ВЛИЯНИЕ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА НА CА ?АКТИВИРУЕМУЮ K ?ПРОНИЦАЕМОСТЬ ЭРИТРОЦИТОВ БОЛЬНЫХ АРТЕРИАЛЬНОЙ

Сибирский медицинский журнал, 2011, Том 26, № 1, Выпуск 1
ЛАБОРАТОРНЫЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ
ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 612.111.6:612.23:[612.12&008.331.1:616.379&008.64&098]
ВЛИЯНИЕ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА НА CА2+?АКТИВИРУЕМУЮ
K+?ПРОНИЦАЕМОСТЬ ЭРИТРОЦИТОВ БОЛЬНЫХ АРТЕРИАЛЬНОЙ
ГИПЕРТЕНЗИЕЙ В СОЧЕТАНИИ С САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2?ГО ТИПА
О.А. Трубачева
НИИ кардиологии СО РАМН, Томск
E9mail: otrubacheva@inbox.ru
INFLUENCE OF REACTIVE OXYGEN SPECIES ON СА2+?ACTIVATED К+?CNANNELS
OF ERYTHROCYTES IN PATIENTS WITH ARTERIAL HYPERTENSION ASSOCIATED
WITH TYPE 2 DIABETES
О.А. Trubacheva
Institute of Cardiology of the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Tomsk
В настоящем исследовании методом регистрации мембранного потенциала по изменениям рН среды инкубации
в присутствии протонофора изучено влияние супероксид&аниона и перекиси водорода на Са2+&зависимую кали&
евую проницаемость мембраны эритроцитов больных артериальной гипертензией в сочетании с сахарным диа&
бетом 2&го типа и здоровых доноров. Продукты системы ксантин–ксантиноксидаза оказывают различное дей&
ствие на Са2+&активируемые К+&каналы эритроцитов больных артериальной гипертензией в сочетании с сахар&
ным диабетом 2&го типа и здоровых доноров. Супероксид&анион при его аппликации с наружной стороны мемб&
раны не изменяет активность Са2+&активируемых К+&каналов как больных, так и здоровых доноров. Перекись
водорода увеличивает Са2+&зависимую К+&проницаемость мембраны эритроцитов больных и снижает ее у здоро&
вых доноров, но только при обработке эритроцитов ингибитором каталазы. Совместное действие перекиси во&
дорода и агониста α1&адренэргических рецепторов L&фенилэфрина, либо ФМА и перекиси водорода значительно
увеличивает Са2+&зависимую К+&проницаемость мембраны эритроцитов здоровых доноров, но не изменяет ее у
больных артериальной гипертензией в сочетании с сахарным диабетом 2&го типа.
Ключевые слова: артериальная гипертензия, сахарный диабет 2&го типа, эритроциты, Ca2+&активируемые кали&
евые каналы, активные формы кислорода.
In the present study by recording membrane potential by changing the pH of the incubation medium in the presence of
protonophore, the effect of superoxide&anion and hydrogen peroxide in the Ca2+&dependent potassium permeability of
the membrane of red blood cells of patients with arterial hypertension and type 2 diabetes and healthy donors was
studied. Products of xanthine – xanthine oxidase have different effects on Ca2+&activated K+&channels of erythrocytes in
patients with arterial hypertension and type 2 diabetes and healthy donors. Superoxide&anion in its application to the
outer side of the membrane does not alter the activity of Ca2+&activated K+&channels as both patients and healthy donors.
Hydrogen peroxide increases the Ca2+&dependent K+&permeability of the membrane of red blood cells of patients and
reduces it from healthy donors, but only in the processing of erythrocyte catalase inhibitor. The combined effect of
hydrogen peroxide and α1 adrenergic receptors agonist L&phenylephrine or PMA and hydrogen peroxide significantly
increases the Ca2+& dependent K+&permeability of the membrane of red blood cells from healthy donors, but does not alter
the patients with arterial hypertension and type 2 diabetes.
Key words: arterial hypertension, type 2 diabetes, erythrocytes, Ca2+&activated potassium channels, reactive oxygen species.
Введение
При ряде заболеваний, сопровождающихся окисли&
тельным повреждением эритроцитов, в частности при ар&
118
териальной гипертензии и сахарном диабете, наблюда&
ются типовые изменения со стороны клеток красной кро&
ви [3]: повышение внутриклеточной концентрации ионов
кальция, снижение их деформируемости, сокращение
О.А. Трубачева
продолжительности жизни [9–11]. Известно, что Са2+&ак&
тивируемые К+&каналы – К+(Са2+)&каналы эритроцитов –
играют важную роль в программируемой гибели клетки
и их деформируемости [7].
Нельзя исключить, что в условиях повышенной про&
дукции АФК, которая отмечается при артериальной ги&
пертензии (АГ) и сахарном диабете (СД) 2&го типа, изме&
няется как функционирование самих К+(Са2+)&каналов,
так и внутриклеточных сигнальных систем, участвующих
в их регуляции. Однако данные об участии АФК в регуля&
ции К+(Са2+)&каналов эритроцитов человека немногочис&
ленны.
В связи с вышесказанным представляется весьма ак&
туальным изучение роли АФК в регуляции К+(Са2+)&кана&
лов эритроцитов как в норме, так и при патологическом
процессе, сопровождающемся окислительным поврежде&
нием эритроцитов. Цель исследования: оценить вклад
супероксид&аниона и перекиси водорода в регуляцию
Са2+&зависимой калиевой проницаемости мембраны
эритроцитов больных артериальной гипертензией в со&
четании с сахарным диабетом 2&го типа.
Материал и методы
В работе использовалась кровь больных АГ в сочета&
нии с СД 2&го типа (38 человек) и кровь практически здо&
ровых доноров (27 человек). Клинический диагноз вери&
фицировали с помощью клинико&лабораторных методов
исследования на базе отделения атеросклероза и хрони&
ческой ишемической болезни сердца НИИ кардиологии
СО РАМН (руководитель – академик РАМН Р.С. Карпов).
Группы исследуемых соответствовали по полу и возрас&
ту. Кровь забиралась из локтевой вены утром натощак в
пробирки с гепарином (25 ед./мл крови). После центри&
фугирования (1000g, 5 мин, 4 °С) плазму и клетки белой
крови удаляли, а эритроциты дважды промывали 3 час&
тями изоосмотического раствора NaCl (150 мМ), содер&
жащего 5 мМ Na&фосфатный буфер (рН 7,4) при тех же
условиях центрифугирования.
Для исследования К+(Са2+)&каналов был применен
метод регистрации мембранного потенциала в суспен&
зии эритроцитов по изменениям рН среды инкубации в
присутствии протонофора, основанный на том, что в этих
условиях распределение протонов зависит от мембран&
ного потенциала [4]. Эксперименты проводились по сле&
дующему плану: для получения гиперполяризационного
ответа к 4,75 мл среды инкубации (среда N), содержащей
150 мМ NaCl, 1 мМ KCl, 1мM MgCl2, 10 мM глюкозы и 10
мкМ СаСl2, добавляли 0,25 мл упакованных эритроцитов.
Через 5 мин инкубации при 37 °С и постоянном переме&
шивании добавляли протонофор СlССР до конечной кон&
центрации 20 мкМ и спустя 2 мин 0,5 мкМ Са2+&ионофо&
ра А23187. Добавление кальциевого ионофора А23187 к
суспензии клеток, содержащей хлорид кальция, приво&
дило к выходу ионов калия и развитию гиперполяриза&
ционного ответа (ГО) мембраны эритроцитов, что нахо&
дило свое отражение в изменении рН суспензии. Заще&
лачивание среды инкубации соответствовало гиперполя&
ризации мембраны, а восстановление рН – возвращению
мембранного потенциала (МП) к исходному значению.
Амплитуда ГО и скорость его развития характеризуют
ВЛИЯНИЕ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА...
Са2+&активируемые калиевые каналы, а скорость восста&
новления МП – активность Са2+&АТФазы [4].
Для получения супероксид&аниона и перекиси водо&
рода использовалась система, включающая ксантин
(10&4 М) и ксантиноксидазу (10 мU/мл). Продукцию супе&
роксид&аниона оценивали спектрофотометрически по
степени восстановления цитохрома С в бесклеточной
среде при длине волны 550 нм. Измерения проводились
против кюветы, содержащей среду N и цитохром С.
Спектрофотометрические исследования показали, что
максимальная продукция супероксид&аниона наблюда&
лась при 10 минутах инкубации. Концентрация суперок&
сид&аниона в среде инкубации в описанных условиях
составила 9 мкМ. Другим продуктом реакции с участием
ксантиноксидазы является перекись водорода, что нахо&
дит свое отражение в снижении содержания супероксид&
аниона. В ряде экспериментов среда инкубации клеток
содержала 5·10–8 М, 10–7 М и 10–6 М перекиси водорода
(Н2О2), либо 0,026 М ингибитора каталазы аминотразола
в присутствии соответствующих концентраций Н2О2. Сти&
муляцию α1&адренэргических рецепторов эритроцитов
проводили добавлением L&фенилэфрина гидрохлорида
(10–8 М). Для активации протеинкиназы C был использо&
ван форболовый эфир (РМА – phorbol 12&myristate&13&
acetate) в концентрации 10–7 М, который добавлялся в
среду инкубации эритроцитов.
Анализ данных проводили при помощи программы
Statistica 6.0 for Windows фирмы Statsoft. Фактические
данные представлены в виде “среднее ± ошибка средне&
го” (X±m). Для определения характера распределения
полученных данных использовали критерий нормально&
сти Колмогорова–Смирнова. Сформированные выборки
не подчинялись закону нормального распределения, по&
этому для проверки статистических гипотез были исполь&
зованы непараметрические критерии. Для проверки ги&
потезы об однородности двух независимых выборок ис&
пользовался U&критерий Манна–Уитни (Mann–Whitney
U&test). Для проверки однородности парных или зависи&
мых выборок был использован Т&критерий Вилкоксона
(Wilcoxon mached pairs test). Различия считали статисти&
чески значимыми при уровне значимости р<0,05.
Результаты и обсуждение
В первой серии экспериментов исследовали влияние
системы ксантин (10 –4 М) и ксантиноксидаза (10 мU/мл)
на параметры ГО эритроцитов больных АГ в сочетании с
СД 2&го типа. Прединкубация эритроцитов с ксантином
и ксантиноксидазой проходила в течение 10, 20 и 30
минут.
Амплитуда ГО эритроцитов больных АГ в сочетании
с СД 2&го типа и здоровых доноров при 10 минутах инку&
бации достоверно не изменялась. Возможно, это связано
с тем, что супероксид&анион не проникает через мемб&
рану клеток, а его действие снаружи не оказывает воз&
действия на K+(Ca2+)&каналы.
Увеличение времени инкубации эритроцитов боль&
ных АГ в сочетании с СД 2&го типа и системы ксантин и
ксантиноксидаза до 20 и 30 минут вызывало достовер&
ное возрастание амплитуды ГО, тогда как этот параметр
у здоровых доноров, напротив, снижался (рис. 1).
119
Сибирский медицинский журнал, 2011, Том 26, № 1, Выпуск 1
Скорость развития ГО и скорость восстановления МП
у больных АГ в сочетании с СД 2&го типа достоверно не
изменялись, тогда как у здоровых эти параметры снижа&
лись.
Возможно, обнаруженный эффект связан не с супер&
оксид&анионом, а с другим продуктом ксантиноксидаз&
ной реакции перекисью водорода.
В следующей серии экспериментов изучено влияние
перекиси водорода на K+(Ca2+)&каналы эритроцитов. Ам&
плитуда ГО эритроцитов больных с АГ в сочетании с СД
2&го типа повышалась при всех выбранных концентра&
циях (рис. 2). Скорость развития ГО и скорость восста&
новления МП у больных АГ в сочетании с СД 2&го типа
статистически значимо не изменялись.
Рис. 1. Влияние времени инкубации с 10–4 М ксантином и 10 мU/мл ксантиноксидазой на амплитуду гиперполяризационного
ответа эритроцитов больных АГ в сочетании с СД 2&го типа и здоровых доноров. За 100% приняты значения параметра в отсут&
ствии ксантина и ксантиноксидазы; * – параметры, статистически значимо отличающиеся от контрольных значений, р<0,05
Рис. 2. Влияние перекиси водорода на амплитуду гиперполяризационного ответа эритроцитов больных АГ в сочетании с СД 2&го
типа (без добавления аминотриазола) и здоровых доноров (обработанных аминотриазолом). За 100% приняты значения пара&
метра в отсутствии агентов; * – параметры, статистически значимо отличающиеся от контрольных значений, р<0,05
120
О.А. Трубачева
ВЛИЯНИЕ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА...
тивности Са2+&насоса мембраны эритроцитов в условиях
повышения внутриклеточной концентрации Н2О2. Ранее
в работах показано [5], что в формировании Са2+&инду&
цированного ГО эритроцитов участвуют не только
К+(Са2+)&каналы, но и Са2+&АТФаза: увеличение ее актив&
ности снижает амплитуду ГО эритроцитов. Не исключе&
но, что увеличение активности Са2+&АТФазы под действи&
ем Н2О2 приводило к описанному эффекту.
При инкубации эритроцитов больных АГ в сочетании
с СД 2&го типа с Н2О2 и аминотриазолом параметры ГО
достоверно не отличались от полученных
в отсутствии ингибитора каталазы.
Результаты исследования позволяют
заключить, что Н2О2 оказывает существен&
ное влияние на Ca 2+&активируемую
K+&проницаемость мембраны эритроци&
тов больных АГ в сочетании с СД 2&го типа.
Причиной этого может быть дисбаланс
про& и антиоксидантных систем эритро&
цитов [3], отмечаемый при данных пато&
логиях.
В ряде работ показано участие внут&
риклеточных сигнальных систем в регу&
ляции К+(Са2+)&каналов эритроцитов [3, 5].
Известно, что активность ряда ферментов,
являющихся участниками внутриклеточ&
ных регуляторных каскадов, таких, как
протеинкиназа С (ПК С), NO&синтаза, гу&
анилатциклаза и др., модулируются АФК
[12].
В следующей серии экспериментов
A
изучалось совместное влияние Н2О2 и аго&
ниста α1&адренэргических рецепторов
L&фенилэфрин гидрохлорида на Ca2+&ак&
тивируемую K+&проницаемость мембраны
эритроцитов. Инкубация эритроцитов
больных АГ в сочетании с СД 2&го типа
как в присутствии L&фенилэфрина, так и
при совместном действии L&фенилэфри&
на и Н2О2 не приводила к изменению па&
раметров ГО. У здоровых доноров только
амплитуда ГО в этих условиях существен&
но возрастала (рис. 3А).
Одним из ключевых ферментов сиг&
нального пути, опосредованного α1&адре&
нэргическими рецепторами, является
протеинкиназа С (ПКС), представленная
в эритроцитах изоформой альфа, которая
активируется форболовыми эфирами.
В следующей серии экспериментов ис&
следовалось влияние форбол&миристат&
ацетата (ФМА) на параметры ГО эритро&
цитов больных и здоровых доноров. Ам&
плитуда ГО эритроцитов больных АГ в
Б
сочетании с СД 2&го типа статистически
значимо не изменялась в присутствии
Рис. 3. Совместное влияние L&фенилэфрина (А), форбол&миристат&ацетата (Б)
ФМА, либо ФМА и Н2О2, тогда как в эрит&
и перекиси водорода на амплитуду гиперполяризационного ответа мембраны
роцитах здоровых доноров этот параметр
эритроцитов больных АГ в сочетании с СД 2&го типа и здоровых доноров. За
статистически значимо увеличивался
100% приняты значения параметра в отсутствии агентов; * – параметры, статис&
(рис. 3Б).
тически значимо отличающиеся от контрольных значений, р<0,05
В то же время у здоровых доноров амплитуда ГО ста&
тистически значимо не изменялась при всех выбранных
концентрациях Н2О2 (рис. 2). Обработка эритроцитов
здоровых доноров аминотриазолом – ингибитором ка&
талазы в присутствии всех концентраций перекиси во&
дорода вызывала снижение амплитуды и скорости раз&
вития ГО (рис. 2), но при этом увеличивалась скорость
восстановления мембранного потенциала. Полученные
данные свидетельствуют о снижении Са2+&зависимой ка&
лиевой проницаемости и, напротив, об увеличении ак&
121
Сибирский медицинский журнал, 2011, Том 26, № 1, Выпуск 1
Известно, что в эритроцитах стимуляция ПК С вызы&
вает увеличение входа ионов кальция, что ведет к актива&
ции K+(Ca2+)&каналов [6]. Возможно, в условиях повыше&
ния внутриклеточной концентрации Н2О2 увеличивается
активность ПК С, стимулированной через α1&адренэрги&
ческие рецепторы, либо ФМА, что ведет к повышенному
входу ионов Са2+ и, соответственно, к увеличению Са2+&
зависимой К+&проницаемости мембраны эритроцитов, а
также возрастанию активности Са2+&насоса. Однако та&
кой эффект проявляется, видимо, только в эритроцитах
здоровых доноров. Отсутствие влияния L&фенилэфрина
и ФМА на фоне перекиси водорода на К+(Са2+)&каналы
эритроцитов больных АГ в сочетании с СД 2&го типа мо&
жет быть связано с тем, что у этой категории больных
активность ПК С изначально увеличена [1]. Кроме того, в
условиях повышенной внутриклеточной концентрации
ионов кальция, что отмечается у исследованной катего&
рии больных [8], дополнительный вход Са2+ может и не
приводить к приросту амплитуды ГО.
Таким образом, регуляция K+(Ca2+)&каналов АФК раз&
личается в эритроцитах больных АГ в сочетании с СД 2&
го типа и здоровых доноров, что можно объяснить дис&
балансом про& и антиоксидантных систем эритроцитов
[3], увеличением степени гликозилирования не только ге&
моглобина, но и белков мембранного каркаса [1, 2], от&
мечаемых у больных АГ в сочетании с СД 2&го типа.
Заключение
Таким образом, в настоящем исследовании установ&
лено, что супероксид&анион при его аппликации с наруж&
ной стороны мембраны не изменяет активность Са2+&ак&
тивиуемых К+&каналов эритроцитов как в группе боль&
ных артериальной гипертензией в сочетании с сахарным
диабетом 2&го типа, так и у здоровых доноров. Перекись
водорода увеличивает Са2+&зависимую К+&проницаемость
мембраны эритроцитов больных и снижает ее у здоро&
вых доноров, но только при обработке эритроцитов ин&
гибитором каталазы. Совместное действие перекиси во&
дорода и агониста α1&адренэргических рецепторов L&фе&
нилэфрина, либо форбол&миристат&ацетата и перекиси
водорода значительно увеличивает Са 2+&зависимую
К+&проницаемость мембраны эритроцитов здоровых до&
норов, но не изменяет ее у больных артериальной гипер&
тензией в сочетании с сахарным диабетом 2&го типа.
122
Литература
1. Алекcандровский Я.А. Молекулярные механизмы развития
диабетических осложнений // Биохимия. – 1998. – Т. 63,
Вып. 11. – С. 1470–1479.
2. Максимов О.В., Солун М.Н. Особенности липидного соста&
ва эритроцитарных мембран у больных сахарным диабе&
том // Пробл. эндокринол. – 1989. – Т. 35, № 2. – С. 14–18.
3. Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., Степовая Е.А. Физиология и
патофизиология эритроцита. – Томск : Изд&во Том. ун&та,
2004. – 202 c.
4. Орлов С.Н., Петрова И.В., Покудин Н.И. и др. Са2+&активиру&
емые калиевые каналы эритроцитов, исследованные мето&
дом регистрации Са2+&индуцированных изменений мемб&
ранного потенциала // Биол. мембраны. – 1992. – Т. 9, № 9.
– С. 885–903.
5. Орлов С.Н., Покудин Н.И., Ряжский Г.Г. и др. О механизме
регуляции транспорта ионов через плазматическую мемб&
рану при изменении объема клетки // Биологические мем&
браны. – 1988. – Т. 5, № 10. – С. 1030–1041.
6. Andrews D.A., Yang L., Low P. S. Phorbol ester stimulates a protein
kinase C&mediated agatoxin&TK&sensitive calcium permeability
pathway in human red blood cells // Blood. – 2002. – Vol. 100.
– No. 9. – С. 392–399.
7. Bor&Kucukatay M., Rosalinda B. et al. Effects of nitric oxide on
red blood cell deformability // Amer. J. Physiol. – 2005. –
Vol. 284. – P. 1577–1584.
8. Fujita J., Seno M., Obayashi H. et al. Elevated erythrocyte sodium&
lithium countertransport activity correlates with increased
intracellular sodium and free calcium&ion concentration in type
2 diabetes // Diabet Med. – 2008. – No. 60. – P. 661–668.
9. Fujita J., Tsuda K., Takeda T. et al. Nisoldipine improves the
impaired erythrocyte deformability correlating with elevated
intracellular free calcium&ion concentration and poor glycaemic
control in NIDDM // Br. J. Clin. Pharmacol. – 1999. –
Vol. 47. – P. 499–506.
10. McMillan D.E., Utterback N.G., La Puma J. Reduced erythrocyte
deformability in diabetes // Diabetes. – 1978. – No. 27(9). –
P. 895–901.
11. Effect of pravastatin on erythrocyte rheological and biochemical
properties in poorly controlled Type 2 diabetic patients /
P. Miossec, F. Zkhiri, J. Paries et al. // Diabet. Med. – 1999. –
No. 5. – P. 424–430.
12. Rodrigues&Martinez M.A., Alonso M.J., Redonto J. et al. Role of
lipid peroxidation and the glutathione&dependent antioxidant
system in the impairment of endothelium&dependent
relaxations with age // Br. J. Pharmacol. – 1998. –
Vol. 123. – P. 113–121.
Поступила 06.12.2010