Выделение ДНК: гены на ладони Учебное руководство Ваша
advertisement
ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК: ГЕНЫ НА ЛАДОНИ УЧЕБНОЕ РУКОВОДСТВО ВАША СУЩНОСТЬ У ВАС В РУКАХ! Посмотрите на свою ДНК! ДНК является ежедневной темой для разговоров – ее клонируют, секвенируют, картируют, модифицируют. Познакомьте ваших учеников с молекулярной биологией – с помощью их собственной ДНК! Как ученые выделяют ДНК из клеток, составленных из липидов, белков, углеводов и солей? Мембраны разрушаются детергентом, чтобы ДНК оказалась в растворе; затем белки и другие органические молекулы разрушаются и отделяются от ДНК. ДНК собирается в виде осадка в форме, с которой далее можно делать все что угодно. Благодаря этой простой работе, ваши ученики получат представление о том, как в действительности в биотехнологии выделяется ДНК для различных целей. Они выделят их собственную ДНК из своих клеток и увидят, как она образует осадок в виде плавающих белых нитей. Нити ДНК легко можно собрать и переместить в стеклянный сосуд, который можно носить на шее, как кулон! Увидеть – значит поверить. Для учеников, в первый раз слышащих о молекулярной биологии, ДНК – нечто абстрактное и недоступное взгляду. Эта работа помогает сделать невидимое видимым – убедиться в том, что ДНК вполне реальна и осязаема. Каждый узнает что-то новое. Эта работа подходит для любого класса и не требует никакого специального оборудования. В старших классах можно совместить эту работу с уроками по строению и функциям ДНК, клеток и ферментов, а в средней школе она может быть замечательным введением в мир науки о ДНК. Мы приветствуем ваши комментарии и предложения. Наслаждайтесь! РУКОВОДСТВО ДЛЯ ПРЕПОДАВАТЕЛЕЙ КОНТРОЛЬНЫЙ СПИСОК() СОДЕРЖАНИЯ НАБОРА В этом разделе перечислены все компоненты, входящие в состав набора по выделению ДНК и требуемые дополнительные принадлежности. Каждый набор рассчитан на девять рабочих мест для учеников (на каждом рабочем месте может работать до 4 человек). Проверьте с помощью этого списка, все ли у вас есть, перед тем как начать работу. Компоненты в составе набора Буфер для лизиса Сухая протеаза и соль 15 мл пробирки Разноцветные микропробирки Стерильные пипетки в индивидуальной упаковке Необходимые дополнительные принадлежности 91% изопропанол или 95% этанол Водяная баня с термометром* Стакан или штатив чтобы поместить 15 мл пробирки в водяную баню (до 36 пробирок) Стакан для слива Штативы для микроцентрифужных пробирок Контейнер со льдом Фломастеры Количество () 110 мл 1.5 г 50 60 60 Количество () ок. 360 мл 1 1 9 1-9 1 1-9 *Если водяной бани нет, можно воспользоваться термоизолирующим контейнером, например пенопластовой коробкой (достаточно большой, чтобы туда поместился стакан или штатив с 36 пробирками), и налить туда воду, нагретую до 50°С ВВЕДЕНИЕ ДЛЯ УЧИТЕЛЯ Почему вы должны проводить работу по выделению ДНК? 1) Выделение ДНК позволяет вашим ученикам увидеть их собственные гены Ваши ученики будут в восторге от того, что смогут собственными глазами увидеть вещество, делающие их уникальными. Выделенную ДНК можно перенести в стеклянный сосуд и бережно хранить сколь угодно долго. 2) Выделение ДНК помогает ученикам понять свойства ДНК Молекулы ДНК, из которых сделаны наши хромосомы, невероятно длинные и тонкие. Спросите своих учеников, как такие длинные молекулы могут поместиться внутрь микроскопических клеток эпителия щеки. Тонкие белые нити, которые увидят ваши ученики как осадок ДНК – это многие тысячи отдельных молекул, переплетенных друг с другом как клубок ниток. 3) Выделение ДНК это первый шаг в биотехнологии Выделение ДНК это первый шаг во многих биотехнологических процедурах: клонировании и картировании генов, секвенировании ДНК. Почти любой анализ ДНК подразумевает, что она должна быть выделена из клеток или тканей. С помощью этой работы ученики получают представление о том, как просто можно выделить ДНК для использования в современных научных экспериментах. Предполагаемый уровень учеников Эта работа подходит для учеников от 7 до 11 класса, как введение в мир ДНК или как впечатляющее дополнение к урокам молекулярной биологии. Даже ученики, которые выделяли ДНК из клеток лука или печени, найдут выделение своей собственной ДНК гораздо более интересным и важным. Это руководство содержит материалы как для уровня средней школы (базовый уровень), так и для уровня старших классов (продвинутый уровень). В зависимости от ваших потребностей, вы можете включать то или иное содержание в ваши уроки. Для каждого уровня приведено полное руководство Место в курсе Эта работа может быть выполнена в любое удобное время в течение года, но наиболее полезно связать ее со следующими темами: Биомолекулы Строение клетки Митоз и мейоз Генетика ДНК-технология Ученики старших классов должны иметь представление о структуре и функции ДНК перед началом этой работы. От учеников средней школы никаких предварительных знаний не требуется. Разбивка по урокам Эту работу можно уложить в один 45-минутный урок, но можно расширить это занятие, включив туда дополнительный материал: Урок 1 Введение в тему Урок 2 Выделение и осаждение ДНК из клеток эпителия щеки Урок 3 Изготовление ДНК-кулона (по желанию) Вопросы безопасности В этой работе не требуется никаких специальных мер предосторожности. Тем не менее, в помещении, где выполняется работа, нельзя есть, пить, курить, пользоваться косметикой. Рекомендуется использование перчаток и защитных очков. Ученики должны вымыть руки с мылом до и после урока. Если какой-то из растворов попадет кому-либо из учеников в глаза, тщательно промойте их водой. Ключи к успеху Для успешного выполнения работы необходимо собрать достаточное количество клеток со внутренней поверхности щеки. Проверьте, чтобы ваши ученики правильно выполнили эту процедуру. ВВЕДЕНИЕ И ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ ДЛЯ УРОВНЯ СРЕДНЕЙ ШКОЛЫ Что такое ДНК и что она делает? Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) – это молекула, присутствующая в клетках всех живых организмов - бактерий, растений, животных. ДНК несет генетическую информацию, которая наследуется, то есть передается от родителей к потомкам. ДНК определяет все физические признаки и особенности человека: цвет волос, глаз и кожи; рост; черты лица; группу крови и бесчисленное множество других. Ваша ДНК является комбинацией ДНК вашего отца (из его сперматозоидов) и вашей матери.(из ее яйцеклетки) сформировавшейся после оплодотворения. ДНК состоит из четырех повторяющихся химических «кирпичиков»: А (аденин), Г (гуанин), Т (тимин), Ц (цитозин). Последовательность этих четырех «букв» кодирует генетическую информацию. Из 33 букв в русском алфавите складывается бесчисленное количество слов; так из 4 букв на языке ДНК составляются понятные для клеток слова, называемые генами. Гены содержат информацию для синтеза белков, которые составляют основу нашего тела и всех его клеток. Все молекулы ДНК в вашей клетке образуют ваш геном. Точная последовательность букв в вашем геноме делает вас уникальным. Ученые установили, что последовательности ДНК у всех людей на 99.9% одинаковы. За наши различия между собой отвечает всего <0.1% последовательности ДНК! Где находится ДНК? За редким исключением, ДНК находится в каждой клетке любого организма. В наших клетках есть специальная структура, содержащая ДНК, так называемое ядро. Каждый раз когда клетка делится (при росте тела, залечивании повреждений или размножении организма) содержащаяся в ядре ДНК копируется и плотно упаковывается в хромосомы. Человеческий геном состоит из 46 хромосом, содержащих приблизительно 30,000 генов – инструкций по которым сделаны наши тела. На что похожа ДНК? На молекулярном уровне, ДНК похожа на винтовую лестницу. «Лестница» состоит из двух цепей ДНК, а пары букв А, Т, Г, Ц образуют «ступени». Структура, образуемая ДНК, называется двойной спиралью. Каждая нить ДНК очень тонкая и длинная, и плотно упакована, чтобы поместиться в клеточное ядро. Если полностью развернуть все 46 хромосом человека и сложить в ряд, цепочка ДНК достигнет двух метров в длину, а ширина цепи составит всего 2 нанометра (2 миллиардных части метра). Рис 1. Схематичное изображение ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты). ДНК – это длинная, похожая на цепь молекула, хранящая генетическую информацию Как мы можем увидеть ДНК? Мы можем увидеть ДНК, если возьмем много клеток, вскроем их, и соберем ДНК изо всех клеток вместе. Представьте себе молекулы ДНК как длинные белые нитки. Если нити висят в воздухе вдоль всей комнаты, их сложно увидеть, но если собрать все нитки в моток на полу, он будет виден очень хорошо. В этой лабораторной работе с помощью детергента и ферментов, ваши ученики вскроют клетки, собранные со внутренней поверхности щек и высвободят их них ДНК. Затем добавляется соль и холодный спирт, которые заставляют ДНК выпасть в осадок в виде достаточно большой, заметной глазу массы. ВВЕДЕНИЕ И ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ ДЛЯ УЧЕНИКОВ СТАРШИХ КЛАССОВ Применение ДНК-технологии Эта работа может быть частью уроков, посвященных структуре и функции ДНК, и позволит дать ученикам простой опыт общения со своей собственной ДНК. Но она приобретет еще большее значение, если ученикам будет понятно, что выделение ДНК является первым шагом многих биотехнологических процессов, таких как: Клонирование Клонирование – это получение множества копий гена или генома. Поврежденный ген, вызывающий болезнь, может быть клонирован, чтобы в дальнейшем определить его последовательность (секвенировать) и проанализировать с целью найти лекарство. Ген, кодирующий интересующий нас белок, может быть клонирован с целью перенести его в другой организм (см. Перенос генов ниже). Аналогично, весь геном может быть клонирован, путем переноса в ядра клеток, каждая из которых способна развиться в целый организм. Перенос генов: генетически модифицированные организмы (ГМО) Для того, чтобы получать большие количества ценных белков, таких как человеческий тромбин, гены, кодирующие такой белок, переносят в другие организмы, клетки которых можно быстро вырастить в большом количестве. Это могут быть бактерии, дрожжи, плесневые грибы, растения или животные. Иногда для производства нужного белка используют млекопитающих. Ген, кодирующий полезный белок, переносят в оплодотворенную яйцеклетку коровы. Молоко генетически модифицированной коровы будет содержать этот белок, и его можно будет оттуда выделить. Сельскохозяйственные растения сейчас часто содержат гены, происходящие из других организмов. Например, некоторые содержат ген, кодирующий белок, защищающий растения от гусениц. Другие могут содержать ген, дающий устойчивость к гербицидам, так что фермеры могут безбоязненно обработать ими все поле, уничтожив сорняки. ДНК-профилирование Используя технологию полимеразной цепной реакции (ПЦР), ученые могут находить отдельные участки ДНК, по которым одни люди отличаются от других, и получать большие количества этих последовательностей для анализа. С помощью гель-электрофореза можно наблюдать различия между двумя индивидами в виде набора полос, напоминающего штрих-код. Это технология помогает раскрывать преступления, определять отцовство и устанавливать эволюционное связи между разными видами. Выделение и очистка ДНК: как это работает? Ученики начинают работу с того, что осторожно пожевывают внутренние поверхности щек; при этом с них слущиваются эпителиальные клетки. Затем они полощут рот водой и сплевывают ее в пробирку или стакан, чтобы собрать клетки. К воде, содержащей клетки, добавляется буферный раствор для лизиса, содержащий детергент (моющее средство), разрушающий фосфолипидные мембраны клеток и высвобождающий ДНК. Буферный раствор обладает свойством поддерживать определенный pH, чтобы ДНК оставалась стабильной. Для того, чтобы разрушить связанные с ДНК белки, а также белки, которые могут повредить ДНК, к раствору добавляется протеаза – фермент, расщепляющий белки. Клеточный лизат, содержащий протеазу, инкубируется на оптимальной для ее работы температуре - 50ºС. ДНК и другие компоненты клетки, такие как белки, сахара и жиры, растворяются в буфере для лизиса. ДНК растворяется благодаря тому, что окружена молекулами воды, не дающими отрицательно заряженным фосфатным группам образовать прочные связи с положительно заряженными ионами, находящимися в растворе. Когда к раствору добавляется большое количество спирта, молекул воды становится относительно мало, и они уже не препятствуют взаимодействию ионов натрия с ДНК с образованием натриевой соли ДНК. На границе слоев воды и спирта начинает образовываться осадок в виде тонких белых нитей. В то же время, другие компоненты клетки остаются в растворе. ПОДГОТОВКА ПРЕПОДАВАТЕЛЕЙ К ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЕ Этот раздел содержит общий план работы, описывает необходимую подготовку, которую надо будет провести перед работой, моменты, которые надо будет подчеркнуть, и конкретную последовательность экспериментальных процедур. План работы Урок 1 Введение в работу. По желанию – наглядно объясните как будет производиться выделение ДНК (рекомендуется для учеников 7-9 классов). См. Приложение в конце руководства Урок 2 Собирание клеток со слизистой щек, выделение и осаждение ДНК Урок 3 30-45 минут – изготовление ДНК-кулона (по желанию) Использование пипетки Перед началом лабораторных занятий, покажите ученикам градуировки на пипетке. В качестве единицы измерения в течение работы будет применяться как 250 мкл так и 1 мл 1. Поместите спирт (этанол или изопропанол) в морозильник не менее чем за час до начала работы 2. Возьмите пакет, содержащий сухую протеазу и соль (помеченный prot) и надрежьте один угол. Высыпьте порошок в 15 мл пробирку. Добавьте 15 мл воды. Можно использовать как питьевую, так и дистиллированную воду. Приготовленный раствор протеазы надо хранить в холодильнике при +4ºС. Его можно использовать в течение недели. Если вы рассчитываете использовать набор для нескольких групп учеников в разное время, то надо отмерить часть порошка для использования сейчас, и сохранить другую часть в сухом виде для того, чтобы использовать потом. Концентрация протеазы в растворе должна быть 100 мг/мл. Отмерьте по 1.25 мл раствора протеазы в 8 розовых микропробирок, как описано ниже. Подготовка растворов для рабочих мест учеников (4 ученика на одно рабочее место): 1. Налейте 3 мл воды в 15-мл пробирку (по одной на каждого ученика). Подойдет любой тип питьевой воды 2. Налейте 1.25 мл раствора протеазы в 9 розовых микропробирок и обозначьте их «прот» 3. Налейте по 10 мл буфера для лизиса в 9 15-мл пробирок. Напишите на каждой «лизис» 4. Положите 4 15-мл пробирки с водой и пробирку с буфером для лизиса в стакан или штатив и поставьте на каждое рабочее место. Также положите или поставьте в штатив на каждом рабочем месте одну розовую микропробирку с раствором протеазы. Замечание: не всем может показаться удобным выплевывать воду после полоскания рта в 15 мл пробирку. Как альтернативный вариант, можно использовать любые маленькие стаканчики для питья. Контрольный список для проверки рабочих мест Материалов в этом наборе достаточно для обеспечения работы 36 учеников Рабочее место учителя Нагретая до 50°С водяная баня со стаканом или штативом для 36 15 мл пробирок Охлажденная бутылка 91% изопропанола или 95% этанола на льду. Рабочие места учеников (4 ученика на место) 15 мл пробирки, по 3 мл воды в каждой Розовая микропробирка, подписанная «прот», содержащая 1.25 мл раствора протеазы 15 мл пробирка, подписанная «лизис», содержащая 10 мл буфера для лизиса Одноразовые пластиковые пипетки Фломастер Стакан для слива Число 4 1 1 6 1 1 Замечания для преподавателя Для успешного выполнения работы необходимо собрать достаточное количество клеток со внутренней поверхности щеки. Проверьте, чтобы ваши ученики правильно выполнили эту процедуру. ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРОТОКОЛ В КАРТИНКАХ 1. Возьмите с вашего стола 15 мл пробирку, содержащую 3 мл воды. Подпишите ее вашими инициалами. 2. Осторожно пожуйте внутренние поверхности ваших щек в течение 30 секунд. НЕ НАДО кусать щеки до крови! 3. Наберите воду из 15-мл пробирки в рот и тщательно полощите его в течение 30 секунд. 4. Аккуратно выплюньте воду обратно в пробирку 5. Возьмите пробирку с буфером для лизиса с вашего стола, и добавьте 2 мл буфера к вашему образцу. 6. Закрутите пробирку крышкой и аккуратно переверните пробирку 5 раз (не трясите ее!). Посмотрите на пробирку. Вы заметили какие-то изменения? Если да, запишите их. 7. Возьмите с вашего стола маленькую пробирку с протеазой («прот»). Добавьте 5 капель протеазы (250 мкл) к вашему образцу. 8. Закройте пробирку и несколько раз переверните ее, чтобы перемешать содержимое 9. Поместите вашу пробирку в штатив или стакан на водяную баню, нагретую до 50°С на 10 минут. По истечении этого времени выньте пробирки. 10. Возьмите у вашего преподавателя пробирку с холодным спиртом. Держа пробирку с вашим образцом под углом 45, наполните ее спиртом (надо добавить около 10 мл). 11. Закройте вашу пробирку крышкой и понаблюдайте за ней, не трогая ее, в течение 5 минут. Запишите все что происходит в пробирке. 12. Через 5 минут медленно переверните пробирку 5 раз, чтобы ускорить осаждение ДНК 13. Вы можете сохранять свою ДНК в микропробирке, или сделать ДНК-кулон, перенеся 750 мкл-1 мл раствора в стеклянный фиал (см. набор ДНК-кулон) РУКОВОДСТВО ДЛЯ УЧЕНИКОВ: БАЗОВЫЙ УРОВЕНЬ ГЕНЫ НА ЛАДОНИ: ВАША СУЩНОСТЬ У ВАС В РУКАХ СОДЕРЖАНИЕ Урок 1 Введение Урок 2 Выделение и осаждение ДНК из клеток слизистой щеки Урок 3 Изготовление ДНК-кулона (по желанию) УРОК 1: ВВЕДЕНИЕ Что такое ДНК и что она делает? Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) – это молекула, присутствующая в клетках всех живых организмов - бактерий, растений, животных. ДНК несет генетическую информацию, которая наследуется, то есть передается от родителей к потомкам. ДНК определяет все физические признаки и особенности человека: цвет волос, глаз и кожи; рост; черты лица; группу крови и бесчисленное множество других. Ваша ДНК является комбинацией ДНК вашего отца (из его сперматозоидов) и вашей матери.(из ее яйцеклетки) сформировавшейся после оплодотворения. ДНК состоит из четырех повторяющихся химических «кирпичиков»: А (аденин), Г (гуанин), Т (тимин), Ц (цитозин). Последовательность этих четырех «букв» кодирует генетическую информацию. Из 33 букв в русском алфавите складывается бесчисленное количество слов; так из 4 букв на языке ДНК составляются понятные для клеток слова, называемые генами. Гены содержат информацию для синтеза белков, которые составляют основу нашего тела и всех его клеток. Все молекулы ДНК в вашей клетке образуют ваш геном. Точная последовательность букв в вашем геноме делает вас уникальным. Ученые установили, что последовательности ДНК у всех людей на 99.9% одинаковы. За наши различия между собой отвечает всего <0.1% последовательности ДНК! Где находится ДНК? Наши тела состоят из мельчайших «кирпичиков» - клеток. Из них составлены все ткани и органы (мышцы, мозг, железы, пищеварительная система, кожа и.т.п.). Клетки отделены одна от другой мембранами, сделанными из липидов (жиров) и белков. Внутри клетки также есть разные структуры со специализированными функциями. Одна из структур, так называемое ядро, является «генеральным штабом» клетки. В нем находятся молекулы ДНК, содержащие инструкции для выполнения всех функций клетки. Наши клетки содержат 46 молекул ДНК, плотно упакованных особым образом – хромосом. При каждом делении клетки хромосомы копируются, так что дочерние клетки получают идентичный генетический материал. На что похожа ДНК? На молекулярном уровне, ДНК похожа на винтовую лестницу. «Лестница» состоит из двух цепей ДНК, а пары букв А, Т, Г, Ц образуют «ступени». Структура, образуемая ДНК, называется двойной спиралью. Каждая нить ДНК очень тонкая и длинная, и плотно упакована, чтобы поместиться в клеточное ядро. Если полностью развернуть все 46 хромосом человека и сложить в ряд, цепочка ДНК достигнет двух метров в длину, а ширина цепи составит всего 2 нанометра (2 миллиардных части метра). Рис 1. Схематичное изображение ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты). ДНК – это длинная, похожая на цепь молекула, хранящая генетическую информацию Как мы можем увидеть ДНК? Шаг 1. Собрать клетки Чтобы увидеть вашу ДНК, вам придется собрать клетки с внутренней поверхности вашей щеки, лизировать их, и собрать ДНК из всех клеток вместе. Для того, чтобы собрать тысячи клеток достаточно просто пожевать внутренние поверхности щек и промыть рот водой. Эпителиальные клетки внутри вашего рта делятся один или два раза в день. Старые клетки постоянно слущиваются, а их место занимают новые. Это происходит каждый раз,когда вы едите Вопрос 1: как вы могли бы проверить, что вы действительно собрали клетки из вашего рта? Какое лабораторное оборудование вы могли бы использовать для этого? Шаг 2 Вскрыть (лизировать) клетки После того ,как вы собрали клетки, их необходимо лизировать (разрушить), чтобы высвободить ДНК. Мембраны клеток сделаны из жиров и белка и детергент (моющее средство) растворяет их точно так же, как растворяет жиры и белки на грязной сковородке. Процесс разрушения клеток называется лизисом, а содержащий детергент раствор – буфером для лизиса. После растворения мембран, ДНК оказывается в растворе. Вопрос 2: какой водой лучше мыть посуду, теплой или холодной? Как вы думаете, при высоких или низких температурах детергент будет лучше разрушать мембраны? Вопрос 3: Как вы думаете, будет ли ДНК видна после того, как вы разрушили клетки? Почему вы так думаете? Шаг 3: Удаление белков ДНК плотно упакована с помощью белков, она фактически намотана на них, как нитки намотаны на катушку. Благодаря этому она не запутывается и имеет сложно организованную структуру. Чтобы вы смогли увидеть ДНК, надо удалить эти белки, чтобы молекулы ДНК из разных клеток собрались в один большой комок. Для этого вы будете инкубировать ваши лизированные клетки с протеазой, ферментом, расщепляющим белки, так что они больше не способны связывать ДНК. Протеаза это фермент, который работает лучше всего при 50ºС – это температура слегка горячей воды. Помимо белков, связанных с ДНК, протеаза расщепляет любые оставшиеся клеточные или мембранные белки, которые могут помешать выделению ДНК. Вопрос 4: как вы думаете, где протеазы находятся в вашем теле? Подсказка: где расщепляются белки, которые вы едите? Шаги 4 и 5: осаждение ДНК Нити ДНК такие тонкие, что увидеть их, когда они растворены в воде, невозможно. Представьте себе тонкую белую нитку. Если растянуть ее в воздухе через всю комнату, ее будет трудно увидеть. Однако, если собрать ее всю в комок на полу, вы легко ее обнаружите. В этой лабораторной работе вы используете соль и холодный спирт, чтобы вывести ДНК из раствора, или осадить ее. Добавление соли и спирта создает условия, когда ДНК не может больше растворяться, и она слипается вместе, образуя плотный комок. Вопрос 5: пробовали ли вы когда-нибудь добавлять сахар в холодный чай? Легко ли он растворялся? Легче ли растворить то же количество сахара в горячем чае? На что похож осадок ДНК? Как соль, или сахар, ДНК бесцветна, когда растворена в жидкости, но достаточно большой осадок ДНК белый. Осадок становится виден как тонкие белые нити, висящие в жидкости. Эти нити хрупкие, и могут легко порваться. Когда масса ДНК вынимается из жидкости, она слипается в комок, как лапша вынутая из кастрюли. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОСАЖДЕНИЕ ДНК: ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРОТОКОЛ Контрольный список для проверки вашего рабочего места Рабочее место учителя Нагретая до 50°С водяная баня со стаканом или штативом для 36 15 мл пробирок Охлажденная бутылка 91% изопропанола или 95% этанола на льду Рабочие места учеников (4 ученика на место) 15 мл пробирки, по 3 мл воды в каждой Розовая микропробирка, подписанная «прот», содержащая 1.25 мл раствора протеазы 15 мл пробирка, подписанная «лизис», содержащая 10 мл буфера для лизиса Одноразовые пластиковые пипетки Фломастер Стакан для слива Число 4 1 1 6 1 1 Процедура выделения ДНК Шаги 1 и 2: сбор и лизис клеток Чтобы собрать достаточное количество эпителиальных клеток со слизистой ваших щек, вы должны осторожно жевать внутренние части вашего рта в течение 30 секунд, и потом прополоскать рот небольшим количеством воды. Для успеха работы важно собрать нужное количество клеток, поэтому удостоверьтесь в том, что вы достаточно долго жевали ваши щеки. 1. Возьмите с вашего стола 15 мл пробирку, содержащую 3 мл воды. Подпишите ее вашими инициалами. 2. Осторожно пожуйте внутренние поверхности ваших щек в течение 30 секунд. НЕ НАДО кусать щеки до крови! 3. Наберите воду из 15-мл пробирки в рот и тщательно полощите его в течение 30 секунд. Не глотайте воду! 4. Аккуратно выплюньте воду обратно в пробирку 5. Найдите на вашем столе 15-мл пробирку с надписью «лизис». Используя чистую одноразовую пластиковую пипетку, добавьте 2 мл буфера для лизиса в вашу пробирку. 6. Закрутите пробирку крышкой и аккуратно переверните пробирку 5 раз (не трясите ее!). Посмотрите на пробирку. Вы заметили какие-то изменения? Если да, запишите их. Шаг 3: удаление белков 1. Возьмите с вашего стола маленькую пробирку с протеазой («прот»). Добавьте 5 капель протеазы (250 мкл) к вашему образцу. 2. Закройте пробирку и несколько раз переверните ее, чтобы перемешать содержимое 3. Поместите вашу пробирку в штатив или стакан на водяную баню, нагретую до 50°С на 10 минут. По истечении этого времени выньте пробирки. Шаги 4 и 5: сделайте вашу ДНК видимой 1. (Возможно, вам нужно будет сделать этот шаг на столе учителя.) Возьмите у вашего преподавателя пробирку с холодным спиртом. Наполните одноразовую пластиковую пипетку холодным спиртом 3. Держа пробирку с вашим образцом под углом 45º, добавьте туда 10 мл спирта, так чтобы он медленно стекал по стенке пробирки. Завинтите крышку на пробирке. 4. Поставьте пробирку прямо перед вами в стакан или штатив, и оставьте ее на 5 минут, не трогая. 5. Через 5 минут, снова посмотрите на пробирку. Обратите внимание на границу слоев воды и спирта. Вы видите что-нибудь? Запишите свои наблюдения. Сравните ваш образец с образцами ваших одноклассников. 6. Медленно переверните пробирку 5 раз, чтобы ускорить осаждение ДНК. Обратите внимание на плавающие в пробирке нити, белые или прозрачные. Это ваша ДНК! 7. Если вы хотите сделать кулон со своей ДНК, учитель даст вам стеклянную бутылочку. Вы должны одноразовой пипеткой осторожно перенести туда вашу ДНК вместе с 750 мкл-1 мл раствора. Учитель покажет вам, как запечатать бутылочку и сделать кулон. Если вы не хотите делать кулон ,вы можете перенести свою ДНК в микропробирку и хранить ее там. Просто перенесите одноразовой пипеткой ДНК вместе с 1 мл раствора спирта в микропробирку. Закройте крышку и удивите ваших близких и друзей вашей собственной ДНК! РУКОВОДСТВО ДЛЯ УЧЕНИКОВ: ПРОДВИНУТЫЙ УРОВЕНЬ ГЕНЫ НА ЛАДОНИ: ВАША СУЩНОСТЬ У ВАС В РУКАХ СОДЕРЖАНИЕ Урок 1 Введение Урок 2 Выделение и осаждение ДНК из клеток слизистой щеки Урок 3 Изготовление ДНК-кулона (по желанию) ВВЕДЕНИЕ Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) это молекула, присутствующая в клетках всех живых организмов, от бактерий до высших растений и животных. ДНК переносит генетическую информацию и определяет ваш цвет волос, глаз, рост, телосложение, черты лица, группу крови и все остальное, что делает вас уникальным. Также ДНК несет информацию, необходимую клеткам для выполнения всех функций. Ваша ДНК является комбинацией ДНК вашего отца (из его сперматозоида) и вашей матери (из ее яйцеклетки), сформировавшейся после оплодотворения. Все клетки вашего организма несут этот полный набор инструкций. Любая выделенная из клеток ДНК выглядит одинаково, но все равно здорово посмотреть на собственную ДНК, осознавая, что это то, что делает вас живым и уникальным. В этой лабораторной работе вы выделите собственную ДНК из эпителиальных клеток со внутренней поверхности ваших щек. Вы будете использовать простую и быструю процедуру, которую ученые обычно используют для выделения ДНК из различных источников. Каждый день, по мере исследования информации, закодированной в нашей ДНК,.совершаются новые открытия. Знания о ДНК таят в себе возможность лечить болезни, дарят надежду миллионам людей, страдающим от различных генетических расстройств, помогают делать лучшие сельскохозяйственные продукты и являются ключом к долголетию. Изучая собственные гены, мы начинаем понимать, кем мы являемся и почему. Структура ДНК На молекулярном уровне, ДНК похожа на винтовую лестницу. Две длинных молекулы расположены одна вдоль другой и соединены «ступенями» из оснований. Структура ДНК обычно называют двойной спиралью, так как каждая из цепей закручена по спирали. Основания функционируют как буквы в генетическом коде, поэтому их обычно называют А, Т, Г, Ц (по первым буквам их полных названий – аденин, тимин, гуанин, цитозин). Каждое основание соединено с молекулой сахара и фосфатной группой. Связанные между собой сахара и фосфаты образуют сами цепи, или «остов» молекулы. (элементарная единица, из которой сложена структура ДНК, называется нуклеотидом. Она состоит из основания, сахара и фосфатной группы). Ученые обнаружили, что основания образуют пары друг с другом определенным образом: А всегда образует пару с Т, а Г – с Ц. Рис 3. Схематическое изображение ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты). ДНК это длинная молекула в виде цепи, которая хранит генетическую информацию Четыре химических «буквы» в составе ДНК, образуют длинные «слова», которые называются генами. Гены содержат информацию о том, как сделать белки, являющиеся структурной и функциональной основой всех клеток. Каждая из ваших клеток содержит несколько миллиардов букв генетического «текста» Последовательности ДНК у разных людей идентичны на 99.9%, поэтому всего 0.1% последовательности - случайные изменения в некоторых буквах - отвечает за различия между вами и вашим одноклассником. Геном, хромосомы, гены, ДНК, РНК и белки…как все это связано друг с другом? ДНК находится в ядре каждой клетки вашего тела, за исключением созревших эритроцитов (красных кровяных клеток). Цепи ДНК, как нитки на катушку, накручены на белки и организованы в сложные структуры, называемые хромосомами. При каждом делении клетки хромосомы копируются в процессе митоза. 46 хромосом, находящихся в клетках человека, можно уподобить 46 томам энциклопедии, которые вместе содержат всю информацию – это ваш геном. Ген – это участок ДНК, содержащий информацию для изготовления белка. Он является «рецептом», где указан состав и порядок сборки белка. Человеческий геном содержит около 30,000 генов. Геном можно сравнить с гигантской поваренной книгой (помните, что она состоит из 46 томов). Не все рецепты в книге используются сразу в одно время, точно так же и не все гены в геноме работают одновременно в одной и той же клетке. Выборочная экспрессия разных генов отличает разные типы клеток друг от друга. Все ваши клетки содержат одни книги (хромосомы), но разные клетки «читают» оттуда разные рецепты (гены). Хотя гены и определяют, какие белки будут сделаны клетками, ДНК не является непосредственной матрицей для синтеза белков. Такими матрицами являются молекулы РНК (рибонуклеиновой кислоты), так называемые матричные РНК (мРНК). Каждая мРНК это копия последовательности ДНК для одного гена. мРНК это посредники, которые передают информацию из ДНК, находящейся в ядре, в цитоплазму, где находятся рибосомы – «фабрики» по производству белка. Рибосомы расшифровывают генетическую информацию и соединяют разные аминокислоты друг с другом в нужной последовательности, чтобы сделать закодированной в данном гене белок. Синтезированные в клетке белки определяют ее характерные признаки. Вопросы: 1. Представьте, что вы объясняете разницу между хромосомами, генами и ДНК вашему брату или сестре, который(ая) на два года младше вас. Напишите объяснение простыми словами, которые они могли бы понять. 2. Клетка печени и клетка эпителия содержат одни и те же хромосомы? 3. Если вам надо выделить ген, который кодирует белок, находящийся в желудке, можете ли вы найти этот ген в клетках эпителия? Объясните ваше предположение. Как можно выделить ДНК из клеток? Шаг 1. Собрать эпителиальные клетки с поверхности щеки Первым шагом в любой процедуре выделения ДНК является сбор клеток. Клетки ,выстилающие внутреннюю поверхность рта, очень часто делятся и слущиваются. Достаточно слегка пожевать свои щеки изнутри и промыть рот водой, чтобы собрать необходимое для выделения ДНК количество клеток. Вопросы: 4. Ниже приведено схематическое изображение эпителиальной клетки Обозначьте различные структуры клетки, включая ядро, цитоплазму и мембрану. 5.В каком месте в клетке по вашему мнению находится геномная ДНК? 6.Почему для того, чтобы генетическая информация могла быть транслирована в белки, нужен посредник, такой как мРНК? 7.Как вы думаете, каким будет первый шаг для выделения вашей ДНК? Шаг 2. Лизис клеток и растворение фосфолипидных мембран Если вы написали, что первым шагом выделения ДНК будет являться разрушение клеток, вы угадали! Детергент растворяет гидрофобные (жирные) молекулы, а ядерные и клеточные мембраны состоят в основном из таких молекул (вы могли уже слышать о фосфолипидных бислойных мембранах). После того, как вы собрали клетки со внутренней поверхности вашего рта, вы добавляете к ним раствор детергента. Вопросы: 6. После того, как мембраны растворятся, ДНК окажется в растворе, но вместе с ней там окажутся и множество других видов молекул, находившихся в клетке. Напишите, что это могут быть за молекулы. 7. Какие методы или агенты могут быть использованы, чтобы избавиться от этих нежелательных молекул? Шаг 3. Использование протеазы для того чтобы разрушить клеточные белки Как вы уже могли догадаться, большинство молекул, которые могут помешать выделению чистой ДНК – это белки. Мы можем легко избавиться от белков, не повредив ДНК, если используем специальный фермент, расщепляющий белки, так называемую протеазу. Протеаза расщепляет пептидные связи между отдельными аминокислотами, из которых состоит белок. Уничтожая все белки, вы в том числе уничтожаете ферменты, расщепляющие ДНК- ДНКазы - которые могут помешать выделению. Вопросы: 8. Какие белки могут быть ассоциированы с ДНК в клетке? 11. Протеаза, используемая в нашей работе, лучше всего работает при 50С. Как вы думаете, ее выделили из Е. coli? Аргументируйте ваш ответ. Подсказка: где в природе находится E. coli? 9. Размягчитель мяса часто используется, чтобы сделать жесткие куски мяса, например стейки, более нежными. Если вы знаете, что стейки сделаны из богатой белком мышечной ткани коров, можете ли вы придумать как работает размягчитель? Шаг 4. Осаждение ДНК Чтобы отделить ДНК от других молекул в вашем экстракте клеток, вы добавите к вашему образцу примерно три объема холодного спирта. При этом ДНК начнет выпадать в осадок, так как она гораздо хуже растворима в спирте, чем в воде. При наличии в растворе положительно заряженных ионов, они будут взаимодействовать с отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК и будет образовываться нерастворимая соль. Положительно заряженные ионы натрия уже присутствуют в растворе, так как раствор протеазы, который вы добавляли на предыдущем этапе, содержал соль. Чем более холодный спирт вы берете, тем хуже растворяется ДНК – это можно сравнить с тем, как сахар хуже растворяется в холодном чае, чем в горячем. В присутствии соли и спирта ДНК, выделенная из ваших клеток, собирается вместе и выпадает в осадок, который можно видеть невооруженным глазом! Другие мелкие молекулы, содержащиеся в растворе, такие как аминокислоты или углеводы, остаются растворенными в спирте. Одна видимая глазом нить состоит из тысяч цепей ДНК, на каждой из которых расположены тысячи генов, так что вы сразу смотрите на миллионы генов. Помните, что вы видите ДНК из многих тысяч клеток. Вопросы: 10. Соедините правильно экспериментальные процедуры (справа) и их результаты (слева): __Собрать клетки __Растворить клеточные мембраны А. Добавить протеазу и инкубировать при 50ºС Б. Добавить холодный спирт __Осадить ДНК В. Добавить раствор детергента __Расщепить белки Г. Пожевать внутренние поверхности ваших щек и тщательно прополоскать водой ВЫДЕЛЕНИЕ И ОСАЖДЕНИЕ ДНК: ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРОТОКОЛ Контрольный список для проверки вашего рабочего места Рабочее место учителя Нагретая до 50°С водяная баня со стаканом или штативом для 36 15 мл пробирок Охлажденная бутылка 91% изопропанола или 95% этанола на льду Рабочие места учеников (4 ученика на место) 15 мл пробирки, по 3 мл воды в каждой Розовая микропробирка, подписанная «прот», содержащая 1.25 мл раствора протеазы 15 мл пробирка, подписанная «лизис», содержащая 10 мл буфера для лизиса Одноразовые пластиковые пипетки Фломастер Стакан для слива Число 4 1 1 6 1 1 Процедура выделения ДНК Шаги 1 и 2: сбор и лизис клеток Чтобы собрать достаточное количество эпителиальных клеток со слизистой ваших щек, вы должны осторожно жевать внутренние части вашего рта в течение 30 секунд, и потом прополоскать рот небольшим количеством воды. Для успеха работы важно собрать нужное количество клеток, поэтому удостоверьтесь в том, что вы достаточно долго жевали ваши щеки. 1. Возьмите с вашего стола 15 мл пробирку, содержащую 3 мл воды. Подпишите ее вашими инициалами. 2. Осторожно пожуйте внутренние поверхности ваших щек в течение 30 секунд. НЕ НАДО кусать щеки до крови! 3. Наберите воду из 15-мл пробирки в рот и тщательно полощите его в течение 30 секунд. Не глотайте воду! 4. Аккуратно выплюньте воду обратно в пробирку 5. Найдите на вашем столе 15-мл пробирку с надписью «лизис». Используя чистую одноразовую пластиковую пипетку, добавьте 2 мл буфера для лизиса в вашу пробирку. 6. Закрутите пробирку крышкой и аккуратно переверните пробирку 5 раз (не трясите ее!). Посмотрите на пробирку. Вы заметили какие-то изменения? Если да, запишите их. Шаг 3: удаление белков 1. Возьмите с вашего стола маленькую пробирку с протеазой («прот»). Добавьте 5 капель протеазы (250 мкл) к вашему образцу. 3. Закройте пробирку и несколько раз переверните ее, чтобы перемешать содержимое 3. Поместите вашу пробирку в штатив или стакан на водяную баню, нагретую до 50°С на 10 минут. По истечении этого времени выньте пробирки. Шаги 4 и 5: сделайте вашу ДНК видимой 1. (Возможно, вам нужно будет сделать этот шаг на столе учителя.) Возьмите у вашего преподавателя пробирку с холодным спиртом. Наполните одноразовую пластиковую пипетку холодным спиртом 2. Держа пробирку с вашим образцом под углом 45º, добавьте туда 10 мл спирта, так чтобы он медленно стекал по стенке пробирки. Завинтите крышку на пробирке. 3. Поставьте пробирку прямо перед вами в стакан или штатив, и оставьте ее на 5 минут, не трогая. 4. Через 5 минут, снова посмотрите на пробирку. Обратите внимание на границу слоев воды и спирта. Вы видите что-нибудь? Запишите свои наблюдения. Сравните ваш образец с образцами ваших одноклассников. 5. Медленно переверните пробирку 5 раз, чтобы ускорить осаждение ДНК. Обратите внимание на плавающие в пробирке нити, белые или прозрачные. Это ваша ДНК! 6. Если вы хотите сделать кулон со своей ДНК, учитель даст вам стеклянную бутылочку. Вы должны одноразовой пипеткой осторожно перенести туда вашу ДНК вместе с 750 мкл-1 мл раствора. Учитель покажет вам, как запечатать бутылочку и сделать кулон. Если вы не хотите делать кулон ,вы можете перенести свою ДНК в микропробирку и хранить ее там. Просто перенесите одноразовой пипеткой ДНК вместе с 1 мл раствора спирта в микропробирку. Закройте крышку и удивите ваших близких и друзей вашей собственной ДНК! ПРИЛОЖЕНИЕ НАГЛЯДНОЕ ОБЪЯСНЕНИЕ РАБОТЫ Для учеников 7-9 классов мы рекомендуем наглядно показать, что происходит на каждом шаге выделения ДНК. Возьмите воздушный шарик и поместите туда разные мелкие предметы и нити, чтобы изобразить внутриклеточные органеллы, белки и ДНК. Подчеркните, что детергент разрушает мембрану клетки (лопните шарик) ,протеаза разрушает белки (раздавите мелкие предметы), а соль и спирт вызывают осаждение ДНК (соберите нитки в комок) ОТВЕТЫ НА ВОПРОСЫ (БАЗОВЫЙ УРОВЕНЬ) 1. Как вы могли бы проверить, что вы действительно собрали клетки из вашего рта? Какое лабораторное оборудование вы могли бы использовать для этого? Вы могли бы посмотреть на каплю раствора, который вы получили, под микроскопом. Чтобы увидеть клетки, надо будет предварительно покрасить препарат. 2. Какой водой лучше мыть посуду, теплой или холодной? Как вы думаете, при высоких или низких температурах детергент будет лучше разрушать мембраны? В теплой воде мыть посуду лучше, потому что высокая температура помогает моющему средству растворять жиры и белки. Точно так же при высокой температуре детергент будет лучше разрушать мембраны клеток. 3. Как вы думаете, будет ли ДНК видна после того, как вы разрушили клетки? Почему вы так думаете? ДНК не будет видна, потому что она будет растворена в буфере для лизиса. 4. Как вы думаете, где протеазы находятся в вашем теле? Подсказка: где расщепляются белки, которые вы едите? Протеазы можно найти в вашем желудке и кишечнике, где расщепляются белки, поступающие с пищей. 5. Пробовали ли вы когда-нибудь добавлять сахар в холодный чай? Легко ли он растворялся? Легче ли растворить то же количество сахара в горячем чае? Сахар намного хуже растворяется в холодном чае, чем в горячем. В целом с температурой растворимость разных веществ в жидкости растет. ОТВЕТЫ НА ВОПРОСЫ (ПРОДВИНУТЫЙ УРОВЕНЬ) 1. Представьте, что вы объясняете разницу между хромосомами, генами и ДНК вашему брату или сестре, который(ая) на два года младше вас. Напишите объяснение простыми словами, которые они могли бы понять. ДНК – это химическое вещество, которое можно найти в любом живом существе, и которое передается от родителей к детям. В нем содержится информация, делающая нас самими собой. Хромосомы – это длинные цепи ДНК, упакованные с помощью белков. ДНК организована в хромосомы, чтобы компактно храниться в клетке и легче копироваться при делении клеток. Гены - это участки ДНК, кодирующие белки, которые в свою очередь выполняют большинство задач в живой клетке. 2. Клетка печени и клетка эпителия содержат одни и те же хромосомы? Да. Геномная ДНК во всех соматических (не половых) клетках одна и та же, независимо от того, что это за ткань. 3. Если вам надо выделить ген, который кодирует белок, находящийся в желудке, можете ли вы найти этот ген в клетках эпителия? Объясните ваше предположение. Ген, который кодирует белок из желудка, может быть найден в геномной ДНК клетки эпителия. Тем не менее, клетка эпителия не будет синтезировать мРНК (копии гена) белка из желудка. Ген этого белка будет экспрессироваться только в желудке. 4. Ниже приведено схематическое изображение эпителиальной клетки 4. В каком месте в клетке по вашему мнению находится геномная ДНК? Геномная ДНК находится в ядре. 5. Почему для того, чтобы генетическая информация могла быть транслирована в белки, нужен посредник, такой как мРНК? ДНК представляет собой архив информации, как книги, которые всегда лежат в библиотеке. Создание временных «копий» генов в виде мРНК позволяет во много тысяч раз увеличить количество белков, которые клетка может сделать. 6. Как вы думаете, каким будет первый шаг для выделения вашей ДНК? Нужно разрушить клеточную и ядерную мембраны, чтобы высвободить ДНК 7. После того, как мембраны растворятся, ДНК окажется в растворе, но вместе с ней там окажутся и множество других видов молекул, находившихся в клетке. Напишите, что это могут быть за молекулы. РНК, белки, жиры, сахара, минеральные соли, АТФ и др. 8. Какие методы или агенты могут быть использованы, чтобы избавиться от этих нежелательных молекул? Существуют ферменты, расщепляющие разные молекулы. Протеазы расщепляют белки, ДНКазы - ДНК, РНКазы – РНК. Жиры могут быть растворены с помощью детергентов. Процессы расщепления ускоряются при повышении температуры и перемешивании. Для того чтобы выделить нужные компоненты из клетки, часто используются разные виды хроматографии (основанной на разных физикохимических свойствах клеточных компонентов) 9. Какие белки могут быть ассоциированы с ДНК в клетке? С хромосомной ДНК ассоциированы гистоны, а также РНК-полимераза и факторы транскрипции. 11. Протеаза, используемая в нашей работе, лучше всего работает при 50ºС. Как вы думаете, ее выделили из Е. coli? Аргументируйте ваш ответ. Подсказка: где в природе находится E. coli? Заселяющая кишечник человека и животных E. Coli существует при температуре тела – около 37ºС – и это оптимальная температура работы для ее ферментов. Фермент, работающий при 50ºС, скорее всего был выделен из организма, живущего при такой температуре – например, термофильной бактерии из горячего источника. 12. Размягчитель мяса часто используется, чтобы сделать жесткие куски мяса, например стейки, более нежными. Если вы знаете, что стейки сделаны из богатой белком мышечной ткани коров, можете ли вы придумать как работает размягчитель? Многие размягчители содержат протеазу из плодов папайи – папаин. Эта протеаза частично расщепляет молекулы белков соединительной ткани, делая мясо более мягким и нежным. 13. Соедините правильно экспериментальные процедуры (справа) и их результаты (слева): _Г_Собрать клетки _В_Растворить клеточные мембраны А. Добавить протеазу и инкубировать при 50ºС Б. Добавить холодный спирт _Б_Осадить ДНК В. Добавить раствор детергента _А_Расщепить белки Г. Пожевать внутренние поверхности ваших щек и тщательно прополоскать водой