ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ РАСТЕНИЙ Культура растительных клеток и тканей 2002

ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ РАСТЕНИЙ
Культура растительных клеток и тканей
Учебное пособие
2002
2
УДК
ББК
Основы биотехнологии растений. Культура клеток и тканей: Учебное пособие
/ Составители: Сорокина И.К., Старичкова Н.И., Решетникова Т.Б., Гринь Н.А.
Рекомендовано к изданию
УМК биологического факультета СГУ им. Н.Г.Чернышевского;
кафедрой методики преподавания биологии и экологии.
3
СОДЕРЖАНИЕ:
Введение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
Тема 1. Техника культивирования растительного материала на искусственных питательных средах.
Работа 1. Организация биотехнологической лаборатории . . . . . . . . . . .
6
Работа 2. Приготовление питательных сред для культивирования клеток
и тканей in vitro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7
Работа 3. Способы стерилизации в биотехнологии . . . . . . . . . . . . . . . . ..
10
Работа 4. Способы стерилизации растительных эксплантов. . . . . . . . .
11
Работа 5. Техника работы в ламинаре при культивировании стерильных
проростков. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12
Тема 2. Микроклональное размножение растений и получение безвирусного посадочного материала
Работа 1. Вычленение апикальных меристем и регенерация растений. .
14
Работа 2. Пролиферация побегов и микрочеренкование стерильных
проростков. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
Работа 3. Индукция корнеобразования при микроклональном размножении растений. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
Работа 4. Получение микроклубней картофеля in vitro. . . . . . . . . . . . . . .
17
Работа 5. Иммуноферментный анализ. Тестирование растительного
материала на содержание вирусов. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
Работа 6. Получение безвирусного посадочного материала методом
термотерапии в сочетании с культивированием апикальных
меристем. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
19
Работа 7. Получение безвирусного посадочного материала методом
химиотерапии в сочетании с методом апикальных меристем. 20
Тема 3. Дедифференциация и каллусогенез в культуре растительных
клеток и тканей.
Работа 1. Получение каллусов из листьев табака. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.21
Работа 2. Получение каллусов из незрелых зародышей и узлов кущения
пшеницы. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
Работа 3. Получение каллусов из корешков фасоли. . . . . . . . . . . . . . . . .
23
Работа 4. Субкультивирование каллусов. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
24
Тема 4. Суспензионные культуры.
Работа 1. Получение и культивирование суспензии. . . . . . . . . . . . . . . . .
25
Работа 2. Подсчет плотности суспензии. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
26
Работа 3. Определение степени агрегированности и жизнеспособности
суспензии. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
Работа 4. Получение клеточных клонов на агаризованных средах.
Метод плейтинга. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
Тема 5. Гормональная регуляция в культуре клеток и тканей.
Работа 1. Индукция органогенеза и соматического эмбриогенеза в
каллусной ткани табака под действием фитогормонов. . . . . .30
4
Работа 2. Индукция деления клеток и роста клеток растяжением под
действием ауксина и гиббереллина. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
Тема 6. Культура гаплоидных клеток.
Работа 1. Получение каллусов из пыльников вишни и яблони. . . . . . . .
32
Работа 2. Получение растений – регенерантов из пыльцевых каллусов
вишни. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
Терминология. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
36
Приложение. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40
Список литературы. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
5
Введение
Современная биотехнология – это наука и отрасль производства, развивающаяся в трех основных направлениях:
- молекулярная биология и генетическая инженерия;
- микробиология и микробиологическая промышленность;
- культура клеток и тканей in vitro.
Клеточные технологии, основанные на культивировании in vitro органов, тканей, клеток и изолированных протопластов высших растений, могут
облегчить и ускорить традиционный процесс создания новых сортов и видов.
Они предлагают принципиально новые пути, такие как сомаклональная изменчивость, мутагенез на клеточном уровне, клеточная селекция, соматическая гибридизация для создания генетического разнообразия и отбора форм с искомыми признаками. Кроме того, клеточные технологии эффективны в создании
безвирусного материала вегетативно размножаемых растений.
В данном пособии представлены наиболее простые для освоения студентами биологических и сельскохозяйственных специальностей спсобы культивирования растений in vitro : метод апикальной меристемы; получение каллусов, суспензий и растений – регенерантов как на диплоидном, так и гаплоидном
уровне.
По каждой теме предусмотрены: минимум теоретического материала,
методика выполнения работы, перечень необходимого оборудования и реактивов. После каждой темы приводятся контрольные вопросы.
Использование данного пособия не исключает подготовку к занятиям
по другой учебной литературе.
6
Тема 1. ТЕХНИКА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО
МАТЕРИАЛА НА ИСКУССТВЕННЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ
Работа 1. ОРГАНИЗАЦИЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ
Объяснение. Для организации биотехнологической лаборатории необходимы просторные изолированные помещения, а также современное оборудование
и высококачественные реактивы.
Для удобства проведения дезинфекции полы и стены в помещениях должны
иметь кафельное покрытие, а потолок должен быть побелен.
Оборудование моечной комнаты: мойки с горячей и холодной водой; дистиллированная вода; дистилляторы и бидистилляторы; сушильные шкафы с
режимом работы для сушки посуды – до 100-130оС, для инструментов – до
170оС; шкафы для хранения чистой посуды и инструментов, емкости для хранения моющих средств, вытяжные шкафы с эксикаторами для хромпика (H2SO4
98 % + K2CrO7).
Оборудование комнаты для приготовления питательных сред: лабораторные
столы; холодильники для хранения маточных растворов солей, гормонов и витаминов; аналитические и торсионные весы; иономер; магнитные мешалки;
плитки, газовые горелки; набор посуды (колбы, стаканы, мерные цилиндры,
мензурки, пробирки и др.), необходимый набор химических реактивов надлежащей степени чистоты (ХЧ, Ч, ЧДА).
Оборудование помещения для стерилизации: автоклавы с режимом работы –
давление 1-2 атмосферы и температура 120оС; стеллажи для штативов с питательными средами; шкафы для хранения стерильных материалов. Данное помещение должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией и иметь
канализационный слив для отвода конденсата из автоклава.
Оборудование комнаты для инокуляции растительных эксплантов на питательные среды: ламинар-боксы, лабораторные столы, стеллажи, бактерицидные
лампы, шкафы для материалов и оборудования.
Оборудование культуральных комнат: световое отделение – источники
освещения со спектром близким к спектру дневного света (от 3 до 10 kLx), кондиционер для регуляции температуры (25+ - 2оС) и влажности воздуха (70 %),
стеллажи для штативов с культивируемым материалом; темновое отделение – с
тем же оборудованием, исключая источники освещения. Для культивирования
эксплантов на питательной среде желательно использовать термостаты или
хладотермостаты, способные с высокой точностью поддерживать задаваемые
режимы температуры и влажности воздуха.
Необходимый набор посуды, инструментов и материалов в биотехнологической лаборатории: мерные колбы, колбы Эрленмейера, химические стаканы,
мерные цилиндры, чашки Петри, пробирки, бутылки, пипетки, стеклянные палочки, стеклянные и мембранные фильтры, ланцеты (в том числе глазные, хирургические, анатомические), ножницы, пинцеты, ножи, бритвенные лезвия,
препарировальные иглы, шпатели, бумага (оберточная, пергаментная, фильтровальная), фольга алюминиевая, вата, марля, шпагат.
7
Материалы и оборудование. Химические стаканы (50, 100, 250 мл), штативы
с пробирками, инструменты (пинцеты, скальпели, препарировальные иглы),
моющие средства (стиральный порошок), хромпик.
Ход работы.
1. Ознакомиться с устройством биотехнологической лаборатории.
2. Под руководством преподавателя освоить принципы работы автоклава,
сушильных шкафов, дистиллятора.
3. Посуду тщательно отмыть в растворах детергентов (стиральный порошок), промыть 8-10 раз проточной водой, поместить на 4-6 часов в хромпик
(смесь серной кислоты с бихроматом калия), промыть теплой водой, затем дважды дистиллированной и бидистиллированной.
4. Чистую посуду поместить в сушильный шкаф на 2 часа при температуре
100-130оС.
5. Сухую посуду для хранения закрыть ватными пробками, фольгой, целлофаном.
Работа 2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ
КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ IN VITRO
Объяснение. Компоненты среды для выращивания растительных клеток и
тканей можно разделить на 6 основных групп, что обычно отражает порядок
приготовления концентрированных маточных растворов: макроэлементы, микроэлементы, источники железа, витамины, источники углерода, фитогормоны.
Основой для всех питательных сред для культивирования растительных
эксплантов является смесь минеральных солей. Это соединения азота в виде
нитратов, нитритов, солей аммония; фосфора – в виде фосфатов; серы – в виде
сульфатов; а также растворимых солей К+, Na+, Са++, Мg++. Железо используется в виде хелатов [FeО4 или Fe2O4 + ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или её натриевая соль Na ЭДТА (трилон Б)] – наиболее доступной форме
для усвоения растительными тканями.
Азот, фосфор, сера входят в состав органических соединений: белков, жиров, нуклеиновых кислот. Железо, цинк, марганец, молибден, кобальт в сочетании с порфиринами образуют макромолекулы пигментов фотосинтеза (хлорофилла), окислительно-восстановительных ферментов (каталазы, пероксидазы,
полифенолоксидазы). Следовательно, все эти соединения выполняют в клетках
и тканях структурную функцию. В то же время ионы К +, Na+, Са++, Cl –, Н +
необходимы для регуляции pH среды и поддержания физиологических градиентов клеток (тургора, осмотического давления, полярности).
В качестве источника углерода для биологических макромолекул, а также
при культивировании гетеротрофных тканей (каллусов и суспензий) в питательные среды добавляют углеводы в концентрации 20-60 г/л. Обычно это дисахариды (сахароза), моносахариды (гексозы: глюкоза и фруктоза, пентозы:
ксилоза и другие). Полисахариды в питательных средах практически не исполь-
8
зуются. Только некоторые типы тканей (опухолевые), содержащие гидролитические ферменты, выращивают на средах с крахмалом, рафинозой, целлобиозой.
Для стимуляции биохимических реакций в клетке используют биологические катализаторы – витамины группы В (В1, В6, В12), С (аскорбиновую кислоту), РР (никотиновую кислоту), мезоинозит.
Тиамин (В1) входит в состав пируватдекарбоксилазы, участвует в превращениях углеводов. Тиаминпирофосфат входит в состав ферментов окислительного декарбоксилирования кетокислот (пировиноградной и кетоглутаровой),
является коферментом транскетолазы.
Пиридоксин (В6) в виде фосфорнркислого эфира входит в состав ферментов
декарбоксилирования и переаминирования аминокислот.
Никотиновая кислота (РР) в виде амида входит в состав дегидрогеназ НАД
и НАДФ, катализирующих донорно-акцепторную цепь Н+ (отнятие Н+ от молекул органических веществ).
Для управления процессами формообразования в культуре тканей необходимы биологические регуляторы роста и развития – фитогормоны. Эти вещества влияют на дифференциацию и дедифференциацию клеток и тканей, инициируют гистогенез, индуцируют деление и растяжение клеток, участвуют в
процессах старения и созревания, либо стимулируют, либо ингибируют рост и
развитие клеточных культур, обуславливают формирование пола. В биотехнологических исследованиях чаще используют гормоны, стимулирующие рост и
развитие: ауксины, цитокинины, гиббереллины.
Ауксины: ИУК – -индолил-3-уксусная кислота, ИМК – индолил-3-масляная кислота, НУК – -нафтилуксусная кислота, 2,4-Д – 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота.
Цитокинины: кинетин – 6-фурфуриламинопурин, зеатин, NN-дифенилмочевина, 6-БАП – 6-бензиламинопурин.
Гиббереллины: гиберрелловая кислота.
В качестве биологических добавок для индукции первичного каллуса можно использовать растительные экстракты (10-15 % от общего объёма среды):
кокосовое молоко (жидкий эндосперм кокосового ореха), вытяжки из незрелых
зерновок кукурузы (лучше в период молочной спелости), которые содержат цитокинины – кинетин и зеатин (6-ти замещенные аминопурины) и NNдифенилмочевину.
В культуре in vitro применяют жидкие и агаризованные (твердые) среды.
Жидкие среды используются для культивирования суспензий, каллусов, изолированных органов и тканей, растений-регенерантов. При этом для поддержания
эксплантов в пробирки со средой помещают специальные мостики-поддержки
из фильтровальной бумаги или синтетических пористых материалов.
Агаризованные среды готовят на основе агар-агара – полисахарида, входящего в состав морских водорослей, который образует с водой гель при pH 5,66,0. иногда в качестве уплотнителя и заменителя агар-агара используют полиакриламидные гели (биогели) P10 и P200.
9
Для искусственных питательных сред растворы макро- и микросолей готовят заранее и используют многократно. Это маточные (концентрированные)
растворы. Их хранят в специальных условиях: макро- и микросоли в холодильнике в сосудах с притертыми пробками при 0…+4оС; витамины, фитогормоны,
ферменты, растительные экстракты – при -20оС в небольших по 5-10 мл сосудах с пробками (пеницилловые флаконы).
Маточные растворы макросолей обычно превосходят рабочие по концентрации в 10-40 раз, микросолей – в 100-1000 раз, витаминов – в 1000 раз.
Растворы фитогормонов желательно готовить непосредственно перед работой со средами.
Для приготовления маточного раствора макро- и микросолей каждую соль
растворяют в отдельном стаканчике при нагревании, затем сливают и доводят
до нужного объема. В охлажденную смесь микросолей последним добавляют
раствор солей молибдена, а в макросоли – раствор солей магния (для предотвращения выпадения осадка).
Маточные растворы хлористого кальция и хелата железа (сернокислое железо + ЭДТА, либо Na ЭДТА – трилон Б) готовят и хранят отдельно от других
солей.
Концентрированные растворы витаминов готовят следующим образом: 10кратные навески растворяют в 10 мл дистиллированной воды каждый отдельно.
Фитогормоны – это вещества, которые плохо растворяются в воде. Поэтому
предварительно 100 мг вещества растворяют в небольших количествах (0,5-2,0
мл) спирта (ауксины, гиббереллины), 0,5-1 н HCl или КОН (цитокинины), затем
подогревают до полного растворения (кроме абсцизовой кислоты и кинетина) и
доводят до 100 мл объема (1 мл содержит 1 мг вещества).
Материалы и оборудование. Химические стаканы, колбы, мерные цилиндры
от 5 мл до 2 л, пробирки, пипетки от 0,01 мл до 10 мл или дозаторы, весы аналитические до 500 г, весы торсионные до 100 мг, пинцеты, ножницы, шпатели,
электроплитки, магнитные мешалки, химические реактивы или готовые маточные растворы макро- и микросолей, витаминов, фитогормонов.
Ход работы.
1. В химический стакан емкостью 2 л поместить 20 г сахарозы, долить дистиллированной водой до 400 мл и растворить.
2. Добавить к раствору сахарозы 50 мл маточного раствора макросолей, 1
мл микросолей, 5 мл хелата железа, 5 мл хлористого кальция.
3. Приготовить агар: навеску 7 г поместить в стакан и залить водой до 200
мл, растворить, нагревая плитке или газовой горелке, при постоянном помешивании. Готовый агар долить к раствору солей.
4. Питательную среду довести до нужного объема (1 л) дистиллированной
водой. Измерить pH среды: если pH превышает 5,5-6,0 добавить несколько капель 0,1 н HCl, если ниже этого значения – 0,1 н КОН.
5. Готовую питательную среду разлить в пробирки на 1/3 объема, закрыть
пробирки ватными пробками, поместить пробирки в металлические штативы.
10
6. Штативы с пробирками завернуть в целлофановую бумагу (чтобы в автоклаве не открылись пробки).
7. Поместить штативы с пробирками в автоклав и проавтоклавировать.
Работа 3. СПОСОБЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ В БИОТЕХНОЛОГИИ
Объяснение. Все работы с культурой клеток и тканей in vitro проводят в
стерильных (асептических) условиях в стерильном боксе или ламинар-боксе,
стерильными инструментами, в стерильной посуде, на стерильных питательных
средах. В случае нарушения стерильности на средах хорошо развиваются микроорганизмы (грибы, бактерии), нарушающие состав среды и подавляющие
рост растительных эксплантов.
Чаще всего для стерилизации помещений (боксов для пересадки тканей,
культуральных комнат) используют ультрафиолетовое облучение в течение 0,52 часов (в зависимости от площади помещения). Работы в облученном помещении начинают через 15-20 минут после отключения бактерицидных ламп, так
как под действием ультрафиолетового излучения двухатомный кислород воздуха становится трехатомным озоном – газом, токсичным для человека. Для
достижения максимальной стерильности перед обработкой УФ все поверхности
тщательно отмываются моющими средствами, водой и растворами хлорсодержащих веществ, поверхности ламинар-бокса обрабатывают 96 % спиртом.
Посуду, халаты, вату, бумагу, дистиллированную воду, питательные среды
стерилизуют в автоклавах под давлением пара 1-2 атмосферы и температурой
120оС в течении 20-60 мин, в зависимости от объёма стерилизуемого материала.
Колбы, штативы со средой, вату, бумагу, халаты перед автоклавированием
заворачивают в целлофановую бумагу, либо помещают в биксы.
Металлические инструменты автоклавировать нельзя, так как под действием пара образуется ржавчина. Поэтому их стерилизуют сухим жаром в термостатах с температурой 170-250оС в течении 1-2 часов.
Материалы и оборудование. Чашки Петри, колбы с дистиллированной водой, штативы с пробирками, заполненными питательной средой, препарировальные иглы, пинцеты, скальпели, вата, марля, бумага: фильтровальная и целлофановая.
Ход работы.
1. Металлические инструменты завернуть в плотную бумагу и поместить в
сушильный шкаф для стерилизации сухим жаром при to 170-200oС в течение 2
часов.
2. Чашки Петри, штативы с пробирками, заполненными питательной средой, вату, марлю, фильтровальную бумагу, колбы с дистиллированной водой
(закрытые фольгой) завернуть в целлофановую бумагу и поместить в автоклав.
3. Автоклав привести в рабочее состояние: закрыть плотно крышку, воду
залить до метки. Включить автоклав, давление пара довести до метки 1,2 атм. (в
паровой камере), заполнить паром стерилизационную камеру, вытеснить кон-
11
денсат в течении 10 минут, при этом давление пара в стерилизационной камере
должно быть на уровне 0,1-0,2 атм. Довести давление в стерилизационной камере до 1 атм., включить автоматический режим.
4. Автоклавировать 20 минут при давлении в стерилизационной камере 11,2 атм.
5. Отключить автоклав, вытеснить пар из обеих камер довести давление до
0 атм.
6. Проавтоклавированные материалы перенести в комнату для пересадки
тканей и поместить в шкафы или на стеллажи.
Работа 4. СПОСОБЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ ЭКСПЛАНТОВ
Объяснение. С целью получения эксплантов для каллусной и опухолевой
культур, микроклонального размножения, изучения гормональной регуляции
используют стерильные проростки. Семена для проращивания высевают либо
на воду, либо на питательную среду.
Растительные объекты перед стерилизацией тщательно отмывают проточной водой, иногда с моющими средствами, очищают от излишних тканей. С
корнеплодов и корней снимают кожуру, с побегов – кору, с почек – кроющие
чешуи.
Растительные экспланты стерилизуют растворами веществ, содержащими
активный хлор (хлорамином, гипохлоритом Са и Nа, сулемой), бром (бромной
водой), перекисью водорода, спиртом, нитратом серебра, диацидом, антибиотиками.
Этиловый спирт часто применяют для предварительной стерилизации, протирая им поверхность материала или погружая материал на несколько секунд в
абсолютный спирт. Иногда такой стерилизации достаточно, ее используют при
работе с плодами, семенами, побегами, завязями.
Гипохлорит кальция (хлорная известь) используется в виде 5-7 % раствора
для обработки почек, завязей, цветков, семян, побегов в течение 5-8 минут.
Гипохлорит натрия используется в виде 0,5-5 % раствора для обработки
любых эксплантов в течение 1-20 минут. Это вещество является клеточным
ядом, поэтому время стерилизации и концентрацию подбирают экспериментально. Например: для изолированных зародышей используют 2-3 % раствор в
течение 10-15 минут, а для сухих семян 3-5 % раствор в течение 1 часа. Остатки
гипохлорита натрия сначала удаляют 0,01 н HCl, а затем 8 раз промывают автоклавированной дистиллированной водой.
Хлорамин применяют в концентрации 1-6 %. Пыльники и молодые зародыши обрабатывают в течение 1-3 минут, сухие семена – 30-60 минут, затем промывают стерильной дистиллированной водой 2-3 раза.
Сулема – токсичное вещество и требует особой тщательности, как при хранении, так и при подборе концентрации для отдельных объектов. Для стерилизации зародышей используют 0,1 % раствор в течение 1-3 минут, для корне- и
клубнеплодов – до 10-20 минут.
12
Растворы, содержащие активный хлор используются 1 раз и готовят их
непосредственно перед работой.
Диацид используется в 0,2 % растворе для стерилизации корнеплодов, семян, кусочков, тканей, верхушечных меристем, изолированных зародышей,
пыльников. Диацид готовят, растворяя отдельно 330 мг этанолмеркурхлорида и
660 мг цетилпиридиния хлорида в горячей воде (330 мл), затем их смешивают и
доводят объем жидкости до 1 л, добавляют несколько капель детергента твин80; хранят в плотно закрытой колбе в темноте.
Антибиотики применяют для стерилизации растительного материала, инфицированного бактериями (ткани корончатогалловых опухолей). Наиболее часто применяют стрептомицин и тетрамицин 10-80 мг/л, ампициллин 200-400
мг/л, левомицитин, каномицин и другие.
Материалы и оборудование. Стерильные чашки Петри, колбы с автоклавированной дистиллированной водой, флаконы со стерилизующими растворами,
зерновки пшеницы и тритикале, ламинар-бокс, флакон с 96 % спиртом, вата,
спиртовка, пинцеты, фильтровальная бумага.
Ход работы.
1. Отобрать 30 здоровых зерновок пшеницы или тритикале.
2. В ламинар-боксе поместить семена в чашки Петри со стерилизующими
растворами по 5 семян в каждую (6 % хлорамин, 6 % гипохлорит кальция, 96 %
спирт, сулема 0,1 %, ампициллин 400 мг/л, вода). Время стерилизации подобрать экспериментально.
3. Отмыть семена от стерилизующих растворов дистиллированной автоклавированной водой.
4. Поместить семена для проращивания в стерильные чашки Петри на стерильную фильтровальную бумагу в небольшое количество стерильной дистиллированной воды. Чашки Петри закрыть и перенести в термостат для проращивания.
5. Результаты опыта зарисовать через неделю. Сделать выводы об эффективности стерилизующих растворов.
Работа 5. ТЕХНИКА РАБОТЫ В ЛАМИНАРЕ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ
СТЕРИЛЬНЫХ ПРОРОСТКОВ.
Объяснение. Для культивирования стерильных проростков необходимо использовать ламинар-боксы, обеспечивающие посадку эксплантов на питательную среду без заражения микроорганизмами.
Все поверхности ламинара обрабатываются 96 % спиртом, простерилизованные инструменты, материалы, растительный материал помещают на стол
ламинара и включают УФ-излучение. Через 20 минут выключают УФ и включают биофильтры. Для работы в ламинар-боксе надевают стерильный халат и
шапочку, руки обрабатываю 96 % спиртом. Пинцеты, скальпели и препариро-
13
вальные иглы помещают в стакан с 96 % спиртом. Перед каждой манипуляцией
инструменты обжигают на пламени спиртовки.
Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, пробирки с питательными средами, стерильные препарировальные иглы, пинцеты, скальпели, флакон с 96 %
спиртом, спиртовка, вата, 6 % раствор хлорамина, колбы с автоклавированной
дистиллированной водой, чашки Петри, зерновки пшеницы.
Ход работы.
1. Отобрать 10 здоровых зерновок пшеницы, поместить в 6 % раствор хлорамина на 5 минут, промыть стерильной дистиллированной водой.
2. Зерновку поместить на стол ламинара бороздкой вниз.
3. Одной препарировальной иглой придерживать зерновку, другой – надрезать оболочку вокруг зародыша.
4. Боковой частью иглы надавить на зародыш (на границе с эндоспермом) и
вычленить его из зерновки.
5. Зародыш поместить в чашку Петри со стерильной дистиллированной водой.
6. Взять из штатива пробирку с питательной средой, обжечь горлышко над
спиртовкой, снять пробку. Пробирку держать открытой частью от себя.
7. Препарировальной иглой перенести зародыш на поверхность питательной среды щитком вниз (не заглублять).
8. Пробирку и горлышко пробирки обжечь на пламени спиртовки, пробирку
закрыть.
9. Пробирки с зародышами поставить в штатив и перенести на стеллаж в
культуральную комнату.
10. Проростки пшеницы зарисовать через 1-2 недели. Оценить качество посадки.
Контрольные вопросы к теме 1.
1. Как устроена биотехнологическая лаборатория?
2. Как простерилизовать питательные среды, посуду, дистиллированную
воду, инструменты, помещение лаборатории?
3. Какие стерилизующие растворы используются для растительных эксплантов?
4. Какие вещества входят в состав питательных сред, и какую функцию они
выполняют в культуре клеток и тканей in vitro?
5. Как получают стерильные проростки и для чего их используют?
14
Тема 2. МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ РАСТЕНИЙ И
ПОЛУЧЕНИЕ БЕЗВИРУСНОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА.
Работа 1. ВЫЧЛЕНЕНИЕ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ И РЕГЕНЕРАЦИЯ
РАСТЕНИЙ.
Объяснение. В культуре тканей можно размножать растения и получать
оздоровленный (безвирусный) посадочный материал. Для оздоровления растений используют культуру апексов или культуру апикальных меристем, так как
в стеблевой апекс вирусы проникают медленнее, чем в другие части растений.
При культивировании апексов размножение вирусов подавляется реакцией растительного организма на травму, вызванную отсечением верхушки. Обычно на
питательные среды высаживают небольшую часть меристемы до 0,5 мм.
В целом закономерность такова: чем меньше величина меристемы, тем
больше вероятность получения безвирусных растений.
Биотехнология позволяет получать безвирусный оздоровленный посадочный материал практически всех сельскохозяйственных культур. Наиболее полно разработана технология получения безвирусного картофеля. Система первичного семеноводства и оздоровления посадочного материала картофеля
включает следующие этапы: подготовка клубней для вычленения апикальных
меристем, вычленение апикальных меристем, регенерация растений из меристем, адаптация растений-регенерантов в защищенном грунте, получение первой продукции безвирусного материала в открытом грунте, выращивание безвирусного посадочного материала в первичных звеньях семеноводства, сохранение коллекции сортов.
В культуре тканей используются апексы верхушечных и боковых почек.
Чтобы исключить влияние метаболитов клубня на проростки и повысить регенерационную способность исходного материала из средней части клубня вырезают глазки с частью паренхимы (1,5  1,5 см). Глазки проращивают на песке,
предварительно обработанном сухим жаром. Этиолированные проростки выращивают в темноте при температуре 25 + 2оС, влажности воздуха 70-80 %. Песок дважды в день увлажняют, через 7-10 дней проводят подкормку раствором
Кнопа.
Апикальные меристемы проростков изолируют на 12-13 пластохроне*. Изолированные меристемы культивируют в асептических условиях на питательных
средах с богатым содержанием макро- и микросолей, с повышенной концентрацией цитокининов (6-БАП 2 мг/л). В культуральной комнате с кондиционированным воздухом поддерживают температуру 25 + 2оС, влажность воздуха 70
%, освещенность 5 кLx и фотопериод 16 часов.
* Пластохрон – промежуток времени между инициациями двух листовых
бугорков.
В среднем от посадки меристемы на среду до формирования проростков с 56 листочками проходит 30-45 дней, в некоторых случаях от 2 до 8 месяцев.
Среды по мере истощения обновляют, и проростки периодически пересаживают на новые среды в стерильных условиях.
15
Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, бинокулярный микроскоп МБС9 или МБС-10, флаконы со стерилизующими растворами, (0,2 % диацид или 70
% спирт), чашки Петри, стерильная дистиллированная вода, стерильные инструменты: пинцеты, препарировальные иглы, скальпели, спиртовка, пробирки
со средой.
Ход работы.
1. Поверхность ламинара, штативы, пробирки, микроскоп обработать ультрафиолетом и 96 % спиртом. Руки протереть спиртом. Препарировальные иглы, пинцеты, скальпели поместить в 96 % спирт и перед каждой манипуляцией
обжигать на пламени спиртовки.
2. Проростки (2 см) отделить от клубней и поместить в чашки Петри со стерилизующими растворами: в диацид на 3-5 минут, в спирт на 1-2 минуты.
3. Проростки промыть 3 раза стерильной дистиллированной водой и перенести в стерильные чашки Петри.
4. Тонкой препарировальной иглой у проростков удалить все листья, последовательно обнажая верхушечные и боковые меристемы с примордиями.
5. Меристему с 1-2 примордиями отделить от проростков, при этом величина экспланта должна быть не более 100-250 мкм.
6. Экспланты перенести в пробирку на поверхность питательной среды.
7. Пробирки закрыть пробками, поместить в штатив и перенести в культуральную комнату.
8. Результаты зарисовать через 2-4 недели, сделать выводы.
Работа 2. ПРОЛИФЕРАЦИЯ ПОБЕГОВ И МИКРОЧЕРЕНКОВАНИЕ
СТЕРИЛЬНЫХ ПРОРОСТКОВ.
Объяснение. Микроклональное размножение пробирочных растений осуществляют с помощью черенкования. Такое размножение основано на подавлении апикального доминирования и активации пазушных меристем при удалении верхушки побега. Из пазушных почек на питательных средах образуются
побеги. Растения, сформировавшие 5-6 листочков, в стерильных условиях извлекают из пробирок и разрезают на части (отрезок стебля с листом и пазушной
почкой). Черенки высаживают на глубину междоузлия в питательные среды
либо без гормонов, либо с добавлением ауксинов.
Черенки культивируют в тех же условиях, что и меристемы: при температуре 24-25оС днем и 19-20оС ночью, освещенности 5-6 кLx и продолжительности
фотопериода 16 часов.
Рост стебля и корней начинается на 3-4 день после посадки на питательную
среду, а полностью растения формируются через 12-15 дней.
Каждое последующее черенкование проводят через 14-20 дней. Из одного
растения можно получить 5-8 черенков, а через 2-3 месяца – 3-5 тыс. черенков.
16
Нижнюю часть растения используют для ИФА. Растения, зараженные вирусами, бракуют, а здоровые дают начало мериклонам (меристематическим клонам).
Если почки или черенки высадить на питательные среды с высоким содержанием цитокининов, то образуется конгломерат почек и побегов. Полученные
побеги легко отделяются друг от друга, их можно либо укоренить, либо использовать для дальнейшего микрочеренкования.
Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, пробирки с проростками, пробирки с питательной средой, скальпели, препарировальные иглы, спиртовка,
флакон с 96 % спиртом.
Ход работы.
1. Подготовить ламинар-бокс и инструменты к работе.
2. В ламинаре извлечь стерильные проростки из пробирок.
3. Побеги разделить на микрочеренки (междоузлие с почкой) и посадить в
питательную среду на глубину междоузлия.
4. Пробирку закрыть пробкой, поместить в штатив и перенести в культуральную комнату.
5. Результаты зарисовать через 2-4 недели. Сделать выводы о степени пролиферации почек различных сельскохозяйственных культур.
Работа 3. ИНДУКЦИЯ КОРНЕОБРАЗОВАНИЯ ПРИ
МИКРОКЛОНАЛЬНОМ РАЗМНОЖЕНИИ РАСТЕНИЙ.
Объяснение. Для укоренения растений, образовавшихся при микрочеренковании, их необходимо пересадить на новую питательную среду. Черенки и побеги легко укореняются на средах с обедненным составом минеральных солей
(среда Уайта, Мурасиге-Скуга, разбавленная вдвое), либо на средах с добавлением ауксинов: ИУК, НУК, ИМК.
Проростки, сформировавшиеся в пробирках со средами, можно рассматривать как небольшие укорененные растения, которые необходимо адаптировать
к обычным условиям выращивания. Такие растения лучше пересаживать в
грунт, когда полностью сформируются 5-6 листьев и достаточно разрастутся
корни. Однако, разные виды культурных растений по-разному приспосабливаются к изменению условий среды. Каждое растение требует специально подобранных условий культивирования в грунте, которые устанавливают экспериментально.
Материалы и оборудование. Пробирки с проростками, пробирки с питательными средами для индукции корнеобразования: без гормонов и с добавлением ИУК, стерильные инструменты, ламинар-бокс, спиртовки, флакон с 96 %
спиртом, вата, стерильные чашки Петри.
Ход работы.
17
1. В стерильных условиях проростки извлечь из пробирок и стерильным
пинцетом перенести в пробирки с питательными средами для укоренения.
2. Пробирки с пересаженными растениями поставить в штативы и перенести в культуральную комнату с освещением 5 кLx, температурой 25 + 2оС и
влажностью воздуха 70 %.
3. Результаты укоренения оценить через 1-4 недели, сделать рисунки.
4. Укоренившиеся растения перенести в ящики или вегетационные сосуды с
торфом и песком (3:1).
Работа 4. ПОЛУЧЕНИЕ МИКРОКЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ IN VITRO
Объяснение. В практике биотехнологии на искусственных питательных
средах с определенным набором биологических регуляторов можно вызвать
пролиферацию почек и побегов, укоренить их, а также индуцировать образование микроклубней. Для этого обычно используют среды с высоким содержанием минеральных солей (Мурасиге-Скуга), углеводов (сахарозы до 8 % от объема среды), цитокининов, абсцизовой кислоты, хлорхолинхлорида.
В течение первых10-12 суток после черенкования растения выращивают на
обычном фотопериоде (16-17 часовой) с интенсивностью освещения 3-5 кLx,
при температуре 25оС днем и 19-20оС ночью. Последующее культивирование
проводят на 12 часовом фотопериоде при той же степени освещенности и температуре. В некоторых случаях, после выращивания в условиях длинного дня
пробирки переносят в холодильник с температурой 10оС. образование микроклубней происходит через 1-1,5 месяца.
Микроклубни хранят в холодильнике при температуре +2 +5 оС и влажности
воздуха до 95 %. Их закладывают в стерильные пробирки без среды по 10 штук
в каждую и закрывают пробками (срок хранения до 6 месяцев). Таким образом,
создаются условия, соответствующие периоду покоя картофеля, что способствует лучшей всхожести и жизнеспособности растений.
Весь период от микрочеренкования до получения микроклубней составляет
60-65 дней.
Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, пробирки с питательной средой
для получения микроклубней, пробирки со стерильными проростками, имеющими 5-6 сформированных листьев, флаконы с 96 % спиртом для стерилизации
инструментов, скальпели, пинцеты, препарировальные иглы, спиртовка, вата,
стерильные чашки Петри.
Ход работы.
1. В стерильных условиях, стерильными инструментами извлечь проростки
с хорошо сформированными корнями из пробирок и перенести на питательные
среды для индукции клубнеобразования.
2. Пробирки с пересаженными в них растениями закрыть и перенести в
культуральную комнату.
18
3. Провести наблюдение процесса клубнеобразования через 4-6-8 недель
культивирования.
4. Результаты зарисовать, сделать выводы на основании теории гормональной регуляции.
5. Заложить микроклубни на хранение.
Работа 5. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ. ТЕСТИРОВАНИЕ
РАСТИТЕЛЬНОГО МАТЕРИАЛА НА СОДЕРЖАНИЕ ВИРУСОВ
Объяснение. Принцип метода ИФА заключается в следующем: к одному из
компонентов антиген-антитело присоединяют фермент, другой компонент сорбируют на твердой фазе. Затем проводят реакцию нейтрализации, добавляют
субстрат и определяют активность комплекса. Активность фермента, то есть
количество образовавшихся комплексов антиген-антитело пропорционально
содержанию вирусов.
Для анализа используют полистероловые плата, в лунки которых добавляют
сыворотку и антитела, полученные на основе тестируемых вирусов из крови
млекопитающих.
Антитела адсорбируются на поверхности ячеек плата в течение 6 часов.
Остатки сыворотки удаляют специальным буфером. Затем в лунки вносят исследуемые вытяжки растений (сок листьев, клубней). При наличии вирусного
заражения образуется комплекс вирус-антитело. Обязательно готовят контрольные плата (без заражения). После промывания буфером в ячейки добавляют антитела в комплексе с ферментами: фосфотазой и пероксидазой. В присутствии вируса на поверхности плата образуется комплекс антиген-антителофермент. Если материал стерилен, комплексы не образуются, а остатки фермента отмываются буфером. После всех описанных выше манипуляций в лунки
плата добавляют субстрат, на котором работает фермент (для фосфотазы необходимы эритроциты крови, которые разрушаются в ее присутствии).
В результате реакции между ферментом и субстратом окраски растворов в
лунках плата изменяются в зависимости от степени заражения вирусом: нет
окраски – «-» – вирус отсутствует, светло-коричневая окраска – «+» – среднее
заражение вирусом, ярко-коричневая окраска –«++» – высокая степень заражения вирусом.
Для успешного тестирования вирусов необходимо создать стандартные
условия, использовать высококачественные антитела, ферменты, плата.
Материалы и оборудование. Полистероловые плата, растительные вытяжки,
гомогенизатор, сыворотки, растворы ферментов, кровь млекопитающих, буферный раствор, центрифуга, растительный материал.
Ход работы.
1. Растительный материал гомогенизируют и центрифугируют.
2. Заполнить сывороткой полистероловые плата и оставить для инкубации
на 6 часов.
19
3. Промыть плата буфером.
4. Внести в лунки плата центрифугат и оставить для инкубации на 1 час.
5. Промыть плата буфером.
6. Заполнить плата сывороткой с ферментом и оставить на 1 час.
7. Промыть плата буфером.
8. Внести в лунки субстрат для фермента.
9. Протестировать изменение окраски в лунках плата по шкале.
10. Отобрать образцы без вирусов, со слабой степенью заражения и с сильным заражением вирусом.
11. Результаты тестирования зарисовать, сделать выводы о качестве посадочного материала.
Работа 6. ПОЛУЧЕНИЕ БЕЗВИРУСНОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА
МЕТОДОМ ТЕРМОТЕРАПИИ В СОЧЕТАНИИ С КУЛЬТИВИРОВАНИЕМ
АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ
Объяснение. В случае заражения посадочного материала вирусами применяют термотерапию. Предварительно клубни без бактериальных и грибковых
инфекций тестируют ИФА. Затем их размещают в кюветах со стерильным песком и проращивают 1-2 недели при температуре 28-30оС, 4 недели при температуре 37-38оС и влажности воздуха 70-80 %. Дважды в день песок увлажняют,
через 7-10 дней проводят подкормку раствором Кнопа и микроэлементов по
прописи Мурасиге-Скуга: 5 мл маточного раствора на 1 л раствора Кнопа.
Клубни жаровыносливых сортов можно сразу выращивать при температуре 3738оС и влажности воздуха 70 %.
Режим тепловой обработки для каждого сорта подбирают экспериментально.
В случаях заражения растений мозаичными, веретеновидными, нитевидными, палочковидными вирусами термическая обработка малоэффективна. Поэтому дополнительно используют биотехнологические методы: метод апикальных меристем. Для этого перед термообработкой верхушки растений картофеля
срезают и помещают на 5 часов в раствор гетероауксина (50 мг/л). Укорененные проростки помещают в культуральные камеры или комнату с температурой
воздуха 37оС, почвы – 30-32оС, с фотопериодом 16 часов на 4-6 недель.
Термообработку обычно проводят осенью и зимой. Весной из растений вычленяют пазушные почки от 0,3 до 1 мм и высаживают на питательные среды
(МС без гормонов, pH 5,7).
Материалы и оборудование. Клубни картофеля, кюветы с песком, флаконы
с водой, кюветы с проращенными и прошедшими термотерапию растениями,
ламинар-бокс, бинокулярный микроскоп МБС-9 или МБС-10, стерильные
20
скальпели, препарировальные иглы, флаконы с 96 % спиртом, хлорамином,
спиртовки, пробирки с питательными средами.
Ход работы.
1. Здоровые клубни картофеля тщательно промыть проточной водой.
2. Клубни обработать стерилизующим раствором (спирт, хлорамин), промыть проавтоклавированной водой.
3. Вырезать глазки с частью паренхимы (1,5  1,5 см) и поместить в кюветы
для проращивания и термотерапии.
4. Проростки, прошедшие термотерапию, поместить в 6 % раствор хлорамина на 5 минут, промыть стерильной дистиллированной водой.
5. В ламинар-боксе под микроскопом вычленить апикальные меристемы и
поместить их в пробирки с питательными средами.
6. Весь растительный материал перенести в культуральную комнату.
7. Результаты зарисовать через 2-4-6-8 недель.
Работа 7. ПОЛУЧЕНИЕ БЕЗВИРУСНОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА
МЕТОДОМ ХИМИОТЕРАПИИ В СОЧЕТАНИИ С МЕТОДОМ
АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ.
Объяснение. Для химиотерапии используют специальные веществаингибиторы вирусов: ферменты, влияющие на нуклеиновые кислоты (РНКазы). Непосредственную обработку клубней ферментом можно проводить методом инфильтрации в вакуумной камере в течение 20 минут, что приводит к
большому расходу вещества. Поэтому эффективнее добавлять РНК-азы в питательные среды для культивирования апексов.
РНК-аза стимулирует рост и развитие растений из апексов и ингибирует
развитие вирусов. В результате применения такой технологии выращивания на
10-35 % повышается приживаемость меристем на питательных средах, на 30-40
% больше образуется растений-регенерантов.
Материалы и оборудование. Пробирки с питательными средами, ламинарбокс, фильтры Зейтца, стерильная бидистиллированная вода, флаконы с 96 %
спиртом, спиртовки, микроскопы МБС-9 или МБС-10, стерильные инструменты (скальпели, препарировальные иглы, пинцеты), раствор РНК-азы (0,01 н),
химическая посуда (колбы на 50-100 мл, стаканы на 50-100 мл, мерные цилиндры), проростки картофеля.
Ход работы.
1. Раствор РНК-азы профильтровать через фильтр Зейтца, добавить в 100 мл
среды Мурасиге-Скуга и разлить в пробирки с застывшей стерильной средой до
0,5 см.
2. Простерилизовать проростки картофеля в 6 % хлорамине 5 минут.
3. Проростки промыть стерильной дистиллированной водой и поместить в
стерильные чашки Петри.
21
4. В условиях ламинар-бокса под микроскопом вычленить апикальные меристемы и поместить на среды без фермента (контроль) и с ферментом (опыт).
5. Пробирки с меристемами перенести в культуральную комнату.
6. Результаты зарисовать через 2-4-6 недель, сделать выводы.
Контрольные вопросы к теме 2.
1. Что такое микроклональное размножение растений: основные этапы?
2. Каковы основные способы микроклонального размножения?
3. Как получить безвирусный посадочный материал?
4. Какой из способов получения безвирусного посадочного материала Вы
бы предпочли в своей работе?
5. Чем отличаются питательные среды для пролиферации побегов, индукции корнеобразования, культивирования меристем, получения микроклубней?
6. Как протестировать посадочный материал на степень заражения вирусами?
ТЕМА Ш. ДЕДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ И КАЛЛУСОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ.
Работа 1. ПОЛУЧЕНИЕ КАЛЛУСОВ ИЗ ЛИСТЬЕВ ТАБАКА.
Объяснение. Каллусная клетка, в результате деления которою возникает
каллус, представляет собой один из типов клеточной дифференцировки. Для
растения in vivo каллус – это группа клеток, возникающая при травмах и защищающая место поранения (раневая паренхима). В ней накапливаются питательные вещества для регенерации анатомических структур или утраченного органа.
Дифференцированные клетки объединяются в растении в ткани и выполняют определенные функции. Клетки различаются не только функционально, но и
морфологически.
На питательных средах с большим содержанием ауксинов (2,4 Д) клетки
экспланта дедифференцируются и переходят к пролиферации. Особенности дедифференциации клеток экспланта зависят от генетики и эпигенетики экспланта. Клетки утрачивают прежние функции и морфологию. Причем, чем меньше
структурно и химически дифференцирована клетка, тем легче получить каллус.
В клетке, готовящейся к делению, стимулируется синтез всех форм РНК,
начинается репликация ДНК, исчезают специфические тканевые белкиантигены, синтезируются новые, специфичные для каллусных клеток. Меняется
активность структурных генов и белкового аппарата клеток. Дедифференциация специализированных клеток начинается с обогащения их элементами цитоплазмы: микротрубочками, мембранами ЭПС и комплекса Гольджи, рибосомами, исчезают хлоро- и хромопласты, продукты их деятельности; может образоваться много ядер или увеличиться число хромосом; укрупняются вакуоли.
Каллус, выращиваемый поверхностным способом, представляет собой
аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго
22
определенную структуру. Клетки каллуса либо бесцветны, либо имеют желтоватый оттенок. В зависимости от происхождения и условий культивирования
различают каллусы: рыхлые, с сильно оводненными, легко отделяющимися
друг от друга клетками; средней плотности, с зонами меристематическои активности; плотные, с зонами редуцированного камбия и сосудов.
В биотехнологии, для отработки методик культивирования, чаще всего используют те виды растений, которые и в обычных условиях легко укореняются,
регенерируют, образуют каллус. Поэтому большинство методов получения и
культивирования каллуса разработано для табака. Каллусы можно получить
практически из любой части растения, так как клетки табака легко дедифференцируются и переходят к пролиферации. Для культивирования каллусов из
листьев табака используют среду Мурасиге-Скуга с добавлением ауксинов (2,4
Д).
Материалы и оборудование. Растения табака, 6% раствор хлорамина, колбы
со стерильной дистиллированной водой, чашки Петри со стерильной питательной средой для индукций каллусогенеза.
Ход работы.
1. Листья табака поместить в стерилизующий раствор на 5 минут, затем
промыть стерильной дистиллированной водой 3 раза.
2. Стерильным скальпелем вырезать срединную жилку листа с участком паренхимы: длиною 1,5-2 см, шириной 1 см.
3. Поместить экспланты на питательные среды (перед каждой манипуляцией инструменты обрабатывать спиртом и обжигать на пламени спиртовки).
4. Чашки Петри с эксплантами перенести в термостат для индукций каллусогенеза при температуре 25 + 2о С.
5. Результаты зарисовать через 2-4 недели.
Работа 2. ПОЛУЧЕНИЕ КАЛЛУСОВ ИЗ НЕЗРЕЛЫХ ЗАРОДЫШЕЙ И
УЗЛОВ КУЩЕНИЯ ПШЕНИЦЫ.
Объяснение. Каллусы из различных органов пшеницы на искусственных
питательных средах впервые были получены в 1968 году. Их можно использовать для изучения солеустойчивости, устойчивости к температурному стрессу,
получения суспензий и протопластов.
Для индукции каллусогенеза обычно используют стерильные пробирочные
растения, выращенные из зародышей на средах без гормонов.
Растения для получения каллусов можно вырастить в теплице. Для этого
набухшие семена помещают на 5 недель в холодную камеру на яровизацию при
2оС, проростки высаживают в вегетационные сосуды и выращивают до достижения молочною спелости. Незрелые зародыши выделяют и переносят на питательные среды.
Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, пробирки с питательной средой,
23
пробирки со стерильными растениями, колосья пшеницы в стадии молочной
спелости, инструменты: препарировальные иглы, пинцеты, скальпели, стерильная бумага, 6% раствор хлорамина, стерильная дистиллированная вода, спиртовки, флаконы с 96 % спиртом.
Ход работы.
1. Незрелые зерновки поместить в стерилизующий раствор на 5 минут.
2. Промыть 3 раза стерильной дистиллированной водой.
3. Простерилизовайные зерновки поместить на стерильные бумажные мостики.
4. Препарировальной иглой вычленить зародыши и перенести в пробирки с
питательными средами.
5. Пробирки с зародышами закрыть пробками и поставить в штатив.
6. Пробирочные растения пшеницы выложить на стерильные бумажные
матрасики и разрезать на небольшие части по 5-10 мм, выделить междоузлия с
участками листового влагалища.
7. Перенести экспланты на питательные среды МС + 2,4 Д в концентрации
4мг/л.
8. Зарисовать каллусы через 2-4 недели, сделать выводы о морфологии каллусов, рассмотреть каллусные клетки под микроскопом.
Работа 3. ПОЛУЧЕНИЕ КАЛЛУСОВ ИЗ КОРЕШКОВ ФАСОЛИ.
Объяснение. Каллусы можно получать из разных частей растения, в том
числе из кончиков корней. Образование каллуса происходит в области первичных и вторичных меристем. Процесс каллусообразования зависит от размера
экспланта. Оптимальная величина экспланта 5-10 мм3 и масса 20-100 мг.
Многие ткани имеют физиологическую полярность. Поэтому каллус лучше
образуется на той стороне экспланта, которая ближе к апикальным меристемам
корня. Кончики корней легко образуют каллус, если они помещены на среду
горизонтально, тогда как сегменты стебля лучше формируют каллус, если их
поместить вертикально.
Для культивирования на питательных средах лучше использовать стерильные корешки, полученные при проращивании семян в стерильных условиях.
Материалы и оборудование. Семена фасоли, 6% раствор хлорамина, стерильные инструменты: пинцеты, скальпели, препарировальные иглы, чашки
Петри с питательными средами для индукции каллусогенеза, стерильные чашки
Петри, флаконы со спиртом и стерильной дистиллированной водой.
Ход работы.
1. Семена фасоли поместить в чашки Петри (по 15 штук в чашку), залить
раствором хлорамина до полного погружения семян в жидкость и оставить на
20 минут.
2. Промыть семена стерильной дистиллированной водой 3 раза.
3.Стерильные семена залить стерильной водой и оставить для набухания на
24
24 часа.
4.Семена с разрушенной кожурой удалить, а жизнеспособные семена простерилизовать повторно 6% хлорамином 20 минут.
5. Промыть семена стерильной дистиллированной водой 3 раза.
6. Семена перенести в стерильные чашки Петри (по 5 штук в чашку).
7. Стерильным пинцетом придерживать семя, а стерильным скальпелем
надрезать оболочку.
8. Стерильным скальпелем и препарировальной иглой изолировать корешки
(2-3 мм) и перенести в чашки Петри со стерильной дистиллированной водой
(по 15 штук в чашку).
9. Корешки стерильной препарировальной иглой поместить на поверхность
агаризованной среды и слегка вдавить в агар для обеспечения хорошего
контакта со средой (среда ШХ+10 мг/л п-ХФУК+2 мг/л 2,4Д+0,1 мг/л кинетина).
Работа 4. СУБКУЛЬТИВИРОВАНИЕ КАЛЛУСОВ.
Объяснение. В цикле выращивания каллусные клетки после ряда делений
проходят обычный онтогенез: растут растяжением, дифференцируются и деградируют. Рост каллуса внешне отражает образная кривая. Ростовой цикл
начинается с посадки экспланта на среду (начало культивирования), а завершается в момент прекращения митозов (стационарная фаза).
В лагфазе (латентной фазе) клетки не делятся, не увеличиваются в размере,
имеют низкую метаболическую активность. В экспоненциальной фазе (фазе логарифмического роста) клетки активно делятся митозом. В ранней экспоненте
увеличивается количество митохондрий (синтезируется АТФ), рибосом, всех
видов РНК, синтезируются белки, активизируется метаболизм, интенсивно поглощается кислород. Поздняя экспонента или фаза латентного роста, характеризуется снижением удельной скорости роста, замедлением клеточного деления, увеличением среднего размера клеток за счет растяжения. В стационарной
фазе размер клеток продолжает увеличиваться, а их деление прекращается. В
поздней стационарной фазе (фаза деградации) за счет истощения среды клетки
стареют и умирают.
Продолжительность ростового цикла каллусных клеток 21-28 дней. В процессе культивирования каллус пассируют (пересаживают на свежую питательную среду) каждые 4-6 недель. Масса транспланта (фрагмента ткани, который
пассируют на свежую питательную среду) составляет 60-100 мг на 20-40 мл
среды.
Материалы и оборудование. Пробирки с каллусами, пробирки с питательной средой для культивирования каллусов, инструменты: пинцеты, препарировальные иглы, флакон с 96 % спиртом, ламинар-бокс, спиртовка.
25
Ход работы.
1. В асептических условиях извлечь каллусы из пробирок и поместить на
стерильную поверхность (столик ламинар-бокса, обработанный 96 % спиртом и
УФ-излучением), стерильной препарировальной иглой выделить зоны меристематической активности (белые мелкие клетки).
2. Транспланты величиной 2-3 мм поместить на поверхность питательной
среды (МС+ИУК - 0,5 мг/л + кинетин - 0,5 мг/л).
3. Результаты культивирования зарисовать через 2-4 недели, по результатам
взвешиваний через 1-2-3-4 недели построить график роста каллуса.
Контрольные вопросы к теме Ш.
1. Назвать основные способы культивирования каллусов.
2. Что такое дедифференциацйя и пролиферация клеток?
3. Чем характеризуются основные фазы ростового цикла каллуса?
4. Отличаются ли по морфологии каллусы различных видов растения?
5. Для каких целей используют культуру каллусов в биотехнологии, генетике и селекции?
6. Какие питательные среды используют для индукции каллусогенеза и
культивирования каллусов?
ТЕМА IV. СУСПЕНЗИОННЫЕ КУЛЬТУРЫ.
Работа 1. ПОЛУЧЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ СУСПЕНЗИИ.
Объяснение. Суспензионные культуры – это одиночные клетки, мелкие,
средние и крупные агрегаты (группы клеток), выращиваемые в жидкой питательной среде при постоянной аэрации (доступ кислорода) в асептических
условиях. Суспензии получают из каллусов. Для инициации суспензионной
культуры необходимо 2-3 г свежей рыхлой массы каллусных клеток на 60-100
мл жидкой питательной среды. Первичную суспензию культивируют в колбах с
жидкой питательной средой на круговых качалках со скоростью 100-120
об./мин.
Модельная кривая роста суспензии имеет S-образную форму и включает:
лаг-фазу, экспоненциальную фазу, стационарную фазу и фазу деградации.
Форма реальных ростовых кривых отличается продолжительностью фаз. Это
зависит от генетики популяции, количества инокулюма и состава питательной
среды. Скорость нарастания биомассы колеблется от 15 до 70 суток.
Суспензии используют для получения важных химических веществ: органических кислот, ферментов, алкалоидов, красителей, белков, аминокислот, которые применяются в фармакологии, парфюмерии, пищевой и химической
промышленности, сельском хозяйстве.
Суспензионные культуры имеют большое значение для генетики и особенно
молекулярной биологии: из суспензионных клеток получают протопласты, необходимые для соматической гибридизации, генетической инженерии, а также
для изучения метаболизма клеток.
26
Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, пробирки с рыхлыми каллусами
табака (среда МС+2,4-Д 2 мг/л), колбы с питательной средой для инициаций
суспензии, магнитные мешалки, стерильные инструменты, флакон с 96 % спиртом.
Ход работы.
1. В асептических условиях извлечь каллус из пробирки и поместить в колбу с питательной средой, из расчета 2-3 г на 100 мл среды: 1. МС+2,4-Д, 2.
МС+ИУК, 3.МС+ИУК+6-БАП, 4. МС без гормонов.
2. Колбы с суспензией поместить на круговые качалки при 100-120 об./мин.
и оставить на 2 недели.
3. Результаты культивирования суспензии на различных по составу средах
зарисовать и сделать выводы.
Работа 2. ПОДСЧЕТ ПЛОТНОСТИ СУСПЕНЗИИ.
Объяснение. По плотности суспензии можно не только охарактеризовать
состояние клеточной популяции, но и определить время субкультивирования
(отбора инокулянта и пересадки на свежую питательную среду). В большинстве
случаев суспензию для субкультивирования отбирают в конце экспоненциальной фазы (через 14-16 дней после начала культивирования). При построении
кривой роста показатели снимают через день. Плотность суспензии за 2-3 недели культивирования возрастает в 20 раз. Клетки суспензий удобнее всего подсчитывать в специальных счетных камерах Фукса-Розенталя /гемоцитомерах/.
Для подсчета клеток суспензии иногда используют временные препараты, но
это более трудоемкий процесс: значительно увеличивается число повторностей.
Объем выборки должен составлять не менее 1000 клеток. Подсчет клеток
затрудняется, если в суспензии преобладает фракция агрегатов. В таких случаях к 1 объему культуры добавляют 2 объема 8 % оксида хрома и нагревают до
700С в течение 2-15 минут. После охлаждения культуру встряхивают, чтобы
распались агрегаты. Для разрушения агрегатов в суспензию добавляют пектиназу – 0,25 % объема.
Плотность суспензии можно определить и по соотношению объема биомассы к общему объему суспензии. Измеряют средний объем клетки и получают
число клеток в 1 мл суспензии.
Материалы и оборудование. Микроскоп, центрифуга, колба с суспензией,
стерильная пипетка, предметное стекло, покровное стекло, камера для подсчета
элементов крови, фильтровальная бумага.
Ход работы.
1. Колбу с суспензией встряхнуть и отобрать пипеткой несколько мл суспензии.
2. 1 мл суспензии смешать с 2 мл 8 % оксида хрома и поставить на 15 минут
27
в термостат при температуре 700 С.
3. Смесь пропустить 3 раза через шприц с толстой иглой (пипетировать).
4. Камеру Фукса-Розенталя заполнить суспензией.
5. Подсчитать клетки под микроскопом.
6. Плотность суспензии рассчитать по формуле:
Мn1000
Х=
, где Х – число клеток в мл,
3,2
М – среднее число клеток в камере,
n – разведение.
Работа 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕПЕНИ АГРЕГИРОВАННОСТИ И
ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ СУСПЕНЗИИ.
Объяснение. В зависимости от целей исследования условия культивирования и состав питательной среды подбирают так, чтобы в суспензии преобладала
определенная фракция клеток. Обычно в суспензии различают 4 основные
фракции: одиночные клетки, мелкие агрегаты, средние агрегаты, крупные агрегаты. Степень агрегированности определяют, подсчитывая клетки в нескольких
полях зрения на временных препаратах под малым увеличением микроскопа
(не менее 1000 клеток).
При работе с суспензиями необходимо учитывать и ее жизнеспособность. О
жизнеспособности клеток можно судить по движению цитоплазмы, по степени
проницаемости клеточной стенки для красителей, по активности ферментов.
Прижизненные красители, такие как метиленовый синий, клетки не убивают и через оболочки живых клеток в цитоплазму не проникают. Суспензия считается жизнеспособной, если более 70 % клеток не окрашиваются в синий цвет;
агрегат жизнеспособен, если более 50 % его клеток не окрасились.
Для количественного определения жизнеспособности суспензии используют вещества, участвующие в метаболизме клетки: флуоресцеиндиацетат расщепляется в клетке эстеразами с образованием флуоресцеина, дающего флуоресценцию цитоплазмы живых клеток. Активность эстеразы определяют на
спектрофотометре. Окрашивание клетки солями тетразоля позволяет определить интенсивность дыхания клетки.
Материалы и оборудование. Микроскоп, флакон с 0,1 % раствором метиленового синего, предметные и покровные стекла, фильтровальная бумага, дистиллированная вода, марлевые салфетки, пипетки.
Ход работы.
1. Приготовить препарат суспензии: встряхнуть суспензию в колбе, пипеткой отобрать небольшое количество суспензии, поместить каплю суспензии на
предметное стекло, добавить каплю красителя, накрыть покровным стеклом,
излишки жидкости убрать фильтровальной бумагой.
28
2. Поместить препарат на столик микроскопа под малое увеличение объектива и подсчитать клетки и агрегаты в 3-х полях зрения (просмотреть не менее
трех препаратов).
3. Результаты записать в таблицу.
4. Один препарат зарисовать, описать морфологию клеток суспензии (форму, величину).
5. Сделать вывод о степени агрегированности суспензий (какие фракции
преобладают, %) и жизнеспособности суспензии (неокрашенных клеток, %).
Таблица.
Степень агрегированности и жизнеспособности суспензии.
Фракции
1
1
о
2
н
о
3
н
о
н
Препараты
2
Поля зрения
1
2
3
о н о н о н
3
1
о
2
н
о
3
н
о
н
одиночные
клетки
мелкие агрегаты (2-5
клеток)
средние
агрегаты
(6-20 клеток)
крупные
агрегаты
(21-50 клеток)
очень
крупные
агрегаты
(50 и более
клеток)
Примечание: о – окрашенные клетки и агрегаты,
н – неокрашенные клетки и агрегаты.
Работа 4. ПОЛУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ КЛОНОВ НА АГАРИЗОВАННЫХ
СРЕДАХ. МЕТОД ПЛЕЙТИНГА.
Объяснение. Культивирование отдельных (одиночных) клеток позволяет
получать клоны и исследовать генетическую и физиологическую стабильность
или изменчивость клонового материала. Одиночные клетки или изолированные
протопласты используются в клоновой селекции мутантных, гибридных и
трансформированных линий. В эти клетки можно ввести новые гены, в то же
время – это хорошая модель для изучения онтогенеза и физиологии клетки.
29
Источником отдельных (одиночных) клеток являются клеточные суспензии, растущие на жидкой питательной среде; мацерированные ткани растений
(мезофилл листа); изолированные протопласты после восстановления клеточной стенки.
Наиболее эффективными методами для получения одиночных клеток являются: метод «кормящего слоя» или «культуры-няньки», кондиционированных сред, микрокапель. Для получения генетически стабильных клонов и клеточной селекции используется метод плейтинга.
Материалы и оборудование. Колбы с суспензией, стерильные чашки Петри, стерильный цилиндр, чашки Петри с агаризованной средой, инструменты:
пинцеты, препарировальные иглы, спиртовка, 96 % спирт.
Ход работы.
1. Пипеткой отобрать 5 мл верхней фракции суспензии (в верхнем слое суспензии преобладает фракция одиночных клеток) и смешать с 5 мл агаризированной (1,4 % агара) среды для культивирования каллуса. Работу проводить в
стерильной посуде: мерном цилиндре, стакане.
2. Полученную смесь разлить в стерильные чашки Петри слоем до 1 см.
3. Чашки Петри закрыть крышками и герметизировать парафином.
4. Количество колоний подсчитать через 4-6 недель.
5. Результаты зарисовать, подсчитать плотность высева по формуле:
количество образовавшихся колоний
Эффективность высева =
 100 %
количество высеянных клеток
Контрольные вопросы к теме IV.
1. Что такое суспензионные культуры, и каковы основные способы их получения?
2. Как определить степень агрегированности и жизнеспособности суспензий?
3. Как подсчитать плотность суспензии?
4. Каковы основные способы культивирования одноклеточных суспензий?
5. В каких отраслях производства и науки используют суспензионные культуры?
30
ТЕМА V. ГОРМОНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК
И ТКАНЕЙ.
Работа 1. ИНДУКЦИЯ ОРГАНОГЕНЕЗА И СОМАТИЧЕСКОГО
ЭМБРИОГЕНЕЗА В КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ ТАБАКА ПОД ДЕЙСТВИЕМ
ФИТОГОРМОНОВ.
Объяснение. Фитогормоны – это биологические регуляторы роста и развития растений, осуществляющие взаимодействие клеток, тканей и органов, стимулирующие и ингибирующие морфогенетические и физиологические процессы в растительных организмах. Фитогормоны влияют на деление и рост клеток
растяжением, состояние покоя, созревание, старение, формирование пола,
устойчивость к стрессу, тропизмы, транспирацию; обеспечивают функциональную целостность растительного организма, закономерную последовательность
фаз индивидуального развития.
По химической природе гормоны растений четко подразделяются на две
группы: производные мевалоновой кислоты (гиббереллины, абсцизины, брассины, фузикокцин, цитокинины), производные аминокислот (ауксины –из
триптофана, этилен – из метионина и аланина). Биосинтез фитогормонов происходит в определенных частях растений: в апексах побегов образуется ИУК–
индолил-3-уксусная кислота, лист служит донором ключевого продукта синтеза гиббереллинов – каурена, а также абсцизовой кислоты, в апексах корней
синтезируется кинетин, а в зоне растяжения корня – гиббереллины, источником
зеатина является эндосперм проростающих семян.
По функциональному действию различают 5 основных групп фитогормонов: ауксины, цитокинины, гиббереллины, абсцизины и этилен. Ауксины в
культуре тканей вызывают рост клеток растяжением, в больших концентрациях
– деление клеток, в сочетании с цитокининами – органогенез. В биотехнологии
применяют как природные ауксины (ИУК), так и синтетические [ИМК (индолил-З-масляная кислота), ИПК (индолил-З-пропионовая кислота), 2,4-Д (2,4дихлорфеноксиуксусная кислота), НУК(нафтилуксусная кислота)].
Цитокинины в сочетании с ауксинами индуцируют митозы, пролиферацию
клеток, почек и побегов. К природным цитокининам относятся: зеатин, кинетин
(6-фурфуриламинопурин), NN-дифенилмочевина (кокосовое молоко); к синтетическим – 6-БАП (6-бензиламинопурин).
Гиббереллины стимулируют рост клеток растяжением, а также синтез ауксинов и цитокининов. Сейчас известно около 60 видов гиббереллинов. В культуре ткани используется гибберелловая кислота.
Абсцизины (АБК – абсцизовая кислота) и этилен ингибируют ростовые
процессы, деление клеток, в сочетании с цитокининами и хлорхолинхлоридом
индуцируют органогенез (образование микроклубней).
Гормональная система тесно связана с генетическим аппаратом клетки. Фитогормоны не только влияют на степень метилирования ДНК и таким образом
регулируют экспрессию генов, но и связываются с белками – репрессорами на
опероне, что приводит к активации структурных генов и синтезу определенных
31
ферментов. Следовательно, изменяя соотношение гормонов в питательных средах, можно в какой-то степени изменять и генетические программы клеток и
тканей. Эти процессы известны как дедифференциация, редифференциация и
дифференциация клеток и тканей.
Материалы и оборудование. Пробирки с каллусами табака, колбы на 50 мл
со стерильном питательной средой (МС без гормонов), колбы со средами для
стеблевого органогенеза и соматического эмбриогенеза и индукции ризогенеза,
флаконы с 96 % спиртом, стерильные пинцеты и препарировальные иглы, спиртовка, ламинар-бокс.
Ход работы.
1. Стерильным пинцетом переложить каллусы на стерильную поверхность
стола ламинар-бокса, разделить на кусочки 5х5 мм. и поместить в колбы с питательными средами, содержащими различные наборы фитогормонов.
2. Колбы перенести в культуральную комнату с температурой 25 + 2оС,
влажностью воздуха 70 % и интенсивностью освещения 5кLх.
4. Результаты эксперимента зарисовать через 2-4-6-8 недель.
Работа 2. ИНДУКЦИЯ ДЕЛЕНИЯ КЛЕТОК И РОСТА КЛЕТОК
РАСТЯЖЕНИЕМ ПОД ДЕЙСТВИЕМ АУКСИНА И ГИББЕРЕЛЛИНА.
Объяснение. В растении фитогормоны находятся в тесном взаимодействии
друг с другом: ИУК индуцирует синтез этилена и цитокининов, ГК увеличивает
содержание ИУК, цитокинины усиливают синтез МУК, но снижают содержание свободной АБК, этилен тормозит транспорт ИУК и увеличивает содержание АБК.
В культуре ткани фитогормоны, добавленные в различных пропорциях, регулируют синтез эндогенных гормонов растений, что проявляется в разнообразных морфогенетических реакциях клеток и тканей.
В 1955 г. Скуг и Миллер предложили гипотезу гормональной регуляции в
культуре клеток и тканей, которая сейчас известна, как правило СкугаМиллера: если концентрация ауксинов и цитокининов в питательной среде относительно равны или концентрация ауксинов незначительно превосходит концентрацию цитокининов, то образуется каллус; если концентрация ауксинов
значительно превосходит концентрацию цитокининов, то формируются корни;
если концентрация ауксинов значительно меньше концентрации цитокининов,
то образуются почки, побеги.
Фитогормоны способны изменять проницаемость клеточных мембран. Под
действием ауксинов и гиббереллинов усиливается выброс протонов из клетки,
что приводит к подкислению клеточной стенки и ослаблению связей между
целлюлозными фибриллами в результате частичного кислотного гидролиза
пектиновых веществ. Поэтому клеточная стенка становится более эластичной и
под действием тургорного давления вакуоли клетка приобретает способность к
растяжению.
32
Материалы и оборудование. Семена пшеницы и тритикале, колбы с дистиллированной водой, 6 % хлорамин, чашки Петри с растворами гормонов, стерильные пинцеты, спиртовки, 96% спирт , ламинар-бокс.
Ход работы.
1.Отобрать 30 здоровых семян пшеницы или тритикале.
2. Семена простерилизовать в растворе хлорамина в течение 5 минут.
3. Промыть семена автоклавированной водой 3 раза.
4. Стерильным пинцетом поместить семена в чашки Петри с дистиллированной водой, раствором 2,4-Д (5-10 мг/л), раствором гибберелловой кислоты
(2-4 мг/л).
5.Закрыть чашки Петри и поместить в термостат при температуре 25 + 2оС и
влажности воздуха 70 %.
6.Результаты опыта зарисовать через 2-4 недели.
Контрольные вопросы к теме V.
1. Что такое фитогормоны, и какие процессы в растительных клетках и тканях они стимулируют?
2. Какие группы фитогормонов стимулируют и ингибируют рост и развитие
растений?
3. Как осуществляется гормональная регуляция в культуре клеток и тканей?
4. Какова химическая природа фитогормонов, и в каких органах растения
они синтезируются?
5. Каким образом гормональная система влияет на генетический аппарат
клетки?
ТЕМА VI. КУЛЬТУРА ГАПЛОИДНЫХ КЛЕТОК.
Работа 1. ПОЛУЧЕНИЕ КАЛЛУСОВ ИЗ ПЫЛЬНИКОВ ВИШНИ
И ЯБЛОНИ.
Объяснение. Гаплоидия является таким уменьшением числа хромосом, при
котором в половинном наборе соматической и половой клеток каждая пара гомологичных хромосом представлена лишь одной из них. Гаплоидом или моноплоидом называют организм, имеющий в соматических клетках гаплоидный
набор негомологичных хромосом. Генотип гаплоидов имеет характерные особенности. У гаплоидов проявляются рецессивные гены. Гаплоиды по внешнему
виду сходны с соответствующими диплоидами, но меньше их. Клетки гаплоидов имеют меньший размер, чем клетки диплоидов. Гаплоиды не образуют
полноценных гамет. Путем удвоения числа хромосом соматических клеток гаплоида можно получить полностью гомозиготное диплоидное растение.
Гаплоиды получают, используя гаплопродюссеры (отдаленную гибридизацию), партеногенез. Гаплоиды можно получить в культуре тканей из пыльников
и клеток зародышевого мешка, гаплоиды в культуре тканей уже получены у 200
видов растений.
33
Для большинства растений оптимальным сроком посадки пыльников на питательные среды является стадия "средних" или "поздних" одноядерных вакуолизированных микроспор. На этой стадии микроспоры высвобождаются из тетрад и готовятся к первому митозу.
Для культивирования пыльников используют среды: Мурасиге-Скуга с 1/2
концентрацией солей, китайские среды, среды с картофельным экстрактом,
среду Нич. Ауксины либо вообще не добавляют, либо используют 2,4-Д. Из цитокининов применяют кинетин и 6-ЬАП. Агар-агар тщательно промывают, так
как он содержит вещества неблагоприятно влияющие на развитие пыльников.
Для адсорбции метаболитов ингибирующих ростовые процессы в культуре тканей в питательные среды добавляют активированный уголь.
Перед культивированием пыльники выдерживают при температуре 4-6о С в
течение 2-8 суток. Изолированные пыльники культивируют либо в темноте, либо при слабом освещении при температуре 25 + 2о С.
]На питательных средах микроспора может образовать каллус или гаплоидныи зародыш (сначала образуется 40-50-клеточный проэмбрио). Зародыш в
глобулярной стадии разрывает экзину и проходит стадии, аналогичные развитию зиготического зародыша. Пыльца делится, клетки увеличиваются, экзина
разрывается и образуется каллус, на котором, варьируя соотношение фитогормонов, можно получить гаплоидные эмбриоиды. Получение гаплоидов биотехнологическими методами позволяет быстро создавать гомозиготные линии, что
делает данную технологию весьма ценной для селекции и генетики.
В процессе культивирования изолированных пыльников на питательных
средах развитие идет двумя путями: либо прямым андрогенезом (образованием
эмбриоидов и гаплоидных растений-регенерантов), либо косвенным андрогенезом, когда репродуктивные клетки дедифференцируются и переходят к пролиферации, образуя сначала каллус, а затем при пассировании на специальные
среды – морфогенный каллус и регенеранты.
Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, бутоны вишни и яблони, пробирки со средою для каллусогенеза, препарировальные иглы, пинцеты, флакон
с 96 % спиртом, 6 % раствор хлорамина, вата, фольга.
Ход работы.
1. Бутоны стерилизуют в 6 % растворе хлорамина 10 минут, для этого поместить бутоны в марлевый мешочек по 20 штук в каждый и опустить в стакан со
стерилизующим раствором, затем тщательно промыть бутоны (5-6 раз) стерильной дистиллированной водой.
2. Перенести бутоны на стерильную поверхность стола ламинар-бокса,
осторожно отделить пыльцевые мешки от тычиночных нитей.
3. Стерильной препарировальной иглой перенести пыльники на поверхность питательною среды в пробирки по 5-10 пыльников в каждую.
4. Закрыть пробирки и перенести в термостат с температурою 26о С и влажностью 70 %.
5. Результаты работы зарисовать через 2-4 недели.
34
Работа 2. ПОЛУЧЕНИЕ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ ИЗ ПЫЛЬЦЕВЫХ
КАЛЛУСОВ ВИШНИ.
Объяснение. Способность каллусов к морфогенезу определяется балансом
фитогормонов как в питатальных средах, так и в самих клетках (эндогенные
фитогормоны). Для получения растений-регенерантов используют среды, содержащие кинетин – 0,1-0,3 мг/л, ГК – 4 мг/л, 6-БАП – 0,5-1,5 мг/л, ИУК – 0,51,5 мг/л. Каллусы культивируют при 16 часовом фотопериоде и интенсивностью освещения 2-3 кLх.
Морфогенный каллус имеет плотную консистенцию, бугристую поверхность, молочно-белый, желтоватый и зеленоватый цвет.
Поверхностные слои морфогенного каллуса состоят из меристематических,
богатых цитоплазмою клеток, имеющих заполненные крахмалом пластиды и
хорошо развитые митохондрии. Центральная часть каллуса представлена крупными вакуолизированными клетками с пикнотическими ядрами, которые чередуются с меристематическими участками.
Для индукции побегообразования, каллусы переносят на среды для регенерации: МС + кинетин – 1-2 мг/л, 6-БАП – 3-6 мг/л, аденин – 1-2 мг/л, ГК – 1-2
мг/л, феруловая кислота – 0,5-0,7 мг/л, ИУК – 0,2-0,4 мг/л, НУК – 0,2-0,4 мг/л,
ИМК – 0,2-0,4 мг/л, 2,4-Д – 0,1-0,3 мг/л.
Через 1,5-2 месяца культивирования морфогенных каллусов на 16-ти часовом фотопериоде при освещенности 3 кLх начинается пролиферация почек и
побегов. Морфогенные каллусы пассируют каждые 4-6 недель.
Побеги-регенеранты, полученные из пыльцевых каллусов, неоднородны по
морфологическим признакам. Это обусловлено гетерогенностью каллусов. Поэтому необходимо проводить цитологическое изучение и каллусов и растенийрегенерантов.
Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, спиртовки, флаконы с 96 %
спиртом, пробирки с пыльцевыми каллусами, пробирки со средами для получения морфогенного каллуса, пробирки со средами для регенерации, препарировальные иглы, пинцеты.
Ход работы.
1. В условиях ламинар-бокса извлечь каллус из пробирки и перенести на
стерильную поверхность. Стерильной препарировальной иглой выделить зону
морфогенного каллуса (белые мелкие клетки, каллус средней плотности).
2. Стерильной препарировальной иглой перенести кусочек (5-6 мм) морфогенного каллуса в пробирку со средой для регенерации, закрыть пробирку стерильной пробкой.
3.Перенести штативы с пробирками в световую культуральную комнату с
температурой 25 + 2о С, влажностью 70 %, освещенностью 4 кLх.
4. Через 4-6 недель зарисовать результаты работы.
5. Побеги перенести в пробирки со средами для пролиферации побегов: МС
35
+1-2 мг/л 6-БАП, 1 мг/л НУК.
6. Перенести побеги на среды для индукции корнеобразования: МС без
гормонов, МС +1-2 мг/л ИМК + 1мг/л ГК и поместить на 20 дней в темноту.
Контрольные вопросы к теме VI.
1. Для чего используются гаплоиды в селекции и генетике?
2. Как получить морфогенный каллус из пыльников?
3. Каковы основные способы получения гаплоидных и дигаплоидных растений-регенерантов?
36
ТЕРМИНОЛОГИЯ
In vitro – выращивание растительных объектов «в стекле» (пробирке, колбе,
биореакторе) на искусственных питательных средах, в асептических условиях.
Тотипотентность – свойство соматических клеток полностью реализовать
генетический потенциал целого организма.
Омнипотентность ядер – сохранение ядрами соматических клеток растений всех потенций ядра зиготы, то есть сохранение всей генетической информации.
Культура тканей in vitro – выращивание в длительной пересадочной культуре тканей, возникших путем пролиферации клеток изолированных сегментов
разных органов или самих органов растений.
Культура органов in vitro – асептическое выращивание на искусственной
питательной среде в пересадочном режиме изолированных корней, стеблевых
апексов, незрелых частей цветка, незрелых плодов.
Культура корней in vitro – асептическое выращивание на искусственной питательной среде в пересадочном режиме изолированных корней.
Культура меристем in vitro – асептическое выращивание на искусственной
питательной среде изолированного апекса или пазушной почки побега конуса
нарастания с одним или двумя листовыми примордиями.
Культура суспензионная или культура клеток in vitro – асептическое выращивание отдельных клеток или их небольших групп во взвешенном состоянии
в жидкой питательной среде.
Культура зиготических зародышей in vitro – асептическое выращивание на
искусственной питательной среде незрелых или зрелых изолированных зародышей.
Апекс – верхушечная часть стебля или корня.
Меристема – образовательная ткань с мелкими, активно делящимися клетками.
Апикальное доминирование – явление подавления роста боковых почек побега в присутствии терминальной почки.
Адвентивные почки – почки, возникшие из тканей и клеток растения, обычно их не образующих.
Фитогормоны – (гормоны растений) – биолигически активные соединения,
образующиеся в раститениях в малых количествах, вызывающие специфический ростовой или формообразовательный эффект.
Ауксины – фитогормоны (ИУК, НУК, 2,4-Д), активизирующие ррост стеблей и корней, стимулирующие образование корней у проростков.
Цитокинины – фитогормоны (кинетин, 6-БАП), активизирующие развитие
меристем, стимулирующие образование почек.
Гиббереллины – фитогормоны (ГК и др.), активизирующие рост стеблей, вызывающие прорастание семян.
ГК – гибберелловая кислота
ИУК – -индолилуксусная кислота
НУК – -нафтилуксусная кислота
2,4-Д – 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота
37
6-БАП – 6-бензиламинопурин
Клональное микроразмножение или микроклональное размножение – получение in vitro неполовым путем растений, генетически идентичных исходному
(метод вегетативного размножения растений в культуре in vitro).
Эксплант фрагмент ткани или органа, инкубируемый на питательной среде
самостоятельно или используемый для получения первичного каллуса.
Пролиферация – новообразование клеток и тканей путем размножения уже
существующих.
Дедифференциация – переход специализированных клеток к пролифирации
и неорганизованному каллусному росту (утрата клетками специализации).
Редифференциация – переход специализированных клеток из одного состояния дифференцировки в другое с предшествующими делениями или непосредственно.
Дифференциация – комплекс процессов, приводящих к различиям между
клетками.
Дифференцировка – состояние специализации клеток, отличающее их от
других.
Морфогенез in vitro – процесс формообразования, то есть заложения, роста
и развития клеток (цитогенез), тканей (гистогенез) и органов (органогенез) в
культуре клеток и тканей in vitro.
Ризогенез – процесс заложения, роста и развития корней.
Регенерация – восстановление целостного организма из клетки, ткани, органа.
Эмбриоидогенез – процесс образования зародышеподобных структур (эмбриоидов) неполовым путем в культуре тканей и клеток in vitro.
Каллус – группа дедифференцированных клеток, возникших in vivo или in
vitro путем неорганизованной пролиферации.
Культура каллусов in vitro – выращивание в длительной пересадочной культуре каллусов, возникших путем дедифференциации и пролиферации клеток,
тканей, органов растений.
Культура «привыкших» тканей – выращивание тканей, возникших путем
редифференциации или мутации клеток нормальных каллусных тканей, и способных расти на питательных средах без гормонов.
Трансплант – часть каллусной ткани, используемая для переноса на свежую
питательную среду.
Инокулюм – часть клеточной суспензии, используемая для переноса на свежую питательную среду.
Субкультивирование – процесс переноса транспланта или инокулюма в
культуральный сосуд на свежую питательную среду.
Цикл выращивания – период от помещения клеточного инокулюма или каллусного транспланта на питательную среду до последующего субкультивирования.
Ростовой цикл – рост популяции клеток в цикле периодического выращивания, характеризующийся сигмоидальной (S-образной) кривой. Фазы ростового
38
цикла: латентная (лаг-фаза), экспоненциальная (лог-фаза, фаза логарифмического роста), замедления роста, стационарная, деградации.
Штамм – культура, возникшая после первого субкультивирования, и состоящая из многих клеточных линий, возникших из клеток первичного каллуса.
Линия – культура, возникшая из штамма путем селекции или клонирования,
имеющая маркерные признаки.
Клон – культура, возникшая из одной клетки.
Клеточная селекция in vitro – метод выделения мутантных клеток и сомаклональных вариаций с помощью селективных условий.
Сомаклональные вариации и варианты – фенотипическое выражение непостоянства ядерного и органелльных цитоплазматических геномов культивируемых клеток. От истинных генных мутаций отличаются большей частотой возникновения и комплексностью изменений (изменения в структуре генов, хромосом, геномов).
Эпигенетические вариации – фенотипическое выражение дифференциальной активности генов. От мутаций и сомаклональных вариаций отличаются
тем, что не сохраняются в цикле клетка-растение-клетка.
Соматическая (парасексуальная) гибридизация – способ создания гибридных клеточных линий и соматических гибридов растений путем генетической
рекомбинации хромосом и генов ядра и органелл вне сексуального цикла,
например путем слияния изолированных протопластов.
Изолированный протопласт – растительная клетка, лишенная клеточной
стенки с помощью ферментативного или механического разрушения.
Цитопласт – ограниченный мембраной участок цитоплазмы, возникший
при фрагментации изолированного протопласта.
Субпротопласт – изолированный протопласт, потерявший часть цитоплазмы, сохранивший ядро.
Слияние изолированных протопластов – формирование одной клетки из
двух и более объединением их поверхностных мембран.
Культура изолированных протопластов – выращивание клеток, лишенных
стенок, в жидкой или на агаризованной среде, содержащей в качестве дополнительного компонента осмотически активное вещество (стабилизатор) в оптимальной для данного вида концентрации. При регенерации стенок изолированные протопласты превращаются в культуру клеток.
Соматический гибрид – растение, полученное путем гибридизации изолированных протопластов.
Цибрид – растение, полученное при слиянии изолированного протопласта с
цитопластом, протопластом с инактивированным ядром или с энуклеированным протопластом.
Кариотип – набор хромосом, характерных для данного вида.
Моноплоид – ядро, клетка, организм, характеризующиеся основным числом
хромосом в полиплоидной серии (символ Х).
Гаплоид – ядро, клетки, организм, характеризующиеся набором хромосом,
представляющим
половину
полного
набора,
свойственного
виду
(символ n).
39
Диплоид – ядро, клетки, организм, характеризующиеся двойным набором
гомологичных хромосом, представленным числом, характерным для данного
вида (символ 2n).
Псевдодиплоид – ядро, клетки, организм, характеризующиеся диплоидным
числом хромосом, отличающиеся от зигот данного вида по кариотипу.
Полиплоид – ядро, клетки, организм, характеризующиеся умноженным основным числом хромосом (символ 3Х, 4Х и т.д.).
Эуплоид – ядро, клетки, организм с числом хромосом, кратным Х.
Анеуплоид – ядро, клетки, организм с числом хромосом, отклоняющимся от
Х и от чисел, кратных Х.
Мутация – изменения в генетическом материале клеток путем перестройки
ДНК ядер и органелл, изменений в структуре хромосом или уровне плоидности
организма.
Рецессив – ген или генетически обусловленный признак, проявляющийся в
диплоидной клетке или организме при условии, когда оба набора хромосом
несут данные гены.
Доминант – ген, проявляющийся как признак при условии, когда гомологичные наборы имеют разные гены.
40
ПРИЛОЖЕНИЕ
Таблица 1.
Приготовление маточных растворов для среды Мурасиге-Скуга.
№
Компонент среды
Количество вещества
п.п.
Маточный раствор макросолей (г на 1 л маточного раствора)
1.
KNO3
38
2.
NH4NО3
33
3.
KH2PO4
3,4
.
4.
MgSO4 7H2O
7,4
или MgSO4 безводный
3,6
.
5.
CaCl2 2H2O
8,8
или CaCl2 безводный
6,65
Маточный раствор микросолей (мг на 100 мл маточного раствора)
6.
Na2MoO4 . 2H2O
25
.
7.
CuSO4 5H2O
2,5
8.
H3BO3
620
.
9.
MnSO4 5H2O
2410
.
или MnSO4 4H2O
2230
.
10.
ZnSO4 7H2O
860
11.
KJ
83
.
12.
CoCl2 6H2O
2,5
13.
FeSO4
557
Na2 ЭДТА
745
Таблица 2
Среда Мурасиге-Скуга (М-С) для клеточных и тканевых культур
Компоненты питательной среды
Маточный раствор макросолей
50 мл/л
Маточный раствор микросолей
1 мл/л
Fe-хеллат
5 мл/л
CaCl2
50 мл/л
Тиамин-HCl
0,1 мг/л
Пиридоксин-HCl
0,5 мг/л
Никотиновая кислота
0,5 мг/л
Мезоинозит
100 мг/л
Глицин
2 мг/л
Сахароза
30 г/л
рН 5,6-5,8
Таблица 3
41
Модифицированная питательная среда Мурасиге-Скуга для
культивирования апикальных меристем картофеля
Компоненты питательной среды
Маточный раствор макросолей
50 мл/л
Маточный раствор микросолей
1 мл/л
Fe-хеллат
5 мл/л
CaCl2
50 мл/л
Тиамин-HCl
1 мг/л
Пиридоксин-HCl
1 мг/л
Витамин В12
0,015 мг/л
Никотиновая кислота
2 мг/л
Фолиевая кислота
0,5 мг/л
Мезоинозит
100 мг/л
Гидролизат казеина
1 г/л
Аденин
40 мг/л
Пантотенат Са
10 мг/л
Рибофлавин
0,5 мг/л
Биотин
1 мг/л
Активированный уголь
10 г/л
ГК
2 мг/л
Кинетин
0,5 мг/л
Сахароза
20 г/л
Глюкоза
20 г/л
Агар-агар
7 г/л
рН 5,7-5,8
Таблица 4
Модифицированная питательная среда Мурасиге-Скуга для
микроразмножения картофеля черенкованием побегов
Компоненты питательной среды
Маточный раствор макросолей
50 мл/л
Маточный раствор микросолей
1 мл/л
Fe-хеллат
5 мл/л
CaCl2
50 мл/л
Тиамин-HCl
1 мг/л
Пиридоксин-HCl
1 мг/л
Никотиновая кислота
2 мг/л
Аденин
40 мг/л
Кинетин
0,5 мг/л
Гибберелловая кислота
2 мг/л
Пантотенат Са
10 мг/л
Продолжение таблицы 4
42
Активированный уголь
Сахароза
Агар-агар
10 г/л
30 г/л
7 г/л
рН 5,8
Таблица 5
Приготовление маточных растворов для среды Гамборга-Эвелега.
№
Компонент среды
Количество вещества
п.п.
Маточный раствор макросолей (г на 1 л маточного раствора)
1.
KNO3
60
2.
(NH4)2SO4
2,68
.
3.
MgSO4 7H2O
10,0
.
4.
NaH2PO4 H2O
3,0
.
5.
CaCl2 2H2O
3,0
Маточный раствор микросолей (мг на 100 мл маточного раствора)
6.
Na2MoO4 . 2H2O
25
.
7.
CuSO4 5H2O
7,5
8.
H3BO3
300
.
9.
MnSO4 H2O
1000
.
10.
ZnSO4 7H2O
200
.
11.
CoCl2 6H2O
2,5
12.
FeSO4
557
Na2 ЭДТА
745
Таблица 6
Среда Гамборга-Эвелега
Компоненты питательной среды
Маточный раствор макросолей
50 мл/л
Маточный раствор микросолей
1 мл/л
Fe-хеллат
5 мл/л
CaCl2
50 мл/л
Тиамин-HCl
10 мг/л
Пиридоксин-HCl
1 мг/л
Никотиновая кислота
1 мг/л
Мезоинозит
100 мг/л
2,4-Д
2 мг/л
Сахароза
20 г/л
рН 5,8
Таблица 7
Модифицированная питательная среда Мурасиге-Скуга
для клубнеобразования у картофеля.
43
Компоненты питательной среды
Маточный раствор макросолей
50 мл/л
Маточный раствор микросолей
1 мл/л
Fe-хеллат
5 мл/л
CaCl2
50 мл/л
Тиамин-HCl
1 мг/л
Пиридоксин-HCl
0,5 мг/л
Никотиновая кислота
0,5 мг/л
Аскорбиновая кислота
1 мг/л
Кинетин
0,5 мг/л
Сахароза
50 г/л
Агар-агар
7 г/л
рН 5,8-6,0
Таблица 8
№
п.п.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
Приготовление маточных растворов для среды Блейдза.
Компонент среды
Количество вещества
Маточный раствор макросолей (г на 1 л маточного раствора)
KNO3
20
KCl
1,3
KH2PO4
6
NH4NO3
20
.
MgSO4 7H2O
1,44
или MgSO4 безводный
0,7
.
Ca(NO3)2 4H2O
10,28
Маточный раствор микросолей (мг на 100 мл маточного раствора)
H3BO3
160
.
MnSO4 H2O
440
.
или MnSO4 5H2O
627
.
ZnSO4 7H2O
150
KJ
80
FeSO4
557
Na2 ЭДТА
745
Таблица 9
Среда Блейдза для каллусогенеза.
Компоненты питательной среды
Маточный раствор макросолей
50 мл/л
44
Маточный раствор микросолей
Fe-хеллат
CaNO3
Тиамин-HCl
Пиридоксин-HCl
Никотиновая кислота
Аскорбиновая кислота
Мезоинозит
2,4-Д
Сахароза
Агар-агар
1 мл/л
5 мл/л
50 мл/л
0,5 мг/л
0,5 мг/л
1 мг/л
1 мг/л
0,1 г/л
2 мг/л
20 г/л
7 г/л
рН 6,0
Таблица 10
Среда Блейдза для соматического эбриогенеза.
Компоненты питательной среды
Маточный раствор макросолей
50 мл/л
Маточный раствор микросолей
1 мл/л
Fe-хеллат
2,5 мл/л
CaNO3
50 мл/л
Тиамин-HCl
0,5 мг/л
Пиридоксин-HCl
0,5 мг/л
Никотиновая кислота
1 мг/л
Аскорбиновая кислота
1 мг/л
Мезоинозит
0,1 г/л
ИУК
0,2 мг/л
Кинетин
0,2 мг/л
АБК
0,05 мг/л
Сахароза
20 г/л
Агар-агар
7 г/л
рН 6,0
45
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бутенко Р.Г. Рост и дифференциация в культуре клеток растений // Рост
растений и природные регуляторы – М.: Наука, 1977.
2. Бутенко Р.Г. Культура клеток растений и биотехнология. – М.: Наука,
1986.
3. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии
на их основе: Учеб. пособие – М.: ФБК-ПРЕСС, 1999.
4. Гамбург К.3., Рекославская Н.И., Швецов С.Г. Ауксины в культурах тканей и клеток растений – Новосибирск: Наука, 1990.
5. Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Клеточная инженерия растений – Киев: Наукова думка, 1984.
6. Калинии Ф.Л., Бутенко Р.Г. Методы культуры тканей в физиологии растений – Киев: Наукова думка, 1980.
7. Калинин Ф.Л., Кушнир Г. П., Сарнацкая В.В. Технология микроклонального размножения растений – Киев: Наукова думка, 1992.
8. Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений –
М.: Наука, 1983.
9. Клеточная инженерия / Р.Г. Бутенко, М.В. Гусев, А.Ф. Киркин //
Биортехнология. Т. З. – М.: Высшая школа, 1987.
10. Лабораторно-практические
занятия
по
сельскохозяйственной
биотехнологии: Методические указания / Сост. Г.М. Артамонова, С.И.
Герасимова, С.В. Дегтярев, Е.З. Кочиева, Д.В. Калашников, И.К. Блиновский,
Л.И. Хрусталева. Под ред. акад. ВАСХНИЛ В.С. Шевелухи. Москва: Изд-во
МСХА, 1991.
11. Микроразмножение и оздоровление растений в промышленном плодоводстве и цветоводстве / Сб. науч. трудов ВНИИГиСП – Мичуринск, 1989.
12. Муромцев Г.С., Бутенко Р.Г., Тихоненко Т.И., Порофьев М.И. Основы
сельскохозяйственной биотехнологий. – М: Наука, 1990.