочерних популяций из бактерии сопровождается её разрушением (лизисом). Такие вирусы, вызывающие гибель инфицированных бактерий, известны как литические бактериофаги. Взаимодействие бактериофагов с клеткой специфично так как они инфицируют бактерии только определённого вида. Подобно вирусам животных, репродуктивный цикл литических бактериофагов включает адсорбцию свободного фага на клеточных рецепторах, взаимодействие с ДНК клетки - хозяина, образование копий вирусных белков и нуклеиновых кислот, самосборку и выход дочерних популяций. Однако он включает и существенные различия, отличающие бактериофаги, имеющие хвостовой отросток с сокращающимся чехлом, от прочих вирусов, которые будут рассмотрены ниже (см. рисунок 3). Адсорбция. Прикрепление фага к бактерии происходит при помощи поверхностных структур бактериальной стенки, служащих рецепторами для вирусов. Например, рецепторы для фагов Т3, Т4 и Т7 расположены в липополисахаридном слое, для Т2 и Т6 — в наружной мембране. На бактериях без клеточной оболочки (протопласты, L-формы) бактериофаги не адсорбируются. Некоторые фаги в качестве рецепторов используют F-пили. Помимо рецепторов, адсорбция фага зависит от рН среды, температуры, наличия катионов и некоторых соединений (например, триптофана для Т2-фага). При избытке фага на одной клетке может адсорбироваться до 200–300 вирусных частиц. Адсорбция фага — пусковой момент его жизненного цикла, а специфичность взаимодействия с рецепторами на поверхности бактериальной 10 клетки обусловливает, в том числе, возможность практического использования бактериофагов, например для идентификации, бактерий, а также для фаготерапии и фагопрофилактики. Рисунок 3 - Литическое взаимодействие фага с бактериальной клеткой Инъекция фага. После адсорбции происходит ферментативное расщепление клеточной стенки лизоцимом, находящимся в дистальной части отростка. Базальная пластина хвоста лизирует прилегающий фрагмент клеточной стенки, выделяя присутствующий в отростке лизоцим. Одновременно в чехле высвобождаются ионы Са2+, активизирующие АТФазу, что вызывает сокращение чехла и вталкивание стержня хвоста через цитоплазматическую мембрану в клетку. Затем вирусная ДНК «впрыскивается» в цитоплазму (внедрение вирусной ДНК). Поскольку диаметр канала лишь немного превышает диаметр молекулы ДНК (около 20 нм), то ДНК способна попадать в цитоплазму только в форме нити. При этом структурные элементы фага - капсид и отросток - остаются вне клетки. Взаимодействие с геномом бактериальной клетки. Проникнув в клетку, нуклеиновая кислота фага «исчезает», т.е. диссоциирует, и уже через несколько минут обнаружить вирус не удаётся. В этот, так называемый скрытый период (эклипс) вирус берёт на себя генетическое управление клеткой, осуществляя полный цикл репродукции фага. К его окончанию составляющие фага соединяются в зрелый вирион. В зависимости от типа нуклеиновй кислоты, установление фагового генома может реализоваться через взаимодействия: а) однонитевой ДНК - с репликативным аппаратом для синтеза комплементарной ей нити и образования репликативной формы; далее ее поведение аналогично двунитевой ДНК; б) двунитевой ДНК - с транскрипционным аппаратом для синтеза мРНК и последующей трансляции вирусспецифичных белков (ферментов и структурных); в) РНК (через геном бактерии) - к трансляционному аппарату для синтеза вирусспецифичных белков (ферментов репликации и структурных). Поскольку большинство бактериофагов являются ДНК-овыми вирусами, то после инъекции вирусной ДНК (вДНК) в цитоплазму бактериальной клетки, клеточные РНК-полимеразы транскрибируют ДНК в мРНК, транслирующуюся на рибосомах. В результате осуществляется синтез вирусной полимеразы и других ранних вирусных белков. Вирусная полимераза участвует в образовании вДНК дочерних популяций. Часть образовавшейся в ДНК используется как матрица для синтеза белков головок и хвостов. После присоединения в ДНК последние образуют дочернюю популяцию фагов. Синтез фаговых белков. В первую очередь синтезируются ферменты, необходимые для образования копий фаговой ДНК. К ним относятся ДНКполимераза, киназы (для образования нуклеозидтрифосфатов) и тимидилат синтетаза. Они появляются в клетке через 5–7 мин после её заражения. 11 Клеточная РНК-полимераза транскрибирует вирусную ДНК в мРНК, которая транслируется бактериальными рибосомами в «ранние» белки фага, включая вирусную РНК-полимеразу и белки, способные посредством различных механизмов ограничивать экспрессию бактериальных генов. Вирусная РНКполимераза осуществляет транскрипцию «поздних» белков (например, белков оболочки и эндолизина), необходимых для сборки фаговых частиц дочернего поколения. Некоторые вирусы расщепляют ДНК клетки-хозяина до нуклеотидов, чтобы использовать их для синтеза собственных нуклеиновых кислот. Репликация нуклеиновых кислот. Реализуется за счёт активности вновь синтезированных вирусных ДНК-полимераз, производящих множественные копии вирусных нуклеиновых кислот. Выход дочерних популяций. Вновь синтезированные белки формируют в цитоплазме пул предшественников, входящих в состав головок и хвостов дочерних вирусных частиц. Другой пул содержит ДНК потомства. Специальные аффинные области в вирусной ДНК индуцируют объединение предшественников головок вокруг агрегатов нуклеиновой кислоты и образование ДНК-содержащих головок. Заполненная головка затем взаимодействует с хвостовой частью, образуя функциональный фаг. Весь процесс (от адсорбции до появления вновь синтезированных вирусов) занимает около 40 мин. После образования потомства («урожай», или выход фага, составляет 10–200 из одной инфицирующей частицы) клетка хозяина лизируется, высвобождая дочернюю популяцию. В разрушении клеточной стенки участвуют различные факторы: фаговый лизоцим, увеличенное внутриклеточное давление. Вирус, по-видимому, также стимулирует образование аутолизинов либо блокирует механизмы, регулирующие их синтез (подобные литические факторы выявлены в фаголизатах многих бактерий). Феномен лизогении. При изучении явления бактериофагии исследователи обратили внимание на то, что иногда встречаются культуры микроорганизмов, которые содержат фаги, хотя на эти культуры фагами и не воздействовали. Другими словами, получалось, что вирулентных свойств фага оказывалось недостаточно для разрушения бактерий. Подобные вирусы, известные как умеренные бактериофаги, претерпевают любопытные превращения, известные как редукция фага. Умеренные фаги лизируют не все клетки в популяции, с частью из них они вступают в «симбиоз», в результате чего ДНК фага встраивается в хромосому бактерии. Геном бактериофага, пребывающий в таком состоянии называется профаг. Профаг, ставший частью хромосомы клетки, при ее размножении, реплицируется синхронно с геномом бактерии, не вызывая ее лизиса, а также передается по наследству от клетки к клетке неограниченному числу потомков. Биологическое явление симбиоза микробной клетки с умеренным фагом получило название лизогения, Это название (от греч. lysis, разложение, genea, происхождение) отражает способность профага самопроизвольно либо под действием ряда 12 физических и химических факторов реактивироваться и запускать полный репродуктивный цикл, т.е. вести себя как литический бактериофаг. По своим основным свойствам лизогенные культуры принципиально не отличаются от исходных, но они невосприимчивы к повторному заражению гомологичным или близкородственным фагом и, кроме того, приобретают дополнительные свойства, контролируемые генами профага. При размножении лизогенной культуры какая-то часть клеток популяции лизируется и освобождает зрелые частицы специфичного для этой популяции умеренного фага. Сохранение способности к инфицированию у умеренного фага зависит от низкомолекулярного белкового репрессора, кодируемого вирусной ДНК и «выключающего» все вирулентные функции бактериофага. Переход умеренного фага на литический цикл развития происходит при нарушениях синтеза белкового репрессора. При этом встроенный в геном бактерии вирус проявляет все свои вирулентные свойства, репродуцируется и лизирует клетки, а также может инфицировать другие бактерии. Образование лизогенными культурами зрелых частиц фага получило название спонтанной индукции. Количество лизируемых клеток и количество образовавшихся зрелых частиц фага зависят от особенностей данной культуры и условий выращивания. В то же время количество клеток, освобождающих фаги, может быть резко увеличено при воздействии на лизогенную культуру некоторыми физическими и химическими факторами, или при создании в среде избытка некоторых питательных веществ и витаминов. При индукции некоторых лизогенных культур удавалось вызывать образование зрелых частиц фага почти у всех клеток. К индуцирующим агентам относятся ультрафиолетовые (УФ), рентгеновские и гамма-излучения, перекиси, азотистый иприт и его гомологи, этиленимин, урацил, многие антибиотики. Наиболее эффективные и широко применяемые индуцирующие факторы - УФ-облучение и антибиотик митомицин С. Как отмечалось, важным свойством лизогенной культуры является ее устойчивость к содержащемуся в ней фагу. В связи с этим выделение и изучение умеренных фагов лизогенной культуры возможно лишь в том случае, когда имеется другая культура того же вида, которая чувствительна к умеренному фагу, инфицировавшему данную лизогенную культуру. Такие культуры получили название индикаторных. К лизогенным культурам, особенно широко распространенным в природе, сравнительно легко можно подобрать индикаторные культуры среди других разновидностей этого же вида. В отдельных случаях умеренный фаг лизогенной культуры может спонтанно (без внешних воздействий) или под влиянием различных факторов измениться и стать вирулентным. Тогда фаг приобретает способность лизировать все клетки данной культуры. У некоторых лизогенных культур превращение умеренного фага в вирулентный происходит сравнительно легко, но также известны культуры бактерий, у которых экспериментально не удавалось превратить умеренный фаг в вирулентный. Возможность возникновения 13 вирулентных мутантов умеренных фагов имеет большое теоретическое и практическое значение. Не редки случаи, когда единственным доказательством лизогенности культуры является возникновение вирулентных мутантов её умеренного фага. Лизогения широко распространена среди всех систематических групп микроорганизмов. Лизогенная конверсия. Нередко под влиянием профага происходит изменение свойств микроорганизмов. Такое изменение генетических свойств, вызванное вирусной ДНК, обозначают терминами «инфекционная наследственность» или «лизогенная (фаговая) конверсия». В отличие от истинной трансдукции, где фаг выступает в роли «механического» переносчика генетического материала, при лизогенизации сам фаг (вернее, его нуклеиновая кислота) является тем генетическим материалом, который в виде профага дополнительно придается генетическому материалу клетки. Изменение генотипа и, соответственно, фенотипа в результате фаговой конверсии отмечено у многих бактерий и касается различных их свойств: культуральных, биохимических, токсигенных, антигенных, чувствительности к антибиотикам и др. Известны бактерии (например, дифтерийная палочка, холерные вибрионы, сальмонеллы, клостридии и др.), вирулентные свойства которых (обычно в виде экзотоксинов или адгезинов) кодируются лизогенными фагами. Иными словами, лизогенная бактерия будет вирулентной, тогда как её нелизогенный «двойник» останется безвредным. Кроме того, лизогения широко распространена среди стрептококков, клубеньковых бактерий, актиномицетов, микобактерий и др., также она выявлена и грибов рода Penicillium и дрожжей. Таким образом, умеренные фаги являются важным фактором изменчивости микроорганизмов. При лизогении происходит изменение наследственных свойств не только бактериальной клетки, но и фага; размножаясь в клетке, он способен захватывать некоторые гены бактерии и, инфицируя другую клетку, передаёт приобретённые гены новому хозяину. Подобная передача (трансдукция) во многом аналогична генетической рекомбинации у высших растений и животных. Например, -бактериофаг сходен с вставочными последовательностями (ISэлементами) и транспозонами, так как способен включаться практически в любой участок бактериальной хромосомы, привнося свой генетический материал и вызывая мутагенный эффект. При наличии всех типичных свойств фага, бактериофаг можно рассматривать как гигантский транспозон. При трансдукции фаг играет роль лишь механического переносчика; при этом лизогенизация клетки не обязательна. Один и тот же фаг может переносить разные свойства. Трансдукция происходит довольно редко: из одного и более миллионов фаговых частиц только одна способна осуществлять трансдукцию. При помощи трансдукции удавалось перенести от клеток-доноров клеткам-реципиентам различные свойства: токсичность, устойчивость к антибиотикам, способность продуцировать определенные ферменты, антигенные и другие свойства. Есть все основания утверждать, что абсолютное большинство 14 микроорганизмов являются лизогенными. Ни про одну культуру нельзя с уверенностью сказать, что она не лизогенная. К настоящему времени накоплен большой объём данных о том, что многие лизогенные культуры содержат 2, 3, 4 и более умеренных фагов, т.е. являются полилизогенными. Например, многие актиномицеты, проактиномицеты, клубеньковые бактерии и некоторые спороносные бактерии содержат четыре и более фагов. Содержащиеся в полилизогенных культурах фаги часто резко различаются между собой по форме частиц, антигенным свойствам и спектру литического действия. Полилизогенные культуры можно экспериментально получить с помощью воздействия на них одновременно или последовательно различными умеренными фагами. Полученные таким способом культуры не отличаются от бактерий, выделенных из природных источников. Как уже отмечалось, профаг лизогенной культуры способен превратиться спонтанно или при индукции в зрелую полноценную фаговую частицу. Однако в ряде случаев под влиянием различных факторов у профага возникают стойкие наследуемые изменения (мутации), в результате которых он при индукции не способен превращаться в полноценную частицу. Поэтому у таких культур возникают частицы, состоящие только из головки или только из одного отростка. Возможны и другие нарушения в структуре фаговой частицы. При индукции таких культур лизогенная клетка лизируется, но образовавшиеся частицы как неполноценные не способны к размножению на индикаторной культуре. Наиболее детально изучены дефектные фаги, у которых образуются одни лишь отростки. Такие фаги способны адсорбироваться на клетке, вызвать её лизиз, но не способны к репродукции. В последние годы такие дефектные фаги привлекают внимание исследователей, так как было установлено, что многие описанные в литературе бактериоцины (вещества, убивающие бактерии) представляют собой дефектные фаговые частицы. Существуют два принципиально различных типа бактериоцинов. Первые отличает низкий молекулярный вес, отсутствие способности осаждаться при центрифугировании, чувствительность к трипсину, термолабильность. Кроме того, их невозможно обнаружить электронной микроскопией. Бактериоцины второго типа имеют высокий молекулярный вес, осаждаются при центрифугировании, термостабильны и при электронной микроскопии видны в виде фагоподобных частиц или отдельных компонентов фаговой частицы (преимущественно в виде отростков). До настоящего времени, отсутствуют данные, указывающие на происхождение бактериоцинов первого типа и о возможной связи их с лизогенным состоянием культуры - продуцента. В то же время многими исследователями показано, что образование бактериоцинов второго типа тесно связано с дефектной лизогенией продуцента. Наиболее убедительное доказательство дефектной лизогении - выявление 15 дефектных фаговых частиц, количество которых значительно увеличивается при индукции вируса. Имеются все основания утверждать, что дефектная лизогения также довольно широко распространена. Она выявлена у очень многих культур, например у актиномицета, продуцирующего антибиотик стрептомицин, клубеньковых бактерий, спороносных бактерий, применяемых для борьбы с вредными насекомыми, актиномицетов Не исключено, что лизогенизация является одним из механизмов защиты бактериальной клетки от фаговой инфекции, выработанным клеткой в процессе эволюции. В известной степени, лизогенизация биологически выгодна и клетке, и фагу. Клетка при лизогенизации становится устойчивой не только к данному фагу, но и к родственным ему фагам и, кроме того, приобретает дополнительные свойства. Фаг же приобретает устойчивость к разнообразным внешним воздействиям и в то же время сохраняет потенциальную возможность перейти в вегетативное состояние и в состояние зрелой инфекционной частицы. Широкое распространение лизогении дает основание рассматривать это явление не как исключительное, а как нормальное на данном этапе эволюции микробов. Иногда можно встретить так называемые «ложнолизогенные культуры», состоящие из смеси устойчивых и чувствительных к определенному фагу бактериальных клеток. Такие культуры могут быть легко освобождены от содержащихся в них фагов или путем нескольких рассевов, с помощью специфической антифаговой сыворотки, или воздействием веществ, подавляющих активность бактериофагов. Умеренные фаги широко применяют в генной инженерии, их используют для изучения опухолевого роста, как фактор изменчивости микроорганизмов и в других исследованиях. Так как лизогенные культуры в отличие от «здоровых» чувствительны к радиации, они служат для определения надежности защиты космических кораблей от космических лучей - при ненадежной защите профаг переходит в вирулентную форму и лизирует культуру. Оценка действия литических бактериофагов. На твёрдых средах в 16 бактериальных культурах, засеянных сплошным «газоном», размножение фагов сопровождается лизисом бактерий и образованием зон просветления — «стерильных пятен». Для их обозначения предложен термин «негативные колонии бактериофага». У разных фагов они имеют строго определённые размеры и форму, например, звёздчатую у дизентерийных фагов (см. рисунок 4). При заражении бульонных культур литическим фагом наблюдают просветление среды. Способность образовывать негативные колонии в культурах чувствительных бактерий широко применяют в качестве метода фагодиагностики при идентификации возбудителей инфекционных болезней. Рисунок 4 - Негативные дизентерийного (Б) бактериофагов колонии сальмонеллёзного (А) и На чашках Петри, засеянных исследуемыми культурами, бактериофаги образуют негативные колонии, что указывает на род и даже вид бактерии (в зависимости от специфичности фага). При распознавании неизвестных бактериофагов учитывают форму негативных колоний. В данном случае дизентерийный бактериофаг образует характерные звёздчатые колонии. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ВИРУЛЕНТНЫХ ФАГОВ Для выделения фага из объектов внешней среды, органов и выделений человека и животных, культур микроорганизмов и т.д., материал из которого получают фаг, обычно фильтруют с помощью бактериальных фильтров. Подготовка материала: 1. Жидкий материал (кровь, мочу, воду, смывы с предметов и т. п.) освобождают от крупных частиц с помощью бумажного фильтра или центрифугированием, чтобы они не забили поры бактериального фильтра. 2. Вязкий материал (гной, кал) эмульгируют в изотоническом растворе натрия хлорида или бульоне, после чего освобождают от крупных частиц, как описано выше. 3. Плотный материал (кусочки органов, пищи и т.п.) предварительно измельчают, растирают в ступке со стерильным кварцевым песком, стерильными кончиками пастеровских пипеток или битыми покровными стеклами. Подготовленный материал тщательно эмульгируют в изотоническом растворе натрия хлорида или бульоне и освобождают от крупной взвеси. Полученный материал пропускают через бактериальный фильтр, освобождая от посторонней микрофлоры. Подготовка культур микроорганизмов (известных или изучаемых). В работе с фагом применяют 20 - 24 часовые агаровые культуры, или 2 6 часовые бульонные культуры. Для определения чистоты культуры готовят 17 мазки, окрашивают их фуксином Пфейффера или по Граму. В пробирку со скошенным агаром содержащим выращенную культуру наливают 3 - 5 мл изотонического раствора натрия хлорида и готовят взвесь микроорганизмов, вращая пробирку между ладонями, осторожно смывая культуру с поверхности среды так, чтобы не намочить пробку. Взвесь переносят в стерильную пробирку и разводят 1:10 (0,5 мл взвеси в 4,5 мл изотонического раствора натрия хлорида). Вся работа с фагом требует соблюдения асептики. Для этого необходима стерильная посуда (градуированные и пастеровские пипетки, чашки Петри, пробирки, воронки, колбы, ступки), а также термостат, бактериальные фильтры, центрифуга, штативы и прибор для счета колоний. Качественные методы определения бактериофагов. Вирулентные бактериофаги лизируют чувствительные к ним микробные культуры (тест-культура). Выявление фага на плотных средах. Приготовленную взвесь тесткультуры засевают «газоном» в чашку Петри на поверхность агара. Посев подсушивают в термостате 30 - 40 мин при открытой крышке, затем наносят на чашку каплю изучаемого материала. Когда жидкость впитается, чашки с посевами помещают в термостат при 37 °С на 18 - 20 часов. При наличии фага в изучаемом материале, произойдет лизис тест - культуры и на месте, куда была нанесена капля, культура или совсем не вырастет (сплошной лизис) или образуются отдельные колонии фага. Выявление фага в жидких средах. Для опыта используют две пробирки с мясо-пептонным бульоном, в которые вносят по одной капле культуры микроба, в отношении которого изучают фаг. В первую пробирку добавляют исследуемый фаг или фильтрат материала, в котором его определяют, а вторая пробирка служит контролем роста культуры. Посевы термостатируют 12 - 20 часов при 37 °С. Результаты учитывают только при наличии роста культуры в контроле (помутнение среды). Отсутствие видимого роста или последующее просветление среды в пробирке с изучаемым материалом подтверждает присутствии фага. Если в этой пробирке отмечается помутнение, то исследование необходимо дополнить посевом на плотную среду, так как помутнение могло произойти из-за роста культуры устойчивой к фагу. Если в посеве на МПА фаг не будет обнаружен, то можно сделать вывод, что его нет в изучаемом материале. Количественные методы. При проведении многих микробиологических исследований количественные методы определения фагов имеют большое значение. Врачу нужно знать активность фага, чтобы правильно установить его дозу для лечения и профилактически инфекционного заболевания, а исследователю - чтобы выяснить, как изменяется активность фага в эксперименте. Активность фага выражают понятием титр. Его можно определять на жидких питательных средах по методу Аппельмана и плотных питательных средах титрованием по методу Грациа. 18 Титр фага в жидкой питательной среде — наибольшее его разведение (или наименьшее количество), которое подавляет рост тест - культуры в условиях данного опыта, а на плотной среде титр фага — количество фаговых частиц (вирионов) в 1мл исходного материала. Титрование фага в жидкой среде по методу Аппельмана. В 12 стандартных стерильных пробирок наливают по 4,5 мл стерильного бульона. Уровень жидкости во всех пробирках должен быть одинаковым, для чего бульон разливают пипетками, объемом 5 или 10 мл. При постановке опыта нельзя использовать нестандартные пробирки, различающиеся между собой диаметром и высотой. Пробирки ставят в штатив и нумеруют от 1 до 10. При титровании фага ставят контроль культуры (КК) — т.е. на ее способность выживать и размножаться на данной среде и контроль фага (КФ) и бульона на стерильность. На одиннадцатой пробирке пишут «КК» (контроль культуры), а на двенадцатой - «КФ» (контроль фага). Все пробирки, в которых проводят опыт, должны быть надписаны. В десяти пробирках готовят последовательные десятикратные разведения фага с 101 до 1010 (см. таблицу 1). Для разведения фага пользуются пипетками, объемом 1-2 мл. В первую пробирку и контроль фага вносят по 0,5 мл фага. Сменив пипетку, новой пипеткой тщательно перемешивают содержимое 1-й пробирки и переносят 0,5 мл его во 2-ю пробирку; 0,5 мл содержимого 2-й пробирки переносят в 3-ю и так далее до 10-й пробирки, меняя каждый раз пипетки. Перемешав содержимое 10-й пробирки, 0,5 мл жидкости из нее выливают в дезинфицирующий раствор. Также поступают с содержимым пробирки контроля фага. Уровень жидкости в пробирках должен быть одинаковым. В о в с е пр о б и р к и , кр о м е п р о б и р к и ко н т р о л я фага, вносят по 1 капле (0,05 мл) взвеси тест - культуры. Пробирки встряхивают. Во всех пробирках, кроме пробирки контроля фага, должна появиться слегка заметная муть. Если этого не происходит, все операции с не стан дартной пробиркой повторяют вновь. Пробирки с посевами помещают в термостат при 37 °С на 18-20 часов, затем учитывают результат титрования. Учет результатов обязательно следует начинать с конт ролей. При правильной постановке опыта содержимое пробирки КК становится мутным, что указывает на рост и размножение бактерий и что питательная среда обеспечивает развитие микроорганизмов в данных условиях опыта. Соответственно, отсутствие помутнения в пробирках с культурами, в которые был внесен фаг, указывает на его литическое действие. В пробирке с контролем фага (КФ) жидкость должна остаться прозрачной. Это позволит сделать вывод, что посуда, бульон и фаг стерильны, т.е. не загрязнены посторонней микрофлорой. 19 После учета правильных результатов контролей регистрируют характер изменений в десяти опытных пробирках. Рост культуры в пробирках «опытного» ряда говорит об отсутствии или недостаточном количестве в них фага в материале от больного. Затем устанавливают титр фага, то есть его наибольшее разведение, в котором произошел лизис культуры и содержимое пробирки прозрачно. Обозначают титр степенью разведения фага со знаком плюс, что соответствует порядковому номеру пробирки. Например, если культура не растет в пяти опытных пробирках, титр фага равен 10 5 (таблица 1). Таблица 1 - Схема титрования фагов по методу Аппельмана Пробирки Опыт Ингредиенты 1 Бульон Исследуемый фаг Культура микроба 4,5 4,5 0,5 0,5 0,05 0,05 2 3 4 5 6 7 8 9 0 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 контроль 1 куль-ры 4,5 0,05 фага 4,5 0,5 Разведение фага 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 01 02 03 04 05 06 07 08 09 010 Пробирки тщательно встряхивают и инкубируют при 37С 18-10 ч. Результат – – – – – + + + + – 10 1 – отсутствие роста микробов в пробирке; + наличие роста микробов. Титрование фага на плотной среде методом агаровых слоев по Грация. Метод позволяет определить количество фаговых частиц в титруемом материале. Основан на том, что каждая частица фага на чашке Петри с чувствительными бактериями, засеянными газоном, дает зону просветления (лизиса), то есть образует отдельную негативную колонию, или бляшку. 20 Чашки с 20-25 мл МПА покрывают стерильной фильтровальной бумагой и подсушивают в термостате или под бактерицидной лампой (расстояние от лампы не более 2 м). Титруемый фаг разводят от 10-1 до 10 -10 (как в предыдущем опыте). Полученный материал из каждого разведения переносят по 1 мл в другие пронумерованные пробирки, в которые заранее наливают по 2,5 мл 0,7% МПА, расплавленного и остуженного до 45 °С (соответственно из 1-й в 1-ю и так далее до 10-й). После этого в каждую пробирку добавляют по 0,1 мл тесткультуры. Содержимое пробирок быстро перемешивают, не давая застыть агару и выливают на поверхность среды в чашке Петри с номерами, соответствующими номерам пробирок. После застывания агара чашки ставят в термостат при 37 °С. Результаты опыта учитывают через 18-20 часов. В отрицательном случае зоны лизиса бактерий на чашках с посевами будут отсутствовать. В положительном случае при большой концентрации фага (в первых чашках) произойдет сплошной лизис культуры. В тех разведениях фага, в которых находилось небольшое количество частиц фага, появятся изолированные колонии, которые необходимо подсчитать. Для исключения ошибки в подсчете, каждую учтенную колонию помечают со стороны дна чашки. Чтобы установить количество частиц фага в 1 мл фаголизата, пользуются формулой: п = у х 10 х, где п - искомое число; у - количество выросших на чашке колоний фага; х степень разведение фага в чашке, в которой подсчитаны колонии. Например, если в чашке с разведением фага 10-3 (1:103) выросло 15 колоний, то в 1 мл исходной жидкости содержится 15 х 10 3 или 1,5 х 104 частиц фага. Более точные результаты получают, если определяют количество частиц фага в исходной жидкости по нескольким разведениям и вычисляют среднее арифметическое. Например, при разведении фага 10 -4 выросло 320 колоний, следовательно, в 1 мл исходной жидкости было 320 x 10 4 или 3,2 х 106/мл частиц фага. При разведении фага 10-5 выросло 31 колонии, следовательно, в исходной жидкости было 3,1х106/мл частиц фага. При разведении фага 10 -6 выросло 3 колоний, следовательно, в исходной жидкости было 3х10 6/мл частиц фага. Сложив величины, полученные при этих подсчетах и разделив сумму на 3 (количество проведенных подсчетов), устанавливают число частиц фага в 1 мл титруемого препарата. В нашем случаен оно равно 3,1 х 10 6/мл частиц фага. Подсчитывать колонии лучше всего на чашках, где выросло не меньше 5 и не больше 50 колоний. В противном случае страдает точность подсчета. Если на чашке много колоний, чашку можно разделить на несколько секторов, сосчитать колонии на одном из них и полученную цифру умножить на количество секторов. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ФАГОВ 21 Прямой метод. Позволяет получить и изучить фаги в фильтратах исследуемого материала. О наличии и активности фага узнают по лизису чувствительной к нему тест-культуры. Прямой метод, обычно, не дает убедительных результатов из-за малого количества фага, содержащегося в фильтрате. Для повышения его количества используют методы обогащения. Метод обогащения. Полученный фильтрат исследуемого материала вносят в 2-3 часовую бульонную культуру соответствующих микроорганизмов. Посевы инкубируют при 37 °С 18-24 часа. Бактериофаг размножается в клетках культуры и титр его значительно увеличивается. Затем бульон фильтруют и в фильтрате определяют свойства и активность фага. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ФАГОВ Использование бактериофагов в медицинской практике основано на их строгой специфичности к инфицированию чувствительных микробных клеток. В соответствии с этим бактериофаги применяют для профилактики, лечения инфекционных заболеваний, а также идентификации и типирования их возбудителей. Фагопрофилактика - способ предупреждения развития заболеваний в очагах инфекции посредством применения коммерческих препаратов бактериофагов. Фаготерапия - метод лечения инфекционных заболеваний, посредством применения коммерческих препаратов бактериофагов к которым чувствительны возбудители. В настоящее время выпускают следующие препараты для лечения и профилактики: - дизентерийный поливалентный; - сальмонеллезный поливалентный групп А, В, С, В, Е; - брюшнотифозный; - стафилококковый; - стрептококковый; - синегнойный; - протейный; - клебсиеллезный; - коли-фаг; Также выпускают комбинированные препараты из нескольких видов бактериофагов: - коли-протейный; - пиобактериофаг; - интести-бактериофаг; - поливалентный (секстафаг). 22 Фагодиагностика - метод идентификации выделенных культур микроорганизмов, основанный на способности диагностических фагов лизировать чувствительные бактерии. В основе фагодиагностики и фаготипирования лежит принцип совместного культивирования выделенного микроорганизма с соответствующими видовыми или типовыми фагами. Положительным результатом считается наличие хорошо выраженного лизиса исследуемой культуры с видовым, а затем с одним из типовых фагов. Например, если лизис колоний вызван дизентерийным бактериофагом, то выделенные бактерии являются культурой шигелл. Строгая специфичность типовых фагов дает возможность идентифицировать отдельные варианты (фаговары) внутри вида. Таким образом обычно типируют золотистый стафилококк и возбудитель брюшного тифа. Фаготипирование имеет большое значение в эпидемиологии, так как позволяет расшифровывать эпидемиологические цепочки, т.е. установить источник инфекции. Диагностические бактериофаги широко применяют для идентификации бактерий, выделенных от больного или из инфицированных объектов внешней среды. С помощью бактериофагов вследствие их высокой специфичности можно определить виды бактерий и с большей точностью отдельные типы выделенных бактерий. В настоящее время широко применяют фагодиагностику и фаготипирование бактерий родов Salmonella, Vibrio и Staphylococcus. Особое значение имеет их применение в экспресс-диагностике особо опасных инфекций (чума, холера, сибирская язва и др.), т.к. позволяет быстро идентифицировать возбудитель и своевременно организовать карантинные мероприятия. Фаготипирование помогает устанавливать источник инфекции, изучать эпидемиологические связи, отличать спорадические случаи заболеванийаотаэпидемических. В основе фагодиагностики и фаготипирования лежит принцип совместного культивирования выделенного микроорганизма с соответствующими видовыми или типовыми фагами. Положительным результатом считается наличие хорошо выраженного лизиса исследуемой культуры с видовым, а затем с одним из типовых фагов. Фаготипирование. Для типирования бактерий суточную агаровую культуру испытуемого штамма засевают в 2,5 мл бульона Хоттингера или мясопептонного бульона (рН 7,2-7,4) и культивируют 3-4 часа при 37°С (до появления помутнения, видимого невооруженным глазом). Одновременно в чашки Петри заливают по 25-30 мл 1,2% агара на бульоне Хоттингера, дополненным внесением свежей мясной воды (рН 7,5±0,1), 0,4% глюкозы и CaCl2. Хлористый кальций добавляют в расплавленный агар непосредственно перед разливом (из расчета 0,2 мл стерильного 10%-ного раствора CaCl2 на 100 мл агара). Чашки Петри, накрывают стерильными фильтрами и после застывания подсушивают 30-40 минут при 36-37 С. Затем чашки засевают исследуемой бульонной культурой с помощью пастеровской пипетки «газоном». Избыток 23 культуры удаляют пипеткой. Открытую чашку с агаром накрывают стерильным фильтром и подсушивают 30-40 минут 36-37 °С. Дно засеянной чашки расчерчивают маркером на 23 квадрата (по числу типовых бактериофагов) и в каждый квадрат засеянной чашки петлей диаметром, 2мм или тонко оттянутой пастеровской пипеткой наносят каплю соответствующего бактериофага всегда в одном и том же порядке (таблица 2). Таблица 2 - Расположение бактериофагов на квадратах чашки Петри 29 52 52А 79 3А ЗС 55 71 42Е 47 53 54 77 83А 84 85 96 81 95 После нанесения на газон культуры одного из бактериофагов петля прожигается, а пастеровская пипетка меняется. При нанесении бактериофагов следует избегать касания пипеткой поверхности агара во избежание возможности переноса культуры. После подсыхания капель бактериофагов чашку переворачивают крышкой вниз и инкубируют 18-20 часов при 30 °С, либо 5-6 часов при 36-37 °С с последующим культивированием течение 20-22 часов при комнатной температуре. На чашке образовались негативные колонии на квадратах №77 и №81. (рис. 5). 24 Рисунок 5 - Учет результатов культуры S. aureus при фаготипировании Исследование начинают рабочим разведением бактериофагов, соответствующим 1 ТР (титр разведения, в нашем примере разведение 10‾³). При наличии отрицательного результата (отсутствие учитываемого лизиса хотя бы с одним бактериофагом), культуры типируют повторно разведением бактериофагов, соответствующим 100 ТР (в нашем примере разведение 10‾1). Учет и регистрация результатов. Результаты выражают в «крестах»: «++++» — сливной (полный) лизис; «+++» — полусливной лизис (незначительный рост культуры в зоне лизиса); «++» — наличие в месте нанесения капли бактериофага свыше 50 колоний бактериофага (пятен лизиса); «+» — от 20 до 50 колоний бактериофага; «±» — менее 20 колоний бактериофага; — полное отсутствие лизиса. 25 Для упрощения схемы учета степени лизиса, результаты, результаты «++++», «+++», «++» — обозначают как «сильная реакция». При типировании бактериофагами возможен еще один результат, называемый «ингибицией» (подавлением) и обозначаемый «0». Также некоторые бактериофаги могут давать неспецифическое подавление роста бактерий в виде истончения газона в месте нанесения бактериофага. Однако, при разведении такого бактериофага негативных колоний не выявляют. Штамм считают типируемым, если хотя бы один бактериофаг вызвал «сильную реакцию». Если при использовании 1 ТР и 100 ТР получены только «слабые реакции», обозначаемые «+» или «±», либо лизис полностью отсутствует, то такой штамм следует считать нетипируемым. Результаты типирования регистрируют, записывая против названия штамма разведения бактериофагов, с помощью которых был получен положительный результат (1 ТР или 100 ТР), а также номера бактериофагов, обусловивших «сильную реакцию». Отдельно, в скобках следует записывать наличие «слабых реакций», если таковые имелись. При учете результатов записывают фагогруппы стафилококков (таблица 3). Таблица 3 - Фагогруппы стафилококков Фагогруппы Номера бактериофагов I II III V Вне групп 29, 52, 52А,79, 80 3А, 3С, 55, 71 6, 42Е, 47, 53, 54, 75, 77,83А, 84, 85 94, 96 81,95 Например, штамм №3564 1 ТР 6++, 47++, 53++, (42E±). Фагомозаика этого штамма 6/47/53+ где ± означает наличие дополнительной «слабой реакции». Полученный результат дает основание отнести штамм №3564 к III-ей фагогруппе. Штаммы золотистых стафилококков чаще лизируются не одним, а несколькими бактериофагами, что дает для каждого штамма характерную для него фагомозаику. В зависимости от бактериофагов, входящих в эту фагомозаику, штаммы стафилококков относят к тем или иным фагогруппам: I, II, III, смешанная I+III и т.д. Если штаммы обнаруживают одну и ту же фагомозаику, то они идентичны. Если фагомозаики различаются на 1, 2 и более «сильных реакций» в качестве ориентировочной установки следует принять правило: культуры стафилококка при типировании в один и тот же день, дающие фагомозаики, различающие на 1 «сильную реакцию», следует считать идентичными; если 26 разница составляет 2 и более «сильных реакций», штаммы следует признать разными. Например: штамм №3564 1ТР 6++, 47++, 53++, (42Е±) штамм №3565 1ТР 47++, 53++ штамм №3566 1ТР 47++, 75++ Штаммы №3564, 3565 можно считать идентичными (различие на 1 «сильную реакцию» - бактериофаг 6), а штамм №3566 - отличным от них (различие на 2-3 «сильных реакции» - бактериофаги 53, 75, 6). Для получения правильного ответа в каждом отдельном случае необходимо иметь, по возможности, наиболее полную информацию о выделенной культуре: источник и дату выделения, патогенные свойства, чувствительность к антибиотикам и т.д. Также фаготипирование проводят для определения неизвестного фага с помощью известной тест-культуры микроорганизмов. Например, если исследуемый бактериофаг лизирует культуру возбудителя холеры, то это холерный бактериофаг. Кроме того, в диагностике инфекционных заболеваний нашел применение ускоренный метод с помощью реакции нарастания титра фага (РНТФ), не требующей выделения чистой культуры возбудителя. Исследуемый материал (от больного или из объектов внешней среды) и индикаторный известный бактериофаг, титр которого строго установлен, вносят в бульон. После культивирования в термостате определяют титр фага по методу Грациа. Наростание титра (числа негативных колоний) фага в 5 раз и более говорит о том, что в исследуемом материале есть соответствующие возбудители, в которых фаг репродуцировался. ЛЕЧЕБНО – ПРОФИЛАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ В настоящее время принято считать, что вполне доказана неэффективность фаготерапии большинства инфекционных заболеваний. Тем не менее, многие аспекты подобной точки зрения являются следствием недостаточно и не должным образом изученных фактов. Причины такого недоверия к фаготерапии могут быть обусловлены: - Неправильным или недостаточным пониманием гетерогенности и экологии бактериофагов, а также чувствительных к ним бактерий. Например, бактериальную дизентерию могут вызывать различные виды шигелл и неадекватно выбранный фаг не будет эффективен. - Низкой эффективностью селекции фагов, высоко вирулентных против соответствующих бактерий. - Неудовлетворительными результатами применения моновалентных бактериофагов при инфекциях, вызванных, на самом деле, несколькими возбудителями. 27 - Появлением бактерий, резистентных к заражению бактериофагами. Такие штаммы могут возникнуть в результате селекции устойчивых мутантов (это часто происходит, при использовании только одного штамма фага против конкретной бактерии) или за счет лизогенизации (при инфицировании умеренным фагом). - Неправильной систематизацией бактериофагов либо ошибками в производстве (в отношении титра) препаратов, некоторые из которых были полностью неактивны. - Инактивацией многих бактериофагов в условиях низкого рН желудка при применении препаратов внутрь, а также неспецифическим ингибирующим действием различных факторов в жидкостях организма. - Избыточным высвобождением эндотоксинов вследствие массивного лизиса грамотрицательных бактерий в организме больного, что может привести к токсическому шоку (феномен Яриша-Херцхайера). Но подобная проблема также может возникнуть и при применении антибиотиков или антибактериальных химиопрепаратов. - Недостаточной готовностью бактериологических лабораторий для надежной и тщательной идентификации этиологически значимых бактерий, что делает малоэффетивной фаготерапию ввиду ее строгой специфичности. Тем не менее, существуют и очевидные преимущества фаготерапии. - Репродукция бактериофагов регулируется естественным путем, поскольку она поддерживается до тех пор, пока имеются чувствительные бактерии, а затем они постепенно элиминируются из организма и окружающей среды. - Действие бактериофагов строго специфично, по сравнению с антибиотиками, и не вызывает выраженных нарушений в составе микробных сообществ в нестерильных полостях организма человека. В тоже время дисбиотические нарушения, вызванные применением многих антибиотиков, могут приводить к развитию серьезных вторичных инфекций. Наиболее яркими примерами являются неспецифические псевдомонозы, трудно поддающиеся лечению, и псевдомембранозные колиты, вызываемые Clostridium difficile. Несомненно, что такие осложнения увеличивают затраты на лечение, а также могут быть причиной летальных исходов. - В сравнении с антибиотиками, число мутантных штаммов, резистентных к бактериофагам значительно ниже. - Фаготерапия дает мало побочных эффектов и особенно показана для лиц с гиперчувствительностью к антибиотикам. - Бактериофаги можно использовать и для санации лечебнопрофилактических учреждений и поликлиник для борьбы с госпитальными инфекциями. - Бактериофаги можно применять как в виде монотерапии, так и в сочетании с антибиотиками, что значительно снижает риск селекции резистентных штаммов бактерий. 28 - Несомненные преимущества имеет местное использование бактериофагов, поскольку они продолжают репродуцироваться и проникать глубже в очаг поражения до тех пор, пока в нем остаются жизнеспособные бактерии. В противоположность им, концентрации антибиотиков или антисептиков быстро снижаются по мере удаления от поверхности. С терапевтической целью бактериофаги применяют самыми разными способами. Для коррекции кишечных дисбиозов жидкие препараты применяют внутрь или per rectum при помощи клизмы. Таблетированные формы принимают внутрь. Также возможно использование бактерифагов в форме ректальных свечей. При кожных и раневых инфекциях их применяют в форме примочек на очаги поражения. При фарингитах, ларингитах и тонзиллитах препараты используют для орошения или полосканий. Для лечения отитов препараты закапывают в уши. При лечении абсцессов практикуют введение в его полость ватного шарика, пропитанного препаратом. Больным, страдающим хроническими остеомиелитами, препарат вводят непосредственно в пораженный участок кости. Также препараты можно вносить в различные полости — брюшную, плевральную и суставные, а также применять в форме аэрозолей при легочных поражениях. При инфекциях мочевыводящих путей бактериофаги вливают непосредственно в пораженный орган с помощью зонда. При гинекологических заболеваниях препарат вливают в матку либо применяют влагалищные тампоны, пропитанные ими. Особое направление составляет фагопрофилактика - применение бактериофагов для предупреждения инфекционных болезней в эпидемических очагах путем применения бактериофагов среди лиц с высоким риском заражения. Для профилактики инфекционных заболеваний бактериофаги назначают лицам, имеющим контакт с больным в очаге заболевания. КОММЕРЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ БАКТЕРИОФАГОВ Для промышленного получения препаратов бактериофагов используют хорошо изученные штаммы микроорганизмов и фагов, обычно выращиваемые в реакторах, что позволяет получать большие количества фаголизата. Лечебно-профилактические бактериофаги выпускают в жидком виде (в ампулах и флаконах), в таблетках и свечах. Таблетки фагов, предназначенные для приема внутрь, покрыты кислотоустойчивой оболочкой, защищающей фаги от действия желудочного сока. Все препараты фагов подлежат обязательному контролю на отсутствие посторонней флоры, безвредность и активность (титр), осуществляемому на выпускающем их производстве. Выборочный контроль производят в ФГБУ «Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича» Минздравсоцразвития России. На препараты наносят этикетку в которой указано: учреждение выпускающее бактериофаг, 29 название фага, серия, номер контроля и срок годности. Каждая упаковка снабжена наставлением по условиям применения и хранения фага. БАКТЕРИОФАГ ДИЗЕНТЕРИЙНЫЙ ПОЛИВАЛЕНТНЫЙ Представляет собой стерильный фильтрат фаголизата возбудителей дизентерии S. sonnei и S. flexneri типов I, II, III, IV и VI. Препарат обладает строгой специфичностью, но не подавляет нормальную микрофлору и безвреден для человека. Препарат — прозрачная жидкость желтого цвета различной интенсивности; выпускается по 20, 50, 100 мл во флаконах. Также изготавливают в таблетированной форме, включающей лиофилизированный стерильный очищенный концентрат фаголизата штаммов возбудителей дизентерии S. sonnei и S. flexneri типов I, II, III, IV и VI. Таблетки во флаконах по 50 штук либо 25 штук. Свечи для ректального введения по 10 штук. Использование препарата приводит к элиминации возбудителей дизентерии Зонне и Флекснера в микробиоценозе кишечника, вследствие этого, лечению дизентерии. Показания к применению: лечение и профилактика дизентерии, санация бактерионосителей (Рис.6). БАКТЕРИОФАГ САЛЬМОНЕЛЛЕЗНЫЙ Представляет собой стерильный фильтрат фаголизата бактерий сальмонелл: группы А - S. paratyphi А, группы В – S. paratyphi В, S. typhimurium, S. heidelberg, группы С – S. newport, infantis, S. choleraesuis, S. oranienburg, группы Д - S. dublin, S. enteritidis, S. gallinarum, группы Е - S. anatum . Препарат обладает строгой специфичностью, но не подавляет нормальную микрофлору и безвреден для человека. Препарат - прозрачная жидкость желтого цвета различной интенсивности; выпускается по 100 мл во флаконах. Также изготавливают в таблетированной форме, включающей лиофилизированный стерильный очищенный концентрат фаголизата возбудителей сальмонеллезов - группы А - S.paratyphi А, группы В - S. paratyphi В, S. typhimurium, S. heidelberg, группы С - S. newport, S. infantis, S.choleraesuis, S. oranienburg, группы Д - S. dublin, S. enteritidis, S. gallinarum, группы Е S.anatum. Таблетки во флаконах по 50 штук либо 10-25 штук, в свечах по 10 штук в упаковке. Использование препарата приводит к элиминации возбудителей сальмонеллеза и, вследствие этого, лечению сальмонеллезов. Показания к применению: лечение и профилактика сальмонеллезов, санация реконвалесцентов (бактерионосителей) (Рис.7). БАКТЕРИОФАГ БРЮШНОТИФОЗНЫЙ 30 Представляет собой стерильный фильтрат фаголизата возбудителя брюшного тифа. Препарат обладает строгой специфичностью, но не подавляет нормальную микрофлору и безвреден для человека. Препарат в таблетированной форме включает лиофилизированный стерильный очищенный концентрат фаголизата штаммов возбудителя S. typhi. Таблетки во флаконах по 50 штук либо 10 штук. Использование препарата приводит к элиминации возбудителя брюшного тифа и, вследствие этого, лечению брюшного тифа. Показания к применению: лечение и профилактика брюшного тифа. БАКТЕРИОФАГ СТАФИЛОКОККОВЫЙ Представляет собой стерильный фильтрат фаголизата золотистого стафилококка. Препарат обладает строгой специфичностью, но не подавляет нормальную микрофлору и безвреден для человека. Препарат - прозрачная жидкость желтого цвета различной интенсивности; выпускается по 20, 50, 100 мл во флаконах. Также изготавливают в таблетированной форме, включающей лиофилизированный стерильный очищенный концентрат фаголизата штаммов Staphylococcus aureus, наиболее значимых в развитии гнойно-воспалительных поражений. Таблетки во флаконах по 50 штук либо 10-25 штук. Использование препарата приводит к элиминации стафилококков из кишечных микробиоценозов, и, вследствие этого, коррекции дисбактериоза кишечника или переходу дисбиотических нарушений из 2-й степени в 1-ю. Стафилококковый бактериофаг также применяют в составе сложных лекарственных препаратов: пиобактериофаг комбинированный жидкий, пиополифаг в таблетках, пиобактериофаг поливалентный очищенный жидкий, интести-бактериофаг жидкий. Показания к применению: дисбактериоз; кишечные инфекции и другие поражения, вызванные стафилококками - карбункулез, фурункулез, абсцессы, тяжелые инфицированные поражения кожи, бурситы, плевриты, флегмоны, маститы и ангины (Рис.8) БАКТЕРИОФАГ СТРЕПТОКОККОВЫЙ ЖИДКИЙ Представляет стерильный фильтрат фаголизата стрептококков, этиологических значимых в развитии гнойно-воспалительных заболеваний. Способен специфически лизировать стрептококки, обладает строгой специфичностью, в связи с чем не подавляет нормальную микрофлору и безвреден для клеток организма человека. Жидкий бактериофаг - прозрачная жидкость желтого цвета различной интенсивности; выпускают по 20, 50, 100 мл во флаконах. 31 Применение препарата приводит к элиминации стрептококков из кишечных микробиоценозов и, вследствие этого, устранению дисбактериоза кишечника или переходу дисбиотических нарушений из 2-й степени в 1-ю степень. Показания к применению: дисбактериоз; кишечные инфекции (гастроэнтероколиты), холецистит. Препарат также используют при карбункулезе, фурункулезе, абсцессах, тяжелых инфицированных поражениях кожи, бурситах, плевритах, флегмонах, маститах и ангинах. Стрептококковый бактериофаг также используют в составе сложных лекарственных препаратов: пиобактериофаг комбинированный жидкий, пиополифаг в таблетках, пиобактериофаг поливалентный очищенный жидкий (Рис. 9). БАКТЕРИОФАГ PSEUDOMONAS AERUGINOSA (СИНЕГНОЙНЫЙ) ЖИДКИЙ Представляет собой стерильный фильтрат фаголизата бактерий Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка) и способен специфически их лизировать. Препарат обладает строгой специфичностью и безвреден для организма человека. Жидкий бактериофаг - прозрачная жидкость желтого цвета различной интенсивности; выпускают во флаконах по 20, 50, 100 мл. Использование препарата приводит к элиминации синегнойной палочки и кишечных микробиоценозов, и, вследствие этого, коррекции дисбактериоза кишечника или переходу дисбиотических нарушений из 2-й степени в 1-ю. Показания к применению: дисбактериоз; кишечные инфекции (гастроэнтероколит), холецистит, тонзиллит, фурункулез и другие заболевания, вызванные синегнойной палочкой. Бактериофаг также применяют в составе сложных лекарственных препаратов: бактериофаг коли – протейный жидкий, пиобактериофаг комбинированный жидкий, пиополифаг в таблетках, пиобактериофаг поливалентный очищенный жидкий, интести-бактериофаг жидкий (Рис.10). БАКТЕРИОФАГ ПРОТЕЙНЫЙ ЖИДКИЙ Представляет собой стерильный фильтрат фаголизата бактерий Proteus vulgaris и P. mirabilis. Препарат обладает строгой специфичностью, но не подавляет нормальную микрофлору и безвреден для клеток организма человека. Наиболее известен жидкий бактериофаг - прозрачная жидкость желтого цвета различной интенсивности. Препарат в жидком виде выпускают по 20, 50, 100 мл во флаконах. Применение препарата приводит к элиминации P. vulgaris и P. mirabilis из состава кишечных микробиоценозов, и, вследствие этого, устранению 32 дисбактериоза кишечника или переходу выраженности дисбиотических нарушений из 2-й степени в 1-ю степень. Показания к применению: дисбактериоз; кишечные инфекции, холециститы. Препарат также назначают для лечения поражений ЛОР-органов, бронхов и легких, ран, гнойных процессов кожи и мягких тканей самого разного характера и локализации, гнойных процессов, локализованных в костных тканях и суставах. Кроме того, может быть эффективен в лечении инфекций мочевыводящих органов, при лечении септических состояний, воспалительных процессах слизистых оболочек глаз. Протейный бактериофаг используют и в составе сложных лекарственных препаратов: бактериофаг коли-протейный жидкий, колипротеофаг в таблетках, пиобактериофаг комбинированный жидкий, пиополифаг в таблетках, пиобактериофаг поливалентный очищенный жидкий, интести- бактериофаг жидкий (Рис.11). БАКТЕРИОФАГ KLEBSIELLA PNEUMONIAE ЖИДКИЙ Представляет собой стерильный фильтрат фаголизата бактерий Klebsiella pneumonia. Препарат обладает строгой специфичностью, но не подавляет нормальную микрофлору и безвреден для человека. Препарат — прозрачная жидкость желтого цвета различной интенсивности; выпускается в ампулах по 5,10 мл и по10 и 20 мл во флаконах. Использование препарата приводит к элиминации клебсиелл из кишечных микробиоценозов, и, вследствие этого, коррекции дисбактериоза кишечника или переходу дисбиотических нарушений из 2-й степени в 1-ю. Показания к применению дисбактериоз; кишечные инфекции, риносклерома, озена, воспалительные процессы в области носовых пазух или среднего уха, воспалительные процессы в мягких тканях и внутренних органах. Препарат также применяют в составе сложных лекарственных препаратов: пиобактериофаг поливалентный очищенный жидкий, бактериофаг Klebsiella pneumonia поливалентный (Рис.12, 13). БАКТЕРИОФАГ КОЛИ ЖИДКИЙ Представляет собой стерильный фильтрат фаголизата энтеропатогенных Escherichia coli. Бактериофаг обладает способностью специфически лизировать энтеропатогенные кишечные палочки. Препарат обладает строгой специфичностью и не подавляет нормальную микрофлору и безвреден для клеток организма человека. Наиболее распространен жидкий бактериофаг, представляющий собой прозрачную жидкость желтого цвета различной интенсивности. Препарат выпускают во флаконах по 20, 50, 100 мл. Использование препарата приводит к элиминации энтеропатогенных кишечных палочек из кишечных микробиоценозов, и, вследствие этого, 33 устранению дисбактериоза кишечника либо переходу дисбиотических нарушений из второй степени в первую. Показания к применению: дисбактериоз; кишечные инфекции гастроэнтероколит, холецистит; другие заболевания, ассоциированные с энтеропатогенными E. сoli. Препарат также применяют в составе сложных лекарственных препаратов: бактериофаг коли-протейный жидкий, пиобактериофаг комбинированный жидкий, пиополифаг в таблетках, пиобактериофаг поливалентный очищенный жидкий, интести- бактериофаг жидкий. БАКТЕРИОФАГ КОЛИПРОТЕЙНЫЙ Представляет собой стерильный фильтрат фаголизата бактерий энтеропатогенной кишечной палочки и протея. Препарат обладает строгой специфичностью, но не подавляет нормальную микрофлору и безвреден для человека. Препарат - прозрачная жидкость желтого цвета различной интенсивности; выпускается во флаконах по 20, 50, 100 мл. Использование препарата приводит к элиминации энтеропатогенной E. сoli и P. vulgaris и mirabilis. из кишечных микробиоценозов и, вследствие этого, коррекции дисбактериоза кишечника или переходу дисбиотических нарушений из 2-й степени в 1-ю. Показания к применению: дисбактериоз, кишечные инфекции, энтероколит, кольпит, цистит, пиелонефрит, пиелит, сальпингоофорит, эндометрит, вызванные энтеропатогенной E. сoli и P. vulgaris и mirabilis. Препарат также применяют в составе сложных лекарственных препаратов: пиобактериофаг комбинированный жидкий, пиополифаг в таблетках, пиобактериофаг поливалентный очищенный жидкий, интестибактериофаг жидкий (Рис.14). ПИОБАКТЕРИОФАГ КОМБИНИРОВАННЫЙ Представляет собой стерильный фильтрат фаголизата энтеропатогенной кишечной палочки, стафилококков, стрептококков, синегнойной палочки и протея, наиболее значимых в этиологии гнойновоспалительных заболеваний Препарат обладает строгой специфичностью, но не подавляет нормальную микрофлору и безвреден для человека. Препарат прозрачная жидкость желтого цвета различной интенсивности; выпускается по 20, 50, 100 мл во флаконах. Также изготавливают в таблетированной форме, включающей лиофилизированный стерильный очищенный концентрат фаголизата штаммов энтеропатогенной E. сoli, стафилококков, стрептококков, синегнойной палочки и протея. Таблетки во флаконах по 50 штук либо 10, 25 штук. 34 Использование препарата приводит к элиминации штаммов кишечной палочки, стафилококков, стрептококков, синегнойной палочки и протея из кишечных микробиоценозов и, вследствие этого, коррекции дисбактериоза кишечника или переходу дисбиотических нарушений из 2-й степени в 1-ю. Показания к применению: дисбактериоз кишечника другие заболевания, вызванные кишечной палочкой, стафилококками, стрептококками, синегнойной палочкой и протеями. Препарат используют для лечения инфекций лор-органов, органов дыхательной системы, мочеполовой системы, пищеварительной системы и для лечения самых разных гнойных процессов мягких тканей, суставов, костей, внутренних органов. Также применяют в составе сложных лекарственных препаратов: пиобактериофаг поливалентный очищенный жидкий и интести - бактериофаг жидкий. ИНТЕСТИ-БАКТЕРИОФАГ ЖИДКИЙ Представляет собой стерильный фильтрат фаголизата бактерий энтеропатогенной кишечной палочки, шигелл, сальмонелл, энтерококков, стафилококков, Pseudomonas aeruginosa и протеев видов P. vulgaris и mirabilis, Препарат обладает строгой специфичностью, но не подавляет нормальную микрофлору и безвреден для человека. Препарат — прозрачная жидкость желтого цвета различной интенсивности; выпускается по 100 мл во флаконах. Использование препарата приводит к элиминации штаммов энтеропатогенной кишечной палочки, шигелл Флекснера 1, 2, 3, 4, 6 сероваров и шигелл Зонне, сальмонелл – S. paratyphi А, S. paratyphi В, S. typhimurium, S. infantis, S. choleraesuis, S. oranienburg, S. enteritidis, энтерококков, стафилококков, P. aeruginosa и протеев видов P. vulgaris и P.mirabilis из кишечных микробиоценозов и, вследствие этого, коррекции дисбактериоза кишечника или переходу дисбиотических нарушений из 2-й степени в 1-ю и лечению кишечных инфекций. Показания к применению: дисбактериоз кишечника и другие заболевания, вызванные энтеропатогенными кишечными палочками, шигеллами, сальмонеллами, энтерококками, стафилококками, синегнойной палочкой и протеямиы видов P. vulgaris и P. mirabilis и для лечения энтероколита, поноса (Рис.15). БАКТЕРИОФАГ ПОЛИВАЛЕНТНЫЙ Под названием секстафаг выпускается российской фармацевтической компанией Микроген. Представляет собой стерильный фильтрат фаголизата бактерий стрептококков, стафилококков, протея, синегнойной палочки, клебсиелл и кишечной палочки. Препарат обладает строгой специфичностью, но не подавляет нормальную микрофлору и безвреден 35 для человека. Препарат - прозрачная жидкость желтого цвета различной интенсивности; выпускается 20 мл во флаконах по 20 мл и используется как орально, так и в виде клизм. Для терапии кожных поражений делают примочки с бактериофагом два раза в сутки. Использование препарата приводит к элиминации штаммов стрептококков, стафилококков, протея, синегнойной палочки, клебсиелл и кишечной палочки из кишечных микробиоценозов и, вследствие этого, коррекции дисбактериоза кишечника или переходу дисбиотических нарушений из 2-й степени в 1-ю и лечению кишечных инфекций. Показания к применению: дисбактериоз кишечника другие заболевания, вызванные стрептококками, стафилококками, протеями, синегнойной палочкой, клебсиеллами и кишечной палочкой. Используется поливалентный секстафаг для предупреждения и терапии недугов, спровоцированных чувствительной к препарату микрофлорой. Это могут быть воспалительные процессы среднего уха, носовых пазух, горла, бронхов, легких, трахей. Также используется при инфицированных ранах, термических поражениях кожи, фурункулезе, карбункулезе, флегмоне, абсцессе, бурсите, мастите, инфекционных процессах в костях. Эффективно средство и для лечения инфекционно – воспалительных процессов органов мочевыделения: при кольпите, цистите, эндометрите, уретрите. Используют бактериофаг поливалентный и для лечения воспалительных процессов органов зрения, а также при инфекционных заболеваниях органов пищеварительного тракта, при общем заражении крови, при болезнях новорожденных младенцев, спровоцированных вышеописанными микробами (Рис.16). ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ Цель занятия: - изучить морфологию и свойства бактериофагов; - изучить методы титрования фагов; - изучить препараты бактериофагов. Мотивационная характеристика темы: Знание свойств бактериофагов и методов их использование микробиологии и в медицине необходимы врачу любого профиля. Студент должен знать: - морфологию и свойства бактериофагов; - практическое применение фагов; - методы титрования фагов; - препараты бактериофагов. в 36 Студент должен уметь: - проводить выделение чистой культуры микроорганизма; - проводить подготовку материала от больного для выделения фагов; - делать посева материала от больного на плотные и жидкие питательные среды для обнаружения фагов; - проводить титрование фагов методами Аппельмана и Грация; - проводить количественный учет посевов фагов в плотных и жидких питательных средах; - проводить фаготипирование; - оценивать результаты микробиологических исследований и оформлять на их основе соответствующие заключения. Студент должен иметь навыки: -соблюдения санитарно-гигиенического и противоэпидемического режима и техники безопасности в бактериологических лабораториях; - приготовления микропрепаратов: мазков из чистых культур бактерий, из исследуемого материала для обнаружения микроорганизмов; - окраски мазков простыми способами (водными растворами фуксина и метиленовой синьки) и по методу Грама; - микроскопии препаратов в световом микроскопе с иммерсионным объективом; - дифференцирования микроорганизмов по морфологическим признакам в микропрепаратах; - посева исследуемого материала тампоном, петлёй, пипеткой, шпателем, «газоном»; на плотные, полужидкие и жидкие среды; - иметь навыки подсчета колоний фагов на плотных питательных средах; - иметь навыки работы с инструкциями лекарственных препаратов. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ. 1. Какова природа и химический состав фагов? 2. Каково строение фагов? 3. Чем обусловлена специфичность действия фага? 4. Каков характер взаимодействия вирулентных фагов с бактериальной клеткой? 5. Каков характер взаимодействия умеренных фагов с бактериальной клеткой? 6. Какие свойства фагов используют для их получения и использования? 6. Почему культуру фага необходимо титровать в стерильных условиях? 7. Как титруют фаг по методу Аппельмана? 37 8. С каких пробирок начинают учет опыта титрования фага по Аппельману? 9. Как титруют фаг по методу Грация? 10. Какое являение можно наблюдать при репродукции фагов на плотных питательных средах? 11. Как проводят экспресс-диагностику инфекционных болезней с помощью бактериофагов? 12. Как проводят фаготипирование микроорганизмов? ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ 1. По своей природой фаги являются: а) грибы; б) вирусы; в) бактерии; г) простейшие; д) водоросли. 2. Фаги образуют при посеве на МПА с микроорганизмами: а) белые колонии б) красные колонии в) бесцветные колонии г) черные колонии д) прозрачные колонии (стерильные пятна, или бляшки) 3. Титрование бактериофага в жидкой питательной среде проводят по методу: а) Дригальского; б) Грациа; в) Бурри; г) Коха; д) Аппельмана. 4. Титрование бактериофага на плотной питательной среде проводят по методу: а) Дригальского; б) Грациа; в) Бурри; г) Коха; д) Аппельмана. 5. Для лечения шигеллезов используют фаги: а) Брюшнотифозные; 38 б) Стафилококковые; в) Сальмонеллезные; г) Дизентерийные; д) Клебсиеллезные. 6. Структурными компонентами фага являются: а) Нуклеоид; б) Рибосомы; в) Капсулу; г) Головку, хвост и хвостовые нити; д) Жгутики. СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ ЗАДАЧА №1 В результате бактериологического обследования новорожденных и медперсонала в роддоме были выделены несколько штаммов золотистого стафилококка. Были произведены посевы этих штаммов со стафилококковыми бактериофагами. С какой целью это было сделано? ЗАДАЧА №2 В детском саду из групп несколько человек заболело сальмонеллёзом. Какие профилактические мероприятия нужно провести с контактировавшими с этими больными? Какие препараты следует назначить? Что содержат эти препараты? ЗАДАЧА №3 В хирургическом отделении больницы возникла вспышка стафилококковой инфекции. При исследовании медицинского персонала отделения у одной из медицинских сестёр из носоглотки был выделен стафилококк. Как доказать, что именно она явилась источником заражения? Какие исследования для этого нужно провести? ЗАДАЧА №4 В инфекционную больницу поступил больной Н. с диагнозом ОКЗ. Из его испражнений был выделен холерный бактериофаг. Чем болен Н.? Как было проведено лабораторное исследование для выявления бактериофага? ЗАДАЧА №5 Сотрудники СЭС провели санитарно-бактериологическое исследование роддома №3. При исследовании мазков из носоглотки у 5 работников был выделен S. aureus. Такой же микроорганизм был выделен и при исследовании воздуха в родильном зале и в палате новорожденных. Как можно провести лабораторные исследования, чтобы выявить источник инфекции в родильном доме? 39 ЗАДАЧА №6 В средней группе детского сада №3 выявлено 4 случая дизентерии. Больные дети госпитализированы в инфекционную больницу. Какие лечебные препараты можно использовать для профилактики дизентерии среди контактных лиц? Что содержат эти препараты? ЭТАЛОНЫ ОТВЕТОВ Ответы на тесты: 1 – б, 2 – в, 3 – д, 4 – б, 5 – г, 6 – г. Ответы к задачам: 1. Анализ проведен для определения фаготипа бактерий. 2. Больным можно назначить сальмонелезный бактериофаг, содержащий бактериофаги лизирующие различные виды сальмонелл. 3. Необходимо провести фаготипирование. Если стафилококк выделенный от медицинской сестры и другие выделенные штаммы микроорганизмов будут лизироваться одинаковыми бактериофагами, то источник инфекции один. 4. Больной Н. болен холерой. Для постановки диагноза была проведена фагодиагностика. Испражнения больного профильтровали через бактериальный фильтр и нанесли на чашку с посевом лабороторного штамма возбудителя холеры. Посевы инкубировали 37 °С – 24 часа, затем при просьмотре чашки выявили на ней стерильное пятно в месте нанесения бактериофага. 5. Для исследования нужно провести фаготипирование. С этой целью берут чашки Петри с посевами делят их на квадраты и капают в них типовые стафилококковые бактериофаги. Посевы инкубируют при 37 °С – 24 часа и если все штаммы стафилококков будут лизироваться одинаковым бактериофагом то в роддоме один источник инфекции. 6. Для профилактики дизентерии среди контактных лиц можно назначить дизентерийный бактериофаг, содержащий бактериофаги лизирующие различные виды шигелл. ОСНАЩЕНИЕ ЗАНЯТИЯ На группу: Таблицы «Морфология фагов» «Строение фага Т-четного бактериофага» «Взаимодействие вирулентного фага с микробной клеткой». На рабочее место: - препараты бактериофагов (стафилококковый, дизентерийный, сальмонеллезный и брюшнотифозный); - чашка с негативными колониями (метод Грация); - пробирки с посевами материала от больного по методу Аппельмана; 40 - чашка с результатами посевов на фаготипирование. I день исследования: - исследуемая культура микроорганизмов; - чашки Петри с МПА; - пробирки с физиологическим раствором; - стерильные пробирки; - дизентерийный бактериофаг; - бактериологические петли; - спиртовки; - стерильные пипетки (1 см3); - карандаш по стеклу. II день исследования: - посевы на МПА. Учебная карта занятия. 1.Изучить строение и свойства бактериофагов. 2.Изучить взаимодействия вирулентного и умеренного фагов с микробной клеткой. 3. Изучить количественные методы определения фагов. 4.Изучить методы титрования фагов в жидкой и плотной питательных средах. 5. Изучить препараты бактериофагов и их использование для лечения и профилактики инфекционных заболеваний. 6.Поставит опыт по определению чувствительности к фагам культуры микроорганизмов. Протокол №1 определения чувствительности микроорганизмов к дизентерийному бактериофагу методом капли. День 1 день Материал Ход исследования Культура Приготовить взвесь культуры микроорган в физиологическом растворе. измов 1. Залить полученную взвесь на чашку с МПА. 2. Подсушить чашку в термостате. 3. Нанести на чашку каплю дизентерийного бактериофага пипеткой. 4. Посевы поместить в термостат и инкубировать при 37 ºС 18-24 часа. Результаты 41 2 день Посев на МПА Изучение посева и учет результатов. На чашке с МПА появилось стерильное пятно. Вывод: Выделенная культура чувствительна к дизентерийному бактериофагу. В материале от больного обнаружен возбудитель дизентерии. ЛИТЕРАТУРА 1. Банникова Л.А., Королева Н.С. Микробиологические основы молочного производства. - М., 1987. С. 143-147, 296. 2. Габрилович И.М. Практическое пособие по бактериофагии. - Мн., 1968. 18 -19, 79-87. 3. Гольдфарб Д. М., Бактериофагия, М., 1961. 4. Иванов А.В. Клиническое применение бактериофагов. Практическое руководство, Санкт - Петербург, 2000. - 41 с. 5. Кривиский А. С., Проблемы бактериофагии, в сборнике: Актуальные вопросы вирусологии, М., 1960. 6. Медицинская микробиология. Под ред. В.И. Покровского, О.К. Поздеева. М.: ГЭОТАР-Медицина, 1998. 7. Определитель бактерий Берджи. - М., 1997, т. 2. С. 538, 549-550. 8. Раутенштейн Я. И., Бактериофагия, М., 1955. 9. Стент Г., Молекулярная биология вирусов бактерий, пер. с англ., М., 1965. 10. Фурик Н.Н., Богданова Л.Л., Сафроненко Л.В. Иучение свойств вирулентных бактериофагов промышленных штаммов лактококков, используемых в сыроделии // Весцi НаН Беларусi. Сер. бiял. навук, 2003, №3. С. 113-116. 11. Шабалов Н.П. Детские болезни, т. 2, 2006. 736 стр. Приложение 5 (Дозировки наиболее часто используемых бактериофагов). 12. Levin BR and Bull JJ, Phage therapy revisited: the population biology of a bacterial infection and its treatment with bacteriophage and antibodies. Amer Naturalist 1996, v.147(6), pp. 881 - 898. 42 ПРИЛОЖЕНИЕ Основные бактериофаги Рис. 6 Бактериофаг дизентерийный Рис. 7 Бактериофаг сальмонеллезный поливалентный 43 Рис. 8 бактериофаг стафилококковый Рис.10 Бактериофаг pseudomonas aeruginosa (синегнойный) жидкий Рис. 9 Бактериофаг стрептококковый жидкий Рис.11 Бактериофаг протейный жидкий 44 Рис.12 Бактериофаг klebsiella Рис.14 Бактериофаг колипротейный Рис.13 pneumoniae жидкий Рис.15 Интести – бактериофаг жидкий 45 Рис.16 Бактериофаг поливалентный
