Мухамедова Наталья Анатольевна

На правах рукописи
Мухамедова Наталья Анатольевна
Влияние бишофитсодержащей рапы
соленого озера «Малое Лиманское» Астраханской
области на функциональное состояние
и свободнорадикальный гомеостаз самцов крыс
03.00.13 - физиология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Астрахань-2009
Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии, генетики и
биохимии Государственного образовательного учреждения высшего
профессионального
образования
«Астраханский
государственный
университет»
Научный руководитель
- доктор биологических наук, профессор
Кондратенко Елена Игоревна
Официальные оппоненты - доктор биологических наук, доцент
Лазько Марина Владимировна
доктор биологических наук, доцент
Котельников Андрей Вячеславович
Ведущая организация –
Ставропольский государственный университет
Защита состоится
26 июня 2009 года в 14 часов на заседании
диссертационного совета ДМ 212.009.01 при Астраханском государственном
университете по адресу: 414000, Астрахань, пл. Шаумяна, д.1
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Астраханского
государственного университета по адресу: 414000, Астрахань, пл. Шаумяна,
д.1
Автореферат разослан 25 мая 2009 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор биологических наук
Нестеров Ю.В.
2
АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ
Неблагоприятная
экологическая
обстановка,
а
также
стресс-
обусловленная нагрузка на живой организм являются причиной развития
макро- и микрополиэлементозов. Все это приводит к биохимическим и
функциональным изменениям, которые негативно отражаются на состоянии
здоровья,
работоспособности
и
качестве
жизни
человека.
Поэтому
исследование зависимости физиологических процессов от обеспеченности их
макроэлементами стало предметом изучения многих известных ученых
(Carl, G, 1994; А.П. Авцин, 1991; Н.А. Агаджанян, Н.В. Ермакова, 1997;
А.В.Скальный, А.Т.Быков, 2003)
Одним из основных макроэлементов в организме человека является
магний.
Существующие
средства восполнения недостатка магния
в
организме представляют собой лекарственные препараты и пищевые
добавки, которые принимаются перорально (Tsuji H. Et. Fl., 1994;
Компанцева Е.В., и соавт., 2002; Забелина В.Д., 2003; Скальный А.В., 2004).
Отличительной особенностью магнийсодержащих препаратов при их
наружном применении является их способность снимать воспалительные
реакции и болевой синдром при различны заболеваниях ОДС, оказывать
мощный седативный эффект и улучшать физико-химические показатели
кожи при его наружном применении (Стрельцов Д.А., 2001, 2002; Мотов
А.А., 2003, 2004, 2005).
Магнийсодержащие
минералы
эффективно
применяются
в
бальнеологии и косметологии ( Dyckner, Webster, 1984; Nigam S. с соавт.,
1986; Смирнова, Л.А., 1994; Спасов, А.А., 2003; Щава С.Н., 2001). В этой
связи особое внимание привлекает минерал бишофит,
содержащий
максимальное количество магния хлорида (до 95-96 % в сухом остатке).
Условия существования бишофитсодержащей рапы при непосредственном
контакте с окружающей средой формируют сложную органоминеральную
композицию,
физиологические
особенности,
действия
которой
не
исследованы. В зарубежной практике данный минерал, а также содержащая
3
его рапа Поморийского озера (Болгария) и Мертвого моря (Израиль,
Иордания), используется как основа для противовоспалительных средств
наружного
применения.
Подземные
залежи
бишофита
имеются
в
Прикаспийской впадине. В Астраханской области также имеются запасы
магнийсодержащих веществ в многочисленных соленых озерах, одним из
которых является озеро «Малое Лиманское». Физиологические особенности
действия Астраханского озерного бишофита не исследованы. Биологическая
активность
озерной
рапы
«Малое
Лиманское»
определенных особенностей по сравнению с
должна
иметь
ряд
подземным минеральным
бишофитом. В связи с этим изучение функционального состояния организма
под влиянием рапы озера «Малое Лиманское» является актуальным.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Установить
влияние бишофитсодержащей рапы соленого озера
«Малое Лиманское» Астраханской области на физиологические параметры и
свободнорадикальный гомеостаз самцов крыс.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
1.
Оценить токсикологическую безопасность рапы Астраханского озера
«Малое Лиманское».
2.
Исследовать влияние физиологически адекватного разведения раствора
рапы, вводимого внутрижелудочно, на показатели крови крыс.
3.
Изучить влияние рапы соленого озера «Малое Лиманское» на
ориентировочно-исследовательское поведение крыс.
4.
Оценить эффект раствора рапы на
интенсивность перекисного
окисления липидов (ПОЛ) по следующим показателям: содержание
малонового
диальдегида
(МДА),
скорость
спонтанного
и
аскорбатзависимого ПОЛ в гомогенатах тканей печени, почек, миокарда;
уровень промежуточных продуктов ПОЛ (ацилгидроперекиси, кетодиены и
сопряженные триены, диеновые конъюгаты) в липидных экстрактах плазмы
крови и степень перекисного гемолиза эритроцитов.
4
Изучить
5.
влияние
модификации
раствора
белков
рапы
(ОМБ)
(кетодинитрофенилгидразоны,
на
процессы
плазмы
окислительной
крови
алифатические
и
миокарда
альдегидо-
и
кетонопроизводные динитрофенилгидразонов основного характера) и
сопоставить характер изменения интенсивности ПОЛ и ОМБ.
6.
Изучить
изменения
активности
ферментативного
звена
антиоксидантной системы самцов крыс и активность антиоксидантного
белка
крови
–
церулоплазмина
–
под
воздействием
растворов
бишофитсодержащей рапы (РАР) и Волгоградского бишофита (РВБ).
7.
Провести сравнительный
бишофитсодержащей
рапы
анализ эффектов воздействия растворов
соленого
озера
«Малое
Лиманское»
Астраханской области и Волгоградского бишофита на физиологические
параметры и показатели свободнорадикального гомеостаза самцов крыс.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
Впервые исследован химический состав рапы соленого озера «Малое
Лиманское» Астраханской области. В рапе обнаружены бальнеологически
значимые количества бишофита, соединений калия, брома и бора,
органические компоненты и установлена ее токсикологическая безопасность.
Обнаружено
влияние
бишофитсодержащей
рапы
внутрижелудочного
на
структуру
введения
ориентировочно-
исследовательского поведения самцов крыс, заключающееся в снижении
показателей тревожности.
Впервые установлены тканеспецифические изменения интенсивности
перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков в
условиях внутрижелудочного введения бишофитсодержащей рапы.
Показано, что бишофитсодержащая рапа соленого озера «Малое
Лиманское» Астраханской области способствует активации ферментативного
звена
антиоксидантной
бишофитсодержащей
системы
рапы
самцов
соленого
крыс.
озера
Специфика
«Малое
влияния
Лиманское»
Астраханской области заключается в значительном снижении интенсивности
5
окислительной модификации белков миокарда. Она не является полным
аналогом Волгоградского бишофита.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Экспериментально доказана целесообразность использования рапы
соленого озера «Малое Лиманское» в качестве бальнеологического средства.
Разработаны технические условия на применение бишофитсодержащей
рапы в качестве косметического сырья.
Созданы
рецептуры
и
отработана
технология
введения
бишофитсодержащей рапы в косметические средства для волос и кожи
головы.
Физиологически
бишофитсодержащей
обоснована
рапы
целесообразность
соленого
озера
применения
«Малое
Лиманское»
Астраханской области в бальнеологической практике.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
1. Рапа озера «Малое Лиманское» при внутрижелудочном введении в
изоосмотическом разведении не является токсичной, тканеспецифически
изменяет про- и антиоксидантное равновесие в организме самцов крыс,
способствует изменению структуры ориентировочно-исследовательского
поведения животных и уменьшения уровня тревожности.
2. Физиологические аспекты бальнеологической реакции, развивающейся
под воздействием внутрижелудочного введения рапы озера «Малое
Лиманское»
Астраханской
ферментативного
звена
области,
заключается
антиоксидантной
системы
в
и
активации
уменьшении
интенсивности окислительной модификации белков миокарда.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ
Результаты исследования доложены на конференциях и опубликованы
в материалах IХ
биологические
международной научной конференции «Эколого-
проблемы
бассейна
Каспийского
моря»
(2006),
II
Всероссийской научной конференции «Экологические проблемы природных
и урбанизированных территорий» (Астрахань, 2008), VI международной
6
практической конференции «Человек и животные»
(Астрахань, 2008),
Всероссийского форума «Здравница» (Москва, 2008), XVI Российского
национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 2009), IV
Международной (XIII Всероссийской) Пироговской студенческой научной
медицинской конференции (Москва, 2009), Х Всероссийской научнопрактической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых
«Молодежь и наука ХХI века», посвященная 85-летию со дня рождения В.П.
Астафьева (Красноярск, 2009), научной конференции с международным
участием «Научный прогресс на рубеже тысячелетий - 2009» (Прага, 2009),
Каспийском инновационном форуме (Астрахань, 2009).
ПУБЛИКАЦИИ
По теме диссертации опубликовано 8 работ.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания
материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов
собственных исследований, выводов. Работа изложена на 125 стр., содержит
14 таблиц, 2 рисунка, список литературы включает 143 источника, из
которых 57 иностранных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Санитарно-микробиологические
«Малое
Лиманское»
Лиманского
показатели рапы соленого озера
района
Астраханской
области
соответствуют установленным нормам. Токсичные компоненты содержатся
в количествах, значительно
меньших допустимых концентраций.
Содержание в рапе радионуклидов не превышает пределов, установленных
нормами радиационной безопасности (Бальнеологическое заключение ФГУ
«РНЦ ВМиК Россздрава» № 14/98 от 04.03.2008 г.).
Изучение химического состава рапы проводили лазерным массспектральным методом на приборе ЭМАЛ-2.
Изучение токсикологической безопасности магнийсодержащей рапы
озера
Малое
Лиманское
Астраханской
области
проводилось
двумя
7
способами: 1) по санитарно-микробиологической оценке (инфузориипарамеции) («Методы определения токсичности» ГОСТ 13496.7-97); 2) при
помощи методики определения токсичности в биопробе на лабораторных
животных (мыши) («Методические указания по определению токсичности
кормов, кормовых добавок и сырья для производства кормов в биопробе на
лабораторных животных» », № 13-5-02/0795 от 26.06.2003г.).
Схема
эксперимента. Исследования проводились на 60 белых
беспородных крысах-самцах со средней массой 250 г. Возраст животных
составлял 6 месяцев.
В качестве препарата сравнения был выбран хорошо изученный
минеральный бишофит Волгоградского месторождения. Использовался
раствор минерала бишофит, очищенный от техногенных примесей.
Самцы крыс были разделены на три группы: 1)
внутрижелудочно
NaCl
внутрижелудочно
раствор
физиологически
(0,9%
раствор);
рапы
адекватном
2)
животные, получавшие
животные,
Астраханского
разведении;
3)
соленого
животные,
получавшие
озера
в
получавшие
внутрижелудочно раствор Волгоградского бишофита. Процедура введения
исследуемых веществ продолжалась в течение 10 дней (ежедневно,
однократно). Внутрижелудочные введения производили с помощью зонда в
дозе 3 мл/кг. Все животные содержались в стандартных условиях вивария со
свободным доступом к воде и пище. Умерщвление животных декапитацией
проводили
после
предварительной
наркотизации
внутрибрюшинным
введением этаминала натрия в дозе 4 мг/100 г массы тела.
Приготовление растворов. Раствор Астраханской рапы (РАР) и
раствор
Волгоградского
бишофита
(РВБ)
разводили
до
получения
изотонического раствора. Точку изотоничности находили с помощью
теста на осмотическую резистентность эритроцитов (Кошев В.И., 2004).
До и после эксперимента оценивали вес животных. Определяли
изменения относительной массы надпочечников и щитовидной железы. В
крови определяли уровень гемоглобина (с помощью набора «LACHEMA») и
8
цветовой показатель, количество эритроцитов и лейкоцитов (подсчет
производили стандартным способом с помощью камеры Горяева).
Ориентировочно-исследовательская активность. Влияние раствора
Астраханской
рапы
на
ориентировочно-исследовательское
поведение
изучалась в условиях теста «открытое поле» (Bureš Y., Burešová O., 1983),
при
котором
регистрировали
пересеченных
количество
активность),
квадратов
вставаний
(горизонтальная
на
количество
следующие
задние
лапы
обследованных
показатели:
количество
двигательная
активность),
(вертикальная
двигательная
отверстий
(ориентировочно-
исследовательская активность), число выходов в центральную зону,
количество
актов
груминга,
количество
фекальных
болюсов
(эмоциональный фактор).
Определение активности щелочной фосфатазы в плазме крови при
внутрижелудочном введении раствора Астраханской рапы проводили
унифицированным методом по «конечной точке». Метод основан на
образовании п-нитрофенола из п-нитрофенилфосфата в реакции со щелочной
фосфатазой.
Определение
активности
церулоплазмина
в
сыворотке
крови.
Определение активности основного медьпротеида крови – церулоплазмина
проводили по ускоренной методике, предложенной Э.В. Тен (2007). Метод
основан
на
реакции
окисления
парафенилендиамина.
Активность
церулоплазмина измеряли в единицах оптической плотности.
Интенсивность
свободнорадикального
окисления
определяли
по
скорости перекисного окисления липидов в гомогенатах тканей печени,
почек, миокарда по методу И.Д. Стальной и Т.Г. Гаришвили (1977).
Критериями оценки ПОЛ в тканях были содержание МДА, скорость
спонтанного и аскорбатзависимого ПОЛ. Промежуточные продукты ПОЛ в
плазме крови определяли по методу И.А. Волчегорского и соавторов (1989).
В изопропанольной и гептановой фракциях плазмы крови определяли
9
уровень
ацилгидроперекисей,
диеновых
конъюгатов,
кетодиенов
и
сопряженных триенов. Активность каталазы определяли в тканях почек,
миокарда и в плазме крови при помощи методики М.А. Королюка и
соавторов (1988). Для определения перекисного гемолиза эритроцитов
использовали модификацию метода определения степени перекисного
гемолиза эритроцитов А.А. Покровского и А.А. Абрарова (1964), которую
предложили А.Е. Лазько, Р.И. Асфандияров и А.А. Рязаев (1993). Оценку
степени окислительной модификации белков проводили по методике Е.Е.
Дубининой и соавт. (1995) метод оценки и принцип которого основан на
цепи взаимодействия окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4динитрофенилгидразином,
в
результате
чего
образуются
2,4-
динитрофенилгидразоны, алифатические альдегидо- и кетонопроизводные
динитрофенилгидразонов основного характера. Для определения активности
СОД в биологических материалах использовали адаптированный метод,
предложенный С. Чевари и соавт. (1984). Метод основан на способности
СОД конкурировать с нитросиним теетразолием (НСТ) за супероксидные
анионы. Полученные данные были подвергнуты статистической обработке с
использованием критерия Стьюдента и коэффициента корреляции.
Результаты исследования и их обсуждение
Исследовавшийся образец рапы был отобран в конце лета (17.08.07 г.)
при минимальном уровне вод и, соответственно, при максимальном значении
минерализации – 368 г/л.
10
Таблица 1
Лазерный масс-спектральный анализ элементного состава
рапы соленого озера «Малое Лиманское» Астраханской области
Содержание
в атом. %
0,0045
0,7701
0,0082
34,5686
0,0625
1,6250
16,0770
0,0054
0,0085
0,0034
0,0555
42,5840
4,1724
0,0183
0,0004
0,0001
0,0003
0,0005
0,0103
0,0001
0,0002
0,0004
0,0014
0,0002
0,0001
0,0003
0,0185
Элемент
B
C
N
O
F
Na
Mg
Al
Si
P
S
Cl
K
Ca
Ti
V
Cr
Mn
Fe
Co
Ni
Cu
Zn
Ga
As
Se
Br
Содержание
в масс. %
0,0018
0,3463
0,0043
20,7082
0,0445
1,3993
14,6390
0,0055
0,0089
0,0039
0,0666
56,5362
6,1081
0,0274
0,0006
0,0002
0,0007
0,0010
0,0215
0,0002
0,0005
0,0010
0,0033
0,0006
0,0002
0,0009
0,0554
Примечание: жирным шрифтом выделены бальнеологически значимые элементы
Реакция среды слабокислая (рН=5,3), что, видимо, обусловлено
наличием
в
рапе
повышенного
содержания
органических
кислот.
Органолептические свойства: вода полупрозрачная, светло-коричневая, с
небольшим коричневым осадком и слабым своеобразным морским запахом.
Токсичные компоненты (свинец, ртуть, нитраты и другие) содержатся в
количествах, значительно меньших допустимых концентраций. Содержание
радионуклидов
радиационной
не
превышает
безопасности
пределов,
(НРБ-99).
установленных
нормами
Санитарно-микробиологические
11
показатели
рапы
благополучные,
чему
способствует
её
высокая
минерализация.
В соответствии с Классификацией минеральных вод Минздрава России
рапа озера Лиманское при максимальных величинах минерализации (>300
г/л) относится к бромным (Вr 1096 мг/л), борным (Н3ВО3 644 мг/л) крепким
рассолам хлоридно-магниевого состава. В пересчете на гипотетические соли
в рапе содержится в подавляющем количестве бишофит (МgСl2 . 6Н2О) – 84,1
%, в качестве примесей – кизерит (МgSO4 . Н2О) – 7,6 %, галит (NaCl) – 4,6 %,
карналлит (KCl. МgСl2. 6Н2О) – 1,7 %, а также гидрокарбонат магния
(Mg(HCO3)2) – 1,6 % и бромид натрия (NaBr) – 0,4 % (таблица 2).
Таблица 2
Минеральный состав исследуемой рапы
№ п/п
1
2
3
4
5
6
Минеральные соли
бишофит
кизерит
галит
карналлит
гидрокарбонат
магния
бромид натрия
Итого
Химический состав
МgСl2 . 6Н2О
МgSO4 . Н2О
NaCl
KCl. МgСl2. 6Н2О
Содержание в %
84,1
7,6
4,6
1,7
Mg(HCO3)2
1,6
NaBr
0,4
100
Помимо минеральных солей рапа данного озера содержит большое
количество органических компонентов: гуминовые кислоты и их соли, а
также битумы, составляющих основную часть разницы между сухим
остатком (390,43 г/л) и минерализацией (386,0 г/л). Высокий удельный вес
рапы – 1,2 г/см3 (весной) и 1,4 г/см3 (в конце лета) способствует сохранению в
её составе планктона после его переработки и разложения в растворенном
(водорастворимые и легкогидролизуемые вещества) и во взвешенном
состоянии (гуминовые кислоты и их соли, битумы). В этом основное
бальнеологическое отличие озёрных рассолов от подземных (ископаемых)
(Бальнеологическое заключение ФГУ «РНЦ ВМиК Россздрава» № 14/98 от
04.03.2008 г.).
12
Токсикологическая безопасность Астраханской рапы проверялась по
санитарно-микробиологической
оценке
(инфузории-парамеции)
и
при
помощи методики определения токсичности в биопробе на лабораторных
животных (мыши). Степень токсичности исследуемого образца методом
санитарно микробиологической оценки определяли по выживаемости
инфузорий через 1 час экспозиции в вытяжке исследуемого образца. В
результате эксперимента обнаружено, что
выживаемость инфузорий
составила 88 %.
В результате определения токсичности в биопробе на лабораторных
животных (мыши) было установлено, что в дозе 3 мл/кг изотонический
раствор Астраханской рапы оказался не токсичным: все животные живы,
клинические
признаки
интоксикации
отсутствуют.
Изменений
в
поведенческих показаниях животных контрольной и подопытных групп не
выявлено, отказа от корма не было. После окончания исследования животные
были вскрыты. Видимых патологических изменений не обнаружено.
Проведенные исследования показали, что раствор Астраханской рапы в
физиологически адекватном разведении, вводимый внутрижелудочно,
не
влияет на относительную массу щитовидной железы и надпочечников, а
также на изменение массы тела. Прирост массы тела был равномерным и
различий в весе органов не обнаружено (таблица 3).
Таблица 3
Показатели массы крыс и относительной массы желез внутренней секреции
при внутрижелудочном введении физиологического раствора, РАР и РВБ
Исследуемый
показатель
масса тела
животных, г
в начале
эксперимента
в конце
эксперимента
относительный вес
Внутрижелудочное
введение NaCl,
(контроль),
п=20
Внутрижелудочное
введение раствора
Астраханской рапы,
п=20
Внутрижелудочное
введение
Волгоградского
бишофита, п=20
257,6±8,06
261,1±8,75
229,4±7,87
359,0±10,92
368,4±8,25
320,7±12,8
13
надпочечников,
мг/г
относительный вес
щитовидной
железы, мг/г
Данные
о
0,0592±0,003
0,0559±0,002
0,05033±0,004
0,02344±0,002
0,0297±0,003
0,02662±0,002
влиянии
Астраханской
рапы
на
гематологические
исследования приведены в таблице 4.
Из данных, представленных в таблице, видно, что существенного
влияния на состояние крови физиологическое разведение рапы и минерала
бишофита не оказывают. В группе, принимавшей раствор Астраханской
рапы, уровень гемоглобина остался без изменений. У группы, принимавшей
раствор Волгоградского бишофита, наблюдалось небольшое
снижение
гемоглобина.
Таблица 4
Гематологические показатели крови крыс
при внутрижелудочном введении NaCl, раствора Астраханской рапы
и раствора бишофита Волгоградского
Внутрижелудочное
введение NaCl,
(контроль)
п=20
Внутрижелудочное
введение раствора
Астраханской рапы,
п=20
Внутрижелудочное
введение
Волгоградского
бишофита, п=20
Гемоглобин, г/л
134,4±6,19
133,5±4,25 Δ
114,5±5,22*
Эритроциты, 1012
5,27±0,37
5,05±0,39
5,17±0,65
Лейкоциты, 109
4,48±0,81
2,9±0,3
2,83±0,8
0,79±0,07
0,81±0,04
0,71±0,08
Показатели крови
Цветовой показатель
Условные обозначения: * - достоверность различий между группами животных
контрольной группы и животными, получавшими раствор Астраханской рапы и раствор
Волгоградского бишофита (по Стьюденту); * - р<0,05; ** - p<0,01;*** - p<0,001.
Δ
- достоверность различий между группами животных, получавшими РАР и РВБ
(по Стьюденту); Δ - р<0,05; ΔΔ - p<0,01; ΔΔΔ - p<0,001.
Количество эритроцитов – на уровне контроля, количество лейкоцитов
имело тенденцию к
снижению, цветовой показатель, характеризующий
14
среднее содержание гемоглобина в одном эритроците,
оставался без
изменений.
Таким образом, согласно классификации
токсичности
веществ
Саноцкого И.В. и Улановой И.П. (1975), рапа озера «Малое Лиманское»
относится к малотоксичным веществам.
В ходе экспериментов было показано, что после перорального введения
раствора Астраханской рапы горизонтальная двигательная активность крыс
в открытом поле не изменяется (таблица 5). Наблюдалось незначительное
снижение посещения центральных квадратов у крыс, принимавших
Волгоградский бишофит. Количество посещений периферических квадратов
осталось таким же, как и в контроле.
Количество центральных стоек в обеих группах, получавших раствор
рапы и раствор бишофита, имела тенденцию к снижению, что может быть
обусловлено специфическим действием ионов магния. Исследовательский
компонент поведения (наибольшее число заглядываний в отверстия) у крыс
обеих групп, получавших РАР и РВБ, более выражен.
Таблица 5
Показатели двигательной активности в «открытом поле» при
внутрижелудочном введении крысам NaCl, РАР и РВБ
Показатели
двигательной
активности
Латентный
период (сек)
Центральные
квадраты
Периферические
квадраты
Центральные
стойки
Периферические
стойки
Норки
Внутрижелудочное
введение NaCl,
(контроль),
п=20
Внутрижелудочное
введение раствора
Астраханской рапы,
п=20
Внутрижелудочное
введение
Волгоградского
бишофита,
п=20
3,2±0,57
2,37±0,18 Δ
3,78±0,49
10,8±2,34
10,5±0,99
7,56±1,53
33,5±2,72
34,3±2,87
34,2±2,92
3,125±1,34
1,857±0,55
1,4±0,4
6,2±0,9
5,1±0,99
4,78±0,46
3,44±0,29
4,6±0,82
3,89±0,77
15
Груминг
8±0,91
5,44±0,58* Δ
9,67±1,84
Болюсы
-
6,0±0
2,0±1,0
Частота актов груминга,
достоверно уменьшалась у группы,
получавшей РАР. Количество болюсов у экспериментальных животных
значительно увеличивалось по сравнению с животными, получавшими
раствор хлорида натрия, что может быть обусловлено действием ионов
магния, стимулирующим перистальтику кишечника.
Таким
образом,
существенного
ориентировочно-исследовательской
внутрижелудочно раствор
влияния
активности
на
показатели
крыс
получавших
Астраханской рапы и раствор бишофита
Волгоградского в тесте открытого поля не имеют.
Индикатором элементного статуса магния может быть определение
активности щелочной фосфатазы (табл.6).
Таблица 6
Определение активности щелочной фосфатазы в плазме крови
при внутрижелудочном введении NaCl , раствора Астраханской рапы и
Волгоградского бишофита самцам крыс
Внутрижелудочное
введение NaCl,
(контроль)
1357 ± 11,13
Активность фермента, нмоль/с*л
Внутрижелудочное
Внутрижелудочное
введение раствора
введение раствора
Астраханской рапы
Волгоградского бишофита
1351 ± 9,56 ΔΔΔ
1536 ± 14,73***
Изменение количественного содержания элементного магния при
введении РАР не происходило, тогда как в группе, получавшей раствор
Волгоградского бишофита наблюдался достоверный рост показателей
активности щелочной фосфатазы.
Существенного влияния на степень перекисного гемолиза эритроцитов
относительно
контроля раствор рапы Астраханского месторождения не
оказывал. Изменения содержания продуктов перекисного окисления липидов
в гептан-изопропанольных экстрактах следующие: в изопропаноловой фазе
16
содержание ацилгидроперекисей при введении раствора рапы озера Малое
Лиманское оставалось без изменения, а в группе, получавшей раствор
Волгоградского
бишофита,
наблюдалось
достоверное
увеличение
содержания ацилгидроперекиси. Аналогично изменялись показатели по
содержанию диеновых конъюгатов. Содержание кетодиенов и сопряженных
триенов повышалось в обеих сравниваемых группах.
Результаты, полученные при изучении процессов ПОЛ в разных
органах, позволяют проанализировать тканеспецифические эффекты в
изменении про- и антиоксидантного равновесия при внутрижелудочном
введении раствора рапы Астраханского месторождения.
По величине исходного уровня малонового диальдегида изучаемые
органы у животных контрольной группы располагались в следующей
последовательности: почки > миокард > печень (рис. 1). Исходя из значений
данного параметра, раствор рапы Астраханского соленого озера проявляет
прооксидантные свойства в миокарде и почках, в печени просматривается
тенденция к снижению исходного уровня МДА.
9
***
нмоль/мг белка ткани
8
***
7
6
5
4
3
2
1
0
Печень
NaCl
Почки
РАР
Миокард
РВБ
Рис. 1. Динамика исходного уровня МДА в различных органах при
внутрижелудочном введении РАР и РВБ
Условные обозначения (здесь и далее к рис 2 – 7): * - достоверность различий между
группами животных контрольной группы и животными, получавшими РАР и РВБ (по
Стьюденту); * - р<0,05; ** - p<0,01;*** - p<0,001.
Δ
- достоверность различий между группами животных, получавшими РАР и РВБ
(по Стьюденту); Δ - р<0,05; ΔΔ - p<0,01; ΔΔΔ - p<0,001.
17
120
80
70
***
***
60
***
ΔΔ
нмоль/ч
50
40
30
20
10
0
Печень
Почки
Миокард
РАР
NaCl
РВБ
Рис. 2. Изменение скорости спонтанного ПОЛ в различных органах при
внутрижелудочном введении РАР и РВБ
Это подтверждают и кинетические показатели, где наблюдается динамика
увеличения скорости спПОЛ и аскПОЛ у животных, получавших раствор
Астраханской рапы. Показатели спПОЛ в тканях миокарда увеличивались и
в группе животных,
получавших РАР и РВБ (рис. 2). В ткани почек
достоверный рост спПОЛ наблюдался в группе получавших РВБ.
*
140
120
нмоль/ч
100
80
*** ***
60
40
20
0
Печень
Почки
Миокард
РАР
NaCl
РВБ
Рис. 3. Изменение скорости аскорбатзависимого ПОЛ в различных тканях при
внутрижелудочном введении РАР и РВБ
При
изучении
аскПОЛ
наиболее
высокими
кинетическими
показателями обладала ткань миокарда, несколько меньшей скорость
аскПОЛ была в почках (рис 3). В печени этот процесс протекал с достаточно
низкой скоростью, на уровне контроля.
18
При сравнении показателей, характеризующих ПОЛ, с таковыми в
контроле выявлено, что прооксидантный эффект от внутрижелудочного
введения раствора Астраханской рапы проявился в миокарде: скорость
аскПОЛ увеличилась в 3 раза по отношению к контролю, спПОЛ – в 2,4
раза, а исходное МДА – в 2,3 раза. Это позволяет утверждать, что
внутрижелудочное введение рапы соленого озера Малое Лиманское
оказывает тканеспецифические эффекты. В частности, раствор рапы
Астраханского озера и раствор Волгоградского бишофита оказывают
кардиоспецифический прооксидантный эффект. Прооксидантный эффект
наблюдался и при исследовании тканей почек у группы, получавшей раствор
Волгоградского бишофита.
Окислительная модификация белков и нуклеиновых кислот в большей
степени является отражением функционирования внутриклеточных систем
(Вьюшина А.В., 2004). Учитывая большую и очень разнообразную
функциональную нагрузку белков в тканях, их окислительная модификация
может носить в отличие от пероксидации липидов более избирательный и
специфический характер при различных функциональных нагрузках и
патологических состояниях. (Дубинина Е.Е. и соавт., 2000).
1,00
0,90
ΔΔ
0,80
0,70
*
*
*
0,60
0,50
0,40
0,30
0,20
*
*
*
363
370
ΔΔ
0,10
0,00
270
NaCl
РАР
РВБ
Рис. 4. Изменение скорости окислительной модификации белков в миокарде при
внутрижелудочном введении РАР и РВБ
19
Внутрижелудочное введение крысам рассола Астраханской рапы
снижает содержание как начальных, так и конечных продуктов ОМБ в
миокарде почти в 2 раза (рис. 4). У крыс, получавших внутрижелудочно
раствор Волгоградского бишофита, прослеживалась тенденция к снижению
содержания начальных продуктов ОМБ в миокарде. Достоверных изменений
содержания продуктов ОМБ в плазме не обнаружено.
Биологическая функция каталазы состоит в защите биохимических
систем клетки от токсического воздействия перекиси водорода. Активность
каталазы (рис. 5) в гомогенатах почек и сердца достоверно снижалась у
групп, получавших раствор Астраханской рапы и раствор Волгоградского
бишофита. В плазме крови активность каталазы в группах, получавших
внутрижелудочно раствор Астраханской рапы и раствор Волгоградского
мкат/л
бишофита, достоверно увеличивалась.
***
450
400
**
ΔΔ
350
300
250
*** ***
200
*** ***
150
100
50
1
NaCl
2
РАР
3
РВБ
Рис.5. Изменение активности каталазы (1 – почки; 2 – миокард; 3 – плазма крови)
при внутрижелудочном введении РАР и РВБ
Церулоплазмин является белком плазмы крови, выполняющим в
организме ряд важных биологических функций: повышает стабильность
клеточных мембран, участвует в иммунологических реакциях, ионном
обмене,
оказывает
антиоксидантное
действие,
тормозит
перекисное
окисление липидов, стимулирует гемопоэз.
20
ед.опт.пл.
0,6
0,5
***
**
0,4
0,3
0,2
0,1
0
РАР
NaCl
РВБ
Рис.6. Изменение активности церуплазмина в плазме крови
при внутрижелудочном введении РАР и РВБ
Активность
церуплазмина
в
исследуемых
группах
достоверно
возрастает (рис. 6), что связано, возможно, с проявлением антиоксидантных
эффектов.
Голдстэйн и др. ( Goldstain et al., 1979) ранее показали, что
церулоплазмин
утилизирует
супероксид,
а,
следовательно,
служит
антиоксидантом. Антиоксидантная функция церулоплазмина может быть
связана с его способностью связывать ионы меди. Ионы меди являются
хорошо известными катализаторами прооксидантов, а их связывание
церулоплазмином приводит к снижению окисления.
Важнейшим ферментом системы антиоксидантной защиты является
супероксиддисмутаза,
которая
катализирует
превращение
высоко
реакционного аниона радикала кислорода (супероксид анион, О2-.) в
относительно менее активную перекись водорода и молекулярный кислород.
Активность этого фермента в эритроцитах исследуется с целью выяснения
состояния
антиоксидантной
системы
защиты
организма
в
условиях
патологического процесса (Терехина Н. А., 1992; Sjostrom K., 1991; Zima T.,
1996).
21
60
50
***
***
у.ед./мг
40
30
20
10
0
NaCl
РАР
РВБ
Рис.7. Изменение активности СОД в плазме крови при внутрижелудочном
введении РАР и РВБ
Результаты изменения активности супероксиддисмутазы представлены
на рис. 7. Повышение активности СОД рассматривается как фактор,
увеличивающий общую антиоксидантную защиту клетки и препятствующий
развитию патологии (Кумерова А.О., 1996; Zhu C.S., 1994; Карагезян К.Г.,
1989).
Анализ полученных данных показывает, что влияние раствора
Астраханской рапы на свободнорадикальные процессы в организме крыс не
однозначно. Проведенные исследования
выявили изменения показателей
системы ПОЛ, ОМБ и антиоксидантной защиты. Бальнеологическая
реакция проявилась в увеличении продуктов ПОЛ,
таким образом,
организм адаптировался к комплексному воздействию антиоксидантов,
содержащихся в РАР. Возможно, что активация систем перекисного
окисления
липидов
модификации
развивается
структуры
и
как
функции
физиологический
механизм
биологических
мембран,
индуцированная поступлением в организм крыс антиоксидантов в составе
РАР. Вероятно, это связано с присутствием в рапе Астраханского
месторождения гуминовых соединений. Гуминовые вещества накапливают
элементы питания и энергию, участвуют в миграции катионов, снижают
негативное действие токсических веществ (Агапов А.И. и соавт., 1988,
Холопов А.П. и соавт., 2002). Гуминовые вещества обеспечивают активность
рапы в отношении окислительно-восстановительных, кислотно-основных и
22
комплексообразовательных процессов (Холопов А.П. и соавт., 2002,
Авакумова Н.П. и соавт., 1994).
Бальнеологический эффект от введения РАР подтверждается и
снижением показателей ОМБ в миокарде. По мнению ряда ученых
(Дубинина Е.Е. и др., 1993; Mickel H.S. и др.) уровень окисленных белков
можно считать своего рода индикатором тканевого поражения. При
введении РАР уровень ОМБ в миокарде снижался, следовательно,
процессы, запущенные ПОЛ простимулировали обновление клеточной
мембраны, а не разрушение ткани миокарда.
Это подтверждается
достоверно значимой обратной корреляцией между показателями МДА и
ОМБ по количеству конечных продуктов окисления (r = - 0,75 ).
Достоверный
рост
показателей
активности
каталазы,
супероксиддисмутазы и церулоплазмина в плазме крови подтверждает
активацию ферментативного звена антиоксидантной системы крыс.
При изучении антиоксидантной активности РАР целесообразно иметь в
виду не только многообразие механизмов антиоксидантной активности,
входящих в ее состав отдельных биологически активных веществ (гуминовые
кислоты и их соли), но и то, что роль каждого из них может существенно
различаться при различных способах активации свободнорадикальных
процессов, при этом они способны иметь одновременно несколько точек
приложения. Возможно, физиологический механизм, который является
действующим или доминирующим в эффектах, вызванных раствором рапы
соленого озера «Малое Лиманское» Астраханской области, зависит от
условий реакции и определяет выраженность антиоксидантной активности.
Выводы
1. Методами санитарно-микробиологической оценки и в биопробе на
лабораторных животных (мыши) доказана токсикологическая безопасность
рапы Астраханского соленого озера «Малое Лиманское», что согласуется с
данными бальнеологического заключения ФГУ ВМиК Росздрава № 14/98 от
04.03.2008.
23
2. Вес животных, относительная масса эндокринных органов и
уровень гемоглобина
самцов крыс,
получавших внутрижелудочно
физиологически адекватное разведение рапы Астраханского соленого озера
«Малое Лиманское» и Волгоградского бишофита, не отличались от
соответствующих показателей в контроле.
3.
Структура
ориентировочно-исследовательского
поведения
самцов крыс, получавших раствор рапы соленого озера «Малое Лиманское»
Астраханской области изменялась в направлении уменьшения уровня
тревожности.
4.
Внутрижелудочное введение раствора рапы соленого озера
Малое Лиманское не изменяет интенсивность ПОЛ в гомогенатах ткани
печени и почек. Уровень промежуточных продуктов ПОЛ (содержание
ацилгидроперекисей,
кетодиенов,
сопряженных
триенов
и
диеновых
конъюгатов) в липидных экстрактах плазмы крови не изменяется.
5.
Рапа
Астраханского озера «Малое Лиманское» оказывает
кардиоспецифический прооксидантный эффект на уровне ПОЛ, в тоже время
ингибирует процесс окислительной модификации белков в миокарде крыс.
6.
Факт
активации ферментативного звена антиоксидантной
системы подтверждается
увеличением
неспецифическая
ростом показателей каталазы и СОД,
активности церулоплазмина в плазме крови.
каталазная
активность
имеет
а также
Общая
тканеспецифические
особенности: в тканях почек и сердца она снижается, в плазме крови –
повышается.
7. Специфика влияния бишофитсодержащей рапы соленого озера
«Малое Лиманское» Астраханской области заключается в значительном
снижении интенсивности окислительной модификации белков миокарда.
Список научных работ, опубликованных по теме диссертации
1. Мухамедова
Н.А.
Изучение
физико-химических
свойств
и
антиоксидантных эффектов сульфидно-иловой грязи Астраханской
области [Текст] / С.К. Касимова, Е.И. Кондратенко, Н.А. Ломтева, Н.А.
24
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Мухамедова // Актуальные проблемы восстановительной медицины,
курортологии и физиотерапии: М. – 2008. – С. 102.
Мухамедова Н.А. Исследование рапы озера «Малое Лиманское»
Астраханской области [Текст] / Е.И. Кондратенко, Н.А. Мухамедова, С.К.
Касимова, Н.А. Ломтева // Актуальные проблемы восстановительной
медицины, курортологии и физиотерапии: М. – 2008. – С. 106-107.
Мухамедова Н.А. Физиолого-биохимическое обоснование использования
Астраханского озерного бишофита в качестве лечебного и косметического
средства [Текст] / Н.А. Мухамедова // Естественные науки. – 2009. – №
2.– с.16-22. ISSN 1818-507X.
Мухамедова Н.А. Оценка влияния рапы соленого озера «Малое
Лиманское» Астраханской области на динамику показателей крови у
белых крыс [Текст] / Н.А. Мухамедова // Вестник РГМУ. 2009. – № 3. –
С.54.
Мухамедова Н.А. Влияние рапы соленого озера «Малое Лиманское»
Астраханской области на свободнорадикальные процессы у крыс [Текст] /
Н.А. Мухамедова // Сборник материалов XVI Российского национального
конгресса «Человек и лекарство» (6-10 апреля 2009 г., г. Москва). М.: ЗАО
РИЦ «Человек и лекарства», 2009. – С. 704.
Мухамедова Н.А. Исследование биохимических аспектов влияния
бишофитсодержащей рапы Астраханских соленых озер [Текст] / Н.А.
Мухамедова // Фундаментальные исследования в биологии и медицине:
сборник научных трудов – Вып. 6. - Ставрополь: Изд. СевКавГТУ, 2009.
С.-115-122. ISBN 978-5-9296-0431-7.
Мухамедова Н.А. Исследование влияния бишофитсодержащей рапы на
про- и антиоксидантные эффекты у крыс при внутрижелудочном введении
[Текст] / Н.А. Мухамедова // Сборник материалов научно-практической
конференции «Молодежь и наука XXI века» (2009г., г. Красноярск), 2009.
– С.522.
Мухамедова Н.А. Влияние внутрижелудочного введения рассола рапы
соленого озера на интенсивность окислительной модификации белков в
миокарде крыс [Текст] / Н.А. Мухамедова, С.К. Касимова // Сборник
материалов научной конференции с международным участием «Научный
прогресс на рубеже тысячелетий - 2009» (2009г., г. Прага), 2009. – С. 427430.
25