Методичка: Большой практикум

Министерство образования и науки Российской Федерации
Сибирский федеральный университет
БОЛЬШОЙ ПРАКТИКУМ
(биологический контроль состояния окружающей среды)
Учебно-методическое пособие
Красноярск
СФУ
2012
УДК 504.064.36(07)
ББК 28.081.4я73
Б799
Составитель: ст. преп. Шашкова Т.Л.
Большой практикум. Биологический контроль состояния окружающей среды:
учебно-методическое пособие [Текст] / сост. Т.Л. Шашкова. – Красноярск: Сиб.
Федер. ун-т, 2012. – 16 с.
Предметом изучения данной дисциплины является освоение современных
методик проведения биологического контроля окружающей среды. Учебнометодическое пособие содержит указания для лабораторных работ.
Предназначено для студентов, обучающихся на очной форме обучения, по
специальности 020801.65 экология и направлению 020800.65 «Экология и
природопользование»
УДК 504.064.36(07)
ББК 28.081.4я73
© Сибирский
федеральный
университет, 2012
СОДЕРЖАНИЕ
ЧАСТЬ 1. ЛИХЕНОИНДИКАЦИЯ ................................................................................... 5
Анатомия, морфология экология лишайников. Идентификация видов и
коллектирование лишайников ........................................................................................ 5
Изучение количественных характеристик лишайникового покрова и методик
пассивной лихеноиндикации .......................................................................................... 7
Пассивная лихеноиндикация состояния воздушной среды условно чистых
районов ............................................................................................................................ 13
Пассивная лихеноиндикация состояния воздушной среды слабозагрязненных
районов ............................................................................................................................ 14
Пассивная лихеноиндикация состояния воздушной среды сильнозагрязненных
районов ............................................................................................................................ 15
Трансплантационная лихеноиндикация состояния воздушной среды ..................... 16
Обработка результатов лихеноиндикационных исследований ................................. 18
ЧАСТЬ 2. БИОИНДИКАЦИЯ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ВОЗДУШНОЙ СРЕДЫ ................... 20
Морфометрический анализ побегов хвойных деревьев ............................................. 20
Анализ пигментного состава хвои................................................................................ 22
Определение влияния атмосферного загрязнения на жизненные циклы растений с
использованием метода регистрации термоиндуцированных изменений нулевого
уровня флуоресценции хлорофилла ............................................................................. 26
ЧАСТЬ 3. БИОТЕСТИРОВАНИЕ ВОДНОЙ СРЕДЫ................................................... 31
Определение чувствительности Daphnia magna к модельному токсиканту в
зависимости от степени минерализации культивационной воды ............................. 31
Оценка действия ионов тяжелых металлов на трофическую активность Daphnia
magna ............................................................................................................................... 35
Оценка действия ионов тяжелых металлов на выживаемость Ceriodaphnia affinis 38
Оценка действия ионов тяжелых металлов на выживаемость Artemia salina в
условиях вращения......................................................................................................... 42
Изучение зависимости скорости роста культуры водоросли от интенсивности
света ................................................................................................................................. 45
Изучение зависимости скорости роста культуры водоросли от температуры ........ 47
Изучение зависимости скорости роста культуры водоросли от наличия
углекислого газа в среде ................................................................................................ 49
Определение чувствительности культуры Chlorella vulgaris к ионам тяжелых
металлов .......................................................................................................................... 51
Определение чувствительности ряски малой к ионам тяжелых металлов .............. 55
Биотестирование стоков городских очистных сооружений разными методами .... 59
ЧАСТЬ 4. МЕТОДЫ БИОТЕСТИРОВАНИЯ В ОЦЕНКЕ ТОКСИЧНОСТИ ДРУГИХ
СРЕД ................................................................................................................................... 69
Оценка токсичности проб почвы различными методами биотестирования ............ 69
Замедленная флуоресценция водоросли хлорелла в оценке иммунитета клубней
картофеля ........................................................................................................................ 73
Скорость роста корней пшеницы в зависимости от кислотности и присутствия
токсиканта в воде ........................................................................................................... 76
Биотестирование качества талого снега по приросту водоросли хлореллы ............ 78
ЧАСТЬ 1. ЛИХЕНОИНДИКАЦИЯ
Лабораторная работа № 1
Анатомия, морфология экология лишайников.
Идентификация видов и коллектирование лишайников
Цель: Ознакомиться с особенностями анатомии, морфологии и экологии
лишайников, методами их сбора, коллектирования и идентификации.
Оборудование и материалы: Конверты, этикетки, лупы, компас, ножи,
микроскопы, наборы для изготовления микропрепаратов, определители
лишайников, гербарные образцы лишайников различных систематических и
экологических групп.
Методика сбора и коллектирования лишайников
Перед началом лихеноиндикационных работ необходимо произвести
предварительную идентификацию видового состава лишайников, чтобы затем легко
узнавать их при определении относительной численности тем или иным методом.
Для этого сначала проводят рекогносцировочное обследование местности,
собирая образцы лишайников для последующей идентификации в лабораторных
условиях. При этом желательно охватить территории с предположительно
различной степенью загрязнения среды.
При сборе лишайников с помощью ножа необходимо соблюдать технику
безопасности: около ствола дерева должен находиться только ОДИН сборщик.
Случайно соскользнувший с субстрата (коры дерева) нож может нанести травму
стоящему рядом человеку.
Лишайники собирают вместе с кусочком коры или иного субстрата так, чтобы
не повредить нижний коровый слой и ризины. При этом вред, причиняемый дереву,
нужно по возможности свести к минимуму. Для этого лучше брать лишайники с
поверхностным слоем достаточно толстой корки ствола, не затрагивая ее
глубоколежащие слои.
При сборе лишайники упаковывают в индивидуальные конверты. На них
обязательно указывается место сбора, порода дерева, дата. Дополнительная
информация (экспозиция, высота расположения и пр.) тоже может быть указана,
если в дальнейшем планируется изучение экологических или экологоморфологических особенностей конкретных видов.
Если образцы лишайников были собраны во влажную погоду, при
возвращении в лабораторию их необходимо будет просушить во избежание
заплесневения.
Для хранения в научной коллекции образцы лишайников высушивают,
помещают в специализированные конверты стандартного образца и этикетируют.
Постоянная этикетка содержит информацию о систематическом положении вида,
месте и дате сбора, субстратной приуроченности образца, имени и фамилии
сотрудника, собравшего и идентифицировавшего образец. При наличии небольших
по величине фрагментов талломов лишайников бывает целесообразно размещать их
в небольшие конверты, которые затем вкладывают в конверт стандартного образца.
Методика изучения строения и идентификации лишайников
Лишайники, собранные в результате полевых исследований, затем проходят
5
камеральную обработку,
в результате которой устанавливается их видовая
принадлежность. Лишайники идентифицируют, применяя общепринятые методы
микроскопирования и используя определительные таблицы.
Изучение морфологии слоевищ удобнее производить с помощью
бинокуолярной лупы. Особенности строения таллома (морфологический тип,
апотеции, соредии, изидии, ризины и пр.) отображаются в отчете.
Для изучения анатомии лишайника изготовляется поперечный срез его
таллома. Для этого фрагмент таллома лишайников отделяют от субстрата,
размачивают, помещают на предметное стекло, фиксируют лезвиями и изготовляют
несколько тонких срезов. Полученный препарат изучается методом
микроскопирования. В отчете отображаются детали строения (верхняя и нижняя
кора, сердцевина, ризины, эпитеци, гипотеций, гимений, эксципул, сумки, споры).
Результаты, полученные при изучении анатомических и морфологический
особенностей лишайника в дальнейшем используются при его идентификации с
помощью определительных таблиц.
Ход работы:
1. На исследуемой территории произвести сбор образцов лишайников, указывая
в сопроводительной этикетке географическое положение исследуемой
территории, растительное сообщество, субстрат, древесную породу,
особенности расположения таллома лишайника на стволе, дату и данные
коллектора. Изучение морфологических особенностей строения талломов
лишайников.
2. Изучить анатомические особенности строения талломов лишайников.
3. Идентифицировать виды лишайников.
4. Упаковать идентифицированный лишайник в конверт для хранения в гербарии
и оформить гербарную этикетку.
Обработка и представление результатов. Результаты проделанной работы
излагаются в отчете (систематическое положение идентифицированных видов,
рисунки микроскопированных объектов, подготовленные для хранения образцы
лишайников).
1.
2.
3.
4.
Контрольные вопросы
Какие морфологические типы талломов лишайников можно выделить?
Каковы функции соредий и изидий?
Особенности строения апотециев лишайников.
Особенности строения таллома лишайников.
Рекомендуемая литература
1. Определитель лишайников СССР. Вып. 4. Веррукариевые – Пилокарповые. 1977. Изд-во
“Наука”, Ленинград, 344 с.
2. Определитель лишайников СССР. Вып. 5. Кладониевые – Акароспоровые. 1978. Изд-во
“Наука”, Ленинград, 304 с.
3. Определитель лишайников СССР. Вып.1. Пертузариевые, Леканоровые, Пармелиевые.
1971. Изд-во “Наука”, Ленинград, 412 с.
4. Определитель лишайников СССР. Вып.2. А.Н. Окснер. Морфология, систематика и
географическое распространение. 1974. Изд-во “Наука”, Ленинград, 284 с.
5. Определитель лишайников СССР. Калициевые – Гиалектовые. Вып. 3. 1975. Изд-во
“Наука”, Ленинград, 275 с.
6
Лабораторная работа № 2
Изучение количественных характеристик лишайникового покрова и методик
пассивной лихеноиндикации
Цель: Для освоения методик пассивной лихеноиндикации освоить правила
заложения пробных площадей, визуальные ознакомиться с приемами измерения
относительной численности лишайников, освоить методику расчета индексов
полеотолерантности.
Оборудование и материалы: Лупы, ножи и конверты для сбора образцов,
яркие ленты или полоски ткани, пластиковые этикетки с номерами, сантиметровая
лента, зажимы или срепки, рамка 10 х 10 см, таблицы для записи результатов
измерений, калькуляторы.
Выбор пробных площадей и модельных деревьев
Для исследований закладываются пробные площади – участок территории, в
пределах которого выбираются модельные деревья. Для долговременного
мониторинга закладывают постоянные пробные площади, на которых деревья
маркиуют металлическими пластинками с номером.
Если работы ведутся в лесном массиве, то площади закладываются регулярно
или в узлах сетки со стороной квадрата от 1 до 5 км, или на трансектах, заложенных
в различных направлениях от источника загрязнения на равном расстоянии друг от
друга. (Как правило, это направления преобладающих ветров). В условиях города
площади закладываются в пределах городских зеленых насаждений, при этом по
возможности в отдалении от дорожно-транспортной сети.
Требования к пробным площадям и модельным деревьям:
1. Структура и состав фитоценозов на удаленных друг от друга пробных
площадях должны быть по возможности схожими. Для этого учитывают: тип
леса, состав, сомкнутость крон древостоя, время, прошедшее с момента
последнего пожара.
2. Пробные площади должны быть по возможности удалены от источников
загрязнения.
3. Модельные деревья должны в среднем быть похожи по высоте, возрасту,
диаметру, жизненному состоянию, радиусу, густоте, высоте прикрепления
кроны, рельефу коры, углу отклонения поверхности ствола по вертикали.
Только при соблюдении всех этих требований можно с достаточной степенью
достоверности говорить о том, что различия в числе видов или проективном
покрытии вызваны именно влиянием какого-либо вещества, а не различиями в
микроклиматических условиях.
При проведении лихеноиндикационных работ намечается центр пробной
площади (первое дерево), и далее вокруг него выбираются ближайшие 10-20
деревьев, отвечающих требованиям модельных. Деревья помечаются яркими
полосками ткани и пластиковыми этикетками с нанесенными на них несмываемыми
номерами (от 1 до 10 или до 20).
Методика визуальной оценки обилия лишайников
Эта самая простая и одновременно самая субъективная и потому недостаточно
точная методика является вариантом шкалы балльной Браун-Бланке, используемой
7
для стандартных геоботанических исследований. Используются следующие
градации:
+ - встречаются единичные талломы, степень покрытия ничтожна.
1 – талломов достаточно много, но ПП невелико или особи разрежены при
большой площади покрытия.
2 – ПП 10-25 %.
3 – ПП 25-50 %.
4 – ПП 50-75 %.
5 – ПП более 75 %.
Она приемлема при предварительной оценке обилия лишайников или при
быстрых, но широкомасштабных лихеноиндикационных работах.
Так же при экспресс-анализе состояния среды применяется такая
характеристика обилия лишайников, как встречаемость. При этом учитывается, на
скольких стволах из всего числа модельных деревьев встречается какой-либо вид
лишайника, и это число переводится в проценты.
Методики измерения относительной численности лишайников
Методика измерения линейных пресечений
На ствол дерева на заданной высоте накладывается гибкая лента с
миллиметровыми делениями в определенной относительно сторон света точке,
обычно с северной стороны, оборачивается вокруг ствола и закрепляется зажимом.
Длину окружности ствола при дальнейших вычислениях принимают за 100%.
При измерениях фиксируют начало и конец каждого пересечения ленты с
талломами лишайников с точностью до 1 мм.
Результаты вносят в заранее приготовленную таблицу:
Таблица 1
Дата ________ Ф.И.О. коллектора ___________ Пробная площадь № _____
Местонахождение__________________________________________________
Древесная порода ______________ Средний диаметр стволов _____________
Характеристика древостоя ______________________________________
Дл. окруж. ствола, см
Вид лишайника
Число деревьев
2
3
4
1
…n
1
2
…
При обработке результатов измерений подсчитывается суммарная
протяженность талломов лишайников каждого вида. Затем, зная длину окружности
ствола дерева и принимая ее за 100%, пропорцией рассчитываем проективное
покрытие лишайников.
Методика измерения проективного покрытия
Для измерения проективного покрытия (далее – ПП) используют рамку, или
сеточку. Она представляет собой жесткий контур с соотношением сторон 1:1 или
1:2, разделенный леской или нитями на квадраты-ячейки со стороной 1 х 1 см.
Рамку прикладывают к стволу дерева на определенной высоте.
8
Количественный учет лишайников производится чаще всего на двух уровнях:
у комля дерева и на высоте 1,3-1,5 м от поверхности земли (на уровне груди или на
уровне глаз) Высоту измерения ПП обязательно отмечают в протоколе. Измерения
проводят или с четырех сторон света, или, чаще, в направлении к источнику
загрязнения и с противоположной стороны, от него. При мозаичном распределении
нескольких источников загрязнения на исследуемой территории рамку накладывают
с двух сторон: с северо-западной (как правило, наиболее густо обросшей
лишайниками) и юго-восточной стороны (менее всего покрытой лишайниками)
ствола дерева.
При подсчете каждая ячейка при размере рамки 10 х 10 см будет
соответствовать одному проценту проективного покрытия (ПП).
Результаты вносят в заранее приготовленную таблицу:
Таблица 2
Дата ________ Ф.И.О. коллектора ___________ Пробная площадь № ________
Местонахождение___________________________________________________
Древесная порода ______________ Средний диаметр стволов ______________
Характеристика древостоя ____________________________________________
№
дерева
Вид лишайника,
экспозиция
1
с\з
в
н
…n
2
ю\в
в
н
с\з
в
н
ю\в
в
н
с\з
в
н
ю\в
в
н
1
2
…
Полученные для каждого вида лишайника проценты ПП складывают и делят
на число обследованных деревьев, чтобы вычислить среднее ПП для всей пробной
площади.
По результатам измерений можно вычислить ПП в разных вариантах: для
каждого обнаруженного вида лишайника, для всей синузии в целом, для
лишайников, растущих на комле дерева, для растущих на стволе, для определенной
экспозиции и т.д. Эти данные характеризуют распределение лишайников по
субстрату на различных пробных площадях и могут быть информативны при их
последующем сравнении.
Использование классов полеотолерантности лишайников
На основании результатов подробных исследований лихенофлоры некоторых
регионов лишайники группируются в классы полеотолерантности. В один класс
попадают виды, примерно одинаково реагирующие на тот или иной уровень
загрязнения среды.
Полученная шкала полеотолерантности будет корректна для определения
степени загрязнения районов, территориально и флористически близких к тому, на
основании изучения которого она создавалась. Она используется или для
приблизительной качественной, или для более точной количественной оценки
состояния среды.
Для качественной оценки достаточно определить, к какому классу
9
полеотолерантности относятся доминанты лишайникового покрова, относительно
часто встречающиеся на той или иной исследуемой территории. Для этого бывает
достаточно визуально оценить их обилие на пробной площади.
Для количественной оценки необходимо тщательное измерение ПП
лишайников и применение лихеноиндикационных индексов.
Индекс полеотолерантности вычисляется по формуле:
n
IP  
j i
AiCi
Cn
Где n – число видов на описанной пробной площади, Ai – класс
полеотолерантности вида (от 1 до 10), Ci – проективное покрытие вида в баллах, Cn
– сумма значений покрытия всех видов в баллах.
Оценка проективного покрытия дается по 10-балльной шкале:
Балл
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Оценка
1-3 3-5 5-10 10- 20- 30- 40- 50- 60- 80проективного
20
30
40
50
60
80
100
покрытия, %
Для вычисления IP для какой-либо пробной площади для каждого вида
определяется класс полеотолерантности и проективное покрытие в баллах. Затем
полученные данный подставляются в формулу. После получения значений IP для
некоторого числа пробных площадей становится возможным создание
лихеноиндикационной карты и сравнительная оценка состояния атмосферы
исследованных территорий. Наблюдается закономерность: чем больше значение IP,
тем более загрязнен воздух на территории, на которой располагалась данная
пробная площадь. Для использования на территории Красноярского края
предлагается следующая шкала полеотолерантности лишайников (табл. 3).
1.
2.
3.
4.
Ход работы
В исследуемом районе заложить пробную площадь и выбрать деревья,
соответствующие критериям модельных.
За пределами пробной площади собираются образцы лишайников для
коллектирования и идентификации видового состава.
В пределах пробной площади на модельных деревьях проводится визуальная
оценка относительной численности лишайников и измерение их проективного
покрытия.
На основании результатов измерения проективного покрытия рассчитываются
индексы полеотолерантности для двух пробных площадей. Полученные
результаты
сохраняются
для
последующего
составления
лихеноиндикационных карт.
Обработка и представление результатов
Результаты проделанной работы излагаются в отчете (список обнаруженных
на пробной площади видов с указанием их систематического положения, результаты
исследования прпоективного покрытия лишайников, рассчитанные индексы
полеотолерантности).
10
Класс
Таблица 3
Классы полеотолерантности лишайников г. Красноярска и его окрестностей
I
II
III
IV
V
VI
VII
VII
I
IX
X
Тип местообитаний по степени
Виды
влияния антропогенных факторов
и встречаемость в них видов
Естественные местообитания
Athroniа radiata, Bacidia albescens,
(ландшафты) без ощутимого
B. bechausii, Bryoria sp., Buellia alboathra,
антропогенного влияния
Сyphellium lucidum, Graphis scripta,
Hypogymnia tubulosa, Lecanora allophana,
L. argentata, L. fuscescens, Lepraria incana,
Leptogium saturninum, Opegrafa vulgata,
Pseudoevernia furfuracea, Vulpicida pinastri,
Usnea sp.
Естественные (часто) и
Biatora sp., Cladonia fimbriata, C. coniocraea,
антропогенно-слабоизмененные Evernia mesomorpha, Heterodermia speciosa,
(редко) местообитания
Hypogymnia physodes, Phaeophyscia ciliata,
Physconia detersa, Peltigera canina,
Pertusaria amara, Ramalina dilacerata,
R. roeslerii, Usnea subfloridana
Естественные (часто) и
Lecanora symmicta, Melanelia olivacea,
антропогенно-слабоизмененные Opegrapha rufescens, Parmelia sulcata,
(часто) местообитания
Phaeophyscia kairamoi, Physconia perisidiosa,
Physcia tribacea, Rinodina pyrina, Usnea hirta,
Xanthoria candelaria
Естественные (часто), слабо
Amandinea punctata, Caloplaca haematites,
(часто) и умеренно (редко)
Candelariella xanthostigma, Physcia caesia,
измененные местообитания
Ph. tenella, Ramalina sp., Ph. stellaris
Естественные, антропогенно
Melanelia exasperatula, Physcia dubia,
слабо и умеренно измененные
Rinodina sophodes
местообитания (с равной
встречаемостью)
Естественные (сравнительно
Candelariella vitellina,
редко) и антропогенно-умеренно Flavopunctelia soredica,
измененные местообитания
Phaeophyscia nigricans, Physcia aipolia
Умеренно (часто) и сильно
Candelaria concolor, Oxneria fallax
(редко) антропогенно-измененные
местообитания
Умеренно и сильно антропогенно Phaeophyscia cf. оrbicularis,
измененные местообитания (с
Physcia adscendens, Phaeophyscia sp.
равной встречаемостью)
Сильно антропогенно измененные Caloplaca ferruginea, C. cerina
местообитания (часто)
Очень сильно антропогенно
Lecanora hageni, Candelariella aurella
измененные местообитания
(встречаемость и жизненность
низкие)
11
Контрольные вопросы
1. Правила выбора и заложения пробных площадей.
2. Правила выбора модельных деревьев.
3. Какими способами можно оценить количественные характеристики лишайникового
покрова?
Рекомендуемая литература
1. Бязров Л.Г. Лишайники в экологическом мониторинге / М.: Научный мир, 2002. - 336 с.
2. Шкараба Е.М., Селиванов А.Е. Использование лишайников в качестве индикаторов
загрязнения окружающей среды: Учебное пособие. - Пермь. Изд. ПГПУ, 2001.
3. Трасс Х.Х. Классы полеотолерантности лишайников и экологический мониторинг / Трасс
Х.Х. // Проблемы экологического мониторинга и моделирования экосистем. Л.:
Гидрометеоиздат, 1985. - Т. 7. - С. 122-137.
4. Трасс Х.Х. Лихеноиндикационные индексы и SO2 / Х.Х. Трасс // Биогеохим. круговорот
веществ в биосфере: сб. науч. статей / - М.: 1987. - C. 111-115.
5. Трасс Х.Х. Полеотолерантность лишайников / Х.Х. Трасс // Материалы 6 симпозиума
микологов и лихенологов Прибалтийских республик. Рига, 1971. Т. 1. С. 66-70
12
Лабораторная работа № 3
Пассивная лихеноиндикация состояния воздушной среды
условно чистых районов
Цель:
Для
отработки
навыка
применения
методик
пассивной
лихеноиндикации исследовать состояние атмосферного воздуха в районе с низким
уровнем загрязнения с помощью измерения относительной численности
лишайников (методы линейных пресечений и проективного покрытия). Освоить
методику расчета индексов полеотолерантности. Ознакомиться с некоторыми
приемами лихеноиндикационного картирования.
Оборудование и материалы: Сантиметровая лента, зажимы или срепки,
рамка 10 х 10 см, таблицы для записи результатов измерений, калькуляторы.
Задания, аналогичные приведенным в лабораторной работе № 2, выполняются
на пробной площади, расположенной в районе с заведомо низким уровнем
загрязнения окружающей среды. При идентификации видов используются
методики, освоенные при выполнении лабораторной работы № 1, при изучении
лишайникового покрова – работ № 2.
На пробной площади обследуется лишайниковый покров 20 деревьев двух
пород, желательно выбирать древесные породы с противоположными
характеристиками коры.
1.
2.
3.
4.
Ход работы:
В исследуемом районе заложить пробную площадь и выбрать деревья,
соответствующие критериям модельных.
Провести изучение видового разнообразия лишайников исследуемой
территории.
Провести изучение количественных характеристик лишайникового покрова,
используя методики линейных пресечений и проективного покрытия.
На основании полученных данных рассчитать индекс полеотолерантности для
исследованной территории.
Обработка и представление результатов
Результаты проделанной работы излагаются в отчете (список обнаруженных
видов, проективное покрыетие отдельных видов лишайников, вычисленные
лихеноиндикационные индексы).
Контрольные вопросы
1. К каким классам полеотолерантности относятся виды лишайников, обнаруженные на данной
территории?
2. Назовите наиболее чувствительные к загрязнению окружающей среды виды лишайников.
3. Каково соотношение лишайников различных жизненных форм на данной территории?
Рекомендуемая литература
1. Бязров Л.Г. Лишайники в экологическом мониторинге / М.: Научный мир, 2002. - 336 с.
2. Трасс Х.Х. Классы полеотолерантности лишайников и экологический мониторинг / Трасс Х.Х.
// Проблемы экологического мониторинга и моделирования экосистем. Л.: Гидрометеоиздат,
1985. - Т. 7. - С. 122-137.
3. Трасс Х.Х. Полеотолерантность лишайников / Х.Х. Трасс // Материалы 6 симпозиума
микологов и лихенологов Прибалтийских республик. Рига, 1971. Т. 1. С. 66-70.
13
Лабораторная работа № 4
Пассивная лихеноиндикация состояния воздушной среды
слабозагрязненных районов
Цель:
Для
отработки
навыка
применения
методик
пассивной
лихеноиндикации исследовать состояние атмосферного воздуха в районе со средним
уровнем загрязнения с помощью измерения относительной численности
лишайников (методы линейных пресечений и проективного покрытия). Освоить
методику расчета индексов полеотолерантности. Ознакомиться с некоторыми
приемами лихеноиндикационного картирования.
Оборудование и материалы: Сантиметровая лента, зажимы или срепки,
рамка 10 х 10 см, таблицы для записи результатов измерений, калькуляторы.
Задания, аналогичные приведенным в лабораторной работе № 2, выполняются
на пробной площади, расположенной в районе со средним уровнем загрязнения
окружающей среды. При идентификации видов используются методики, освоенные
при выполнении лабораторной работы № 1, при изучении лишайникового покрова –
работ № 2.
На пробной площади обследуется лишайниковый покров 20 деревьев двух
пород, желательно выбирать древесные породы с противоположными
характеристиками коры.
Ход работы:
1. В исследуемом районе заложить пробную площадь и выбрать деревья,
соответствующие критериям модельных.
2. Провести изучение видового разнообразия лишайников исследуемой
территории.
3. Провести изучение количественных характеристик лишайникового покрова,
используя методики линейных пресечений и проективного покрытия.
4. На основании полученных данных рассчитать индекс полеотолерантности для
исследованной территории.
Обработка и представление результатов
Результаты проделанной работы излагаются в отчете (список обнаруженных
видов, проективное покрыетие отдельных видов лишайников, вычисленные
лихеноиндикационные индексы).
Контрольные вопросы
1. К каким классам полеотолерантности относятся виды лишайников, обнаруженные на
данной территории?
2. Назовите виды лишайников, способных существовать при среднем уровне загрязнения
окружающей среды.
3. Каково соотношение лишайников различных жизненных форм на данной территории?
Рекомендуемая литература
1. Бязров Л.Г. Лишайники в экологическом мониторинге / М.: Научный мир, 2002. - 336 с.
2. Трасс Х.Х. Классы полеотолерантности лишайников и экологический мониторинг / Трасс
Х.Х. // Проблемы экологического мониторинга и моделирования экосистем. Л.:
Гидрометеоиздат, 1985. - Т. 7. - С. 122-137.
3. Трасс Х.Х. Полеотолерантность лишайников / Х.Х. Трасс // Материалы 6 симпозиума
микологов и лихенологов Прибалтийских республик. Рига, 1971. Т. 1. С. 66-70.
14
Лабораторная работа № 5
Пассивная лихеноиндикация состояния воздушной среды
сильнозагрязненных районов
Цель:
Для
отработки
навыка
применения
методик
пассивной
лихеноиндикации исследовать состояние атмосферного воздуха в районе с высоким
уровнем загрязнения с помощью измерения относительной численности
лишайников (методы линейных пресечений и проективного покрытия). Освоить
методику расчета индексов полеотолерантности. Ознакомиться с некоторыми
приемами лихеноиндикационного картирования.
Оборудование и материалы: Сантиметровая лента, зажимы или срепки,
рамка 10 х 10 см, таблицы для записи результатов измерений, калькуляторы.
Задания, аналогичные приведенным в лабораторной работе № 2, выполняются
на пробной площади, расположенной в районе с высоким уровнем загрязнения
окружающей среды. При идентификации видов используются методики, освоенные
при выполнении лабораторной работы № 1, при изучении лишайникового покрова –
работ № 2.
На пробной площади обследуется лишайниковый покров 20 деревьев двух
пород, желательно выбирать древесные породы с противоположными
характеристиками коры.
Ход работы:
1. В исследуемом районе заложить пробную площадь и выбрать деревья,
соответствующие критериям модельных.
2. Провести изучение видового разнообразия лишайников исследуемой
территории.
3. Провести изучение количественных характеристик лишайникового покрова,
используя методики линейных пресечений и проективного покрытия.
4. На основании полученных данных рассчитать индекс полеотолерантности для
исследованной территории.
Обработка и представление результатов
Результаты проделанной работы излагаются в отчете (список обнаруженных
видов, проективное покрыетие отдельных видов лишайников, вычисленные
лихеноиндикационные индексы).
Контрольные вопросы
1. К каким классам полеотолерантности относятся виды лишайников, обнаруженные на
данной территории?
2. Назовите наиболее толерантные к загрязнению окружающей среды виды лишайников.
3. Каково соотношение лишайников различных жизненных форм на данной территории?
Рекомендуемая литература
1. Бязров Л.Г. Лишайники в экологическом мониторинге / М.: Научный мир, 2002. - 336 с.
2. Трасс Х.Х. Классы полеотолерантности лишайников и экологический мониторинг / Трасс
Х.Х. // Проблемы экологического мониторинга и моделирования экосистем. Л.:
Гидрометеоиздат, 1985. - Т. 7. - С. 122-137.
3. Трасс Х.Х. Полеотолерантность лишайников / Х.Х. Трасс // Материалы 6 симпозиума
микологов и лихенологов Прибалтийских республик. Рига, 1971. Т. 1. С. 66-70.
15
Лабораторная работа № 6
Трансплантационная лихеноиндикация состояния воздушной среды
Цель: Освоить методы изучения флуоресцентных параметров состояния
водорослевого компонента лишайников. Подготовить экспериментальный материал.
Разместить лишайниковых трансплантатов на пробных площадях.
Оборудование и материалы: Гербарные образцы лишайников, кюветы,
капроновая сеть, прочные нитки, тесьма, степлеры, мелованная бумага.
В процессе выполнения заданий лабораторной работы студенты знакомятся с
методом трансплантационной лихеноиндикации с применением метода измерения
замендленной флуоресценции хлорофилла для оценки состояния водорослевого
компонента лишайников.
В качестве тест-объектов используются широко распространенные эпифитные
лишайники семейства Parmeliaceae порядка Lecanorales: листоватые Flavopunctelia
soredica, Hypogymnia physodes и кустистые Evernia mesomorfa и Usnea subfloridana.
Таллмы этих видов собирают на незагрязненных территориях.
Состояние водорослевого компонента лишайников до и после экспонирования
определяется методом измерения замедленной флуоресценции хлорофилла с
помощью прибора флуориметра. Флуориметнр для биологического контроля
загрязнения окружающей среды «Фотон-10» регистрирует у различных
растительных объектов несколько параметров замедленной (ЗФ) флуоресценции
хлорофилла на основе измерения послесвечения хлорофиллсодержащего
растительного объекта в промежутках между импульсами возбуждающего света.
В работе с лишайниками в качестве показателей ЗФ взято усредненное
значение интенсивности миллисекундной ЗФ, регистрируемое в режиме высокой
интенсивности возбуждающего синего света (ЗФв). Режим измерения выбирается
индивидуально для каждого вида лишайника. Измерение свечения образцов
выполняется автоматически, данные передаются на управляющий компьютер и
после обработки выводятся на экран или сохраняются в файл.
Методика предэкспериментальной подготовки трансплантируемого
материала. Талломы лишайников Evernia mesomorfa, Usnea subfloridana аккуратно
отделяются от коры деревьев, Flavopunctelia soredica и Hypogymnia physodes для
сохранения их целостности ножом снимются преимущественно с поверхностным
слоем коры. Далее в лаборатории лишайники высушиваются в хорошо
вентилируемом помещении в течение 3-4 суток, упаковываются в картонные
коробки, и хранились в сухом месте без доступа света. Перед проведением
эксперимента талломы лишайников активируются: для этого их погружают в воду
на 1-2 минуты до полного водонасыщения. Затем сырые талломы рассекаются на
одинаковые фрагменты диаметром 2,5 см, раскладываются в пронумерованные
кюветы и выдерживаются сутки под люминесцентными лампами ЛБ-40. Перед
измерением ЗФв слоевища опять смачиваются до полного водонасыщения и еще час
выдерживаются под люминесцентными лампами ЛБ-40, после чего проводятся
измерения на приборе «Фотон-10».
Затем проводится сортировка талломов, при которой из группы
подготавливаемых к экспонированию образцов удаляют экземпляры с очень
низкими или очень высокими значениями показателя ЗФв. Таким образом,
достигается относительная однородность трансплантируемых лишайников по
16
уровню предэкспериментальной ЗФв, при которой разница между минимальном и
максимальным значением этого показателя у образцов не превышает 10-15%. В
результате такой сортировки лишайниковые трансплантаты на различных пробных
площадях в среднем имеют одинаковые предэкспериментальные значения
показателя ЗФв.
Методика размещения лишайниковых трансплантатов в тестируемом
районе. Каждый лишайниковый трансплантат пронумеровывается и помещается в
конверт из нейлоновой сетки. Конверты нанизываются на тесьму или малозаметную
прочную нить, которая быстро и надежно фиксируется на стволе дерева в
исследуемом районе.
Размещать лишайники можно на стволах крупных деревьев (Populus
balsamifera, Betula pendula, Malus vulgaris, Acer negundo, крайне редко, при
отсутствии других древесных пород, Pinus silvestris) на высоте около 1,5-2 метров,
при этом соблюдать примерно одинаковые условия освещенности и ориентации
относительно сторон света.
Срок экспонирования образцов может составлять от 7 до 21 суток. После
экспонирования образцы снимаются со ствола дерева и доставляются в
лабораторию. Лишайники извлекаются из конвертов, раскладываются в кюветы,
смачиваются водой и выдерживаются сутки под люминесцентными лампами ЛБ-40.
Перед измерением ЗФв слоевища опять увлажняются до полного водонасыщения и
еще час выдерживаются лампами ЛБ-40, после чего проводили измерения на
приборе «Фотон-10».
Ход работы:
1. Провести предэкспериментальную подготовку лишайниковых трансплантатов
и измерение уровня их ЗФ.
2. Произвести сортировку подготовку лишайниковых трансплантатов,
пронумеровать их и разместить в сетчатые конверты.
3. Разместить лишайниковые трансплантаты в тестируемых районах.
Обработка и представление результатов
Для обработки результатов экспериментов используется стандартные методы
математической статистики (пакет программ MS «Excel» или «Статистика»).
Результаты проделанной работы излагаются в отчете (систематическое положение
идентифицированных видов, рисунки микроскопированных объектов).
Контрольные вопросы
Каков минимальный срок экспонирования лишайниковых трансплантатов в исследуемом
районе?
2. Порядок действий при предэкспериментальной подготовке лишайниковых трансплантатов.
3. Каким образом можно размещать лишайниковые трансплантаты в тестируемом районе?
1.
1.
2.
3.
4.
5.
Рекомендуемая литература
Андерсон Ф.К. Реакция лишайников на атмосферное загрязнение / Ф.К. Андерсон, М.
Трешоу // Загрязнение воздуха и жизнь растений. - Л.: Гидрометеоиздат, 1988. - C. 295-326.
Биоиндикация загрязнений наземных экосистем / Э Вайнерт [и др.]; под общ. ред. Р.
Шуберта; - М: Мир. -1988.-350 с.
Бязров Л.Г. Лишайники в экологическом мониторинге / М.: Научный мир, 2002. - 336 с.
Шкараба Е.М., Селиванов А.Е. Использование лишайников в качестве индикаторов
загрязнения окружающей среды: Учебное пособие. - Пермь. Изд. ПГПУ, 2001.
Трасс Х.Х. Трансплантационные методы лихеноиндикации // Проблемы экологического
мониторинга и моделирования экосистем. - Л. : Гидрометеоиздат, 1985. - Т. 8. - C. 140-144.
17
Лабораторная работа № 7
Обработка результатов лихеноиндикационных исследований
Цель: Обработать собранные данные по качественному составу и
количественноым характеристикам лихенофлоры с отображением полученных
результатов с помощью лихеноиндикационного картирования.
Оборудование и материалы: калькуляторы, бланки картосхем исследуемой
территории.
Обработка результатов экспериментов по трансплантационной
лихеноиндикации
После окончания срока экспонирования конверты с талломами доставляются в
лабораторию
и
высушиваются.
Перед
проведением
измерения
постэкспериментального уровня ЗФ талломы лишайников активируются: для этого
их погружают в воду на 1-2 минуты до полного водонасыщения, затем
раскладывают в пронумерованные кюветы и выдерживают сутки под
люминесцентными лампами ЛБ-40. Перед измерением ЗФв слоевища опять
смачивают до полного водонасыщения и еще час выдерживаются под
люминесцентными лампами ЛБ-40, после чего проводятся измерения на приборе
«Фотон-10».
Результаты измерений оформляют в виде графиков и наносят на общую
лихеноиндикационную карту, для создания которой используют предложенные
каротсхемы (рис. 1).
Обработка результатов экспериментов по пассивной лихеноиндикации
По результатам изучения особенностей лихенофлоры производится выделение
нескольких зон загрязнения атмосферы и/или лихенокартирование исследованной
территории.
Для этих целей могут использоваться такие показатели, как число видов,
обнаруженных на определенной территории, проективное покрытие какого-либо
вида, значение индексов полеотолерантности и пр. В любом случае карта будет тем
точнее, чем большее число пробных площадей было обследовано.
Сведения о видовом составе исследуемой территории оформляются в виде
списка видов в табличной форме, в котором отмечается русское и латинское
наименование вида лишайника, субстрат, на котором он был обнаружен, его
встречаемость в исследованных районах города и класс полеотолерантности.
Сведения о количественных характеристиках лишайникового покрова могут
иметь несколько вариантов оформления.
Результаты измерения проективного покрытия наиболее распространенных
видов приводятся в процентах и отображаются на графике. На одном графике
приводятся данные сразу по всем исследованным районам, что позволяет
производить наглядное сопоставление полученных результатов.
Для создания лихеноиндикационных карт разрабатывается система условных
обозначений, обозначающих тот или иной вид и его обилие в процентах. Значения
индексов полеотолерантности также наносятся на общую карту.
18
Рис. 1. Примеры раличных картосхем территории г. Краснорярска,
применяемых для создания лихеноиндикационных карт.
Ход работы:
1. В исследуемом районе заложить пробную площадь и выбрать деревья,
соответствующие критериям модельных.
2. Провести изучение видового разнообразия лишайников исследуемой
территории.
3. Провести изучение количественных характеристик лишайникового покрова,
используя методики линейных пресечений и проективного покрытия.
4. На основании полученных данных рассчитать индекс полеотолерантности для
исследованной территории.
5. На основании результатов, полученных при применении всех вышеописанных
методик, сделать выводы о степени загрязнения атмосферы исследованных
пробных площадей.
6. Полученные результаты нанести на бланки картосхем исследуемой
территории.
Обработка и представление результатов
Результаты проделанной работы излагаются в обобщаюшем отчете с
приложением лихеноиндикационной карты.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Контрольные вопросы
О чем свидетельствует снижение ЗФ экспонированных лишайниковых трансплантатов?
Какие морфологические типы талломов лишайников можно выделить?
Каковы функции соредий и изидий?
Особенности строения апотеция леканорового типа.
Особенности строения апотецмия лецидеевого типа.
Как устроен гетеромерный таллом лишайника?
Рекомендуемая литература
Бязров Л.Г. Лишайники в экологическом мониторинге / М.: Научный мир, 2002. - 336 с.
Мелехова О.П., Егорова Е.И., Евсеева Т.И. Биологический контроль окружающей среды:
Биоиндикация и биотестирование / Издательство Академия, 2007. – 288 с.
Шкараба Е.М., Селиванов А.Е. Использование лишайников в качестве индикаторов
загрязнения окружающей среды: Учебное пособие. - Пермь. Изд. ПГПУ, 2001.
Трасс Х.Х. Классы полеотолерантности лишайников и экологический мониторинг / Трасс
Х.Х. // Проблемы экологического мониторинга и моделирования экосистем. Л.:
Гидрометеоиздат, 1985. - Т. 7. - С. 122-137.
Трасс Х.Х. Лихеноиндикационные индексы и SO2 / Х.Х. Трасс // Биогеохим. круговорот
веществ в биосфере: сб. науч. статей / - М.: 1987. - C. 111-115.
Трасс Х.Х. Полеотолерантность лишайников / Х.Х. Трасс // Материалы 6 симпозиума
микологов и лихенологов Прибалтийских республик. Рига, 1971. Т. 1. С. 66-70
19
ЧАСТЬ 2. БИОИНДИКАЦИЯ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ВОЗДУШНОЙ СРЕДЫ
Лабораторная работа № 8
Морфометрический анализ побегов хвойных деревьев
В истории биоиндикации морфологические изменения растений в ответ на
антропогенные воздействия привлекли к себе внимание очень рано. В середине XIX
в. были отмечены повреждения растений дымом вокруг бельгийских и английских
содовых фабрик, а уже в 1850 г. Штекхардт опубликовал свои наблюдения о
повреждениях дымом елей. Позднее сообщалось о характерных изменениях окраски
растений во время военного применения ядовитых газов или их утечек. Сегодня во
всех промышленно развитых странах известно о видимых поражениях
растительности дымом или уличных деревьев солью. В ряде стран морфологические
индикаторы используются в национальной системе мониторинга, в том числе в
Нидерландах уже более 10 лет. С помощью методов биоиндикации, основанных на
морфологических изменениях растений, получена большая часть картосхем
антропогенного влияния.
Традиционно для биоиндикации с помощью хвойных растений используются
такие морфометрические показатели, как линейный прирост побега, количество
хвои, длина и масса хвои, процент хвои с хлорозами и некрозами. Как правило, эти
параметры фиксируют отдельно для основного и боковых побегов.
Наиболее информативным параметром для сосны обыкновенной является
изменение охвоенности побегов с увеличением возраста хвои. У ели различия по
этому параметру практически отсутствуют. Для ели сибирской оптимальным
показателем для биоиндикационных исследований является процент хвои с
некрозами и хлорозами и удельная площадь некротизированных участков.
Эти различия объяснимы с учетом различий морфологического строения
побегов сосны и ели. Хвоя сосны обыкновенной по две хвоинки в пучке
расположена на брахибластах (укороченных побегах), которые, в свою очередь,
прикреплены к ауксибластам (удлиненным, т.е. обычным побегам). Брахибласты
сравнительно легко отсоединяются от ауксибластов, и поврежденная хвоя опадает,
избавляя, таким образом, растение от накопленных поллютантов. У ели сибирской
побеги представлены только ауксибластами, хвоя прикреплена к ним достаточно
прочно, поэтому, даже накопив значительное количество токсичных веществ и имея
значительную площадь некротизированных участков, хвоя остается на побеге.
В заключение следует отметить, что использование разных видов растений в
качестве биоиндикаторов возможно только с учетом их видовых адаптационных и
акклимационных стратегий к загрязнению среды.
Цель
работы:
изучить
влияние
атмосферного
загрязнения
на
морфологические параметры побегов хвойных деревьев.
Оборудование, материалы и реактивы:
Секатор для получения веток хвойных деревьев, ножницы, линейки.
Ход работы:
Для проведения биоиндикационных исследований следует взять ветки
хвойных деревьев из районов с разным уровнем антропогенной нагрузки. Ветки
одного вида должны быть взяты на одинаковой высоте, с учетом экспозиции.
20
Камеральная обработка включает в себя определение длины побегов, длины
хвои, количество хвои, количество хвои на единицу длины побега, количество хвои
с хлорозами, количество хвои с некрозами.
Для удобства заполняются следующие таблицы:
ФИО ____________________________________________________________
Морфологический анализ побегов сосны обыкновенной
Проба № __________ ПП __________________
Побег
Длина побега
Длина хвои
Количество хвои на
единицу длины побега
Процент хвои с хлорозами
1 год
2 год
3 год
4 год
5 год
6 год
Процент хвои с некрозами
ФИО ____________________________________________________________
Морфологический анализ побегов ели сибирской
Проба № __________ ПП __________________
Побег
Длина побега
1 год
2 год
3 год
4 год
5 год
6 год
Длина хвои
Количество хвои на
единицу длины побега
Процент хвои с хлорозами
Процент хвои с некрозами
Обработка и представление результатов
После заполнения таблиц провести сравнение показателей из районов с
разным уровнем атмосферного загрязнения. Построить сравнительные диаграммы.
Сделать выводы об уровнях антропогенной нагрузки в исследованных районах.
Контрольные вопросы
1. Почему деревья хвойных пород часто используют в биоиндикации загрязнения
воздуха?
2. Почему хвойные растения по сравнению с лиственными более чувствительны к
загрязнению воздуха?
3. Какова роль биоиндикационных методов в биологическом мониторинге состояния
окружающей среды?
4. Определите преимущества хвойных деревьев в качестве биоиндикаторов;
5. Проведите сравнительный анализ побегов хвойных деревьев, взятых из районов с
разным уровнем атмосферного загрязнения.
Рекомендуемая литература
1. Физиология роста и развития растений: учебное пособие для университетов / Полевой В.В.,
Саламатова Т.С., Ленинград : Ленинградский университет, 1991. - 240 с.
2. Медведев С.С. Физиология растений: учебник для студентов и аспирантов биологических
факультетов университетов / С. С. Медведев. - Санкт-Петербург: СпбГУ, 2004. - 335 с.
21
Лабораторная работа № 9
Анализ пигментного состава хвои
Фоторецепторная система фотосинтеза строится на основе двух важнейших
типов химических соединений: 1) тетрапирролов, образующих циклическую
структуру хлорофиллов (магнийпорфиринов), а также открытую структуру
пигментов фикобилинов; 2) полиизопреноидов, образующих большой и
разнообразный класс пигментов каротиноидов.
Для высших растений основными фотосинтетическими пигментами являются
хлорофилл а и хлорофилл b. Центральный атом магния определяет уникальные
функции молекулы хлорофилла в фотосинтезе, связанные с поглощением,
запасанием и преобразованием энергии.
Рис. 2. Структура хлорофиллов а и b.
Хлорофилл а – универсальный пигмент высших растений и водорослей. У
некоторых водорослей (синезеленых, некоторых красных) он представляет
единственную форму хлорофилла. Максимум поглощения в органических
растворителях в красной области спектра находится при длинах волн 660-664 нм.
Хлорофилл b – дополнительный пигмент высших растений и водорослей,
впервые появляется у эвгленовых водорослей, заменяя фикобилины. Отличается от
хлорофилла а наличием альдегидной группы вместо метильной во втором
пиррольном кольце. Красный максимум поглощения в ацетоне 645 нм.
Спектры поглощения магнийпорфиринов имеют два хорошо выраженных
максимума поглощения в сине-фиолетовой (полоса Соре) и красной областях
спектра (рис. 3). У хлорофилла b оба максимума расположены между максимумами
поглощения хлорофилла а, что увеличивает области поглощаемой энергии
хлоропластами высших растений.
Каротиноиды — большая и разнообразная группа желтых, оранжевых,
красных пигментов, поглощающих коротковолновую часть видимой области
спектра (400-550 нм) и выполняющих ряд очень важных функции в фотосинтезе.
По
химической
природе
каротиноиды
представляют
собой
полиизопреноидную цепь, состоящую из 40 атомов углерода, которая у
большинства каротиноидов замыкается по концам в два иононовых кольца.
Центральная часть молекулы, состоящая из 18 атомов углерода, представляет собой
систему сопряженных связей, образуя основную хромофорную группу молекулы
пигмента (рис. 3).
22
Рис. 3. Спектры поглощения хлорофиллов а (1) и b (2); ɛ – удельный
коэффициент экстинкции.
В зависимости от содержания кислорода в молекуле каротиноида различают
каротины (например, β-каротин), не содержащие кислорода, и ксантофиллы –
содержащие кислород в форме гидрокси-группы или эпокси-группы.
У высших растений главными представителями ксантофиллов являются
лютеин, виолаксантин, зеаксантин и неоксантин.
Каротиноиды присутствуют в мембранах у всех фотосинтезирующих
организмов, где они выполняют ряд важнейших функций в процессе фотосинтеза:
антенную (дополнительные пигменты в процессе поглощения солнечной энергии),
защитную (тушители триплетного хлорофилла и синглетного кислорода) и
фотопротекторную (предохраняют реакционный центр от мощных потоков энергии
при высоких интенсивностях света и стабилизируют липидную фазу тилакоидных
мембран, защищая ее от переокисления).
Немаловажное значение при исследовании состояния растительности имеет
изучение пластичности фотосинтетического аппарата, его способности
приспосабливаться к изменяющимся внешним условиям. Одним из информативных
и наиболее распространенных параметров, характеризующих фотосинтетический
аппарат, является его пигментный состав. Известно, что одним из биохимических
показателей реакции растений на изменение факторов внешней среды, степени их
адаптации к новым экологическим условиям является содержание хлорофиллов –
главных фоторецепторов фотосинтезирующей клетки. Наиболее значимые
показатели являются отношение хлорофиллов a и b, и суммы хлорофиллов к
каротиноидам.
Метод спектрофотометрии основан на регистрации характерных спектров
поглощения отдельных групп пигментов.
23
Рис. 4. Структура некоторых каротиноидов
Цель работы: изучить влияние атмосферного загрязнения на пигментный
состав хвои.
Оборудование, материалы и реактивы:
Спектрофотометр SPEKOL 1300 Analytik Jenna AG, кюветы для
спектрофотометра, секатор для получения веток хвойных деревьев, ножницы,
ацетон, дистиллированная вода, стеклянные фильтры, фильтровальная бумага, весы,
фарфоровые ступки с пестиками, колбы, мерная пробирка, CaCO3 (мел), битое
стекло.
Ход работы:
Количественно фотосинтетические пигменты определяют в ацетоновой
вытяжке 85% по стандартной методике (Гавриленко, Жигалова, 2003) с помощью
спектрофотометра SPEKOL 1300 Analytik Jenna AG (Германия). Измерение
содержания количества пигментов, осуществляется с использованием трех длин
волн: 452,5, 644 и 663 нм.
ВНИМАНИЕ! Во время работы необходимо помнить, что работа
количественная — нельзя потерять ни капли вытяжки!
Для приготовления раствора хлорофилла используют свежую хвою. Величина
навески составляет 1 гр. Навеску помещают в фарфоровую ступку и растирают
пестиком до полного извлечения пигментов. Для лучшего измельчения тканей к
навеске перед растиранием добавляют немного битого стекла. Чтобы не произошло
феофитинизации хлорофилла за счет эндогенных кислот, для нейтрализации
последних добавляют щепотку мела. К растертой массе приливают небольшое
24
количество ацетона, снова тщательно растирают. Содержимое ступки
количественно переносят на стеклянный фильтр (закрытый кружком
фильтровальной бумаги), вставленный в колбу Бунзена с подвешенной на нитке
мерной пробиркой для сбора фильтрата. Ступку и пестик ополаскивают
небольшими порциями ацетона и переносят его на фильтр до тех пор, пока не
остается следов зеленых пигментов на ступке, пестике и фильтре. Фильтрат
собирают в мерную колбу на 25-50 мл, после полного извлечения пигментов
доводят ацетоном до 50 мл, тщательно перемешивают. Полученная вытяжка
содержит сумму зеленых и желтых пигментов.
Обработка и представление результатов
Для расчета концентрации хлорофиллов a и b и каротиноидов в вытяжке
пигментов определить оптическую плотность вытяжки на спектрофотометре при
длинах волн, соответствующих максимумам поглощения определяемых пигментов в
данном растворителе: λ = 663, 644 и 452,5 нм. Контроль – чистый растворитель (85%
ацетон), lкюв. = 1 см.
Расчеты производят по следующим формулам Robbelen (Гавриленко,
Жигалова, 2003):
Са (мг/л) = 10,3 × (D663-D720)-0,918 × D644-D720)
Cb (мг/л) = 19,7 × (D644-D720)-3,87 × D663-D720)
Ca+b (мг/л) = 6,4 × (D663-D720)+18,8 × D644-D720)
Ck (мг/л) = 4,75 × (D452,5-D720)-0,226 × Ca+b
где
D452,5, D644, D663 и D720– оптическая плотность вытяжки при 452,5, 644 и 663 нм
соответственно;
С – концентрация пигмента в вытяжке, [мг/л].
Установив концентрацию пигмента в вытяжке, определяют его содержание в
исследуемой ткани с учетом объема вытяжки и массы пробы:
F[мг/г сыр.массы] = (V × C) / P
где
F – содержание пигмента в растительном материале, [мг/г сыр.массы];
V – объем вытяжки, [л];
С – концентрация пигмента, [мг/л];
Р – навеска растительного материала, [г].
Полученные результаты представить в виде диаграмм, где по оси абсцисс
расположить варианты концентраций хлорофиллов в зависимости от районов, а по
оси ординат – значение рассчитанных концентраций в пересчете на сырой вес хвои.
1.
2.
3.
1.
2.
3.
Контрольные вопросы
Роль пигментов в жизни растений.
Назовите преимущества хвойных деревьев в качестве биоиндикаторов.
Как зависит пигментный состав хвойных пород от испытываемой деревьями антропогенной
нагрузки?
Рекомендуемая литература
Большой практикум по фотосинтезу: Учеб./ В.Ф. Гавриленко, Т.В. Жигалова. – М.: изд-во
«Академия», 2003. – 256 с.
Мелехова О.П., Сарапульцева Е.И. Биологический контроль окружающей среды:
биоиндикация и биотестирование. М.: Академия. 2010.
Биоиндикация загрязнений наземных экосистем. Под ред. Р. Шуберта М.: Мир, 1988, с.
215-216.
25
Лабораторная работа № 10
Определение влияния атмосферного загрязнения на жизненные циклы
растений с использованием метода регистрации термоиндуцированных
изменений нулевого уровня флуоресценции хлорофилла
Фотосинтетический аппарат, имеющий огромную поверхность контакта со
средой, в первую очередь и в наибольшей степени подвергается неблагоприятным
воздействиям загрязнения среды. К числу методов, способных давать оперативную
информацию о физиологическом состоянии фотосинтетического аппарата,
относится регистрация различных параметров флуоресценции хлорофилл
содержащих растений (Маторин и др., 1985; Веселовский, Веселова, 1990; Гаевский,
Моргун, 1993; Сорокина и др., 2005; Пахарькова и др., 2010). Преимущество
флуоресцентных методов заключается в том, что информацию о содержании
хлорофилла, организации фотосинтетического аппарата и его активности, можно
получить за очень короткий отрезок времени, как при контактном, так и
бесконтактном способах измерения, что очень важно для решения экологических
проблем (Гольд и др., 1984).
Техногенное загрязнение атмосферы изменяет многие эволюционно
сложившиеся комплексы приспособительных реакций живых организмов к
условиям существования. Одним из возможных проявлений такого воздействия
может быть нарушение естественной динамики перехода древесных растений в
состояние покоя и выхода из него. При изучении этого явления хорошо
зарекомендовала себя регистрация термоиндуцированных изменений нулевого
уровня флуоресценции (ТИНУФ).
Согласно современной точке зрения все процессы трансформации световой
энергии, в том числе и флуоресценция, связаны с мембранами тилакоидов
хлоропластов, представляющих собой жидкие кристаллы с «айсбергами» белковых
комплексов. При помощи электрофореза фрагментов тилакоидов удается выделить
хлорофилл-белковые комплексы (ХБК) фотосистемы 1 (ХБК-1), фотосистемы 2
(ХБК-2) и светособирающий хлорофилл а/b белковый комплекс (СХБК) (Сорокина,
1985).
Реакционным центром фотосистемы 1 (ФС-1) является особая форма
хлорофилла а с максимумом поглощения 700 нм. Хлорофилл а реакционного центра
фотосистемы 2 (ФС-2) поглощает в максимуме 680 нм. В систему поглощения и
концентрации световой энергии включаются СХБК и пигменты антенны
фотосистем 1 и 2, основная функция которых заключается в поглощении световой
энергии и передаче ее в реакционный центр. Светособирающий комплекс,
включающий 50-70% всего количества хлорофилла фотосинтезирующей мембраны
и около 30% общего белка, функционально тесно связан с ХБК-2 и не обладает
собственной фотохимической активностью (Гольд В.М. и др., 1984). При комнатной
температуре ФС-1 не флуоресцирует. ФС-2 и светособирающий комплекс являются
основными флуоресцирующими единицами в этих условиях.
При нагревании от 25 до 85-90 °С интенсивность флуоресценции
изменяется, поскольку повреждающее действие высоких температур проявляется в
нарушении структуры и функций хлорофилл-белковых комплексов и изменении
эффективности межкомплексной передачи энергии возбуждения (Гаевский,
Сорокина, 1991). Нулевой уровень флуоресценции регистрируется в положении,
26
когда все реакционные центры ФС-2 находятся в окисленном состоянии
(«открыты»).
На
кривой
термоиндуцированных
изменений
нулевого
уровня
флуоресценции активно фотосинтезирующих растений регистрируется два пика.
Интенсивность флуоресценции при температуре 40-65 °С (низкотемпературный
пик) определяется действием нагревания на структуру и функции компонентов ФС2 (рис. 5). В фазу подъема это выражается в нарушении функциональной связи
между антенным комплексом ХБК-2 и его энергетической ловушкой - открытым
реакционным центром (РЦ), при котором возможно повреждение самого
реакционного центра ФС-2. В фазу спада, вызванную нагреванием, наблюдается
функциональное и, вероятно, структурное разделение светособирающего Хлбелкового комплекса ФС-2, а также снижение эффективности передачи энергии от
хлорофилла b к хлорофиллу а. Для оценки этого явления можно использовать
относительную величину низкотемпературного максимума:
R1 = Флнт-Фл25/Флнт,
где Флнт
– интенсивность флуоресценции при низкотемпературном
максимуме,
Фл25 – интенсивность флуоресценции при 25 °С.
Рис. 5. Термоиндуцированные изменения нулевого уровня флуоресценции
хлорофилл-содержащих тканей в фазе активной вегетации.
Поскольку для флуоресцирующей пигментной системы нет принципиальной
разницы, каким образом она "теряет" энергетическую ловушку (в результате
теплового нарушения связи между реакционными центрами ХБК-2 и антенной или
путем фотохимического восстановления первичного акцептора электронов),
относительную величину низкотемпературного максимума можно считать
показателем эффективности захвата энергии возбуждения в реакционных центрах
ФС-2 (Гаевский и др., 1991).
Причиной высокотемпературного максимума может быть "разгорание"
флуоресценции более термостабильного хлорофилл-белкового комплекса ФС-1 при
инактивации ее реакционных центров (Гаевский и др., 1991). Определенный вклад в
появление высокотемпературного пика может дать и хлорофилл-белковый комплекс
фотосистемы 2 при условии его локализации в межгранных участках мембран
27
тилакоидов и дефиците светособирающего хлорофилл-белкового комплекса
(Гаевский и др., 1989). Соотношение низко- и высокотемпературного максимумов
(R2) определяли по формуле:
R2 = Флнт/Флвт,
где Флвт – интенсивность флуоресценции при высокотемпературном
максимуме. По отношению низко- и высокотемпературного максимумов (R2) можно
оценивать картину структурной организации мембран хлоропластов (Гаевский и др.,
1985).
При переходе растений в состояние зимнего
покоя наблюдается
качественное изменение формы кривой, проявляющееся в полном исчезновении
низкотемпературного и росту интенсивности высокотемпературного пика. Следует
также отметить, что "зимний" тип термограмм у изученных хлорофилл-содержащих
тканей, по-видимому, наиболее универсален из известных в настоящее время
критериев криорезистентного состояния хлоропластов (Гаевский и др., 1991).
Рис. 6. Термоиндуцированные изменения нулевого уровня флуоресценции
хлорофилл-содержащих тканей в состоянии зимнего покоя.
Рассчитанное отношение низко - и высокотемпературного максимумов (R2)
может служить показателем степени глубины покоя. Для периода зимнего покоя
отношение составляет 0,08, возрастая при переходе растений к активному
метаболизму до 1,7 (Гаевский и др., 1987).
Цель: определение глубины зимнего покоя путем регистрации
термоиндуцированных изменений нулевого уровня флуоресценции хлорофилла
хвои и феллодермы побегов хвойных и лиственных деревьев из районов с разным
уровнем загрязнения воздуха, измеренных в переходный период или в зимнее время
непосредственно после взятия проб и после выведения из состояния покоя в
лабораторных условиях.
Задачи:
 Изучить глубину покоя древесных растений, находящихся в районах с
разным уровнем загрязнения в зимний период;
 Определить скорость выхода побегов древесных растений из районов с
разным уровнем атмосферного загрязнения;
28
 Определить уровень атмосферного загрязнения в исследуемых районах г.
Красноярска.
Оборудование, материалы и реактивы
Флуориметр «Фотон 11», побеги древесных растений, собранные в районах с
разным уровнем атмосферного загрязнения, климатические камеры для выведения
растений из состояния зимнего покоя в лабораторных условиях, нож, вода, шприц,
салфетки.
Ход работы
Для работы можно использовать побеги как хвойных, так и
покрытосеменных растений. Побеги, собранные в районах с разным уровнем
атмосферного загрязнения разделите на две половины. Одну половину поместите в
климатические камеры для выведения их из состояния зимнего покоя.
Непосредственно перед началом анализа у отрезков побегов текущего года
(длиной 1-1,5 см.) удалите покровные ткани, более толстые побеги разделите
пополам и поместите в кювету.
Также можно использовать для анализа хвою второго года жизни.
Сформируйте пробы отдельно для каждого района. Затем, перемешав между собой
хвою, собранную в одном районе, случайным образом выберите 10 хвоинок, и,
обрезав верхушку и основание, среднюю часть хвои длиной 2 см равномерно
разместите в кювете.
С помощью шприца с иглой аккуратно заправьте доверху кювету с образцом
отстоянной водопроводной водой. При этом для обеспечения равномерного
прогрева образца нельзя допускать его всплывания и наличие воздушных полостей в
самой ячейке. Установите кюветный блок в прибор.
В настройках программы «Фотон-11» установите скорость нагрева образцов
6 °С в минуту, охлаждение – 16 °С. Интенсивность света и усиление настроить в
зависимости от исследуемых экземпляров. Сохраните полученные термограммы (в
виде рисунков и текстовых файлов).
Таким же образом последовательно проведите измерение каждой пробы.
Повторяйте измерения ТИНУФ в течение недели, до тех пор, пока побеги
полностью не выйдут из покоя.
Обработка результатов
На основе полученных кривых ТИНУФ рассчитайте отношение (R 2)
интенсивностей флуоресценции, соответствующих низкотемпературному и
высокотемпературному максимумам на кривой, по формуле R2 = Флнт / Флвт.
Проведите анализ кривых термоиндуцируемых изменений нулевого уровня
флуоресценции, определите, в каком состоянии (вегетации или покоя) находятся
изучаемые побеги.
Через неделю, на следующем занятии повторите работу, использовав вторую
половину ранее собранных побегов. Рассчитайте значения R2, сравните полученные
данные и кривые ТИНУФ с данными, полученными на прошлом занятии.
Для количественной оценки влияния уровня загрязнения атмосферного
воздуха на состояние растений в исследованных районах рассчитайте параметр А:
А=Ro/Rk
где Ro – среднее значение отношения низкотемпературного к
высокотемпературному максимуму в исследуемых районах (R2);
29
Rk
–
среднее
значение
отношения
низкотемпературного
к
высокотемпературному максимуму (R2) в контрольном районе.
Поскольку в загрязненных районах уровень показателя R2 выше по
сравнению с чистыми (контрольными районами), то чем выше значение параметра
А, тем выше уровень атмосферного загрязнения в данном районе. Сделать
заключение по результатам.
Контрольные вопросы
1. Что такое «нулевой уровень флуоресценции»?
2. В чем заключаются отличия между «зимним» и «летним» типами термограмм ТИНУФ?
3. Какие изменения происходят в клетках растений при подготовке к зиме?
Рекомендуемая литература
1. Веселовский В.А., Веселова Т.В. Люминесценция растений: Теоретические и
практические аспекты. – М.: Наука, 1990. – 200 с.
2. Гаевский Н.А., Ладыгин В.Г., Гольд В.М. Новые данные о природе
высокотемпературного подъема флуоресценции хлорофилла // Физиол. раст. 1989. Т. 36.
Вып. 2. С. 272
3. Гаевский Н.А., Моргун В.Н. Использование переменной и замедленной флуоресценции
хлорофилла для изучения фотосинтеза растений // Физиол. Раст. – 1993. – Т.40. - №4, с.
136-145
4. Гаевский Н.А., Сорокина Г.А., Гольд В.М. Изучение природы термоиндуцированных
изменений флуоресценции хлорофилла с использованием мутантов Chlamydomonas
reinhardii //Физиол. раст. 1985. Т. 32. Вып. 4. С. 674
5. Гаевский Н.А., Сорокина Г.А., Гольд В.М., Миролюбская И.В. Сезонные изменения
фотосинтетического аппарата древесных и кустарниковых растений // Физиол. раст. –
1991. – Т. 38. Вып. 4 – с. 685-692
6. Григорьев Ю.С., Пахарькова Н.В. Влияние техногенного загрязнения воздушной среды
на состояние зимнего покоя сосны обыкновенной // Экология, 2001, № 6, с.471-473.
7. Пахарькова Н.В., Калякина О.П., Шубин А.А., Григорьев Ю.С., Пахарьков С.В.,
Сорокина Г.А. Различия в акклимационных стратегиях сосны обыкновенной и ели
сибирской на загрязнение воздушной среды // Хвойные бореальной зоны, 2010, № 3, с.
231-236.
8. Сорокина Г.А., Тарасова О.В., Григорьев Ю.С. Влияние насекомых-филлофагов и
загрязнения атмосферы на фотоассимиляционную функцию городских тополевых
насаждений // Вестник КГУ. Ест. науки, 2005, № 5, с.113-116
9. Теоретические основы и методы изучения флуоресценции хлорофилла: Учеб. пособие. /
Гольд В.М., Гаевский Н.А., Григорьев Ю.С., Попельницкий В.А., Гехман А.В. –
Красноярск; изд. КГУ, 1984. – 82 с.
30
ЧАСТЬ 3. БИОТЕСТИРОВАНИЕ ВОДНОЙ СРЕДЫ
Лабораторная работа № 11
Определение чувствительности Daphnia magna к модельному токсиканту в
зависимости от степени минерализации культивационной воды
Метод биотестирования с использованием дафний широко применяется у нас
в стране и за рубежом. Daphnia magna используется как тест-объект в воднотоксикологических исследованиях уже около 75 лет. Вторым по популярности
использования в водной токсикологии ракообразным является Ceriodaphnia affinis, и
этот вид, наряду с D. magna и D. pulex, был введен в руководства по
биотестированию во многих странах мира.
Различают острые и хронические тесты. Первые рассчитаны на получение
экспресс-информации о токсичности исследуемого вещества для данного тесторганизма, хронические опыты (обычно по плодовитости дафний) – на выявление
долговременного эффекта действия токсикатов, в частности малых и ультра малых
концентраций.
Острые опыты проводятся в различные сроки: от нескольких минут (при
достаточной экспрессности тест-реакции) до 96 часов. Чаще всего для этих целей
применяется биотест на выживаемость дафний. В результате проведенных опытов
учитывается величина выживаемости (или обратная величина смертности), т.е.
статистически достоверный процент выживаемых или гибнущих особей за
определенное время при определенной концентрации вещества.
При определении острой токсичности, питьевых, сточных, поверхностных
пресных, грунтовых вод, а также их разбавлений на основе выживаемости рачков
устанавливают:
 среднюю летальную кратность разбавления вод, вызывающую гибель 50%
тест- объектов за 48-часовую экспозицию – ЛКР50-48
 безвредную кратность разбавления вод, вызывающую гибель не более 10
% тест-объектов за 48-часовую экспозицию – ЛКР10-48
Для определения острой токсичности исследуемой воды рассчитывается
процент погибших дафний (А, %) в тестируемой воде по сравнению с контролем:
A
X K  XT
100
XK
,
где XK – количество выживших дафний в контроле, ХТ – количество
выживших дафний в тестируемой воде.
Если А ≤ 10%, тестируемая вода не оказывает острого токсического действия
(безвредная кратность разбавления).
Если А ≥ 50%, тестируемая вода оказывает острое токсическое действие
(средняя летальная кратность разбавления).
Цель работы: сравнить чувствительность дафний (по показателю
выживаемости) к модельному токсиканту в пробах культивационной воды
различных уровней минерализации.
Оборудование, материалы и реактивы:
Климатостат Р2, устройство для экспонирования рачков УЭР-03 (3 шт),
пробирки стеклянные объемом 100 мл (54 шт), штатив для пробирок (3 шт),
31
стеклянная трубочка с внутренним диаметром 4-5 мм (3 шт), стеклянные стаканы на
100 мл (6 шт), стеклянные стаканы на 250-400 мл (3 шт), мерный цилиндр на 50 мл
(3 шт), пипетки-дозаторы на 1 и 5 мл, ершики и губки для мытья посуды, шприц
одноразовый на 5 мл, раствор бихромата калия, натрия бикарбонат (сода питьевая),
синхронизированная культура рачков дафний (540 особей дафний возрастом менее
суток), культивационная вода для дафний, дистиллированная вода.
Ход работы:
1. Всю посуду, необходимую для проведения эксперимента, вымыть
раствором соды, тщательно прополоскать и затем высушить.
2. Приготовить растворы токсиканта в концентрациях 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 по
схеме, представленной на рис. 7. Каждый стаканчик необходимо пометить стикером
с указанием приготовленной концентрации модельного токсиканта.
0,125 мг/л
0,25 мг/л
0,5 мг/л
1,0 мг/л
2,0 мг/л
29,4 г/л
K2Cr2O7
1 мл
дафнии
дафнии
дафнии
дафнии
дафнии
+ 99 мл
дистиллята
10 мл
дистиллята
1 мл
10 мл
10 мл
10 мл
дистиллята
1 мл
10 мл
дистиллята
1 мл
1 мл
1 мл
10 мл
10 мл
10 мл
дистиллята
19,5 мл
10 мл
дистиллята
294 мг/л
бихромата
Рис. 7. Схема разведения бихромата калия для контроля чувствительности культуры
дафний.
3. Приготовить пробы культивационной воды различных уровней
минерализации.
Для
этого
исходную
культивационную
(отстоянную
водопроводную) воду разбавить в 2 и 4 раза дистиллированной водой. У каждого
полученного
образца
культивационной
воды
измерить
показания
электропроводности и рН.
Далее каждая подгруппа работает с одной из проб культивационной воды
(100%, 50% или 25%).
4. В пробирки (18 шт.) объемом 100 мл рассадить по 10 дафний возраста 8-24
часов. Дафний отловить пипеткой (с отпиленным и оплавленным концом) объемом
32
2 см3 из емкостей, в которых выращивается синхронизированная культура. Далее
поочередно из каждого флакона удалить с помощью одноразового шприца
культивационную воду, попавшую вместе с дафниями, таким образом, чтобы не
повредилась ни одна дафния. Еще раз пересчитать количество особей (10 шт. в
пробирке) и затем аккуратно, по стенке сосуда налить, предварительно отмеренные
цилиндром, 49 мл культивационной воды. В последние три флакона с рачками
налить 50 мл культивационной воды.
5.В опытные пробирки (с 1 по 16) добавить по 1 мл приготовленного раствора
токсиканта. Для каждой концентрации токсиканта по 3 повторности (пробирки).
Токсикант необходимо разливать пипеткой-дозатором на 1 мл, начиная с раствора
меньшей концентрации и далее последовательно ее увеличивая.
Приготовленные пробы испытуемых растворов с дафниями последовательно
поместить в устройство для экспонирования рачков в следующем порядке:
контрольные пробы (без токсиканта)
с 1 по 3
0,125 мг/л бихромата калия
с 4 по 6
0,25 мг/л бихромата калия
с 7 по 9
0,5 мг/л бихромата калия
с 10 по 12
1,0 мг/л бихромата калия
с 13 по 15
2,0 мг/л бихромата калия
с 16 по 18
Включить устройство для экспонирования рачков и зарегистрировать время
его включения.
6. Через 24 часа экспонирования остановить УЭР и последовательно
переместить флаконы в штатив, произвести подсчет выживших рачков с занесением
полученных значений в таблицу. Рассчитать среднее значение выживаемости (в
процентах) и стандартное отклонение для каждой концентрации модельного
токсиканта и контроля. Занести рассчитанные значения в таблицу 4.
Таблица 4
Выживаемость дафний в присутствии бихромата калия в течение 24 часов
Концентрация
Выживаемость, шт.
Среднее
Стандартное
бихромата
значение
отклонение
1
2
3
калия, мг/л
выживаемости,
флакон флакон флакон
%
Контроль
0,125
0,25
0,5
1,0
2,0
Обработка и представление результатов
Для сравнения чувствительности дафний к модельному токисканту в разных
вариантах культивационной воды, необходимо определить концентрацию
бихромата калия, которая вызывает смертность 50% тест-организмов за 24 часа
экспонирования (LC50).
33
Результаты работы представить в виде гистограммы, отражающей
концентрационную зависимость выживаемости рачков при различной степени
минерализации культивационной воды.
В выводе по работе отразить выявленную зависимость с приведением
конкретных значений LC50. А также уточнить какой вариант культивационной воды
приемлем для культивирования дафний и проведения биотестирования на них.
Контрольные вопросы:
1. Для чего необходимо проводить биотестирование культивационной воды с модельным
токсикантом раз в квартал?
2. Какую культуру рачков используют в биотестировании?
3. Какие факторы оказывают влияние на чувствительность дафний к токсикантам?
4. От чего зависит жесткость воды? Как она может повлиять на результаты
токсикологического эксперимента?
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Рекомендуемая литература
Коросов, А.В. Количественные методы экологической токсикологии: учебно-методическое
пособие / А.В. Коросов, Н.М. Калинкина. – ПетрГУ, КНЦ. – Петрозаводск, 2003. – 56 с.
Григорьев Ю.С., Шашкова Т.Л. Методика определения токсичности водных вытяжек из
почв, осадков сточных вод и отходов, питьевой, сточной, природной воды по смертности
тест-объекта Daphnia magna Straus (ПНД Ф 14.1:2:4.12-06 16.1:2.3.3.9-06). / Москва, 2011,
44 с.
Мелехова О.П., Сарапульцева Е.И. Биологический контроль окружающей среды:
биоиндикация и биотестирование. М.: Академия. 2010.
Бубнов, А.Г. Биотестовый анализ – интегральный метод оценки качества объектов
окружающей среды: учебно-методическое пособие / А.Г. Бубнов. С.А. Буймова, А.А.
Гущин, Т.В. Извекова.; под общ. ред. В.И. Гриневича. – Иван. хим.-технол. ун-т. – Иваново,
2007. – 112 с.
Гидрохимические показатели состояния окружающей среды: справочные материалы / под
ред. Т.В. Гусевой. – М.: ФОРУМ: ИНФРА-М, 2007. – 192 с.
Чалова, И.В. Оценка качества природных и сточных вод методами биотестирования с
использованием ветвистоусых ракообразных (Cladocera, Crustacea): научно-метод. изд. /
И.В. Чалова, А.В. Крылов. – Рыбинск: Издательство ОАО «Рыбинский дом печати». – 2007.
– 73 с.
34
Лабораторная работа № 12
Оценка действия ионов тяжелых металлов
на трофическую активность Daphnia magna
Одним из наиболее оперативных ответов низших ракообразных на
загрязнение является угнетение скорости их питания. Преимущество этого метода
связано с большей чувствительностью к загрязняющим веществам, а также с его
оперативностью. Доказано, что биотест на трофическую активность дафний
является более чувствительным к загрязнению, чем существующие в настоящее
время стандартизированные тесты по свечению бактерий, приросту водорослей,
выживаемости дафний и рыб.
Использование трофической активности как показателя токсичности на
сублетальном уровне важно и актуально, поскольку малые концентрации
загрязняющих веществ, не вызывающие гибели животных и действующие в течение
продолжительного времени, могут накапливаться в организме дафний и в
дальнейшем передаваться по трофической цепи, тем самым вызывая нарушения в
структуре экосистемы
Цель работы: Определить чувствительность трофической активности дафний
к модельным токсикантам (сульфат меди, сульфат кадмия, сульфат цинка)
Оборудование, материалы и реактивы:
Климатостат Р2, устройство для экспонирования рачков УЭР-03 (2 шт),
флуориметр Фотон-10, ИПС-03, центрифуга, пробирки стеклянные объемом 100 мл
(36 шт), штатив для пробирок, стеклянная трубочка с внутренним диаметром 4-5 мм,
стеклянные стаканы на 100 мл (6 шт), стеклянные стаканы на 250-400 мл (2 шт),
мерный цилиндр на 50 мл, пипетки-дозаторы на 1 и 5 мл, пенициллиновые флаконы
(2 шт), центрифужные пробирки объемом 50-100 мл, ершики и губки для мытья
посуды, шприц одноразовый на 5 мл, растворы модельных токсикантов
(CuSO4˟5H2O, CdSO4˟8/3H2O, ZnSO4˟7H2O), натрия бикарбонат (сода питьевая),
культура водоросли хлореллы, синхронизированная культура рачков дафний (150
особей возрастом 1,5-2 суток), культивационная вода для дафний, кюветы для
флуориметра Фотон 10 (19 шт).
Ход работы:
Подготовка посуды производится аналогично инструкции, указанной в
лабораторной работе № 2.
При посадке дафний во флаконы осуществляются действия, описанные в
предыдущей работе, но в опытные пробы наливают по 46 мл культивационной
воды, а в контрольные – 47 мл. Первые три флакона необходимо оставить без
дафний (только 47 мл культивационной воды) для контроля за исходным уровнем
хлореллы. Пробирки с пробами воды и тест-организмами помещаются на 5 часов во
вращающуюся кассету устройства для экспонирования рачков (УЭР-03).
Общая схема размещения пробирок в УЭР-03 следующая:
Хлорелла
с 1 по 3
Дафнии + Хлорелла
с 4 по 6
Дафнии + x мг/л токсиканта + Хлорелла
с 7 по 9
Дафнии + 0,5x мг/л токсиканта + Хлорелла
с 10 по 12
Дафнии + 0,25x мг/л токсиканта + Хлорелла
с 13 по 15
Дафнии + 0,125x мг/л токсиканта + Хлорелла
с 16 по 18
35
Для приготовления ряда концентраций модельного токсиканта необходимо
предварительно составить схему разведения (в пересчете на ионы тяжелого
металла) исходного (концентрированного) раствора соли.
Для сульфата цинка приготовить концентрации: 1; 0,5; 0,25; 0,125 мг/л;
Для сульфата меди приготовить концентрации: 0,06; 0,03; 0,015; 0,0075 мг/л
Для сульфата кадмия приготовить концентрации: 0,01; 0,005; 0,0025; 0,00125
После пяти часов экспонирования рачков в исследуемой пробе воды во все
варианты опыта, включая те, где нет рачков, добавляют по 3 мл суспензии клеток
водоросли хлорелла оптической плотностью 0,500 (кювета 2 см, длина волны 560
нм, прибор ИПС-03). Затем все пробирки вновь экспонируются в УЭР-03 в течение
17-24 часов.
После экспонирования проводится регистрация трофической активности.
Изменение содержания клеток водоросли в растворе определяют путем регистрации
интенсивности нулевого уровня флуоресценции хлорофилла клеток хлореллы,
находящихся в воде. Для этого из каждой пробирки с помощью пипетки-дозатора на
5 мл отбирают по 4 мл пробы с клетками хлореллы (исключить попадание рачков) и
помещают в кювету флуориметра Фотон 10 для измерения показателей
флуоресценции.
Для измерения концентрации клеток водоросли в испытуемых растворах в
меню фотона-10 устанавливаются параметры, указанные на рисунке 8.
Данные, полученные при измерении фотоном, сохраняются и передаются в
таблицу Excel, где рассчитываются значения трофической активности по
следующей формуле:
ТА 
Fхл  Fхл  р
Fхл
*100%
,
где ТА – трофическая активность;
Fхл – показатель флуоресценции в суспензии хлореллы;
Fхл+р - показатель флуоресценции в суспензии хлореллы с рачками.
Рис. 8. Параметры замера для регистрации нулевого уровня флуоресценции
при измерении трофической активности дафний
36
Обработка и представление результатов
Результаты расчета занесите в таблицу 5, по которой затем постройте
диаграмму.
Таблица 5
Трофическая активность дафний в присутствии бихромата калия в течение 24
часов
Концентрация
бихромата
калия, мг/л
Трофическая активность, %
1
флакон
2
флакон
3
флакон
Среднее
значение
трофической
активности, %
Стандартное
отклонение
Контроль
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Контрольные вопросы:
1. Как температура влияет на показатель трофической активности дафний и их
чувствительность к тяжелым металлам?
2. От каких факторов зависит рассчитанный вами показатель трофической активности
дафний?
3. Предложите вероятные механизмы воздействия тяжелых металлов на организм дафний.
4. Почему при одновременном помещении дафний и их корма (хлореллы) в тестируемую
среду токсический эффект значительно ниже, чем, при задержке внесения корма на
несколько часов?
Рекомендуемая литература
1. Гутельмахер Б.Л., Алимов А.Ф. Количественные закономерности фильтрационного питания
водных животных // В кн. Общие основы изучения водных экосистем / Под ред. Г.Г.
Винберга. Л.: Наука. 1979. с. 171-193.
2. Мелехова О.П., Сарапульцева Е.И. Биологический контроль окружающей среды:
биоиндикация и биотестирование. М.: Академия. 2010.
3. McWilliam R.A., Barid D.J. Postexposure feeding depression: a new toxicity endpoint for use in
laboratory studies with Daphnia magna // Environment Toxicology and Chemistry. 2002. Vol. 21.
№ 6. pp. 1198-1205.
37
Лабораторная работа № 13
Оценка действия ионов тяжелых металлов на выживаемость
Ceriodaphnia affinis
Во второй половине XX века последователями американской школы
биотестирования в качестве тест-организма была предложена Ceriodaphnia affinis, и
этот вид, был введен в руководства по биотестированию во многих странах мира.
Рачки Ceriodaphnia affinis, удобны тем, что имеют короткий жизненный цикл,
быстро размножаются (дают первое потомство на 4-е сутки жизни и далее
ежедневно или через сутки), а также обладают малыми размерами 0,8 – 1,0 мм.
Причем, в зимних культурах при 18-20 оС этот вид ветвистоусых развивается лучше
и продолжительность его жизни в культурах зимой повышается. Так же вид C.
affinis называют наиболее короткоживущим в лабораторных условиях. Все эти
характеристики делают этих рачков удобными для использования в оценке
хронической токсичности, отражающейся в изменениях их репродуктивных
функций.
Острое токсическое действие растворов отдельных химических веществ,
исследуемой воды или водной вытяжки из почв, осадков сточных вод и отходов на
цериодафний определяется по их смертности (летальности) за определенный период
экспозиции. Критерием острой токсичности. Критерием острой токсичности служит
гибель 50% и более цериодафний за 48 часов в исследуемой воде при условии, что в
контроле гибель не превышает 10%.
В экспериментах по определению острого токсического действия
устанавливают:
 острую токсичность или среднюю летальную концентрацию отдельных
веществ (кратность разбавления вод, водной вытяжки из почв, осадков
сточных вод и отходов, содержащих смеси веществ), вызывающую
гибель 50% и более тест-организмов (ЛК50-48, ЛКР50-48);
 безвредную (не вызывающую эффекта острой токсичности)
концентрацию отдельных веществ (кратность разбавления вод, водной
вытяжки из почв, осадков сточных вод и отходов, содержащих смеси
веществ) вызывающую гибель не более 10% тест-организмов (БК10-48,
БКР10-48).
Хроническое токсическое действие растворов отдельных химических веществ,
исследуемой воды или водной вытяжки из почв, осадков сточных вод и отходов на
цериодафний определяется по смертности и изменению их плодовитости за период
7 и более суток (до появления третьего помета молоди в контроле) в исследуемой
воде по сравнению с контролем. Критерием хронической токсичности служит
гибель 20% и более тест-организмов и (или) достоверное отклонение в
плодовитости из числа выживших по сравнению с контролем.
При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в
точном соответствии с методикой значение погрешности (и ее составляющих)
результатов измерений, не превышают значений, приведенных в таблице 6.
38
Таблица 6
Значения метрологических характеристик для различных анализируемых
объектов
Объект
Показатель
точности
(границы
относительной
погрешности)
±δ,
%,
при Р = 0,95
Показатель
повторяемости
(относительное
среднеквадрати
чное
отклонение
повторяемости),
Ϭr, %
Показатель
воспроизводимости
(относительное
среднеквадрати
чное
отклонение
воспроизводимости), ϬR,%
Предел повторяемости,
r, %, Р = 0,95,
n=2
Вода
питьевая
и 40
11
20
30
поверхностная
пресная,
грунтовая,
сточная.
Водные
вытяжки из почв,
осадков сточных вод,
отходов
производства
За результат
измерений принимают среднее арифметическое результатов двух
параллельных определений, если выполняется условие приемлемости
(1)
где х1 , х2 — результаты параллельных определений по уровню смертности
или снижению плодовитости цериодафний, шт.; r — значение предела
повторяемости (таблица 6).
10.2. Если условие, приведенное в формуле (1), не выполняется, получают еще
один результат в полном соответствии с данной методикой. За результат измерений
принимают среднее арифметическое значение результатов трех определений, если
выполняется условие (2):
,
(2)
Где xmax, xmin — максимальное и минимальное значения из полученных трех
результатов параллельных определений по уровню смертности или снижению
плодовитости цериодафний, шт.; CR0,95 (n) — значение критического диапазона для
уровня вероятности Р = 0,95 и n — результатов определений.
CR0,95=f(n)·ϭr ,
(3)
Для n = 3
CR0,95=3,3 ϭr ,
(4)
где ϭr — показатель повторяемости, % (таблица 6).
Если условие, приведенное в формуле (2), не выполняется, выясняют причины
превышения критического диапазона, устраняют их и повторяют выполнение
измерений в соответствии с требованиями методики.
Результат анализа в документах, предусматривающих его использование,
представляют в виде:
,
где
— среднее арифметическое значение результатов п определений,
признанных приемлемыми, шт.; ± δ — границы относительной погрешности
измерений, % (таблица 6).
39
Цель работы: Определить ЛК50-24 и БК10-48 для ионов тяжелых металлов
(меди, кадмия, цинка) в остром токсикологическом опыте с цериодафниями.
Оборудование, материалы и реактивы:
Климатостат Р2, устройство для экспонирования рачков УЭР-04, пробирки
стеклянные объемом 30 мл (40 шт), штатив для пробирок, стеклянная трубочка с
внутренним диаметром 4-5 мм, пипетки-капельницы, стеклянные стаканы на 100 мл
(6 шт), стеклянный стакан на 250-400 мл, мерный цилиндр на 50 мл, пипеткидозаторы на 1 и 5 мл, ершики и губки для мытья посуды, растворы модельных
токсикантов, натрия бикарбонат (сода питьевая), синхронизированная культура
рачков цериодафний (80 особей возрастом 1,5-2 суток), культивационная вода для
цериодафний.
Порядок выполнения лабораторной работы:
1. Приготовить всю необходимую посуду для проведения опыта.
2. Во все опытные пробирки (30 шт) налить по 29 мл культивационной воды, в
контрольные – по 30 мл
3. В каждую пробирку с водой переместить с помощью пипетки капельницы
по 2 цериодафнии возрастом 1 сутки с минимальным количеством воды
4. Приготовить ряд растворов модельного токсиканта. Для приготовления ряда
концентраций модельного токсиканта необходимо предварительно рассчитать (в
пересчете на ионы тяжелого металла) схему разведения исходного
(концентрированного) раствора соли.
Для сульфата меди приготовить концентрации: 0,3; 0,1; 0,03; 0,01; 0,003 мг/л
Для сульфата кадмия приготовить концентрации: 0,3; 0,1; 0,03; 0,01; 0,003 мг/л
5. В опытные пробирки добавить по 1 мл раствора токсиканта
соответствующей концентрации. Распределение количества пробирок для
различных концентраций следующее:
Контроль
10 пробирок
1-я концентрация (минимальная)
5 пробирок
2-я концентрация
5 пробирок
3-я концентрация
10 пробирок
4-я концентрация
5 пробирок
5-я концентрация (максимальная)
5 пробирок
6. Все пробирки разместить в УЭР-04 в климатостате при температуре 24ºС.
7. Через 24 часа эспонирования произвести подсчет выживших особей.
Обработка и представление результатов
8. Произвести контроль приемлемости результатов по указанным выше
формулам для контрольного варианта опыта и для средней концентрации раствора
токсиканта, при которой исследовалась выживаемость цериодафний в 10 пробирках.
9. Рассчитать ЛК50-24 и БК10-48, используя при необходимости графический
метод определения действующей концентрации.
10. Сделать вывод о токсичности исследуемого модельного токсиканта для
цериодафний и достоверности полученных результатов.
Контрольные вопросы:
1. В чем принципиальное отличие дафний и цериодафний как тест-организмов?
2. В каких случаях применяются хронические методы биотестирования?
40
3. Какие параметры цериодафний как тест-организма регистрируют при определении
хронического токсического действия?
4. Каковы особенности определения погрешности эксперимента при выполнении методики
биотестирования на цериодафниях?
1.
2.
3.
4.
Рекомендуемая литература
Брагинский Л.П. Методологические аспекты токсикологического биотестирования на
Daphnia magna и других ветвистоусых ракообразных (критический обзор) //
Гидробиологический журнал. 2000. Т. 36 № 5. С. 50-70.
Бубнов, А.Г. Биотестовый анализ – интегральный метод оценки качества объектов
окружающей среды (Текст): учебно-методическое пособие / А.Г. Бубнов. С.А. Буймова,
А.А. Гущин, Т.В. Извекова.; под общ. ред. В.И. Гриневича. – Иван. хим.-технол. ун-т. –
Иваново, 2007. – 112 с.
Мелехова О.П., Сарапульцева Е.И. Биологический контроль окружающей среды:
биоиндикация и биотестирование. М.: Академия. 2010.
Григорьев Ю.С., Агилова Ю.Н. Методика определения острой токсичности питьевых,
пресных природных и сточных вод, водных вытяжек из почв, осадков сточных вод и
отходов по смертности цериодафний (Ceriodaphnia affinis). ПНД Ф Т 14.1:2:4.18-2011 Т
16.1:2.3:3.19 – 2011, ФР.1.31.2011.09714.2011.
41
Лабораторная работа № 14
Оценка действия ионов тяжелых металлов на выживаемость
Artemia salina в условиях вращения
Методика основана на определении смертности жаброногих рачков артемий
(Artemia salina L.) при воздействии токсических веществ, присутствующих в
исследуемой водной среде c повышенным содержанием солей, по сравнению с
контрольной культурой в пробах, не содержащих токсических веществ.
Острое токсическое действие исследуемой пробы на артемий определяют по
их смертности (летальности) за определенный период экспозиции. Критерием
острой токсичности служит гибель 50% и более особей артемий за 48 часов
экспозиции в исследуемой пробе, при условии, что в контроле гибель не превышает
10%.
При выявлении уровня токсичности устанавливают:
- среднюю летальную концентрацию отдельных веществ (кратность
разбавления пробы), вызывающую гибель 50% тест-объектов за 48 часовую
экспозицию;
- безвредную (не вызывающую эффекта острой токсичности) концентрацию
отдельных веществ (кратность разбавления пробы), вызывающую гибель не более
10% за 48 часовую экспозицию.
Исходным материалом для биотестирования служат науплии в возрасте до 24
часов, полученные в лаборатории из покоящихся яиц. Науплии артемий легко
получают в очень широком диапазоне солености из яиц (цист), которые могут
храниться продолжительное время.
Сухие яйца артемий заливают отстоянной водопроводной водой c
необходимой концентрацией соли NaCl (1 – 3) г яиц на 500 см3 воды). Через 30
минут сливают слой воды над осевшими яйцами, при этом удаляют всплывшие
нежизнеспособные яйца и пустые оболочки яиц. Очистку повторяют несколько раз.
Затем яйца несколько раз промывают культивационной водой (необходимой
солености). Промытые яйца помещают в стакан с культивационной водой в
термолюминостат для выклева. При температуре (232)°С науплии появляются
через (24 – 36) часов.
Рост, развитие и размножение. В благоприятных условиях выклев науплиев
артемий из яиц происходит через (1 – 2) суток. В первые дни жизни науплии
находятся на эндогенном питании. В возрасте (3 – 4) суток (метанауплис III)
науплиусы переходят на активное питание и совершают первую линьку. В
зависимости от температурных условий артемии достигают половозрелости через (3
– 4) недели после выклева из яиц.
В природных условиях у артемий наблюдается как половое размножение, так
и партеногенез. Партеногенетические яйца развиваются сразу после созревания,
оплодотворенные яйца могут довольно долго сохраняться в покоящемся состоянии,
постэмбриональное развитие со сложным метаморфозом (Определитель
пресноводных беспозвоночных…, 1995).
Питание. Артемии являются фильтраторами. Взрослым особям пищей служат
мелкие планктонные организмы (одноклеточные водоросли, бактерии) и частицы
детрита.
42
В связи с эндогенным питанием науплиусы артемий не нуждаются в
подкормке в течение четырех суток после выклева (Временные методические
рекомендации...,1999). Таким образом, при выявлении острой токсичности при 48
часовой экспозиции кормить науплиусы не надо.
Определение токсичности каждой пробы без разбавления и каждого
разбавления проводят в пяти параллельных сериях. В качестве контроля используют
пять параллельных серий с культивационной водой. В качестве культивационной
воды используют отстоянную водопроводную воду с добавлением NaCl,
соответствующей солености, т.е. идентичной солености тестируемой пробы.
Цель работы: Сравнить действие модельного токсиканта на выживаемость
артемий в условиях вращения и в неподвижно установленных флаконах
Оборудование, материалы и реактивы:
Климатостат Р2, устройство для экспонирования рачков УЭР-03, пробирки
стеклянные объемом 50 мл (32 шт), штатив для пробирок (2 шт), стеклянная
трубочка с внутренним диаметром 3 мм, стеклянные стаканы на 100 мл (6 шт),
стеклянный стакан на 250-400 мл, мерный цилиндр на 50 мл, пипетки-дозаторы на 1
и 5 мл, ершики и губки для мытья посуды, раствор модельного токсиканта
(бихромата калия), хлористый натрий (соль), натрия бикарбонат (сода питьевая),
науплии артемий возрастом до 24 часов (128 особей), культивационная вода.
Порядок выполнения лабораторной работы:
1. Приготовить всю необходимую посуду для проведения опыта.
2. Приготовить водный раствор соленостью 10 промиле (на основе
культивационной воды)
3. Во все опытные пробирки налить по 19 мл соленойой воды, в контрольные
– по 20 мл
3. В каждую пробирку с водой переместить с помощью пипетки по 4 артемии
возрастом 1 сутки с минимальным количеством воды
4. Приготовить ряд растворов модельного токсиканта. Для приготовления ряда
концентраций модельного токсиканта необходимо предварительно рассчитать схему
разведения исходного (концентрированного) раствора соли бихромата калия.
Для первой группы приготовить концентрации: 16, 8, 4 мг/л
Для второй дгруппы приготовить концентрации: 14, 7, 3,5 мг/л
Для третьей группы приготовить концентрации: 12, 6, 3 мг/л
5. В опытные пробирки добавить по 1 мл раствора токсиканта
соответствующей концентрации. Для каждой концентрации и контроля приготовить
по 10 пробирок с 4 артемиями в каждой.
6. Измерить концентрацию кислорода в пробирках.
7. Половину пробирок разместить в УЭР-03 в климатостате при температуре
20ºС, другую половину установить неподвижно в штативе, который разместить в
климатостате.
8. Через 24 и 48часов эспонирования произвести подсчет выживших особей и
измерение концентрации кислорода во всех пробирках.
Обработка и представление результатов
43
8. Произвести расчет среднего арифметического выживаемости рачков и
стандартного отклонения от среднего. Результаты измерения содержания кислорода
в тестируемых пробах до и после экспонирования отразить в виде таблицы:
Вариант опыта
Среднее значение содержания кислорода Изменение
концентрации
До экспонирования После
кислорода
экспонирования
(«до» – «после»)
В условиях вращения
Контроль
1-я концентрация
2-я концентрация
3-я концентрация
В неподвижно установленных пробирках
Контроль
1-я концентрация
2-я концентрация
3-я концентрация
9. Построить гистограмму отражающую зависимость выживаемости артемий
от концентрации токсиканта в условиях вращения и в неподвижно установленных
флаконах.
10. Сделать вывод о влиянии токсиканта и содержания кислорода на
выживаемость артемий.
1.
2.
3.
4.
Контрольные вопросы:
Для биотестирования каких проб используют артемий?
Что такое соленость и в чем она измеряется?
Какое значение имеет содержание кислорода в тестируемой среде при проведении
биотестирования?
Как на результаты биотестирования может повлиять экспонирование тест-организмов во
вращающейся кассуте УЭР?
Рекомендуемая литература
1. Бубнов, А.Г. Биотестовый анализ – интегральный метод оценки качества объектов
окружающей среды (Текст): учебно-методическое пособие / А.Г. Бубнов. С.А. Буймова,
А.А. Гущин, Т.В. Извекова.; под общ. ред. В.И. Гриневича. – Иван. хим.-технол. ун-т. –
Иваново, 2007. – 112 с.
2. Мелехова О.П., Сарапульцева Е.И. Биологический контроль окружающей среды:
биоиндикация и биотестирование. М.: Академия. 2010.
3. Методика определения токсичности высокоминерализованных поверхностных и сточных
вод, почв и отходов по выживаемости солоноватоводных рачков ARTEMIA SALINA L.
ЛЭТАП, лаб. водной токсикологии МГУ ЭАЦ "Экотерра". ФР 1.39.2006.0250; ;ПНД Ф Т
14.1:2.14-06 (ПНД Ф Т 16.1:3.11-06)
44
Лабораторная работа № 15
Изучение зависимости скорости роста культуры водоросли
от интенсивности света
Растения являются автотрофными или “самопитающими” организмами,
поскольку они создают первичное органическое вещество из неорганических
соединений за счет энергии Солнца. Поэтому солнечный свет - один из важнейших
абиотических факторов в любой экосистеме, поскольку он необходим зеленым
растениям для производства органического вещества из неорганических
компонентов. Этот процесс образования органического вещества при участии света
называется фотосинтезом. Помимо солнечного света для фотосинтеза необходимы
вода и углекислый газ. Продуктами, образующимися в процессе фотосинтеза,
являются различные сахара. Двуокись углерода относится к низкоэнергетическим
химическим соединениям, тогда как сахара обладают большим запасом энергии,
заключенной в их химических связях. Таким образом, в процессе фотосинтеза
энергия солнечного света превращается в химическую энергию, или, иными
словами, запасается в виде химической энергии.
Помимо органических веществ в процессе фотосинтеза выделяется кислород.
Часть этого кислорода используется самим растением, но, как правило, его
образуется больше, чем требуется растению. Жизнь всех животных, в том числе и
жизнь человека, зависит от кислорода. Прямо или косвенно мы зависим также и от
синтезируемых сахаров, поскольку поедаем либо сами растения, либо животных,
питающихся растениями.
Во многих экосистемах солнечный свет присутствует в достаточном
количестве. Однако в них есть и такие участки, например, под пологом густого леса
или в толще глубоководного водоема, где света явно не достаточно для нормального
роста растений. В результате эти организмы - продуценты органического вещества замедляют процесс его образования, что сопровождается уменьшением скорости
прироста их биологической массы, а для одноклеточных организмов
(микроводорослей) - их численности. Снижение первичной продукции
растительным звеном экосистемы может привести к ее разрушению.
Цель работы: изучить зависимость скорости роста культуры водоросли от
интенсивности света.
Оборудование, материалы и реактивы:
Фитотестеры-04, ИПС-03, КВ-05, стаканы (50-100 мл), мерный цилиндр,
комплект флаконов с пробками, дозаторы (1-5 мл), наконечники для дозаторов (1-5
мл), 50% среда Тамия, дистиллированная вода, сода, губка с держателем, культура
микроводоросли хлорелла, выращенная на 50% среде, вата, воронка.
Ход работы:
В трех культиваторах “Фитотестер-04” установить соответственно,
максимальную, среднюю и минимальную интенсивность света. Для этого в двух
приборах регулятор света (С) должен находиться в противоположных крайних
положениях, а в одном - в среднем. Это будет примерно соответствовать
освещенности 80, 40 и 20 Вт/м2.
Затем надо приготовить 125 мл суспензии водоросли с оптической плотностью
0,005 для заправки флаконов Фитотестеров-04. Для этого взять профильтрованную
через 4 слоя марли (или вату) пробу культуры водоросли из культиватора КВ-05
45
объемом 20 мл и, измеряя оптическую плотность суспензии прибором ИПС-03,
довести ее значение до 0,125 путем разбавления свежей 50% средой Тамия.
Приготовленный иннокулят в объеме 5 мл вносится в стакан со 120 мл
дистиллированной воды. В результате получим суспензию водоросли для
биотестирования с параметрами: начальная оптическая плотность 0,005,
концентрация среды Тамия 2% от исходной. Далее эта культура водоросли
разливается шприцом-дозатором по 6 мл в 18 кювет – реакторов. Заправленные
флаконы и закрытые полиэтиленовыми пробками с отверстиями 6 мм равномерно
размещаются по 6 штук в каждый из трех культиваторов.
После включения приборов в сеть в культиваторах устанавливается
одинаковая температура равная 360,5 градусам. Это достигается путем
периодического измерения в течение первых 30–40 минут температуры суспензии
водоросли непосредственно во флаконах с помощью электронного термометра. При
несоответствии измеренной температуры необходимой ее можно повысить
(поворотом вправо) или понизить (поворотом влево) с помощью ручки (T)
регулятора термостатирующего устройства, выведенной на боковую стенку
культиватора.
Через 22 часа культивирования одновременно выключить культиваторы,
достать из них флаконы и измерить на приборе ИПС-03 оптическую плотность
суспензий водоросли в каждом из вариантов опыта.
Обработка и представление результатов
Просуммировав все 6 значений D для каждого из вариантов (интенсивности
света) опытов и поделив сумму на число 6, определить среднюю величину
оптической плотности суспензии во всех трех культиваторах, также оценить
стандартное отклонение от средней величины во всех вариантах. Отношение
полученной средней величины к исходной оптической плотности суспензии равной
0,005 даст значение величины прироста численности культуры водоросли за время
эксперимента (число раз).
Построить график зависимости величины прироста водоросли хлорелла от
интенсивности света. Для этого отложить на оси ординат значения прироста
водоросли, а на оси абсцисс – значения интенсивности света. Полученные точки
пересечения соединить прямыми линиями. Дать объяснение полученным
результатам.
Контрольные вопросы:
1. Является ли интенсивность света в проведенных опытах лимитирующим фактором?
2. Объясните на примере проведенного опыта закон лимитирующих факторов.
3. Какова роль светового фактора для жизнедеятельности зеленых растений (продуцентов
органических веществ)?
4. Определите роль данного экологического фактора, оказывающего ограничивающее
воздействие (в случае его недостатка или избытка) на организм.
5. Каков оптимальный уровень воздействия фактора на рост и размножение тесторганизма?
Рекомендуемая литература
1. Шилов, И. А. Экология / И.А.Шилов. – М.: Издательство Юрайт, 2011. – 512 с.
2. Полевой В.В. Физиология растений: учебник для биологических специальностей вузов
/ В.В. Полевой. - Москва: Высшая школа, 1989. - 464 с.
3. Медведев С.С. Физиология растений: учебник для студентов и аспирантов
биологических факультетов университетов: / С. С. Медведев. - СпбГУ, 2004. - 335 с.
46
Лабораторная работа № 16
Изучение зависимости скорости роста культуры водоросли от температуры
Температура, как и свет, является одним из основных ограничивающих
экологических факторов. В то время как световой режим на нашей планете
достаточно однороден, температурный неодинаков и может значительно отличаться.
И хотя пределы, в которых может существовать жизнь, укладываются примерно в
300 С (от -200 С до +100 С), однако активность большой части видов приурочены
к более узкому диапазону температур. Как правило, нижние предельные значения
фактора оказываются менее критическими, чем верхние, хотя многие организмы
вблизи верхних пределов диапазона толерантности функционируют более
эффективно. Диапазон колебаний температуры в воде обычно меньше, чем на суше,
и поэтому диапазон толерантности к температурному фактору у водных организмов
обычно уже, чем у соответствующих наземных животных. Таким образом,
температура представляет собой важный и часто лимитирующий фактор.
Изменчивость температуры крайне важна с экологической точки зрения.
Жизнедеятельность организмов, которые в природе обычно подвергаются действию
переменных температур, подавляется частично или полностью или замедляется при
воздействии постоянной температуры. Во всяком случае, стимулирующий эффект
переменных температур, по крайней мере в умеренной зоне, можно считать четко
установленным, и это необходимо подчеркнуть, поскольку лабораторные
эксперименты обычно проводятся при постоянной температуре.
Температура оказывает огромное влияние на рост и жизнедеятельность живых
организмов. Связано это с тем, что протекание различных биохимических реакций,
необходимых для поддержания жизнедеятельности, зависит от температуры.
Вообще скорость химических реакций увеличивается в 2-4 раза при повышении
температуры на 10С. Наблюдается огромное разнообразие и удивительное
совершенство механизмов приспособления к изменениям температуры окружающей
среды, которые выработались у организмов в процессе эволюции.
По отношению к температуре выделяют следующие основные группы
организмов:
 криофилы – предпочитают относительно низкие температуры (напр.,
диатомовые водоросли);
 мезофилы – предпочитают условия со средними положительными
температурами;
 термофилы – организмы, живущие при очень высоких температурах среды
(напр., некоторые термофильные бактерии).
Цель работы: изучить зависимость скорости роста культуры водоросли от
интенсивности света.
Оборудование, материалы и реактивы:
Фитотестеры-04, ИПС-03, КВ-05, стаканы (50-100 мл), мерный цилиндр,
комплект флаконов с пробками, дозаторы (1-5 мл), наконечники для дозаторов (1-5
мл), 50% среда Тамия, дистиллированная вода, сода, губка с держателем, культура
микроводоросли хлорелла, выращенная на 50% среде, вата, воронка.
Ход работы:
В
трех
культиваторах
Фитотестер-04
установить
максимальную
интенсивность света, что примерно будет соответствовать 80 Вт/м2. Затем надо
47
приготовить 125 мл суспензии водоросли с оптической плотностью 0,005 для
заправки флаконов в Фитотестер-04. Для этого взять профильтрованную через 4
слоя марли (или вату) пробу культуры водоросли из культиватора КВ-05 объемом
20 мл и, измеряя оптическую плотность суспензии прибором ИПС-03, довести ее
значение до 0,125 путем разбавления свежей 50% средой Тамия.
Приготовленный иннокулят в объеме 5 мл вносится в стакан со 120 мл
дистиллированной воды. В результате получим суспензию водоросли для
биотестирования с параметрами: начальная оптическая плотность 0,005,
концентрация среды Тамия 2% от исходной. Далее эта культура водоросли
разливается шприцом-дозатором по 6 мл в 18 кювет-реакторов. Заправленные
флаконы и закрытые полиэтиленовыми пробками с отверстиями 6 мм равномерно
размещаются по 6 штук в каждый из трех культиваторов.
После включения приборов в сеть во флаконах трех культиваторов
устанавливается три различные температуры – 29, 33 и 37 градусов.
Через 22 часа культивирования одновременно выключить культиваторы,
достать из них флаконы и измерить на приборе ИПС-03 оптическую плотность
суспензий водоросли в каждом из вариантов опыта.
Обработка и представление результатов
Просуммировав все значения D для каждого из вариантов (температуры)
опытов и, поделив сумму на число используемых флаконов, определить среднюю
величину оптической плотности суспензии во всех трех культиваторах, также
оценить стандартное отклонение от средней величины во всех вариантах.
Отношение полученной средней величины к исходной оптической плотности
суспензии равной 0,005 даст значение величины прироста численности культуры
водоросли за время эксперимента (число раз).
Построить график зависимости величины прироста водоросли хлорелла от
температуры. Для этого отложить на оси ординат значения прироста водоросли, а на
оси абсцисс – значения температуры. Полученные точки пересечения соединить
прямыми линиями. Дать объяснение полученным результатам.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
1.
2.
3.
4.
Контрольные вопросы
Является ли температура в проведенных опытах лимитирующим фактором?
Объясните на примере проведенного опыта закон лимитирующих факторов.
понять роль данного фактора для жизнедеятельности организмов;
определить оптимальный уровень воздействия температуры на рост водорослей и
пределы их устойчивости (т.е. максимальную и минимальную температуры, пригодные
для жизни);
объяснить действие закона лимитирующих факторов;
определить к какой группе организмов по отношению к температуре относится данный
тест-объект.
Рекомендуемая литература
Шилов, И. А. Экология / И.А.Шилов. – М.: Издательство Юрайт, 2011. – 512 с.
Полевой В.В. Физиология растений: учебник для биологических специальностей вузов /
В.В. Полевой. - Москва: Высшая школа, 1989. - 464 с.
Медведев С.С. Физиология растений: учебник для студентов и аспирантов
биологических факультетов университетов: / С. С. Медведев. - СпбГУ, 2004. - 335 с.
Биохимия растений: учебное пособие для биологических специальностей / Л. А.
Красильникова, О. А. Аквентьева [и др.]; под ред. Л. А. Красильникова. - Харьков:
Торсинг; Ростов-на-Дону: Феникс, 2004. - 224 с.
48
Лабораторная работа № 17
Изучение зависимости скорости роста культуры водоросли
от наличия углекислого газа в среде
Общеизвестно, что у многих растений удается увеличить интенсивность
фотосинтеза, умеренно повысив концентрацию СО2 в среде. Это вызвано тем, что
углекислый газ является конечным акцептором (потребителем) световой энергии
при фотосинтезе. При его недостатке или полном отсутствии углекислоты в среде
поглощенная хлорофиллом энергия света не только не может быть использована
растением, но и даже вызывает его повреждение или даже гибель. В водных
местообитаниях количество кислорода, двуокиси углерода, а также
других
растворенных и потому доступных организмам газов, сильно варьирует во времени
и в пространстве, что в наземных местообитаниях бывает очень редко. В озерах и в
водоемах с высоким содержанием органических веществ, лимитирующим фактором
часто оказывается кислород. Содержание двуокиси углерода в воде также может
сильно варьировать. Хотя концентрация двуокиси углерода в воздухе невелика, она
прекрасно растворяется в воде. Кроме того, в воду может поступать углекислый газ,
освобождающийся при дыхании и разложении органических веществ. Поэтому
минимальный предел содержания СО2 в естественных условиях, как правило, не
имеет такого значения, как в случае с О2. Тем не менее, небольшое увеличение
содержания СО2 в среде обычно повышает интенсивность фотосинтеза и
стимулирует процессы развития многих фотосинтезирующих растительных
организмов.
Цель работы: изучить зависимость скорости роста культуры водоросли от
наличия углекислого газа в среде
Оборудование, материалы и реактивы:
Фитотестеры-04, ИПС-03, КВ-05, стаканы (50-100 мл), мерный цилиндр,
комплект флаконов с пробками, дозаторы (1-5 мл), наконечники для дозаторов (1-5
мл), 50% среда Тамия, дистиллированная вода, сода, губка с держателем, культура
микроводоросли хлорелла, выращенная на 10% среде, вата, воронка.
Ход работы:
В культиваторе “Фитотестер-04” установить максимальную интенсивность
света. В 16 флаконов-реакторов заливается по 6 мл суспензии водоросли хлорелла с
оптической плотностью равной 0,01, приготовленной на 10 % питательной среде
Тамия. Все флаконы делятся на 4 группы по 4 шт. в каждой и закрываются
пластиковыми крышками, в которых:
1. нет отверстия;
2. просверлено отверстие диаметром 1 мм;
3. просверлено отверстие диаметром 3 мм;
4. просверлено отверстие диаметром 6 мм.
Отверстия, если они есть, обеспечивают большее или меньшее попадание в
кювету свежего воздуха, содержащего углекислый газа, который постоянно
потребляется растущей культурой водоросли. Пополнение “съеденной” двуокиси
углерода осуществляется путем ее диффузии в водную среду через непрерывно
обновляющуюся, в результате вращения кюветы, поверхность суспензии водоросли.
Все 4 варианта флаконов загружаются в один культиватор. После включения
прибора в сеть в реакторах устанавливается одинаковая температура, близкая 36
49
градусам. Через 24 часа культивирования выключить культиватор, достать из них
флаконы и измерить на приборе ИПС-03 оптическую плотность (D) суспензий
водоросли в каждом из вариантов опыта.
Обработка и представление результатов
Просуммировав все значения D для каждого из вариантов опытов (условий
питания культуры водоросли) и, поделив сумму на число используемых флаконов,
определить среднюю величину оптической плотности суспензии во всех трех
культиваторах, также оценить стандартное отклонение от средней величины во всех
вариантах. Отношение полученной средней величины к исходной оптической
плотности суспензии равной 0,005 даст значение величины прироста численности
культуры водоросли за время эксперимента (число раз).
Построить график зависимости величины прироста водоросли хлорелла от
диаметра отверстий в пробках флаконов. Для этого отложить на оси ординат
значения прироста водоросли, а на оси абсцисс – значения диаметра отверстий (мм).
Полученные точки пересечения соединить прямыми линиями. Дать объяснение
полученным результатам.
Контрольные вопросы
1. Является ли содержание углекислого газа во флаконах лимитирующим фактором?
2. Объясните на примере проведенного опыта закон лимитирующих факторов.
1.
2.
3.
4.
5.
Рекомендуемая литература
Шилов И. А. Экология / И.А.Шилов. – М.: Издательство Юрайт, 2011. – 512 с.
Полевой В.В. Физиология растений: учебник для биологических специальностей вузов /
В.В. Полевой. - Москва: Высшая школа, 1989. - 464 с.
Медведев С.С. Физиология растений: учебник для студентов и аспирантов
биологических факультетов университетов: / С. С. Медведев. - СпбГУ, 2004. - 335 с.
Биохимия растений: учебное пособие для биологических специальностей / Л. А.
Красильникова, О. А. Аквентьева [и др.]; под ред. Л. А. Красильникова. - Харьков:
Торсинг; Ростов-на-Дону: Феникс, 2004. - 224 с.
Полевой В.В. Физиология роста и развития растений / В.В. Полевой, Т.С. Саламатова.
Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1991. 240 с.
50
Лабораторная работа № 18
Определение чувствительности культуры Chlorella vulgaris
к ионам тяжелых металлов
Тяжелые металлы (свинец, ртуть, медь, цинк, кадмий, кобальт, олово, висмут,
ванадий, и др.) называют тиоловыми (протоплазматическими) ядами. Они
необратимо связываются с тиоловыми группами белков (SH), что приводит к потере
белком своей биологической активности. Поскольку тиоловые яды действуют на
белки не избирательно, то нарушается функция и ферментов, и гормонов, и
транспортных белков, и белков ахроматинового веретена, и белков хромосом и
структурных белков. Поэтому указанные яды для SH-групп имеют широкий спектр
действия. Они вызывают мутации, рак, аллергию, болезни системы крови, печени,
почек, мозга. Прочное связывание протоплазматических ядов с клеточными
структурами обусловливают их способность накапливаться в организме. Лишь
незначительная часть протоплазматических ядов выводится из организма. У
растений тиоловые яды частично обезвреживаются с помощью органических
кислот, частично превращаются в летучие органические соединения и испаряется с
поверхности листа. Так, ртуть превращается в метилртуть, выделяющуюся в воздух.
Метилртуть более токсичное соединение, чем сама ртуть и ее соли. Разные растения
способны в неодинаковой степени накапливать протоплазматические яды. Наиболее
эффективно накапливают яды и очищают среду тополь, липа, боярышник,
многолетние злаки, а также растения с высоким содержанием винной и щавелевой
кислот, SH-соединений, такие как, салат, щавель, ревень, капуста, свекла, черемша.
Высока способность аккумулировать тяжелые металлы, мышьяк, сурьму, селен у
водных организмов. Причем содержание загрязнителя увеличивается по мере
повышения уровня пищевой цепи. Употребление их в пищу может вызвать
отравление тяжелыми металлами. Таким образом, человек, представляющий одно из
последних звеньев пищевой цепи, испытывает на себе наибольшую опасность
нейротоксического воздействия тяжелых металлов вследствие возрастания
биологической аккумуляции вдоль пищевой цепи.
Цель работы: определить чувствительность культуры водоросли хлореллы к
ионам тяжелых металлов.
Оборудование, материалы и реактивы: культиватор КВМ-05, ИПС-03, КВ05, стаканы (50-100 мл), мерный цилиндр, комплект флаконов с пробками, дозаторы
(1-5 мл), наконечники для дозаторов (1-5 мл), 50% среда Тамия, дистиллированная
вода, сода, губка с держателем, культура микроводоросли хлорелла, выращенная на
50% среде, вата, воронка, растворы тяжелых металлов.
Ход работы
Определение токсического действия тяжелых металлов лучше проводить на
растворах их солей. Для этого используют хорошо растворимые в воде хлориды или
сульфаты меди, кадмия, кобальта, цинка и др. металлов.
Характер воздействия тестируемых вод оценивается путем сравнения
суточного прироста численности клеток водорослей в контрольном и опытном
вариантах. Контроль над численностью клеток проводится посредством измерения
оптической плотности суспензии.
Расчет показателя токсичности (КТ) проводится по формуле:
,
51
где Dк и Dт – величины оптической плотности контрольного и тестируемого
образца, соответственно, после 22 часов культивирования.
Превышение КТ величины 0,2 свидетельствует о токсичности пробы воды.
При этом суточный прирост в контроле должен быть не менее 25 раз.
В случае если показатель токсичности воды превышает применяемый
пороговый уровень (КТ=0,2), то возникает необходимость измерения величины ее
биологически
безопасного
разведения,
которая
выступает
в
роли
токсикологического критерия качества тестируемой воды. В таких случаях
готовится несколько разведений тестируемой воды кратных двум. Для этого берется
5 стаканчиков или баночек объемом 50-100 мл, в которые шприцом - дозатором
разливается по 24 мл тестируемая и разбавляющая вода по схеме:
1 - тестируемая вода без разведения (24 мл);
2 - разведение в 2 раза (24 мл тестируемой воды +24 мл дистиллированной);
3 - разведение в 4 раза (24 мл разведения 2 + 24 мл дистиллированной воды);
4 - разведение в 8 раз (24 мл разведения 4 + 24 мл дистиллированной воды);
5 - разведение в 16 раз (24 мл разведения 8 + 24 мл дистиллированной воды).
24 мл
контроль
48 мл
тестируемой
воды
24 мл
24 мл воды
24 мл
24 мл воды
24 мл воды
24 мл
24 мл
24 мл воды
Чтобы упростить процедуру приготовления разбавлений тестируемой воды
надо сначала разлить по 24 мл дистиллированной воды в 4 последних стаканчика. В
первый вносится 48 мл тестируемой пробы воды. После этого тем же шприцомдозатором отбирается 24 мл содержимого первого стакана и переносится во второй
стакан, из второго в третий, из третьего в четвертый, из четвертого в пятый, а из
пятого 24 мл отбрасывается совсем. При этом после каждого переноса порции воды
следует перемешивать содержимое очередного стакана двукратным заполнением и
сливом в него воды из шприца. Во все приготовленные таким образом пробы воды
объемом по 24 мл вносится по 1 мл суспензии хлореллы оптической плотности
0,125, выращенной на 50% среде Тамия.
Все разведения тестируемой и контрольной проб воды разливаются по 6 мл в
3 флакона каждая и загружаются в один культиватор. Если анализируется сразу
несколько проб воды без разбавлений, то их вместе с контролем в трех
повторностях также помещают в один культиватор.
Обработка и представление результатов
Полученные результаты занести в таблицу.
Показатель Оптическая плотность (D)
D средняя КТ
Вариант
кювета 1 кювета 2 кювета 3
Контроль
Без разбавления
Разбавление 2
52
Разбавление 4
Разбавление 8
Разбавление 16
Для удобства использования показателя уровня биологически безопасного
разведения вводится его обратная величина (1/УББР), которая рассчитывается по
формуле:
, где
КТм – показатель токсичности разбавления, имеющего величину менее 0,2;
КТб – показатель токсичности разбавления, имеющего величину более 0,2;
М – обратная величины степени разбавления, имеющего величину КТ
меньшую 0,2;
Б – обратная величина степени разбавления, имеющего величину КТ большую
0,2;
0,2 – показатель (критерий) токсичности воды.
Пример: при разбавлении пробы воды в 4 раза КТ составил величину 0,34, а
при разбавлении 8 раз – 0,11. Тогда величина М будет равна 1/8, а Б – 1/4, КТм –
0,11, КТб – 0,34.
УББР = 5,8 раз.
Разведение растворов с металлами: Для биотестирования токсичности
растворов хранения необходимо сделать ряд их разбавлений. Величина разбавления
определяется на основе расчета содержания в солевых растворах иона тяжелого
металла и чувствительности к нему тест-организма. Для меди и кадмия
максимальное содержание ионов в тестируемом растворе применительно к
используемому водорослевому биотесту может быть ограничено величиной 0,1 мг
ТМ/л. Данный начальный раствор получают многократным разбавлением раствора
хранения (10 г/л) дистиллированной водой.
Пример. Сульфат меди (CuSO45H2O) имеет молекулярный вес 250, в котором
вес иона меди составляет 64, или 25,6%. Таким образом, ранее приготовленных
раствор хранения данной соли (10 г/л) содержит 2,56 г/л Cu+2. Для получения
начального, максимального по концентрации раствора, равного 0,1 мг/л, его
необходимо разбавить 25600 раз. Для этого его сначала можно разбавить в 200 раз,
внеся в 199 мл воды 1 мл этого раствора, а затем еще в 128 раз, перенеся 1 мл
полученного раствора в 127 мл воды.
После этого данный раствор разбавляется кратно двум в ряд из пяти
концентраций. Затем в тестируемые растворы (24 мл), включая контрольную пробу
с дистиллированной водой, вносится по 1 мл суспензии водоросли хлорелла с
оптической плотностью 0,125 в 50% среде Тамия.
Полученные 6 вариантов тест-культуры разливают по 6 мл в три отдельных
флакона культиватора. Через 22 часа выращивания водоросли в культиваторе КВМ05 при температуре 36о С и максимальной интенсивности света определяется
безопасная концентрация соли путем деления значения начальной концентрации ТМ
(например, 0,1 мг/л для Cu+2) на величину безопасного разбавления (БР),
рассчитанной по формуле, описанной выше.
53
24 мл
24 мл
дистиллированной воды
1 мл
48 мл
последнего
разведения
1 мл
24 мл
24 мл
дистиллированной воды
1 мл
24 мл
24 мл
24 мл
дистиллированной воды
24 мл
дистиллированной воды
1 мл
1 мл
24 мл
24 мл
дистиллированной воды
1 мл
суспензия водоросли хлорелла D=0,125 (50% Тамия)
Сделать вывод о чувствительности тест-объекта к ионам тяжелых металлов.
1.
2.
1.
2.
3.
4.
5.
Контрольные вопросы
Чем обусловлено токсическое действие ионов тяжелых металлов на растительные
объекты?
Каким образом может проявляться токсичность тех или иных ионов тяжелых металлов,
исследованных вами, на растительные объекты?
Рекомендованная литература
Мелехова О.П., Сарапульцева Е.И. Биологический контроль окружающей среды:
биоиндикация и биотестирование. М.: Академия. 2010.
Гольд, В.М. Теоретические основы и методы изучения флуоресценции хлорофилла
(Текст): Учебное пособие / В.М. Гольд, Н.А. Гаевский, Ю.С. Григорьев, В.А.
Попельницкий, А.В. Гехман; Красноярский государственный университет. –
Красноярск: изд. КГУ, 1984. – 82 с.
Будников Г.К. Тяжелые металлы в экологическом мониторинге водных систем / Г.К.
Будников // Соросовский образовательный журнал. – 1998. - №5. – С. 23-29.
Веселовский В.А., Веселова Т.В. Люминесценция растений: Теоретические и
практические аспекты. – М.: Наука, 1990. – 200 с.
Рубин, А.Б. Биофизические методы в экологическом мониторинге / А.Б. Рубин //
Соросовский Образовательный Журнал. -2000. -Т.6. -№4. - с.7-13.
54
Лабораторная работа № 19
Определение чувствительности ряски малой к ионам тяжелых металлов
Одними из самых опасных загрязнителей биосферы являются тяжелые
металлы, которые в отличие от органических загрязнителей не разрушаются,
участвуя в биологических процессах, могут накапливаться в живых организмах и
передаваться по пищевым цепям на более высокие уровни. Данное положение лежит
в основе определения токсичности тяжелых металлов с помощью растений, а так же
дает возможность использовать водные растений для биомониторинга содержания
тяжелых металлов в среде. Ряска малая широко используется в качестве тесторганизма для оценки загрязнения вод тяжелыми металлами. К числу наиболее
экспрессных методов оценки физиологического состояния растений можно отнести
ингибирование фототаксиса хлоропластов в листьях, флуоресценцию хлорофилла,
определение количества погибших клеток с помощью витального окрашивания,
фиксацию морфологических отклонений.
Ионы тяжелых металлов, такие как Cu2+, Zn2+, Fe2+, Ni2+ необходимы для
жизнеобеспечения растений и других живых организмов, хотя в больших
количествах они могут вызывать угнетение роста и нарушение метаболизма. Так,
например, избыток меди может привести к замене ионов металла (магния) в
активных центрах ферментов, стать причиной хлороза, некроза и замедления роста
Цель: определить чувствительность ряски малой к ионам тяжелых металлов.
Оборудование, материалы и реактивы
Культиватор для ряски, стаканы (50-100 мл), мерный цилиндр, комплект
флаконов, дозаторы (1-5 мл), наконечники для дозаторов (1-5 мл), 100% среда
Штейнберга, дистиллированная вода, сода, губка с держателем, культура
микроводоросли хлорелла, выращенная на 50% среде, вата, воронка, растворы
тяжелых металлов.
Ход работы
Отбирают из культуры ряску, выбирая трехлистецовые розетки, одинаковые
на вид, активно растущие, чистые, зеленые, неповрежденные, здоровые на вид. В
кюветы разлить по 4 мл дистиллированной воды, положить на поверхность колечки
для фиксации в центре кюветы тест-объекта. Отобранную ряску по одной розетке
поместить в кюветы. Кюветы с ряской проанализировать на флуориметре при
оптимальных настройках и выбрать из всей совокупности экземпляры с близкими
по ЗФв значениями.
В каждый флакон помещается одна розетка растения. Каждая проба
выполняется в трех повторностях. В итоге готовится 150 мл каждого раствора.
Для приготовления контрольного раствора в мерный цилиндр наливается 3 мл
100% среды Штейнберга и доводится до 150 мл дистиллированной водой.
Полученный раствор разливается во флаконы по 50 мл.
Разведение растворов с металлами: Для биотестирования токсичности
растворов хранения необходимо сделать ряд их разбавлений. Величина разбавления
определяется на основе расчета содержания в солевых растворах иона тяжелого
металла и чувствительности к нему тест-организма. Для меди и кадмия
максимальное содержание ионов в тестируемом растворе применительно к
используемому биотесту при помощи ряски 0,2 мг ТМ/л. Данный начальный
55
раствор получают многократным разбавлением раствора хранения (10 г/л)
дистиллированной водой.
Пример для ионов меди. Сульфат меди (CuSO45H2O) имеет молекулярный
вес 250, в котором вес иона меди составляет 64, или 25,6%. Таким образом, ранее
приготовленных раствор хранения данной соли (10 г/л) содержит 2,56 г/л Cu+2. Для
получения начального, максимального по концентрации раствора, равного 0,2 мг/л,
его необходимо разбавить 12800 раз. Конечное разбавление в 150 раз, производится
при добавлении 1 мл раствора промежуточного разведения меди в 149 мл итогового
раствора с 2% средой Штейнберга. Для получения промежуточного раствора
исходный разбавить в 12800/150=85,3 раза.
Далее выполняется двукратный ряд разведения по приведенной схеме (рис. 9.)
Во флаконы с готовыми растворами помещается по одной розетке ряски.
Флаконы вставляются в кассету камеры биотестирования, в которых
поддерживается постоянное освещение и температура 27-28 °C.
Получение результатов: экспозиция длится в течение 24 часов. После чего
проводиться анализ морфологических изменений розеток. Полученные результаты
занести в таблицу 7.
1 мл
2 мл
2 мл
2 мл
2 мл
исходный
раствор
меди 10 г/л
84,3 мл воды
1 мл
2% Шт.
3 мл Шт. +
146 мл воды
2 мл воды
2 мл воды
1 мл
3 мл Шт. +
146 мл воды
2 мл воды
1 мл
3 мл Шт. +
146 мл воды
1 мл
3 мл Шт. +
146 мл воды
2 мл воды
1 мл
3 мл Шт. +
146 мл воды
Рис. 9. Схема приготовления растворов для биотестирования на ряске.
Табл. 7. Морфологические параметры растений ряска малая
Показатель
Вариант
Контроль
Без разбавления
Разбавление 2
Разбавление 4
Разбавление 8
Разбавление 16
Опадение
корней
Хлорозы Некрозы
Окрашивание
Прирост Разделение
листецов розеток
Затем ряска анализируется на флуориметре Фотон 10, измерение параметров
ЗФ производится после установления кювет с тестируемыми пробами в кассету
флуориметра Фотон 10. Для этого включить управляющий компьютер прибора,
запустить программу «Foton 10». Подключить кабелем-адаптером к USB порту
компьютеру флуориметр и включить его в сеть. После установления связи между
компьютером и прибором, перевести программу в режим загрузки кювет, нажав
56
иконку «ОПЗФ». Загружать надо с так называемой «нулевой» кюветы, которая
должна содержать 4 см3 дистиллированной воды. После загрузки всех кювет
перевести программу в режим «Быстрые настройки» и выбрать из нижнего меню
настройки для ряски малой.
Выставив необходимые параметры замера, нажать на кнопку «СТАРТ».
Кассета сначала установит в оптический блок прибора кювету «0», а затем
последовательно все остальные кюветы. На экране монитора будут отображаться
номер кюветы и круга и значения регистрируемых показателей.
Если для каких-либо кювет величины показателей будут слишком высокими
(зашкаливать), или величина ОПЗФ в контрольном варианте выходит за пределы
значений 4-8, то необходимо прервать процесс измерения нажатием кнопки
«СТОП». При этом замер прекратится после завершения выполнения замера
текущей кюветы. Снизив чувствительность или усиление прибора снова запустить
замер нажатием кнопки «СТАРТ». В случае низкого значения ОПЗФ надо
уменьшить величину параметра «Низкий свет, мс», и наоборот увеличить
длительность импульсов низкого света, если относительный показатель
замедленной флуоресценции превышает 8. Откорректировав (при необходимости)
параметры прибора надо сделать 5 кругов замера показателей свечения образцов.
После завершения процедуры измерения необходимо сохранить полученные
данные.
Критерием токсичности выступает подавление и стимулирование ОПЗФ более
чем на 30% по сравнению с контролем, а также изменение морфологических
параметров розеток в сравнении с контрольными.
Сделать вывод о чувствительности тест-объекта к ионам тяжелых металлов.
Представление результатов
О степени острого токсического воздействия тестируемой воды на ряску
малую судят по разнице величины ОПЗФ (ЗФв, ЗФн) тест-культуры в контрольных
и опытных вариантах. Полученные данные по параметрам замедленной
флуоресценции (ЗФв, ЗФн, ОПЗФ) статистически обрабатываются (определение
средней величины в каждом варианте, стандартное отклонение σ) и представляются
в виде диаграмм.
Контрольные вопросы
 Чем обусловлено токсическое действие ионов тяжелых металлов на
растительные объекты?
 Каким образом может проявляться токсичность тех или иных ионов тяжелых
металлов, исследованных вами, на растительные объекты?
Рекомендованная литература
1. Мелехова О.П., Сарапульцева Е.И. Биологический контроль окружающей
среды: биоиндикация и биотестирование. М.: Академия. 2010.
2. Гольд, В.М. Теоретические основы и методы изучения флуоресценции
хлорофилла (Текст): Учебное пособие / В.М. Гольд, Н.А. Гаевский, Ю.С.
Григорьев, В.А. Попельницкий, А.В. Гехман; Красноярский государственный
университет. – Красноярск: изд. КГУ, 1984. – 82 с.
3. Будников Г.К. Тяжелые металлы в экологическом мониторинге водных систем
/ Г.К. Будников // Соросовский образовательный журнал. – 1998. - №5. – С. 2329.
57
4. Веселовский В.А., Веселова Т.В. Люминесценция растений: Теоретические и
практические аспекты. – М.: Наука, 1990. – 200 с.
5. Рубин, А.Б. Биофизические методы в экологическом мониторинге / А.Б. Рубин
// Соросовский Образовательный Журнал. -2000. -Т.6. -№4. - с.7-13.
6. Тахтаджян, А.Л. Жизнь растений (Lemnaceae). Т.6./А.Л. Тахтаджян. - М.:
Просвещение, 1982. С. 493-500.
7. Филенко, О.Ф. Основы водной токсикологии (Текст): учеб. Пособие для
ВУЗов / О.Ф. Филенко, И.В. Михеева. – М.: Колос, 2007. – 144 с.
8. Гольд, В.М. Теоретические основы и методы изучения флуоресценции
хлорофилла (Текст): Учебное пособие / В.М. Гольд, Н.А. Гаевский, Ю.С.
Григорьев, В.А. Попельницкий, А.В. Гехман; Красноярский государственный
университет. – Красноярск: изд. КГУ, 1984. – 82 с.
9. Будников Г.К. Тяжелые металлы в экологическом мониторинге водных систем
/ Г.К. Будников // Соросовский образовательный журнал. – 1998. - №5. – С. 2329.
10.Бубнов, А.Г. Биотестовый анализ – интегральный метод оценки качества
объектов окружающей среды: учебно-методическое пособие / А.Г. Бубнов.
С.А. Буймова, А.А. Гущин, Т.В. Извекова.; под общ. ред. В.И. Гриневича. –
Иван. хим.-технол. ун-т. – Иваново, 2007. – 112 с.
58
Лабораторная работа № 20
Биотестирование стоков городских очистных сооружений разными методами
В настоящее время оценка загрязнения окружающей среды (воды, почвы и
воздуха) производится главным образом на основе результатов химического
анализа. Однако из-за огромного числа видов самих загрязняющих веществ,
источников их выбросов, а также сложности и высокой стоимости анализов
организовать эффективный экологический мониторинг только средствами
аналитической химии практически нельзя. Это невозможно еще и потому, что
химико-аналитический контроль не учитывает комбинированный характер действия
загрязнителей, когда влияние каждого из них может дополнять, усиливать или
подавлять друг друга.
Между тем, многие из перечисленных трудностей удается преодолеть, если в
традиционную схему экологического контроля ввести методы биологического
анализа. Эти методы основаны на регистрации суммарного токсического действия
на тест-организм сразу всех или многих из компонентов загрязнения и, таким
образом, позволяет быстро и с минимальными затратами оценить, является ли
анализируемая проба загрязненной или нет. После процедуры биотестирования
дорогостоящему химическому анализу подвергаются лишь те немногие образцы
(районы), которые вызывают сомнения относительно их экологической
безопасности.
В целом при помощи биотестирования могут решаться следующие задачи:
 токсикологическая оценка качества промышленных и городских сточных вод
с целью выявления потенциальных источников их загрязнения;
 контроль в оперативном и непрерывном режимах аварийных и иных залповых
сбросов высокотоксичных сточных вод;
 оценка степени токсичности сточных вод на разных стадиях их образования и
очистки на самих предприятиях;
 контроль токсичности сточных вод, подаваемых на сооружения
биологической очистки, с целью предупреждения поступления токсичных
веществ в биоценоз активного ила и недопущения его гибели;
 контроль качества работы очистных сооружений через оценку токсичности
выходящих после очистки вод;
 определение уровней безопасного разбавления сточных вод для организмов
гидробионтов при установлении предельно допустимых сбросов
предприятиями;
 токсикологическая оценка природных вод, используемых для санитарнобытовых целей.
К сожалению, несмотря на столь большие возможности, биологические
методы контроля загрязнения окружающей среды пока лишь ограничено
используются для решения практических задач. Это вызвано тем, что среди
известных и утвержденных методов для биомониторинга может быть применено
очень малое число приемов, позволяющих быстро и точно оценить величину
токсического действия пробы на тест-организм.
Водоросли являются одним из важнейших звеньев природных водоемов.
Входя в состав фитопланктона и фитобентоса, они, поглощая солнечную энергии,
осуществляют процесс первичной продукции в водной экосистеме, а также
59
определяют ее самоочищающую способность. Поэтому не случайно, что
водорослевые тест-организмы всегда используются в биотестировании загрязнения
водных источников.
Оценка токсичности природных и сточных вод на водорослях производится
как в остром, так и в хроническом экспериментах. В первом случае степень действия
загрязняющих веществ определяется в пределах одного поколения водорослей на
основе использования, как правило, достаточно оперативных методов. В
хронических опытах, в которых оценивается характер неблагоприятного
воздействия загрязнителей на весь цикл развития клетки, наблюдения ведутся на
нескольких поколениях и потому значительно дольше. Согласно рекомендованной
методике, изложенной в руководящем документе по биотестированию воды (РД
118-02-90), такой эксперимент должен проводиться в течение 14 суток. При этом
требуется большое количество химической посуды и реактивов, а также выделения
значительных рабочих площадей для выполнения данного варианта
биотестирования.
Одной из перспективных разработок такого рода является разработанный в
СФУ и запатентованный в России культиватор КВМ-05. Прибор позволяет в
одинаковых условиях одновременно выращивать до 24 проб водоросли и, таким
образом, проводить биотестирование нескольких проб воды. В качестве показателя
токсичности образцов используется степень изменения величины прироста
численности клеток тест-культуры одноклеточной, зеленой водоросли хлорелла за
определенный период времени (обычно 22 часа). Прирост культуры оперативно
определяется по измерению оптической плотности суспензии водоросли в конце
культивирования. Ее величина в достаточно широком диапазоне изменяется прямо
пропорционально количеству клеток в суспензионной культуре микроводоросли.
Таким образом, хронические токсикологические эксперименты на водорослях,
благодаря культиватору КВМ-05, можно проводить в течение одних суток и с
меньшими материальными затратами.
Ряска малая является также представителем продуцентов, но имеет более
высокую структурную организацию и в биотестировании может отражать действие
поллютантов на высшие водные растения.
Ряску
называют
«экологической
дрозофилой».
Особенности
морфологического строения, высокая скорость размножения, чувствительность к
среде обитания – все это делает ряску удобным объектом для биологического
тестирования. В биотестировании широко используют быструю изменчивость
морфологических признаков ряски, которые легко оценивать визуально.
Так, например, основным методом оценки токсического эффекта на ряску
малую, предусмотренном в международном стандарте (ISO/DIS 20079), является
учет ингибирующего действия токсикантов на рост популяции. Также фиксируют
все морфологические отклонения от нормы (контроля) под действием загрязнителя:
различные степени пожелтения, хлорозы, некрозы, увядание листьев,
специфические реакции. Это позволяет избежать использования дополнительного
оборудования и получить представление о токсичности проб воды. Однако этот
метод несет скорее качественную оценку и требует достаточно длительного времени
для получения результата (до 7 дней и более). Поддержание стерильности культуры
и тест-системы усложняет работу в целом.
60
Использование физиологических реакций организма позволяет получить
более ранние сведения о состоянии организма, до того, как изменения проявятся в
видимых признаках (изменение морфологии, задержка роста). Чтобы
зарегистрировать начальные нарушения клеточного метаболизма, которые имеют
место на мембранном уровне организации клеток, используют биофизические
методы диагностики состояния клеток.
Сюда относятся различные спектральные и люминесцентные методы. В их
основе лежит идея, что хлорофилл, находящийся в фотосинтетических мембранах,
является природным датчиком состояния клеток водорослей и высших растений.
При нарушении состояния фотосинтетических мембран под действием какого-либо
фактора изменяются оптические свойства хлорофилла, которые и служат
источником информации состояния клеток. Этому обстоятельству способствует то,
что в фотосинтетическом аппарате хлорофилл-белковый комплекс фотосистемы II,
ответственный за разложение воды и выделение кислорода, является
чувствительной мишенью для таких внешних факторов, как экстремальные
температуры, избыточная освещенность, соли тяжелых металлов, высушивание,
повышение содержания солей в питательной среде.
Методы регистрации различных параметров флуоресценции хорошо показали
себя при изучении влияния загрязнителей на наземные высшие растения.
Преимущество данных биофизических методов заключается в том, что они
позволяют получать обширную информацию в ненарушенных объектах (Гольд и
др., 1984).
Источником оперативной информации о характере функционирования
фотосинтетического аппарата может являться процесс замедленной флуоресценции
(ЗФ) хлорофилла, описанный Арноном и Стреллером в 1951 году. Это явление
состоит в том, что после светового возбуждения в фотосинтезирующих клетках
наблюдается слабое, длительно затухающее свечение, испускаемое хлорофиллом.
Это свечение возникает уже после прекращения быстрой флуоресценции за счет
энергии, выделяемой в ходе темновых реакций первичных фотопродуктов
фотосинтеза в реакционном центре.
На кафедре экологии и природопользования СФУ разработан флуориметр
Фотон 10, позволяющий проводить регистрацию параметров замедленной
флуоресценции для быстрой и количественной оценки воздействия токсических
веществ на растительные тест-организмы с использованием относительного
показателя
замедленной
флуоресценции
(ОПЗФ).
Данный
показатель,
представляющий отношение интенсивностей миллисекундной замедленной
флуоресценции при возбуждении светом высокой (ЗФв) и низкой интенсивности
(ЗФн), позволяет выделять до 100 градаций состояния тест-организма и работать в
широком диапазоне токсических воздействий (Григорьев и др., 1996). Благодаря
своей относительности данный показатель не зависит от количества хлорофиллсодержащей ткани растений и позволяет проводить исследования даже с очень
малым количеством тест-объекта.
Цель: изучить токсичность очищенных стоков городских очистных
сооружений г. Красноярска.
Задачи:
61
 Исследовать токсичность стоков городских очистных сооружений
г. Красноярска;
 Сравнить результаты биотестирования стоков городских очистных
сооружений, полученные разными методами.
Оборудование и реактивы:
Культиваторы КВ-05, КВМ-05, измеритель плотности суспензии ИПС-03,
свежевыращенная культура водоросли хлорелла (50%), вата, наборы флаконов с
пробками в штативах, среда Тамия (50%), дозаторы (1-5 мл), сода пищевая, губки на
пинцете, стаканчики (50-100 мл), мерный цилиндр (100 мл), термометр, культура
ряски малой, флуориметр Фотон 10, набор кювет для флуориметра и колец для
кювет, набор флаконов, среда Штейнберга (100%), пробы стоков городских
очистных сооружений.
Ход работы (хлорелла, метод оценки по приросту культуры)
Приготовить 125 мл суспензии водоросли с оптической плотностью 0,005 для
заправки флаконов. Для этого взять профильтрованную через 4 слоя марли (или
вату) пробу культуры водоросли из культиватора КВ-05 объемом 20 мл и, измеряя
оптическую плотность суспензии прибором ИПС-03, довести ее значение до 0,125
путем разбавления свежей 50% средой Тамия. Полученная суспензия водорослей
разливается по 1 мл дозатором в 24 мл тестируемой пробы воды, при этом она
разбавляется в 25 раз до оптической плотности 0,005 и концентрации среды Тамия
2%.
В качестве контроля используется дистиллированная вода. В каждом из
вариантов опыта используется по 4 флакона, которые последовательно, начиная с
контрольной пробы, устанавливаются в кассету культиватора со стартовой метки.
При оптимальном режиме (T=36±0,5 °C, максимальной интенсивности света и
скорости вращения кассеты с реакторами – 30 об/мин) прирост численности клеток
за время проведения хронического токсикологического эксперимента (22 часа) в
контроле составляет 25-30 раз. Прибор позволяет в одном опыте протестировать на
фитотоксичность пять образцов природной или сточной воды вместе с одной
контрольной пробой.
Характер воздействия тестируемых вод оценивается путем сравнения
суточного прироста численности клеток водорослей в контрольном и опытном
вариантах. Контроль за численностью клеток проводится посредством измерения
оптической плотности суспензии.
Расчет показателя токсичности (КТ) проводится по формуле:
,
где Dк и Dт - величины оптической плотности контрольного и тестируемого
образца, соответственно, после 22 часов культивирования.
Превышение КТ величины 0,2 свидетельствует о токсичности пробы воды.
При этом суточный прирост в контроле должен быть не менее 25 раз.
В случае если показатель токсичности воды превышает применяемый
пороговый уровень (КТ=0,2), то возникает необходимость измерения величины ее
биологически
безопасного
разведения,
которая
выступает
в
роли
токсикологического критерия качества тестируемой воды. В таких случаях
готовится несколько разведений тестируемой воды кратных двум. Для этого берется
62
5 стаканчиков или баночек объемом 100 мл, в которые шприцом-дозатором
разливается по 48 мл тестируемая и разбавляющая вода по схеме:
1 - тестируемая вода без разведения (24 мл);
2 - разведение в 3 раза (12 мл тестируемой воды +24 мл дистиллированной);
3 - разведение в 9 раза (12 мл разведения 3 + 24 мл дистиллированной воды);
4 - разведение в 27 раз (12 мл разведения 9 + 24 мл дистиллированной воды);
5 - разведение в 81 раз (12 мл разведения 27 + 24 мл дистиллированной воды)
12 мл
контроль
36 мл
тестируемой
воды
24 мл воды
12 мл
24 мл воды
12 мл
24 мл воды
12 мл
12 мл
24 мл воды
Чтобы упростить процедуру приготовления разбавлений тестируемой воды
надо сначала разлить по 24 мл дистиллированной воды в 4 последних стаканчика. В
первый вносится 36 мл тестируемой пробы воды. После этого тем же шприцомдозатором отбирается 12 мл содержимого первого стакана и переносится во второй
стакан, из второго в третий, из третьего в четвертый, из четвертого в пятый, а из
пятого 12 мл отбрасывается совсем. При этом после каждого переноса порции воды
следует перемешивать содержимое очередного стакана двукратным заполнением и
сливом в него воды из шприца. Во все приготовленные таким образом пробы воды
объемом по 24 мл вносится по 1 мл суспензии хлореллы оптической плотности
0,125, выращенной на 50% среде Тамия.
Все разведения тестируемой и контрольной проб воды разливаются по 6 мл в
4 флакона каждая и загружаются в один культиватор.
Представление результатов
Полученные результаты занести в таблицу.
Показатель
Оптическая плотность (D)
D
КТ
средняя
Вариант
кювета 1 кювета 2 кювета 3 кювета 4
Контроль
Проба без
разбавления
Разбавление 3
Разбавление 9
Разбавление 27
Разбавление 81
Для удобства использования показателя уровня биологически безопасного
разведения вводится его обратная величина (1/УББР), которая рассчитывается по
формуле:
, где
КТм – показатель токсичности разбавления, имеющего величину менее 0,2;
63
КТб – показатель токсичности разбавления, имеющего величину более 0,2;
М – обратная величины степени разбавления, имеющего величину КТ
меньшую 0,2;
Б – обратная величина степени разбавления, имеющего величину КТ большую
0,2;
0,2 – показатель (критерий) токсичности воды.
Пример: при разбавлении пробы воды в 9 раза КТ составил величину 0,34, а
при разбавлении 27 раз – 0,11. Тогда величина М будет равна 1/27, а Б – 1/9, КТм –
0,11, КТб – 0,34.
18 мл воды
18 мл воды
2 мл
18 мл воды
2 мл
18 мл воды
2 мл
27 мл
тестируемой
воды
2 мл
2 мл
контроль
18 мл
2 мл
УББР = 15,1 раз.
Ход работы (хлорелла, метод оценки по ЗФ хлорофилла культуры)
Перед биотестированием культура водоросли Chlorella vulgaris, выращенная
на 10% среде Тамия в культиваторе КВ-05, профильтровывается через 4 слоя марли
или вату и разбавляется до оптической плотности 0,400±0,020 10% средой Тамия.
Измерение
светопропускания
суспензии
водоросли
проводится
на
специализированном приборе ИПС-03.
Проведение биотестирования
Приготовленная таким образом тест-культура водоросли вносится по 2 мл в 6
стаканов с 18 мл контрольной и тестируемых проб воды. При этом в результате 10кратного разбавления засеваемой культуры содержание элементов питания в
тестируемой воде, необходимых для обеспечения роста клеток водоросли, будет
соответствовать 1% среде Тамия, а исходная оптическая плотность тест-культуры
водоросли будет равна 0,040±0,002.
9 мл
9 мл
9 мл
9 мл
9 мл
Культура хлореллы D=0,400±0,020 10% среда Тамия
Содержимое каждого стакана разливается по 4 мл во флаконы-реакторы (по 4
флакона на каждый вариант тестируемой воды, включая контрольную пробу).
Световая экспозиция проб культуры водоросли хлорелла, внесенные во
флаконы-реакторы, производится в многокюветном культиваторе КВМ-05. Прибор
позволяет в одинаковых и контролируемых условиях по температуре,
64
интенсивности света, снабжению СО2 (0,03%) и перемешиванию одновременно
культивировать (экспонировать) 24 пробы культуры водорослей.
Перед проведением биотестирования прибор предварительно настраивается на
температуру 36±0,5 °С.
Все флаконы с тестируемой водой строго по вариантам устанавливаются в
предварительно включенный в сеть и настроенный на температуру 36±0,5 °С
культиватор КВМ-05.
Снятие результатов токсикологического эксперимента
Через 1 час световой экспозиции выключить культиватор КВМ-05 из сети и
перенести содержимое флаконов в специальные кюветы для измерения ЗФ. Для
этого флаконы надо извлечь из культиватора и установить в штатив. Затем
последовательно перелить содержимое флаконов в кюветы.
Измерение параметров ЗФ производится после установления кювет с
тестируемыми пробами в кассету флуориметра Фотон 10. Для этого включить
управляющий компьютер прибора, запустить программу «Foton 10». После
установления связи между компьютером и прибором, перевести программу в режим
загрузки кювет, нажав иконку «ОПЗФ». Загружать надо с т.н. «нулевой» кюветы,
которая должна содержать 4 см3 дистиллированной воды. После загрузки всех кювет
перевести программу в режим «Быстрые настройки» и затем нажать иконку
«Больше». В появившемся окне «Параметры замера» выставить параметры, в
близком соответствии с рекомендуемыми (рис.10).
Рис. 10. Окно расширенных настроек флуориметра «Фотон-10»
Выставив необходимые параметры замера (их можно также загрузить из
файла), нажать на кнопку «СТАРТ». Кассета сначала установит в оптический блок
прибора кювету «0», а затем последовательно все остальные кюветы. На экране
монитора будут отображаться номер кюветы и круга и значения регистрируемых
показателей.
Если для каких-либо кювет величины показателей будут слишком высокими
(зашкаливать), или величина ОПЗФ в контрольном варианте выходит за пределы
значений 4-8, то необходимо прервать процесс измерения нажатием кнопки
«СТОП». При этом замер прекратится после завершения выполнения замера
текущей кюветы. Снизив чувствительность или усиление прибора снова запустить
65
замер нажатием кнопки «СТАРТ». В случае низкого значения ОПЗФ надо
уменьшить величину параметра «Низкий свет, мс», и наоборот увеличить
длительность импульсов низкого света, если относительный показатель
замедленной флуоресценции превышает 8. Откорректировав (при необходимости)
параметры прибора надо сделать 5 кругов замера показателей свечения образцов.
После завершения процедуры измерения необходимо сохранить полученные
данные.
О степени острого токсического воздействия тестируемой воды на водоросли
судят по разнице величины ОПЗФ тест-культуры в контрольных и опытных
вариантах. С этой целью для каждого разведения по результатам четырех
параллельных определений вычисляют среднее значение ОПЗФ.
Рассчитывают относительную (в %) разницу величины ОПЗФ для каждого
разведения по сравнению с контролем (I):
I=(Xк – Xо) / Xк  100 %, где
Xк и Xо – средние значения ОПЗФ в контроле и в опыте, соответственно.
Критерием токсичности пробы воды является снижение средней величины
ОПЗФ по сравнению с контрольным вариантом на 25% и более в случае подавления
фотосинтеза тест-культуры или ее повышение на 25% и более – при стимуляции.
Установление качества тестируемой воды
Качество тестируемой воды устанавливается на основе ее токсикологических
характеристик через величину токсичной кратности разбавления вод и водных
вытяжек. Для этого из результатов биотестирования разведений пробы воды,
кратных трем, выбирают то разбавление, для которого индекс отклонения (I)
превысил критерий токсичности воды. При этом процент отклонения в величине
ОПЗФ по сравнению с контролем, проявляющийся в виде подавления фотосинтеза,
приводятся со знаком (+), а его стимуляции со знаком (–).
Если в ряду разбавлений имеются отклонения в ОПЗФ как в ту, так и другую
сторону, то качество воды устанавливается по наибольшей величине разбавления,
для которой превышен критерий токсичности. Если критерий токсичности не
превышен ни при одном разбавлении воды, включая ее исходный неразбавленный
вариант, то проба считается нетоксичной.
Токсикологические характеристики качества испытуемой воды
Величина разбавления тестируемой воды, при Качество воды
которой превышен критерий токсичности
1 (неразбавленная)
слаботоксичная
3
среднетоксичная
9
токсичная
27
сильнотоксичная
81
гипертоксичная
Пример: Значения отклонения в % от контроля средней величины ОПЗФ тесткультуры водоросли для 1, 3, 9, 27 и 81 кратного разбавления тестируемой воды
составили соответственно: 83, 65, 37, 28 и 7. Тогда, руководствуясь таблицей,
качество воды определяется как «сильнотоксичная», поскольку критерий
токсичности (25% подавление) превышен для 27-кратного разбавления.
Величина токсичной кратности разбавления (ТКР)
66
ТКР вод и водных вытяжек, если превышен критерий токсичности в виде 25%
подавления или 25% стимуляции ОПЗФ, рассчитывается по формуле:
Рб – величина разбавления (большая), при которой индекс отклонения был
ниже критерия токсичности;
Рм – величина разбавления (меньшая), при которой индекс отклонения был
выше критерия токсичности;
Iб и Iм – величины соответствующих этим разбавлениям индексов отклонения
в ОПЗФ, выраженных в долях.
В качестве Рб и Рм берется та пара наибольших разбавлений, между которыми
имеет место переход индекса величины установленного критерия токсичности.
Пример: Значения отклонения в долях от контроля средней величины ОПЗФ
тест-культуры водоросли для 1, 3, 9, 27 и 81 кратного разбавления тестируемой
воды составили соответственно: 0,83; 0,65; 0,37; 0,28; и 0,07. Анализ этих данных
показывает, что переход через критерий токсичности в виде 25% подавления
фотосинтеза (в долях это 0,25) имеет место между разбавлениями тестируемой воды
в 27 (Рм) и 81 (Рб) раз. Тогда, руководствуясь формулой, сначала рассчитывается
показатель степени выражения, а затем величина ТКР:
ТКР = 101,50 = 31 раз
Аналогичным образом проводится расчет токсической кратности разбавления
и для других кратностей разбавлений тестируемых вод и водных вытяжек.
Ход работы (ряска, метод по ЗФ хлорофилла)
Подготовка тест-объекта ряски малой
Отбирают из культуры ряску, выбирая трехлистецовые розетки, одинаковые
на вид, активно растущие, чистые, зеленые, неповрежденные, здоровые на вид. В
кюветы для флуориметра «Фотон-10» разлить по 4 мл дистиллированной воды,
положить на поверхность колечки для фиксации в центре кюветы тест-объекта.
Отобранную ряску по одной розетке поместить в кюветы. Кюветы с ряской
проанализировать на флуориметре при оптимальных настройках и выбрать из всей
совокупности экземпляры с близкими по ЗФв значениями.
Для биотестирования используют флаконы емкостью 50 мл. Опыты проводят
в трехкратной повторности, поэтому для каждого разведения готовится 150 мл
раствора. Схема разведения представлена ниже.
100% среда Штейнберга
67
2 мл пробы
+145 мл воды
3 мл
6 мл пробы
+141 мл воды
3 мл
17 мл пробы
+130 мл воды
3 мл
50 мл пробы
+97 мл воды
3 мл
147 мл пробы
воды
3 мл
3 мл
контроль
147 мл воды
Для приготовления контрольного раствора в мерный цилиндр наливается 3 мл
100% среды Штейнберга и доводится до 150 мл дистиллированной водой.
Полученный раствор разливается во флаконы по 50 мл.
Во флаконы с готовыми растворами помещается по одной розетке ряски.
Флаконы вставляются в кассету камеры биотестирования, в которых
поддерживается постоянное освещение и температура 27-28° C.
Получение результатов: экспозиция длится в течение 22 часов. После чего
проводится анализ морфологических изменений розеток (результаты описаний
записать).
Затем ряска анализируется на флуориметре Фотон 10 (измерение проводиться
в 7 кругов, для расчетов нулевой круг не берется, из оставшихся выбрать 3
последовательных круга с близкими значениями).
Представление результатов
Полученные данные по замедленной флуоресценции статистически
обрабатываются (определение средней величины в каждом варианте, стандартное
отклонение σ) и представляются в виде диаграмм.
Критерием токсичности выступает подавление и стимулирование ОПЗФ более
чем на 30% по сравнению с контролем.
Контрольные вопросы
 Чем может быть обусловлено токсическое или стимулирующее действие
стоков городских очистных сооружений на тест-объект?
 Чем объясняется использование разбавленных питательных сред в
биотестировании?
68
ЧАСТЬ 4. МЕТОДЫ БИОТЕСТИРОВАНИЯ В ОЦЕНКЕ ТОКСИЧНОСТИ
ДРУГИХ СРЕД
Лабораторная работа № 21
Оценка токсичности проб почвы различными методами биотестирования
Отбор, транспортировка, хранение проб почвы
Методы отбора, транспортировки, хранения, подготовки к выполнению
биотестирования должны обеспечить неизменность состава проб почвы в интервале
времени между отбором и их анализом.
При отборе проб почвы должна быть определена протяженность и топография
зон загрязнения. Участки для отбора проб почвы должны хорошо отражать
структуру района исследования: почвенный покров, материнскую породу, рельеф,
геологические и гидрологические характеристики.
Необходимым условием отбора проб почвы является предохранение их от
вторичного загрязнения (в том числе атмосферных осадков) на всех этапах отбора и
подготовки проб к биотестированию.
Для характеристики загрязнения почвы на определенной площади отбираются
объединенные пробы почвы. Объединенную пробу составляют путем смешивания
единичных проб почвы, отобранных в разных точках данной пробной площадки
размером не менее 10 х 10 м (100 м2), которая располагается в типичном для данной
территории месте. На каждые 20 га площади закладывается не менее одной пробной
площадки. При обследовании площади менее 0,5 га размер площадки уменьшается и
составляет 5х5 м.
Объединенную пробу составляют из 5-10 или 15-20 единичных проб (в
зависимости от однородности исследуемого участка), равномерно размещенных на
пробной площадке.
Взятие смешанного образца проводится следующим образом: лопатой делается
прикопка на глубину до 30-40 см, отмечается мощность и цвет верхнего горизонта
или слоя и изменения в цвете и состоянии от поверхности вглубь, после чего со
стенки берется образец на полную глубину горизонта (слоя) массой 1-2 кг,
предварительно очистив поверхность почвы от растений. Отбирается также образец
поверхностной пробы до глубины 5-10 см той же массы.
Единичные пробы ссыпают на крафт-бумагу или клеенку, тщательно
перемешивают, квартуют (сокращают) в 3-4 раза (почву разравнивают на бумаге в
виде квадрата, делят на четыре части, две противоположные части отбрасывают, две
оставшиеся части перемешивают). Оставшуюся после квартования почву делят на 69 квадратов, из центра которых отбирают примерно одинаковое количество почвы,
обеспечивая захват всей толщины слоя, в банки из стекла с герметичной крышкой,
таким образом, получают объединенную пробу, масса которой приблизительно 2 кг
(1 кг на анализ и 1 кг для хранения дубликата). При отборе проб почвы составляют
протокол, в котором указывают цель пробоотбора, число, время, место отбора
пробы, номер пробы, ставят подпись и расшифровывают подпись отбиравшего. На
банку, контейнер наклеивают этикетку с указанием номера пробы, места, даты и
времени ее отбора.
Транспортируют пробы при температуре окружающего воздуха от +4 до +28
°С.
69
Пробы почв должны быть подвергнуты анализу не позднее 12 ч от момента
отбора. При невозможности обеспечения данного условия, объединенные пробы в
естественно влажном состоянии хранят в холодильнике (в банках с притертой или
плотно завинченной крышкой) не более одной недели при температуре от +2 до
+4°С. Пробы почв не консервируют.
Приготовление водной вытяжки из почв
В лаборатории отобранные на токсикологический анализ почвы сначала
разрыхляют вручную металлическим шпателем и освобождают от материала,
заведомо относящегося к инородным (случайным) механическим включениям
(возможные промышленные, строительные бытовые отходы и т.п.), а также
галечника, обломков камней, корневищ, веток. Решение об изъятии таких
включений из подготавливаемой пробы принимают на основе изучения полевого
описания конкретного места ее отбора; эти сведения должны являться обязательной
частью сопроводительной документации к пробам, направленным на
токсикологический анализ.
Перед биотестированием пробы просеивают сквозь сито с размером ячей 1 мм и
доводят до воздушно-сухого состояния. Для чего пробу подсушивают в вытяжном
шкафу или в хорошо проветриваемом помещении, размещая ее (в зависимости от
массы и естественной влажности) в стеклянных кристаллизаторах подходящей
вместимости, на стекле или на чистых листах плотной бумаги.
Размещенные таким образом пробы почвы выдерживают открытыми не менее
2-х часов при комнатной температуре и влажности воздуха. Подготовленную пробу
распределяют на ровной поверхности слоем толщиной не более 1 см и отбирают
ложкой или шпателем из 5-ти точек методом конверта. Не допускается
предназначенные для исследования на токсичность пробы почв подвергать тепловой
обработке, поэтому гигроскопическая влажность почвы определяется в отдельном
образце.
Проба с массой приблизительно 300 г делится на две равные части: для
биотестирования и для определения гигроскопической влажности после
высушивания до постоянной массы, что необходимо для пересчета воздушно-сухой
пробы на массу абсолютно-сухой по формуле:
М абс.сух .
ΔMвозд.сух.=
К ср
где ΔMабс.сух — масса абсолютно-сухого образца, г; ΔМвозд.сух. — масса воздушносухого образца почвы, г; Кср — коэффициент пересчета массы воздушно-сухой
пробы на массу абсолютно-сухой (среднее расчетное значение из трех измерений).
Для определения массовой доли почвы в воздушно-сухой пробе необходимо:
1. Взвесить три пустых высушенных бюкса с крышками и зафиксировать их
массы (Мoi ), затем взвесить эти же бюксы с навесками воздушно-сухой пробы
(около 1 г) и зафиксировать их массы (Мвозд.сух.i).
2. Установить открытые бюксы с воздушно-сухими пробами в сушильный
шкаф. Пробы выдержать в сушильном шкафу в течение 3 ч при температуре от 105
до 115 °С. Закрыть бюксы притертыми крышками, перенести их в эксикатор и
выдержать там до полного остывания (около 40 мин). Взвесить бюксы с навесками
абсолютно-сухой пробы и зафиксировать их массы (Мабс.сух.i). После взвешивания
пробы почвы следует повторно высушить в течение 2 ч, затем охладить в эксикаторе
70
и снова взвесить. После первого и второго высушивания допустимое расхождение в
массе не должно превышать 0,005 г. В противном случае высушивание следует
повторить. Точность взвешивания для всех экспериментов должна составлять 0,001
г.
3. Рассчитать значения коэффициента пересчета Кi для каждого эксперимента
по формуле:
Ki 
M абс.сух .i  M oi
M в озд.сух .i  M oi
,
где Кi — коэффициент пересчета в i-том измерении; Мабс.сух.i — масса бюксы с
абсолютно-сухим образцом в i-м измерении, г; Mвозд.сух.i — масса бюксы с воздушносухим образцом в i-м
измерении, г; Мoi — масса пустой бюксы в i-м измерении, г.
4. Так как по результатам измерений получено три значения коэффициента,
производят расчет его среднего значения (Kср.) по формуле:
К ср. 
К1  К 2  К 3
.
3
Далее среди трех величин Кi рассчитывают размах (R) полученных значений с
учетом максимальной (Kmax) и минимальной (Kmin) величин по формуле:
R
K max  K min
100%.
K ср
Если полученное значение R > 10 %, то эксперимент повторяют, устранив
причину неудовлетворительных результатов.
Водную вытяжку из почвы для биотестирования готовят в соотношении: 1
часть почвы (с учетом гигроскопической влажности) и 4 части культивационной
воды (допускается использование дистиллированной воды).
Для приготовления водной вытяжки из почвы отвешивают 100-200 г пробы
почвы в воздушно-сухом состоянии, пересчитав ее массу на массу абсолютно-сухой.
Масса пробы на стадии перед приготовлением водной вытяжки должна быть
достаточной для получения необходимого объема экстракта при проведении
биотестирования во всех предполагаемых разведениях с учетом контрольных
испытаний. Навеску почвы помещают в колбу емкостью 1000 см3 и приливают 4кратное количество культивационной воды.
Далее на аппарате для встряхивания жидкости полученную смесь в течение 2-х
часов встряхивают, после чего отстаивают в течение 30 мин. Надосадочная
жидкость сифонируется, а затем профильтровывается через бумажные обеззоленные
фильтры "белая лента" или через мембранные фильтры с диаметром пор 3,5 мкм.
Перед тем как вылить вытяжку на фильтр, содержимое склянки или колбы
встряхивают, чтобы взмутить присутствующие взвешенные частицы почвы. На
фильтр стараются перенести всю взвесь. При выливании струю суспензии
направляют на боковую двойную стенку бумажного фильтра, но не на дно фильтра,
так как при выливании на дно бумага может легко порваться. Фильтрация
осуществляется с помощью вакуумного водяного или электрического насоса. Для
фильтрации применяется слабый вакуум (не более 20 мм рт. ст.). Первые порции
фильтрата часто бывают мутными и их нужно несколько раз перефильтровать до
прозрачного раствора или отцентрифугировать.
71
При повышенной мутности водной вытяжки из почв (гумусированные,
дерново-подзолистые, торфяные и др. почвы) допускается отстаивание в
холодильнике до 5 суток. Затем жидкость над осадком сифонируется. Вытяжка из
почв должна иметь величину рН в диапазоне 7,0-8,2. При необходимости вытяжку
перед серийным разбавлением предварительно нейтрализуют. После нейтрализации
пробы аэрируют 10-20 мин для стабилизации рН. Непосредственно перед началом
биотестирования пробы доводят до температуры 20 ± 2 °С. Биотестируемая проба
водной вытяжки из почв должна иметь концентрацию растворенного кислорода не
ниже 6 мг/дм3, в противном случае пробу аэрируют.
Биотестирование проводится согласно методикам описанным в лабораторных
работах № 11, 18, 19.
72
Лабораторная работа № 22
Замедленная флуоресценция водоросли хлорелла
в оценке иммунитета клубней картофеля
Существование огромного числа фитопатогенных микроорганизмов не
ограничивает жизненность высших растений и их фитоиммунитет является скорее
правилом, а восприимчивость – исключением. Отмечается, что из большого
разнообразия паразитарных микроорганизмов способных проникать в растение
каждый вид поражается лишь относительно небольшим их числом, по отношению
же ко всем остальным растение обладает так называемым видовым иммунитетом.
Исследование биохимических механизмов видового иммунитета и их
своевременная оценка должны способствовать выявлению устойчивости растения в
целом.
Покой клубней картофеля, подобно состоянию покоя практически всех видов
сосудистых растений, разделяется на два отчетливо наблюдаемых периода:
естественный (глубокий) и вынужденный. Известно, что степень устойчивости
растений к фитопатогенам тесно связывают с физиологическим состоянием их
тканей и органов и, в частности, с эндогенным ритмом процессов роста. Как
правило, молодые, активно растущие растения обладают гораздо более высокой
устойчивостью к болезням, чем старые. Клубни картофеля также более устойчивы к
патогенам в состоянии глубокого покоя, когда подавлен рост меристематических
тканей – «глазков». Однако состояние покоя свойственно не всему клубню, а лишь
его меристеме. Паренхимные ткани покоящихся клубней находятся в состоянии
активной жизнедеятельности, о чем, в частности, свидетельствует их более активная
реакция на поранение (образование раневой перидермы, биосинтез крахмала,
фенолов и др.) по сравнению с клубнями, вышедшими из покоя.
Продолжительность периода покоя клубней картофеля является генетическим
признаком сорта, а также зависит от условий внешней среды, при которых
происходит формирование клубней и последующее их хранение.
Во время покоя блокируется ряд биохимических процессов, сопровождающих
нормальный рост клеток. Это происходит благодаря действию эндогенных
ингибиторов роста, среди которых обнаружены фенольные соединения (ФС) –
хлорогеновая и кофейная кислоты, скополетин и соединение терпеноидной природы
– абсцизовая кислота. Так, во время глубокого покоя в тканях клубней картофеля
накапливаются скополетин и кофейная кислота, содержание которых в момент
выхода из покоя уменьшается. Оба этих соединения в период глубокого покоя
подавляют рост растительной ткани и спор микроорганизмов.
Принято считать, что если при видовом иммунитете устойчивость растений к
паразитарным микроорганизмам является абсолютной, то при сортовом иммунитете
защитные силы растений более ограничены. Так один сорт будучи устойчивым к
одной расе паразита может поражаться другой. Это происходит вследствие того, что
каждый ген устойчивости ответственен за невосприимчивость растения не вообще к
возбудителю болезни, грибу, бактерии или вирусу, а лишь к отдельным его
разновидностям. В то же время, большинство патогенных микроорганизмов
представляют из себя популяции, состоящие из нескольких физиологических рас,
иногда значительно различных по вирулентности.
73
Изучение устойчивости картофеля к разным расам фитофторы показало, что
она контролируется соответствующими генами устойчивости. Количество этих
генов обуславливает устойчивость к тому или иному числу рас патогена. Однако в
последнее время в связи с повсеместным распространением высоковирулентных рас
гриба фитофторы, большое значение имеет полевая, или полигенная устойчивость,
направленная не против каких-то определенных конкретных рас или видов
фитопатогенных микроорганизмов, а против всех одновременно. В этом случае
предполагается не полная несовместимость, а лишь относительная устойчивость.
При полевой устойчивости поражение происходит медленнее, спорообразование
растягивается и тем самым ослабляется угроза возникновения эпифитотий.
Согласно современным представлениям, все защитные механизмы растений, в
том числе клубней картофеля, по отношению к фитопатогенам можно схематически
представить в виде четырех обособленных групп.
1. физиологическая резистентность – патоген лишен возможности контакта;
2. конституционные защитные вещества – стероидные гликоалкалоиды и ФС;
3. продукты превращения конституционных веществ;
4. синтез фитоалексинов и лишение паразита жизненно-важных метаболитов.
Фитоалексины это – соединения, которые аккумулируются в ответ на
разнообразные травмы растительной ткани и играют ведущую роль в устойчивости
растений к болезням. Именно эти соединения относят к факторам
постинфекционной природы, поскольку их содержание значительно возрастает
лишь в ответ на инвазию патогена либо иное повреждающее действие. Чаще всего
накопление фитолексинов происходит при инфицировании растений грибами или
бактериями, а также при воздействии физических и химических факторов.
Однако немаловажен факт взаимодействия защитных механизмов. Наиболее
четко он прослеживается на примере специфической для растительного мира
реакции сверхчувствительности (СВЧ), которая является важным фактором
видового иммунитета и сортовой устойчивости. Механизм СВЧ достаточно сложен
и многостадиен. Общим результатом его служит гибель патогена вследствие
отравления либо недостатка необходимых метаболитов. Одна из важнейших
ступеней СВЧ – это некротизация ткани, прилегающей к месту проникновения
фитопатогена. Исследования этого процесса обнаружили обратную зависимость
между устойчивостью и количеством некротизирующихся клеток. В механизме
развития СВЧ решающую роль отводят фитоалексинам, а также ФС, системе
полифенол-полифенолоксидаза, и гликоалкалоидам.
Цель работы: определить устойчивость клубней разных сортов картофеля к
фитопатогенам методом регистрации показателей замедленной флуоресценции.
Оборудование, материалы и реактивы:
Флуориметр Фотон 10, центрифужная соковыжималка, клубни картофеля
разных сортов, стаканы (50-100 мл), комплект кювет, дозаторы (1-5 мл),
наконечники для дозаторов (1-5 мл), 50% среда Тамия, дистиллированная вода,
сода, губка с держателем, культура микроводоросли хлорелла, выращенная на 10%
среде Тамия, вата, воронка, нож.
Ход работы:
1. Подготовка тест-организма:
74
В качестве тест организма используется термофильный штамм культура
хлореллы, выращенная на 10% среде Тамия. Для работы приготовить суспензию
водоросли с оптической плотностью D=0.2, доводя раствор свежей 10% средой.
2. Получение гомогената клубней картофеля:
Клубни каждого сорта промыть от грязи и очистить. Выделение клеточного
сока (гомогената тканей) провести с помощью центрифужной соковыжималки.
Чтобы уменьшить до минимума изменения в образцах клеточного сока после его
выделения, общая продолжительность процедуры получения сока и его
использование не должна превышать 5 минут.
3. Работа с Фотоном 10:
Гомогенат разлить в кюветы в трех повторностях по 2 мл. В контрольных
вариантах вместо гомогената – дистиллированная вода. В каждую кювету добавить
по 2 мл культуры хлореллы и отправить на регистрацию параметров замедленной
флуоресценции на Фотон 10, настройки выбрать из меню программы.
Обработка и представление результатов
Для оценки фитотоксичности клеточного сока клубней использовать
коэффициент токсичности, рассчитываемый по формуле:
КТ=1-(ОПЗФопыт)/(ОПЗФконтроль),
где ОПЗФконтроль и ОПЗФопыт – относительные показатели замедленной
флуоресценции контрольных (с дистиллированной водой) и опытных (с соком)
образцов.
Заполнить таблицу, представленную ниже.
Показате
ОПЗФ
ль
Вариант
кювета 1 кювета 2 кювета 3
Контроль
Картофель №1
Картофель №2
Картофель №3
Сделать заключение по результатам.
1.
2.
3.
4.
ОПЗФ
среднее
КТ
Контрольные вопросы
Чем обусловлен фитоиммунитет клубней картофеля в период закладки урожая на
хранение осенью?
Объяснить природу иммунитета клубней картофеля в весенний период.
Какие сорта картофеля наиболее токсичны для культуры хлореллы?
Сопоставьте уровень фитотоксичности сока клубней картофеля с их устойчивостью к
фитопатогенам.
Рекомендуемая литература
1. Полевой В.В. Физиология роста и развития растений / В.В. Полевой, Т.С. Саламатова.
Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1991. 240 с.
2. Инфекционные болезни растений: физиологические и биохимические основы: перевод с
английского / Л. Л. Великанов, Л. М. Левкина, В. П. Прохоров, И. И. Сидорова, под ред.,
предисл. Ю. Т. Дьяков. - Москва: Агропромиздат, 1985. - 368 с.
3. Биохимия иммунитета, покоя, старения растений: монография / Л. В. Метлицкий, О. Л.
Озерецковская, Е. Г. Салькова. - Москва: Наука, 1984. - 264 с.
75
Лабораторная работа № 23
Скорость роста корней пшеницы в зависимости от кислотности и присутствия
токсиканта в воде
Наблюдение за энергией прорастания и скоростью роста корней растений
можно использовать при определении токсичности водных экстрактов из
загрязненных почв, а также природных и сточных вод.
Работа выполняется с использованием прибора, предназначенного для
наблюдения за развитием корней прорастающих семян растений. На основе
измерения прироста длины корней за определенный отрезок времени можно
определять всхожесть семян и энергию их прорастания. В миниризотроне можно
одновременно изучать скорости роста корней одного и того же вида семян в 4
различающихся водных средах. Это позволяет проводить сравнительную оценку
воздействия исследуемых растворов на рост корней, используя данную процедуру
как биологический тест на токсичность.
В миниризотроне рост корней происходит в условиях аэропоники, что
достигается периодическим погружением и выведением семян из воды. Этот
процесс осуществляется в автоматическом режиме в течении всего эксперимента. В
результате этого рост корней семян происходит в условиях оптимального снабжения
кислородом и водой.
Прибор может работать непрерывно в течении нескольких суток, во время
которых необходимо лишь подливать в ванночки с растворами испарившуюся воду
и измерять длину стержневого корня каждого семени. Семена помещаются в
специальные трубки-держатели, верхняя часть которых имеет больший, а нижняя
меньший диаметр, чем сама семянка. Благодаря этому она удерживается не
проваливаясь в верхней части держателя, а растущий корень, движущийся в
процессе роста по его узкому нижнему каналу, может быть легко измерен в длину
обычной линейкой.
Цель работы: изучить проявление активности (токсичности) ионов алюминия
в среде различной кислотности.
Тест-объект – прорастающие семена пшеницы, ржи, ячменя.
Оборудование, материалы и реактивы:
Миниризотрон 02, стеклянные трубки-держатели (96 шт.), чашки Петри,
марля, вата, ершики и губки для мытья посуды, натрия бикарбонат (сода питьевая),
отстоянная водопроводная вода, сульфат алюминия, соляная кислота (0,1 н),
стеклянные стаканы на 100, 250-400 мл, мерный цилиндр на 200 мл, пипеткидозаторы на 1 и 5 мл, колбы для приготовления растворов, рН-метр.
Порядок выполнения лабораторной работы:
1. Вымыть ризотрон и стеклянные трубки.
2. Определить объемы камер ризотрона.
3. Приготовить следующие растворы:
рН 6,0 без Al+3;
рН 4,0 без Al+3;
рН 6,0 с Al+3;
рН 4,0 с Al+3;
Количество токсиканта (сульфат алюминия) рассчитывается исходя из того,
что в тестируемом растворе он должен присутствовать в концентрации 150 мкМ Al+3
76
Необходимый уровень кислотности достигается добавлением к раствору 0,1 н
HCl.
4. Отобрать по 100 шт. здоровых внешне семян пшеницы, ржи, ячменя.
5. Замочить отобранные семена в водопроводной воде в чашке Петри и
поставить для прорастания.
6. Когда семена прорастут (через 2 суток), отобрав одинаковые проростки,
поместить их по одному в стеклянные трубки в правильном положении (корнем
вниз). Трубки поместить в кассету миниризотрона, в каждую камеру которого
предварительно были налиты необходимые растворы (см. выше).
7. Ежедневно, в течение 4-х суток, необходимо проверять уровень растворов в
камерах миниризотона и при необходимости доливать.
8. Через 4 суток экспонирования провести морфометрические исследования
тест-организмов (длина и количество корней, длина листьев). Провести
статистическую обработку полученных данных. Сделать вывод.
77
Лабораторная работа № 24
Биотестирование качества талого снега по приросту водоросли хлореллы
Выпавший на земную поверхность снег формирует снежный покров –
уникальный слой, способный качественно и количественно характеризовать
содержание загрязнителей в атмосферных осадках, накапливающихся в толще снега
в течение зимнего периода. Снежный покров накапливает в своем составе
практически все вещества, поступающие в атмосферу. В связи с этим он обладает
рядом свойств, делающих его удобным индикатором загрязнения не только самих
атмосферных осадков, но и атмосферного воздуха, а также последующего
загрязнения почвы и воды. При образовании снежного покрова из-за процессов
сухого и влажного выпадения примесей концентрация загрязняющих веществ в
снегу оказывается на 2-3 порядка выше, чем в атмосферном воздухе.
Основными источниками искусственных аэрозольных загрязнений воздуха
являются ТЭС, которые потребляют уголь высокой зольности, обогатительные
фабрики, металлургические, цементные, магнезитовые и сажевые заводы.
Аэрозольные частицы от этих источников отличаются большим разнообразием
химического состава. Чаще всего в их составе обнаруживаются соединения
кремния, кальция и углерода, реже – оксиды металлов: железа, магния, марганца,
цинка, меди, никеля, свинца, сурьмы, висмута, селена, мышьяка, бериллия, кадмия,
хрома, кобальта, молибдена, а также асбест. Вследствие такого химического состава
атмосферных выбросов зимой, снег имеет, как правило, слабощелочную реакцию.
Цель работы: изучить токсичность снежного покрова г. Красноярска.
Оборудование, материалы и реактивы:
Культиваторы КВ-05, КВМ-05, измеритель плотности суспензии ИПС-03,
свежевыращенная культура водоросли хлорелла (50%), вата, наборы флаконов с
пробками в штативах, среда Тамия (50%), дозаторы (1-5 мл), сода пищевая, губки на
пинцете, стаканчики (50-100 мл), мерный цилиндр (100 мл), термометр, пробы снега
из разных районов г. Красноярска.
Ход работы
Сбор образцов снежного покрова производится в заранее выбранных районах
города и осуществляется следующим образом:
1. Найти на выбранном месте взятия проб 2 участка снежного покрова, где
отсутствуют какие-либо следы деятельности человека, выгула домашних
животных и естественных наносов.
2. Требуемое для биотестирования количество снега с участка составляет 1
полиэтиленовый пакет или 2-х литровая банка хорошо утрамбованного
снега. Сбор осуществляется на всю толщу снежного покрова, не взирая на
его глубину.
3. В случае чрезмерного количества снега (глубины снежного покрова),
следует весь собранный снег перенести на полиэтиленовую пленку,
тщательно перемешать и отобрать требуемое его количество в пакет или
банку.
Взятые образцы снега далее растапливаются в лаборатории путем
естественного таяния. Ни в коем случае нельзя использовать нагревательные
приборы в высокотемпературном режиме. Объем полученных талых вод занести в
тетрадь.
78
Фильтрование и определение содержания твердых частиц.
Воду талого снега необходимо отфильтровать, попутно определив содержание
в нем твердых частиц. С этой целью фильтр требуется предварительно взвесить.
После этой процедуры талые воды фильтруются, фильтрат переносится в емкости
для их хранения, а фильтр с отфильтрованными частицами высушивается и
взвешивается еще раз. Разница в массе фильтра до и после фильтрования дает нам
содержание твердых частиц в снеге собранного объема. У профильтрованной воды
определяют реакцию среды (pH), электропроводность (µS) и окислительновосстановительный потенциал (mV). Полученные данные занести в тетрадь.
Далее проводится биотестирование профильтрованной талой воды.
Приготовить 125 мл суспензии водоросли с оптической плотностью 0,005 для
заправки флаконов. Для этого взять профильтрованную через 4 слоя марли (или
вату) пробу культуры водоросли из культиватора КВ-05 объемом 20 мл и, измеряя
оптическую плотность суспензии прибором ИПС-03, довести ее значение до 0,125
путем разбавления свежей 50% средой Тамия. Полученная суспензия водорослей
разливается по 1 мл дозатором в 24 мл тестируемой пробы воды, при этом она
разбавляется в 25 раз до оптической плотности 0,005 и концентрации среды Тамия
2%.
В качестве контроля используется дистиллированная вода. В каждом из
вариантов опыта используется по 4 флакона, которые последовательно, начиная с
контрольной пробы, устанавливаются в кассету культиватора со стартовой метки.
При оптимальном режиме (T=36±0,5 °C, максимальной интенсивности света и
скорости вращения кассеты с реакторами – 30 об/мин) прирост численности клеток
за время проведения хронического токсикологического эксперимента (22 часа) в
контроле составляет 25-30 раз. Прибор позволяет в одном опыте протестировать на
фитотоксичность пять образцов исследуемых вод вместе с одной контрольной
пробой.
Характер воздействия тестируемых вод оценивается путем сравнения
суточного прироста численности клеток водорослей в контрольном и опытном
вариантах. Контроль за численностью клеток проводится посредством измерения
оптической плотности суспензии.
Расчет показателя токсичности (КТ) проводится по формуле:
КТ = (Dк-Dт) / Dк,
где Dк и Dт - величины оптической плотности контрольного и тестируемого
образца, соответственно, после 22 часов культивирования.
Превышение КТ величины 0,2 свидетельствует о токсичности пробы воды.
При этом суточный прирост в контроле должен быть не менее 25 раз.
В случае если показатель токсичности воды превышает применяемый
пороговый уровень (КТ=0,2), то возникает необходимость измерения величины ее
биологически
безопасного
разведения,
которая
выступает
в
роли
токсикологического критерия качества тестируемой воды. В таких случаях
готовится несколько разведений тестируемой воды кратных двум. Для этого берется
5 стаканчиков или баночек объемом 100 мл, в которые шприцом-дозатором
разливается по 48 мл тестируемая и разбавляющая вода по схеме:
1 - тестируемая вода без разведения (24 мл);
2 - разведение в 3 раза (12 мл тестируемой воды +24 мл дистиллированной);
79
3 - разведение в 9 раза (12 мл разведения 3 + 24 мл дистиллированной воды);
4 - разведение в 27 раз (12 мл разведения 9 + 24 мл дистиллированной воды);
5 - разведение в 81 раз (12 мл разведения 27 + 24 мл дистиллированной воды).
12 мл
контроль
36 мл
тестируемой
воды
12 мл
24 мл воды
12 мл
24 мл воды
24 мл воды
12 мл
12 мл
24 мл воды
Чтобы упростить процедуру приготовления разбавлений тестируемой воды
надо сначала разлить по 24 мл дистиллированной воды в 4 последних стаканчика. В
первый вносится 36 мл тестируемой пробы воды. После этого тем же шприцомдозатором отбирается 12 мл содержимого первого стакана и переносится во второй
стакан, из второго в третий, из третьего в четвертый, из четвертого в пятый, а из
пятого 12 мл отбрасывается совсем. При этом после каждого переноса порции воды
следует перемешивать содержимое очередного стакана двукратным заполнением и
сливом в него воды из шприца. Во все приготовленные таким образом пробы воды
объемом по 24 мл вносится по 1 мл суспензии хлореллы оптической плотности
0,125, выращенной на 50% среде Тамия.
Все разведения тестируемой и контрольной проб воды разливаются по 6 мл в
4 флакона каждая и загружаются в один культиватор.
Обработка и представление результатов
Полученные результаты занести в таблицу.
Показатель
Вариант
Контроль
Проба без разбавления
Разбавление 3
Разбавление 9
Разбавление 27
Разбавление 81
кювета 1
Оптическая плотность (D)
кювета 2
кювета 3 кювета 4
D
средняя
Стандартное
отклонение
КТ
Для удобства использования показателя уровня биологически безопасного
разведения вводится его обратная величина (1/УББР), которая рассчитывается по
формуле:
(0,2 – КТм)  (М – Б)
1/УББР = М – ——––——–––———– ,
КТб – КТм
где КТм – показатель токсичности разбавления, имеющего величину менее 0,2;
КТб – показатель токсичности разбавления, имеющего величину более 0,2;
М – обратная величины степени разбавления, имеющего величину КТ меньшую 0,2;
Б – обратная величина степени разбавления, имеющего величину КТ большую 0,2;
0,2 – показатель (критерий) токсичности воды.
Пример: при разбавлении пробы воды в 9 раза КТ составил величину 0,34, а
при разбавлении 27 раз – 0,11. Тогда величина М будет равна 1/27, а Б – 1/9, КТм –
0,11, КТб – 0,34.
80
(0,2 – 0,11)  (1/27 – 1/9)
0,09  (– 0,074)
1/УББР = 1/27 – ––––––––––––––––––––––– = 0,037 – –––––––––––––– = 0,066.
0,34 – 0,11
0,23
УББР = 15,1 раз.
Соотнесите результаты по токсичности талой воды с ее физико-химическими
параметрами, с уровнем антропогенной нагрузки района.
Составьте сводную таблицу районов города по степени токсичности талого
снега.
Контрольные вопросы
1. Объясните слабощелочную или щелочную реакцию талого снега.
2. Чем может быть обусловлено токсическое или стимулирующее действие талых вод на
тест-объект?
3. Какие районы г. Красноярска имеют наибольший уровень атмосферного загрязнения и
чем это объясняется?
Рекомендуемая литература
1. Гидрохимические показатели состояния окружающей среды: справочные материалы /
под ред. Т.В. Гусевой. – М.: ФОРУМ: ИНФРА-М, 2007. – 192 с.
81
Учебное издание
Подготовлено к изданию РИО БИК СФУ
Подписано в печать ……..2012 г. Формат 60x84/16
Бумага офсетная. Печать плоская
Усл. Печ. Л.
Уч.-изд.л.
Тираж экз. Заказ
Редакционно-издательский отдел
Библиотечно-издательского комплекса
Сибирского федерального университета
660041, г. Красноярск, пр. Свободный, 79
Тел/факс (391) 206-21-49. E-mail rio@sfu-kras.ru
http://rio.sfu-kars.ru
Отпечатано Полиграфическим центром
Библиотечно-издательского комплекса
Сибирского федерального университета
660041, г. Красноярск, пр. Свободный, 82а
Тел. 206-26-58, 206-26-49