5 лекция - Учебно-методические комплексы Ташкентской
advertisement
ТАШКЕНТСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ КАФЕДРА БИОЛОГИЧЕСКОЙ И БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ЛЕЧЕБНОГО И МЕДИКО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО ФАКУЛЬТЕТОВ Тема лекции: «БИОСИНТЕЗ БЕЛКА» для студентов 2 курса лечебного, медико-профилактического факультетов Рассмотрена и одобрена на учебно-методическом заседании кафедры от 28 августа 2006 г. протокол №1 Составитель: проф. Собирова Р.А., Иноятова Ф.Х. Ташкент - 2006 г. 2 1. Тема лекции: Биосинтез белка 2. Для студентов 2 курса лечебного, медико-профилактического факультетов. 3. Ознакомить студентов основными этапами биосинтеза белков, механизмами регуляции этих процессов. Изучение данной темы даст возможность студентам понять основные механизмы развития наследственных заболеваний. Нуклеиновые кислоты совместно белками лежат в основе жизни, являются материальными субстратами жизни. Согласно современному определению жизни: “Жизнь представляет собой способ существования белковых тел и нуклеиновых кислот, содержанием которого являются непрерывный обмен веществ между организмом и окружающей средой, процессы отражения и саморегуляции, направленные на самосохранение и самовоспроизводство организмов”. • • • • • • • Регуляция действия генов и дифференцировка клеток. 4. Вопросы рассматриваемые на данной лекции: 4.1. Генетический код и его состав. Значение опытов 10мин Ниренберга и Маттея в выяснении генетического кода. 4.2. Стадии биосинтеза белка, посттрансляционные изменения. 20мин. 4.3. Регуляция биосинтеза белка, ингибиторы биосинтеза белка. 4.4. Регуляция действия генов и дифференцировка клеток. 4.5. Молекулярные основы генетики. Молекулярные механизмы наследственных заболеваний. 4.6. Повреждение ДНК и его репарация. 4.7. Полиморфизм белков. Тканевая несовместимость. 20мин. 10мин. 10мин. 20мин 10мин. 5. Текст лекции: 5.1. Генетический код и его состав. Значение опытов Ниренберга и Маттея в выяснении генетического кода. Концепция один ген – один белок (один цистрон – одна полипептидная цепь) возникла приизучении наследственных метаболических дефектов, которые развиваются в результате отсутствия гена контролирующего синтез соответствующего фермента. К этим наследственным заболеваниям относятся – алкаптонурия, фенилкетонурия, тирозиноз, альбинизм. В каждом из этих случаев изменение одного гена 3 (мутация) приводит к метаболическому дефекту. Мутация одного гена ведет к утрате активности одного специфического фермента. Это нашло отражение в концепции “один ген один фермент”. Такие исследования были проведены на мутантных вирусах, бактерий, высших растений и животных. В настоящее время эта концепция переформулирована: “один ген – одна полипептидная цепь”, т.к. многоцепочечные белки синтезируются несколькими генами, локализованными в разных хромосомах. ДНК и полипептидная цепь коллинеарны. Это означает, что определенные участки ДНК, кодирующие включение каждой из аминокислот в белок следуют в том порядке, что и аминокислоты в белке. Это же конечно справедливо и для РНК. Изучением первичной структуры триптофансинтетазы установлена строгая коллинеарность аминокислотной последовательности и генетической карты. Существует 3-х этапная передача генетической информации: 1.Репликация – копирование ДНК с образованием идентичной дочерной ДНК. 2.Транскрипция переписывание мРНК генетической информации с ДНК. 3.Трансляция перевод генетической информации с “языка” иРНК на “язык” белковой структуры. Генетический (биологический) код. Нуклеиновые кислоты образованы чередованием нуклеотидов 4-типов, а белки построены из 20 типов аминокислот. Необходимо было выяснить закон, определяющий коррекцию между нуклеиновыми основанями и аминокислотами. В принципе можно было предположить, что каждой аминокислоте в полипептидной цепи соответствует один или несколько нуклеотидов в ДНК или мРНК. Если бы каждому нуклеотиду соответствовала какая-то одна минокислота, система иогла бы кодировать только четыре типа аминокислот. Если же для кодирования одной аминокислоты было бы достаточно комбинации 2-х нуклеотидов, то кодирующая емкость системы увеличилась бы до 16 аминокислот (42 =16). И наконец, если для кодирования одной аминокислоты было необходимо комбинация уже 43 =64 аминокислоты. Таким образом, для получения необходимого числа комбинаций для 20 аминокислот биологические коды следует составлять из 3-х нуклеотидов (триплеты). Крику удалось экспериментально доказать, что каждая аминокислота закодирована одним или несколькими триплетами иРНК. Смысл кодона: опыт Ниренберга и Маттея (1961) с поли-У в качестве мРНК. В бесклеточные системы E.Coli Ниренберг и Маттей добавили поли– U, синтезированную при помощи полинуклеотидфосфорилазы и одну из содержавших радиоактивную метку аминокислот. Измерение радиоактивности белковых осадков показало, что радиоактивным был осадок только той пробы, где в качестве аминокислоты был добавлен фенилаланин14 С. Это дало основание считать, что кодирующим триплетом для фен служит УУУ. Точно также удалось показать, что триплет ЦЦЦ кодирует пролин, 4 триплет ААА –лизин. Таким образом, с помощью синтетических полинуклеотидов удалось получить полимеры аминокислот: поли-фен, полипро, поли-лиз. Полинуклеотидфосфорилаза – бактериальный фермент, обнаружен в 1955 г Очао и Грюнберг-Манаго, катализирует синтез полинуклеотидов из нуклеозиддифосфатов, например из УДФ поли-У. Биологическая роль данного фермента еще неясна, но он оказался полезным для расшифровки генетического кода. Таблица кода и его особенности: Характерными особенностями генетического кода являются: 1. Код является триплетным. 2. Множественным или вырожденным – т.е. для одной аминокислоты имеется несколько кодов (от 1 до 6 триплетов). 3. Непрерывным, то есть отсутствуют “знаки препинания”, поэтому счтывание должно начаться с “правильного” места. 4. Универсальным – т.е. одним и тем же для организма любого вида. 5. Существует всего 61 смысловые триплеты и 3 бессмысленные триплетные кодоны: УГА, УАА, УАГ – они используются для сигналов окончания синтеза (терминация) полипептидной цепи – стоп кодоны. Принцип комплементарности является характерным для нуклеотидов, однако между нуклеотидами и аминокислотами комплементарности не имеется. Поэтому аминокислоты не могут вставляться в полипептидную цепь прямо с помощи кодонами. Наличие “адапторов” необходимых для переноса аминокислот в соответствующие участки иРНК было предсказано еще до открытия тРНК. В 1958 г Крик высказал предположение о том, что тРНК является молекулярным адаптором, в который “вставляется” аминокислота и она становится способной связываться со своим триплетным кодом. В молекуле тРНК имеется акцепторный участок, связывающий аминокислту. Имеется также антикодоновая петля содержащая много модифицированных нуклеотидных оснований. Антикодоновый участок включает трплетную последовательность, комплементарную кодону. Нуклеотидная последовательность антикодона в тРНК такова, что обеспечивает образование специфических водородных связей с соответствующим кодоном мРНК. Благодаря этому транспортируемая аминокислота может занять правильное положение в растущей полипептидной цепи. 5.2. Стадии биосинтеза белка, посттрансляционные изменения. Синтез белка протекает в пять основных этапов: 1. Активация аминокислот. 2. Инициация – начало полипептидной цепи. 3. Элонгация – удлинение полипептидной цепи. 4. Терминация – завершение синтеза полипептидной цепи. 5. Сворачивание и процессинг. 5 Подробно остановимся на каждом из этих этапов отдельно. 1. Активация аминокислот. Этот этап протекает в цитоплазме, каждая из 20 аминокислот ковалентно присоединяется к определенной тРНК, используя для этого энергию АТФ, необходимы ионы магния. Реакция каталисируется ферментом амино-ацил-тРНК-синтетазой, их 20, каждый из них специфичен по отношению к какой-то одной аминокислоте и к соответствующей тРНК. А) R-СН2-СН-СООН +АТФ R-СН2-СН-СОО-АМФ + РР NН2 NН2 Аминокислота аминоациладенилат Б) R-СН2-СН-СООАМФ +тРНК R-СН2-СН-СОО-тРНК + АМР NН2 NН2 аминоацилтРНК 2. Инициация полипептидной цепи. МРНК, содержащая информацию о данном полипептиде, связывается с малой субчастицей рибосомы, а затем и с инициирующей аминокислотой, прикрепленной к соответствующему тРНК; в результате образуется инициирующий комплекс. тРНК, несущая инициирующую аминокислоту, взаимодействует по принципу комплементарности с находящимся в составе мРНК особым триплетом, или кодоном, который сигнализирует о начале полипептидной цепи. Осуществлению этого процесса, который требует участия гуанозинтрифосфата (ГТФ) и 3 факторов инициации – IF-1, -2, -3. В первой стадии инициации IF-3 связывается с 30S-рибосомной субчастицей и это препятствует объединению 30S и 50S субчастиц. Затем к 30S субчастице присоединяется мРНК таким образом, что инициирующий кодон мРНК АУГ сявзывается с определенным участком 30S-субчастицы. Во второй стадии на инициирующий кодон попадает ГТФ связанный с IF-2 и Nформилметионин-тРНКf met. Функция IF-1 не выяснена. В третей стадии образованный взаимодействует с 50S рибосомной субчастицей. В это время ГТФ гидролизуется до ГДФ+Р. Освобождаются факторы инициации IF-3, IF-2, ГДФ и Р. Образуются функционально активная 70S рибосома, называемая инициирующим комплексом. В рибосоме имеется 2 участка. 1. А-участок – аминоацильный 2. Р-участок – пептидильный. Инициирующий фмет-тРНК может связываться только с Р участком. Все остальные вновь поступающие амино-ацил-тРНК присоединяются к Аучастку, тогда как Р-участок – это такое место рибосомы с которого уходят «пустые» (те освободившиеся от аминокислот) тРНК. 3. Элонгация. 6 Происходит удлинение полипептидной цепи за счет последовательного ковалентного присоединения аминокислот. Протекает в 3 стадии: 1. Происходит связывание второй амино-ацилтРНК, которая поступает в рибосому в комплексе с фактором элонгации Тu, содержащим связанный ГТФ. ГТФ гидролизуется, образующийся ГДФ вновь превращается в ГТФ в ходе реакции катализируемый фактором элонгации Тs 2. Происходит образование пептидной связи между аминокислотами, чьи тРНК расположены в А и Р участках рибосомы. Катализируется пептидилтрансферазой и образуется дипептидилтРНК в А-участке, а в Р участке остается «пустая» тРНКfmet 3. Рибосома перемещается вдоль иРНК по направлению к 3 концу на один кодон. ПРоисходит перемещение дипептидитРНК из А участка в Р участок, в это время свободная тРНК отделяется от Р участка и уходит обратно в цитозоль. Теперь в А-участке находится третий кодон мРНК, а второй кодон оказывается в Ручастке. Передвижение рибосомы вдоль мРНК называется транслокацией (транслоказа, или фактор элонгации Q участвует) и сопровождается расходом ГТФ. Терминация и высвобождение. После завершения синтеза полипептидной цепи, о котором сигнализирует терминирующий кодон мРНК, происходит высвобождение полипептида из рибосомы при участии особых «рилизинг» факторов R1, R2, R3. Терминирующими кодонами являются УАА, УАГ, УГА. Чтобы принять свою нативную биологическую активную форму, полипептид должен свернуться, образуя при этом определенную пространственную конфигурацию. До или после сворачивания новосинтезированный полипептид может претерпевать процесинг, осуществляемый ферментами и заключающийся в удалении инициирующих аминокислот, в отщеплении лищних аминокислотных остатков, во введении в определенные аминокислотные остатки фосфатных, метильных, карбоксильных и других групп, а также в присоединении олигосахаридов или простетических групп. Первичная структура белка может претерпевать изменения в процессе формирования молекуля его или его субъединицы. При этом полипептидные цепи могут расщепляться или укорачиваться. Посттрансляционная модификация некоторых полипептидных цепей заключается в фосфорилировании и ацтилировании ряда аминокислотных остатков. Некоторые ферменты, в особенности те, что локализованы на поверхности клеток, соединяются с полисахаридами, а белки мембран образуют комплексы с липидами. Посттрансляционное расщепление полипептидов в той или ионй форме свойственно многим белкам. Посттрансляционные изменения белков может заключаться в расщеплении различных продуктов трансляции. Эти процессы распространены очень широко. Например активация ряда 7 пищеварительных ферментов происходит путем разрезания белковпредшественников. Известно, что оба субъединицы инсулина являются продуктами расщепления единого полипептида –проинсулина. Более того, созревание первичного продукта трансляции происходит через несколько последовательных стадий протеолитического расщепления. У млекопитающих показано существование предшественника проинсулина (препроинсулин), содержащего «лишние» пептиды по сравнению с проинсулином. Точно также субъедиицы коллагена образуются в результате расщепления проколлагена. Для образования конформации многоцепочечных белков также нет специальных генетических факторов; их образование является следствием генетической информации, выраженной в аминокислотной последовательности полипептидных цепей (например, гемоглобин, альдолаза, ГДГ и др.). Неактивный белок-предшественник таких белков как инсулин, химотрипсин и плазмин синтезируется в виде единой цепи. Образование многоцепочечных активных форм является результатом частичного протеолиза. Укладка и самосборка сложных глобулярных белков, а также мультиферментных комплексов (ПДГ комплекс) также происходит без специальных генетических факторов. Они происходят благодаря аминокислотной последовательности. В самом деле, основная роль генов заключается в кодировании аминокислотной последовательности в полипептидных цепях, а сборка должна быть преимущественно самосборкой, то есть без дальнейшего вмешательства генетических детерминант. Включение небелковых компонентов в белковую молекулу происходят без прямого генетического контроля. Например, образование гемоглобина происходит путем спонтанной рекомбинации гема с глобином без генетического контроля. Аналогичным образом присоединяются многие простетические группы, кофакторы (например флавины, гем, пиридоксальфосфат, НАД, НАДФ или ионы металлов) с апоферментом с образованием активного фермента. Модификация аминокислот в полипептидной цепи путем фосфорилирования, метилирования, гликозилирования и т.д. происходит во время или после окончания образования полипептидной цепи. Ферменты, катализирующие эти модификации иих специфичность, находятся под генетическим контролем. Модификация ферментов играет важную роль в регуляции их активности. Например, фосфорилазы и глутаминсинтетазы. Таким образом, появление вторичной, третичной и четвертичной структур белка не требует особых генетических контрольных факторов или энзимов. Специальная пространственная организация белков определяется 8 первичной структурой и является термодинамически свободным процессом, протекающим самопроизвольно. 5.3. Регуляция биосинтеза белка, ингибиторы биосинтеза белка. В живых клетках существует оптимальное соотношение между количествами различных белков и ферментов. Это осуществляется путем регуляции биосинтеза белков. Гипотеза механизма регуляции синтеза белков основана на материале наблюдений индукции и репрессии ферментов в бактериальных клетках. В присутствии конечных продуктов концентрация фермента снижается и это явление называется репрессией фермента (индукторы – репрессоры). В конце 50-х годов Жаков и Моно изучили генетические механизмы индукции и репрессии ферментов. В генетическом аппарате клетки различают сообщества структурных генов, название опероном, причем каждый ген отвечает за синтез одного фермента. Деятельность оперона контролируется геном-оператором, который разрешает или запрещает образование на генах и-РНК. Этот участок получил название промотора, а вся совокупность описанных участков (промотор, оператор и структурные гены) именуются транскриптоном. Функция гена-оператора контролируется пространственно изолированием от него гена-регулятора, который транскрибирует иРНК, необходимую для синтеза белка-репрессора на рибосомах. Белок –репрессор может специфически связываться с геном оператором и регулирует функции структурных генов. Согласно гипотезе Жакоба и Моно в случае индукции фермента белок-репрессор связывается с индуктором и образует комплекс репрессор-индуктор, который не может подавлять активность генаоператора. Это приводит к активации транскрипции структурного гена и синтеза иРНК и последующего синтеза фермента на рибосоме. В случае репрессии фермента конечный продукт ферментативной реакции (корепрессор) образует комплекс с репрессором – репрессоркорепрессор, который связывается с геном-операторм и блокирует транскрипции структурного гена и биосинтеза соответствующего фермента. Картина регуляции генов в клетках выоскоорганизованных организмов значительно усложняется. Структура транскриптона в клетках эукариотов в ьолшей части занята участком, выполняющим служебные функции, а меньшая часть принадлежит структурным генам. Если последняя зона кодирует белки, то первая зона взаимодействует с белкамирепрессорами и через этот механизм управляет транскрипцией структурных генов. Образуемая на таком транскриптоне с помощью ДНК-зависимыхРНК-полимераз иРНК содержит значительный отрезок полинуклеотидной цепи, не несущей информации синтезируемом белке. Поэтому эта гигантская молекула иРНК (называемая про-иРНК) распадается в ядре, теряя ненесущую информацию часть о синтезируемом белке, а отщепивщаяся иРНК переходит в цитоплазму и участвует в синтезе белка на рибосоме. Полагают, что такое строение транскриптона расширяет 9 возможности для регуляции генов, т.к. одним транскриптоном могут управлять разные регуляторные белки, а с другой стороны, один белокрегулятор может одновременно регулировать функцию нескольких транскриптонов, имеющих общую зону управления. Описанная система регуляции синтеза белков является лишь частью сложной системы регуляции биосинтеза белков сложноорганизованных организмов. В организме регуляция осуществляется не только на уровне макромолекул, но и на уровне субклеточных структур (формирование полисом, роль мембран), на уровне клетки (ядерно-цитоплазменные отношения), на уровне органа и организма (нейрогуморальная регуляция). На синтез белков и ферментов действуют в основном стероидные гормоны. Это действие проявляется на уровне генома, стимулируя синтез специфических РНК и белков. Стероидные гормоны проникают внутрь клеток-мишеней, где соединяются со своими рецепторными белками. Эти рецепторы меняют свою конфигурацию и вместе с гормонами проходят через ядерную мембрану, а затем в хроматине вступают в контакт с негистоновыми белками. В результате таких контактов осуществляются воздействия на ДНК, на РНК-полимеразу, что в конце концов приводит к изменению характера синтеза некторых РНК и в частности иРНК. Под влиянием гормонов, как правило, происходит активация синтеза РНК, иногда может иметь место его ингибирование (например, гидрокортизон в тимусе). Регуляция процесса транскрипции осуществляется различными белками хроматина (гистоновыми и негистоновыми). Гистоны путем фосфорилирования за счет АТФ утрачивают свою ингибиторную способность. Негистоновые белки, связанные с ДНК препятствуют ингибированию синтеза РНК гистонами. Таким образом, регуляция транскрипции осуществляется гистонами, котрые ингибируют синтеза РНК. Негистоновые белки препятствуют эту ингибицию. Пострансляционная регуляция осуществляется на уровне инициации, элонгации и терминации, которые протекают с участием различных белковых факторов, ингибиторов, действующие на иРНК или на процесс трансляции. В настоящее время в медицинской практике применяются многие антибиотики, которые избирательно тормозят процессы биосинтеза нуклеиновых кислот и белков у бактерий не оказывая влияния на организм человека. Следовательно, антибиотики действуют на коючевые химические реакции синтеза белков и нуклеиновых кислот. Одним из мощных ингибиторво белкового синтеза является пуромицин. Из-за структурного сходства пуромицина с концевым остатком адениловой кислоты в аминоацил-тРНК он легко взаимодействует с 10 пептидил-тРНК с образованием пептидилпуромицина. В результате этого вызывается обрыв элонгации пептидной цепи и свободные пептидилпуромицины освобождаются из рибосомы. Ингибирование биосинтеза белка происходит актиномицином Д, обладающим противоопухолевым действием. Он оказывает тормозящее действие на синтез всех типов клеточной РНК и в особенности мРНК. Актиномицин ингибируя ДНК-зависимую РНК-полимеразу прекращает транскрипцию ДНК. Рифамицин – антибиотик, применяемый для лечения туберкулеза ингибирует ДНК-зависимую-РНК-полимеразу бактерий. Ингибиторами биосинтеза белков является также ряд других антибиотиков, применяемых при лечении тифозных инфекций. Так, хлорамфеникол ингибирует пептидилтрансферазную реакцию (в стадии элонгации), циклогексамид является ингибитором транслоказы. Противотуберкулезные антибактериальные антибиотики (стрептомицин и неомицин) вызывают ошибки в трансляции мРНК (например кодон УУУ вместо фенилаланина начинает кодировать лейцин – в результате образуется аномальный белок, что приводит к гибели бактерий). Тетрациклин ингибирует синтез белка в 70S рибосоме, тормозя связывание аминоацил-тРНК с аминоацильным центром в 50S субъединице рибосомы. Пенициллин не является истинным ингибитором синтеза белка, его антибактериальный эффект связан с торможением синтеза гексапептидов, входящих в состав клеточной стенки. Механизм их интеза отличается от рибосомального механизма синтеза белка. Эритромицин и олеандомицин тормозят активность транслоказы в процессе трансляции в 80S-рибосомах. Нарушение и выпадение любого звена, участвующего в синтезе белка, почти всегда приводит к развитию патологии, причем клинические проявления болезни будут определяться природой и функцией белка, синтез которого оказывается нарушенным. 5.4. Регуляция действия генов и дифференцировка клеток. 1.Адаптация организмов к различным воздействиям окружающей среды осуществляется, в частности, путем изменения экспрессии (активности) генов. Этот процесс, в деталях изученный на бактериях и вирусах, включает взаимодействие специфических белков с участками ДНК в непосредственной близости от стартового участка транскрипции. Эукариотические клетки используют этот же принцип, хотя в регуляции экспрессии генов реализуются и некоторые другие механизмы. 2.У прокариотов определенные белки связываются с регуляторными участками оперона и предотвращают или усиливают связывание РНК-полимеразы с промотором. Если оперон регулируется по механизму индукции 11 (например, лактозный оперон), то в отсутствие индуктора (лактозы) белокрепрессор связан с оператором (рис. 3.19). А поскольку участки оператора и промотора перекрываются, то присоединение ре-прессора к оператору препятствует связыванию РНК-полимеразы с промотором и транскрипция структурных генов оперона не идет. Когда индуктор появляется в среде, он присоединяется к белку-ре-прессору, изменяет его конформацию и снижает сродство к оператору. РНК-полимераза связывается с промотором и транскрибирует структурные гены. При регуляции оперона по механизму репрессии (например, гистидиновый или триптофановый оперо-ны) белокрепрессор не имеет сродства к оператору (рис. 3.20). Когда к белкурепрессору присоединится небольшая молекула — корепрессор (гастидин или триптофан), то в результате происходящих в белковой молекуле конформационных изменений комплекс белок-репрессор—корепрессор приобретает сродство к оператору и прекращает транскрипцию. 3. В клетках млекопитающих существуют два ви да регуляции биосинтеза белков: • кратковременная, обеспечивающая адаптацию организма к возможным изменениям окружающей среды; • длительная, стабильная, определяющая диф-ференцировку клеток и разный белковый состав органов и тканей. 4. В хроматине разных органов и тканей наряду с огромными транскрипционно неактивными или стабильно репрессированными участками имеются активные или потенциально активные участки. За малым исключением (лимфоциты), каждая клетка организма содержит один и тот же набор генов. Существование специализированных органов и тканей зависит от дифференциальной экспрессии генов, это означает, что в дифференцированных клетках разных тканей транскрибируются разные участки хроматина. Например, ДНК, содержащая набор генов (3-глобина, находится в области активного хроматина в ретикулоцитах, но в области неактивного хроматина в мышечных клетках. Доступность для транскрипции хроматина зависит от: • пространственной укладки: конденсированное состояние обнаруживается в неактивных областях, а разрыхленное, чувствительное к действию нуклеаз — в активных; метилирования дезоксицитидина в последовательностях 5-тСрО-ДНК, которое сильно меняет конформацию хроматина и препятствует активной транскрипции; связывания с гистонами и образования нук-леосом, которые также снижают транскрипционную активность ДНК. 5.Адаптивная регуляция у высших организмов отличается от регуляции транскрипции у прокариотов многообразием сигналов, которые контролируют не только начало процесса на молекуле ДНК, но и частоту, с которой он происходит (рис. 3.21). ТАТА-участок промотора присоединяет ТА-ТАсвязывающий белок, факторы транскрипции А и В, которые обеспечивают 12 взаимодействие с РНК-полимеразой и определяют стартовую точку транскрипции. Минимальный синтез мРНК становится возможным после связывания РНК-полимеразы с транскрипционными факторами Р, Е, Н. Если, кроме указанных компонентов, с ТАТА-связывающим белком образуют комплекс белки, присоединенные к регуляторным участкам ДНК, то скорость транскрипции меняется. Она возрастет, если это будут белки-активаторы, обеспечивающие взаимодействие с энхансерами (усилителями), и снижается, если к ТАГА-связывающему белку присоединится белок, взаимодействующий с участком сайленсера (тушителя транскрипции). Регуляторные зоны ДНК — энхансеры и сайленсеры — различны по числу и расположению на молекуле ДНК для разных генов в разных тканях, т.е. являются тканеспе-цифическими характеристиками. Они могут располагаться за тысячи нуклеотидных пар от стартовой точки транскрипции перед, после или внутри гена, связывать комплексы белков с метаболитами или гормонами и влиять на конформацию гена. 6.Амплификация генов. Среди повторяющихся последовательностей ДНК обнаружены сотни копий генов рибосомной и транспортной РНК. Такое количество копий генов в геноме гамет передается от поколения к поколению. В то же время обнаружена стимуляция амплификации специфических участков ДНК под влиянием внешних воздействий, например высоких доз лекарственных препаратов. Так, при лечении онкологических заболеваний у пациентов, получающих метотрексат — аналог фолиевой кислоты, в опухолевых клетках наблюдается многократная амплификация гена дигидрофолатредуктазы, на подавление активности которой направлено действие метотрексата. 5.5. Молекулярные основы генетики. Молекулярные механизмы наследственных заболеваний. Естественный отбор и биологическая эволюция невозможны без генетической изменчивости, которая возникает за счет мутаций и рекомбинаций в процессе мейоза. В последнем случае происходит обмен участками ДНК между гомологичны ми хромосомами родителей. Мутации — это нерепарированные изменения первичной структуры ДНК, появляющиеся в молекуле в ответ на дефекты в ра боте ДНК-полимераз или ДНК-репарирующей системы, воздействия внешней и внутренней среды. 2. Точечные мутации в основном бывают трех видов: • замены (это наиболее распространенный тип повреждений молекулы ДНК); • вставки; • делеции (или выпадения) нуклеотидов (табл. 3.11). Каждый тип мутации вызывает разные последствия. Так, замена нуклеотида: • может быть «молчащей» и не проявиться в белке, если кодирующий триплет, в котором находится мутантный нуклеотид, из-за вырожденности кода обеспечивает включение в белок той же аминокислоты, что исходный кодон; • может сопровождаться включением в белок одной измененной 13 аминокислоты (миссенс-му-тация). (Такого типа мутации возникают при действии алкилирующих агентов.) Алкильная группа присоединяется к N7 пуринового кольца гуанина, изменяя его ионизацию и характер связывания с другим нуклеотидом в комплементарной паре. В результате против алкилированного гуанина встает тимин, а следовательно, в последующем поколении пара С-С заменяется на А-Т). • может привести к образованию «терминирующего» кодона (нонсенсмутация), на котором работа белоксинтезирующего аппарата будет остановлена и образуется укороченный вариант белка. Делеции и вставки также приводят к неоднозначным результатам: • если включается или выпадает один нуклеотид или участок ДНК, в котором число нуклеотидов не кратно 3, то происходит сдвиг рамки считывания информации и при трансляции вся информация, расположенная за местом мутации, читается неверно. Возникает белок, у которого за местом мутации расположена случайная последовательность аминокислот. Такого типа мутации вызывают вещества, ин-теркалирующие между азотистыми основаниями молекулы ДНК; если выпадает или включается в ДНК участок с длиной цепи, кратной 3, то сдвига рамки считывания информации не происходит (деления или вставка без сдвига рамки считывания информации). Белок, который зашифрован такой матрицей, будет либо укорочен (при де леции), либо удлинен (при вставке) на одну или несколько аминокислот. 3.В большинстве случаев мутации влияют на экспрессию или структуру генов, что проявляется в снижении количества или изменении структуры белкового продукта, а следовательно, и его функциональной активности. Иногда снижение или полное отсутствие белка является результатом мутаций в регуляторных участках генов. 4.Мутации в половых клетках передаются по наследству и могут проявляться в фенотипе потомства как наследственная болезнь, связанная со структурным и функциональным изменением белка. В соматических клетках мутации могут вызвать различные функциональные нарушения, такие, как непереносимость некоторых пищевых и лекарственных веществ, предрасположенность к определенным заболеваниям, преждевременное старение, а иногда трансформацию клеток и развитие опухолей. 5.Нарушение последовательности пуриновых и пиримидиновых оснований в геноме и невозможность его восстановления ферментами репарации приводит к мутациям. 6.Около 20% беременностей, особенно в ранних периодах, в эмбрионах хромосом появляются структурные нарушения. 90% их завершается спонтанными абортами или нарушением формирования плода. Наследственные болезни • Первичные мутации в основном в гетерозиготном положении и не приводят к развитию патологии. Однако они способствуют распространению мутации в популяции. 14 • Если мутации имеются у обоих родителей, то они передаются поколению в виде гомозиготы и приводят к развитию патологии. • У 2-4% новорожденных выявляются наследственные заболевания, которые в 40% являются причиной смерти новорожденных или детской инвалидности. • 31% генных мутаций приходится на ферменты. • Для некоторых заболеваний характерна наследственная предрасположенность. Например, атеросклероз, сахарный диабет, семейный полипоз, подагра, шизофрения и др. Амплификация генов, независимые мутации в копиях и рекомбинации приводят к дивергенции (расхождению) свойств соответствующих белков. Результатом этих процессов является усложнение генома в филогенезе и образование семейств родственных белков с близкой аминокислотной последовательностью и функциями или полиморфных разновидностей одного и того же белка. Каждый индивидуум может иметь только два варианта любого белка, тогда как в популяции число вариантов может быть огромно (так, по всем аллелям НЬА популяция людей образует более 600 генетически различающихся групп). Полиморфизм белков настолько велик, что можно говорить о биохимической индивидуальности каждого человека. 5.6. Повреждение ДНК и его репарация. 1.Молекула ДНК постоянно подвергается разнообразным изменениям, как спонтанным, так и индуцируемым химическими соединениями, радиацией и ультрафиолетовым облучением. 2.Причины спонтанных повреждений: • Ошибки репликации. • Депуринизация. Результатом депуринизации является появление в ДНК остатков дезокси-рибозы, лишенных основания. Дезаминирование. При дезаминировании ци-тозин превращается в урацил, аденин — в ги поксантин, а гуанин — в ксантин. Чаще всего дезаминируется цитозин. 3. Причины индуцируемых повреждений: • Некоторые химические вещества могут алки-лировать ДНК, например метилировать основания ДНК. Наиболее часто встречающиеся продукты алкилирования — 6-метилгуанин, 7-метилгуанин, 3-метиладенин. Главным нарушением, возникающим под действием ультрафиолета, является образование пиримидиновых димеров из 2 соседних пири-мидинов цепи ДНК. 4. Поврежденные основания ДНК обнаружива ются и удаляются ДНК-1Ч-гликозилазами. Фермен ты гидролитически расщепляют Ы-гликозидную связь между поврежденным основанием и остат ком дезоксирибозы. 15 5. Дальнейший ход репарации может идти по од ному из двух путей: • Фермент ДНК-инсертаза может присоединять к дезоксирибозе основание в соответствии с правилом комплементарности. Описана ДНК-инсертаза, присоединяющая пуриновые основания. • Эндонуклеаза определяет место повреждения (дезоксирибоза без основания) и гидролизует 3',5'-фосфодиэфирную связь (рис. 3.6). Экзонуклеаза находит место разрыва цепи и удаляет поврежденный участок. ДНК-полимераза Р достраивает поврежденную нуклеотидную цепь (ликвидирует брешь); матрицей служит сохранившаяся цепь ДНК. ДНК-лигаза соединяет неповрежденный и вновь синтезированный участки цепи ДНК. 6. Репарация возможна благодаря существова нию 2 копий генетической информации. Если од новременно повреждается комплементарная пара нуклеотидов, репарация невозможна. 7. Репарация необходима для сохранения генети ческого материала на протяжении всей жизни ор ганизма (сохранение структуры генома). Все фер менты постоянно активны, т.е. процесс идет непрерывно. Снижение активности ферментов ре парации приводит к накоплению повреждений (мутаций) в ДНК. 4.7. Полиморфизм белков. Тканевая несовместимость. В ходе эволюции в пределах одного биологического вида замены аминокислотных остатков могут приводить к возникновению разных белков, вы полняющих родственные функции и имеющих гомологичные последовательности аминокислот. Они имеют поразительно сходные конформации: количество и взаиморасположение а-спиралей и/или р-структур, большинство поворотов и изгибов полипептидных цепей похожи или идентичны. Белки, имеющие гомологичные участки полипептидной цепи, сходную конформацию и родственные функции, выделяют в семейства белков. Примеры семейств белков: - сериновые протеиназы; - семейство иммуноглобулинов; - семейство миоглобина. Сериновые протеиназы — семейство белков, выполняющих функцию протеолитических ферментов. К ним относятся пищеварительные ферменты — химотрипсин, трипсин, эластаза и многие факторы свертывания крови (см. соответствующие разделы). Эти белки имеют в 40% положений идентичные аминокислоты и 16 • • • • • • • • • • • • • очень близкую конформацию (рис. 1.22). Некоторые аминокислотные замены привели к изменению субстратной специфичности этих белков и возникновению функционального многообразия внутри семейства. Резюме. Большинство белков произошло от ограниченного числа предковых генов. Каждый ген характеризуется определенной изменчивостью. В процессе филогенеза усложнение генома протекало в 2 направлениях: удвоение или мутации в них. Распространение их в популяции привело в фенотипической гетерогенности и полиморфизма белков, т.е. появлению белков, выполняющих одинаковые или схожие функции. Существует 2 типа полиморфизма белков: Вследствие схожести локусов в геноме появление неаллельных генов (HbA, HbA2, HbF). Множественно аллельные гены (HbA, HbS). Тканевая несовместимость Внутривидовая специфичность и тканевая несовместимость связана с HLA системой (лимфоцитарный антиген человека). Он делится на 2 класса: I класс – гетеродимерные белки, содержаться во всех ядросодержащих клетках. Их α1 и α2 домены распознают антигены, локализованные на внешней поверхности клетки. II класс – гетеродимерные белки, содержаться в В-клетках, Т-хелперах, отсутствуют в Т-киллерах и макрофагах. Домены их α- и β-цепей связываются с антигенами. Они обладают высоким полиморфизмом и определяют клеточную несовместимость. Полиморфизм белков настолько высок, что определяет биохимическую индивидуальность человека. Генная инженерия Применение ДНК-полимеразной реакции в медицине (ПЦРдиагностика). Первичная структура ДНК разных организмов различна. Находя определенный праймер для ДНК возбудителей заболеваний можно провести гибридизацию. Например, ПЦР-диагностика позволяет определить наличие вирусов гепатита В и С, различных внутриклеточных инфекций в организме человека. Изучение генома человека. Для этих целей используются специальные праймеры. Можно определить различные наследственные заболевания или предрасположенность к ним. Например, определение филадельфийской хромосомы у больных с хроническим миелолейкозом, специфического белка, предрасполагающего к развитию семейного полипоза и других заболеваний. 6.Примеры из практики. 17 6.1. Для того, чтобы данный материал был понятен для студентов необходимо привести несколько примеров наследственных заболеваний, встречающихся в детском возрасте: зайчья губа, волчья пасть и другие; 6.2. На примере развития мутаций объяснить механизм развития наследственных заболеваний. 6.5. На примере универсальности кода разъяснить студентам о единстве происхождения всех форм жизни на Земле. 7. Демонстрационный материл: Модель ДНК, таблицы - кода, схема строения тРНК; этапы синтеза белка, регуляция синтеза белка. 8. Заключение На основани вышеизложенного нуклеиновые кислоты и белки можно назвать информационными молекулами. При биосинтезе новых молекул нуклеиновых кислот и белков носителями такой программы являются нуклеиновые кислоты; в этой роли их называют матрицами. Матрица в ходе матричного синтеза не расходуется и может использоваться многкратно. 9. Вопросы к аудитории: - Какие 3 этапа передачи генетической информации различают? - Что такое репликация? - Что такое транскрипция? - Какие изменения происходят при созревании РНК? - Какова функция мяРНК? - Какой белок переносит иРНК через ядерную мембрану? - Перечислите этапы синтеза белка? - Какие изменения происходят с белком на стадии созревания? 10. Использованная литература: 1. Николаев А.Я. Биологическая химия. Москва, 1989. 2. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. Москва, 1990. 1. Николаев А.Я. Биологическая химия. Москва, 1989. 2. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. Москва, 1990. 3. Ленинжер А. Биохимия,1-3т, Москва, 1990 4. Мельцер Д. Биохимия, 1-3т, Москва, 1990 5. Срайер Л, Биохимия,1985 6. Строев Биохимия, 1981 7. Уайт и др. Биохимия, 1983 8. Хорст А. Молекулярные основы патогенеза болезней, 1982