На правах рукописи Болотина Наталья Александровна ОПУХОЛЬ-ПРОМОТОРНЫЙ ЭФФЕКТ ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИХ
advertisement
На правах рукописи Болотина Наталья Александровна ОПУХОЛЬ-ПРОМОТОРНЫЙ ЭФФЕКТ ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ (ПАУ). 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва-2008 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и в НИИ Канцерогенеза Государственного учреждения «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН» Научный руководитель: Доктор медицинских наук, профессор Дубовая Татьяна Клеониковна Доктор биологических наук, профессор Кобляков Валерий Александрович Официальные оппоненты: Кандидат медицинских наук, доктор биологических наук, профессор Кондратенко Вадим Григорьевич Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН РФ Доктор медицинских наук, профессор ГОУ ВПО РГМУ Росздрава Ивков Николай Николаевич Ведущее учреждение: Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН РФ Защита состоится «8» декабря 2008 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.04 при Российском государственном медицинском университете по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1 Автореферат разослан «29» октября 2008 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор А.И.Щеголев Список используемых сокращений: АФК – активные формы кислорода БП – бензо/а/пирен БеП - бензо/е/пирен ДМБА – 7,12-диметилбенз/а/антрацен МЩК - межклеточные щелевые коммуникации 3-МХ - 3-метилхолантрен, -НФ - -нафтофлавон ПАУ – полициклические ароматические углеводороды АР-1 – аctivator protein-1 NF-kB – ядерный транскрипционный комплекс kB Общая характеристика работы. Актуальность проблемы. В настоящее время для решения целого ряда проблем цитологии, клеточной биологи и биологии развития используются самые разные модели. Это обусловлено поразительным множеством и сходством морфофункциональных, молекулярно-генетических и биохимических изменений, лежащих в основе жизнедеятельности клеток в различных условиях функционирования в норме и при развитии патологических процессов. С этих позиций довольно часто в экспериментальных исследованиях используется модель канцерогенеза. Очевидно, что работы в этой области важны и для биологи, и для практической медицины. Причины возникновения злокачественных опухолей многообразны. К ним следует отнести ультрафиолетовое излучение, ионизирующую радиацию, инфекционные агенты, генетические факторы и др. Лидирующие позиции в этом списке занимают химические канцерогены (Канцерогенез, 2004; Trosko, 2000; Loeb et all., 2008). Среди химических канцерогенов имеются, так называемые, непрямые и прямые. Непрямые канцерогены (проканцерогены) исходно биологически инертные вещества и для их превращения в активный канцероген требуется метаболическая трансформация в клетке. Прямые канцерогены в исходной форме реализуют свой канцерогенный потенциал. Кроме того, среди химических канцерогенов выделяют «полные» и «неполные». Полные канцерогены способны индуцировать развитие опухоли без дополнительных воздействий. Неполные - индуцируют или стадию инициации (инициаторы), или стадию промоции (промоторы). Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), используемые в нашей работе, являются полными непрямыми канцерогенами. Именно ПАУ - наиболее распространенные загрязнители окружающей среды. Эти соединения находятся в выхлопных газах двигателей 2 внутреннего сгорания, в табачном дыме, их выявляют в продуктах питания, подвергшихся термической обработке и пр. Как известно, в течении химического канцерогенеза принято выделять три стадии: инициация, промоция и прогрессия. Что касается ПАУ, то в первую очередь следует обратить внимание на то, что до настоящего времени исследования по механизму их канцерогенного действия были направлены на изучение инициации, поскольку считалось, что именно эта стадия является определяющей в развитии опухоли при действии непрямых канцерогенов (Boutwell et al., 1982; Trosko et al., 1996). Попытки применения и разработка новых препаратов, ингибирующих стадию инициации (в первую очередь антиоксиданты, ингибиторы свободно - радикальных процессов) успеха не принесли. Исследования последнего времени дали основания считать, что стадией, определяющей канцерогенность ПАУ, является стадия промоции (Thilly W.2003). Поэтому изучение механизмов промоции при действии непрямых канцерогенов является важной и актуальной задачей, дающей в перспективе возможность создания профилактических и лечебных препаратов, препятствующих (или замедляющих) развитию опухолевого процесса. Цель исследования - изучение механизмов опухоль-промоторного действия «полных» канцерогенов на примере ПАУ на модели культуры клеток гепатом. Задачи исследования: 1. провести сравнительное изучение действия канцерогенных ПАУ и их неканцерогенного аналога на функциональную активность межклеточных щелевых коммуникаций (МЩК) в культуре клеток гепатом, экспрессирующих и неэкспрессирующих ферменты метаболизма и Ahрецептор. 2. исследовать образование активных форм кислорода (АФК) в клеточных культурах при действии канцерогенных и неканцерогенных ПАУ; 2 3 3. сравнить экспрессию белков-супрессоров р21 и р27 в культуре клеток при действии ряда ПАУ. 4. исследовать влияние ПАУ на активацию транскрипционных факторов АР-1 (activated protein 1) и NF-kB (ядерный транскрипционный комплекс kВ). Научная новизна работы. В нашей работе впервые использована в качестве сравнительной модели для изучения опухолевой промоции уникальная культура клеток гепатомы Г-27, в которой отсутствует экспрессия цитохрома Р450 и Ahрецептора. Проведенное сравнительное исследование показало, что наблюдаемые нами эффекты ПАУ, ассоциированные с промоторной стадией канцерогенеза (подавление функциональной активности МЩК, активация транскрипционного фактора NF-kB) обусловлены действием исходной химически инертной молекулой вещества. Мы показали, что эффекты канцерогенных ПАУ, ассоциированные с промоторной стадией канцерогенеза, в культуре клеток реализуются по нескольким механизмам в зависимости от экспрессии Ah-рецептора и изоформ цитохрома Р450 в клетках-мишенях. Впервые продемонстрировано существование ранее неизвестного механизма опухоль-промоторного действия канцерогенных ПАУ. Практическая значимость работы. Известно, что в химическом канцерогенезе выделяют 3 стадии: инициация, промоция и прогрессия. Стадия инициации химического канцерогенеза для ПАУ достаточно хорошо изучена, однако в представлениях о стадии промоции, необходимой для дальнейшего выживания инициированной клетки, остается много невыясненных вопросов. Полученные нами данные позволяют ответить на некоторые из них. В частности, нами установлено, что нарушение функционирования МЩК, активация некоторых белков, регулирующих клеточную пролиферацию и апоптоз на стадии опухолевой 3 4 промоции, вызываются исходной биологически инертной молекулой ПАУ, по ранее неизвестному механизму. Полученные данные углубляют существующие представления о механизмах действия ПАУ, реализующихся на стадии опухолевой промоции. Полученные результаты важны для экспериментальной онкологии, гистологии, биохимии и молекулярной биологии, кроме того, их целесообразно учитывать при разработке новых способов лечения и профилактики онкологических заболеваний. Внедрение в практику Полученные диссертантом данные внедрены в лекционные курсы на кафедрах гистологии и эмбриологии лечебного факультета и биохимии РГМУ. Основные положения выносимые на защиту: 1. Стадия промоции является определяющей в развитии опухоли при действии ПАУ. Эффект канцерогенных ПАУ реализуется в зависимости от наличия или отсутствия экспрессии Ah-рецептора и изоформ цитохрома Р450 в клетках-мишенях. 2. Выявление новых аспектов механизма канцерогенного действия ПАУ на стадии промоции опухолевого роста было возможно в связи с: - сравнительным изучением действия ПАУ на модели культуры клеток гепатом с экспрессией Ah-рецептора и цитохрома Р450 (HepG2) и без таковой (Г-27) как наиболее перспективной для изучения механизмов опухоль-промоторного эффекта ПАУ - использованием комплексного методического подхода для оценки состояния клеток с применением морфологических, биохимических, биофизических, иммунологических, молекулярно-биологических методов 3. Канцерогенные ПАУ оказывают воздействие на ключевые функции клеток: подавляют функциональную активность МЩК, влияют на пролиферативную активность клеток и апоптоз. 4 5 4. Полученные результаты позволяют высказать предположение о существовании (кроме Ah-рецептора и цитохрома Р450) в клетках неизвестного ранее фактора, взаимодействие с которым канцерогенных ПАУ нарушает гомеостаз, приводящий к промоции. Апробация работы. Материалы исследования доложены и обсуждены на совместной научной конференции кафедр гистологии лечебного и педиатрического факультетов РГМУ и морфологии медико- биологического факультета РГМУ. Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, 7 из них - в центральной печати. Структура и объем диссертации Материал диссертации изложен на 100 страницах машинописного текста и состоит из введения и глав: «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение» и выводов. Работа проиллюстрирована - 21 рисунком, 2 таблицами. Библиографический материал включает в себя ссылки на 160 источников литературы, в том числе 20 отечественных и 140 иностранных. Содержание работы Материалы и методы исследований. В экспериментах использовались клеточные культуры 2-х типов гепатом. Гепатома Г-27 - низкодифференцированная перевиваемая опухоль, вызванная диэтилнитрозамином (Швемберг 1970). Клетки гепатомы человека HepG2 были получены из АТСС (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA). Выбор данных клеточных культур объясняется отсутствием ферментов цитохрома Р450 и Ahрецептора в клетках культуры Г-27 в отличие от клеток культуры HepG2. Благодаря чему, имеется возможность сравнить воздействие ПАУ на клетки в присутствии и отсутствии системы цитохрома Р450. В экспериментах в качестве канцерогенных ПАУ использовались: бензо/а/пирен (БП), 3-метилхолантрен (3-МХ), 7,12-диметилбенз/а/антрацен (ДМБА) и неканцерогенный аналог БП – бензо/е/пирен (БеП). В работе определялись нижеописанные параметры 5 6 Функциональная активность межклеточных щелевых контактов (МЩК). Проницаемость МЩК определяли методом внутриклеточных инъекций флуоресцентного красителя люцифера желтого СН (Sigma США) в одну из клеток монослоя с последующей регистрацией распространения его в соседние клетки. Флуоресценция регистрировалась при помощи флуоресцентного микроскопа Axiolab (Zeiss, Германия) с фазово-контрастным освещением и 40 водно - иммерсионным объективом и видео камерой CCTV (Panasonic Япония), соединенной с компьютером. Окрашивание клеток происходило через 2 минуты после инъекции. Определение уровня бензо/а/пирена (БП) и бензо/е/пирена (БеП) в клетках производилось методом квазилинейной люминесценции при низких температурах. Количество БП определялось при λ298 возбуждения и возбуждения и λ403флуоресценции, а для БеП при λ334 λ388флуоресценции. Реакция связывания NF-kB (ядерный транскрипционный комплекс kВ) и АР-1 (Асtivator protein 1) с консенсусным олигонуклеотидом (Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA). Белковый экстракт из ядер для проведения реакции получали как описано ранее (Lyakh et al., 2000). Реакцию связывания проводили следующим образом: инкубировали 10 микрограммов ядерного белка в 20 микролитрах связывающего буфера (HEPES (pH 7.5), 10 mM; KCl - 80 mM; EDTA - 1 mM; EGTA - 1 mM; глицерол - 6%, поли(dI-dC) - 0.5 мкг и консенсусного олигонуклеотида, меченого по 5’-концу фосфором 32Р (1 x 105 - 3 x 105 cpm). Реакцию мечения проводили согласно протоколу производителя нуклеотидов (Promega Corp., Madison, США). Комплексы белок-олигонуклеотид анализировали в 6% нативном ПААГ, содержащем 0.25-кратный буфер ТБЕ. Высушенный гель экспонировали с пленкой Кодак при -80° в течение 1-7 суток. Электрофорез и Иммуноблоттинг. Клетки на стадии формирования 80% монослоя промывали физиологическим раствором, снимали с чашек и получали клеточные экстракты как описано ранее (Красильников М.А. и др., 2004). Электорофорез образцов, содержащих по 60 мкг белка, проводили в 12,5% SDS-ПААГ геле и переносили на нитроцеллюлозные фильтры Immobilon-P (Millipore Corporation, Bedford, США) методом электропереноса. Антитела к IкB были получены из Santa Cruz Biotechnology Inc., США и к фосфо-Ser32IкB - из Cell Signaling Technology Inc, США и к р21Cip/Kip(Sigma) и р27Cip/Kip (Sigma). Инкубация с АТ к IкB длилась 1,5 часа при комнатной температуре, а к фосфо -Ser32IкB - 12 ч (в буфере без молока) при 25°С. Инкубация с АТ к р21 и р27 длилась в течение 12 часов при комнатной температуре. В качестве вторичных для АТ к IkB и 6 7 фосфо -Ser32- IкB использовались кроличьи АТ, коньюгированные с пероксидазой (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция). В качестве вторичных для АТ к р21 ир27 использовались мышиные АТ, коньюгированные с пероксидазой (Sigma). Проявление специфического сигнала осуществлялось с помощью системы ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция). Для оценки интенсивности иммуноблотинга с АТ к р21Cip/Kip и р27Cip/Kip использовали программу Scion Image (версия 4. 02) Scion corporation США. Транзиторная трансфекция и определение активности гена-репортера. Для транзиторной трансфекции клеток использовалась плазмида, содержавшая генрепортер-люциферазы под контролем промотора с NF-kB-чувствительным элементом, любезно предоставленной профессором А.В. Гаспарьяном. Для контроля за эффективностью и потенциальной токсичностью процедуры трансфекции применялась котрансфекция клеток плазмидой, содержащей ген βгалактозидазы. Клетки выращивались формирования 50-70% монослоя на 24-луночной трансфецировались плашке и плазмидами. на В стадии качестве трансфекционного агента использовался PolyFect (Qiagen). Через сутки после трансфекции клетки инкубировались в течение 24 часов с исследуемыми ПАУ в концентрации 5 мкг/мл среды. Далее клетки лизировались как описано ранее (см. Электрофорез и Иммуноблотинг). Активность люциферазы измерялась по стандартному протоколу (Promega, США) на люминометре Turner BioSistems 20/20n (США). Активность β-галактозидазы измерялась по стандартной методике, основаной на использовании в качестве субстрата β-галактозидазы ONPG (О-нитрофенил-b-Dгалактопиранозидазы) (Sigma-Aldrich). Расчет относительной активности люциферазы проводили в условных единицах (отношение общей активности люциферазы к активности галактозидазы в исследованных образцах). Определение влияния ПАУ на образование активных форм кислорода (АФК) в клетках гепатомы Г-27. Клетки выращивали на 60 миллиметровых чашках до монослоя 80%. За сутки до исследования к клеткам добавлялся БП или БеП. Затем к ним добавлялся флуоресцентный краситель диацетилдихлорофлуоресцеин до конечной концентрации 10 микромолей на миллилитр среды, клетки инкубировались с красителем в течение 30 минут при 37о С. Контрольные клетки после инкубирования с красителем промывались теплым раствором Хенкса и инкубировались с перекисью водорода 45 минут при 37о С в концентрации 2 милимоля на миллилитр среды. Среда сливалась, клетки снимались холодным Версеном и переносились в холодный раствор 7 8 Хенкса. Диацетилдихлорофлуоресцеин при проникновении в клетку и взаимодействии с АФК, например, такими как перекись водорода, гидроксильный и супероксидный радикалы, окисляется ими до флуоресцентного соединения. Уровень образования АФК в клетках гепатомы Г-27 определяли методом проточной цитофлоуметрии после окраски клеток красителем дихлородиацетилфлуоресцеином в цитометре FACSCalibur (Becton Dicinson, USA). Дальнейшую компьютерную обработку данных проводили с помощью программы WinMDI 2.9 (Joseph Trotter, La Jolla, CA, USA). Результаты исследований и их обсуждение. 1.Ингибирование межклеточных щелевых контактов при действии ПАУ в культуре клеток HepG2. Как ранее упоминалось, одним из событий опухолевой промоции является нарушение межклеточных щелевых коммуникаций (МЩК). С целью изучения действия ПАУ на МЩК были выбраны клетки гепатомы человека HepG2 с достаточно высоким для опухолевых клеток уровнем функциональной активности МЩК. Как видно из рисунка 1, люциферовый желтый эффективно окрашивает рядом лежащие клетки, в которые ввели краситель. Рисунок 1(с,d) демонстрирует, что часовая экспозиция бензо/а/пирена (БП) в концентрации 5мкг/мл вызывает значительное подавление перетекания красителя в соседние клетки. Было установлено, что после часа воздействия БП отмечается выраженный (более 80%) эффект ингибирования МЩК (см. рис. 1), 3-метилхолантрен (3-МХ) демонстрирует слабый ингибирующий эффект на МЩК (см. таблица 1). Для исследуемых канцерогенов эффект ингибирования МЩК вызывали при 24 часовом воздействии на клетки. Наиболее сильный ингибирующий эффект продемонстрировали БП (до 100%) (см. рис. 1) и 7,12-диметилбенз/а/антрацен (ДМБА) приблизительно 75% (см. таблица 1). Неканцерогенный бензо/е/пирен (БеП) ингибировал МЩК после часа икубирования на 10% и на 19% после суток воздействия (см. таб.1; см. рис. 1). 8 9 Эффект БП на ингибирование МЩК в культуре клеток гепатомы HepG2 зависел от его концентрации. Эффект БП становится выраженным при концентрации 0,6мкг/мл. Как известно, одним из свойств опухолевых промоторов является обратимость их действия после прекращения воздействия. Этот феномен, характерный и для ПАУ, был продемонстрирован на примере БП. После инкубирования клеток в течение часа в среде с концентрацией БП 1.25мкг/мл путем трехкратной смены культуральной среды вещество удалялось. В результате этого отмечалось восстановление МЩК с 29.4% до 65% по сравнению с контролем. Частичное восстановление МЩК можно объяснить только высокой липофильностью БП, так как полное его удаление из клеточной мембраны требует более длительной отмывки. Для ответа на вопрос, связано ли нарушение функционирования МЩК под действием ПАУ с образованием их активных метаболитов, был исследован эффект ингибитора метаболизма ПАУ (-нафтофлавона) на блокирование МЩК 3-метилхолантреном (3-МХ). Как видно из рисунка 2, сам нафтофлавон (-НФ) не влияет на МЩК и не изменяет ингибиторного эффекта 3- метилхолантрена. Таким образом, ингибиторный эффект ПАУ на МЩК не связан с формированием его активных метаболитов. Таблица 1 Эффект различных ПАУ на прницаемость МЩК в клетках гепатом HepG2 и Г27 при экспозиции 1ч и 24 ч. Эффект выражен в % окрашенных клеток к контролю. ПАУ(5мкг/мл) Клетки Время воздействия 9 10 1час 24 часа бензо/а/пирен (20М) HepG2 12.9 ±1.3 0 7,12-диметилбнзантрацен (20М) 3-метилхолантрен (19М) HepG2 98.9±1.1 36.3±0.7 HepG2 98.3 ±1.2 21.8 ±0.5 -нафтофлавон (5М) -нафтофлавон (5М)+ 3-метилхолантрен (19М) бензо/е/пирен (20М) бензо/а/пирен (20М) HepG2 HepG2 108.1 ±12.6 21.7 ±5.3 HepG2 Г-27 91.5 ±8.8 11.5 ±3.4 81.0 ±1.0 0 В контроле за 100% принимается среднее (из 7-11 инъекций) количество окрашенных соседних клеток через 2 минуты после инъекции красителя в одну из клеток монослоя. В контроле для клеток HepG2 среднее количество окрашенных клеток составляет 11, а для Г-27 – 7 клеток. 2. Ингибирование межклеточных щелевых контактов ПАУ в культуре клеток Г-27. Для ответа на вопрос о роли метаболизма ПАУ и Аh-рецептора в эффекте бензо/а/пирена (БП) на функцию МЩК мы использовали культуру клеток гепатомы Г-27, в которой, как было показано, отсутствует экспрессия изоформ цитохрома Р450 и Аh-рецептора. Рис 3(а,b) демонстрирует перетекание красителя в клетках гепатомы Г-27 без воздействия, а рис. 3(с,d) показывает ингибирование перетекания красителя при воздействии 5 мкг/мл БП в течение 1 часа. Экспозиция БП клеток гепатомы Г-27 в течение 24 часов вызывает ингибирование МЩК на 100% (см. таблица 1). Неканцерогенный БеП в дозе 5 мкг/мл в течение 1 часа и 24 часов не влиял на функционирование МЩК. (рис. 3 e,f; g,h) Исходя из полученных результатов, можно заключить, что ингибирование МЩК канцерогенными ПАУ осуществляется исходной неметаболизированной молекулой и не зависит от его взаимодействия с Ahрецептором. Концентрационная зависимость действия БП на ингибирование МЩК в клетках гепатомы Г-27 идентична тому, что показано для клеток гепатомы HepG2, из чего можно сделать заключение, что в клеточных культурах обоих 10 11 типов гепатом эффект БП вызывается действием через один и тот же клеточный центр. В клетках гепатомы Г-27 отсутствует экспрессия как цитохрома Р450, так и Ah-рецептора. Таким образом, можно заключить, что механизм действия БП не связан с ранее известными механизмами действия, такими как активация Ah-рецептора и функционирование цитохрома Р450. Различия в действии БП и неканцерогенного БеП может быть связано с неодинаковым накоплением этих веществ в цитоплазматической мембране клетки. Для проверки данного предположения мы измерили уровень БП и БеП в клетках после 1 и 24 часов воздействия. Из таблицы 2 видно, что накопление ПАУ в клетках зависит от времени и количества БП и БеП, выделенных из клеток, значительно больше после 24 часов воздействия, по сравнению с 1 часом. Таблица 2. Определение степени накопления ПАУ в клетках гепатомы Г-27. ПАУ Концентрация мкг/мл БП и БеП, выделенные из клеток (нг/миллион клеток) Время 1 час 24 часа Бензо/а/пирен 5.0 136.6 ± 22.2 237.8 ±24.6 Бензо/а/пирен 1.25 37.0 ±16.3 135.7 ±32.1 Бензо/а/пирен 0.6 33.0 ±12.2 50.0 ±16.8 Бензо/е/пирен 5.0 603.0 ±58.6 1356.0 ±64.0 Таким образом, зависимое от времени возрастание ингибирования МЩК в результате воздействия ПАУ связано с увеличением накопления этих соединений в клетке. Более эффективное накопление БеП в клетках свидетельствует о том, что различный эффект при воздействии БП и БеП на МЩК не является результатом степени их накопления в клеточной мембране. 3. Влияние ПАУ на экспрессию белков р21 и р27. Белки р21 и р27 относятся к семейству белков-супрессоров семейства Cip/Kip, количество которых увеличивается на стадии G0 и уменьшается при получении клеткой митотического стимула. Как было показано в предыдущем разделе, БП вызывает стимуляцию пролиферации и снижает функциональную активность МЩК. Мы предположили, что эти эффекты могут сопровождаться изменениями уровня белков семейства Cip/Kip. 11 12 Для исследования действия БП на уровень белков р21 и р27 клетки культивировались в течение суток без сыворотки для приостановки их роста, а затем добавлялась сыворотка в качестве контроля и БП на 4, 8 и 24 часа. Рисунок 4а показывает, что в клетках гепатомы Г-27 уровень белка р21 начинает падать после 4 часов воздействия БП и достигает своего минимума после 8 часов воздействии БП по сравнению с контролем. Из диаграммы на рис. 4б видно, что через 8 часов после воздействия БП уровень белка р21 уменьшается на 50% по сравнению с контролем. Уровень белка р27 в клетках гепатомы Г27 в результате действия БП не меняется ни в одной из исследованных временных точках. Как показывает рисунок 5а, уровень белка р27 в клетках гепатомы HepG2 падает через 8 часов приблизительно на 30% (рис. 5б) после воздействия БП по сравнению с контролем. Уровень р21 в клетках гепатомы HepG2 не меняется ни в одной из временных точек. Таким образом, подавление функции МЩК в клетках гепатомы Г-27 под воздействием БП сочетается с падением уровня белка р21, а в клетках гепатомы HepG2 с падением уровня белка р27. 4. Влияние ПАУ на активность NF-kB. а. Влияние ПАУ на транскрипционную активность NF-kB, определяемую методом транзиторной трансфекции. NF-kB является транскрипционным фактором, контролирующим такие важные клеточные процессы как, пролиферация клеток и апоптоз. Помимо этого, NF-kB влияет на способность опухолевых клеток к метастазированию и на ангиогенез. В настоящее время в литературе недостаточно сведений о влиянии ПАУ на экспрессию NF-kB. Считается, что активация NF-kB может играть определенную роль в промоции. 12 13 Для определения влияния БП на транскрипционную активность NF-kB в культурах клеток гепатомы Г-27 и HepG2 мы трансфецировали клетки плазмидой, содержащей ген-репортер люциферазы под контролем NF-kBчувствительного промотора, с последующим определением активности люциферазы по стандартному протоколу. В клетках Г-27 транскрипционная активность NF-kB в 3,6 раз возрастает по сравнению с контролем после культивирования клеток в течение 24 часов с БП. Культивирование клеток Г-27 с неканцерогенным БеП не влияло на транскрипционную активность NF-kB. В культуре клеток HepG2 канцерогенный БП и его некацерогенный аналог БеП не влияли на транскрипционную активность NF-kB. В качестве положительного контроля клетки культивировались с известным активатором NF-kB – TNF-α. Активация TNF-α свидетельствует о том, что отсутствие эффекта БП не связано с отсутствием в клетках HepG2 белка NFkB. Для более детального изучения действия БП на активацию NF-kB мы исследовали активацию NF-kB с целью оценки способности связывания с консенсусным олигонуклеотидом. б. Влияние ПАУ на активацию NF-kB, определяемую методом EMSA. Как и в предыдущем разделе, мы сравнили действие канцерогенного БП и неканцерогенного БеП на активацию NF-kB в клетках гепатомы Г-27 и HepG2. Клетки обрабатывались изучаемыми веществами в количестве 5 мкг/мл среды, а затем проводилась реакция связывания фракции ядерных белков, выделенных из клеток, с консенсусным олигонуклеотиом к NF-kB (см. рис. 6). Реакция с антителами (супершифт) показала, что обработка клеток БП вызывает связывание двух комплексов NF-kB- р50/р50 и р65/р50 (см. рис. 6). Как показано на рис. 6, после добавления к клеткам Г-27 БП через 30 минут наблюдается усиление связывания NF-kB, которое достигает максимума 13 14 через 60 минут после добавления. Через 90 минут после добавления БП к клеткам Г-27 связывание ослабевает. Обработка БП клеток HepG2 вызывает увеличение связывания NF-kB, хотя в очень слабой степени, также через 30 минут после добавления (см. рис. 6). Неканцерогенный аналог БП – БеП, как показывает рисунок 7, вызывает очень слабое усиление связывания через час после добавления к клеткам. В качестве положительного контроля активации NF-kB был использован его известный активатор TNF-α. Как видно из диаграммы (рис. 7б), максимальная активация NF-kB при действии БП составляет 50% активации, вызванной TNF-α. Традиционный путь активации NF-kB предусматривает зависимое от фосфорилирования потеолитическое удаление ингибирующего белка IkB. Поэтому мы решили исследовать уровень фосфорилированного IkB после воздействия БП. Обработка клеток Г-27 БП увеличивает уровень фосфорилированного IkB через 30 минут после воздействия. Деградация общего IkB наблюдается после 60 минут после воздействия БП. Для положительного контроля клетки обрабатывались известным активатором NF-kB – TNF-α, который вызывал более сильное фосфорилирование IkB. Из полученных результатов видно, что в отличие от клеток Г-27 с отсутствием системы метаболизма, в клетках с экспрессией ферментов метаболизма и Ah-рецептора HepG2, отмечается более слабая активация NFkB. Из этого можно заключить, что БП активирует NF-kB, находясь в исходной неметаболизированной форме и для его действия нет необходимости в активации Ah-рецептора. Предыдущими исследователями показано, что NF-kB взаимодействует с неактивированным Ah-рецептором. В результате, по-видимому, NF-kB будучи связан с Ah-рецептором не может быть активирован. Поэтому в системе, где присутствует Ah-рецептор (гепатома HepG2) NF-kB не активируется лигандом, а в отсутствии Ahрецептора (гепатома Г-27) наблюдается активация при действии БП. 5. Влияние ПАУ на активацию АР-1. 14 15 АР-1 является транскрипционным фактором способным, влиять на клеточную пролиферацию благодаря регуляции экспрессии и функции таких регуляторов клеточного цикла как циклины D1, А, Е, белки р53, р21, р15, р19. АР-1 активируется при различных стимулах клеточной пролиферации. Нами было проведено исследование по влиянию БП на активацию транскрипционного фактора АР-1 в клетках гепатомы HepG2 с экспрессией цитохрома Р450 и Ah-рецептора и в клетках гепатомы Г-27, в которой отсутствует экспрессия цитохрома Р450 и Ah-рецептора. Рисунок 8 демонстрирует, что в клетках гепатомы HepG2 БП усиливает связывание АР-1 через час после воздействия и достигает максимума через 2 часа. Обработка клеток гепатомы Г-27 БП не вызывает усиления связывания АР-1.(см. рис. 8) Из этого следует, что активация АР-1 при действии лигандов Ah-рецептора связана с активацией исключительно Ah-рецептора и/или образованием активных метаболитов и цитохрома Р450, и наблюдаемые нами эффекты канцерогенных ПАУ в клетках с отсутствием Ah-рецептора и цитохрома Р450 не распространены на активацию АР-1. 6.Влияние ПАУ на образование активных форм кислорода. (АФК) Одним из механизмов опухолевой промоции является образование АФК в клетке. Считается, что с формированием АФК связаны такие промоторные эффекты как ингибирование МЩК и стимуляция пролиферации. Образование АФК в клетке под действием промотора и разнообразных индукторов цитохрома Р450 (Akintobi et al., 2007; Jin et al., 2004) может быть обусловлено функционированием цитохрома Р450, однако, в клетках гепатомы Г-27 отсутствует экспрессия цитохрома Р450. В том числе не исключено, что формирование АФК может происходить в результате изменения других клеточных систем, продуцирующих АФК (например, дыхательная цепь митохондрий). 15 16 Возможность образования АФК в клетках гепатомы Г-27 под действием БП мы исследовали с помощью маркерного соединения дихлородиацетилфлуоресцеина (см материалы и методы). Мы показали, что ни БП, ни его неканцерогенный аналог не вызывают увеличения уровня флуоресценции в клетках гепатомы Г-27, что свидетельствует об отсутствии образования АФК под действием БП. Из этих данных можно заключить, что описанные выше эффекты ПАУ на функции клеток (ингибирование МЩК, активация транскрипционных факторов АР-1 и NF-κВ) не связаны с образованием АФК. ВЫВОДЫ. 1. Модель клеточной культуры гепатом с экспрессией Ah-рецептора и цитохрома Р450 (HepG2) и без таковой (Г-27) является наиболее перспективной для изучения механизмов опухоль-промоторного эффекта полициклических ароматических углеводородов (ПАУ). 2.Стадия промоции является определяющей в развитии опухоли при действии ПАУ. Эффект канцерогенных ПАУ реализуется в зависимости от наличия или отсутствия экспрессии Ah-рецептора и изоформ цитохрома Р450 в клетках-мишенях. 3. Канцерогенный эффект ПАУ обусловлен действием исходным (химически-инертным) состоянием его молекулы. 4. Используемые в работе канцерогенные ПАУ (БП- бензо/а/пирен, 3-МХ - 3метилхолантрен, ДМБА – 7,12-диметилбенз/а/антрацен) и неканцерогенный аналог бензо/е/пирен оказывают различное влияние на функциональную активность межклеточных щелевых контактов (МЩК) гепатом, экспрессирущих (HepG2) и неэкспрессирующих (Г-27) Ah-рецептор и изоформы цитохрома Р450. При этом: а) Канцерогенные ПАУ (в отличие от неканцерогенных) ингибируют МЩК в клетках обоих типов гепатом. б) БП вызывает наиболее сильный ингибирующий эффект на МЩК по сравнению с другими изучаемыми канцерогенами. 16 17 в) В обеих клеточных культурах (Г-27 и HepG2) ингибирующее действие бензо/а/пирена на состояние МЩК не зависит от функционирования Ahрецептора. 5. Ингибирование МЩК в клетках гепатомы Г-27 под воздействием БП сочетается с падением уровня белка-супрессора р21, а в клетках гепатомы HepG2 с падением уровня белка-супрессора р27. Это свидетельствует о различных механизмах стимуляции клеточной пролиферации в указанных гепатомах. 6. В клетках гепатомы HepG2 (с экспрессией цитохрома Р450 и Ahрецептора) бензо/а/пирен активирует транскрипционный фактор АР-1, тогда как эффект активации транскрипционного фактора NF-kB не наблюдается. В клетках гепатомы Г-27 (с отсутствием экспрессии цитохрома Р450 и Ahрецептора) бензо/а/пирен стимулирует активацию транскрипционного фактора NF-kB, а активация транскрипционного фактора АР-1 отсутствует. Таким образом, механизмы влияния бензо/а/пирена на такие составляющие опухолевой промоции, как стимуляция пролиферации и апоптоз, зависят от экспрессии в клетках цитохрома Р450 и Ah-рецептора. 7.Действие канцерогенного бензо/а/пирена а также его неканцерогенного аналога не вызывает образования активных форм кислорода в клетках гепатомы Г-27. Из этого следует, что вышеописанное влияние ПАУ на различные функции клеток гепатом (подавление функциональной активности МЩК, активация транскрипционных факторов NF-kB и АР-1) не связаны с образованием активных форм кислорода. 8. Полученные данные являются основанием для предположения о существовании (кроме Ah-рецептора и цитохрома Р450) в клетках исследуемых гепатом фактора, при взаимодействии с которым канцерогенных ПАУ нарушается гомеостаз, приводящий к промоции. Практические рекомендации. Целесообразно включение результатов исследования в практику научно-исследовательских подразделений, 17 18 разрабатывающих проблемы канцерогенеза и лекционные курсы по гистологии и онкологии медицинских ВУЗов. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Шаровская Ю.Ю., Соломатина (Болотина) Н.А., Дубовая Т.К., Хитрово И.А., В.А.Кобляков. Ингибирование межклеточных щелевых контактов (ЩК) канцерогенными полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ) в культуре клеток в отсутствии метаболического превращения ПАУ./ Сборник научных трудов ГОУ ВПО «Смоленская Государственная Медицинская Академия МЗ РФ», 2004, с. 245-249. 2. Шаровская Ю.Ю., Вайман А.В., Соломатина (Болотина) Н.А., Кобляков В.А. Ингибирование межклеточных щелевых контактов канцерогенными полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ) в культуре клеток в отсутствии метаболического превращения ПАУ.// Биохимия 2004, 69: 4, 511-518. 3. Kobliakov V., Solomatina (Bolotina) N., Vaiman A., Sharovskaya Y. Inhibition of gap junction intercellular communications (GJIC) and stimulation of cell proliferation in cell culture by carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) in the absence of PAH metabolism.// 18th Meeting of the European Association for Cancer Research, Proceedings, 2004, 105. 4. Кобляков В.А., Соломатина (Болотина) Н.А., Шаровская Ю.Ю. Механизм промоторного действия «полных» канцерогенов.// Вопросы онкологии – 2005, 51:1, 11-12. 5. Соломатина (Болотина) Н.А., Гаспарьян А.В., Дубовая Т.К., Кобляков В.А. Активация транскрипционных факторов NF-kB и АР-1 в клетках гепатом канцерогеном бензо/а/пиреном.// Цитология – 2006, 48:9, 801-802. 6. Sharovskaya Y., Kobliakova Y. , Solomatina (Bolotina) N., Kobliakov V. Effect of some carcinogenic and non-carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons on gap junction intercellular communications in hepatoma cell cultures.// European Journal of cell Biology, 2006, 85: 387-397. 7. Болотина Н.А., Гаспарьян А.В., Дубовая Т.К., Евтеев В.А., Кобляков В.А., Активация бензо/а/пиреном транскрипционных факторов NF-kB и АР-1, связанных с промоторной стадией канцерогенеза в культуре клеток// Биохимия – 2007, 72: 5, 682 – 689. 8. Кобляков В.А., Волков М.С., Гаспарьян А.В., Евтеев В.А., Болотина Н.А. Закономерности промоторной стадии канцерогенеза// Цитология – 2007, 49:9, 756. 9. Гаспарьян А.В., Евтеев В.А., Болотина Н.А., Кобляков В.А. Механизмы негенотоксического действия канцерогенов// Вопросы онкологии, 2007, 63, 10-11. 18