Киргизов Кирилл Игоревич - Федеральный научно

На правах рукописи
КИРГИЗОВ
Кирилл Игоревич
ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДОВ ТЕРАПИИ ТЯЖЕЛЫХ РЕФРАКТЕРНЫХ ФОРМ
РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА У ДЕТЕЙ
14.01.08 Педиатрия
14.01.11 Нервные болезни
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва, 2014 год
Работа
выполнена
«Федеральный
в
Федеральном
научно-клинический
государственном
центр
детской
бюджетном
гематологии,
учреждении
онкологии
и
иммунологии имени Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения Российской
Федерации
Научные руководители:
Доктор медицинских наук Скоробогатова Елена Владимировна
Доктор медицинских наук Бембеева Раиса Цеденкаевна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор кафедры госпитальной педиатрии №1 ГБОУ ВПО
«РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России
Неудахин Евгений Васильевич
кандидат медицинских наук, доцент кафедры нервных болезней ГБОУ ВПО «Первый
МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России
Шмидт Татьяна Евгеньевна
Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение
дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия
последипломного образования» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Защита
состоится
«___»_________
2014
года
в
______
часов
на
заседании
диссертационного совета Д 208.050.01 Федерального государственного бюджетного
учреждения «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и
иммунологии имени Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения Российской
Федерации, ГСП-7 117997, г. Москва, ул. Саморы Машела, д.1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального
государственного бюджетного учреждения «Федеральный научно-клинический центр
детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева» Минздрава
Российской Федерации www.fnkc.ru
Автореферат разослан «___»__________2014 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
д.м.н., профессор
Чернов В.М.
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Рассеянный склероз (РС) является наиболее распространенным
хроническим воспалительным демиелинизирующим заболеванием центральной нервной
системы (ЦНС) и основной причиной инвалидизации лиц молодого возраста (Davidson A.
2001; Tardieu M., 2004; Frohman E.M., 2006; Бембеева Р.Ц., 2010; Шмидт Т.Е., 2010). В
настоящее время в мире насчитывается около 3 млн. больных РС, распространенность РС в
целом составляет 1:1000 населения. Исходя из данного показателя, в России может быть
около 150 000 больных РС (Бембеева Р.Ц., 2007; Шевченко Ю.Л., 2008; Бойко А.Н., 2011).
Типичным возрастом клинического проявления РС считается 20 - 40 лет, но в 2 - 7 %
всех случаев дебют РС приходится на детский возраст (Confraveux C., 1980, Frohman E.M.,
2006, Moore P., 2013).
Актуальность изучения РС у детей продиктована наметившейся в последние годы
тенденцией к росту заболеваемости, обусловленной истинным увеличением числа
заболевших, улучшением качества диагностики и появлением новых методов и средств
патогенетической терапии.
РС рассматривают как иммунологически-опосредованное заболевание, при котором
аутоиммунный ответ индуцируется одним или несколькими экзогенными агентами у
генетически предрасположенного индивидуума (Confraveux, C., 1980; Davidson A. 2001;
Frohman E.M., 2003; Завалишин И.А., 2011).
По современным представлениям, развитие аутоиммунных заболеваний (АЗ) связано
с нарушением супрессорных механизмов, которые контролируют толерантность Т- и Влимфоцитов к аутоантигенам (ААГ) (Елисеева Д.Д., 2010; Balint B., 2013). При этом
значимая роль в патогенезе РС отводится регуляторным Т-лимфоцитам CD4+CD25+FoxP3+
(Т-регуляторы), которые участвуют в поддержании иммунологической толерантности за счет
подавления
пролиферации
цитотоксических
Т-лимфоцитов,
ингибиции
активности
естественных киллеров, макрофагов и В клеток (Zhang L., 2009; Schneider-Hohendorf T.,
2010).
Исходя из этого, изучение субпопуляционного состава лимфоцитов периферической
крови, может служить надежным способом мониторинга активности воспаления и
эффективности проводимого лечения (Быковская С.Н., 2010; Haegele K.F., 2007)
Несвоевременное и неадекватное лечение при РС приводит к значительной
инвалидизации пациентов и иногда представляет угрозу жизни (Бембеева Р.Ц., 2010; Burt
R.K., 2012). В настоящее время для традиционной длительной терапии РС у взрослых
зарегистрирован ряд препаратов изменяющих течение РС (ПИТРС). Опубликованные
данные международных ретроспективных исследований говорят о безопасности и хорошей
3
переносимости ПИТРС у детей с РС (Guilhoto L.M., 1995; Быкова О.В., 2006; Маслова О.И.,
2006; Кузенкова Л.М., 2006; Banwell B., 2006; Harding K., 2013). В детском возрасте
встречаются формы РС, которые имеют злокачественное течение и не отвечают на
проводимую иммуномодулирующую терапию (Banwell B., 2007; Greco R., 2012; Marjanovic
Z., 2012), а ряд пациентов детского возраста по определенным причинам не может получать
традиционные иммуномодулирующие препараты. В этих условиях одним из перспективных
направлений в терапии РС у детей может оказаться применение клеточных технологий и
иммуносупрессивных препаратов в высоких дозах для достижения длительной ремиссии,
эффективность которых была показана во взрослой популяции.
В настоящее время в мировой науке и практике не существует работ, посвященных
проведению клеточной и высокодозной иммуносупрессивной терапии у пациентов с РС в
возрасте до 18 лет, несмотря на достаточное число публикаций, основанных на популяции
взрослых пациентов. Так, с 1999 года в России проводится исследование эффективности
Ауто-ТГСК при РС, которое включает 6 центров, где осуществлено 180 трансплантаций.
Однако ни один из этих центров не занимается лечением пациентов в возрасте до 18 лет
(Шевченко Ю.Л., 2009).
В то же время, в мире накоплен определенный опыт проведения клеточной терапии
культивированными ex-vivo Т-регуляторами (Быковская С.Н., 2010; Schneider-Hohendorf T.,
2010; Елисеева Д.Д., 2011), а также высокодозной химиотерапии с последующей
аутологичной трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток (Ауто-ТГСК) при
рефрактерных к традиционным методам терапии формам РС. Данные методы лечения
показали свою эффективность и безопасность при РС у взрослых и могут быть рассмотрены
в контексте применения у детей (Bettini M., 2009 Zhang L., 2009; Schneider-Hohendorf T.,
2010).
Данные положения определяют актуальность настоящего исследования.
Цель исследования: оптимизировать методы лечения РС у детей, страдающих
рефрактерными к традиционной терапии формами заболевания.
Задачи исследования:
1. Разработать протоколы иммунотерапии РС у детей с использованием Т-регуляторов
и Ауто-ТГСК.
2. Изучить клиническую эффективность и безопасность метода иммунокоррекции
путем введения культивированных ex-vivo аутологичных Т-регуляторов пациентам детского
возраста с РС.
4
3. Оценить результативность и безопасность Ауто-ТГСК как метода лечения крайне
тяжелых рефрактерных форм РС у детей для предотвращения прогрессирования заболевания
и улучшения результатов терапии.
4. Провести количественный анализ Т-регуляторов периферической крови у пациентов,
страдающих РС.
Научная новизна
Впервые выделена группа из 13 пациентов детского возраста, страдающих
рефрактерным к традиционным методам лечения РС, и показана достаточная эффективность
предложенных в работе протоколов лечения в данной когорте пациентов.
Впервые приведены данные о достаточной эффективности (7 из 9 пациентов после
Ауто-ТГСК не имели обострений) и безопасности Ауто-ТГСК у детей с крайне тяжелыми
рефрактерными формами РС с применением иммуноаблативного режима химиотерапии
(препараты циклофосфамид (ЦФ) и антитимоцитарный глобулин (АТГ).
Определено,
что
при
своевременном
проведении
высокодозной
терапии
и
последующего адекватного наблюдения пациентов с рефрактерными формами РС в детской
популяции удается достичь меньшей инвалидизации.
Впервые
для
детей,
страдающих
РС,
предложен
метод
культивирования
аутологичных Т-регуляторов ex-vivo с последующим клиническим применением и
определена эффективность и безопасность их применения у детей с РС.
Впервые
проведен
лабораторный
анализ
количественных
характеристик
Т-
регуляторов у детей с РС до и после проведенной клеточной и высокодозной
иммуносупрессивной терапии и определена корреляция с клинической картиной.
Практическая значимость
Применение предложенных в работе протоколов позволило определить группу детей,
страдающих рефрактерным к традиционным методам лечения РС, и создать алгоритм для
проведения своевременной адекватной терапии рефрактерных форм данного заболевания с
помощью высокодозной терапии с последующей Ауто-ТГСК и клеточной терапии.
Предложенный вариант лечения явился эффективным методом купирования аутоиммунной
воспалительной реакции при рефрактерном течении РС.
Применение предложенных протоколов клеточной и иммуносупрессивной терапии
для пациентов детского возраста с рефрактерными формами РС позволили в ряде случаев (у
4-х пациентов) предотвратить раннюю инвалидизацию пациентов за счет купирования
рефрактерного аутоиммунного процесса и улучшить качество жизни.
Клеточная терапия является альтернативным методом лечения РС при невозможности
или неэффективности применения ПИТРС.
5
Анализ субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови методов
иммунофенотипирования (ИФТ) является, наряду с нейро-радиологическими методами
обследования,
способом
мониторинга
активности
воспалительного
процесса
и
эффективности проводимого лечения при рефрактерных формах РС у детей – в работе была
показана корреляция показателей субпопуляционного состава лимфоцитов и тяжести
клинических проявления заболевания.
Положения, выносимые на защиту:
1.
У детей, страдающих РС, выделена группа пациентов (n=13), рефрактерных к
традиционной терапии, требующая альтернативных подходов к терапии.
2.
Была показана корреляция между тяжестью клинических проявлений и показателями
иммунофенотипирования периферической крови: у пациентов в фазе обострения значимо
снижается показатель иммунологического регуляторного индекса (ИРИ), количество Трегуляторов, установлена обратная зависимость между количеством Т-регуляторов и
степенью тяжести клинических проявлений.
3.
Проведение терапии с применением аутологичных культивированных ex-vivo Т-
регуляторов и/или высокодозной терапии (ЦФ и АТГ) с последующей Ауто-ТГСК позволяет
добиться нормализации иммунного статуса пациента по данным ИФТ.
4.
Протоколы терапии РС у детей с применением аутологичных культивированных ex-vivo
Т-регуляторов и/или высокодозной терапии с последующей Ауто-ТГСК являются
эффективными и безопасными.
5.
Эффективность терапии РС у детей определяется своевременностью ее начала. Оценка
эффективности проводится согласно различным параметрам: нейро-радиологическая
картина, данные ИФТ, показатели токсичности и побочных действий.
Внедрение результатов работы в практику.
Методы внедрены в практику Российской детской клинической больницы (главный
врач – д.м.н., профессор Н.Н. Ваганов), Научного-исследовательского института педиатрии
Научного центра здоровья детей РАН (директор – д.м.н., профессор, академик РАН А.А.
Баранов).
Апробация диссертации.
Основные результаты работы, составившие содержание диссертации, доложены и
обсуждены 13 декабря 2013 г. на заседании Федерального государственного бюджетного
учреждения «Федерального научно-клинического центра детской гематологии, онкологии и
иммунологии имени Дмитрия Рогачева» Министерства Здравоохранения Российской
Федерации. Материалы диссертации представлены на 9-м Конгрессе Европейского общества
детских неврологов 10-14 мая 2011 г. (Хорватия), Конференции исследователей
6
европейского общества детских неврологов 14-15 декабря 2012 г. (Германия), VI Сибирской
межрегиональной
научно-практической
конференции
«РС
и
другие
аутоиммунные
заболевания нервной системы» 8 – 10 февраля 2013 г. (г. Новосибирск), XVII Съезде
педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии» 14-17 февраля 2013 г. (г. Москва), 39м Ежегодном конгрессе Европейской группы по трансплантации крови и костного мозга 7-10
апреля 2013 г. (Великобритания), IV Межрегиональном совещании Национального общества
детских гематологов и онкологов 7-9 июня 2013 г. (г. Москва), 10-м Конгрессе Европейского
общества детских неврологов 25-28 сентября 2013 г. (Бельгия)
Публикации: По теме диссертации опубликовано 12 статей и тезисов, из них 3
оригинальные статьи в журналах, рекомендованных в перечне ВАК.
Личное участие диссертанта
Соискатель овладел всеми методами диагностики и лечения РС, использованными
при выполнении диссертационной работы. С учетом основных тенденций развития
иммуномодулирующей и иммуносупрессивной терапии у пациентов с РС разработал и
внедрил
в
практику
протоколы
терапии
аутологичными
культивированными
Т-
регуляторными клетками CD4+CD25+FoxP3+ и проведения Ауто-ТГСК с включением в
кондиционирование циклофосфамида и антитимоциатрного глобулина. Соискателем была
определена эффективность и безопасность данных протоколов лечения при РС у детей.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа включает следующие разделы: введение (включающее
актуальность проблемы, цели и задачи исследования, научную новизну, практическую
значимость и внедрение результатов работы в практику), обзор литературы, клинический
материал и методы исследования, клинико-нейрорадиологическая характеристика пациентов
с РС, результаты традиционной и предложенной терапии РС у детей, заключение, выводы и
практические рекомендации. Объем работы составляет 100 страниц машинописного текста.
Работа иллюстрирована 12 таблицами, 16 рисунками. В работе представлено 3 клинических
примера. Библиографические указатели содержат 69 источников отечественной и
иностранной литературы. Работа выполнена в отделе оптимизации лечения онкологических
заболеваний у детей (зав. отделом – д.м.н. Ю.В. Румянцева) ФГБУ «Федеральный научноклинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева»
Минздрава России (директор - акад. РАН, проф. А.Г. Румянцев) и на кафедре неврологии,
нейрохирургии и медицинской генетики педиатрического факультета (заведующий кафедрой
–
д.м.н.,
профессор
Н.Н.
Заваденко)
ГБОУ
ВПО
«Российский
национальный
исследовательский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России (ректор – д.м.н.,
профессор А.Г. Камкин). Диагностическое обследование и лечение пациентов проводилось в
7
отделении психоневрологии-1 (зав. отделением – С.В. Пилия) и отделения трансплантации
костного мозга (зав. отделением – д.м.н. Е.В. Скоробогатова) ФГБУ «Российская детская
клиническая больница» Минздрава России (главный врач – д.м.н., проф. Н.Н. Ваганов).
Культивирование аутологичных Т-регуляторов проводилось в отделе клеточных
технологий и регенеративной медицины ГБОУ ВПО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова»
Минздрава России (руководитель отдела – д.м.н., профессор С.Н. Быковская). Работа
выполнялась
на
основании
соответствующих
научно-клинических
лабораторных
протоколов, утвержденных на заседании Ученого Совета «ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия
Рогачева» 20 января 2011 года.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
В работе отражен 4-х летний опыт «Российской детской клинической больницы»,
«Федерального
научно-клинического
центра
детской
гематологии,
онкологиии
и
иммунологии им. Дмитрия Рогачева» и «Российского национального исследовательского
университета им. Н.И. Пирогова» в лечении детей, страдающих РС, с использованием
клеточных технологий и Ауто-ТГСК. Исследовательской группой были разработаны
соответствующие протоколы, примененные в данной работе.
Клинический материал и методы исследования
Клиническая характеристика больных с РС
В исследование было включено 13 пациентов с РС в возрасте 10-17 лет, из них 9
пациентам была проведено Ауто-ТГСК, 6 – клеточная терапия (при этом двум пациентам
после Ауто-ТГСК проводилась терапия Т–регуляторами). Средний возраст пациентов на
момент включения в исследование составил 14,78±3,1года, в группе пациентов получивших
Ауто-ТГСК - 16±1,7 лет, клеточную терапию - 13±1,3 лет соответственно.
При ретроспективном анализе дебют РС у пациентов отмечен в 4-14 лет (12,3±1,7
года), при этом у 3 (21,4%) пациентов в возрасте до 11 лет, у 11 (78,6%) – старше 11 лет.
Период от появления первых клинических симптомов РС до постановки диагноза
достоверного РС составил 12,6±3,2 мес., при этом у пациентов получавших Ауто-ТГСК –
15,5±4,1 мес., клеточную терапию – 7±1,3 мес. Длительность заболевания до включения
пациентов в исследование составила: в группе больных с Ауто-ТГСК - 28,8±13,38 мес.,
получавших клеточную терапию - 14,1±10,96 мес. Из 13 пациентов с РС было 9 девочек
(69,2%) и 4 мальчика (30,8%). Соотношение по полу в общей группе представлено как 2,5:1.
Все пациенты, получившие Ауто-ТГСК, имели вторично-прогрессирующий РС
(ВПРС). 4 (67%) из 6 (100%) пациентов, которым была выполнена клеточная терапия, имели
рецидивирующе-ремиттирующий РС (РРРС), а 2 (33%) - ВПРС. Наиболее часто у пациентов,
подобранных для проведения Ауто-ТГСК, отмечалось двустороннее поражение зрительных
8
нервов (100%), симптомы поражения глазодвигательных нервов, чаще III ЧН, реже VI ЧН
(67% и 33% соответственно), VII, XII ЧН по центральному типу (89%), грубые парезы мышц
конечностей: центральный тетрапарез (45%), нижний спастический парапарез (45%),
гемипарез (45%), нарушения поверхностной (100%) и глубокой (78%) чувствительности,
мозжечковые расстройства (100%), тазовые нарушения по центральному типу (78%). Частота
неврологических симптомов у пациентов с РС на момент инициального обследования
представлена в табл. 1.
Таблица 1
Клинические симптомы у пациентов с РС (на момент инициального обследования)
Клинические симптомы
Пациенты
Клеточная терапия (n =4)
n (%)
Ауто-ТГСК (n=9)
n (%)
Снижение зрения
- одностороннее
- двухстороннее
0
4(100%)
9 (100%)
-расходящееся
1 (25%)
6 (67%)
-сходящееся
-
3 (33%)
Парез взора
0
7 (78%)
Межъядерная офтальмоплегия
0
5 (56%)
Парез мимической мускулатуры
0
5 (56%)
2 (50%)
8 (89%)
4 (100%)
0
- моно
0
0
- геми
0
1 (12%)
- пара
0
4 (45%)
- тетра
0
4 (45%)
-поверхностной
2 (50%)
9 (100%)
- глубокой
0
7 (78%)
-сложной
0
0
Мозжечковые симптомы
3 (75%)
9 (100%)
Тазовые нарушения
0
7 (78%)
Косоглазие
Поражение VII,XII пар черепных
нервов по центральному типу
Пирамидная недостаточность
Парезы
Нарушения чувствительности
Как видно из табл. 1, пациенты, получившие клеточную терапию, изначально имели
менее выраженный неврологический дефицит. Тяжесть состояния больных РС по
расширенной шкале инвалидизации (EDSS) (Kurtzke J.F., 1983) у пациентов, включенных в
группу клеточной терапии, соответствовала 1,0 - 4,0 баллам, в группе с Ауто-ТГСК 4 - 9
балла. Среднее значение степени инвалидизации в группе пациентов, получивших Ауто-
9
ТГСК составило 6,16±0,2 баллов, в группе пациентов с клеточной терапией - 3,13±1,03.
Следует отметить, что у пациента с выраженным неврологическим дефицитом с оценкой в 9
баллов отмечалось пролонгированное обострение, которое не купировалось вплоть до начала
химиотерапии.
Оценка степени инвалидизации в зависимости от формы течения заболевания
представлена в табл. 2.
Таблица 2
Степень инвалидизации больных с РС в зависимости от формы заболевания
EDSS
РРРС
ВПРС
Баллы
2,93±0,93
5,38±1,1
Своевременность начала высокодозной терапии
Для анализа своевременности начала терапии пациентов с Ауто-ТГСК разделены на
две группы – со своевременным (группа 1) и несвоевременным (группа 2) началом
высокодозной терапии с последующей Ауто-ТГСК согласно рекомендациям рабочей группы
по лечению АЗ EBMT (Lavorgna, L., 2012).
Таким образом, в группу 1 включено 4 пациента (пациенты 2, 4, 6, 7), а во вторую – 5
пациентов. Был проведен анализ длительности иммуносупрессивной терапии от момента
фиксации рефрактерности до момента начала кондиционирования. Для группы 1 этот
интервал составил в среднем 3,0±0,3 месяца, а для группы 2 – 12,0±2,3 месяца – различие
между группами статистически достоверно (р=0,0007).
Методы исследования
В ходе исследования на каждого больного заполнялась электронная карта, где
фиксировались
демографические
данные
пациентов,
жалобы,
семейный
анамнез,
перенесенные заболевания, первые признаки РС и динамика патологического процесса,
результаты параклинических исследований, проводимое лечение.
Всем
пациентам
с
РС
проводилось
комплексное
неврологическое
и
нейрорадиологическое обследование при поступлении в стационар и в динамике.
Клиническое неврологическое обследование проводилось по общепризнанной методике
(Л.А.
Бадалян,
2010).
При
постановке
диагноза
РС
применялись
стандартные
диагностические критерии МакДональда, диагностические критерии для РС в детском
возрасте, разработанные International Pediatric MS Study Group (Lauren B. Krupp, B. Banwell,
S. Tenembaum, 2007). Определение олигоклональных полос IgG в церебро-спинальной
жидкости (ЦСЖ), выявляемые методом изоэлектрического фокусирования выполнялось в
10
ФГБУ
«ГНЦ» Минздрава России
в лаборатории
гуморального иммунитета
(зав.
лабораторией – Варламова Е.Ю.).
Клинические формы заболевания выделяли на основе особенностей клинического
течения заболевания: рецидивирующе-ремиттирующий (РРРС); вторично-прогрессирующий
(ВПРС); первично-прогрессирующий (ППРС).
Активность РС оценивали в соответствии с современными представлениями об
обострениях заболевания (McDonald W.I. et al., 2003): атака (рецидив, обострение); интервал
между атаками. Для подтверждения диагноза применялось исследование зрительных
вызванных потенциалов (ЗВП). При анализе основных клинических проявлений РС,
отражающих степень неврологического дефицита, инвалидизацию и на их основе –
прогрессирование болезни применяли шкалы функциональных систем FS и инвалидизации
EDSS.
Магнитно-резонансная томография (МРТ) головного и спинного мозга выполнялась
на томографе «Signa Horizont» (General Electric, США) с напряженностью магнитного поля
1,5
тесла.
Исследование
проводилось
всем
больным
в
стандартных
пульсовых
последовательностях SE и FSE в T1 и T2 взвешенном изображении в аксиальной и
сагиттальной проекциях, для более точной оценки степени распространенности поражения
белого вещества во всех случаях использовалась импульсная последовательность (ИП)
(FlAIR), а также МРТ с контрастным усилением препаратами Магневист, Гадовист
(Schering).
Всем
пациентам,
включенным
в
исследование,
проводилось
исследование
субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови, в том числе определение
количества Т-регуляторов с использованием метода проточной цитометрии. Все измерения
проводились на проточном цитометре FACS Calibur (BD Biosciences, США). С целью оценки
количества
субпопуляций
CD16+CD56+
в
лимфоцитов
мононуклеарной
CD3+,
фракции,
CD8+,
CD4+,
клеточную
CD4+CD25+,
суспензию
CD19+,
окрашивали
соотвествующими антителами. Оценка экспрессии поверхностных маркеров проводилась в
соответствии с протоколом, разработанным производителем набора антител BD Multitest
IMK Kit (BD Biosciences, США). Процентное содержание позитивных по специфическим
маркерам
клеток
подсчитывалось
при
помощи
программного
обеспечения
MACSQuantify(tm) (Miltenyi Biotec GmbH, Германия).
Культивирование Т-регуляторов проводилось на базе Отдела клеточных технологий и
регенеративной медицины ГБОУ ВПО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России
(руководитель отдела – д.м.н., профессор С.Н. Быковская). Выделение регуляторных Тклеток CD4+CD25+Foxр3+ из периферической крови больных РС осуществлялось
11
инкубацией CD4+CD25+ Т-клеток с PE-мечеными анти-человеческими антителами к FoxP3,
клон PCH101 (eBioscience, США).
Данный метод включал забор 40 мл периферической крови у пациента, выделение
субпопуляций регуляторных и эффекторных Т-лимфоцитов и АПК донора, окраску
эффекторных
Т-лимфоцитов
витальным
красителем
карбоксифлуоресцеин
сукцинимидиловым эфиром (Carboxyfluorescein succinimidyl ester – CFSE) и пролиферацию в
смешанной культуре лимфоцитов (mixed lymphocyte reaction – MLR), которая оценивается по
редукции внутриклеточного красителя CFSE методом проточной цитометрии.
Для культивирования Т-регуляторов применяли среду RPMI-1640, содержащую
феноловый красный, L-глутамин и 25мМ HEPES (Gibco, Великобритания) c добавлением 510% аутологичной сыворотки и 1% раствора пенициллин- стрептомицина (Gibco,
Великобритания). В культуральную среду добавляли интерлейкин (ИЛ) - 2 (ИЛ-2, R&D
Systems, Великобритания), мышиные моноклональные антитела к человеческому рецептору
CD3 (МедБиоСпектр, РФ) и мышиные моноклональные антитела к человеческому рецептору
CD28 (BD Pharmingen, США). Клетки культивировали во флаконах 25 см2 или 75 см2 в CO2инкубаторе при 370С в атмосфере 5% СО2. Свежую среду и ростовые факторы добавляли
каждые 3-4 дня. Время культивирования составляло от 5-8 дней. Далее оценивались
фенотипические характеристики (экспрессии маркеров) и экспансия (увеличение количества)
Т-регуляторов после культивирования с помощью проточной цитометрии, и изучалась
супрессорная активность нативных и индуцированных ex vivo Т-регуляторов.
На 7-12й день культивирования клетки концентрировали, подсчитывали количество
живых клеток в гемоцитометре и отмывали центрифугированием в 50 мл конических
стерильных пробирках в фосфатном солевом буферном растворе без Са2+ и Mg2+ в течение 10
мин при 300 g. Осадок разводили в 2-3 мл стерильного физиологического раствора или 6%
раствора декстрана и сразу набирали в стерильный одноразовый шприц, который помещали
в стерильную упаковку и в специальный контейнер для переноса клеток, который
незамедлительно транспортировался в РДКБ. После доставки в отделение психоневрологии1 РДКБ, клетки немедленно вводили пациенту подкожно в область передней брюшной
стенки.
С целью проведения Ауто-ТГСК проводилась мобилизация стволовых клеток
периферической крови с помощью введения ЦФ в дозе 2000 мг/кв.м. внутривенной инфузией
за 1 час на фоне гипергидратации (3000 мл/м2) с обязательным введением препарата
Уромитексан в дозе 180% от дозы ЦФ (80% струйно перед введением ЦФ 100% суточной
инфузией начиная с 0 часа). На +7 день от начала инфузии ЦФ производилась стимуляция
гемопоэза гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (Г-КСФ). Забор стволовых
12
клеток периферической крови производится методом аппаратного афереза на аппарате «Cobe
Spectra» до момента выделения как минимум 2х106 CD34-позитивных клеток на килограмм
массы тела пациента. Продукт афереза подвергался криоконсервации до момента
применения на 0 день. Интервал между инфузией ЦФ в контексте забора стволовых клеток и
кондиционирования составлял не менее 3-х недель.
Кондиционирование включало в себя введение ЦФ в дозе 200 мг/кг (разделенный на 4
эквивалентные дозы на -5, -4. -3, -2 дни), АТГАМ в дозе 160 мг/кг разделенный на 4
эквивалентные дозы на -2, -1, +1, +2 дни). Реинфузия стволовых клеток периферической
крови (СКПК) проводилась на 0 день. Для быстрого выхода из состояния аплазии
кроветворения производилась плановая стимуляция гемопоэза Г-КСФ – 5 мкг/кг начиная с
+5 дня. Разработанная схема кондиционирования с введением АТГ на +1 и +2 день
благоприятно влияла на последующее течение заболевания, в связи с Т-деплецией in-vivo
уже трансплантированных клеток снижая до минимума риск воздействия активированных Тлимфоцитов на пациента.
Терапия проводилась в соответствии с протоколами: «Применение Т-регуляторных
клеток CD4+CD25+Foxp3+ для лечения детей с рассеянным склерозом» и «Аутологичная
трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у детей с рефрактерными формами
рассеянного склероза», утвержденных на заседании Ученого Совета «ФНКЦ ДГОИ им.
Дмитрия Рогачева» 20 января 2011 года (одобрены локальным этическим комитетоа «ФНКЦ
ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» 10 декабря 2010 года).
Методы статистической обработки результатов
Для проведения данного исследования создана компьютерная база данных детей,
получивших лечение с помощью клеточной терапии и Ауто-ТГСК. Для характеристики
распределения проведен анализ данных с использованием тестов Колмогорова-Смирнова и
Шапиро-Уилка. Данные представлены в виде количества наблюдений в группе, среднего
арифметического значения, стандартного отклонения. Категориальные данные представлены
в виде процентных долей.
Выбор
критериев
проверки
статистической
значимости
различий
между
анализируемыми показателями основывался на характере распределения данных. При
сравнении двух групп, в случае связанных выборок, использовали парный t-критерий
Стьюдента и/или его непараметрический аналог – критерий Вилкоксона, в случае
несвязанных
выборок
использовали
непарный
t-критерий
Стьюдента
и/или
его
непараметрический аналог – критерий Манна-Уитни. Оценка статистической значимости
различий показателей при количестве сравниваемых групп больше двух проводилась при
13
помощи дисперсионного анализа повторных измерений и/или рангового критерия Фридмана
для повторных измерений с последующим использованием критериев post hoc. Все тесты
являлись
двусторонними;
различия
между
сравниваемыми
группами
признаны
статистически значимыми при уровне p<0,05; статистическая мощность критериев
составляла не менее 0,80. Статистический анализ проведен с использованием программного
обеспечения Statistica for Windows 7.0.
Результаты традиционной терапии РС у детей до введения предложенных
вариантов лечения
В рамках проводимого исследования был осуществлен анализ опыта лечения
пациентов с РС в РДКБ. Эффективность терапии препаратами интерферонов (ИНФ) бета 1b
у детей с РС (n=65) в возрасте 7-17 лет была очевидна. Но оставалось проблемой лечение
пациентов с выраженными побочными реакциями на введение препаратов ИНФ или при
отсутствии технической возможности частых инъекций (особенности психо-соматического
статуса).
Кроме того, до начала применения метода Ауто-ТГСК для терапии детей с
рефрактерными формами РС, был проведен анализ эффективности лечения Митоксантроном
(n=4). Данный препарат назначался в дозе 12 мг/кв.м., одно введение каждые три месяца в
течение 2 лет. Особенность режима назначения Митоксантрона является необходимость
длительного курса без возможности проведения пульс-терапии в связи с крайне высоким
риском кардиотоксичности данного препарата. Таким образом, Митоксантрон у детей имеет
ограниченные показания к применению и не может рассматриваться как средство для
быстрой стабилизации состояния. Кроме того, протокол терапии с применением
Митоксантрона рассчитан на длительное введение средних доз химиотерапии, при этом
положительный эффект в детской популяции возможен при проведении пульс-терапии
высокими дозами иммуноаблаторов.
Результаты клеточной терапии при РС у детей
Терапию Т-регуляторами получили 6 детей с РС. Средний возраст пациентов на
момент начала терапии составил 13±1,3 лет. Длительность заболевания на момент
включения в исследование составляла 1,4±0,2 года. Всем пациентам проводилось лечение
высокими дозами кортикостероидов в период обострения, 4 из 6 имели анамнез терапии
препаратами ИНФ бета 1b. Средняя EDSS на момент начала терапии по протоколу –
3,13±1,03 балла. Все пациенты (n=6), включенные в протокол, имели изменения по данным
МРТ головного и спинного мозга. Ряд пациентов не могли получать терапию по социальноклиническому статусу.
14
Для
определения
эффективности
проведенной
терапии
оценивалась
нейро-
радиологическая картина и субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови
пациентов. Одним из наиболее важных показателей наличия либо отсутствия аутоиммунной
агрессии является ИРИ. В группе пациентов, включенных в исследование, было установлено
статистически значимое увеличение показателя ИРИ CD4+/CD8+ (p=0,01) после проведения
терапии аутологичными культивированными ex-vivo Т-регуляторами. При динамическом
наблюдении данной группы пациентов (n=6) до и после клеточной терапии выявлено
достоверное снижение количества CD8+ клеток (р=0,006) по сравнению с количеством
данных клеток до введения Т-регуляторов, что обуславливает изменение ИРИ у данных
пациентов. Кроме того, отмечалось достоверное снижение уровня В-лимфоцитов (р=0,01)
(табл. 6).
Таблица 6
Иммунофенотипирование крови детей с РС до и после терапии аутологичными
культивированными ex-vivo Т-регуляторами
Фаза исследования
До введения Т-регуляторов
После введения (n=6)
Значимость различий
71,43 ± 9,55
68,34 ± 7,47
0,57
[62,30;84,60]
[56,30;79,50]
28,46 ± 5,33
21,35 ± 4,96
[21,30;39,40]
[15,40;32,40]
41,13 ± 5,32
42,34 ± 7,87
[32,40;58,30]
[28,30;59,60]
CD4+/CD8+
1,45 ± 0,56
1,93 ± 0,42
(ИРИ)
[1,10;2,50]
[1,60;2,90]
CD19+
13,64 ± 4,19
9,76 ± 4,55
[5,50;19,30]
[4,50;16,10]
20,1 ± 6,54
18,54 ± 9,65
[7,56;37,40]
[6,30;35,50]
2,1±1,25
3,8±1,4
[1,80;2,70]
[3,30;4,60]
(n=6)
Показатель (%)
CD3+
CD8+
CD4+
CD16+CD56+
CD4+CD25+Foxp3+
0,006
0,36
0,01
0,01
0,54
0,003
Однако наибольшее значение придавалось изучению популяции Т-регуляторов,
которые оказывали влияние на популяцию лимфоцитов. В данном исследовании
оценивалось изменение популяции Т-регуляторов у пациентов в обострении, вне обострения
и в контексте проведенной терапии Т-регуляторами. Было выявлено, что содержание Трегуляторов в периферической крови детей с РС повышалось при выходе из обострения с
1,1±0,55% до 2,1±1,25 (р=0,002). Количество клеток вне обострения был ниже показателей
15
здоровых лиц по данным литературы (Быковская С.Н., 2011). Было показано, что при
переходе из стадии обострения в ремиссию происходит увеличение числа Т-регуляторов.
Учитывая полученные данные, было принято решение о необходимости экспансии
числа Т-регуляторов для эффективной иммунотерапии РС. В настоящее время установлена
возможность выделения и индукции ex-vivo больших количеств Т-регуляторов. При этом,
клетки являются высоко стабильным субстратом, долго живут и обладают высокими
супрессорными свойствами, неспецифичны и неиммуногенны.
Лаборатория отдела
клеточных технологий и регенеративной медицины ГБОУ ВПО «РНИМУ им. Н.И.
Пирогова» Минздрава России (руководитель отдела – д.м.н., профессор С.Н. Быковская)
осуществляла экспансию Т-регуляторов ex-vivo по фенотипическим и функциональным
характеристикам полностью идентичных нативным, их количество после экспансии
возрастает в десятки раз (Елисеева Д.Д., Быковская С.Н., 2011).
В рамках исследования было проведено культивирование с последующим введением
аутологичных Т-регуляторов 6 пациентам. У 5 из 6 пациентов после введения через 2 недели
выявлено значимое увеличение содержания данных клеток в среднем с 2,1±1,25% до
3,8±1,4% (р=0,003) (табл. 6). При этом, одному из пациентов потребовалось 2 введения.
Анализ показал, что уровень CD8+ клеток и Т-регуляторов имели разнонаправленное
движение у всех пациентов.
Анализ клеточности вводимого субстрата показал, что в среднем пациентам
трансплантировалась фракция аутологичных культивированных ex-vivo клеток 6,44±1,3х107
(4,5-8,0х107). Метод введения у всех пациентов соответствовал протоколу – клетки
вводились подкожно в область живота, побочных реакций на введение зафиксировано не
было ни у одного пациента.
Нами был проведен анализ инвалидизации по шкале EDSS (табл. 7) в контексте
терапии Т-регуляторами для 6 пациентов с РС. Было выявлено, что средняя оценка по шкале
EDSS на момент введения Т-регуляторов составила 2,58±1,31 балла, а на +60 день от
достижения целевого показателя Т-регуляторов в периферической крови 2,0±0,86 балла
(p=0,04), что демонстрировало достоверную положительную динамику. Обострений в
течение 7 месяцев после введения клеток зафиксировано не было.
16
Таблица 7.
Клиническая характеристика пациентов до и после терапии культивированными
Т-регуляторами (n=6)
Пациент
Возраст на
EDSS на момент
EDSS после
Количество введений
момент
введения Т-
терапии
Т-регуляторов для
включения в
регуляторов
(баллы)
достижения целевого
исследование
(баллы)
показателя
(лет)
Пациент 1
17
2,0
1,0
1
Пациент 2
16
2,0
1,5
1
Пациент 3
9
3,5
3,0
1
Пациент 4
14
1,0
1,0
2
Пациент 5
17
4,0
3,5
1
Пациент 6
16
3,0
2,0
1
Длительность эффективного периода действия клеток составляла в среднем 7,2±1,45
месяцев, что выражалось в стабильно высоких показателях Т-регуляторов при исследовании
субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови. При снижении количества
Т-регуляторов или наличия минимальной неврологической симптоматики, решался вопрос о
повторном введении аутологичных культивированных ex-vivo Т-регуляторах.
При анализе статуса пациентов, получивших клеточную терапию, выявлено снижение
количества эффекторных клеток, оказывающих деструктивное влияние на миелин при
введении Т-регуляторов и благоприятное изменение ИРИ, характеризующееся его
нормализацией. Подобные изменения наблюдались у пациентов и при анализе статуса в
рамках обострения и вне его. Кроме того, было показано, что при переходе из стадии
обострения
в
ремиссию
происходит
увеличение
числа
Т-регуляторов,
что
было
продемонстрировано и на взрослой группе больных (Zhang L., 2009; Быковская С.Н., 2011).
Благодаря возможности выделения и индукции ex-vivo больших количеств долго
живущих, неспецифичных, неиммуногенных Т-регуляторов с высокой супрессорной
активностью и позитивного опыта введения аутологичных Т-регуляторов взрослым с РС,
данный метод успешно использован в качестве коррекции иммунных нарушений и у детей,
страдающих РС. Безопасность и эффективность метода была показана в данном
исследовании - получено достоверное увеличение количество Т-регуляторов в крови детей с
РС, что свидетельствует о миграции данных клеток в кровь, осложнений терапии выявлено
не было.
Результаты трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у детей с РС
Представлены результаты терапии 9 детей с РС, получавших лечение в рамках
протокола по проведению высокодозной терапии с последующей Ауто-ТГСК. Ключевыми
17
показателями эффективности предложенной терапии были определены стабилизация
неврологической
картины,
отсутствие
отрицательной
динамики
по
данным
МРТ,
нормализация показателей субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови и
отсутствие выраженных осложнений.
Средний возраст пациентов, включенных в протокол, на момент Ауто-ТГСК составил
16±1,7 лет, длительность заболевания на момент включения в исследование составила
3,3±0,7 года, что достоверно (р=0,009) больше, чем для пациентов, получивших клеточную
терапию. Важно отметить, что всем пациентам проводилось лечение высокими дозами
кортикостероидов и ВВИГ в период обострения, длительная терапия проводилась
препаратами ИНФ бета 1b, часто без эффекта. При стероидрефрактерном течении пациентам
дополнительно применялся плазмаферез (n=3), ряду пациентов выполнялась терапия
Митоксантроном (n=2) с недостаточным положительным эффектом.
Для подтверждения тяжелого рефрактерного течения заболевания проводился анализ
по следующим параметрам: оценка по шкале инвалидизации, длительность заболевания и
длительность неуспешной терапии в период рефрактерности. Первым этапом был выполнен
подсчет среднего балла по шкале EDSS, который составил 6,16±0,2 балла (3,0 – 9,0). Средняя
длительность заболевания на момент включения в исследование составила 28,8±13,38
месяцев.
Выполнен анализ различия результатов проведенной терапии в группе 1 и 2. При
проведении терапии по протоколу у пациентов группы 1 отмечалось быстрое улучшение
неврологического статуса уже в раннем посттрансплантационном периоде, что обусловлено,
вероятно, действием ЦФ и АТГ. Так, улучшение оценки по шкале EDSS в первые 60 дней в
среднем составило 2,5±0,21 балл, при этом в последующий период - лишь 0,2±0,02 балла, что
подтверждает теорию о том, что значимый эффект Ауто-ТГСК достигается благодаря
действию иммуносупрессивных агентов, используемых в кондиционировании (Burt RK,
2009).
Максимальное улучшение оценки по шкале EDSS в исследуемой когорте пациентов
составило – 5.5 баллов, среднее значение – 2,7±0,3 балл. У пациентов 4 и 6 (группа 1)
отмечалось снижение EDSS до 1 балла с минимальными признаками проявлений РС.
Динамика оценки по шкале EDSS в зависимости от времени наблюдения показана на рис. 1.
Все пациенты наблюдаются в нашей больнице и других клиниках (для больных старше 18
лет). Период наблюдения на момент статистической обработки данных составил 21,1±0,9
месяца (6 - 42 месяцев).
18
Рисунок 1. Клиническая оценка динамики состояния пациентов по шкале EDSS в
зависимости от дня относительно Ауто-ТГСК. Знаком * отмечены пациенты группы 2.
При исследовании было достоверно установлено, что у пациентов, терапия которых
была начата своевременно, исход ТГСК была значимо лучше. Так, улучшение по шкале
EDSS во второй группе составило 1,7±0,41, а в группе 1 – 3,125±0,72, при этом различия
были статистически достоверны (р=0,01). Особо стоит отметить, что у пациентов 6 и 7
начальная степень инвалидизации не была высокой, что обусловило сравнительно
небольшое улучшение оценки по EDSS (табл. 8). Таким образом, важнейшим фактором
успеха
является
своевременность
начала
терапии,
что
подчеркивается
различием
восстановления неврологических показателей у пациентов группы своевременного и
позднего начала эффективной терапии.
Таблица 8.
Зависимость улучшения оценки по шкале EDSS и своевременности начала
высокодозной иммуносупрессивной терапии.
Пациент
2
4
6
7
Группа 1
Улучшение по шкале
EDSS
5,5
3
2
2
Пациент
1
3
5
8
9
Группа 2
Улучшение по шкале
EDSS
2,5
2
2
1
1
При анализе гематологической и общесоматической составляющей протокола, было
показано, что
у пациентов после Ауто-ТГСК достаточно быстро фиксировалось
восстановление лейкоцитарного ростка (количеств лейкоцитов выше 1,0 тыс/мкл), что
19
отражено в табл. 9. В среднем восстановление лейкопоэза происходило на 11,2±0,7 день, что
сокращало период аплазии кроветворения и уменьшало риск возможных осложнений.
При этом, осложнения проводимой терапии фиксировались в 66,7% случаев (6
пациентов из 9), однако они не носили жизнеугрожающий характер и были представлены
фебрильной нейтропенией (n=4) и сывороточной болезнью (n=2). Данные осложнения были
купированы усилением антибактериальной терапии и кратким курсом метилпреднизолона
соответственно.
Отдаленных
осложнений
проведенной
терапии
(ИТП
и
другие)
зафиксировано не было.
Таблица 9.
Клиническая характеристика пациентов до и после Ауто-ТГСК на ранних сроках (n=9)
Пациент
Возраст на
момент
включения в
исследование
EDSS на момент
включения в
исследование
EDSS через 6
месяцев
после АутоТГСК
Осложнения
Пациент 1
17
8,5
6,0
Фебрильная
нейтропения
Пациент 2
Пациент 3
17
17
9,0
7,0
3,5
5,0
Пациент 4
Пациент 5
16
17
4,0
5,0
1,0
3,0
Пациент 6
16
3,0
1,0
Пациент 7
Пациент 8
15
15
5,0
6,0
3,0
5,0
Пациент 9
17
6,5
5,5
Среднее
число
введенных
в
день
0
День
восстановления
лейкоцитов>1
тыс/мкл
приживления
+11
+12
+10
Фебрильная
нейтропения
+12
+10
Фебрильная
нейтропения
Сывороточная
болезнь
+11
+10
+13
Сывороточная
болезнь
Фебрильная
нейтропения
CD34-позитивных
+12
клеток
составило
4,27±1,12х106/кг (3,0 – 5,0х106/кг), что соответствовало требованиям протокола.
7 (77,7%) пациентов из 9 в настоящий момент находятся в ремиссии. При этом
повторные обострения (рецидивы) у пациентов развились в двух случаях (у пациентов 4 и 5).
Данные пациенты относились к различным группам своевременности терапии, развитие
обострения после Ауто-ТГСК не было связано с клеточностью трансплантата либо другой
погрешностью в осуществлении метода. Так, у пациента 4 повторное обострение произошло
лишь через 3 года после Ауто-ТГСК на фоне стресса. До этого момента у пациента
отмечались
стабильные
клинико-рентгенологические
показатели
и
данные
субпопуляционного состава лимфоцитов крови, пациент не требовала поддерживающей
терапии. У пациента 5 повторное обострение случилось на фоне неудовлетворительных
показателей ИФТ – значимое снижение ИРИ, нарастание количества CD8+ клеток.
20
Одним из наиболее важных аспектов в оценке эффективности проведенной терапии и
прогноза по основному заболеванию явилось изучение изменения показателей ИФТ до и
после проведенной Ауто-ТГСК. Для подтверждения иммунологической эффективности
проведенного
лечения
проводился
анализ
субпопуляционного
состава
лимфоцитов
периферической крови. Так, было установлено, что статистически значимое увеличение
иммунорегуляторного индекса (ИРИ) CD4+/CD8+ (p=0,009) после проведения Ауто-ТГСК
соответствовало снижению аутоиммунной агрессии. При динамическом наблюдении данной
группы пациентов (n=9) до и после Ауто-ТГСК выявлено достоверное снижение количества
CD8+ клеток (р=0,004) по сравнению с уровнем до трансплантации, что обуславливает
изменение ИРИ у данных пациентов (табл. 10). Кроме того, в исследовании анализировалось
содержание Т-регуляторов в периферической крови. До трансплантации Т-регуляторы
составляли 1,38±0,86%, а после иммунореконституции уже – 3,56±1,53%, что указывает на
достоверно значимое возрастание данной клеточной популяции (р=0,0001) (табл. 10).
Полученные при проведении Ауто-ТГСК позитивные данные подтверждались
анализом
ИФТ
трансплантации
пациентов,
и
который
нарастание
показал
количества
увеличение
Т-регуляторов,
ИРИ
что
после
проведения
говорит
о явлении
«перезагрузки» иммунной системы. Обращает на себя внимание значимое уменьшение
количества Т-регуляторов на фоне рефрактерного аутоиммунного воспалительного процесса.
Причиной данного обстоятельства может быть увеличенная продукция провоспалительных
цитокинов активированными CD4+ Т-клетками, которые угнетают как образование Трегуляторов на периферии, так и повреждают уже существующие клетки. Помимо этого,
может наблюдаться цитотоксическое действие CD8+ клеток. В работе показана корреляция
улучшения оценки по шкале EDSS и изменений по данным ИФТ, что подтверждает теорию о
«перезагрузке» иммунной системы после Ауто-ТГСК. Увеличение количества Т-регуляторов
в крови детей с РС в стадии ремиссии заболевания может быть связано с тем, что в
дополнение к натуральным Т-регуляторам, образующимся в тимусе, прибавляются
индуцированные на периферии Т-регуляторы. Эти клетки образуются из CD4+ Т-клеток,
примированных антигеном. Необходимым условием для появления индуцированных Трегуляторов является присутствие трансформирующего фактора роста β (Transforming
growth factor beta – TGFβ). При этом индуцированные Т-регуляторы обладают таким же
фенотипом и функциями, как и натуральные.
21
Таблица 10.
Иммунофенотипирование детей с РС до и после Ауто-ТГСК
Фаза исследования
Показатель (%)
CD3+
CD8+
CD4+
CD4+/CD8+
(ИРИ)
CD19+
CD16+CD56+
CD4+CD25+Foxp3+
До Ауто-ТГСК (n=9)
После Ауто-ТГСК (n=9)
Значимость различий
73,32 ± 8,32
[64,80;86,60]
30,87 ± 6,28
[23,70;39,10]
35,47 ± 4,65
[33,20;42,50]
1,36 ± 0,84
[0,9;2,40]
11,59 ± 3,44
[7,20;19,70]
19,48 ± 5,38
[8,80;27,90]
1,38±0,86
[1,0;1,80]
69,76 ± 8,47
[55,10;77,40]
20,27 ± 5,19
[16,80;31,70]
39,89 ± 6,45
[35,20;45,50]
2,2 ± 0,53
[1,90;2,80]
10,23 ± 3,27
[5,90;18,40]
20,69 ± 8,95
[10,28;32,40]
3,56±1,53
[2,90;4,70]
0,09
0,004
0,11
0,009
0,46
0,32
0,0001
Особо стоит отметить, что применение гемопоэтических стволовых клеток
обусловлено необходимостью поддержки гемопоэза и скорейшему выходу из состояния
аплазии кроветворения. Данное исследование показало, что лейкоцитарное приживление
фиксируется на ранних сроках после Ауто-ТГСК, что способствует значимому уменьшению
числа возможных осложнений. Основной эффект при рефрактерном РС обусловлен
действием иммуносупрессивных препаратов.
Настоящее исследование подтвердило ряд данных представленных в мировой и
отечественной литературе. Так, большинство пациентов в исследовании составляли девочки,
что соответствует общепринятой тенденции. У пациентов, включенных в исследование,
отмечался достаточно длительный период заболевания от момента постановки диагноза до
момента начала эффективной терапии, что в ряде случаев обусловило глубокую
инвалидизацию. Данное наблюдение говорит и о необходимости оптимизации структуры
помощи детям с аутоиммунными заболеваниями ЦНС в РФ.
ВЫВОДЫ
1.
Представленные в исследовании протоколы терапии РС у детей с применением
аутологичных культивированных ex-vivo Т-регуляторов и/или высокодозной терапии с
последующей Ауто-ТГСК эффективны и безопасны.
2.
Введение культивированных ex-vivo аутологичных Т-регуляторных клеток детям с РС
позволило
предотвратить
подтверждалась
обострение
показателями
заболевания.
субпопуляционного
состава
нормализация ИРИ, возрастание количества Т-регуляторов.
22
Клиническая
эффективность
лимфоцитов
крови
–
3.
Высокодозная иммуноаблативная терапия (ЦФ и АТГ) с последующей Ауто-ТГСК
является эффективным методом терапии рефрактерных форм РС у детей. Данный метод
позволяет добиться стабилизации состояния пациентов и длительной ремиссии (77,7%
пациентов). Нормализация иммунного статуса пациентов после Ауто-ТГСК свидетельствует
о явлении «перезагрузки» иммунной системы.
4.
Определяющим фактором эффективности Ауто-ТГСК у детей с РС является
своевременность ее проведения, что заметно улучшает прогноз.
5.
У пациентов с РС при обострении и после проведения Ауто-ТГСК в периферической
крови снижается количество Т-регуляторов. После обострения и при иммунореконституции
после Ауто-ТГСК данный показатель увеличивается, что указывает на то, что Т-регуляторы
могут рассматриваться как маркер эффективности проводимой терапии.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1.
Детям с рефрактерным течением РС показано проведение высокодозной терапии ЦФ и
АТГ с последующей Ауто-ТГСК. Начало данной терапии не должно затягиваться.
2.
Для контроля эффективности терапии РС рекомендуется изучение субпопуляционного
состава лимфоцитов периферической крови пациентов как до, так и после терапии. При
тенденции к снижению ИРИ и нарастанию количества цитотоксических Т-лимфоцитов
необходимо принимать решение об эскалации проводимой терапии.
3.
Лечение культивированными ex-vivo Т-регуляторами рекомендуется в качестве терапии
выбора для пациентов с РРРС вне обострения при возможности строгого соблюдения
условий протокола, и применяться как альтернатива препаратам ИНФ.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1.
Оценка эффективности аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых
клеток в терапии рефрактерных форм вторично-прогрессирующего рассеянного склероза.
К.И. Киргизов, Е.В. Скоробогатова, Р.Ц. Бембеева, А.А. Масчан, Э.Ю. Волкова. Вестник
гематологии. Том VII №1 2011 стр. 24-25;
2.
Effectiveness of autologous hematopoietic stem cell transplantation in case of very severe
refractory forms of secondary-progressive multiple sclerosis at children. R. Bembeeva, K.Kirgizov,
E. Skorobogatova, E.Volkova – European Journal of Paediatric Neurology Vol. 15 May 2011
Suppl. 1 (EPNS Congress 11-14 May 2011 abstracts) S110;
3.
Применение
высокодозной
химиотерапии
с
последующей
аутологичной
трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток и таргетной терапии в контексте
лечения детей с крайне тяжелыми формами аутоиммунных заболеваний ЦНС Р.Ц. Бембеева,
23
К.И. Киргизов, Э.Ю. Волкова, Е.В. Скоробогатова, А.А. Масчан, А.А. Бологов, С.В. Пилия.
Сборник тезисов XVI конгресса педиатров России с международным участием «Актуальные
проблемы педиатрии» 24-27 февраля 2012 года, стр. 78;
4.
Effectiveness of autologous hematopoietic stem cell transplantation in case of refractory forms
of multiple sclerosis at children. K.Kirgizov, E. Skorobogatova, R Bembeeva, E.Volkova, A.
Maschan. Bone Marrow Transplantation Vol. 47 Suppl. 1 (38th Annual Meeting of the European
Group for Blood and Marrow Transplantation Abstract book, Geneva, Switzerland, 1-4 April 2012)
P695, S229-230;
5.
Применение аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток и
тергетной терапии в лечении детей с крайне тяжелыми формами аутоиммунных заболеваий
центральной нервной системы – К.И. Киргизов, Р.Ц. Бембеева, Э.Ю. Волкова, Е.В.
Скоробогатова, А.А. Масчан, А.А. Бологов, С.В. Пилия. Вопросы гематологии/онкологии и
иммунопатологии в педиатрии 2012 том 11 №3 (Тезисы III Межрегионального совещания
НОДГО 1-3 июня 2012 года), стр. 46-47;
6.
Подходы к терапии рефрактерных форм рассеянного склероза и оптикомиелита Девика у
детей - Бембеева Р.Ц., Киргизов К.И., Скоробогатова Е.В., Волкова Э.Ю., Масчан А.А.,
Сборник материалов XVII Съезд педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии» 1417 февраля 2013 года, стр. 62;
7.
Autologous haematopoietic stem cell transplantation for paediatric patients with multiple
sclerosis: outcome and prognosis. K. Kirgizov, R. Bembeeva, E. Volkova, O. Blagonravova, A.
Maschan, E. Skorobogatova – Bone Marrow Transplantation Vol. 48 Suppl. 2 (39th Annual Meeting
of the European Group for Blood and Marrow Transplantation Abstract book, London, UK, 7-10
April 2013) P994, S336-337;
8.
Подходы к лечению рефрактерных форм рассеянного склероза и оптикомиелита Девика
у детей. К.И. Киргизов, Р.Ц. Бембеева, Э.Ю. Волкова, С.В. Пилия, Е.В. Скоробогатова, А.А.
Масчан. Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии, №1 том 12 2013
(Тезисы IV Межрегионального совещания НОДГО 7-9 июня 2013 года), стр. 54-55;
9.
Hematopoietic stem cell transplantation in severe refractory autoimmune diseases of central
nervous system in pediatric patients. Kirgizov KI, Volkova EJ, Piliya SV, Maschan AA,
Kuzenkova LM, Skorobogatova EV, Bembeeva RC – European Journal of Paediatric Neurology
(EPNS Congress 25-28 September 2013 abstracts) P139-1715, S91;
10. Аутологичная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у детей с тяжелыми
рефрактерными формами рассеянного склероза – К.И. Киргизов, Е.В. Скоробогатова, Р.Ц.
Бембеева, Э.Ю Волкова, А.А. Бологов, С.В. Пилия, А.А. Масчан, А.Г. Румянцев. Вопросы
современной педиатрии 2013/том12/№1 стр. 149-152;
24
11. Опыт
применения
высокодозной
химиотерапии
с
последующей
аутологичной
трансплантацией стволовых клеток при аутоиммунных заболеваниях ЦНС. К.И. Киргизов,
Е.В. Скоробогатова, Э.Ю Волкова, А.А. Бологов, С.В. Пилия, Р.Ц. Бембеева, А.А. Масчан.
Детская больница №2(53)/2013 стр. 9-15;
12. Рефрактерные формы аутоиммунных заболеваний ЦНС у детей: мультидсциплинарный
подход к терапии. К.И. Киргизов, Э.Ю. Волкова, С.В. Пилия, В.В. Константинова, С.Ю.
Шульга, О.Л. Благонравова, Р.Ц. Бембеева, Е.В. Скоробогатова. Медицинский вестник
Северного Кавказа №4 Т8 (32)/2013, стр. 24-30.
Список сокращений и условных обозначений
АТГ – антитимоцитарный глобулин
АПК – антиген-презентирующие клетки
Ауто-ТГСК – аутологичная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток
БСВ – бессобытийная выживаемость
ВВИГ – внутривенные иммуноглобулины
ВПРС – вторично-прогрессирующий РС
Г-КСФ – гранулоцитарный колониестимулирующий фактор
ГА – глатирамера ацетат
ГСК – гемопоэтические стволовые клетки
ЗВП – зрительные вызванные потенциалы
ИНФ – интерферон
ИРИ - иммунологический регуляторный индекс
ИФТ – иммунофенотипирование
КМ - костный мозг
МНК - мононуклеары
МСК – мезенхимальных стволовых клеток
МРТ – магнтино-резонансная томография
ОД – оптикомиелит Девика
ППРС – первично-прогрессирующий РС
ПИТРС - препараты, изменяющие течение РС
РС – рассеянный склероз
РРРС – рецидивирующе-ремиттирующий РС
СКПК – стволовые клетки периферической крови
Т-регуляторы – регуляторные Т-лимфоциты CD4+CD25+FoxP3+
ТГСК – трансплантация гемопоэтических стволовых клеток
25
ТОТ – тотальное облучение тела
ТПА – трансплантат против аутоиммунной реакции
ТР – тромбоциты
ЦНС – центральная нервная система
ЦсА – циклоспорин А
ЦСЖ – церебро-спинальной жидкости
ЦФ – Циклофосфамид
ЭР – эритроциты
ЭБВ – вирус Эпштейн-Барр
26