Спецпрактикум кафедры химической энзимологии ЗАДАЧА 4. ПРИМЕНЕНИЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ В
advertisement
Спецпрактикум кафедры химической энзимологии Е.В. Кудряшова Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва Helena_Koudriachova@hotmail.com ЗАДАЧА 4. ПРИМЕНЕНИЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ В БИОТЕХНОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ. В последние годы в результате интенсивного развития биотехнологии и генной инженерии ферменты и белки находят широкое применение в медицине. В настоящее время существует более 400 видов лекарственных средств на основе белков. Однако при пероральном применении таких лекарств стоит проблема ферментативной и/или кислотной деградации в желудочно-кишечном тракте. При внутривенном введении препаратов ряд белок-содержащих лекарств также характеризуются коротким временем полураспада, в частности, вследствие поглощения клетками ретикулоэндотелиальной системы (РЭС), состоящей в основном из макрофагов. Другой проблемой, связанной с применением белков медицинского назначения, является наличие аллергических реакций. Для решения данной проблемы разработан ряд подходов основанных на создании фермент-содержащих функциональных систем, различного типа (по природе, структурной организации и функциональным свойствам), которые применяются в зависимости от назначения лекарств и требований предъявляемых к системам. Иммобилизация белков (ферментов) – суть ограничение подвижности данных биомолекул. Иммобилизация биомолекул является одним из основных методов биотехнологии. Метод иммобилизации широко применяется в производстве лекарственных средств; в пищевой промышленности; в производстве косметических средств; в химическом анализе и многих других областях. Цели иммобилизации весьма разнообразны: это может быть перевод биокатализатора в гетерогенное состояние; стабилизация биокатализатора и/или придание новых функциональных или структурных свойств для более эффективного использования в биокаталитическом процессе. При иммобилизации ферменты из разряда гомогенных катализаторов переходят в разряд гетерогенных или микрогетерогенных. Иммобилизация позволяет пространственно разделить фермент и реагенты, что обуславливает возможность получать продукт без примеси фермента; в нужный момент остановить реакцию; регенерировать фермент после окончания реакции и использовать его для нового цикла биотехнологического процесса. Другим, не менее важным аспектом, является придание белкам по средствам образования надмолекулярных структур требуемых физико-химических свойств (гидродинамические свойства, пространственная ориентация биомолекул, агрегатное состояние). Перечисленные свойства важны для расширения области практического использования ферментов. Фактором, способствующим длительному, в том числе непрерывному, функционированию иммобилизованных ферментов является их повышенная стабильность, сохранение активности в течении длительного времени как при хранении, так и в ходе протекания биокаталитической реакции (операционная стабильность). В результате иммобилизации ферменты могут приобретать свойства, не характерные для них в свободном состоянии. Каковы основные преимущества применения методов иммобилизации (инкапсулирования) при разработке новых лекарственных форм? Адресная доставка. Первое и главное преимущество - включение лекарственных препаратов в наносистемы позволяет осуществлять адресную доставку лекарства. Это может реализоваться за счет целенаправленного подбора размеров наночастиц. Например, размер наночастиц может быть больше диаметра пор капилляров, тогда объем распределения наночастиц, содержащих лекарство ограничивается компартаментом введения. Например, при внутривенном введении наночастицы плохо проникают в здоровые органы и ткани, но хорошо проникают в очаги воспаления, т.к. вблизи очагов воспаления капилляры, снабжающие эти области кровью, сильно перфорированы. Этот процесс называется пассивное нацеливание. Существует также метод «активной» адресной доставки лекарства, где в качестве "молекулярного адреса" наиболее часто выбирают иммуноглобулины, имеющие соответствующие мишени на целевых клетках. Ясно, что в результате адресной доставки (как пассивной так и активной) достигается значительное увеличение эффективности действия препаратов при существенном снижении токсичности. Пролонгированное действие лекарства. Важное преимущество наночастиц как лекарственной формы - постепенное высвобождение лекарственного вещества, инкорпорированного в них, что увеличивает время его действия. Стабилизация против био- и кислотной деградации в желудочно-кишечном тракте при пероральном применении лекарственного препарата. При внутривенном введении – возможна защита (маскирование, экранирование) от захвата макрофагов клетками ретикулоэндотелиальной системы РЭС (например, при модификации поверхности частицы полиэтиленгликолем (ПЭГ)). Снижение иммуногенности за счет маскирования лекарственного материала включенного в микрокапсулы Возможность конструировать комплексные препараты, например, поливалентные вакцины. 1. Биосовместимые материалы для получения фермент-содержащих надмолекулярных систем, применяемых в биотехнологии и медицине. Среди основных требований предъявляемых к носителям предназначенным для применения в биологии и медицине отметим следующие: (1) возможность синтезировать требуемые системы в мягких условиях; (2) возможность контролировать свойства синтезируемых систем (структуры, размера, гидродинамических свойств, прочности); (3) возможность включения целевых биомолекул в мягких условиях; (4) возможность придавать системам желаемые функциональные свойства (например, флуоресцентные или магнитные) путем включения в микро- (нано)капсулы или на их поверхность соответствующих компонентов (например, квантовых точек); (5) биосовместимость и биодеградируемость материалов; (6) стабильность. Материалы, используемые в качестве носителей при иммобилизации биокатализаторов, чрезвычайно разнообразны. Это могут быть частицы на основе силикагеля, гидрооксида титана, циркония, железа и др., полимерные синтетические и природные материалы. Для синтеза оболочек при инкапсулировании биокатализаторов часто используются полиэлектролиты и полиэлектролитные пары поликатион-полианион. Химическая природа, молекулярный вес и структура полиэлектролитов входящих в состав оболочки капсул определяют свойства синтезируемых капсул, структуру, размер, проницаемость, прочность и др. Синтетические полимеры обладают рядом преимуществ: четко контролируемые свойства, высокая стабильность, химическая инертность. Однако, при получении фермент-содержащих надмолекулярных систем предназначенных для применения в биологии и медицине в качестве носителей наиболее широко используются природные материалы: полиэлектролиты или полиэлектролитные пары природных полисахаридов, альгиновая кислота, каррагенан, пектин, хитозан; а также это могут быть белки, которые в силу своих амфотерных свойств в зависимости от рН могут являться как поликатионами, так и полианионами; для приготовления функциональных систем на основе липосом используются природные липиды – компоненты биомембран. Преимущество природных соединений перед синтетическими полимерами в том, что они биосовместимы, нетоксичны и биодеградируемы в физиологических условиях. Рассмотрим некоторые широко применяемые в биотехнологии и медицине полисахариды. Альгинаты, соли альгиновой кислоты, широко используется для получения микро- и нанокапсул многих биоактивных молекул, ферментов, вакцин, инсулина и цитокинов. Альгинаты (соли альгиновых кислот) получают из бурых морских водорослей, они состоят из связанных 1.4-- связями остатков D-маннуроновой (рКа=3.38) и -Lгулуроновой (рКа=3.2) кислот. Альгинат образует гели с высокой степенью гидратации (высоким содержанием воды), высокой прочности, но относительно мягкой консистенции, что делает гидродинамические свойства геля близки по своим характеристикам к природным тканям. Гель на основе альгината образуется в мягких условиях при комнатной температуре без добавления органических растворителей, гель биодеградируем в физиологических условиях. Уникальные свойства альгината делают его одним из основных белковых носителей для доставки лекарств в организме. Пектин. Среди природных полисахаридов, содержащих отрицательно заряженные группы, помимо альгината широко распространенным является пектин, который используется в качестве гелеобразующего и влагоудерживающего агента, а также в качестве загустителя в пищевой и фармацевтической промышленности. Пектин выделяют из клеточных стенок растений, например, из лимонной кожуры. Пектин представляет собой линейный полимер α-галактуроновой кислоты, в котором часть карбоксильных групп находится в метоксилированном состоянии (рис. 1.). Молекулярный вес пектинов обычно находится в интервале 100-1000 кДа. Различают высоко-метоксилированный пектин, в котором степень метоксилирования более 50%, и низко-метоксилированный пектин, в котором степень метоксилирования соответственно меньше 50%. Рис. 1. Структурная формула низкометоксилированного пектина. Взаимодействие пектина с белками лежит в основе его многочисленных практических применениях, в основном для гелеобразования и стабилизации пен и эмульсий в производстве лекарственных средств, пищевых добавок и в пищевой промышленности. Классическим примером является использование пектина для стабилизации казеин-содержащих мицелл в кисломолочных напитках. Благодаря электростатическому взаимодействию отрицательно заряженных групп пектина с положительно заряженными аминогруппами казеина, молекулы пектина адсорбируются на казеиновых мицеллах, тем самым, предотвращая агрегацию в кислых средах. Свойства комплексов белков с анионными полисахаридами (в частности, пектином), применяющихся для стабилизации пищевых коллоидных систем, пен и эмульсий, интенсивно изучаются в связи с открывающимися перспективами промышленного применения. Так, для смеси молочных белков, и некоторых других глобулярных белков было установлено, что в присутствие пектина система может находиться в четырех различных состояниях в зависимости от рН, ионной силы и соотношения компонентов. При нейтральных значениях рН пектин отрицательно заряжен, и хотя общий заряд белков также отрицателен, имеет место взаимодействие положительно заряженных аминогрупп групп белков с карбоксильными группами полисахарида. В таких условиях образуется гомогенная система, состоящая из расторимых белок- полисахаридных комплексов находящихся в равновесии со свободными компонентами (1). При снижении значения рН до изоэлектрической точки белка и ниже образуется растворимый белок-полисахаридный комплекс (2). В частности, в случае β- лактоглобулина растворимый комплекс с пектином образуется при значениях рН 4-5. Дальнейшее снижение значения рН приводит к снижению общего отрицательного заряда комплекса. Наблюдается образование двухфазной системы, состоящей из нерастворимого комплекса, в котором большая часть зарядов ПЭ компенсирована, за счет взаимодействия с белком (образуется белок-ПЭ комплекс «стехиометрического» состава) и водной фазы, в которой растворен избыток полисахарида (3). При значениях рН ниже рКа полисахарида происходит протонирование карбоксильных групп пектина и комплексообразования не наблюдается (4). Таким образом, в случае белок-полисахаридных комплексов, варьирование параметров среды позволяет в широких пределах изменять состояние системы, переходить от гомогенных водных растворов к гетерогенным системам, формировать комплексы различной структуры, и размеров. На этом основано все возрастающее применение пектина и других природных полисахаридов в пищевой и косметической промышленности, в производстве пищевых добавок и лекарственных средств. Аравийская камедь. Аравийская камедь - натуральный гидроколлоидный полисахарид. В ее состав входят арабин (кальциевые, калиевые, магниевые соли арабиновой кислоты), глюкуроновая кислота, гиалуроновая кислота, ксилоза, галактоза растворяется в воде с образованием геля. Гуммиарабик отборный, белый, Gummi arabicum electum, albissimum, употребляется в медицине как средство для похудения, замедляет прохождение пищи по кишечнику, уменьшает всасывание холестерина и жиров, лекарства на основе аравийской камеди обладают смягчающим, болеутоляющим, заживляющим действием. Аравийская камедь - противоожоговое средство для кожи, слизистых дыхательных путей и ЖКТ. Может использоваться как основное лекарственное средство, а также как компонент для инкапсулирования и доставки лекарств. Для иллюстрации практического применения аравийской камеди в пищевой промышленности приведем инкапсулирование капель подсолнечного масла, а также масел лимона и апельсина с использованием комплексов молочных белков с аравийской камедью. Полученные капсулы включались в сыр Гауда в качестве натуральных вкусовых добавок, а также использовались для изменения текстурных свойств сыра. Последние варьировали размером капель масла и составом капсул. Хитозан. Одним из наиболее распространенных и широко используемым аминополисахаридом является хитозан. Хитозан является деацилированным (частично или полностью) производным хитина, линейного полисахарида, построенного из остатков N – ацетил - - D – глюкозамина с 14 – связями между ними (рис. 2). Рис. 2. Структурная формула хитозана. Деацилированные производные хитина, хитозаны, существуют в природе, а также их получают путем химической обработки хитина. Молекулярная масса хитозана в зависимости от источника и способа выделения составляет 0.5 – 8*105 Да. Физикохимические свойства и микробиологическая активность хитозана определяются молекулярным весом и степенью деацилирования. Данные факторы влияют на растворимость полисахарида, вязкость полученных растворов и взаимодействие с клеточными стенками микроорганизмов. Хитозан нерастворим в воде при нейтральных значениях рН, но растворяется в разбавленных органических кислотах, например в водном растворе уксусной кислоты с образованием солей, дающих высоковязкие растворы. Некоторые N – ацилпроизводные хитозана – хорошие гелеобразователи; при ацилирование хитозана производными дикарбоновых кислот получают поперечносшитые гели, удобные для получения ферментсодержащих систем. На примере ряда ферментов: липазы, целлюлазы, щелочной протеазы, L–аспарагиназы и др. было установлено, что в результате их иммобилизации на хитозане существенно увеличивается термостабильность ферментов. В ряде случаев наблюдается увеличение каталитической активности ферментов. Ферменты могут быть иммобилизованы на хитозане, используя как амино- так и гидроксильные группы, такую иммобилизацию называют “двойной иммобилизацией”. Сначала образуется связь между аминогруппой и глутаровым альдегидом, а затем между гидроксильной группой и карбодиимидом (рис. 3.). “Двойная иммобилизация” приводит к дополнительной стабилизации фермента. Рис. 3. Иммобилизация липазы на хитозане. Важным свойством хитозана является его способность образовывать прочные нековалентные комплексы с белками, анионными полисахаридами, а также, хелатные комплексы с металлами, на чем основано его применение в качестве материала для инкапсулирования биомолекул при изготовлении медицинских препаратов; для удаления белка из сточных вод в производстве пищевых продуктов (мясная, рыбная, молочная промышленность, сыроделие), создания хелатирующих ионнонообмеников, иммобилизации живых клеток в биотехнологии, а также при изготовлении медицинских препаратов. Липидные носители. Липосомы находят широкое применение в качестве наноносителей для ферментов и лекарственных препаратов, что обусловлено главным образом близостью свойств липидных носителей и природных биомембран. По своей природе входящие в состав биологических мембран липиды можно разделить на три класса: фосфолипиды, гликолипиды и нейтральные липиды, основным представителем которых является холестерин. Структурные формулы представителей каждого класса представлены в таблице 1. Таблица 1. Структурные формулы основных липидов биомембран. СТРУКТУРНАЯ ОСНОВНЫЕ КЛАСС ПРЕДСТАВИТЕЛИ КЛАССА ФОРМУЛА Фосфолипиды Х R1 и R2 – остатки жирных кислот X: X: Фосфатидилхолин (ФХ) Фосфатидилэтаноламин (ФЭ) Фосфатидилсерин (ФС) X: Фосфатидилинозит (ФИ) X: Кардиолипин X: основных Гликолипиды R – остаток жирной кислоты Y: Н Цереброзиды Y: SO3H Сульфатиды Нейтральные липиды Холестерин Фосфолипиды составляют мажорную часть липидов биомембран. Фосфолипиды со сравнительно длинными углеводородными цепями (18-22 углеродных атома) и большим количеством ненасыщенных связей представляют собой “жидкие” липиды. Температура фазовых переходов таких липидов в биомембранах лежит значительно ниже температуры организма, что необходимо для осуществления в мембранах быстропротекающих процессов. Фазовые переходы в мембранах играют важную роль в протекании не только транспортных процессов, но и функционировании мембранных ферментов и ферментных комплексов. Здесь идет речь о регуляции ферментативной активности при фазовом переходе, т.н. вязкотропной регуляции. Механизм вязкотропной регуляции рассматривает в качестве регулирующего фактора не только фазовое состояние, но и плотность упаковки липидов в мембране, которая определяется насыщенностью и длинной углеводородной цепи. Фосфолипидным составом определяется также проницаемость мембран. Важную роль в регуляции биопроцессов играет холестерин. Не будет большим преувеличением, если сказать, что любое нарушение функционального состояния организма сопровождается изменением уровня холестерина в крови. Молекула холестерина отличается уникальным по сравнению с другими липидными компонентами мембран сочетанием структурных особенностей. Она имеет: жесткий углеводородный скелет, который, как правило, трудно разрушается ферментными системами организма; наличие в структуре в целом гидрофобной молекулы гидроксильной спиртовой группы, благодаря чему молекула холестерина легко может проникать в мембрану. Кроме того, холестерин обладает способностью образовывать многочисленные молекулярные соединения с белками, аминами, глюкозой и другими углеводами, желчными и жирными кислотами, неорганическими солями (CaCl2, MgCl2, ZnCl2 и др.). Холестерин образует молекулярные комплексы и с различными фосфолипидами мембран. Включаясь в мембраны, холестерин делает их структуру более жесткой, уменьшая подвижность как в модельных, так и в естественных мембранах. При включении холестерина в мембранах происходит повышение температуры и скорости фазовых переходов липидов. В присутствии холестерина значительно понижается проницаемость мембран для воды, катионов, различных неэлектролитов и других соединений. Для приготовления липосом наиболее часто используются мембранные фосфолипиды: Фосфатидилхолин (ФХ), Фосфатидилэтаноламин (ФЭ), Фосфатидилсерин (ФС), Кардиолипин, а также часто используют смеси липидов. Размер, форма и биологические свойства липосом определяются и регулируются липидным составом, способом и условиями приготовления липосом. 2. Принципы получении белок-содержащих систем для применения в биотехнологии и медицине. Способы иммобилизации чрезвычайно разнообразны, что позволяет подобрать наиболее оптимальный метод включения биомолекул с учетом специфики их последуещего применения. Иммобилизацию биомолекул можно проводить методом адсорбции или «ковалентной пришивки» ферментов к поверхности природных или синтетических носителей; включением ферментов в полимерные гели, поперечной сшивкой молекул фермента, включением в комплексы с полиэлектролитами; инкапсулированием; а также включение белков в липопротеидные комплексы, липосомы, обращенные мицеллы ПАВ. В последние годы для получения белок-содержащих микро- и наносистем широко применяют комбинации различных методов иммобилизации и/или образования коньюгатов. Ярким примером комбинации нескольких методов иммобилизации относятся получение мультифункциональных многослойных полиэлектролитных капсул, где капсулы являются носителями биомолекул, и при этом капсулам можно придавать требуемые функциональные свойства путем введения специфицеских молекул или коллоидных частиц (например, флуоресцентных или магнитных). Классические методы иммобилизации подробно рассмотрены в книге «Биотехнология» части 1 и 7. ? Студенты при сдаче коллоквиума должны уметь рассмотреть следующие аспекты: 1. Классификация носителей для иммобилизации ферментов и обсудить области их возможного применения (привести примеры); 2. Методы иммобилизации – их применение (привести примеры) 3. Ковалентная «пришивка» фермента к носителю. Активация функциональных групп носителей (привести уравнения реакции) 4. Особенности (характеристики и свойства) иммобилизованных ферментов Здесь мы рассмотрим наиболее часто употребляемые методы при получении белоксодержащих систем для применения в биотехнологии и медицине.: образование интерполиэлектролитных и фермент-полиэлектролитных комплексов, инкапсулирование биомолекул включение в липосомы или обращенные мицеллы ПАВ, образование коньюгатов с полиспиртами ПЭГ и блоксополимерами, плюрониками и проксанолами. Интерполиэлектролитные и Белок-Полиэлектролитные комплексы Метод образования интерполиэлектролитных комплексов широко применяется для получения белок-содержащих коллоидных частиц, а также при создании оболочки микрокапсул. Преимуществом данного метода является технологичность, мягкие условия получения и наоборот - деградации, а также возможность целенаправленного контроля свойств частиц: размера, который может варьироваться от 50-100 нм до микрометров; функциональных, гидродинамических, поверхностных свойств частиц. Белок- полиэлектролитные комплексы (БПЭК) спонтанно образуются, в основном, за счет электростатических взаимодействий противоположно полиэлектролитной пары или пары белок-полиэлектролит (рис. 4.). заряженных групп Рис. 4. Образования белок-полиэлектролитных комплексов. БПЭК устойчивы в широком интервале значений рН и ионной силы и отличаются высокой стабильностью благодаря кооперативному характеру взаимодействия. Состав и свойства БПЭК зависят от таких параметров как рН, ионная сила, количество зарядов на поверхности белка, его изоэлектрическая точка и степень полимеризации полиэлектролита. При изменении рН меняется количество зарядов на поверхности белковой глобулы (рис. 5.), что приводит к изменению числа межмолекулярных контактов между белком и полиэлектролитом, в результате чего меняется состав комплекса, его структура и общий размер частицы. Например, если комплекс состоит из белка и поликатиона, то снижение рН приводит к увеличению "емкости" поликатиона по молекулам белка при неизменной длине поликатиона. При этом уменьшается число межмолекулярных контактов в комплексе в расчете на одну глобулу белка. N 2 1 0 0 pI pH Рис. 5. Зависимость количества положительных (1) и отрицательных (2) зарядов на поверхности белка от рН среды. рI - изоэлектрическая точка белка. Наличие в системе низкомолекулярного электролита оказывает влияние на характеристический состав БПЭК. При увеличении ионной силы низкомолекулярный электролит начинает конкурировать с полиэлектролитом за солевые связи с белком, что приводит к уменьшению "емкости" полиэлектролита по белку. При низкой ионной силе для БПЭК наблюдается образование неравновесного комплекса. Для того, чтобы образовался равновесный БПЭК необходимо добавлять небольшое (5-10 мМ) количество соли в растворы полиэлектролита и белка. При высокой концентрации соли (свыше 0,5 М) происходит полное разрушение комплекса белка с полиэлектролитом, а сильное обессоливание (методом диализа) системы приводит к электростатической дестабилизации частиц БПЭК. При этом увеличивается вязкость среды, что связано с образованием крупных агрегатов, которые при добавлении соли восстанавливают свойства БПЭК. Каталитическая активность ферментов в комплексе с ПЭ Образование комплекса с ПЭ, как правило, не приводит к изменению каталитических параметров ферментов. Катализ ферментами в комплексе с полиэлектролитами как правило описывается схемой Михаэлиса-Ментен. В ряде случаев наблюдаеются увеличение каталитической активности ферментов за счет эффектов микросреды, образуемой полиэлектролитной оболочкой, может наблюдаться также уменьшение константы Михаэлиса в 2-5 раз для низкомолекулярных субстратов, но чаще всего кинетические константы остаются практически неизменными. Для ферментов, включенных в комплекс с полиэлектролитом наблюдается: сохранение каталитических свойств; повышение устойчивости к действию протеолитических ферментов; повышение термостабильности, и стабильности при хранении, часто наблюдается изменение рН профиля зависимости каталитической активности. Студенты при сдаче коллоквиума по данной теме должны уметь объяснить: а) за счет чего может увеличиваться стабильность ферментов? б) за счет чего может меняться рН профиль зависимости каталитической активности ферментов при образовании комплексов с полиэлектролитами? в) Какие свойства обуславливают применимость ИПЭК и фермент-ПЭ комплексов в биотехнологии и медицине? Для получения нерастворимых в воде комплексов применяют метод образования тройных комплексов белок-полианион-поликатион, в которых белок связан с обоими ПЭ и в которых регулируется число нескомпенсированных зарядов на полиэлектролитах путем подбора условий. Данный принцип образования комплексов применяют, например, при синтезе белок-содержащих многослойных полиэлектролитных капсул. Многослойные полиэлектролитные капсулы Многослойные полиэлектролитные капсулы – можно расматриватиь как универсальные мультифункциональные носители. Полиэлектролитные капсулы состоят из следующих блоков: (1) Полиэлектролитные оболочка капсул; (2) Включаемые целевые биомолекулы; (3) Дополнительные функциональные агенты (магнитные, флуоресцентные молекулы или частицы, коллоидные частицы драгоценных металлов, золота или серебра) (рис. 6.). Многофункциональные полиэлектролитные капсулы Полиэлектролитная оболочка капсулы Искусственные ПЭ Включаемые вещества: Биомакромолекулы, лекарства ферромагнитные частицы Белки, антитела, ферменты Природные ПЭ: полисахариды Дополнительные функциональные молекулы/частицы ДНК, лекарства локальный перегрев капсул, коллоидные частицы Au, Ag флуоресцентные молекулы, частицы квантовые точки Рис. 6. Структура многослойных полиэлектролитных капсул Синтез многослойных полиэлектролитных капсул проводят послойной адсорбцией полиэлектролитов (поочередно, поликатионов и полианионов) на противоположных по заряду сферических частицах (рис. 7). Частицы могут быть полистиреновые, силикагельные, карбонатные, (MnCO3, CaCO3, CdCO3), а также это могут быть биологические клетки. После окончания процесса послойной адсорбции сферическая частица, служившая в качестве матрицы при синтезе полиэлектролитных капсул удаляется (например, методом растворения) без повреждения структуры полиэлектролитной оболочки. Рис. 7. Синтез многослойных полиэлектролитных капсул. Для растворения ядра полиэлектролитных капсул используют растворы соляной кислоты, раствор ЕДТА и др. в зависимости от химической природы материала. Размер внутренней полости капсул регулируется размером используемой в качестве матрицы частицы, размер которой и соответственно размер внутренней полости капсул может варьироваться от 20 до нескольких сотен нанометров. Отметим, что для использования в медицинских целях при синтезе многослойных полиэлектролитных нанокапсул используют биосовместимые материалы природные полисахариды и белки (подробное описание материалов приведено выше). Споcобы инкапсулирования целевых функциональных биомолекул. Существует несколько способов включения биомолекул в полимерные капсулы. Одна из стратегий основана на использовании ферментов в кристаллическом состоянии или клеток в качестве ядра (матрицы) капсул, на которые послойно адсорбируют полиэлектролитные оболочки. Активность инкапсулированного фермента при этом польностью сохраняется, сохраняются также нативные функциональные свойства клеток. Недостатком такого способа является невозможность получения монодисперстных частиц и невозможность четкого контроля формы, размеров и других параметров частиц. Другой метод основан на возможности включать биомолекулы в полиэлектролитные нанокапсулы незамедлительно после растворения матрицы (ядра) капсулы. Например, существует возможность регулировать проницаемость полиэлектролитной оболочки капсул изменением условий, например, изменяя значение рН и полярность растворителя, переводя капсулы из «закрытого» состояния в «открытое» и обратно. Так, при понижении рН и в присутствии этанола структура полиэлектролитного комплекса становится более рыхлой и полиэлектролитная оболочка становится проницаемой и доступной для включения белков. После включения целевых биомолекул, полиэлектролитная капсула переводится в «закрытое состояние» путем изменения условий среды (рис. 8.). Преимуществом данного метода является возможность синтезировать монодисперстные нанокапсулы заданного размера внутренней полости, используя в качестве матрицы при синтезе полиэлектролитных капсул комерчески доступные полимерные частицы. Рис. 8. Включение функциональных биомолекул методом регулирования проницаемости полиэлектролитной микрокапсулы Альтернативным методом включения целевых функциональных биомолекул является предварительная адсорбция целевых биомолекул на порах наночастиц (например, карбонатных кристаллов), используемых в качестве матрицы при синтезе полиэлектролитных капсул с последующим растворением матрицы в мягких условиях, низких рН или в присутствии ЕДТА. Недостатком подхода является методические трудности при получении монодисперстных карбонатных наночастиц. Помимо включения целевых биомолекул, полиэлектролитным капсулам можно придавать дополнительные функциональные свойства. Например при включении полупроводниковых коллоидных наночастиц CdSe или CdTe (квантовых точек) капсуле придают флуоресцентные свойства и тем самым, возможность детекции наночастиц (рис. 6.). Путем включения магнитных наночастиц, Fe3О4, капсулам придают контролируемую подвижность в требуемом направлении с заданной скоростью, которую регулируют, применяя внешний градиент магнитного поля. Включение коллоидных частиц благородных металлов, золота или серебра в полиэлектролитные слои позволяет регулировать проницаемость полиэлектролитных капсул или инициировать их разрушение. Метод основан на том, что поглощении света частицами золота или серебра приводит к локальному перегреву полиэлектролитных капсул, что ведет к разрушению капсулы и выбросу целевых молекул (лекарства) (рис. 10). Физико-химические методы контроля свойств частиц Для контроля свойств полиэлектролитных капсул и/или роста полиэлектролитных слоев на сферической матрице при синтезе частиц используют ряд физико-химических методов, светорассеяние, электрофоретическая подвижность, за структурой частиц обычно следят методом атомно-силовой микроскопии. Метод лазерной сканирующей микроскопии (или флуоресцентной микроскопии) используется для наблюдения в реальном времени и в условиях in vivo за свойствами нанокапсул, их подвижностью, проникающей способности, поглощения клеткой, и доставкой инкапсулированных материалов. Контролируемая доставка и выброс лекарства. Механизм контролируемого выброса лекарства основан на разрушении или регуляции проницаемости оболочки нанокапсул с применением физических методов (свет, ультразвук, радиоволны). Рис. 9. Контролируемый выброс лекарства путем разрушения нанокапсулы под воздействием лазерного света. (i) Направленный лазерный луч вызывает локальный нагрев частиц коллоидного золота (содержащихся в нанокапсуле), что приводит к светоразрушению капсулы и высвобождению инкапсулированного материала. Таким образом, многослойные полиэлектролитные капсулы являют собой мультифункциональные наносистемы, с четко регулируемыми свойствами. Инкапсулирование альгинат-хитозан. Основная область применения - для доставки лекарств, инкапсулирование обеспечивает устойчивость лекарств (в том числе, белков) к био- и кислотной деградации в желудочно-кишечном тракте, а также пролонгированое действие лекарств. Одним из наиболее широко применяемых методов для придания требуемых свойств лекарственным средствам на основе белков является инкапсулирование биоактивных молекул с использованием альгината, каррагинана, коллагена, желатины, целлюлозы, а также некоторых синтетических полимеров. Белки включенные в такие частицы характеризуются высокой биологической и термостабильностью, устойчивостью к изменению рН, улучшенным (в том числе, более пролонгированным) лечебным эффектом и возможностью направленной доставки. Существует два принципиально различных способа инкапсулирования биомолекул. Первый способ – метод внешнего гелеобразования. Раствор альгината, содержащий инкапсулируемый материал (белок) с помощью специального «микроразбрызгивателя» вносят в раствор хлорида кальция. «Микроразбрызгиватель» (или пульверизатор) позволяет получать однородные капли заданного размера. При контакте альгината с ионами кальция немедленно образуются сферические полимерные белок-содержащие частицы. Гелеобразование происходит в направлении от поверхности к центру частиц. гелеобразования. Поэтому рассматриваемый метод называют способ внешнего Рассмотрим метод внутреннего гелеобразования при инкапсулировании биомолекул с использованием альгината (рис. 10). Иммобилизацию биомолекул на частицах альгината проводят следующим образом: к раствору альгината добавляют твердый измельченный карбонат кальция. Полученную смесь эмульгируют в растительном масле, содержащем ПАВ (SPAN 80). Гелеобразование инициируют понижением рН системы (добавлением 0.2% уксусной кислоты). Частицы геля промывают от масла. На полученных сферических частицах адсорбируют фермент, после чего покрывают пленкой хитозана по механизму электростатического комплексообразования. Вопросы студентам: 1) при каких значениях рН (интервал) следует проводить адсорбцию фермента? наносить на фермент-содержащие частицы хитозановое покрытие? 2) Как можно определить эффективность (выход) инкапсулирования (по ферменту?) Рис. 10. Инкапсулирование ферментов на альгинат-хитозановых частицах. В заключении отметим, преимуществом инкапсулирования методом внутреннего гелеобразования путем эмульгирования является возможность получения частиц заданного размера, варьированием условий (содержания воды, ПАВ в системе). Включение ферментов и других биологически активных молекул в липосомы Искусственные липопротеидные комплексы, липосомы, обращенные мицеллы, часто применяются в биологии для изучения мембраноактивных белков и моделирования различных ферментативных, транспортных и рецепторных функций клеточных мембран. Липосомы часто используют в медицине и косметике, поскольку такие системы по своим свойствам близки к природным мембранам. Основное применение липосом в области медицины – создание биосовместимых носителей для направленной доставки биоактивных молекул, лекарств. Липосомы представляют собой частицы, которые образованы одним или несколькими концентрическими замкнутыми липидными бислoями, внутренний объем которых изолирован от внешней среды. В зависимости от размера частиц и числа образующих их липидных слоев различают следующие липосомы: 1) малые моноламеллярные, образованные одиночным липидным бислоем (диаметр 20-50 нм); 2) крупные моноламеллярные (макровезикулярные), образованные также одиночным бислоем (диаметр 50-200 нм и выше); 3) многослойные (мультиламеллярные), насчитывающие до неск. десятков и даже сотен липидных бислоев (диаметр до 5000-10000 нм) (рис. 11). Рис. 11. Липосомы могут быть однослойными (диаметр 20- 50 нм) и многослойными (5 50 микрометров). Заштрихованные зоны – место нахождения воды, светлые – бимолекулярный липидный слой, «хвосты» составляющих его молекул обращены внутрь слоя. Один из способов получения фермент-содержащих липосом заключается в том, что раствор липида в органическом растворителе впрыскивают с помощью микро-шприца в воду или водный солевой раствор при температуре, несколько превышающей точку кипения растворителя. После испарения растворителя в токе инертного газа происходит самопроизвольное образование (самосборка) бислойных пузырьков, липосом, содержащих включенный фермент. В другом варианте раствор липида (например, лецитина) в органическом растворителе (например, в хлороформе) упаривается в вакууме. Липид остается на стенках колбы в виде тонкой пленки. Затем в колбу вносят раствор фермента, встряхивают и выдерживают в течении некоторого времени. В полученной системе происходит самосборка мультиламеллярных липосом, содержащих включенный фермент. Для удаления невключившегося фермента липосомы отделяют центрифугированием и ресуспендируют в водном буферном растворе. Моноламеллярные липосомы получают из мультиламеллярных ультразвуковой обработкой. Недостатком таких систем являются их недостаточная устойчивость, что сужает область их практического применения в медицине. В последние годы применяют способ получения фермент-содержащих липосом путем включения ферментов в полимерные липосомы. Для получения липосом в этом случае используются липиды, модифицированные путем введения в их молекулу кратной связи. После включения фермента в липосомы, приготовленные из модифицированных молекул липидов, проводят полимеризацию липидных молекул (например путем облучения ультрафиолетовым светом в присутствии инициатора). Образуются ковалентно сшитые замкнутые липидные бислойные мембраны. Полимерные липосомы обладают гораздо более высокой стабильностью по сравнению с обычными. Липосомы часто применяются в биологии для изучения мембраноактивных белков и моделирования различных ферментативных, транспортных и рецепторных функций клеточных мембран. Липосомы очень хорошо зарекомендовали себя в качестве модельной системы при изучении свойств биомембран. Липосомы позволяют воссоздавать элементы биологических структур непосредственно из материала биологических мембран. Было обнаружено, что отделенные от биомембран мембранные ферменты после включения в липосомы обнаруживают сходные со связанным на биомембране ферментом физические и каталитические свойства. В настоящее время липосомы применяются в экспериментальной медицине и косметике как одно из основных средств доставки биоактивных молекул и лекарственных средств. Многие липосомальные препараты дошли до клинических испытаний и некоторые из них лицензированы и применяются. Применение липосом имеет ряд существенных преимуществ перед другими носителями лекарств. Прежде всего, это биосовместимость, что обусловлено сходством с природными мембранами клеток по химическому составу: мембрана липосом состоит из природных фосфолипидов. И при правильном подборе компонентов липосом их введение в организм не вызывает негативных реакций. Второе важное свойство липосом – это универсальность. Благодаря полусинтетической природе можно широко варьировать их размеры, характеристики, состав поверхности. Кроме того, вещество, заключенное в липосомы, защищено от воздействия ферментов, что увеличивает эффективность препаратов, подверженных биодеструкции в биологических жидкостях. Это позволяет использовать липосомы в качестве носителей для широкого круга фармакологически активных веществ: противоопухолевые и противомикробные препараты, гормоны, ферменты, вакцины, а также дополнительные источники энергии для клетки, генетический материал. В-третьих, липосомы сравнительно легко разрушаются в организме (они биодеградируемы), высвобождая доставленные вещества. В процессе доставки лекарств липосомы, сами лишенные свойств антигена, экранируют включенные в них биоактивные молекулы от контакта с иммунной системой, не вызывая защитных и аллергических реакций организма. Еще одно важное преимущество липосом как лекарственной формы постепенное высвобождение лекарственного вещества, инкорпорированного в них, что увеличивает время его действия. Особую роль играет характер взаимодействия липосом с клетками, который может принимать различные формы: самая простая – липосомы адсорбируются на клеточной поверхности. При определенных условиях липосомы могут поглощаться клетками, их мембрана может сливаться с клеточной мембраной, что приводит к внутриклеточной доставке их содержимого (рис. 12). Рисунок 12. Способы проникновения содержимого липосом в клетку (из работы А.П. Каплун, Ле Банг Шон, Ю.М. Краснопольский, В.И. Швец. Вопросы медицинской химии. 1999. Том 45. выпуск 1). Как носители лекарств липосомы наиболее широкое применение получили в экспериментальной онкологии. Суть в том, что существует ряд препаратов, весьма эффективно разрушающих злокачественные клетки или тормозящих их рост. Однако применить их в терапевтических целях не всегда возможно из-за их большой токсичности или плохой растворимости в воде. С помощью липосом эти трудности могут быть преодолены. Так, одно из свойств липосом, регулируемость их размеров в нанодиапазоне стало основой для конструирования эффективных антираковых препаратов. Речь идет о соотношении размеров частиц и диаметра пор капилляров. В случае когда размер липосом больше диаметра пор капилляров, их объем распределения ограничивается компартаментом введения. Например, при внутривенном введении они не выходят за пределы кровотока, т.е. должны плохо проникать в органы и ткани. Следовательно, резко понижается токсическое действие субстанции, включенной в липосому. С другой стороны, это свойство может служить основой для направленной доставки терапевтических препаратов в опухоли и очаги воспаления, так как капилляры, снабжающие эти области кровью, как правило, сильно перфорированы (рис. 13). Следовательно, частицы, содержащие лекарство будут накапливаться в опухоли. Это явление получило название пассивное нацеливание. Таким образом, существует две причины, вследствие которых липосомальные препараты антиканцерогенных субстанций очень эффективны: уменьшение токсичности и пассивное нацеливание. Следствия: - Уменьшение токсичности - Пассивное нацеливание в "горячие" области - Уменьшение объема распределения и, след. - Увеличения концентрации в кровотоке Рис. 13. Пассивное нацеливание Использование липосом для точной, целенаправленной доставки лекарственных веществ имеет, однако, и определенные сложности. Дело в том, что после попадания в организм большая часть липосом поглощается клетками ретикулоэндотелиальной системы (РЭС). Для увеличение времени циркуляции липосомальных препаратов было предложено их поверхность модифицировать полимерами с гибкой гидрофильной цепью, например полиэтиленгликолем (ПЭГ). Для этого используются модифицированные липиды, например, фосфатидилэтаноламин (ФЭ), конъюгированный с ПЭГ. На рис. 14 представлена схема такой "стерически стабилизированной" липосомы. Гибкие молекулы ПЭГ создают в примембранной области избыточное осмотическое давление. Липосомы как бы становятся невидимыми для РЭС (отсюда и название "stealth liposomes"). Рисунок 14. А. Стерически стабилизированные липосомы (Stealth liposomes). Белки (1) не могут достичь поверхности липосом (2) из-за избыточного осмотического давления в примембранном пространстве, создаваемом гибкими цепями (3) иммобилизованных полимеров (например, ПЭГ). Б. Фосфатидилэтаноламин, конъюгированный с ПЭГ, используемый для получения стерически стабилизированных липосом. Рис. 15. демонстрирует насколько увеличивается время циркуляции стерически стабилизированных липосом. Рисунок 15. Время циркуляции липосом, модифицированных ПЭГ в сравнении с обычными липосомами (из работы Torchilin V.P. et al. (1994) BВА, 1195, 181-184). Во многих случаях важна адресная доставка в нужный тип клеток. В качестве "молекулярного адреса" наиболее часто выбирают иммуноглобулины, имеющие соответствующие мишени на целевых клетках. Таким образом, можно представить модель "идеальной" липосомы, как средства направленной доставки лекарственного вещества в клетку (рис. 17). Такая липосома содержит во внутреннем объеме лекарственное вещество, например, ДНК в случае генной терапии, на ее поверхности иммобилизованы гибкие цепи полимера для уменьшения поглощения клетками РЭС, молекулярный адрес, в мембрану инкорпорированы белки слияния. Кроме того, мембрана состоит не только из обычных фосфолипидов, образующих бислой (чаще фосфатидилхолина), но и липидов способствующих слиянию с мембраной клетки (например, диолеоилфосфатидилэтаноламина). Рисунок 17. "Идеальная" конструкция липосомы для направленной доставки лекарственного вещества в клетку (из работы А.П. Каплун, Ле Банг Шон, Ю.М. Краснопольский, В.И. Швец. Вопросы медицинской химии. 1999. Том 45. выпуск 1). 1) Полимер для стерической защиты от РЭС (например, ПЭГ); 2) "Молекулярный адрес" на полимерной ножке (в основном иммуноглобулины); 3) Белки слияния (например, гемагглютинин); 4) Лекарственное вещество (например, ДНК); 5) Липидные положительно заряженные частицы для компактизации ДНК; 6) Мембранообразующие липиды (фосфатидилхолин); 7) Липиды, дестабилизирующие мембрану (например, ФЭ). Основной недостаток липосом как лекарственной формы - относительная небольшая стабильность при хранении. Но, и эта проблема решается. Так, был найден способ сушки предварительно замороженных липосом. Такие высушенные липосомы, содержащие лекарственные вещества, способны храниться достаточно долго: месяцы и годы. Для их использования достаточно прилить к ним тот объем воды, который был удален при сушке. Обращенные мицеллы - сферические частицы, образованные ассоциатами дифильных молекул ПАВ, в которых гидрофобные части молекул ПАВ направлены в сторону неполярного растворителя, а полярные группы – внутрь мицелл. Обращенные мицеллы самопроизвольно образуются в тройных системах ПАВ-вода-органический растворитель. В качестве мицеллообразующего материала используются разнообразные синтетические ПАВ, а также природные липиды. Мицеллы, построенные из анионных ПАВ, (в отличие от катионных), как правило, характеризуются узким распределением по размерам, размер мицелл не зависит от концентрации ПАВ. Благодаря способности образовывать монодисперсные системы, широкое применение нашли обращенные мицеллы на основе АОТ, натриевой соли ди-(2-этил)-гексилового эфира сульфоянтарной кислоты. Ферменты могут включаться в обращенные мицеллы ПАВ в органических растворителях с сохранением их функциональной активности. При солюбилизации ферментов в системе обращенных мицеллы ПАВ молекула белка может «выбрать» оптимальное микроокружение, соответствующее ее природе. Как показано на рисунке 18, молекула гидрофильного белка избегает прямого контакта как с органическим растворителем, так и с поверхностью внутренней полости мицеллы, локализуясь в водном ядре гидратированной обращенной мицеллы. Поверхностно-активные белки, например липазы, имеют возможность взаимодействовать с поверхностным слоем обращенной мицеллы или даже частично в него погружаться. И наконец, типичные мембранные ферменты, если это термодинамически выгодно, могут вступать в контакты с органическим растворителем (рис. 18). Рис 18. Схематическое изображение обращенной мицеллы, содержащей: гидрофильный (Е1), поверностно-активный (Е2) и гидрофобный (Е3) белок. Одним из главных достоинств мицеллярных систем является возможность целенаправленного варьирования основных физико-химических параметров путем простого изменения соотношения компонентов системы (рис. 19.). [ПАВ] [Н2О] Рис. 19. Основные способы регуляции параметров системы обращенных мицелл. 1 - увеличение содержания воды при [ПАВ]=const: размеры мицелл растут, их число уменьшается; 2 – увеличение в одинаковой пропорции концентрации воды и [ПАВ]: размеры мицелл остаются неизменными, их число увеличивается; 3 – увеличение концентрации ПАВ при постоянной концентрации воды: размер мицелл уменьшается, их число растет. Мицеллярный подход является в настоящее время классическим методом контроля олигомерного состава ферментов. Применение обращенных мицелл позволяет целенаправленным подбором размера мицеллярной матрицы (при варьировании степени гидратации системы) формировать желаемую надмолекулярную форму белка. Обращенные мицеллы можно рассматривать как своеобразный «наноконтейнер», позволяющий проводить как ассоциацию, так и диссоциацию белковых комплексов, получать надмолекулярные белковые структуры не реализующиеся в водных растворах. С точки зрения практического применения перспективным направлением является управляемая диссоциация «тел включения» и сворачивание ферментов в системе обращенных мицелл ПАВ. Проблема сворачивания рекомбинантных белков на сегодняшний день остается нерешенной для многих случаев. Особенно, эта проблема проявляется в случае больших, мульти-доменных и гидрофобных ферментов. Особенностью мицеллярного подхода является возможность изолировать молекулу фермента в отдельной мицелле, что с одной стороны, усиливает эффективность процесса сворачивания (подобно действию молекулярных шаперонов), а с другой стороны, защищает фермент от межмолекулярного взаимодействия, межмолекулярных S-S-связей и агрегации белка в процессе рефолдинга. образования Образование конъюгатов полиэтиленгликоля (ПЭГ). биологически Применяется активных для молекул стабилизации с молекулями белок-содержащих лекарственных средств, увеличения времени циркуляции лекарств, транспорт лекарств, уменьшение иммунного ответа на введение чужеродных белков. Лекарственные препараты белковой или пептидной структуры (интерфероны, гормоны, факторы роста, цитокины, тромболитики) все больше применяются в медицине. Как уже отмечалось, лечение нативными препаратами белковой природы имеет ряд существенных недостатков: белки быстро гидролизуются в гастроинтестинальном отделе пищеварительного тракта и поэтому используются, как правило, парентерально. Относительно короткий период "естественной" полужизни таких препаратов в организме пациента предусматривает их многократное использование для достижения требуемого терапевтического воздействия. Еще одним важным негативным фактором, ограничивающим применение нативных или рекомбинантных белковых препаратов, является их высокая иммуногенность и связанные с ней сенситивные реакции. Одним из путей повышения эффективности лекарственных препаратов белковой структуры является "пегилирование" - химическая модификация белков полиспиртами, полиэтиленгликолем (ПЭГ) и блоксополимерами (пролиэтилен- и полипропиленгликоля), плюрониками и проксанолами.полиэтиленгликолем (ПЭГ). Подобная химическая модификация фармакологических препаратов белковой природы направлена на улучшение их переносимости, снижение иммуногенности, повышение периода их полужизни. В настоящее время ПЭГ одобрен Управлением по питанию и лекарственным препаратам США (FDA) в качестве субстанции, разрешенной к использованию в медицине (производство лекарственных препаратов), продуктах питания и косметологии. Для пегилирования белков применяется метод образования нековалентных аддуктов, образующихся в условиях инкубирования смеси белка и ПЭГ в условиях повышенного давления, а также ковалентная модификация по аминогруппам белка. При этом удобно использовать моноальдегидные производные полиспиртов, например: ПЭГ (1) - СН3(ОСН2СН2)44ОСН2СНО; ПЭГ (2) - СН3(ОСН2СН2)16ОСН2СНО; Проксанол (1) - С4Н9[OCH(CH3)CH2]14(OCH2CH2)20OCH2CHO; Проксанол (2) - С4Н9(OCH2CH2)20[OCH(CH3)CH2]14OCH(CH3)CHO. Молекулы ПЭГ могут иметь различную молекулярную массу и стереохимическую структуру. Молекулярный вес молекул ПЭГ может колебаться в пределах 300 - 4000 Дальтон, а выстроенные в цепи макромолекулы ПЭГ могут формировать как разветвленную, так и линейную стереохимию. Именно масса ПЭГ и его стереохимическая структура, как правило, определяют принципиальные свойства будущего модифицированого белкового субстрата. В основном более длинные цепи ПЭГ обуславливают большую продолжительность периода полужизни коньюгата "ПЭГ пептид" и его фармакологическую стабильность. Другим важным фактором, влияющим на фармакодинамику и фармакокинетику ПЭГ - модифицированных белков, является структура ПЭГ - цепочек: разветвленная молекула ПЭГ формирует замедление активного метаболизма препарата, что также влечет за собой удлинение времени активной циркуляции препарата. С разветвленной структурой цепочек ПЭГ связана также и значительно меньшая иммуногенность модифицированных препаратов при сохранении их основных фармакологических свойств. Подобные эффекты могут быть достигнуты и другим путем - связыванием пептида, например, не одной, а несколькими молекулами ПЭГ, имеющими при этом линейную структуру цепочек. Хорошо изученным примером в этой связи является молекула интерлейкина - 2 (ИЛ - 2). Так как молекула ИЛ - 2 очень мала, последняя свободно фильтруется через почки и имеет очень короткий период полужизни. Соединение ИЛ - 2 с ПЭГ, имеющей молекулярную массу менее 20 kDa, практически никак не влияет на фармакодинамику белка, но повышение молекулярной массы ПЭГ до 60 - 70 кДа уже значительно замедляет фильтрацию коньюгата "ПЭГ - ИЛ 2" и увеличивает его время полужизни и биологическую доступность. Одно из важнейших свойств модифицированных ПЭГ - молекул - высокая гидрофильность, формирующая принципиально новые физико-химические свойства модифицированного белка. При модификации белка молекулами ПЭГ происходит формирование "водного облака" вокруг модифицированной молекулы "ПЭГ - белок", за счет чего значительно повышается гидродинамический радиус коньюгата. Этот своеобразный "щит" воды вокруг модифицированной молекулы белка с одной стороны значительно повышает растворимость и биодоступность препарата, с другой - защищает молекулу от других белков (нейтрализующие антитела, комплемент). Таким образом ПЭГ - модифицированные пептиды значительно более защищены от опсонизации (взаимодействия с белками плазмы – опсонинами, которые "метят" чужеродные компоненты, делают их мишенями для клеток ретикулоэндотелиальной системы РЭС) и активного фагоцитоза клеточных структур макроорганизма. ПЭГ - модификация белковых препаратов, привнесла серьезные изменения в результаты лечения при таких заболеваниях, как ферментные дефициты, лейкемия, хронические воспалительные заболевания, онкология, хронические вирусные инфекции, кардиоваскулярная патология. Например Пегинтерферон альфа-2b применяется в противовирусной терапии, индуцирует подавление репликации вирусных ДНК или РНК, что и определило его широкое применение при лечении хронических вирусных гепатитов B и С. Данный препарат уже прошел все необходимые клинические испытания и зарегистрирован к применению во всех ведущих европейских странах (в том числе и России) и США под коммерческим названием ПегИнтрон. На рисунке 2. представлены профили фармакокинетики двух препаратов: нативного интерферна альфа-2b (Б) и пегилированного его коньюгата ПегИнтрона (А). Очевидно, что ПегИнтрон имеет значительно лучший биологический профиль, по сравнению со стандартным интерфероном альфа-2b; это выражается значительным повышением периода полужизни пегилированого аналога, снижением его иммуногенных свойств. Период "эффективной" полужизни препарата составляет в среднем около 40 часов! Для ПэгИнтрона характерен баланс между противовирусной активностью и длительным периодом полувыведения, позволяющим назначать препарат один раз в неделю, а также эффективно выводить метаболиты ПЭГ из организма. А Б 10 20 30 40 50 60 70 80 Время, часы Рис. 19. Фармакокинетический профиль стандартного (Б) и пегилированного интерферона альфа-2b (А) (Из обзора И. Г. Никитин, Г.И. Сторожаков. 2001. Пегилированные лекарственные преапраты: современное состояние проблемы и перспективы. (www.hepatit.ru)) Таким образом, пегилирование лекарственных препаратов пептидной структуры имеет ряд весомых и несомненных преимуществ, которые ранее были просто невозможны при использовании нативных аналогов: усиление биологической активности, удлинение периода "эффективной" полужизни, замедление выведения, понижение токсичности и иммуногенности. К основным недостаткам ПЭГ - коньюгированных пептидов, используемых и в качестве уже разрешенных лекарственных форм, и в продолжающихся клинических испытаниях, можно отнести: возможное уменьшение активности белка, связанное с выбором "неправильного" размера или структуры ПЭГ; с этой же причиной может быть связано и возможное удлинение элиминации пептида. Так или иначе, полученные результаты уже проведенных и продолжающихся клинических испытаний с ПЭГ - модифицированными препаратами белковой структуры, а также экспериментальные данные свидетельствуют о явном преимуществе коньюгированных аналогов по сравнению с нативными белками. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, одним из основных направлений исследований в медицинской биотехнологии является создание функциональных или многофункциональных систем, включающих в свой состав биологически активных вещества. При этом, в первую очередь, ставятся задачи направленной доставки лекарств, создания новых противоопухолевых и антиоксидантных соединений. Рассматриваются направления создания магнитноуправляемых частич, обладающих термочувствительностью. Развитие медицинской биотехнологии в перспективе способно привести к новому уровню понимания биологических процессов и созданию принципиально новых средств диагностики, профилактики и лечения многих заболеваний. РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА Основная: 1. А. Ленинджер. Основы биохимии: В трех томах. (1985) Изд-во: М.: Мир. 2. Серия Биотехнология, книга 1 «Проблемы и перспективы». Москва. Высшая школа. 1987. 3. Серия Биотехнология, книга 7 «Иммобилизованные ферменты». Москва. Высшая школа. 1987. 4. Жан-Мари Лен. Супрамолекулярная химия. Концепции и перспективы. Издательство: Наука, Новосибирск. 1998. Дополнительная: 1. Дж. В. Стид, Дж. Л. Этвуд. Супрамолекулярная химия (комплект из 2 книг). Академкнига. 2007. 2. А. И. Гусев Наноматериалы, наноструктуры, нанотехнологии. Физматлит. Москва. 2007 г . 3. Ч. Пул-мл.,Ф .Оуэнс Нанотехнологии. 3-е издание Техносфера. Москва. 2007. 4. А.П. Каплун, Ле Банг Шон, Ю.М. Краснопольский, В.И. Швец. (1999) Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ. Вопросы медицинской химии. Том 45 (1). 5. И. Г. Никитин, Г.И. Сторожаков. (2001) Пегилированные лекарственные преапраты: современное состояние проблемы и перспективы (www.hepatit.ru). 6. Nanotoday 2008. vol. 3 (3-4) p. 12-21 and 22-30. 7. Niemeyer C., Mirkin C., Nanobiotechnology: Concepts, Applications and Perspectives. Wiley, 2004. 8. Goodsell D., Bionanotechnology: Lessons from Nature. Wiley-Liss, 2004. 9. Reddy R. - Controlled - release, pegylated, liposomal formulations: new mechanisms in the delivery of injectable drugs. - Ann. Pharmacol. - 2000; М. 34. 915 – 923. ЗАДАЧА 4 ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗАДАЧА ИЗУЧЕНИЕ ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТИ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ЩЕЛОЧНОЙ ПРОТЕАЗЫ. СТАБИЛИЗАЦИЯ ЩЕЛОЧНОЙ ПРОТЕАЗЫ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В СИНТЕТИЧЕСКИХ МОЮЩИХ СРЕДСТВАХ. А) при комплексообразовании с хитозаном; Б) при инкапсулировании в системе альгинат-хитозан. В настоящее время наблюдается значительный интерес к использованию ферментов класса гидролаз в синтетических моющих средствах (СМС). В первую очередь здесь речь идет о протеазах, целлюлазах, амилазах и липазах. Использование этих ферментов в моющих средствах позволяет эффективнее производить удаление загрязнений различной природы и повышает моющую активность традиционных моющих средств на 35-40%. Требования к ферментам при их использовании в качестве добавок к СМС определяются их активностью и стабильностью в присутствии других присутствующих в моющих средствах компонентов (окисляющих агентов, поверхностноактивных веществ), при повышенных температурах и щелочных значениях pH, оптимальных для процессов связанных с удалением загрязнений. Однако, недостаточная стабильность ферментов в условиях оптимальных для проведения удаления загрязнения является проблемой и ограничивает область применения фермент-содержащих СМС. В данной практической задаче студентам предлагается: для стабилизации щелочной протеазы (одного из основных ферментов, применяемых в СМС) в условиях, моделирующих процесс стирки, применить метод (А) включения фермента в частицы, образованные на основе фермент-полиэлектролитного с природным полисахаридом, хитозаном или (Б) инкапсулирования фермента в системе альгинат-хитозан. Альгинаты, соли альгиновой кислоты, широко используется для получения микро- и нанокапсул многих биоактивных молекул, ферментов, вакцин, инсулина и цитокинов. Альгинаты (соли альгиновых кислот) получают из бурых морских водорослей, они состоят из связанных 1.4-β- связями остатков D-маннуроновой (рКа=3.38) и β-Lгулуроновой (рКа=3.2) кислот. Альгинат образует гели с высокой степенью гидратации (высоким содержанием воды), высокой прочности, но относительно мягкой консистенции, что делает гидродинамические свойства геля близки по своим характеристикам к природным тканям. Гель на основе альгината образуется в мягких условиях при комнатной температуре без добавления органических растворителей, гель биодеградируем в физиологических условиях. Уникальные свойства альгината делают его одним из основных белковых носителей применяемым в биотехнологии и медицине. Хитозан. Одним из наиболее распространенных и широко используемым аминополисахаридом является хитозан. Хитозан является деацилированным (частично или полностью) производным хитина, линейного полисахарида, построенного из остатков N – ацетил - - D – глюкозамина с 14 – связями между ними (рис. 1). Деацилированные производные хитина, хитозаны, существуют в природе, а также их получают путем химической обработки хитина. Молекулярная масса хитозана в зависимости от источника и способа выделения составляет 0.5 – 8*105 Да. Физикохимические свойства хитозана определяются молекулярным весом и степенью деацилирования. Данные факторы влияют на растворимость полисахарида, вязкость полученных растворов. Хитозан нерастворим в воде при нейтральных значениях рН, но растворяется в разбавленных органических кислотах, например в водном растворе уксусной кислоты с образованием солей, дающих высоковязкие растворы. Некоторые N – ацилпроизводные хитозана – хорошие гелеобразователи; при ацилирование хитозана производными дикарбоновых кислот получают поперечносшитые гели, удобные для иммобилизации ферментов систем. На примере ряда ферментов: липазы, целлюлазы, щелочной протеазы, L–аспарагиназы и др. было установлено, что в результате их иммобилизации на хитозане существенно увеличивается термостабильность ферментов и стабильность фермента в щелочной области значений рН. В ряде случаев наблюдается увеличение каталитической активности ферментов. Ферменты могут быть иммобилизованы на хитозане, используя как амино- так и гидроксильные группы, такую иммобилизацию называют “двойной иммобилизацией”. Сначала образуется связь между аминогруппой и глутаровым альдегидом, а затем между гидроксильной группой и карбодиимидом. “Двойная иммобилизация” приводит к дополнительной стабилизации фермента. Важным свойством хитозана является его способность образовывать прочные нековалентные комплексы с белками, анионными полисахаридами, на чем основано его широкое применение в биотехнологии в качестве носителя для включения белков и живых клеток, а также при изготовлении медицинских препаратов. Выполнение практической задачи 1) Приготовление стабилизированного препарата фермента А) Включение щелочной протеазы в фермент-полиэлектролитный комплекс с хитозаном. Препарат фермента растворяют в 0.02 М натрий-фосфатном буфере, рН 7.5. Хитозан (молекулярно-массовое распределение 20–90 кДа) растворяют в смеси 2 % аскорбиновой кислоте и 2 % уксусной кислоте в концентрации 20 мг/мл. Затем полученный раствор хитозана разбавляют до нужной концентрации водой (финальное значение рН раствора 4.0-5.0). Комплекс щелочной протеазы с хитозаном готовят путем постепенного добавления при перемешивании раствора хитозана к раствору фермента (весовое соотношение фермент/хитозан 4 : 1) при комнатной температуре (рН =6.0). Б. Инкапсулирование щелочной фосфатазы в системе альгинат - хитозан. Инкапсулирование фермента на альгиновых частицах проводят следующим образом: 0.02 г твердого измельченного карбоната кальция добавляют к 6 мл 1.5% (вес/об.) водному раствору альгината натрия и помещают на обработку ультразвуком на 4 мин. Суспензию диспергируют в 30 мл октана, содержащего 1.5% (вес/вес) SPAN 80 и 0.2 % уксусной кислоты при перемешивании (760 rpm) при комнатной температуре в течении 5 мин. К полученной эмульсии добавляют 120 мл воды. Продолжают перемешивать в течении 40 мин при скорости перемешивания 300 rpm. Полученные частицы альгината кальция промывают 200 мл 1% (об.) раствором Tween 80 в воде и затем промывают 3 раза 100 мл воды для удаления остатков масла с поверхности частиц. Для инкапсулирования фермента 0.5 мл частиц альгината кальция (сухой вес 4 мг) добавляют к 0.5 мл 0.2 мг/мл раствору фермента в 0.2 М натрий-фосфатном буфере, рН 6-7. Адсорбция протекает в течении 30 мин при 4оС. Покрытие хитозановой оболочкой: полученные частицы, содержащие фермент, инкубируют в 1% растворе хитозана в течении 10 мин при деликатном перемешивании. После окончания синтеза частицы центрифугируют и промывают 15 мл воды 5 раз для удаления несвязанного фермента. 2. Определение содержащего каталитической активности ферментного препарата, щелочную протеазу (субтилизин) по азо-казеину. В типичном эксперименте реакционную смесь, содержащую 0.03 М Трис-HCl, pH 9, 1мМ CaCl2 и 1% азоказеин, инкубируют 5 минут при 60оС. Реакцию инициировуют добавлением раствора фермента, после чего реакционную смесь инкубировали в течение 10 мин при 60 оС (или другой исследуемой температуре). Реакцию останавливают добавлением раствора TХУ (финальная концентрация в системе 5%). Смесь центрифугируют 10 мин при 12000–13000 об/мин. Измеряют поглощение реакционной смеси при 450 нм относительно раствора сравнения, не содержащего фермент. Исходная концентрация ферментного препарата составляла 5-10 мг/мл. Для измерения каталитической активности исходный ферментный препарат предварительно разбавляли буферным раствором, 0.03 М Трис-HCl, pH 9.0. После чего проверяют финальное значение рН раствора. Разбавление анализируемого ферментного препарата щелочной протеиназы подбирают так, чтобы при измерении каталитической активности полученные значения оптического поглощения при 450 нм находились в пределах линейных участков калибровочной кривой, полученной в отдельном эксперименте. За 1 ед. активности препарата щелочной протеиназы принимали количество фермента необходимое для увеличения оптической плотности раствора на длине волны 450 нм на одну единицу в реакции гидролиза азоказеина в стандартных условиях за 10 мин при 60оС. 3. Исследование термостабильности ферментных препаратов щелочной протеазы в составе нанокомплекса с хитозаном в сравнении со свободным ферментом. Термостабильность ферментных препаратов определяют путем измерения зависимостей остаточной активности (А) ферментных препаратов от времени инкубации при температуре 60оС и рН 9.0 (условия, моделирующие процесс стирки). Исходный ферментный препарат (стабилизированный или нативный) предварительно разбавляли буферным раствором, 0.03 М Трис-HCl, pH 9.0, как делали перед измерением активности. После чего проверяют финальное значение рН раствора. Образцы ферментных препаратов термостатируют при 60оС в течение 60 минут. Через определенные промежутки времени 0, 5, 10, 30, 40 и 60 минут отбирают пробы (по 0.2 мл), охлаждают под сильной струей холодной воды и после 20 минут инкубации при комнатной температуре измеряют остаточную каталитическую активность ферментов в соответствии с методикой измерения каталитической активности щелочной протеазы (см. п. 2). 4. Обработка кинетических кривых термоинактивации. Определение остаточной активности и констант инактивации свободного фермента и фермента в составе нанокомплекса с хитозаном В качестве характеристик термостабильности препарата фермента используется уровень остаточной активности фермента после 60 минутной инкубации при заданных условиях, а также значение константы скорости термоинактивации, kin. Строят зависимости: 1. Активность (А) от времени (остаточная активность) и сравнивают уровень остаточной активности после 60 минут инкубации для свободного фермента и фермента в составе комплекса с хитозаном. 2. Относительная активность А/А0 от времени, где А0 активность соответствующего препарата фермента до инкубирования. 3. В полулогарифмических координатах строят зависимость относительной активности А/А0 от времени. Делают выводы о порядке константы термоинактивации в случае свободного фермента и фермента в комплексе с хитозаном. Определяют константы инактивации первого порядка. Сравнивают стабильность фермента в составе комплекса и свободного фермента. Делают вывод.
