На правах рукописи Рукина Дарья Александровна 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

На правах рукописи
Рукина Дарья Александровна
Особенности иммунного и цитокинового статусов у больных
первичной открытоугольной глаукомой
14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата
медицинских наук
Владивосток – 2012
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном
учреждении высшего профессионального образования «Владивостокский
государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и
социального развития Российской Федерации
Научный руководитель
доктор медицинских наук, профессор, Маркелова Елена Владимировна
Официальные оппоненты:
Запорожец Татьяна Станиславовна, доктор медицинских наук, ведущий
научный
сотрудник
лаборатории
иммунологии
ФГБУ
«Научноисследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» СО РАМН,
заместитель директора по науке
Калинина Елена Петровна, доктор медицинских наук, старший научный
сотрудник Владивостокского филиала ФГБУ «Дальневосточный научный центр
физиологии и патологии дыхания» СО РАМН – Научно-исследовательский
институт медицинской климатологии и восстановительного лечения
Ведущая организация: ФГБУ «Государственный научный центр «Институт
иммунологии» Федерального медико-биологического агентства России, г.
Москва
Защита состоится 24 мая 2012 года в 10 часов на заседании диссертационного
совета ДМ 208.007.02 при Государственном бюджетном образовательном
учреждении высшего профессионального образования «Владивостокский
государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и
социального развития РФ по адресу: 690002, г. Владивосток, проспект
Острякова, 2
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного
бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального
образования «Владивостокский государственный медицинский университет»
Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Автореферат разослан 19 апреля 2012 года
Ученый секретарь
диссертационного совета
Шаркова Валентина Александровна
2
Общая характеристика работы
Актуальность темы.
в
связи
с
В офтальмопатологии глаукома занимает особое место
широким
заболеваемости
и как
распространением
в
мире,
постоянным
лидирующая причина необратимой
ростом
слепоты
и
инвалидности по зрению [Нестеров А.П., 2004; Caprioli J.A. et al., 2009].
Несмотря на огромные успехи, достигнутые медицинской наукой в
разработке разных аспектов глаукомы, сохраняется много неясного в главных
проблемах
болезни:
глаукоматозного
ранней
процесса,
диагностики,
эффективности
механизмах
терапии.
патогенеза
Это
связано
с
полиморфизмом клинической симптоматики, многофакторностью патогенеза,
латентным
течением
ранних
стадий
заболевания.
По
актуальности
обозначенных проблем наибольший вес занимает первичная открытоугольная
глаукома
(ПОУГ),
около
50%
случаев
которой
остаются
недиагностированными [Астахов Ю.С., 2006; Волков В.В., 2008; Wong, T. et al.,
2007; Caprioli, J. A. et al., 2009]. В этой связи возрастает значимость ранней
диагностики болезни, новых подходов к ее выявлению, скрининговых
обследований населения, составляющего группы риска развития глаукомы.
Наименее
изученной
проблемой
глаукомы
является
выявление
иммунных процессов в патогенезе ПОУГ. Исследования различных авторов
показали влияние клеточных и гуморальных факторов иммунитета в развитии
механизмов деструкции, дегенерации и атрофии при глаукоме [Стукалов С.Е.,
Захарова И.А., 1989; Должич Г.И., Бирюкова Н.В., 2008; Еричев В.П. с соавт.,
2009; Страхов В.В., Алексеев В.В., 2009; Rönkkö S. et al., 2007; Malvitte L. et al.,
2007; Kutchey J. et al., 2010]. Однако эти работы немногочисленны, результаты
их противоречивы и отражают отдельные факты иммунных нарушений.
Комплексных исследований, затрагивающих патогенез болезни с позиций
клинической иммунологии, нет. Расширенное изучение параметров клеточного
и гуморального звеньев иммунитета (спектр цитокинов, иммуноглобулины,
матриксные металлопротеиназы) у пациентов
3
ПОУГ позволит расширить
понимание механизмов иммунопатогенеза заболевания и разработать критерии
ранней диагностики болезни.
Цель работы – на основе комплексной оценки иммунных механизмов
патогенеза
разработать
дополнительные
критерии
тяжести
первичной
открытоугольной глаукомы и ранней диагностики этого заболевания у
пациентов групп риска.
Задачи исследования:
Установить изменение системного и
1.
статуса
локального цитокинового
(IL-6, IL-17, IFN-γ, TGF-β1, TGF-β3) в зависимости от тяжести
глаукомного процесса.
Оценить степень информативности системных и локальных
2.
уровней матриксной металлопротеиназы-9 (ММР-9) и ее комплекса с тканевым
ингибитором (MMP-9/TIMP-1) у пациентов первичной открытоугольной
глаукомой.
Определить и оценить степень изменения некоторых показателей
3.
адаптивного гуморального иммунитета (системной продукции IgM, G, A и
локальной продукции sIgA) у пациентов ПОУГ.
Провести
4.
сравнительный
анализ
цитокинового
статуса,
иммуноглобулинов основных классов, матриксной металлопротеиназы-9 и ее
комплекса с тканевым ингибитором I типа у пациентов, составляющих группу
риска
по
развитию
первичной
открытоугольной
глаукомы
(миопия,
гипертоническая болезнь II-III ст., сахарный диабет II типа).
Научная новизна. На основании комплекса иммунологических данных
(система
цитокинов,
маркеры
синтеза
и
деградации
компонентов
межклеточного матрикса, иммуноглобулины), исследованных в сыворотке
крови, слезной жидкости и влаге передней камеры глаза, установлено участие
иммунных воспалительных реакций в патогенезе первичной открытоугольной
глаукомы.
4
Повышенные уровни матриксной металлопротеиназы-9 и дефицит TGFβ1 в слезной жидкости пациентов с первичной открытоугольной глаукомой
сопряжены с тяжестью заболевания.
Выявлен дисбаланс продукции матриксной металлопротеиназы–9 (MMP9) и ее комплекса с тканевым ингибитором (MMP-9/TIMP-1), особенно на
локальном уровне, является ведущим фактором в ранних механизмах
ремоделирования межклеточного матрикса с деструктивным потенциалом в
структурах органа зрения.
Определены информативные ранние иммунологические критерии риска
развития
глаукомы
у
пациентов
группы
риска
развития
первичной
открытоугольной глаукомы (миопия любой степени, гипертоническая болезнь
II-III ст., сахарный диабет II типа).
Практическая
значимость
работы.
Дополнительным
критерием
тяжести глаукоматозного процесса является повышение уровней ММР-9 и
дефицит TGFβ-1 в слезной жидкости пациентов первичной открытоугольной
глаукомой. Для ранней диагностики первичной открытоугольной глаукомы
разработаны критерии, основанные на определении повышенных локальных
уровней IL-17 и ММР-9 у пациентов, составляющих группу риска развития
глаукомы (миопия разной степени, гипертоническая болезнь II-III ст., сахарный
диабет II типа). Определена диагностическая значимость повышенных уровней
секреторного sIgA у пациентов ПОУГ
как критерия развития первичной
открытоугольной глаукомы.
Материалы диссертации легли в основу:
1.
Методических
диагностики
первичной
рекомендаций
«Иммунологические
открытоугольной
глаукомы»,
методы
утвержденные
Департаментом здравоохранения Приморского края и ГБОУ ВПО ВГМУ
Минздравсоцразвития
России,
внедренных
в
практику
работы
офтальмологической службы края и учебный процесс кафедр офтальмологии и
патологической физиологии.
5
2. Заявки на изобретение «Способ прогнозирования заболевания
первичной открытоугольной глаукомой» (№2012109270 от 12.03.2012).
Основные положения, выносимые на защиту:
1.
Дисбаланс в системной и локальной продукции цитокинов,
матриксной протеазы-9 и ее комплекса с тканевым ингибитором являются
важными звеньями развития хронического иммунного воспаления при
первичной открытоугольной глаукоме.
2.
IL-6,
Чрезмерное повышение секреции провоспалительных цитокинов
IL-17,
IFN-γ на фоне активации гуморального звена иммунитета
формируют деструктивный потенциал иммунного воспаления в органе зрения.
3.
Иммунные нарушения у пациентов с миопией, гипертонической
болезнью и сахарным диабетом II типа позволяют отнести их к группе риска
возникновения
первичной
открытоугольной
глаукомы.
Наличие
этих
сопутствующих хронических заболеваний усугубляет прогрессирование и
тяжесть глаукоматозного процесса.
Апробация
результатов
исследования.
Материалы
диссертации
представлены и обсуждены на: VI Дальневосточном конгрессе «Человек и
лекарство» (Владивосток, 2009), XI и XII Тихоокеанской научно-практической
конференции студентов и молодых ученых (Владивосток, 2010, 2011),
заседании Всероссийской школы иммунологов (Санкт-Петербург, 2010), 14-ом
Международном конгрессе по иммунологии (Япония, Кобэ, 2010), Краевом
обществе офтальмологов, приуроченном к Всемирному дню борьбы с
глаукомой (Владивосток, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в
том числе 2 статьи в журналах, включенных в «перечень ведущих
рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть
опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой
степени доктора и кандидата наук», утвержденный ВАК.
Личный
вклад
соискателя
состоит
в
непосредственном
участии
планирования исследования, формирования групп пациентов, включенных в
6
исследование,
сборе
отечественной
и
материала,
зарубежной
проведении
литературы
аналитического
по
изучаемой
обзора
проблеме,
интерпретации, анализе и статистической обработке полученных результатов
исследования.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 135 страницах
компьютерного
набора
и
состоит
из
введения,
обзора
литературы,
характеристики материалов и методов исследования, двух глав собственных
наблюдений, заключения и выводов. Список литературы содержит 257
источников, в том числе 128 отечественных и 129 иностранных авторов. Текст
иллюстрирован 20 рисунками и 18 таблицами.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Обследование пациентов и забор исследуемого материала проводился во
взрослом отделении микрохирургии глаза ГБУЗ «Краевой клинической
больницы №2» г. Владивостока (клинической базы ГБОУ ВПО ВГМУ
Минздравсоцразвития России) в течение 2009 – 2011 гг. Для выполнения
поставленных задач использовано комплексное клиническое, биохимическое,
инструментальное и иммунологическое исследование у 145 человек: 80
пациентов с первичной открытоугольной глаукомой, 35 пациентов из группы
риска по развитию первичной глаукомы, в которую включены лица с миопией
разной степени, гипертонической болезнью II-III стадии (ГБ), сахарным
диабетом II типа в стадии компенсации (СД) (табл.1). Возраст обследованных
пациентов колебался от 35 до 75 лет, средний возраст составил 57,0±3,2 года.
Женщин – 78 (67,8%), мужчин 37 (32,2 %). Контрольную группу составили 30
офтальмологически и соматически здоровых добровольцев, возраст которых
был сопоставим с контингентом больных ПОУГ (51,4±3,0 года). Диагноз
первичной открытоугольной глаукомы был установлен согласно требованиям
Российского национального руководства по глаукоме [Егоров Е.А. с соавт.,
2008]. Всем пациентам проводились общее клиническое обследование и
комплекс
методов
офтальмологического
7
исследования:
визометрия,
биомикроскопия,
тонография,
авторефрактометрия,
периметрия,
офтальмоскопия,
конфокальная
тонометрия,
лазерная
сканирующая
офтальмоскопия, ультразвуковое исследование глаз, электрофизиологическое
исследование глаз. Уровень внутриглазного давления в 67,5% случаев был в
пределах нормальных значений, в 27,5% - умеренно-повышенным, 5% высоким.
Таблица 1.
Структура и количество обследованных
Количество
Группы обследованных
пациентов
Абс.
%
Контрольная группа
30
-
ПОУГ общая группа:
80
100
1 группа (начальная и развитая стадии)
42
52,5
2 группа (далеко-зашедшая и терминальная
38
47,5
ПОУГ без сопутствующей патологии
38
47,5
ПОУГ с сопутствующей патологией:
42
52,5
ПОУГ+миопия
18
22,5
ПОУГ+гипертоническая болезнь II-III ст.
14
17,5
ПОУГ+сахарный диабет, II тип
10
12,5
35
100
Миопия
14
40
Гипертоническая болезнь II-III ст.
11
31,4
Сахарный диабет, II тип
10
28,6
стадии)
Группа риска развития ПОУГ:
В
качестве
биологических
материалов
для
иммунологических
исследований использовалась венозная кровь, слезная жидкость и влага
передней камеры глаза. В сыворотке крови и слезной жидкости определяли
уровни
цитокинов
IL-6,
IL-17,
IFN-,
TGF-1,
TGF-3,
матриксной
металлопротеиназы-9 секреторного типа человека (ММР-9) и ее комплекса с
8
тканевым ингибитором (MMP9/TIMP1), сывороточные
иммуноглобулины
основных классов А, М, G и секреторного иммуноглобулина А (sIgA). В
переднекамерной влаге исследовали уровни цитокинов IL-17 и IL-6.
Определение сывороточных иммуноглобулинов основных
секреторного
иммуноглобулина
А
в
слезной
жидкости
классов,
проводили
с
использованием специфических тест-систем «Вектор-Брест» (г. Новосибирск)
сэндвич-варианта
твердофазного
иммуноферментного
анализа,
согласно
прилагаемой инструкции. Определение уровней цитокинов в сыворотке крови,
слезной жидкости, а также компонентов внеклеточного матрикса выполняли с
использованием специфических тест-систем «R&D Diagnostics Inc.» (USA)
сэндвич-варианта
прилагаемых
твердофазного
инструкций.
иммуноферментоного
иммуноферментного
Учет
результатов
анализатора
анализа,
проводили
«Multiscan»
с
согласно
помощью
(Финляндия).
Расчет
количественных параметров проводили путем построения калибровочной
кривой с помощью компьютерной программы. Количество выражали в пг/мл,
нг/мл. Для статистической обработки результатов использованы методы
описательной, параметрической и непараметрической статистики: W-критерий
Шапиро-Уилка, непараметрический критерий Манна-Уитни, коэффициент
корреляции Пирсона, критерий χ2. Для выявления чувствительности и
специфичности
изменения
выбранных
параметров
использовали
метод
линейной регрессии с построением ROC-кривых.
Результаты исследования и их обсуждение
Известно, что при
хорошо изученном финале болезни
(гибели
зрительного нерва) первичное звено и клетки – мишени неясны. Поэтому в
основу
наших
исследований
легли
поиски
предикторов
развития
глаукоматозного процесса, ранних диагностических маркеров и иммунных
механизмов его прогрессирования. Анализ многочисленных литературных
данных, посвященных глаукоме, свидетельствует о системном поражении
соединительнотканных структур глаза, эндотелия микроциркуляторного русла
9
и нейротрофических нарушениях зрительного нерва и его окружения. Такая
системность
нарушений
функционирования
нервной,
сосудистой,
соединительной ткани одного органа может быть связана с дисфункцией
иммунной системы и развитием хронического иммунного воспаления.
Результаты анализа изменений ряда медиаторов иммунного ответа
(цитокинов, матриксной протеиназы-9 и ее комплекса с ингибитором I типа) в
сыворотке крови и слезной жидкости, проведенного с целью уточнения
механизмов
иммунного
ответа,
демонстрируют
комплекс
нарушений,
свойственных хроническому иммунному воспалению. Так, у пациентов ПОУГ
обнаружены гиперцитокинемия преимущественно провоспалительных IL-6,
IL-17, IFNγ и сниженные значения цитокинов с супрессорной функцией TGFβ-1
и TGFβ-3 (рис.1).
Сыворотка крови
-4
-2
Слезная жидкость
IL-6
IL-6
IFNγ
IFNγ
IL-17
IL-17
MMP-9
MMP-9
TGFβ-3
TGFβ-3
TGFβ-1
TGFβ-1
0
2
4
-4
-2
0
2
4
6
8
10
Рис.1
Схематическое
изображение
дисбаланса
уровней
иммунологических показателей относительно границы контроля (
) у
пациентов ПОУГ.
Степень изменений в двух биологических жидкостях характеризовалась
разнонаправленностью. Так, продукция IL-6 была выше в системном кровотоке
по сравнению с локальной, а
слезной жидкости.
продукция IL-17, напротив, доминировала в
Исследование влаги передней камеры также выявило
высокую локальную гиперцитокинемию IL-6, IL-17 и не имело значительных
10
преимуществ
с
исследованием
слезной
жидкости.
Секреция
металлопротеиназы-9 также преобладала локально. Содержание цитокинов
группы TGFβ (TGFβ-1 и TGFβ-3), напротив, отличалось несколько сниженной
концентрацией как в системном кровотоке, так и локально, что, может быть,
связано как с их потреблением при гиперергических воспалительных реакциях,
так и недостаточностью продукции.
Установлено, что миопия, гипертоническая болезнь, сахарный диабет 2
типа нередко сочетаются с ПОУГ [Должич Р.Р., 2006; Астахов Ю.С. с соавт.,
2006; Короев А.О., 2008; Шкребец Г.В., 2010]. Дисбаланс иммунных
показателей наблюдался и у пациентов категории риска возникновения
глаукомы. Важно отметить, что некоторые звенья патогенеза ПОУГ и этих
хронических заболеваний сходны, что проявлялось и закономерностью
изменений иммунологических показателей (рис. 2).
Сыворотка крови
-4
Слезная жидкость
MMP-9
MMP-9
IL-17
IL-17
IFNγ
IFNγ
IL-6
IL-6
TGFβ-1
TGFβ-1
TGFβ-3
TGFβ-3
-2
0
2
4
6
-5
0
5
10
15
Рис. 2
Схематическое изображение дисбаланса уровней
иммунологических показателей относительно границы контроля (
) у
пациентов группы риска ПОУГ.
Так, у пациентов группы риска возникновения ПОУГ системная
концентрация IL-6 была увеличена вдвое (у больных втрое), а локальная – в 10
раз по сравнению с контролем и вдвое превышала показатели у больных ПОУГ.
Уровень
провоспалительного
IFN-γ
значительно
превышал
таковые
у
контрольной группы и больных ПОУГ как системно, так и локально
11
(соответственно в сыворотке крови и слезной жидкости в 5 и 2 раза). Эти факты
мы склонны расценивать, как признаки раннего иммунного воспаления,
свойственного хроническим заболеваниям, которые
нередко сочетаются с
ПОУГ. Сывороточные концентрации другого цитокина IL-17, отражающего Th17 ответ, у пациентов группы риска были вдвое выше, а локальные, напротив,
втрое меньше, чем у больных ПОУГ.
Высокую степень специфичности (90,9%) и чувствительности (82,1%) IL17 при уровне его диагностического критерия >1,44пг/мл демонстрировали
результаты ROC-анализа (рис.3 А).
100
100
Sensitivity 80
%
60
Sensitivity, 80
%
40
40
20
20
60
0
0
0
20
40
60
80
Specificity, %
100
0
20
А
100
Б
100
Sensitivity,
%
40
60
80
Specificity, %
100
80
80
60
Sensitivity,
60
%
40
40
20
20
0
0
0
20
40
60
80
Specificity, %
100
0
В
20
40
60
80
Specificity, %
100
Г
Рис. 3 ROC-кривая оценки локальной продукции IL-17 у пациентов: с
ПОУГ (общая группа – А), миопией в сочетании с ПОУГ и без нее (Б), ГБ в
сочетании с ПОУГ и без нее (В), СД II типа в сочетании с ПОУГ и без нее (Г)
12
Сравнительный анализ оценки локальных уровней IL-17 у пациентов
отдельных подгрупп (миопия, гипертоническая болезнь (ГБ), сахарный диабет
II типа (СД) также показал его диагностическую ценность для ранней
диагностики ПОУГ. Так у больных с миопической рефракцией (группа риска)
отмечалось увеличение концентрации цитокина в 2,8 раз, а в сочетании с ПОУГ
в 6,6 раз. Результаты ROC-анализа демонстрировали (рис. 3Б) максимально
высокую чувствительность (100%) и специфичность (100%).
Установлена сопряженность глаукоматозного процесса с высокой
локальной концентрацией IL-17 в слезной жидкости пациентов с миопией
(χ2=3,375 с 1 степенью свободы, р=0,05).
Подобная закономерность наблюдалась у пациентов с сахарным диабетом
II типа (СД) и гипертонической болезнью (ГБ), факторы патогенеза которых
имеют сходные черты с ПОУГ: генетические, сосудистые (дисфункция
эндотелия), нейроэндокринные.
Диагностический критерий IL-17 у этих
больных составил >1,44 пг/мл (соответственно ROC-анализ для СД: Sensitivity
83,3%, Specificity 100%, для ГБ: Sensitivity 88,9%, Specificity 100%) (рис 3.Г и
3.В). Следовательно, следует считать локальную гиперцитокинемию
IL-17
дополнительным маркером ранней диагностики ПОУГ, а, возможно, и
предиктором ее развития у категорий риска.
Высокие уровни IL-17 и низкие TGFβ-3 коррелировали с усилением
продукции матриксной металлопротеиназы-9 (соответственно r=0,65 и r=-0,6).
Известно, что характер экспрессии MMP-9 имеет общие черты с
действием реактантов острой фазы воспаления, регулируя продукцию
цитокинов (IL-6, IL-17, TGFβ), миграцию лейкоцитов в очаг воспаления
(Назаров П.Г., 2001).
У больных ПОУГ избыточная системная продукция металлопротеиназы-9
компенсировалась образованием ее комплекса с ингибитором (коэффициент
MMP-9 / MMP-9/TIMP-1 был близок к показателю у здоровых) (табл.2).
Напротив, концентрация МПП-9 в слезной жидкости превышала уровень ее
комплекса с ингибитором в 5 раз, что может являться ключевым фактором в
13
механизмах нарушения регуляции процессов ремоделирования в структурах
трабекулярной сети, решетчатой пластинке склеры и диске зрительного нерва.
Таким образом, секреторная активность комплекса была недостаточна для
нивелирования высоких концентраций ММР. Так, коэффициент соотношения
ММР-9 и ее комплекса с ингибитором в сыворотке не отличался от контроля, а
в слезной жидкости был увеличен в 5 раз, что убедительно доказывает значение
дисбаланса этих медиаторов в иммунопатогенезе ПОУГ.
Таблица 2
Содержание ММP-9 и комплекса ММP-9/TIMP-1 в сыворотке крови
и слезной жидкости пациентов с ПОУГ и группы риска ее развития
Группы
обследованных
n
Сыворотка крови
MMP-9
MMP-9 /
TIMP-1
M±m, нг/мл
M±m,нг/мл
192,2±19,05
4,3±0,7
252,3±19,2*
7,0±0,3*#
236,2±34,8
6,3±0,5*
271,0±19,5*
7,5±0,5*
215,4±17,4
5,6±0,3*
Слезная жидкость
MMP-9
MMP-9 /
TIMP-1
M±m, нг/мл
M±m, нг/мл
34,8±2,86
0,15±0,01
206,5±27,8*#
0,19±0,01
143,±21,3*
0,16±0,008
274,1±47,3*#
0,22±0,02
221,5±42,6*#
0,20±0,03
Контроль
30
Пациенты ПОУГ общ.
80
ПОУГ 1 группа
42
ПОУГ 2 группа
38
ПОУГ без
38
сочетанной патологии
ПОУГ: с сочетанной
42 285,1±28,8*
7,4±0,4*
184,0±31,7*#
0,20±0,01*
патологией
ПОУГ+миопия
18 234,4±25,5
6,8±0,5*
184,3±50,5*#
0,15±0,002#
ПОУГ + ГБ
14 335,9±55,1*
8,3±0,8*
258,3±79,9*#
0,23±0,003*
ПОУГ + СД
10 268,0±41,4
8,8±0,6*
145,2±13,4*#
0,22±0,02*#
Группа риска:
35 262,2±26,8
7,4±0.9*
108,7±21,3*
0,19±0,02
Миопия
14 214,5±36,6
4.5±0,1
96,3±26,6*
0,16±0,007
ГБ
11 372,8±53,1*
10,9±1,4*
155,6±47,9*
0,23±0,04*
СД
8
213,0±18,5
7,3±1,6*
57,0±2,5*
0,18±0,004*
Примечание: *достоверность показателей групп пациентов с контролем,
# групп пациентов ПОУГ и группы риска.
Высокая
специфичность
MMP-9,
как
молекулярного
маркера
деструктивных процессов у пациентов ПОУГ подтвердил анализ ROC-кривых
в подгруппах больных миопией, гипертонической болезнью (ГБ), сахарным
диабетом II типа (СД) в сочетании с ПОУГ и без нее (рис. 4). Определен
дополнительный диагностический критерий ПОУГ у пациентов с миопией:
ММР-9 >61,8 нг/мл (ROC-анализ чувствительность 85,7%, специфичность
80,0%). При более высоких концентрациях ММР-9 риск возникновения
14
глаукомы у этой категории больных значительно увеличивается. При
проведении ROC-анализа у пациентов с сахарным диабетом чувствительность и
специфичность исследования локальной концентрации ММР-9 оказались
максимальными (100%), а диагностический критерий составил >61,8 нг/мл.
ROC-анализ у соответствующих подгрупп пациентов с гипертонической
болезнью не отличался высокой специфичностью (50%) при сохранении
высокой чувствительности при определении ММР-9 (критерий >66,1нг/мл).
100
100
Sensitivity
80
%
Sensitivity 80
%
60
60
40
40
20
20
0
0
20
40
60
80
Specificity, %
0
100
0
А
20
40
60
80
Specificity, %
100
Б
100
100
Sensitivity,
80
%
80
Sensitivity,
%
60
60
40
40
20
20
0
0
0
20
40
60
80
Specificity, %
0
100
В
20
40
60
80
Specificity, %
100
Г
Рис. 4 ROC-кривая оценки локальной продукции ММР-9 у пациентов с
ПОУГ (общая группа – А), миопией в сочетании с ПОУГ и без нее (Б), ГБ в
сочетании с ПОУГ и без нее (В), СД II типа в сочетании с ПОУГ и без нее (Г)
Характерно, что IL-17 совместно с IL-6 и комплексом ММР-9/TIMP-1
стимулирует
развитие
эпителиальных
15
фибробластов,
эндотелиоцитов,
митохондриальную недостаточность, что усиливает воспалительный процесс с
аутоиммунным повреждением ткани в зоне воспаления. Высокие локальные
уровни ММР-9 (χ2=5,96 с 1 ст. свободы, р=0,015) и дефицит локальной
продукции TGFβ-1 (χ2= 3,9 с 1 ст. свободы, р=0,04) зависели от тяжести
проявлений глаукомного процесса.
Результаты
исследования
гуморального
звена
иммунитета
складывались из анализа системной и локальной продукции иммуноглобулинов
(IgG, IgM, IgA, sIgA). Сывороточные уровни иммуноглобулинов изменялись
мало как у больных ПОУГ, так и у пациентов, составляющих группу риска
развития болезни. Локальные концентрации секреторного иммуноглобулина
(sIgA) превышали нормальные параметры как у больных ПОУГ (в 3,5 раза), так
и во всех подгруппах риска развития глаукомы (в 2,5 раза), что свидетельствует
об активации гуморальных механизмов иммунопатогенеза у больных ПОУГ
(рис.5).
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
П
ко
нт
р
ол
ь
О
У
П
Г
О
об
У
щ
Г+
ми
ми опи
я
оп
ия
гр
.р
П
.
О
У
Г+
ГБ
ГБ
гр
.р
П
.
О
У
Г+
СД
С
Д
гр
.р
.
0
Рис. 5 Уровни sIgA в слезной жидкости у пациентов ПОУГ и подгрупп
риска ее развития
Следует учесть значение избыточной активации IL-6 и регуляторные
функции TGFβ-1 и TGFβ-3, индуцирующих переключение всех классов
иммуноглобулинов на sIgA. Это дает право считать гуморальные реакции
одним из важных звеньев в развитии иммунного воспаления при первичной
16
открытоугольной глаукоме. Селективное накопление sIgA в слезной жидкости
свидетельствует об усилении защитной функции слизистых относительно
любого антигена, токсина, аутоантигена, а также о стремлении ограничить
развитие патологического процесса.
Таким образом,
анализ нарушений цитокинового статуса у больных
ПОУГ и пациентов, составивших группу риска ее возникновения, позволяет
предположить, что в начальной фазе иммунного процесса наблюдается
транзиторный
цитокиновый
профиль,
характеризующийся
присутствием
преимущественно провоспалительных цитокинов IL-6, IL-17 и, особенно, IFNγ
–
ключевого
цитокина
Th1-иммунного
ответа.
Однако,
далее
провоспалительные цитокины, реализуя механизмы гиперчувствительности
замедленного типа, инициируют иммунный ответ, ведущий к повреждению
тканей и стимуляции гуморальных факторов ответа. В дальнейшем, в период
формирования глаукомного процесса, цитокиновый профиль меняется и
становится смешанным Th1 – Th17. Несмотря на то, что цитокины,
продуцируемые
Th1-клетками,
подавляют
развитие
Th17-клеток,
было
обнаружено, что при аутоиммунных процессах Т-клетки одновременно
продуцируют IL-17 и IFN-γ [Ярилин А.А., 2010]. Активизация субпопуляции
Th17,
характеризующейся
преимущественно
локальными
высокими
значениями IL-6 и IL-17, инициирует в клеточных структурах глаза
патологический характер иммунного ответа, связанный с персистенцией и
хронизацией воспаления, что приводит к развитию иммунопатологических
реакций и, возможно, аутоиммунному повреждению тканей в очаге воспаления,
то есть в структурах глаза.
Субпопуляция
Th-17
отличается
уникальностью
путей
дифференцировки регуляторных лимфоцитов и, в большей мере, особенностью
эффекторных функций как защищающих, так и индуцирующих местный
хронический
персистирующий
воспалительный
процесс
с
развитием
иммунопатологических реакций и аутоиммунным повреждением тканей в очаге
воспаления. Известно, что развитие и экспрессия Th-17 клеток требует
17
присутствия как IL-6, так и цитокинов семейства трансформирующих факторов
роста (TGFβ), продукция которых в наших исследованиях была снижена у всех
обследованных пациентов в 1,5 – 3 раза. Сниженная локальная секреция TGFβ
может свидетельствовать о прогрессировании фибротических и деструктивных
процессов. Следует отметить похожую динамику цитокина при миопии,
гипертонической болезни и сахарном диабете II типа (снижение локальных
уровней в 1,5 – 3 раза) в сочетании с ПОУГ и без нее. В свете поражения
нервной ткани структур глаза – астроцитов, олигодендроцитов, микроглии и
нейронов следует отметить, что данный спектр цитокинов экспрессируется
именно этими клетками. Высокие уровни
IL-17, IL-6 вызывают активную
деструкцию нервной ткани в зоне воспаления, а низкие значения TGFβ-1 и
TGFβ-3 в слезной жидкости могут расцениваться как прогностический фактор
усиления нейродегенерации и гибели нейронов.
Таким образом, анализ результатов дает право утверждать об
иммуноопосредованности глаукомной оптической нейропатии. Аутоиммунное
воспаление,
запущенное
цитокиновым
каскадом,
не
останавливается
самостоятельно пока вся ткань, экспрессирующая аутоантиген, не будет
разрушена и выведена из организма [Хаитов Р.М. с соавт., 2000], поэтому
ранняя диагностика предикторов глаукоматозного процесса у пациентов,
составляющих
группу
риска
возникновения
глаукомы,
представляется
особенно важной.
Выводы
1.
Изменения цитокинового статуса (высокие концентрации IFNγ, IL-
17, IL-6 и низкие TGF-β1, TGF-β3, как в сыворотке крови, так и в слезной
жидкости) у больных ПОУГ свидетельствуют о превалировании смешанного
Th1 / Th-17 иммунного ответа.
2.
Исследование локальной секреции цитокинов в слезной жидкости
оказалось более информативным, чем в сыворотке крови. Дефицит локальной
продукции TGFβ-1 (χ2= 3,9 с 1 ст. свободы, р=0,04) и высокие локальные
18
уровни ММР-9 (χ2=5,96 с 1 ст. свободы, р=0,015)
сопряжены с тяжестью
проявлений глаукомного процесса.
3.
Концентрация матриксной металлопротеиназы-9 была повышена в
7 раз в слезной жидкости, в 1,5 раза – в сыворотке крови пациентов ПОУГ.
Увеличение локальной концентрации ММР-9 прямо зависело от повышения IL17 (r=0,65) и дефицита TGFβ-3 (r=-0,6). Локальные уровни ММП-9
существенно превышали содержание ее комплекса с тканевым ингибитором
(MMP-9/TIMP-1).
4.
Высокие значения уровней секреторного sIgA у больных ПОУГ в
отличие от системных величин IgM, IgG, IgA отражают вовлечение локальных
гуморальных реакций иммунитета в иммунопатогенез заболевания.
5.
Системные и локальные иммунологические сдвиги у лиц с
миопической рефракцией, гипертонической болезнью II-III ст., сахарным
диабетом II типа характеризовались меньшей выраженностью, чем у пациентов
с ПОУГ, но с однонаправленной тенденцией, что позволяет считать эти
заболевания предикторами возникновения глаукомы.
Рекомендации для внедрения в медицинскую науку и практику
1.
Для дополнительной ранней диагностики ПОУГ рекомендованы
следующие критерии: 1) повышенные уровни металлопротеиназы-9 (ММР-9),
показатели которой в слезной жидкости превышают 52,5 нг/мл; 2) повышенные
уровни секреторного иммуноглобулина А (sIgA), показатели которого в
слезной жидкости превышают 47,38мг/л; 3) повышенные уровни интерлейкина17 (IL-17), показатели которого в слезной жидкости превышают 1,5 пг/мл; 4)
повышенные уровни интерферона-γ (ИФН-γ), показатели которого в слезной
жидкости превышают 5,84 пг/мл.
2.
Дополнительными диагностическими критериями далеко-зашедшей
и терминальной стадий ПОУГ являются увеличение локальных концентраций
MMP-9 (более 164,1нг/мл) и снижение продукции TGFβ-1 (менее 482,0 пг/мл).
3.
Миопия, гипертоническая болезнь II-III ст., сахарный диабет II типа
относятся к факторам риска развития первичной открытоугольной глаукомы.
19
Дополнительными
критериями
ранней
диагностики
ПОУГ
являются
гиперцитокинемия IL-17 и высокие уровни ММР-9 в слезной жидкости:
а) для пациентов с миопической рефракцией диагностически значимые
показатели IL-17>3,22 пг/мл и MMP-9>61,8 нг/мл; б) для пациентов с
гипертонической болезнью: IL-17>1,44 пг/мл; в) для пациентов с сахарным
диабетом II типа: IL-17>1,44 пг/мл и MMP-9>61,8 нг/мл.
Превышение
этих
уровней
диктует
необходимость
углубленного
обследования этой категории пациентов на выявление ПОУГ.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1.
Рукина
Д.А.,
Кириенко
А.В.
Значение
матриксной
металлопротеиназы в патогенезе первичной открытоугольной глаукомы //
Тихоокеанский медицинский журнал. 2011. №3. С. 41–43.
2.
Рукина Д.А. Исследование содержание интерлейкина-17 у
пациентов с первичной открытоугольной глаукомой // Фундаментальные
исследования. 2011. №7. С. 118–120.
3.
Рукина Д.А., Догадова Л.П., Маркелова Е.В., Абдуллин Е.А.,
Осыховский A.Л., Хохлова А.С. Иммунологические аспекты первичной
открытоугольной глаукомы // РМЖ. Офтальмология. 2011. №4. С. 162–165.
4.
Рукина Д.А., Галай Р.В. Роль ИНФ-γ в иммунопатогенезе
первичной открытоугольной глаукомы // Вестник Уральской академической
науки. 2010. №2/1. С. 194.
5.
Rukina D., Markelova E. General and Local levels of IL-2 and IL-6 in
patients with POAG // International Immunology, Abstract of 14-th International
Congress of Immunology, Kobe, Japan. 2010. Vol.22. №1, Day 4 (4/5). P. 124.
6.
Рукина Д.А. Иммунологические нарушения у больных глаукомой //
Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической
медицины:
тезисы
докладов
X
Тихоокеанской
научно-практической
конференции студентов и молодых ученых с международным участием.
Владивосток: Медицина ДВ, 2009. – С. 61–62.
20
7.
Рукина
Д.А.,
Галай
Р.В.,
Галай
В.Н.
Некоторые
аспекты
иммунопатологии глаукомы // Актуальные проблемы экспериментальной,
профилактической
и
клинической
медицины:
тезисы
докладов
X
Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых
ученых с международным участием. Владивосток: Медицина ДВ, 2011. – С. 342.
8.
Рукина Д.А., Кислякова И. С. Роль матриксной металлопротеиназы
в иммунопатогенезе первичной открытоугольной глаукомы // Актуальные
проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины:
тезисы
докладов
X
Тихоокеанской
научно-практической
конференции
студентов и молодых ученых с международным участием. Владивосток:
Медицина ДВ, 2011. – С. 345–346.
9.
Маркелова Е.В., Рукина Д.А., Догадова Л.П. Иммунологические
методы диагностики первичной открытоугольной глаукомы. Методические
рекомендации. Владивосток, 2012. – 16с.
Список сокращений
ГБ – гипертоническая болезнь
ИФА – иммуноферментный анализ
ПОУГ – первичная открытоугольная глаукома
СД – сахарный диабет
IFN – интерферон
Ig - иммуноглобулин
IL – интерлейкин
ММР – матриксная металлопротеиназа
Th – Т-лимфоциты – хелперы
TIMP – тканевой ингибитор матриксной металлопротеиназы
TGF – трансформирующий фактор роста
21