Курсовая работа по теме: «Анализ роли мотива ArgH52– GluH61 в связывании
advertisement
Курсовая работа по теме: «Анализ роли мотива ArgH52– GluH61 в связывании антигенов антителами». Курсовую работу выполнил ученик 10 «Н» класса СУНЦ МГУ Петров Артем под руководством Колясникова О.В. и Аржаника В.К. Москва, 2014 год. Введение Иммунная система - одна из важнейших систем во всех организмах. Но только у позвоночных появляются антитела (иммуноглобулины) - белки, способные специфически распознавать антиген (чужеродный агент) и связываться с ним. Антитела являются основной составляющей специфического иммунитета. Изучение особенностей связывания антител и антигенов и выявление закономерностей в этой области является важнейшей частью разработки вакцин и улучшения уже существующих. В этой работе я сфокусировался на изучении особенностей связывания аминокислотной последовательности, находящейся в одной из канонических структур антитела. Результаты этой работы позволят понять механизмы связывания аминокислот, входящих в одну из канонических структур, с антигеном, а также, методы, описанные в этой работе, возможно, позволят повысить аффинность антител с данным аминокислотным мотивом. Общие сведения Антитела (иммуноглобулины) - это разновидность белков, содержащихся в плазме крови и тканевых жидкостях позвоночных животных, способных специфично связываться с определенным антигеном. На данный момент у большинства животных обнаружено 5 типов антител: IgM, IgD, IgA, IgG, IgE. Антитела разных классов различаются по размеру, заряду белковой молекулы и аминокислотному составу. В моей курсовой работе я буду в основном обсуждать представителей иммуноглобулины антител. Молекула класса антитела IgG, этого как наиболее класса типичных содержит четыре полипептидные цепи- 2 тяжелые (heavy chains, HC) и 2 легкие (light chains, LC). В состав каждой из легких цепей входят 2 домена - один изменяющийся (вариабельный) и один постоянный (неизменяющийся, константный) (Рис.1). Структура каждого из доменов стабилизирована за счет внутренних дисульфидных связей. Дисульфидные связи скрепляют две тяжелые цепи между собой, а также тяжелые и легкие цепи. Каждая пара вариабельных доменов в соседних тяжелой и легкой цепях образуют вариабельный фрагмент (Fv- фрагмент). Однако уровень вариабельности внутри этих фрагментов распределен неравномерно (Рис.2). Самая высокая изменчивость наблюдается в так называемых «гипервариабельных» областях- hypervariable loops. В третичной структуре эти области имеют вид петель, и они же и являются регионами, определяющими комплементарность антитела к антигену, то есть именно они связывают антиген и определяют специфичность иммуноглобулина. Эти регионы называются CDR (Complementarity Determining Region). В одном вариабельном фрагменте выделяют 6 CDR, по три на тяжелую и легкую цепь соответственно. Однако в иммуноглобулине CDR не занимают всю N-концевую часть вариабельного фрагмента, они чередуются с относительно константными участками (каркасными участками, FR- Framework Regions), которые поддерживают третичную структуру вариабельных фрагментов и всего вариабельного домена. Ген вариабельного домена тяжелой цепи представляет собой совокупность последовательностей ДНК, принадлежащих трем классам: V (variable), D (diversity) и J (joint). Ген вариабельного домена легкой цепи представлен лишь V и J фрагментами. Ген каждого CDR в каждом отдельно взятом иммуноглобулине появляется в результате рекомбинации фрагментов генов, принадлежащих этим классам, и именно поэтому сайт связывания каждого антитела индивидуален (Рис.3). Последующее за рекомбинацией созревание антител повышает их специфичность. Созревание антител проходит в два этапа - соматическая гипермутация и отбор наиболее удачных клонов антител. В процессе соматической гипермутации происходит генерация множества вариантов антител, которые возникают при точечных мутациях в генных сегментах, кодирующих вариабельные домены антител. Далее происходит процесс отбора наиболее удачно получившихся иммуноглобулинов через процесс презентации антигена T-лимфоцитами В-лимфоцитам. Если на мембране В-лимфоцита оказывается высокоаффинное антитело (антитело, способное прочно ассоциироваться с антигеном), то происходит активация Влимфоцита, а если этого не происходит, то это означает, что антиген диссоциировал, и иммуноглобулин подвергается дальнейшим мутагенным преобразованиям. Полученные антитела называются зрелыми. Цель работы В каждом антителе CDR полностью индивидуальны. Однако, несмотря на это, роль некоторых аминокислотных остатков на конкретных позициях в аминокислотной последовательности CDR строго фиксирована. В каждом CDR наблюдаются консервативные и неконсервативные аминокислотные мотивы. Консервативные мотивы – это аминокислотные последовательности, которые встречаются с достаточной регулярностью у разных антител в одних и тех же позициях. Неконсервативные мотивы – это последовательности аминокислот, которые не встречаются на фиксированных позициях у различных антител. Целью моей работы было изучение консервативного мотива, находящегося в CDR H2, начинающегося с 52 позиции, на которой стоит аминокислота аргинин, и заканчивающегося на 61 позиции, на которой стоит глутаминовая кислота (глутамат). Данный мотив входит в каноническую структуру H2-121. При физиологических значениях pH боковая цепь аминокислоты аргинина заряжена положительно (Рис.4), а глутаминовой кислоты – отрицательно (Рис.5). Данный консервативный мотив играет большую роль в связывании антигена антителом и имеет определенную функцию. Конформацией данного мотива является петля, начало и конец которой образуются аргинином Н52 и глутаматом Н61 (Рис.6). Задачи работы В качестве задач можно выделить несколько этапов работы. Первый этап – это сбор выборки антител, имеющих данный консервативный мотив. Этот этап был осуществлен с помощью общей базы данных рентгеновских структур антител. На втором этапе работы были проведены необходимые измерения, касающиеся параметров связывания. Были измерены расстояния от заряженных атомов боковых цепей аргинина Н52 и глутаминовой кислоты Н61 до отрицательно заряженного атома карбоксильной или фосфатной группы антигена, а также, между заряженными атомами боковых цепей аргинина Н52 и глутаминовой кислоты Н61. Также, был измерен угол, под которым располагались заряженные атомы (Рис.7). Третий этап работы был посвящен сбору статистической информации, то есть, с какой частотой встречается этот мотив среди всех рентгеновских структур антител, а также как часто он непосредственно участвует в связывании. Четвертый этап – это выяснение механизмов и параметров связывания. Пятый этап был посвящен сбору информации по остальным аминокислотным мотивам с заряженными аминокислотными остатками в позициях Н52 и Н61. Для их изучения были применены методы исследования, описанные выше, в ходе которых были выяснены некоторые возможности для повышения аффинности связывания антител с консервативным мотивом Arg H52 - GluH61. Результаты В базе данных ренгеновских структур антител, насчитывающей 1705 структур, встречаются 67 антител (18 индивидуальных структур), где есть консервативный мотив ArgH52 - GluH61. Следовательно, антитела с данным мотивом составляют порядка 4% всех антител, для которых имеются рентгенографические данные. Проанализировав структуры с мотивом, мной был сделан вывод, что в 66 из 67 случаев мотив ArgH52 GluH61 участвует в связывании антигена. Далее был установлен механизм взаимодействия мотива и антигена. Как уже говорилось, началом и концом данной консервативной структуры являются положительно заряженный аргинин и отрицательно заряженная глутаминовая кислота соответственно. Если обратить внимание на координацию данного мотива относительно отрицательно заряженной при нейтральном значении рН функциональной группы в антигене, то можно заметить типичную для данного мотива картину связывания: положительно заряженный аргинин находится между двумя отрицательно заряженными карбоксильными группами антигена и глутаминовой кислоты соответственно (Рис.8). Проанализировав данную структуру, можно сделать вывод о механизме связывания: положительно заряженный атом азота в аргинине Н52 образует ионную пару с отрицательно заряженным атомом кислорода в функциональной группе антигена. Функция глутаминовой кислоты на позиции Н61 заключается в координации боковой цепи аргинина, имеющей большую степень свободы, в наиболее выгодной для связывания точке пространства. После сбора информации и анализа всех мотивов с заряженными аминокислотными остатками в позициях Н52 и Н61 структуры были разделены на несколько классов. В первый класс попали антитела с мотивом AspH52 - AspH61. Данный мотив не образует петли и периодически участвует в связывании. Второй класс мотивов – ArgH52 - AspH61. Данный мотив не участвует в связывании, но имеет конформацию петли. Но особый интерес для работы представляет третий класс мотивов – ArgH52 - LysH61. Данный мотив образует петлю, на концах которой стоят аминокислота аргинин в позиции H52, заряженная положительно при физиологических значениях pH и аминокислота лизин в позиции H61, также заряженная положительно (Рис.9). Данный мотив также участвует в связывании отрицательно заряженных групп в антигене, но делает это, по-видимому, гораздо эффективнее, чем мотив ArgH52 - GluH61. Два положительно заряженных остатка координируются так, что отрицательно заряженная карбоксильная группа находится между ними (Рис.10). Таким образом, отрицательный заряд распределяется между двумя положительно заряженными остатками, что приводит к понижению энергии связывания по сравнению с взаимодействием с одним положительно заряженным остатком, как в случае мотива ArgH52 - GluH61. Далее я начертил треугольник, образованный заряженными атомами азота в ArgH52, кислорода в GluH61 и кислорода в карбоксильной группе антигена. Такая же операция была проделана для мотива ArgH52 - LysH61. Начертив вектор напряженности электрического поля в точке пересечения серединных перпендикуляров в треугольниках с мотивом ArgH52 - GluH61 и ArgH52 - LysH61, можно увидеть, что в первом случае вектор направлен в сторону от полости связывания, а последнем – в сторону антигена (Рис.11). Это может означать, что аффинность связывания выше в случае мотива ArgH52 - LysH61. При наличии мотива ArgH52 - GluH61, входящего в каноническую структуру H2-12-1, и, заменив глутаминовую кислоту в 61 позиции на лизин, существует возможность достижения некоторого повышения аффинности данных антител. Выводы 1) Мотив ArgH52 - GluH61, входящий в каноническую структуру H2-12-1, встречается в 4% антител, для которых имеются рентгенографические данные; 2) В 66 из 67 антител данный мотив непосредственно участвует во взаимодействии с антигеном; 3) Функция аминокислоты аргинина в данном мотиве фиксирована: положительно заряженный атом азота в ее боковой цепи образует ионную пару с отрицательно заряженной группой антигена; 4) Функция глутаминовой кислоты также определена: отрицательно заряженная карбоксильная группа в составе ее боковой цепи координирует боковую цепь аргинина в наиболее выгодной для связывания точке пространства. Выражаем благодарность программе “Научные лаборатории для школьников, STEMцентры” (http://stemcentre.ru/) за поддержку в ходе выполнения проекта. Список литературы: 1) “Иммунология” А.Ройт, Дж.Бростофф, Д.Мейл. Издательство “Мир”, 592 с. 2) “Получение рекомбинантных антител и способы увеличения их аффинности” Е. П. Альтшулер, Д. В. Серебряная, А. Г. Катруха. Успехи биологической химии. т.50, с. 203-258, 2010. 3) “Interaction of antibodies with small aromatic ligands: the role of π-stacking” Vladimir Arzhanik, Oleg Koliasikov, Darjia Svistunova, Alexey M. Egorov. Journal of bioinformatics and computational biology, Vol. 8 №3, pages 471483, 2010. 4) “Antibody-antigen interactions: contact analysis and binding site topography” Robert M. MacCallum, Andrew C. R. Martin and Janet M. Thornton. Journal of Molecular Biology, Vol.262, issue 5, pages 732-745, 1996. 5) “Identification of specificity-determining residues in antibodies” Eduardo A. Padlan, Chantal Abergel and Jennifer P. Tipper. The Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology, Vol.9, №1, pages 133-139, January 1995 6) “Antigen–antibody interface properties: Composition, residue interactions, and features of 53 non-redundant structures” Thiruvarangan Ramaraja, Thomas Angelb, Edward A. Dratzc, Algirdas J. Jesaitisd, and Brendan Mumey. Journal of Biochemistry and Biophysics. Vol.1824, issue 3, pages 520–532. March 2012. 7) “Use of amino acid composition to predict epitope residues of individual antibodies” Shinji Soga, Daisuke Kuroda, Hiroki Shirai, Masato Kobori and Noriaki Hirayama. Journal: Protein Engineering, Design and Selection, Vol.23 , Issue 6, pages 441-448, 2010. 8) “Crystal structure of the complex of a catalytic antibody Fab fragment with a transition state analog: Structural similarities in esterase-like catalytic antibodies” Jean-Baptiste Charbonnier, Elisabeth Carpenter, Benoit Gigant, Beiatrice Golinelli-Pimpaeau, Zelig Eshhar, Bernard S. Green and Marcel Knossow. Journal “PNAS” vol. 92 №. 25, pages 11721-11725. December 1995. 9) “A new clustering of CDR loop conformations” Benjamin North, Andreas Lehmann, Roland L. Dunbrack Jr. Journal of Molecular Biology. 406(2): pages 228–256. 2011 February 18. Иллюстрации (Рис.1)- Схема общего строения иммуноглобулина, пунктиром обведен вариабельный фрагмент, тяжелые и легкие цепи (тяжелые цепи показаны голубым цветом, легкие – зеленым). (Рис.2)- Распределение вариабельности в вариабельном домене, показаны CDR и их расположение. На первой картинке – схема (обозначены CDR в легкой и тяжелой цепях, антиген обозначен желтым, зеленым показаны легкие цепи, голубым - тяжелые), на второй - реальное расположение CDR в вариабельном фрагменте (красным обозначена реальная форма и расположение CDR в вариабельном домене тяжелой цепи). (Рис.3)- Схема V(D)J рекомбинации генов при формировании тяжелой цепи (CDR H3 в частности). В процессе V(D)J-перестройки генные сегменты, по одному из каждого класса, соединяются вместе. На первой стадии удаляются ненужные сегменты генов классов D и J. Далее идет рекомбинация сегментов этих классов, до образования единого DJ комплекса. На третьей стадии удаляются ненужные фрагменты гена класса V. Затем идет рекомбинация DJ и V фрагментов, образуя единый кодирующий участок- VDJ, который кодирует вариабельные домены. Также, в геноме антитела будет присутствовать ген C, кодирующий константные домены. (Рис.4) – Остаток аминокислоты аргинина, атом азота, заряженный положительно при физиологических значениях pH в боковой цепи, показан “+” знаком. O HN CH C CH2 CH2 CH2 NH C NH NH3 (Рис.5) – Остаток глутаминовой кислоты, карбоксильная группа в боковой цепи, заряженная отрицательно при физиологических значениях pH, показана знаком “– ” . O HN CH C CH2 CH2 C O O (Рис.6) - Третичная структура аминокислотного мотива ArgH52 - GluH61, представляющая из себя петлю, началом и концом которой являются аргинин и глутаминовая кислота соответственно. Фиолетовым показан ArgH52, желтым – GluH61. Спиралью показана α-спираль, стрелкой – начало β-листа. (Рис.7) - На картинке слева изображены расстояния между заряженными атомами кислорода глутаминовой кислоты (изображена желтым) и карбоксильной группы антигена (5,6 Ангстрем), а также положительно заряженным атомом азота аргинина (3,0 и 3,3 Ангстрем соответственно, показан фиолетовым). На картинке справа показан угол между этими атомами (127,8◦). (Рис.8) - Положительно заряженный аргинин (показан фиолетовым) находится между двумя отрицательно заряженными карбоксильными группами антигена и глутаминовой кислоты (показана желтым). Положительно заряженный атом азота в аргинине, показанный значком “+”, образует ионную пару с отрицательно заряженным атомом кислорода в карбоксильной группе антигена, показанным красным и значком “–” . Отрицательно заряженный атом кислорода в карбоксильной группе боковой цепи глутаминовой кислоты, показанный желтым и значком “–”, оказывает координирующее воздействие на боковую цепь аргинина. (Рис.9) - На картинке слева показан положительно заряженный при физиологическом значении pH остаток аминокислоты лизина. Положительно заряженный атом азота в боковой цепи показан значком “+”. На картинке справа показана третичная структура мотива ArgH52 - LysH61, представляющая из себя петлю, началом и концом которой являются аргинин и лизин соответственно. Фиолетовым показан ArgH52, оранжевым – LysH61.Спиралью показана α-спираль, стрелками показаны начала β-листов. O HN CH C CH2 CH2 CH2 CH2 NH3 (Рис.10) - Два положительно заряженных остатка аргинина, показанного фиолетовым, и лизина, показанного оранжевым, координируются так, что отрицательно заряженная карбоксильная группа находится между ними. (Рис.11) - На картинке слева изображен вектор DK напряженности электрического поля в точке пересечения серединных перпендикуляров (точка D) в случае мотива ArgH52 GluH61. На этой картинке сверху изображена карбоксильная группа антигена, заряженная отрицательно, справа – атом азота в боковой цепи аргинина, заряженный положительно, а снизу – отрицательно заряженный атом кислорода боковой цепи глутаминовой кислоты. Ясно видно, что напряженность поля направлена в противоположную сторону от антигена. На картинке справа показан вектор DH напряженности электрического поля в точке пересечения серединных перпендикуляров (точка D) в случае мотива ArgH52 LysH61. На данной картинке снизу изображена карбоксильная группа антигена, справа – положительно заряженный атом азота в боковой цепи аргинина, а слева – положительно заряженный атом азота в боковой цепи лизина. В этом случае наоборот, напряженность поля направлена в сторону антигена. Это показывает, что аффинность связывания во втором случае выше, чем в первом.