ДНК-метилтрансфераза
advertisement
Методы биологических исследований Методы биологических исследований: CFSE - это вещество, известное также под названием CFDA-SE, представляет собой интернализуемую флуоресцентную метку, способную пассивно проникать внутрь клетки. Само по себе это вещество бесцветно и не флуоресцирует до тех пор пока его ацетатные группы не будут расщеплены внутриклеточными эстеразами. После контакта с эстеразами CFSE превращается в сильнофлуоресцирующее вещество. Сукцинимидильные группы данного эфира реагирует с внутриклеточными аминами, формируя флуоресцентный конъюгат с белками, который стабилен, хорошо сохраняется и может быть зафиксирован ацетальдегидом. Лишний неконъюгированный реактив и побочные продукты пассивно диффундируют во внеклеточной питательной среде, откуда они могут быть отмыты. Конъюгат красителя с белками, который формируется в меченных клетках, сохраняется этими клетками в течение всего развития, а также во время мейоза. Поэтому CFSE может быть использован в in vivo исследовании для отслеживания роста и деления клеток. Метка передается дочерним клеткам или после клеточного деления или после слияния клеток, и никогда не передается соседним клеткам в популяции. CFSE позволяет отслеживать деление клеток, так как при делении концентрация метки в дочерних клетках снижается ровно в 2 раза, и интенсивность флуоресценции, соответственно, тоже. ::::::::::::::::: Авторадиография — метод изучения распределения радиоактивных веществ в исследуемом объекте Техника исследования Пленка с чувствительной к радиоактивному излучению фотоэмульсией накладывается на поверхность или срез объекта. Для получения распределения тех или иных веществ в объекте используют маркирование нужных молекул изотопным индикатором. Радиоактивные вещества, содержащиеся в объекте, как бы сами себя фотографируют. После проявления места затемнения на пленке соответствуют локализации радиоактивных частиц. Применение 1 Методы биологических исследований Метод используется в медицине, технике, а также в биологии, например, для изучения процессов фотосинтеза, где прослеживается след радиоактивного диоксида углерода, проходящего через различные химические стадии. Фотографическое изображение распределения радиоактивных веществ, полученное методом авторадиографии, называется авторадиограммой, или радиоавтографом. Авторадиограмма среза эмбрионального мозга крысы. Высокая концентрация маркера, связывающего ГАМК-производящий фермент GAD67, наблюдается в районе субвентрикулярной зоны. Изображение из статьи Popp et al., 2009. ::::::::::::::::::::: Биотелеметрическая система - комплекс средств для дистанционного измерения различных показателей исследуемого организма. Классификация биотелеметрических систем I. По взаимоотношению объекта исследования, передатчика и приемника: взаиморасположение объекта исследования и передатчика: o передатчик находится на небольшом расстоянии от объекта; o передатчик находится внутри объекта; взаимоотношение передатчика и приемника: О - передатчик и приемник взаимно неподвижны; 1 - передатчик или приемник перемещаются 2 Методы биологических исследований Примечание. Временные наименования некоторых наиболее распространенных систем: "стационарная" - АО; "бортовая" - А1; "ретрансляционная" - ВО; "динамическая" - БJ; "эндорадиозонды" - Б1. II. По области применения. Исследуемые системы организма; отрасли биологии и медицины. III. По техническим критериям. Способ передачи информации; способ питания передатчика; способ управления передатчиком; способ модуляции; число каналов и т.п. Использованная литература: Баевский Р.М.Физиологические методы в космонавтике. Издательство "Наука", Москва :::::::::::::::::::: Биуретовый метод один из колориметрических методов количественного определения белков в растворе. Разработан в 1949 году Горналлом, Бардавиллом и Дэвидом, ныне мало используется в биохимической лабораторной практике из-за низкой чувствительности. Принцип Основан на образовании биуретового комплекса пептидных связей белков с двухвалентными ионами меди. В методе используют т. н. биуретовый реактив, состоящий из KOH, CuSO4 и цитрата натрия. В образовавшемся комплексе медь связана с 4 азотами координационными связями, а с 2 кислородами — электростатическими. Полноценный комплекс образуется лишь с пептидами, состоящими более чем из 4 остатков. Оптическую плотность раствора определяют при 540—560 нм. К достоинствам метода стоит отнести его низкую чувствительность к посторонним веществам, невысокую погрешность. Чувствительность метода — 2-10 мг/мл 3 Методы биологических исследований ::::::::::::: Бромистый этидий Бромистый этидий — интеркалирующий агент, широко применяемый для выявления нуклеиновых кислот в молекулярной биологии, в частности, в случае ДНК электрофореза в агарозном геле. Под названием Homidium, бромистый этидий использовался для лечения Трипаносомоза у рогатого скота в 1950х годах. Из-за возможности связывания с ДНК, и при освещении ультрафиолетом, стимулирования разрывов в ДНК, бромистый этидий может быть сильным мутагеном. Также считается канцерогеном и тератогеном, хотя эти свойства никогда не были тщательно исследованы. Бромистый этидий, EtBr Спектр поглощения бромистого этидия 4 Методы биологических исследований Бромистый этидий — интеркалирующий агент, широко применяемый для выявления нуклеиновых кислот в молекулярной биологии, в частности, в случае ДНК электрофореза в агарозном геле. Агарозный гель, окрашенный бромистым этидием. Визуализация ДНК ультрафиолетом Вивисекция, живосечение — проведение хирургических операций над живым животным с целью исследования функций организма, изучения механизмов действия лекарственных средств, разработки методов хирургического лечения или же в образовательных целях. В настоящее время в связи с частым упоминанием опытов на животных в средствах массовой информации далёкие от биологии люди иногда неправильно называют «вивисекцией» любые эксперименты над животными и людьми, приводящие к нарушению здоровья — в частности, проверки на токсичность новых лекарств, косметики, средств бытовой химии, удары электрическим током и т. п). Когда я приступаю к опыту, связанному в конце с гибелью животного, я испытываю тяжёлое чувство сожаления, что прерываю ликующую жизнь, что являюсь палачом живого существа. Когда я режу, разрушаю живое животное, я глушу в себе едкий упрёк, что грубой, невежественной рукой ломаю невыразимо художественный механизм. Но переношу это в интересах истины, для пользы людям. А меня, мою вивисекционную деятельность предлагают поставить под чей-то постоянный контроль. Вместе с тем истребление и, конечно, мучение животных только ради удовольствия и удовлетворения множества пустых прихотей остаются без должного внимания. — Иван Петрович Павлов, великий русский физиолог, академик АН СССР, нобелевский лауреат, создатель учения о высшей нервной деятельности 5 Методы биологических исследований Первый в мире закон об ограничении вивисекции, обязательном обезболивании при эксперименте был принят в 1876 году в Великобритании. В Германии вивисекция впервые была запрещена при национал-социалистах по инициативе Г. Геринга, вместо этого проводились хирургические эксперименты на людях — заключённых концлагерей. В 1977 году вышел приказ министра здравоохранения СССР, запрещающий проводить эксперименты на животных без обезболивания. История Гален демонстрирует эффект перерезки нервов у свиньи. Иллюстрация из книги 1541 года Вивисекция известна со II века н. э. Первым, кто применял вивисекцию, считается Клавдий Гален. Движение против вивисекции Организации выступающие за ограничения вивисекции Американское общество против вивисекции основано в 1883 году в Филадельфии группой людей, вдохновленных незадолго до этого принятым в Великобритании Законом о защите животных. Первоначальной целью общества было регулирование использования животных в науке и обществе. Спустя несколько лет первостепенной задачей общества стал полный запрет вивисекции. Во Франции первое общество противников вивисекции в XIX веке возглавил Виктор Гюго. В 1898 году в Великобритании был основан Британский союз за отмену вивисекции. 6 Методы биологических исследований Известные случаи широкого применения вивисекции людей относятся к периоду Второй мировой войны. Наибольшую огласку имеют место эксперименты над людьми, проводимые в специальном подразделении японской армии, так называемом Отряде 731, занимавшимся исследованиями, разработкой и внедрением методов ведения бактериологической войны. Вивисекция людей осуществлялась с целью исследования воздействий различных факторов на состояние органов человека. Велись эксперименты как со здоровыми людьми, так и с людьми после воздействия на них поражающих факторов: различных инфекций, отравляющих веществ, низких и высоких температур и т. п. Люди, подвергающиеся вивисекции, являлись этническими китайцами, корейцами, монголами, русскими и представителями других народов, попавшими в плен японской армии либо арестованными по обвинению в шпионаже японской жандармерией. При вскрытии могла не применяться ни местная, ни общая анестезия . Служащие Отряда 731 успешно применяли в своей медицинской практике после окончания Второй мировой войны знания, приобретённые в период службы в данном подразделении, в том числе полученные при вивисекции людей. Однако значительная часть задокументированных результатов исследований была уничтожена при отступлении частей Квантунской армии в августе 1945 года. Уцелевшие результаты и данные об этих исследованиях были переданы США в обмен на гарантии жизни и свободы руководству и личному составу Отряда 731 со стороны правительства США. Кроме документов об Отряде 731, есть различные свидетельства, того, что учебные операции на живых людях, оканчивающиеся умерщвлением оперируемого, проводились японскими военными хирургами на всей оккупированной Японией территории В документальном романе Даниила Гранина «Зубр», основанном на воспоминаниях Тимофеева-Ресовского, имеется примечательное свидетельство об отношении к содержанию животных в фашистском государстве в конце войны: Норму продуктов в Бухе урезали до голодного минимума. С. Н. Варшавский рассказывал, что им с женой продовольственной карточки и иждивенческой в придачу стало совсем не хватать. То же испытывали и Иван Иванович Лукьянченко, и даже терпеливый ко всему китаец-генетик Ма Сун-юн. Отдельные части немецкой машины продолжали действовать с нерассуждающей пунктуальностью — подопытным животным аккуратно привозили бумажные мешки с кормом по прежней норме. — «Зубр» Даниил Гранин Вивисекция в художественной литературе 7 Методы биологических исследований Идея о возможностях хирургии и вивисекции в создании новых организмов была популярна в фантастической литературе в конце XIX — первой трети XX вв. Среди произведений на эту тему наиболее известны романы «Остров доктора Моро» Герберта Уэллса, «Человек-амфибия», «Хойти-Тойти», «Голова профессора Доуэля» Александра Беляева, повесть Михаила Булгакова «Собачье сердце». :::::::::::::: Гибридома — гибридная клеточная линия, полученная в результате слияния клеток двух видов: способных к образованию антител Bлимфоцитов, полученных из селезёнки иммунизированного животного, и раковых клеток миеломы. Слияние клеток производится с помощью нарушающего мембраны агента, такого, как полиэтиленгликоль или вирус Сёндай. Поскольку раковые клетки миеломы «бессмертны», то есть способны делиться большое количество раз, после слияния и соответствующей селекции гибридома, производящая моноклональные антитела против антигена может поддерживаться долгое время. В 1984 г. за открытие принципа получения моноклональных антител Мильштейн, Кёлер и Ерне получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине. 8 Методы биологических исследований Гибридомная технология: иммунизация животных; выделение В-лимфоцитов из селезенки; 9 Методы биологических исследований культура клеток миеломы; слияние В-лимфоцитов и клеток миеломы; сегрегация клеточных линий; скрининг и селекция линий, производящих антитела; размножение гибридомы in vitro или in vivo ; получение антител. ::::::::::::::::::::::::::::: Данио-рерио «Дамский чулок», или брахиданио-рерио — вид пресноводных рыб семейства карповых. Популярная аквариумная рыбка. Является модельным организмом в биологии развития и известна в англоязычной литературе как zebrafish. Данио-рерио является первым домашним животным, генетически модифицированным генами биолюминесценции в 2003 году. Внешний вид Это аквариумная рыбка размером до 7 сантиметров с длинным, прогонистым телом, основной тон серебристый с ярко синими полосами. У молодых рыб плавники короткие, со временем они отрастают и образуют вуаль. Края плавников могут быть окрашены в желтый цвет. Отличительной чертой самки является брюшко, у самки оно значительно толще. Данио-рерио Данио-рерио Научная классификация Царство: Животные 10 Методы биологических исследований Тип: Хордовые Класс: Костные рыбы Отряд: Карпообразные Семейство: Карповые Род: Данио Вид: Данио-рерио Латинское название Danio rerio Систематика Изображения ITIS 163699 N на Викивидах на Викискладе Danio rerio — модельный организм, который используют для изучения развития позвоночных и функций генов позвоночных. Первые работы Джорджа Стрейсингера в университете Орегона показали потенциальную возможность использования D. rerio как модельного организма; важность данной модели была подтверждена многими генетическими исследованиями. D. rerio — это один из немногих видов рыбы, которые побывали на орбитальной космической станции. Как объект биологии развития D. rerio имеет некоторые преимущества над другими позвоночными. Эмбрион развивается быстро, и проходит стадии от яйца до личинки всего за три дня. Эмбрионы крупные, выносливые, крепкие, прозрачные и развиваются вне матери, что облегчает манипуляции с ними и наблюдение. Для выключения генов или изменения сплайсинга в Danio rerio часто используют технологию антисмысловых Морфолино. Такие олигонуклеотиды являются синтетическими макромолекулами, содержащими ДНК- или РНК-нуклеотиды, которые связываются с комплементарными последовательностями РНК и снижают активность генов. Олигонуклеотиды Морфолино могут быть введены в клетки зародыша после стадии 32 клеток, при этом образуется организм, в котором активность генов снижена только в тех клетках, которые происходят от модифицированной клетки. Хотя клетки раннего зародыша непроницаемы для крупных молекул, они позволяют проникать молекулам Морфолино между клетками. 11 Методы биологических исследований Danio rerio с мутантной окраской был получен инсерционным мутагенезом. Мутант теряет черный пигмент в меланоцитах, так как не способен синтезировать меланин. Животному на фотографии четыре дня. В верхней части фотографии — животное дикого типа. 12 Методы биологических исследований Хроматофоры Danio rerio, которые обеспечивают покровительственную окраску, являются модельным объектом изучения молекулярной биологии и биологии развития ::::::::::::::::::: ДНК-метилтрансфераза ДНК-метилтрансферазы — группа ферментов, катализирующих метилирование нуклеотидных остатков в составе ДНК. Активность метилтрансфераз, заключающаяся в групп) на азотистое основание цитозин в составе ДНК, ведет к изменению свойств ДНК, при этом изменяется активность, функции соответствующих генов, а также пространственная структура нуклеиновой кислоты. ДНК-метилтрансферазной активностью обладают несколько групп ферментов: цитозин-ДНК-метилтрансферазы — ферменты, ответственные за поддержание картины метилирования генома клетки; 13 Методы биологических исследований ферменты системы рестрикции-модификации, проявляющие КФ 2.1.1.72-ДНК-метилтрансферазная) и КФ 2.1.1.113-ДНКметилтрансферазная) активности; примерами могут служить ферменты PvuII и TaqI. Все известные ДНК-метилтрансферазы используют в качестве донора метильной группы S-аденозил-метионин. Цитозин-ДНК-метилтрансферазы катализируют перенос метильной группы от S-аденозил-метионина на остаток цитозина, находящегося в специфической последовательности в двухцепочечной ДНК, с образованием 5-метилцитозина и Sаденозилгомоцистеина. Эта реакция необратима. Сравнение структуры прокариотических и эукариотических ДНК-метилтрансфераз позволяет отнести их к одному классу ферментов. Все эти ферменты представляют собой мономерные белки, содержащие консервативные гомологичные участки, ответственные за ферментативные функции. У большинства цитозин-ДНК-метилтрансфераз насчитывают до 10-ти таких участков. Среди них различают 4 умеренногомологичных мотива, которые могут отсутствовать у некоторых ферментов, и 6 высокогомологичных мотивов. Между участками VIII и IX расположен домен TRD, длина и аминокислотный состав которого вариабельны. Эукариотические ДНК-метилазы выполняют функцию поддержания метилирования. После репликации ДНК данные ферменты метилируют цитозин по сайтам CpG и CpNpG во вновь синтезированных цепях. ДНК-метилтрансферазы эукариот способны, хотя и с меньшей эффективностью, производить метилирование ДНК de novo. Субстратная специфичность ДНК-метилтрансфераз семейства DNMT1. Полуметилированный дуплекс определяет метилирование цитозина в нижней цепи. Наличие пары *С с гуанином в верхней цепи необязательно. Асимметричный сайт узнавания заключён в рамку У млекопитающих обнаружены четыре активных ДНК-метилтрансферазы: DNMT1, DNMT2, DNMT3a и DNMT3b. Также обнаружен белок, структурно схожий с семейством DNMT3, но не проявляющий метилтрансферазной активности — DNMT3L. 14 Методы биологических исследований Семейство DNMT1 ДНК-метилтрансфераза семейства DNMT1 мыши представляет собой белок с молекулярной массой 190 кДа, содержащий 1620 аминокислотных остатков. Основная активность этого фермента заключается в метилировании полуметилированных сайтов CpG. Молекула ДНК-метилтрансферазы DNMT1 значительно больше прокариотического фермента за счёт наличия N-концевого регуляторного участка, составляющего ²/3 от всей длины полипептидной цепи. Именно этот участок отвечает за «предпочтение» ферментом полуметилированных сайтов перед неметилированными. Регуляторный N-концевой участок соединён с каталитическим C-концевым при помощи Gly-Lys-повторов. Считается, что ген dnmt1 образовался путём слияния гена прокариотической ДНК-метилазы с одним или двумя генами ДНКсвязывающих белков. 15 Методы биологических исследований та же та же белок HP1β гетерохроматина РНК-полимераза II РНК-полимераза II поддерживающее DNMT1 метилирование ДНК DNMT3L репрессор транскрипции HDAC1 деацетилаза гистонов метилтрансфераза SUV39H1 гистона H3 онкогенный DNMT3a PML-RAR транскрипционный фактор транскрипционный RP58 корепрессор белок HP1β гетерохроматина убиквитинподобный SUMO-1 белок поддерживающее DNMT1 метилирование ДНК DNMT3L репрессор транскрипции DNMT3b HDAC1 деацетилаза гистонов убиквитинподобный SUMO-1 белок метилирование ДНК DNMT3a de novo DNMT3L DNMT3b та же MBD3 MeCP2 16 Методы биологических исследований N-концевой домен содержит различные специфические HDAC1 деацетилаза гистонов последовательности, такие как сигнал ядерной локализации, цистеинбелок CMT3 гомолог HP1 богатый Zn-связывающий мотив и специальная последовательность, гетерохроматина направляющая метилазу в область репликации ДНК. Фермент локализуется в областях репликации ДНК в течение S-фазы клеточного цикла, а после её завершения диффундирует в нуклеоплазму. Также Nконцевой домен фермента DNMT1 содержит последовательность, гомологичную репрессору транскрипции HRX, с помощью которой ДНК-метилаза in vivo способна ассоциироваться с деацетилазой гистонов. Человеческий фермент DNMT1 принципиально не отличается от мышиного. Фермент DNMT1 имеет несколько изоформ: соматический DNMT1, промежуточный вариант и изоформа, характерная для ооцитов. DNMT1o синтезируется и накапливается в цитоплазме ооцитов, а затем, во время раннего эмбрионального развития, транспортируется в клеточное ядро. Фермент может проявлять аномальную метилирующую активность, в частности, метилируя CpG-пары в области петли одноцепочечной ДНК, уже содержащей метилированные сайты CpG. Инактивация мышиного фермента DNMT1 приводит к значительному уменьшению метилирования генома и к гибели развивающихся эмбрионов на 10-11 день развития. Оставшийся уровень в 30 % и способность стволовых клеток к метилированию ретровирусной ДНК de novo обеспечиваются другими ДНК-метилтрансферазами. Семейство DNMT2 ДНК-метилтрансфераза DNMT2 состоит из 415-ти аминокислотных остатков и не содержит N-концевого регуляторного домена. Инактивация гена dnmt2 у стволовых клеток мышей не влияло на их способности к поддержанию картины метилирования генома и к метилированию de novo. Аминокислотная последовательность фермента сходна с последовательностями коротких ДНК-метилаз растений, грибов, прокариот. В 2006 году Goll и соавт. показали, что фермент производит метилирование тРНК по цитозину-38 как in vivo, так и in vitro, и не метилирует ДНК. Чтобы отразить функцию фермента в названии, было решено переименовать его в TRDMT1. 17 Методы биологических исследований Семейство DNMT3 ДНК-метилтрансферазы DNMT3a и DNMT3b производят метилирование полуметилированных и неметелированных сайтов CpG с одинаковой скоростью. Человеческие DNMT3a и DNMT3b содержат 908 и 859 аминокислотных остатков, соответственно; ген dnmt3b может кодировать и меньшие полипептиды вследствие альтернативного сплайсинга. Гены dnmt3a и dnmt3b активно экспрессируются в недифференцированных эмбриональных стволовых клетках, тогда как в дифференцированных клетках уровень их экспрессии очень низкий. Инактивация этих генов у мышей приводила к гибели особей, в среднем, к четырёхнедельному возрасту. DNMT3a активнее метилирует сайты CpG, чем CpA, CpT, и CpC. DNMT3a метилирует сайты CpG намного медленнее, чем DNMT1, но быстрее, чем DNMT3b. Несмотря на то, что функции ферментов DNMT3a и DNMT3b во многом перекрываются, имеются также и различия. Так, DNMT3b отвечает за метилирование сателлитных повторов в области центромерного линкера, а мутация гена dnmt3b у человека приводит к ICF-синдрому. ICF-синдром — это редкое аутосомальное рецессивное генетическое заболевание, которое характеризуется дефектами иммунной системы и нарушением нормального строения лица. Синдром связан с нестабильностью центромерного гетерохроматина. При этом основные компоненты гетерохроматина, сателлитные участки DNA II и DNA III, оказываются недостаточно метилированы. DNMT3L содержит DNA-метилтрансферазный мотив и является необходимым для эффекта материнского геномного импринтинга, оставаясь при этом каталитически неактивным. DNMT3L экспрессируется при гаметогенезе, когда и происходит геномный импринтинг. Отсутствие DNMT3L ведет к биаллельной экспрессии генов, для которых в норме не характерна экспрессия материнского аллеля. DNMT3L взаимодействует с DNMT3a и DNMT3b в клеточном ядре. Хотя DNMT3L неспособен проводить метилирование, белок может принимать участие в репрессии транскрипции. У растений обнаружено три семейства ДНК-метилтрансфераз. Семейство Met1 ДНК-метилазы этого семейства сходны с ферментами семейства DNMT1 млекопитающих. У Arabidopsis thaliana найдены 2 такие ДНКметилтрасферазы: METI и METII. Эти белки отличаются от мышиного DNMT1 строением N-концевого домена. Метилазы, гомологичные METI Arabidopsis thaliana найдены у моркови и риса. В это семейство входит и ген NtMETI табака, ген ДНК-метилтрансферазы гороха. Наиболее активны данные ферменты в клетках меристем растений. 18 Методы биологических исследований Семейство хромометилаз Семейству принадлежат полиморфные ДНК-метилазы. Впервые открыты у Arabidopsis thaliana. Молекулы данных ферментов содержат между I и IV участками хромодомен в 80 аминокислотных остатков, отвечающий за взаимодействие со специфическими белками хроматина и с ядерной мембраной. Белки CMT3 Arabidopsis thaliana и Zmet2 кукурузы осуществляют поддерживающее метилирование ДНК по CpNpG и асимметричным сайтам. Выключение их активности ведёт к реактивации эндогенных транспозонов. Хромометилазы характерны только для растений. Семейство DRM Семейство ДНК-метилаз, у которых консервативные мотивы переставлены местами и составлены в следующем порядке: VI—IX — X—I — II—III — IV—V. Отсюда и название семейства: domain rearranged methylases, DRM. Гены этих ферментов были найдены у Arabidopsis thaliana, кукурузы, сои. Несмотря на то, что функциональные мотивы перемешены, молекула формирует трёхмерную структуру, подобную прокариотической ДНК-метилтрансферазе HhaI. N-концевой домен содержит убиквитинсвязывающий участок, что создаёт возможность убиквитинирования этих ферментов. По функции эти ДНК-метилтрансферазы сходны с семейством DNMT3 млекопитающих, в частности, они также способны эффективно осуществлять метилирование ДНК de novo по асимметричным сайтам. Другие ДНК-метилтрансферазы растений Существуют и другие ДНК-метилтрансферазы растений, такие как METIII Arabidopsis thaliana, лишённая N-концевого домена. Во отличие от животных, инактивация ДНК-метилтрансфераз у растений не ведёт к летальному эффекту, однако также приводит к аномалиям развития. 19 Методы биологических исследований Бактериальный фермент M. HhaI вместе с узнаваемым участком ДНК. Домен, распознающий мишень фермента образует специфический контакт с краями оснований в большой канавке молекулы ДНК. Большой каталитический домен отвечает за перенос метильной группы от S-аденозил-L-метионина на цитозин. Мишень — цитозин — полностью выворачивается из двойной спирали, глубоко погружаясь в активный центр фермента. ДНК-метилтрансфераза - ДНК-метилтрансферазы грибов ДНК-метилтрансферазы Ascobolus У аскомицета Ascobolus обнаружены 2 гена: MASCI и MASK2. Первый кодирует белок с молекулярной массой 61,5 кДА, состоящий из 537 аминокислотных остатков. Он содержит 10 консервативных мотивов, характерных для цитозин-метилтрасфераз, но отличается более коротким TRD между VIII и IX мотивом и N-концевым доменом, негомологичным таковому у DNMT1. Мутация в гене MASCI 20 Методы биологических исследований не влияет на поддерживающее метилирование ДНК, но нарушает метилирование de novo повторов в ДНК и приводит к стерильности штаммов, гомозиготных по данной мутации. Ген MASK2 Ascobolus принадлежит семейству DNMT1. Выключение обоих генов не приводит к нарушению поддерживающего метилирования ДНК Ascobolus, что говорит о наличии ещё как минимум одного гена ДНК-метилтрансферазы. ДНК-метилтрансфераза Neurospora crassa У Neurospora crassa имеется один ген ДНК-метилтрансферазы — DIM-2. Белок DIM-2 отвечает за метилирование всего генома, его инактивация ведет к полному деметилированию ДНК Neurospora crassa. Белок состоит из 1454 аминокислотных остатков и принадлежит к семейству DNMT1. Нарушения экспрессии DIM-2 не приводят к заметным аномалиям в развитии гриба ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: Долговременный эксперимент по эволюции E. coli уникальный эксперимент по эволюции бактерии E. coli в искусственных условиях, проведённый группой под руководством Ричарда Ленски в университете штата Мичиган. В процессе эксперимента прослежены генетические изменения, происходившие в 12 популяциях E. coli на протяжении 50 000 поколений. Эксперимент начался 24 февраля 1988 года и продолжается более 20 лет. За время эксперимента обнаружен широкий спектр генетических изменений. Наиболее поразительной адаптацией стала появившаяся у одной из популяций способность усваивать цитрат натрия. Цель эксперимента Целью эксперимента был поиск ответа на некоторые важные вопросы эволюционной биологии: 21 Методы биологических исследований Каким образом меняется во времени скорость эволюционных изменений; Какова повторяемость эволюционных изменений для различных популяций, существующих в одинаковой среде; Каково соотношение эволюции на генотипическом и фенотипическом уровнях. 12 участвующих в эксперименте популяций E. coli на 25 июня 2008 года Бактерии E. coli. Снимок сканирующим электронным микроскопом Выбор бактерии E. coli объясняется быстрой сменой поколений у этого организма и небольшим размером генома, что позволяет за короткий период времени исследовать процессы, которые у более сложных организмов занимают тысячелетия. Благодаря тому, что эта бактерия десятилетиями используется в молекулярной биологии, она хорошо исследована, технологии работы с ней хорошо отлажены. Бактерия без потери жизнеспособности может длительно сохраняться в замороженном состоянии, что позволяет вести своеобразную 22 Методы биологических исследований «летопись эксперимента», а размораживание нужного поколения позволит при необходимости повторить эксперимент с любой ранее сохранённой точки. В качестве предкового штамма E. coli был взят «штамм Bc251», описанный в 1966 году Сеймуром Ледербергом русск. и использованный Брюсом Левиным русск. в экспериментах по бактериологической экологии в 1972 году. Характерными чертами этого штамма были T6, Str, rm, Ara. Перед началом эксперимента путём точечной мутации оперона ara Ленски подготовил Ara вариант этого штамма, способный усваивать арабинозу. В начале эксперимента были созданы 12 популяций исходного штамма. Для точной идентификации каждой популяции были задействованы генетические маркеры. Каждая популяция размножалась в искусственной среде, где скорость размножения ограничивалась стрессовыми условиями. Каждый день 0,1 мл содержимого каждой пробирки переносилось в пробирку с 10 мл свежей питательной среды, где размножение бактерий продолжалось. Каждое 500-е поколение замораживалось в глицерине при температуре 80 °С, чтобы в будущем с появлением новых методов анализа имелась возможность провести более подробное исследование. По ходу эксперимента полностью секвенировался геном предкового штамма, а также геномы некоторых этапных поколений. Поскольку размер генома E. coli составляет 4,6 млн нуклеотидных пар, то при наблюдаемой скорости мутаций, каждая пара нуклеотидов в геноме за 20 лет заменяется в среднем более одного раза. Не все мутации, возникающие в геноме, равнозначны. Полезность мутации определяется скоростью размножения их носителей. Повышенная скорость размножения позволяет мутировавшей бактерии вытеснять из популяции бактерии с отсутствующей мутацией. При этом мутация «фиксируется» и присутствует в геноме всех последующих поколений. Вредные мутации действуют противоположным образом. Существуют также «нейтральные» мутации, которые не влияют на скорость размножения бактерий, так как возникают в незначимых участках генома. Эти мутации не фиксируются и не подавляются отбором и, таким образом, появляются и исчезают случайным образом. В эксперименте использовалась линия E. coli, размножающаяся исключительно делением. Таким образом, круг исследуемых явлений ограничивался вновь возникшими мутациями. Питательная среда DM25 В эксперименте использовалась минимальная питательная среда Дэвиса с концентрацией глюкозы 25 мг/л, обозначаемая как DM25. Эта среда обеспечивает в стационарной фазе плотность 50 млн бактерий/мл. 23 Методы биологических исследований Объём культуры составлял 10 мл. Культуры содержались в 50-мл конических колбах, свободно накрытых перевёрнутыми стеклянными стаканами. Инкубация происходила при температуре 37 °С и скорости вращения 120 об/мин. По прошествии суток 0,1 мл культуры переносился в колбу с 9,9 мл свежей среды. Состав среды DM25 следующий: Компонент Формула Объём Масса Приготовление Гидрофосфат калия K2HPO4 · 3H2O 3,5 г Дигидрофосфат калия KH2PO4 · H2O 1,0 г Сульфат аммония 0,5 г Приготовить раствор и автоклавировать 2SO4 Цитрат натрия Na3C6H5O7 0,25 г Вода H2O 500 мл Глюкоза C6H12O6 0,125 мл 12,5 мг Сульфат магния MgSO4 0,5 мл 25 мг После автоклавирования добавить из стерильных флаконов Тиамин C12H17N4OS 0,5 мл 25 мг Следует отметить, что обычно бактерии E. coli не потребляют цитрат натрия, он используется только как хелатор железа. Частота мутаций Изменение числа фиксированных мутаций и скорости роста бактерий от поколения к поколению 24 Методы биологических исследований В работе приводятся результаты исследования популяции A-1, одной из 12, участвовавших в эксперименте. Авторы разделяют эволюцию популяции на два этапа, граница между которыми примерно приходится на поколение 26 000. При секвенировании генома поколения 20 000 и сравнении его с геномом исходного штамма были обнаружены 45 фиксированных мутаций разного типа, из которых основная масса пришлась на однонуклеотидные замены. Скорость накопления фиксированных мутаций в течение первого этапа эксперимента оставалась примерно постоянной. Неожиданным оказалось то, что приспособленность бактерий к среде, выражавшаяся в скорости размножения, до поколения 1500 росла очень быстро, затем её рост замедлился при прежней скорости фиксирования мутаций. В других популяциях за первые 20 000 поколений менее 100 фиксированных мутаций, из которых полезными были только от 10 до 20. Картина эволюционных изменений в популяции А-1 кардинально изменилась после поколения 26 000. В этот момент произошла мутация в гене mutT, который кодирует белок, участвующий в репарации ДНК. В результате этого среднее число фиксированных мутаций резко возросло до 0,05 за поколение. Всего в поколениях 20 000—40 000 зафиксировалось 609 мутаций. Аналогичное увеличение скорости мутагенеза наблюдалось в трёх других популяциях из 12. Изменения в метаболизме Популяция A-3, заметно более мутная из-за повышенной плотности бактерий Неожиданным оказался результат эволюции популяции А-3. В момент, соответствующий поколению 33 127, в колбе было замечено сильное помутнение, свидетельствующее о высокой плотности бактерий. Подобный эффект обычно наблюдался при загрязнении культуры бактериями другого вида, потребляющими цитрат натрия. Поскольку концентрация цитрата натрия в среде в 20 раз превышает концентрацию глюкозы, потребление цитрата обеспечивает значительно более высокую плотность клеток. 25 Методы биологических исследований Неспособность питаться цитратами является характерной особенностью E. coli, поскольку каналы в её мембране не пропускают молекулы цитратов. Тем не менее, исследование показало, что цитрат натрия потребляют именно мутантные бактерии E. coli. Проверка генетических маркеров, а также наличие мутаций pykF и nadR, характерных для предыдущих поколений А-3, подтвердили, что бактерии Cit не привнесены извне, а являются мутировавшими особями исходного штамма. Ретроспективное обследование замороженных образцов показало, что в поколении 31 000 бактерий Cit нет вообще, в поколении 31 500 они составляют 0,5 %, в поколениях 32 000 и 32 500 — 15 и 19 % соответственно. В поколении 33 000 Cit практически исчезают, однако в поколении 33 500 так же неожиданно отвоёвывают жизненное пространство и последующих поколениях полностью доминируют. Исследователи объясняют это появлением между поколениями 33 000 и 33 500 некоторой пока не установленной мутации, которая в сочетании со способностью питаться цитратом обеспечило бактериям Cit эволюционное преимущество. Была проверена гипотеза о том, что способность усваивать цитрат имелась у бактерий изначально, однако до возникновения сопутствующих мутаций это качество явно не проявлялось. Гипотеза не подтвердилась, так как бактерии до 31 000-го поколения оказались неспособны размножаться в среде без глюкозы. ::::::::::::::::::::::::::::: Зимография электрофоретическая технология, основанная на SDS-PAGE, которая включает субстратную сополимеризацию с полиакриламидным гелем, для обнаружения ферментативной активности. Образцы готовят в стандартно обработанном SDS-PAGE буфере, но без кипячения и без редуцирующего агента. После электрофореза, SDS удаляется из геля выдерживанием в небуферезированном Тритон X-100, затем следует выдерживание в подходящем расщепляющем буфере, за оптимальный отрезок времени при 37 °C. Далее, зимограмма окрашивается, при этом, в том месте, где субстрат был расщеплён ферментом, проявляются области расщепления в виде отчётливых полосок на тёмно окрашенном фоне. Эти протоколы, однако, нуждаются в сильных уточнениях. Например, пищеварительная гликозидаза D. melanogaster выживает в редуцированных условиях и при объёмном подогреве. Действительно, разделение дальнейшим нагреванием до 50 °C приводит к явному увеличению разрешения полос, без существенных потерь активностей. 26 Методы биологических исследований Plasmodium knowlesi Отпечаток гемоглобиназы. Желатин — это наиболее стандартный из используемых субстратов и может быть полезен для демонстрации активности желатин разрушающих протеаз, но зимография может быть применена и к широкому кругу ферментов, включающему ксилоназы, протеазы, липазы, хитаназы, и т. д. Общий протокол, используемый в прошлом для зимографии альфа-амилазной активностей, был назван протоколом тонкого слоя крахмала W. W. Doane. По этому протоколу исходный PAGE гель запускался для разделения белков в гомогенате. После этого тонкий гель с с растворённым в нём крахмалом покрывался сверху исходным гелем на некоторое время. Крахмал окрашивался раствором Люголя. Обратная зимография сополимеризует как субстрат, так и фермент с акриламидом, и это полезно для демонстрации активности ингибитора фермента. При последующем окрашивании, участки ингибирования визуализируются как тёмные пятна на чистом. 27 Методы биологических исследований :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: Изотахофорез — метод разделения различных типов ионов по их подвижности в электрическом поле. При ИТФ все виды ионов мигрируют в одном направлении, образуя набор зон, находящихся в равновесном состоянии и перемещающимися с одинаковыми скоростями. Теоретические основы метода В основе метода ИТФ лежит система, состоящая из трех различных электролитов, объединенных общим противоионом: ведущий электролит, содержащий анионы с наиболее высокой электрофоретической подвижностью, располагается в анодной области; замыкающий электролит, содержащий анионы с минимальной подвижностью, располагается в катодной области; смесь электролитов анализируемой смеси, содержащая анионы с промежуточной подвижностью. Если через эту систему пропустить электрический ток, то анионы расположатся последовательно в соответствии с их электрофоретической подвижностью, ведущий в области анода, замыкающий в области катода, остальные между ними в виде узких зон с четкими концентрационными границами. Ширина отдельных зон по завершении процесса соответствует абсолютному количеству в смеси того или иного аниона. Поскольку отдельные зоны располагаются последовательно. они практически соприкасаются, поэтому в исследуемый образец вносят буфер, содержащий анион с промежуточной подвижностью, зона которого встроится в полученную последовательность и раздвинет зоны исследуемых анионов. Эти вспомогательные зоны называются спейсерами — разделителями, функции которых выполняют амфолиты-носители, используемые в методе ИЭФ. особенностью метода ИТФ является то, что процесс сопровождается концентрированием зон, эффект от которого приводит к разрешению, сравнимому и даже превосходящему разделение методом ИЭФ. Результаты разделения смесей методом ИТФ фиксируются на ленте самописца в виде графика измерения трех параметров: интегральная кривая тепловыделения: по этой кривой можно определить разницу температур между соседними зонами, что служит мерой градиента напряженности поля, то есть разницы электрофоретических подвижностью двух ионов дифференциальная кривая тепловыделения: длина отрезков этой кривой соответствуют ширине зоны вещества, а также служит мерой абсолютного количества вещества в пробе 28 Методы биологических исследований кривая поглощения в УФ-свете: длина отрезков этой кривой соответствует значению экстинкции вещества. Зная коэффициент молярной экстинкции вещества, можно определить абсолютное содержание вещества в пробе, а также вычислить его концентрацию в зоне. 29 Методы биологических исследований Этапы разделения двух образцов при помощи изотахофореза: Белый цвет — ведущий электролит, серый — замыкающий электролит, заштрихованы — анализируемые образцы 30 Методы биологических исследований Изотахофорез - Приборы для изотахофореза Аналитический изотахофорез проводят в капиллярном приборе для изотахофореза, в тефлоновом капилляре с внутренним диаметром 0,5 мм. Препаративный изотахофорез проводят в колонке с полиакриламидным гелем. Применение изотахофореза 1. 2. 3. 4. Аналитическое разделение пептидов, белков, нуклеотидов, органических кислот, ионов металлов с высоким разрешением. Препаративное разделение белков. Накопление в виде узкой зоны следовых количеств веществ из больших объемов пробы вследствие эффекта концентрирования. Определение электрофоретической подвижности. :::::::::::::::::: Изоэлектрическое фокусирование технология разделения молекул по разнице в их электрических зарядах. Это разновидность зонального электрофореза, которую обычно производят в геле. Белок, который находится в рН-зоне ниже собственной изоэлектрической точки, будет положительно заряжен и будет перемещаться к катоду. В результате перемещения заряд молекулы будет снижаться, а перемещение — замедляться. В результате белки образуют четкие полосы, и каждый белок будет располагаться в градиенте значений рН в соответствии с изоэлетрической точкой. Данная технология дает возможность очень четкого разделения белков, отличающихся по заряду. Применение Метод применяют для изучения белков, которые отличаются значениями изоэлектрической точки, то есть соотношением остатков кислых и основных аминокислот. Белки наносят на иммобилизованный градиент рН полиакриламидного или агарозного геля. Изоэлектрическое фокусирование позволяет разделить белки, отличающиеся по изоэлектрическим точкам менее, чем на 0,01. 31 Методы биологических исследований Изоэлектрическое фокусирования является первым этапом в проведении двухмерного электрофореза, при котором белки сначала разделяют по изоэлектрическим точкам, и далее — по молекулярной массе с помощью электрофореза в акриламидном геле. ::::::::::::::::::::::::::: Иммуноферментный анализ — лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала. Сущность и классификация ИФА Из-за разнообразия объектов исследования — от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, и многообразия условий проведения ИФА существует большое количество вариантов этого метода. Возможна классификация по типу иммунохимического взаимодействия на первой стадии анализа. Если в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания, то метод является неконкурентным. Если же на первой стадии в системе одновременно присутствует анализируемое соединение и его аналог, конкурирующие за ограниченное количество центров специфического связывания, то метод является конкурентным. Примером неконкурентного формата ИФА является «сэндвич»-метод. К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации на первой стадии на твердой фазе образуется комплекс антигенантитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом специфические антитела. После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена. На стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченных антител, что послужило поводом для широкого распространения названия «сэндвич»-метод. Ферментативная реакция проходит в присутствии перекиси водорода и субстрата, представленного неокрашенным соединением, которое в процессе пероксидазной реакции окисляется до окрашенного продукта реакции на заключительном этапе проведения исследования. Интенсивность окрашивания зависит от количества выявленных специфических антител. Результат оценивается спектрофотометрически или визуально. 32 Методы биологических исследований «Сэндвич»-метод может быть использован для анализа только тех антигенов, на поверхности которых существуют, по крайней мере, две антигенные детерминанты. На этом формате основано большое количество тест-систем для иммуноферментной диагностики различных инфекций: ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты, цитомегаловирусная, герпесная, токсоплазменная и другие инфекции. Среди конкурентных схем твердофазного ИФА существует два основных формата: 1. Прямой конкурентный формат ИФА использует иммобилизованые на твердой фазе специфические антитела, а меченый ферментом и немеченыйантиген конкурируют за связь с иммобилизованным антителом. К иммобилизованным антителам добавляют раствор, содержащий определяемое вещество и фиксированную концентрацию меченого антигена, инкубируют и после отмывки носителя от несвязавшихся компонентов регистрируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов. Величина детектируемого сигнала находится в обратной зависимости от концентрации антигена. Преимуществом прямой схемы является небольшое число стадий, что позволяет легко автоматизировать анализ. К недостаткам схемы относятся сложность методов синтеза ферментных конъюгатов, а также возможное влияние компонентов образца на активность фермента. 2. В непрямом конкурентном формате ИФА используются меченные ферментом антитела и иммобилизованный на твердой фазе конъюгат антиген-белок-носитель. Непрямая схема с использованием меченых антивидовых антител является одной из наиболее распространенных схем ИФА. На поверхности носителя иммобилизуют конъюгат антиген-белок, к которому добавляют раствор, содержащий определяемый антиген и фиксированную концентрацию немеченых специфических антител, инкубируют и после удаления несвязавшихся компонентов добавляют фиксированную концентрацию меченых антивидовых антител. После инкубации и отмывки носителя детектируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов, причем величина сигнала находится в обратно-пропорциональной зависимости от концентрации определяемого антигена. Применение универсального реагента — меченых антивидовых антител — даёт возможность выявлять антитела к разным антигенам. Кроме того, анализируемый образец и меченый реагент вводятся в систему на разных стадиях, что устраняет влияние различных эффекторов, содержащихся в образце, на каталитические свойства ферментной метки. Однако такая схема анализа усложняет его проведение из-за введения дополнительных стадий. Как любые иммунохимические методы анализа, ИФА может давать ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Например, ложноположительные результаты при определении антител к различным инфекциям могут возникнут за счёт ревматоидного фактора, представляющего собой иммуноглобулин M против собственных иммуноглобулинов G человека; за счёт антител, образующихся при различных системных заболеваниях, нарушениях обмена или приёме лекарственных препаратов; у 33 Методы биологических исследований новорождённых такие ложноположительные реакции могут возникать за счёт образования в организме ребёнка M-антител к иммуноглобулину G матери. Помимо этого, причиной ложнопололожительных результатов может быть синдром поликлональной активации. При этом, особые вещества - суперантигены - неспецифически стимулируют выработку B-лимфоцитами антител к различным инфекциям. Практически это выражается в неспецифическом нарастании титра антител сразу ко многим возбудителям. Ложноотрицательные результаты при определении антител могут быть обусловлены состояниями иммунодефицита, а также техническими ошибками при постановке реакции. Таким образом, за счёт несомненных преимуществ иммуноферментного анализа: удобства в работе, быстроты, объективности за счёт автоматизации учёта результатов, возможности исследования иммуноглобулинов различных классов в настоящее время является одним из основных методов лабораторной диагностики. Основные типы тест-систем в зависимости от используемых антигенов В зависимости от того, какие антигены используются, иммуноферментные тест-системы подразделяются на: 1. Лизатные — в которых используется смесь нативных антигенов; 2. Рекомбинантные — в которых используются полученные генно-инженерным способом белки-аналоги определённых белковых антигенов возбудителя; 3. Пептидные — использующие химически синтезированные фрагменты белков. Общее направление развития ИФА-диагностикумов — это направление от лизатных тест-систем, которые принято называть тестсистемами первого поколения, к рекомбинантным и пептидным. Технология получения рекомбинантных белков позволяет получить в достаточно чистом виде аналог практически любого отдельного антигена. Для создания высококачественной рекомбинантной тест-системы необходимо из всего антигенного многообразия возбудителя выбрать антигены, которые были бы иммуногенными и высоко специфичными. Кроме того, большое значение имеет качество очистки рекомбинантных белков. В идеальном случае возможно получение рекомбинантной тест-системы практически со 100%-ной специфичностью при высокой чувствительности. 34 Методы биологических исследований На практике этого не всегда удаётся достичь, однако специфичность лучших рекомбинантных тест-систем приближается к 100 %. ::::::::::::::::::::::::: Иммунохроматографический анализ иммунохимический метод анализа, основанный на принципе тонкослойной хроматографии и включающий реакцию между антигеном и соответствующем ему антителом в биологических материалах. Проводится с помощью специальных тест полосок, панелей или тест кассет. Сущность метода Принцип действия состоит в том, что при погружении тест полоски в биологическую жидкость, она начинает мигрировать вдоль полоски по принципу тонкослойной хроматографии. Вместе с ней движутся нанесенные на нижнюю часть тест-полоски меченые специфические антитела, которые аффинно связываются с анализируемым веществом. Различают 2 формата ИХА: прямой и конкурентный метод. 1. В схеме прямого ИХА используется конъюгат антитела-метка, нанесенный на мембрану для конъюгата. На тестовой линии иммобилизованы антитела, специфические к данному аналиту, а на контрольной линии – антивидовые антитела, специфические к первичным антителам. При нанесении образца, содержащего анализируемое вещество, при попадании образца на мембрану с конъюгатом, происходит связывание аналита с конъюгатом Ат-метка. Затем иммунный комплекс попадает в тестовую зону, где он связывается со специфическими антителами, образуя «сэндвич» Ат-Аг-Ат-метка. избыток несвязавшегося конъюгата связывается с антивидовыми антителами на контрольной линии. Таким образом, выявление 2-х линий на тест-полоске является положительным результатом теста. При отсутствии аналита в образце конъюгат связывается с антивидовыми антителами только на контрольной линии, образуя одну линию на тест-полоске. Метод прямого ИХА используется для выявления высокомолекулярных соединений – вирусов, в т.ч. ВИЧ; различных гормонов, возбудителей инфекционных заболеваний. 35 Методы биологических исследований 2. Метод конкурентого ИХА, используемый для определения низкомолекулярных соединений, основан на конкуренции аналита и иммобилизованного конъгата аналит:белок-носитель за ограниченное количество центров связывания специфических антител, содержащихся в конъюгате Ат-метка. При нанесении образца, содержащего аналит, он связывается с конъюгатом Ат-метка на мембране с конъюгатом. Далее иммунокомплекс проходит через тестовую зону, где на иммобилизован конъгат аналит:белок-носитель. Иммунокомплекс не может связаться с этим конъюгатом из-за стерических затруднений: низкомолекулярные соединения обычно имеют одну антигенную детерминанту и, соответственно, антитела имеют один центр связывания с антигеном, который уже является занятым аналитом. Далее иммунный комплекс связывают антивидовые антитела, находящиеся на контрольной линии. В результате, отсутствие окрашенной полосы в тестовой зоне и наличие окраски в контрольной зоне свидетельствует о том, что концентрация определяемого вещества в исследуемом образце превышает его пороговое значение для данного теста. При отсутствии анализируемого вещества в образце конъюгат Ат-метка связывается с конъюгатом Аг:белок-носитель, иммобилизованным в зоне тестовой линии. Несвязавшийся конъюгат Ат-метка попадает в зону контрольной линии и связывается там с антивидовыми антителами. Таким образом, наличие двух окрашенных линий является отрицательным результатом анализа. Формат конкурентного ИХА используется для выявления низкомолекулярных соединений, в том числе метаболитов наркотических соединений в моче, жидкости ротовой полости, экстрактах тканей. Преимуществом метода является быстрота его и легкость его применения, возможность использования неприборных форматов ИХА с визуальной оценкой результата анализа. В этом случае не требуется использование никакого оборудования и анализ может быть проведен неспециалистом в любых условиях, в т.ч. "полевых". Существуют также приборные полуколичественные и количественные форматы ИХА, в которых используются специальные ридеры для регистрации интенсивности метки в тестовой зоне тест-полоски ::::::::::::::::: Интеркаляция ДНК 36 Методы биологических исследований Молекула бромистого этидия интеркалирует между адениловыми основаниями ДНК дуплекса Существует несколько способов, которыми молекулы могут взаимодействовать с ДНК. Лиганды могут ковалентно, электростатически связываться либо интеркалировать. Интеркаляция возможна в случае, если лиганд имеет подходящие размеры и химическую природу и может поместиться между основаниями ДНК. Такие лиганды обычно имеют полициклическую, ароматическую структуру, являются плоскими. ДНК интеркаляторы используются при химиотерапии как средства, ингибирующие репликацию ДНК в быстрорастущих раковых клетках, например, доксорубицин и даунорубицин, и дактиномицин. В молекулярной биологии интеркалирующие агенты, такие как бромистый этидий, используются для флуоресцентной маркировки ДНК, например при электрофорезе ДНК в агарозном геле. ::::::::::::::::::::::: Клеточный экстракт Экстракт — разрушенные механическим или химическим способом клетки, использующиеся для воспроизведения биохимических процессов «в пробирке». Для получения экстрактов используются клетки определённого типа, чаще всего, клетки проростков пшеницы или ретикулоцитов кролика. Проведение экспериментов в клеточных экстрактах позволяет контролировать влияние отдельных 37 Методы биологических исследований компонентов на протекание таких сложных процессов как репликация ДНК и транскрипция. При последующем фракционировании экстрактов могут выделятся большие количества отдельных белков, например, факторов инициации трансляции. История В конце XIX века химическое сообщество не имело единого мнения по вопросу о том, необходимы ли для сбраживания сахаров живые клетки или каталитические процессы происходят на уровне отдельных молекул. В 1897 году немецкие химики-братья Ганс и Эдуард Бюхнер показали, что бесклеточный экстракт дрожжей катализирует ферментацию ЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮ Клонирование, в биологии — метод получения нескольких генетически идентичных организмов путем бесполого размножения. Долли— самка овцы, первое млекопитающее, успешно клонированное из клетки другого взрослого существа. Основные сведения 38 Методы биологических исследований Термин клонирование пришёл в русский язык из английского. Первоначально слово клон стали употреблять для группы растений, полученных от одного растения-производителя вегетативным способом. Эти растения-потомки в точности повторяли качества своего прародителя и служили основанием для выведения нового сорта. Позже клоном стали называть не только всю такую группу, но и каждое отдельное растение в ней, а получение таких потомков — клонированием. Со временем значение термина расширилось и его стали употреблять при выращивании культур бактерий. Успехи биологии показали, что и у растений, и у бактерий сходство потомков с организмом-производителем обусловливается генетической идентичностью всех членов клона. Тогда уже термин клонирование стали употреблять для обозначения производства любых линий организмов, идентичных данному и являющихся его потомками. Позже название клонирование было перенесено и на саму технологию получения идентичных организмов, известную как замещение ядра, а потом также и на все организмы, полученные по такой технологии, от первых головастиков до овцы Долли. И уже в конце 1990-х годов XX века, подразумевая возможность применения той же технологии для получения генетически идентичных человеческих индивидов, заговорили и о клонировании человека. Термин перестал быть достоянием научной общественности, его подхватили СМИ, киноискусство, литература, производители компьютерных игр, и он вошёл в язык как общеупотребительное слово, уже не имеющее того специального значения, которым он обладал около ста лет назад. Для бактерий клонирование является единственным способом размножения. Однако обычно, когда говорят о клонировании бактерий, имеют в виду намеренное размножение какой-то бактерии, выращивание её клона, культуры. Естественное клонирование у сложных организмов Клонирование широко распространено в природе у различных организмов. У растений естественное клонирование происходит при различных способах вегетативного размножения. У животных клонирование происходит при амейотическом партеногенезе и различных формах полиэмбрионии. Так, среди позвоночных известны клонально размножающиеся виды ящериц, состоящие из одних партеногенетических самок. У человека естественные клоны — монозиготные близнецы. У некоторых видов броненосцев в норме рождается от четырёх до девяти монозиготных близнецов. Широко распространено клональное размножение среди ракообразных и насекомых. Уникальный вариант естественного клонирования открыт недавно у муравьёв — малого огненного муравья , самцы и 39 Методы биологических исследований самки которого клонируются независимо, так что генофонды двух полов не смешиваются. У этого вида рабочие особи развиваются из оплодотворенных яиц, матки — из неоплодотворенных диплоидных яиц. В некоторых яйцах, оплодотворенных самцами, все хромосомы матери разрушаются, и из таких гаплоидных яиц развиваются самцы Благодаря фундаментальным биологическим открытиям XIX-го — XX-го веков, а именно: открытию клеточного строения тканей, изобретению электронного микроскопа, открытию структуры клеточного ядра, хромосом, ДНК, генов, — стало возможным то, что ныне носит название молекулярного клонирования. Это технология клонирования наименьших биологических объектов — молекул ДНК, их частей и даже отдельных генов. Для молекулярного клонирования ДНК вводят в вектор. Размножаясь, бактерии и фаги многократно увеличивают и количество введенной ДНК, в точности сохраняя её структуру. Чтобы затем выделить большое количество такой ДНК, необходимо отделить бактерии или фаги, которые её содержат, от всех остальных, для чего и применяют клонирование, то есть выделение и размножение бактериального или фагового клона, содержащего необходимые молекулы ДНК. Для облегчения селекции бактериальных клонов в плазмиды обычно вводят ген резистентности к антибиотику, чаще всего ампициллину, в присутствии которого погибают все бактерии, не имеющие клонируемой плазмиды. Такое клонирование необходимо для изучения биологических молекул, их идентификации, решения вопросов клонирования тканей и др. Наибольшее внимание учёных и общественности привлекает клонирование многоклеточных организмов, которое стало возможным благодаря успехам генной инженерии. Создавая особые условия и вмешиваясь в структуру ядра клетки, специалисты заставляют её развиваться в нужную ткань или даже в целый организм. Допускается принципиальная возможность воспроизведения даже умершего организма, при условии сохранения его генетического материала. Различают полное и частичное клонирование организмов. При полном воссоздаётся весь организм целиком, при частичном — организм воссоздаётся не полностью. Репродуктивное клонирование предполагает, что в результате получается целый организм. Кроме научных целей оно может применяться для восстановления исчезнувших видов или сохранения редких видов. Одно из перспективных применений клонирования тканей — клеточная терапия в медицине. Такие ткани, полученные из стволовых клеток пациента, могли бы компенсировать недостаток и дефекты собственных тканей организма и не отторгаться при трансплантации. Это так называемое терапевтическое клонирование. Терапевтическое клонирование предполагает, что в результате намеренно не получается целого организма. Его развитие останавливают заранее, а получившиеся эмбриональные стволовые клетки используют для получения нужных тканей или других 40 Методы биологических исследований биологических продуктов. Эксперименты показывают, что терапевтическое клонирование может быть с успехом применено для лечения некоторых заболеваний, считавшихся неизлечимыми. Клонирование животных и высших растений В 2007 году Яну Уилмуту, одному из создателей овцы Долли, Королева Великобритании Елизавета II пожаловала рыцарское звание. Сформировалась новая фобия, случаи которой встречаются в психиатрии. Врач-психиатр Виктор Яровой, в декабре 2008 года определил новое понятие подобным расстройствам — бионализм. Бионализм — страх перед клонированными людьми, перед их возможным превосходством в физическом, моральном и духовном развитии. Тема клонирования в культуре и искусстве Литературные произведения, фильмы, компьютерные игры, затрагивающие тему клонирования человека и животных. Литература Мы - Е.И. Замятин Геном - Сергей Лукьяненко Люди и слепки Фильмы Через тернии к звёздам Парк Юрского периода Судья Дредд Чужой 4: Воскрешение Звериные Войны — мультипликационный Шестой день Репликант Динокрок 41 Методы биологических исследований Остров Эон Флакс Футурама Звёздные войны Трансформеры — мультипликационный Луна 2112 Универсальный солдат 3: Возрождение Клон Чрево Не отпускай меня ЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮ Коэффициент сходства — безразмерный показатель, применяемый в биологии для определения степени сходства видового состава двух растительных сообществ или зооценозов. К настоящему времени разработано множество коэффициентов сходства, которые можно разделить на две группы: 1. показатели, основанные на качественных данных; 2. показатели, основанные на количественных данных. К наиболее известным показателям первой группы относятся: коэффициент Жаккара: , где а — количество видов на первой пробной площади, b — количество видов на второй пробной площади, с — количество видов, общих для 1 и 2 площади коэффициент Серенсена: , обозначения те же. К наиболее известным показателям второй группы относятся: 42 Методы биологических исследований коэффициент Брея-Кертиса: , где w — сумма меньших количественных показателей для видов, отмеченных на обеих площадях; а — сумма показателей видов 1-й площади, b — сумма показателей видов 2-й площади. Если обилие выражено в десятых долях единицы, то формула Брея-Кертиса упрощается: десятых долях значимость данного вида на 1 площадке, b —значимость данного вида на 2 площадке. , где а — выраженная в Если коэффициент сходства равен 1, то два сообщества обладают абсолютным сходством, если 0, то абсолютным несходством. Для отдельных исследований необходимо вычислить коэффициент несходства, который вычисляется вычитанием найденного коэффициента сходства из единицы ЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮ Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (MALDI) 2. Матрица 3. Механизм ионизации 4. Применение Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация, МАЛДИ — — десорбционный метод «мягкой» ионизации, обусловленной воздействием импульсами лазерного излучения на матрицу с анализируемым веществом. Матрица представляет собой материал, свойства которого обусловливают понижение деструктивных свойств лазерного излучения и ионизацию анализируемого вещества. МАЛДИ масс-спектрометрия находит свое широкое применение для анализа нелетучих высокомолекулярных соединений Впервые возможность применения матрицы для подавления фрагментации при анализе нелетучих органических соединений на примере белков и пептидов была продемонстрирована в 1987 году группой ученых в Германии. 43 Методы биологических исследований Обычно используется в сочетании с времяпролетным масс-анализатором. Таким образом, верхний рубеж определяемых масс ограничивается пропускаемой способностью анализатора. Чувствительность метода: << 1 фемтомоль. Считается, что вещество, используемое в качестве матрицы, должно отвечать следующим основным требованиям: 1) обладать высоким коэффициентом экстинкции при длине волны лазерного излучения; 2) иметь способность к ионизации нейтральных молекул анализируемого вещества путем переноса заряда или заряженной частицы; 3) обладать хорошей растворимостью в растворителях, применяемых в процессе пробоподготовки; 4) быть химически инертным по отношению к анализируемому веществу; 5) иметь низкую летучесть и термическую устойчивость. Стоит указать на селективность в выборе матричных соединений по отношению к классу анализируемых соединений. Во многом это определяется различной природой механизмов образования ионов анализируемого вещества. Как правило, доминирующим процессом в их образовании являются процессы вторичной ионизации, а именно ион-молекулярные взаимодействия между матричными ионами и молекулами анализируемого вещества. Иными словами, вторичная ионизация может происходить за счет таких процессов, как перенос протона, заряженной частицы в виде электрона, металл-катионов. Например, существует широко распространенная группа кислотных матриц для анализа белков и пептидов: 2,5-дигидроксибензойная кислота, различные производные коричной кислот и т. д. Пептиды и белки, как правило, обладают высокими значениями сродства к протону от 900 кДж/моль и более. Эти значения превышают величины сродства к протону матричных соединений, в результате чего реакция переноса протона является экзотермической: А + МН → М + АН, где А – молекула анализируемого вещества, М – матричная молекула. Другой путь образования ионов происходит путем переноса электрона, конечным результатом которого является образование молекулярного радикал-катиона: А + М → А + М. Это наиболее эффективный способ образования положительных ионов для неполярных соединений с низкими значениями энергии ионизации. 44 Методы биологических исследований Примеры МАЛДИ матриц Название Английское название 2,5-Дигидроксибензойная кислота 2,5-Dihydroxybenzoic Acid 2--бензойная кислота 2--benzoic acid α-Циано-4Гидроксикоричная кислота Синапиновая кислота Феруловая кислота α-Cyano-4hydroxycinnamic acid Sinapic Aсid Ferulic Aсid 1,8,9-Антрацентриол 1,8,9-anthracentriol Растворители для матрицы Вода, этанол, метанол, ацетон, ацетонитрил, хлороформ, тетрагидрофуран Диоксан, ацетон, тетрагидрофуран, диметилформамид Ацетон, водн. ацетонитрил, ТГФ, ДМФА, этанол ТГФ, ДМФА ТГФ, ДМФА ТГФ, ДМФА, толуол, хлороформ, хлорбензол Типы исследуемых веществ Пептиды, олигонулеотиды, полисахариды, синтетические полимеры Пептиды, белки, синтетические полимеры Пептиды, синтетические полимеры Пептиды, белки, липиды Пептиды, белки Синтетические полимеры, липиды Схематическое представление механизма МАЛДИ 45 Методы биологических исследований При облучении лазером с длительностью импульса несколько наносекунд и высокими величинами интенсивности излучения из образца, представляющего собой твердый раствор или смесь анализируемого вещества и матрицы, происходит выброс материала в виде микрочастиц. Такие частицы могут достигать размеров несколько сотен микрометров. Над поверхностью образца возникает область высокого локального давления — так называемый факел, который преимущественно состоит из нейтральных частиц. Вместе с тем, в нем присутствуют и заряженные частицы, доля которых по разным оценкам составляет 10—10 от полного числа всех частиц. На начальном этапе образования факела его плотность близка к плотности вещества в конденсированном состоянии. C расширением факела происходит распад конгломератов вплоть до образования отдельных молекул или их фрагментов, а также заряженных частиц. Ионизацию молекул, происходящую непосредственно при выбросе материала из конденсированного состояния, принято рассматривать как первичную. В расширяющемся факеле происходят непрерывные соударения между частицами, в том числе возможны ион-молекулярные реакции между матричными заряженными частицами и молекулами анализируемого вещества, которые приводят к ионизации последнего. Такого рода ионизацию относят к вторичной. Диапазон применения МАЛДИ достаточно широк и охватывает многие классы химических соединений: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Биоорганические соединения; синтетические полимеры; органические комплексные соединения; высокомолекулярные материалы; синтетические дендримеры; фуллерены и др. ЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮ Метод Бредфорда — один из колориметрических методов количественного определения белков в растворе. Предложен Мерионом Бредфордом в 1976 году. Статья М. Бредфорд в журнале Anal Biochem, посвящённая методу количественного определения белка в растворе, является одной из самых цитируемых научных статьей в мире. Принцип 46 Методы биологических исследований Метод основан на реакции красителя кумасси с аргинином и гидрофобными аминокислотными остатками. Связанная форма имеет голубую окраску с максимумом поглощения при 595 нм. Таким образом увеличение адсорбции раствора при длине волны, равной 595 нм, пропорционально количеству белка в растворе. Метод даёт хорошее значение концентрации белка в пределах от 2 мкг/мл до 120 мкг/мл, менее "капризный" по сравнению с методом Лоури. Другие методы Биуретовый метод Микробиуретовый метод метод Лоури спектрофотометрический метод ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, Метод ДНК-комет это метод регистрации повреждения ДНК и изучения репарации на уровне одиночных клеток. Метод способен детектировать разрывы нитей ДНК в отдельных клетках. Является быстрым и весьма чувствительным . История Первым успешным опытом исследования поврежденности ДНК индивидуальных клеток принято считать работу Rydberg и Johanson. Впоследствии метод неоднократно модифицировался и усовершенствовался с целью его упрощения и повышения чувствительности выявления повреждений клеточной ДНК. Применимость 47 Методы биологических исследований Метод ДНК-комет применим в системах in vivo и in vitro. В настоящее время метод широко используется в исследованиях генотоксичности фармацевтических препаратов и промышленных химических веществ, репарации ДНК, апоптоза, клинических исследованиях по пренатальной диагностике, предрасположенности к онкологическим заболеваниям, терапии при раке, катаракте. Данный метод постепенно становится неотъемлемой частью программ по биомониторингу: оценке влияния пищевого рациона, факторов внешней среды, изменений метаболизма и физиологического состояния, старения организма на накопление и репарацию повреждений ДНК; по изучению механизмов радиопротекторных воздействий, формирования радиоадаптивного ответа; исследований по экологии. Использование метода позволяет учитывать гетерогенность сложных популяций, изучать выход повреждений ДНК и репарацию практически в любых эукариотических клетках. При этом для анализа необходимо всего несколько тысяч клеток исследуемого образца. Внешний вид и ранжирование ДНК-комет: Пять условных типов ДНК-комет, которые учитываются при анализе степени поврежденности ДНК ЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮ Метод доминантных летальных мутаций у Drosophila melanogaster 48 Методы биологических исследований генетический тест, который позволяет установить мутагенен ли фактор в отношении половых клеток, за счет учета не развившихся эмбрионов. Простой, экономичный и высокочувствительный метод генотоксикологии для выявления мутагенного эффекта самых различных факторов . История Метод учета частоты доминантных летальных мутаций у Drosophila melanogaster получил широкую известность в 50-70-х годах, когда он активно и повсеместно использовался при выяснении мутагенности химических соединений и особенно гамма-лучей. Важную роль в становлении метода сыграли работы Мэри Л. Александер . Метод не потерял своей актуальности и используется до сих пор . Характеристика метода Применимость Данный метод используется в при тестировании мутагенности: 1. 2. 3. 4. Природных сред: воды и почвы Химических веществ Доз радиации Электромагнитных излучений и полей Кроме того, рекомендован в качестве теста на канцерогены . Достоинства Drosophila melanogaster выбрана объектом метода поскольку это один из наиболее хорошо изученных модельных объектов генетики высших организмов. Около 2/3 генов ответственных за болезни у человека, обнаруживают гомологию в геноме дрозофилы. Основные биохимические процессы в клетках Drosophila melanogaster и млекопитающих идентичны. К достоинствам можно так же отнести тот факт, что у Drosophila melanogaster в процессе метаболизма происходит микросомальная активация веществ. В результате этого промутагены превращаются в мутагены. Это позволяет выявлять скрытые мутагены, которые приобретают генотоксичность в процессе 49 Методы биологических исследований метаболизма . Тесты с использованием Drosophila melanogaster рекомендованы ВОЗ для исследования мутагенной и токсической активности антропогенных ксенобиотиков ЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮ Для постановки опыта используются линии дрозофилы, которые отличаются очень низкой спонтанной мутагенностью в отношении мутаций некоторых типов, что делает их очень удобными для опытов, имеющих целью выяснение различий эффектов индуцированного мутагененза. Воздействию фактора подвергаются самцы. При изучении воздействия электромагнитных излучений требуется подобрать емкость из материала с наименьшими отражающими свойствами. Если изучается мутагенное действие химического соединения, то его примешивают в питательную среду в требуемой концентрации. При изучении мутагенной активности воды или почвы, в качестве емкости используют стаканчики, на дно которых наливают 5 мл исследуемой воды. На дно стаканчика помещается металлическая сеточка таким образом, чтобы вода касалась нижней ее поверхности. На сеточку помещают самцов, которые предварительно были посажены на 3-х часовое голодание. Параллельно ставится интактный контроль. По окончании экспозиции самцов их скрещиваются с самками. Скрещивание проводят в чашках Петри на дно которых была залита агаризованная среда. В чашках мухи содержатся трое суток, через сутки отсаживают самцов, через двое суток — самок. Чашки Петри с отложенными яйцами помещают в термостат на пять суток для выхода личинки из яйца. По истечении этого времени проводится подсчет яиц под микроскопом . Доминантные летальные мутации, которые индуцируются факторами в сперматозоидах, приводят к гибели зиготы или за счёт возникновения в эмбриогенезе, в результате хромосомных аберраций дефицита в геноме, или за счёт различных повреждений, приводящих к блоку редупликации. ПЭЛ и РЭЛ — это два класса ДЛМ, которые хорошо определяются визуально. Яйца с ПЭЛ коричневого, палевого или жёлтого цвета, а с РЭЛ — белого цвета, и внутри них видны остановившиеся этапы сегрегации эмбриона — белые непрозрачные уплотнения. Подсчёт ведётся на стадии яйца, то есть считается количество развившихся из яйца личинок и количество неразвившихся яиц. Также при воздействии на мух мутагенами имеется определённая вероятность откладки неоплодотворённых яиц. Существуют два варианта определения частоты ДЛМ: 1. Подсчитывается общее количество развившихся и не развившихся яиц. Погибшие яйца считают как количество леталей . 50 Методы биологических исследований 2. За летали учитываются только ПЭЛ и РЭЛ. Обозначение Характеристика Расчёт Частота ДЛМ ДЛМ DLM,% — частота хромосомных аберраций и отставаний Частота ДЛМ — рассчитывается как отношение общего числа , где n — количество не развившихся яиц, а N — отложенных яиц к числу не развившихся яиц . общее число отложенных яиц. ЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮ Метод локальной фиксации потенциала Метод локальной фиксации потенциала, patch-clamp — электрофизиологическая методика для изучения свойств ионных каналов, состоящая в том, что фрагмент клеточной мембраны изолируется с помощью специальной микропипетки. Эта методика даёт возможность экспериментатору контролировать разность потенциалов между сторонами мембраны, а также помещать её в среду с определённым химическим составом. В этих хорошо контролируемых условиях измеряют ионные токи, проходящие через мембрану, что, в конечном итоге, позволяет делать выводы о том, как ионные каналы реагируют на электрическое и химическое воздействие. Метод настолько чувствителен, что позволяет наблюдать поведение и химические превращения единичных молекул, взаимодействующих с мембраной. Разработаны экспериментальные протоколы, позволяющие измерять характеристики ионных каналов оптимальным образом. Немецкие исследователи Эрвин Неер и Берт Сакман, разработавшие эту методику, получили Нобелевскую премию в 1991 году. Живые клетки покрыты мембраной, структурную основу которой составляет двойной слой липидов, слабо проницаемый для воды и практически непроницаемый для ионов. Каждая клетка должна обмениваться с внешней средой различными веществами и, в частности, ионами. Перенос ионов через мембрану играет важную роль в процессах возбуждения клетки и передачи сигналов. Ионы проникают в клетку и выходят из неё через встроенные в мембрану белковые структуры — каналы и транспортёры 51 Методы биологических исследований это мембранные белки, которые соединяются с переносимым веществом по одну сторону мембраны, переносят это вещество через мембрану и затем его освобождают. Такой перенос становится возможным потому, что в результате соединения с веществом транспортёр меняет конформацию. Важнейший транспортёр в клетках эукариот — это натрий-калиевый насос. Для работы этого насоса требуется энергия, которую он черпает из запасённой в клетке АТФ. За один цикл своей работы насос выводит из клетки 3 иона Na и вводит в неё 2 иона K. Одна молекула этого транспортёра совершает примерно 10³ циклов в секунду. Сходная частота циклов характерна и для других видов транспортёров. Каналы — это белки, которые выполняют функцию мембранных пор, так как формируют отверстия, сквозь которые могут проходить ионы. Мембранные каналы селективны — проницаемы только для определённых веществ. Селективность обусловлена радиусом пор и распределением заряженных функциональных групп в них. Существуют каналы, селективно пропускающие ионы натрия, а так же калиевые, кальциевые и хлоридные каналы. Для каждого вида ионов существует не один, а довольно много видов каналов. Сквозь один канал за секунду проходит 10 — 10 ионов. Несмотря на фундаментальные различия в механизме транспорта через каналы и транспортёры, они могут быть образованы высокогомологичными белками. Так, недавно получены данные, что мутация единственной аминокислоты в белке транспортёра двухвалентных металлов DMT1 приводит к его превращению в кальциевый канал. Кроме того, существует по крайней мере один транспортёр, осуществляющий 10 переносов в секунду, что очень близко к скоростям, характерным для каналов, и заставляет предположить существование у него некоего «промежуточного» между каналами и транспортёрами механизма. Структура мембранного белка, который может превращаться из транспортёра в канал за счёт одной мутации 52 Методы биологических исследований Так как ионы — это электрически заряженные молекулы, при их переходе через мембранные каналы переносится и заряд, а значит, через мембрану течёт электрический ток. Этот ток можно измерить. Чем больше разность потенциалов между сторонами мембраны, тем больше ток. Проводимость одиночного канала в открытом состоянии варьирует в зависимости от вида канала, от 4-5 до 30—50. Это значит, что при разности потенциалов, равной 100 мВ, через канал потечёт ток в несколько пикоампер. Один внутриклеточный электрод. Измерение разности потенциалов Электрические явления на клеточных мембранах могут измеряться с помощью острых стеклянных микроэлектродов, которые вводятся в клетку. Техника с одним внутриклеточным электродом позволяет измерять разность потенциалов при фиксированном токе. Реже при помощи этой техники можно измерить ток при фиксированном потенциале при помощи методики коммутационной фиксации потенциала. Все измерения происходят исключительно на целой клетке, таким образом изучаются электрические свойства всей клеточной мембраны. Двухэлектродная фиксация потенциала Тот факт, что фиксация трансмембранного потенциала позволит измерять мембранную проводимость по изменениям тока при постоянном напряжении, был впервые осознан ещё в 40-х гг. XX века, и вскоре английские исследователи Алан Ходжкин и Эндрю Хаксли начали эксперименты с двухэлектродной фиксацией потенциала. Суть метода состоит в следующем. В клетку вводятся два электрода, ещё один — электрод сравнения — остаётся вне клетки. Первый внутриклеточный электрод служит для измерения трансмембранной разности потенциалов, второй может подавать ток. Использование одного и того же острого электрода для подачи тока и измерения разности потенциалов невозможно. Дело в том, что такой электрод имеет входное электрическое сопротивление порядка 100-200 МОм, что сравнимо с сопротивлением клеточной мембраны, поэтому, если через систему "электрод-клетка" течет ток, то падение напряжения на электроде окажется соизмеримо с падением напряжения на самой мембране, при чем не существует способа выделить эти две части. Далее, специальное устройство — генератор сигнала — задаёт командный потенциал, которому должен быть равен трансмембранный потенциал. Измеренный трансмембранный потенциал подаётся на вход устройства сравнения, которое вычитает измеренный потенциал из командного и, в зависимости от величины разности, подаёт ток на токовый электрод так, чтобы скомпенсировать эту разницу. Монитор тока, в свою очередь, постоянно измеряет величину тока, которая для этого необходима. В 1940-х 50-х годах, когда работали Ходжкин и Хаксли, не существовало микроэлектродов, поэтому в качестве внутриклеточных электродов использовались тонкие проволоки. Это определило выбор объекта — гигантский аксон кальмара диаметром 1 мм, внутрь 53 Методы биологических исследований которого и вводились эти проволоки. На этом объекте методом двухэлектродной фиксации потенциала исследователи выполнили эксперименты, в которых была установлена ионная природа потенциала действия и впервые постулировано существование ионных каналов. Двухэлектродная фиксация потенциала применяется и в настоящее время, с использованием острых стеклянных микроэлектродов, однако даже с ними эта методика имеет существенные ограничения: два электрода могут быть введены только в весьма крупную клетку. Гигаомный контакт Фотомикрография отверстия пипетки В конце семидесятых годов XX в. Эрвин Неер и Берт Сакман обнаружили, что конусообразные стеклянные пипетки с диаметром кончика 1—2 микрона могут образовывать контакты с клеточной мембраной с сопротивлением в несколько гигаом — это так называемый гигаомный контакт. Он позволяет изолировать от внешней среды и от остальной части мембраны тот её фрагмент, который находится внутри пипетки. Отграниченный пипеткой фрагмент мембраны и называется patch — «фрагмент», слово clamp в названии метода можно интерпретировать и как захват и изоляцию этого фрагмента, так и как фиксацию трансмембранного потенциала в изолированном фрагменте, или, как будет описано позже, потенциала или тока на целой клетке. В пипетку, заполненную раствором электролита, помещается хлор-серебряный электрод, второй электрод размещается внеклеточно, в омывающей жидкости. Отличие электрической схемы от ранее описанной для двухэлектродной фиксации заключается в том что один и тот же электрод используется как для измерения разности потенциалов, так и для подачи тока, что оказывается возможным благодаря сраснительно низкому сопротивлению пипетки. На фото 1 показана часть такой установки. 54 Методы биологических исследований Фото 1. Блок управления patch-clamp установкой. На мониторе видна пипетка, касающаяся поверхности клетки. Cell-attached mode. Огромная сфера, часть которой видна на мониторе в центре фотографии — это клетка, находящийся в данный момент на предметном столике микроскопа, к нему подведена patch-пипетка, её диаметр у носика — около 3 микрон. После установления гигаомного контакта она изолирует фрагмент мембраны площадью приблизительно 7 мкм², ток от ионных каналов в этом фрагменте можно будет записывать. Конфигурация «Cell-attached» Только что описанная конфигурация называется cell-attached patch-clamp. Она иллюстрируется схемой 2. 55 Методы биологических исследований Схема 2. Принципиальная схема patch-clamp в конфигурации Cell-attached. Эта конфигурация, однако, имеет два неудобства. Во-первых, она не позволяет с достаточной надёжностью измерять, а, следовательно, и задавать трансмембранную разность потенциалов — поскольку оба электрода — как пипеточный, так и внешний, находятся по одну сторону мембраны. Вообще говоря, можно, используя омывающий раствор с ионной композицией, повторяющей состав цитоплазмы, деполяризовать мембрану вне пипетки, так что разность потенциалов между внешним электродом и цитоплазмой исчезнет, а тогда разность потенциалов между электродами окажется равна трансмембранному потенциалу — но все это весьма приблизительно, так как точный состав цитоплазмы нам неизвестен. Во-вторых, эта конфигурация не позволяет контролировать состав среды вне пипетки — там остаётся цитоплазма, состав которой не вполне определён. Впрочем, в определенной мере эта особенность конфигурации cell-attached является и достоинством: данная конфигурация позволяет работать в условиях, наиболее близких к физиологическим. 56 Методы биологических исследований Конфигурация Inside-out Однако, если пипетку быстрым движением отвести от клетки, то «внутренний» кусочек мембраны оторвется от клетки и получится конфигурация inside-out, названная так потому, что внутренняя, обычно обращенная к цитоплазме, сторона мембраны окажется снаружи — в омывающем растворе, а наружная — внутри пипетки. Альтернативный метод перехода в конфигурацию inside-out заключается в следующем: из конфигурации cell-attached пипетку отводят плавно, формируя с двух сторон закрытую везикулу; затем поднимают пипетку в воздух и опускают во вторую ванночку, с внутриклеточным раствором. При переносе внешняя мембрана везикулы разрушается, в результате формируется конфигурация inside-out. Схема 3. Принципиальная схема patch-clamp в конфигурации inside-out. Теперь разность потенциалов на фрагменте мембраны строго равна разности потенциалов между электродами. Очевидно, что при использовании такой модификации пипетку заполняют раствором, имитирующим внеклеточную среду, тогда как омывающий раствор делают близким по составу к цитоплазме. При этом, меняя состав омывающего раствора, можно изучать, как такие изменения в цитоплазме влияют на ток интересующих нас каналов — ведь омывающий раствор контактирует с цитоплазматической стороной мембраны). При этом мы точно знаем как состав жидкости по обе стороны мембраны, так и разности потенциалов, что позволяет достаточно точно характеризовать каналы, используя биофизические уравнения Нернста и Гольдмана-Ходжкина-Каца. При этом, если в изолированный участок мембраны попал один канал, то мы наблюдаем поведение единичной молекулы и, если это лигандрегулируемый канал-рецептор, то её взаимодействие с другими единичными молекулами. 57 Методы биологических исследований Конфигурация Whole-cell Если по условиям эксперимента необходимо менять состав внеклеточной среды, можно использовать конфигурацию whole cell. В этом случае пипетку не отводят от клетки, а подают в неё отрицательное давление и таким образом разрушают изолированный фрагмент мембраны. Схема 4. Принципиальная схема patch-clamp в конфигурации whole-cell. После этого пипетка соединена с внутриклеточной средой; поскольку клетка обычно маленькая, то, благодаря диффузии, состав цитоплазмы вскоре оказывается идентичным составу пипеточного раствора, поэтому мы, как и в предыдущем случае, знаем как состав жидкостей, так и разность потенциалов. Отметим, что если в конфигурации inside-out пипеточный электрод был «внеклеточным», а внутренний — «внутриклеточным», то теперь они поменялись ролями. С точки зрения изучения тока через каналы, преимущество этого метода состоит в том, что здесь оказываются сохранны клеточные структуры и регуляторные механизмы. Правда, низкосолекулярные вещества могут диффундировать из цитоплазмы в пипетку и наоборот, так что полной сохранности регуляторных механизмов в данной конфигурации достичь не удается. Определенным недостатком конфигурации можно считать то, что измеряется суммарный ток всех каналов в клетке, а не токи через одиночные каналы, то есть разрешающая способность этого метода ниже, чем у конфигураций с оторванной мембраной. 58 Методы биологических исследований Конфигурация Outside-out Решить проблему сниженной разрешающей способности метода позволяет конфигурация outside-out. Если после перехода в whole-cell mode медленно отводить пипетку от клетки, мембрана не отрывается сразу, а начинает вытягиваться в трубку — это видно на фото 5. Фото 5. Начальная фаза перехода из Whole-cell в Outside-out. Обратите внимание — в пипетке отчетливо видны кусочки цитоплазмы, попавшие туда после разрушения мембраны при переходе в whole-cell. Следующая фаза процесса представлена на фото 6. 59 Методы биологических исследований Фото 6. Переход в outside-out. Заключительная фаза. Мембранная трубка стала совсем тонкой и почти невидима. В следующее мгновение трубка порвётся, а мембрана сомкнется на пипетке в «вывернутом» виде — мы окажемся в конфигурации «outside-out» Итак, пипетка и ее электрод — подобно конфигурации whole-cell — внутриклеточные, мы свободно меняем состав внеклеточного раствора, площадь исследуемой мембраны невелика, так что мы вновь можем изучать одиночные каналы. Схема 7. Принципиальная схема patch-clamp в конфигурации outside-out. 60 Методы биологических исследований Perforated patch Perforated patch— это специфический вариант patch-clamp в whole-cell mode. В данном случае, в пипеточном растворе содержится небольшое количество специального антибиотика, например, амфотерицина-В либо грамицидина. Антибиотики этого класса формируют ионные каналы в клеточной мембране на участке, присоединённом к микропипетке. Такой подход позволяет избежать замещения внутренней среды клетки раствором из пипетки-электрода, то есть клетка остаётся живой с минимальными, насколько это возможно, повреждениями. Таким образом, ответы клетки на раздражители являются максимально приближёнными к естественным. В то же время, данному методу присущ ряд недостатков. Во-первых, по сравнению с классическим whole-cell mode, входное электрическое сопротивление является значительно более высоким. Это понижает качество фиксации потенциала, повышает уровень шума при записи, и увеличивает значения всех ошибок, связанных с изменениями сопротивления полной цепи. Во-вторых, для того, чтобы антибиотик подействовал, требуется довольно много времени, что существенно уменьшает полезный период эксперимента. И, в-третьих, антибиотик повреждает мембрану также и в месте соединения с кончиком пипетки, что приводит к ускоренному разрушению гигаомного контакта и дополнительно уменьшает эффективное экспериментальное время. Таким образом, данный вариант метода может быть с успехом использован только в экспериментах, которые не требуют продолжительного времени для изучения исследуемых явлений. Nucleated patch Интересная разновидность patch-clamp — nucleated patch.. 61 Методы биологических исследований Схема 8. Принципиальная схема установления nucleated patch. Метод состоит в следующем. Пипетка подводится к клетке, а затем рывком пробивает мембрану. После этого кончик пипетки подводится к клеточному ядру, на пипетку подается небольшое отрицательное давление. В результате пипетка присасывается к ядру. Затем пипетка с ядром на конце плавно отводится назад и вынимается из клетки. Пипетку необходимо вывести из клетки таким образом, чтобы участок мембраны в месте выхода «наделся» на присосавшееся ядро и оторвался, обернувшись вокруг него. В результате получается специфический вариант outside-out patch, при котором гораздо больший, чем в обычном варианте метода, участок мембраны присоединён к концу пипетки, будучи обёрнутым вокруг клеточного ядра. Фиксация потенциала и фиксация тока Когда изучаются изменения проводимости однотипных каналов в ответ на какие-то химические воздействия или зависимость их проводимости от разности потенциалов на мембране, удобно фиксировать потенциал и измерять ток канала — как мы до сих пор и описывали. Этот, самый частый вариант patch-clamp, называется voltage clamp. Однако, иногда исследователя интересуют процессы трансмембранного переноса ионов, связанные с изменением мембранного потенциала — например, проведение нервного импульса. В 62 Методы биологических исследований таких случаях можно поступить противоположным образом: зафиксировать на постоянном уровне ток, и изучать изменения разности потенциалов при этом. Такой вариант называется current clamp Примеры записей Рисунок 9. Запись тока одиночного канала Запись одиночного канала рецептора глицина. Чётко видны два состояния: закрытое и открытое. Канал время от времени спонтанно переходит из одного состояния в другое, промежуточных состояний нет. Запись позволяет получить две важнейшие характеристики канала: проводимость и вероятность нахождения в открытом состоянии. К слову, чаще всего активность канала физиологически регулируется путем изменения этой вероятности). Рисунок 10. Запись амилорид-чувствительного тока в главной клетке собирательной трубки почки в конфигурации whole-cell. Запись в конфигурации whole-cell. Клетка эпителия собирательной трубки. Трансмембранный потенциал −60 мВ. С интервалами в 1 минуту на 30 секунд в омывающий раствор вводится амилорид — ингибитор эпителиального натриевого канала. Кстати, чувствительность к ингибиторам — это еще одна из важнейших характеристик канала. Введение амилорида всякий раз приводит к падению тока до нуля, из чего следует, что практически вся проводимость при −60 мВ в данной клетке — это проводимость эпителиального натриевого канала. В противоположность предыдущей записи, изменения тока выглядят непрерывными — это связано с тем, что одновременно записывается много каналов, соответственно, имеется примерно 2000 уровней тока — от «все открыты» до «все закрыты». 63 Методы биологических исследований Планарный patch-clamp Port-a-Patch= измерительний прибор, насос, усилитель, компьютер. планарное сооружение помещается на стол. Это метод, разработанный для увеличения производительности в электрофизиологии, когда требуются массовые измерения трансмембранной проводимости. В частности, этот метод находит применение в фармакологических исследованиях. Если при классическом patch-clamp пипетка позиционируется на неподвижной клетке, то при планарном, напротив, клеточная суспензия наносится на микрочип с упорядоченными отверстиями субклеточного диаметра. Клетка оседает на отверстие, с помощью насоса подсасывается к нему, в результате чего формируется гигаомный контакт. Далее исследование проводится по тому же принципу, что и в традиционном patch-clamp. Основное преимущество планарного patch-clamp состоит в том, что эксперимент выполняется значительно проще, требует меньшей квалификации от исследователя и занимает меньше времени. Достаточно много измерений может быть выполнено одно за другим в автоматическом режиме. По утверждению авторов методики, этот метод позволяет легче осуществлять перфузию внутриклеточного содержимого, а также более точно дозировать исследуемые или тестовые фармакологические вещества. С помощью этого метода относительно легко работать с клетками, обычно находящимися во взвешенном состоянии — в частности, с клетками крови. Вместе с тем, метод планарного patch-clamp имеет ряд существенных ограничений. Основное состоит в том, что исследуемые клетки должны находиться в суспензии. Соответственно, не существует возможности работать с фрагментами ткани, невозможно изучать взаимодействие клеток друг с другом. Для мобилизации клеток необходимо использовать ферменты-протеазы, которые могут модифицировать поведение изучаемых ионных каналов. Все вышесказанное приводит к тому, что планарный patch-clamp находит применение главным образом в фармакологических скрининговых исследованиях, где требуются массовые измерения, но не столь распространен в области фундаментальной науки. 64 Методы биологических исследований ЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮЮ 65