гибридизация ДНК-рРНК - Институт фундаментальной биологии

Федеральное государственное автономное
образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
Институт фундаментальной биологии и биотехнологии
Базовая кафедра биотехнологии
Доклад
Современные методы идентификации микроорганизмов.
Выполнила: студентка 1 курса магистратуры
Гр. ББ1201Б
Ларионова М.Д.
Проверила: Литовка Ю.А.
Красноярск 2012
В настоящее время учеными описано несколько тысяч видов
организмов, однако считается, что это составляет менее 1% от реально
существующих.
Цель идентификации – установить таксономическое положение
исследуемого штамма на основании сравнения его свойств с изученными и
принятыми (официально зарегистрированными) видами.
Принципы классификации и идентификации разных групп прокариот и
эукариот имеют существенные различия. Идентификация дрожжевых грибов,
которые относятся к числу широко используемых объектов разных
микробиологических
исследований,
основана
на
культуральных,
морфологических, цитологических, физиолого-биохимических особенностях,
характеристике жизненных циклов и полового процесса.
Идентификация
прокариот,
которые
морфологически
менее
разнообразны, чем эукариоты, основана на использовании широкого спектра
фенотипических и генотипических признаков. Она в большей степени, чем
идентификация эукариот, основывается на функциональных признаках,
поскольку большинство бактерий можно идентифицировать не по внешнему
виду и по процессам, которые они способны осуществлять.
При описании и идентификации бактерий изучают их культуральные
свойства, морфологию, организацию клетки, физиолого-биохимические
особенности, химический состав клеток, содержание гуанина и цитозина в
ДНК, последовательность нуклеотидов в гене, кодирующем синтез 16S рРНК
и другие фено- и генотипические признаки.
Культуральные свойства, т.е. характерные особенности роста бактерий
на плотных и жидких питательных средах обычно используют для их
характеристики, однако для идентификации применяют довольно редко.
Морфологическая характеристика и организация клеток бактерий
включает такие признаки, как форма и размеры клеток, их подвижность,
наличие жгутиков и тип жгутикования, способность к спорообразованию.
Полезным может оказаться также выявление в клетках характерных
мембранных систем и органелл (хлоросом, карбоксисом, фикобилисом,
газовых вакуолей и т.д.), присущих отдельным группам бактерий, а также
включений
(параспоральных
телец,
гранул
волютина, полигидроксибутирата, полисахаридов и т.д.). Первостепенное значение для
систематики бактерий придается окраске клеток по Граму и строению их
клеточных стенок.
Физиолого-биохимические свойства включают прежде всего
установление способа питания исследуемой бактерии (фото / хемо-, авто /
гетеротрофия) и типа энергетического метаболизма (способность к
брожению, аэробному или анаэробному дыханию или фотосинтезу). Важно
определить такие признаки, как отношение бактерии к молекулярному
кислороду, температуре, рН среды, солености, освещенности и другим
факторам среды. В данную группу признаков входит также перечень
субстратов, утилизируемых в качестве источников углерода, азота и серы,
потребность в витаминах и других факторах роста, образование характерных
продуктов метаболизма, наличие некоторых ферментов. Для этого
используют специальные тесты.
Многие тесты, применяемые для обнаружения перечисленных
признаков, важны для диагностики и широко используются в медицинской
микробиологии. Их постановка требует значительных затрат времени,
большого количества сложных сред и реактивов, соблюдения стандартных
условий проведения. Для ускорения и облегчения процесса идентификации
некоторых микроорганизмов, имеющих главным образом медицинское
значение, разработаны различные тест-системы. Например, система
Enterotube,
предназначенная
для
идентификации
энтеробактерий,
представляет собой пластиковую камеру с 12 ячейками, содержащими
окрашенные диагностические среды. О положительном или отрицательном
результате теста судят по изменению цвета среды, разрыву агара (тест на
газообразование), или после введения специальных реактивов. Каждый
признак обозначают определенной цифрой, поэтому полученные данные
можно ввести в компьютер с соответствующей программой и получить ответ
о таксономическом положении исследуемого штамма.
Определение химического состава клеток бактерий также имеет
значение для их систематики (хемосистематика). Хемотаксономические
методы могут быть важными, для тех групп бактерий, у которых
морфологические и физиологические характеристики широко варьируются и
недостаточны для проведения их удовлетворительной идентификации. В
состав клеточных стенок разных прокариот входит несколько классов
уникальных
гетерополимеров:
муреин
(или
псевдомуреин),
липополисахариды, миколовые и тейхоевые кислоты. В качестве
хемотаксономического маркера иногда используют также липидный и
жирнокислотный состав клеток бактерий. Состав клеточной стенки
определяет и серологические свойства бактерий. Это лежит в основе
иммунохимических методов их идентификации.
Важная информация о взаимном родстве бактерий может быть
получена при изучении клеточных белков – продуктов трансляции генов. На
основании изучения мембранных, рибосомных, суммарных клеточных
белков, а также отдельных ферментов сформировалось новое направление –
белковая таксономия. Спектры рибосомных белков относятся к числу
наиболее стабильных и используются для идентификации бактерий на
уровне семейства или порядка. Спектры мембранных белков могут отражать
родовые, видовые и даже внутривидовые различия. Однако характеристики
химических соединений клетки не могут использоваться для идентификации
бактерий изолированно от других данных, описывающих фенотип, поскольку
нет критерия оценки значимости фенотипических признаков.
Нередко при идентификации бактерий, а иногда и других
микроорганизмов, например дрожжей, используют метод нумерической (или
адансоновской) таксономии. В ее основе лежат идеи французского ботаника
М. Адансона (М. Adanson), предложившего различные фенотипические
признаки, поддающиеся учету, считать равноценными, что позволяет
количественно выразить таксономические дистанции между организмами в
виде отношения числа положительных признаков к общему числу
изученных. Сходство между двумя исследуемыми организмами определяется
путем количественной оценки не менее 100 фенотипических признаков,
которые подбирают так, чтобы их варианты могли обозначаться знаками
«минус» или «плюс». Степень сходства устанавливается на основании
количества совпадающих признаков и выражается в виде коэффициента
сходства.
S = (a+b) / a+b+c+d,
Значение коэффициента сходства может меняться от 0 до 1.
Коэффициент 1 означает полную идентичность, а 0 – полное несходство.
Полученные результаты представляют в виде матрицы сходства и / или в
виде дендрограммы. Нумерическая таксономия может применяться при
оценке сходства между таксонами микроорганизмов только невысокого
ранга (роды, виды). Она не позволяет делать непосредственные выводы
относительно генетического родства микроорганизмов, однако в известной
степени отражает их филогенетические свойства.
Особой проблемой является идентификация таких бактерий и архей,
особенно морских видов, которые не способны расти на известных
лабораторных питательных средах, и для которых нельзя было получить
чистую культуру. До недавнего времени эта проблема казалась
неразрешимой. Однако около 15 лет назад были разработаны методы,
позволившие экстрагировать, клонировать, секвенировать и сравнивать рРНК
прямо из окружающей среды. Это позволило точно сосчитать и
идентифицировать микроорганизмы, населяющий данный биотоп без их
выделения в чистую культуру.
Изучение генотипа микроорганизмов стало возможным в результате
успешного развития молекулярной биологии и привело к возникновению
геносистематики. Исследование генотипа, основанное на анализе
нуклеиновых кислот, дает возможность построить со временем естественную
(филогенетическую)
систему
микроорганизмов.
Филогенетические
взаимоотношения бактерий оценивают определением молярного содержания
ГЦ в ДНК, методами ДНК-ДНК и ДНК-рРНК гибридизации, с помощью
ДНК-зондов, а также изучением последовательности нуклеотидов в 5S, 16S и
23S рРНК.
Определение молярного содержания ГЦ от общего количества
оснований ДНК у прокариот колеблется от 25 до 75%. Каждый вид бактерий
имеет ДНК с характерным содержанием ГЦ. Однако если два организма
очень близки по нуклеотидному составу, то это может являться
свидетельством их эволюционного родства только при условии, что они
обладают большим числом фенотипических признаков.
Гибридизация. Методы гибридизации ДНК состоят в смешивании
одноцепочечных фрагментов ДНК, полученных от двух разных видов. Доля в
смеси общей ДНК, которая воссоединяется, образуя двухцепочечные
спирали, и скорость воссоединения служат мерами степени генетического
родства между данными видами. Этот метод широко применяется зоологами,
ботаниками и другими исследователями.
Метод ДНК-ДНК-гибридизации является более важным для оценки
генетического родства бактерий. Внутри одного вида бактерий степень
генетической гомологии штаммов достигает 70-100%. Однако если в
результате эволюционной дивергенции последовательностей нуклеотидных
оснований геномов двух бактерий различаются в большей степени, то
специфическая реассоциация ДНК-ДНК становится такой слабой, что не
поддается измерению. В таком случае гибридизация ДНК-рРНК позволяет
значительно увеличить круг организмов, у которых можно определить
степень генетической гомологии благодаря тому, что на относительно
небольшом участке бактериального генома, кодирующем рибосомные РНК,
исходная последовательность оснований сохраняется значительно полнее,
чем на других участках хромосомы. В итоге методом ДНК-рРНКгибридизации часто обнаруживают довольно высокую гомологию геномов
бактерий, у которых реассоциация ДНК-ДНК не выявляет заметной
гомологии.
Для идентификации бактерий иногда используют также метод ДНКзондов – разновидность метода молекулярной гибридизации ДНК-ДНК.
Реакция гибридизации ведется в этом случае не между двумя препаратами
тотальной ДНК, а между фрагментом нуклеотидной последовательности
ДНК (зондом), включающим генетический маркер (ген), ответственный за
какую-то определенную функцию (например, устойчивость к антибиотику), и
ДНК изучаемой бактерии. Самым распространенным способом создания
генных зондов является выделение специфических фрагментов путем
молекулярного клонирования. Для этого вначале создают банк генов
изучаемой бактерии, затем отбирают нужный клон из суммы фрагментов
ДНК. Далее выбранный фрагмент ДНК сшивают с подходящей плазмидой, и
полученную рекомбинантную плазмиду вводят в удобный штамм бактерий
(например, в E.coli). Из биомассы бактерии, несущей ДНК зонд, выделяют
плазмидную ДНК и метят ее радиоизотопной меткой. Затем осуществляют
гибридизацию генетического зонда с ДНК бактерии. Образовавшиеся
гибридные участки проявляют методом авторадиографии. По относительной
частоте гибридизации генетического маркера с хромосомой той или иной
бактерии делают заключение о генетическом родстве этих бактерий с
исследуемым штаммом.
Для идентификации бактерий и создания филогенетической системы
их классификации наиболее широкое распространение и значение получил
метод анализа нуклеотидных последовательностей в рибосомальных
РНК. Молекулы 5S, 16S и 23S рРНК содержат участки с самой высокой
степенью генетической стабильности. Считается, что они находятся вне
механизма естественного отбора и эволюционируют только в результате
спонтанных мутаций, происходящих с постоянной скоростью. В случае
анализа 5S рРНК обычно определяют полную последовательность
нуклеотидов, которая в этой молекуле у прокариот составляет 120
нуклеотидов. При исследовании 16S и 23S рРНК, содержащих 1500 и 2500
нуклеотидов соответственно, часто проводят анализ олигонуклеотидов,
полученных из этих молекул при помощи специфических рестриктаз.
При выполнении данных методик исследований необходимо
проведения ряда последовательных операций. Первая – разрушение клеток,
выделение нуклеиновых кислот и при необходимости их дополнительная
очистка с помощью соответствующих наборов реактивов. Следующая –
амплификация исследуемых участков в выделенной смеси НК для
увеличения концентрации этих фрагментов с применением соответствующих
праймеров в ПЦР-реакции. Полученные ПЦР-продукты – концентрированная
смесь амплифицированных участков, принадлежащим различным бактериям,
разделяют, например методом ДГГЭ (Денатурирующего градиентного гельэлектрофореза). Если на этой стадии ввести соответствующие контроли,
томожно провести предварительную идентификацию бактерий. Однако для
достоверной идентификации нужно производить изъятие отдельных полос их
электрофореграммы геля для последующего секвенирования. Выявленные
последовательности сравнивают с данными, имеющимися в международном
банке генов, после чего составляют списки выявленных организмов и строят
филогенетические схемы микробного сообщества.
В настоящее время также разработаны иммунофлуоресцентные
методы (ИФМ), позволяющие выявить интересующий исследователя
организм без выделения в чистую культуру. В основе любых модификаций
ИФМ используется взаимодействие антиген-антитело, которое соединено с
флуоресцирующим красителем. Специфичность реакции антиген-антитело
высока, поэтому и вероятность выявления микроорганизма в природных
образцах или накопительных культурах тоже высока. Недостатком являются
относительно долгая процедура приготовления сывороток с красителями и
существование перекрестных реакций.
Недостатков ИФМ лишен метод, основанный на взаимодействии
флоуресцентно окрашенных олигонуклеотидов с соответствующими
участками 16S рРНК целых клеток (метод FISH - Fluorescent in situ
hybridization).
При флюоресцентной гибридизации in situ используют ДНК-зонды,
которые связываются с комплементарными мишенями в образце. В состав
ДНК-зондов входят нуклеозиды, меченные флюорофорами (прямое мечение)
или такими конъюгатами, как биотин или дигоксигенин (непрямое мечение).
При прямом мечении связавшийся с мишенью ДНК-зонд можно наблюдать
при помощи флюоресцентного микроскопа сразу по завершении
гибридизации. В случае непрямого мечения необходима дополнительная
процедура окрашивания, в ходе которой биотин выявляют при помощи
флуоресцентно-меченного авидина или стептавидина, а дигоксигенин — при
помощи флюоресцентно-меченых антител. Интенсивность флюоресцентного
сигнала зависит от многих факторов — эффективности мечения зондом, типа
зонда и типа флюоресцентного красителя.
В настоящее время с помощью молекулярно-генетических методов
идентификация бактерий стала менее трудоемким процессом, зачастую не
требующим выделения бактерий в чистую клеточную культуру. Благодаря
этому современные квалифицированные специалисты – медики,
микробиологи,
эпидемиологи
–
теперь
способны
проводить
микробиологические исследования в считанные часы.