Микробиологические исследования окружающей среды
advertisement
Балашовский институт (филиал) Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н. Г. Чернышевского» МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ Учебное пособие для студентов специальности 050102 – «Биология» высших учебных заведений М. В. Ларионов, Е. Б. Смирнова, Н. В. Ларионов, С. В. Кабанина Наука 2010 УДК 502.2+574+576.8 Авторы-составители: Максим Викторович Ларионов Елена Борисовна Смирнова Николай Викторович Ларионов Светлана Владимировна Кабанина Рецензенты: Доктор биологических наук, профессор Брянского государственного университета имени академика И. Г. Петровского Валерий Борисович Любимов; Доктор сельскохозяйственных наук, профессор Пензенского государственного университета Александр Петрович Стаценко; Кандидат биологических наук, доцент Балашовского института (филиала) Саратовского государственного университета имени Н. Г. Чернышевского Вера Александровна Обидина. омендовано к изданию Научно-метческим советом Балашовского института ( Микробиологические исследования окружающей среды: учебное пособие для студентов специальности 050102 – «Биология» высших учебных заведений / М. В. Ларионов, Е. Б. Смирнова, Н. В. Ларионов, С. В. Кабанина. – Саратов: Наука, 2010. – 109 с. ISBN 978-5-9999-0479-9 В настоящем учебном пособии содержатся основные сведения по современным методикам микробиологических исследований воздуха, воды, почвы, объектов окружающей среды, пищевых продуктов. Помимо краткой микробиологической характеристики изучаемых объектов, в каждом разделе пособия особое внимание уделено описанию современных методов отбора проб исследуемого материала, его транспортировки и правил хранения, а также подготовки образцов для микробиологических исследований. В пособии включены тесты для самоконтроля знаний студентов. Данное учебное пособие предназначено студентам биологических, экологических и сельскохозяйственных специальностей вузов, а также студентам среднеспециальных учебных заведений медико-биологического и сельскохозяйственного профиля, школьным учителям биологии и экологии. 2 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И ТЕРМИНОВ…………….4 ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………….7 1 ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ НА МИКРООРГАНИЗМЫ….....9 2 ХАРАКТЕРИСТИКА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД…………………………..…………13 3 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ВОДНОЙ СРЕДЫ………..……….19 4 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ВОЗДУХА И ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ…………………………………...……….25 5 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОЧВЕННОЙ СРЕДЫ……………32 6 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ………..36 7 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОДУКТОВ ДЕТСКОГО ПИТАНИЯ…………………………………………………………….47 8 ПРАВИЛА СБОРА И ХРАНЕНИЯ ОТХОДОВ ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ УЧРЕЖДЕНИЙ……………………..…………50 9 СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИКИ ЭКОЛОГО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ……………………………….………53 10 ТЕСТЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ…………………………………………..…….88 11 ОТВЕТЫ НА ВОПРОСЫ ТЕСТОВ……………………………………...……….97 БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК……………………………………...………....98 ПРИЛОЖЕНИЕ……………………………………………………………...……102 3 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И ТЕРМИНОВ БГКП — бактерии группы кишечной палочки, включают: ОКБ — общие колиформные бактерии; ТКБ — термотолерантные колиформные бактерии. К бактериям группы кишечных палочек (БГКП) относятся грамотрицательные, не образующие спор палочки, сбраживающие глюкозу и лактозу с образованием кислоты и газа при температуре 37–44 °С в течение 24–48 часов, и являющиеся в основном представителями следующих родов: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia. К общим колиформным бактериям (ОКБ) относятся не образующие спор грамотрицательные палочки, сбраживающие глюкозу и лактозу с образованием кислоты и газа при 37 °С в течение 24–48 часов; К термотолерантным колиформным бактериям (ТКБ) относятся не образующие спор грамотрицательные палочки, сбраживающие глюкозу и лактозу с образованием кислоты и газа при 44 °С в течение 24–48 часов. КМАФАнМ — культура мезофильных аэробных и факультативно- анаэробных микроорганизмов; МАФАнМ — мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы. К мезофильным аэробным и факультативно-анаэробным микроорганизмам относятся культуры бактерий, дрожжей, плесневых грибов, растущие в присутствии кислорода и имеющие температурный оптимум развития в пределах 25–37 °С. ТАФАнМ — термофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы. К термофильным аэробным и факультативно-анаэробным микроорганизмам (термофилам) относятся культуры бактерий и некоторых грибов, способных размножаться при температуре 60 °С. . 4 ОМЧ — общее микробное число, т.е. общее содержание микроорганизмов в единице объема исследуемого материала — в 1,0 м3 воздуха, в 1,0 л воды, в 1,0 г почвы, пищевых продуктов. — КОЕ колонию микроорганизм, образующая способный в единица результате — жизнеспособный размножения на твердой питательной среде сформировать колонию. БОЕ — бляшкообразующая единица (фаговая частица, способная образовать негативную колонию при определении фагов методом агаровых слоев по Грациа). МПБ — мясопептонный бульон — жидкая универсальная питательная среда для культивирования большинства микроорганизмов, нетребовательных к питательным средам. МПА — мясопептонный агар — твердая универсальная питательная среда для культивирования большинства микроорганизмов, нетребовательных к питательным средам. ЖСА — желточно-солевой агар — твердая элективная (селективная) среда для выделения (культивирования) стафилококков. ЛПУ — лечебно-профилактическое учреждение. ПДК предельно — предельно-допустимая возможное содержание концентрация, данного указывающая химического на соединения (вещества) в единице объема. К сульфитредуцирующим клостридиям относятся спорообразующие облигатные анаэробные палочки, представители рода Clostridium, редуцирующие сульфит натрия на железосульфитном агаре при температуре 44 ± 1 °С в течение 16–18 часов. Колифаги — бактериофаги (вирусы), способные к лизису клеток культуры кишечной палочки (Escherichia coli). Выборка — определение количества исследуемого отбираемого за один прием от каждой единицы упаковки. 5 объекта, Исходный образец — совокупность отдельных выборок, отобранных из одной партии. Средний образец — часть исходного образца, выделенная для проведения лабораторных испытаний. Навеска — часть пробы, выделенная для определения показателей качества. 6 ВВЕДЕНИЕ Цель настоящего учебного пособия – помочь студентам ВУЗов, обучающимся по специальности 050102 – «Биология», а также экологических и сельскохозяйственных специальностей, овладеть основными навыками проведения микробиологических мониторинговых исследований. Будет способствовать лучшему усвоению программы курсов «Микробиология», «Прикладная экология» и «Мониторинг окружающей среды» в соответствии с действующими Государственными образовательными стандартами высшего профессионального образования для данных специальностей. Учебное пособие будет также полезно студентам, обучающимся в среднеспециальных учебных заведениях медико-биологического и сельскохозяйственного профиля, школьным учителям биологии и экологии. Пособие познакомит студентов с микробиологическим оборудованием и приборами, современными способами микроскопирования, поможет овладеть современными методиками и техникой микробиологических исследований. Особое внимание уделено правилам работы с культурами микроорганизмов и методам приготовления питательных сред, их стерилизации, получения накопительных и выделения чистых культур микроорганизмов. Приведены достаточно подробные сведения о морфологокультуральных свойствах микроорганизмов, встречающихся в окружающей среде и в пищевых продуктах. К числу микроорганизмов относятся бактерии, актиномицеты, грибы, в том числе мицелиальные грибы, дрожжи, мельчайшие водоросли, простейшие (одноклеточные) животные организмы и неклеточные формы – вирусы, фаги. Одним из важнейших вопросов микробиологического мониторинга природных сред является вопрос о наличии или отсутствии в них санитарнопоказательных микроорганизмов, являющихся индикаторами загрязнения этих сред, а также продуктов питания. Санитарно-показательные микроорганизмы: 7 1. Должны постоянно содержаться в выделениях человека и теплокровных животных и поступать в окружающую среду в большом количестве. 2. Не должны иметь другого природного резервуара, кроме организма человека и животных. 3. После выделения в окружающую среду должны сохранять жизнеспособность в течение сроков, близких к срокам выживания патогенньх микроорганизмов, выводимых из организма теми же путями. 4. Не должны интенсивно размножаться в окружающей среде. 5. Не должны значительно изменять свои биологические свойства в окружающей среде. 6. Должны быть достаточно типичными, с тем, чтобы их идентификация осуществлялась без особого труда. 7. Индикация, идентификация и количественный учет должны производиться современными доступными и экономичными микробиологическими методами. Показатели и микроорганизмы, наиболее часто определяемые в объектах окружающей среды и продуктах. Вода — ОМЧ, бактерии группы кишечной палочки (БГКП), споры сульфитредуцирующих клостридий, колифаги. Почва — БГКП, клостридии, сальмонеллы, энтерококки. Воздух — ОМЧ, золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus), грибы. Предметы обихода — БГКП, золотистый стафилококк. Пищевые продукты — КМАФАнМ, кишечная палочка (Escherichia coli), БГКП, сульфитредуцирующие клостридии, золотистый стафилококк, патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы, условно-патогенные — протеи, листерии, иерсинии, эетерококки, Pseudomonas aeruginosa, Васillиs cereus (только в продуктах детского питания), а также наличие и количество в них антибиотиков. 8 1 ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ НА МИКРООРГАНИЗМЫ Развитие и жизнедеятельность микроскопических организмов зависит от условий окружающей их среды. К экологическим условиям относятся: физические (влажность, температура, концентрация веществ в среде, лучистая энергия), химические (реакция среды (рН), действие некоторых органических кислот, антисептики), биологические (взаимоотношения микроорганизмов с другими организмами в окружающей среде) средовые факторы. Влажность среды Гидрофиты — бактерии, дрожжи, грибы — условия влажности 98–100 %. Мезофиты — плесневые грибы (Penicillium, Aspergilius), условия влажности 92–96 %. Ксерофиты — (некоторые виды Aspergilius), условия влажности 70–90 %. Водная активность (aw) — отношение давления водяных паров раствора (субстрата) Р и чистого растворителя (воды) РО при одной и той же температуре: aw — Р/РО, Водная активность выражается величинами от 0 до 1 — абсолютно обезвоженное вещество, 1 — дистиллированная вода) и характеризует относительную влажность субстрата. Рост микроорганизмов наблюдается при значениях aw от близких к 1,0 и примерно до 0,65. В пределах 0,99–0,98 находится aw скоропортящихся продуктов. Большинство бактерий не развивается при aw ниже 0,94. Обезвоживание продуктов Конвективная сушка: постепенно, часть растворенных в воде веществ проходит через клеточную стенку и диффундирует в окружающую среду вместе с водой. Во время обезвоживания в клетке повышается концентрация продуктов распада и клетки при этом отмирают. Распылительная сушка (сухое молоко, яичный порошок) — процесс обезвоживания идет мгновенно, наблюдается частичное отмирание при 9 температуре ниже 100 °С (обычно при 65–70 °С). Остаются микрококки, молочнокислые дрожжи и др. Пленочный способ — при температуре около 100 °С. При этом способе остаются главным образом споры бацилл. Яичный порошок получают распылением яичной массы (меланж) в дисковых сушилках, W = 3–9 %. Хранят в герметизированной упаковке при постоянной температуре не выше 15 °С и относительной влажности воздуха не выше 60–65 %. Сублимационная сушка — высушивание в вакууме из замороженного состояния («возгонка») плодов, ягод. Способствует наилучшему сохранению их качеств, т. к. проводится при сравнительно невысоких температурах. Микроорганизмы хорошо переносят такое обезвоживание и сохраняют жизнеспособность долгое время. Во всех случаях необходимо соблюдать строгие санитарно- экологические правила, использовать специальные виды упаковки. Следует учитывать, что устойчивость клеток разных видов микроорганизмов к обезвоживанию весьма различна. Наиболее устойчивы Грам-положительные кокки (стафилококки), бациллы, молочнокислые бактерии, а также дрожжи, грибы (споры). Сальмонеллы, брюшнотифозные микроорганизмы могут сохраняться в некоторых обезвоженных продуктах (яичном порошке) от 3 до 9 месяцев. Грам-отрицательные отмирают в первую очередь. Температура окружающей среды. Каждый микроорганизм развивается только в строго определенных температурных границах, в пределах экологических валентностей того или иного вида. Для одних видов экологические валентности достаточно широкие, для других — более узкие. Кардинальные температурные точки: Мин. Оптимум Макс. Психрофилы 5–10 °С 10–15 °С 25 °С Мезофилы 5–10 °С 25–35 °С 45–50 °С Термофилы 25–30 °С 55–65 °С 70–80 °С 10 Термофилы и психрофилы — в основном бактерии. Отношение микроорганизмов к температурам, превышающим максимальную для их развития, характеризует их термоустойчивость. Она очень различна у разных видов. Также она меняется в зависимости от свойств среды (рН, концентрации веществ и др.). Пастеризация, стерилизация, охлаждение, замораживание — основные способы обработки пищевых продуктов. Концентрация растворенных веществ В нормальных условиях внутриклеточное осмотическое давление должно быть выше, чем в питательном субстрате (продукте). Клетка пребывает в состоянии тургора. При повышении концентрации субстрата (за счет соли, сахара) цитоплазма клетки теряет воду, сжимается (плазмолиз) и клетка может погибнуть. Концентрация NaCl в 3 % может подавлять развитие гнилостных бактерий (главным образом Грам-отрицательных, палочковидных). Кокки, бациллы, клостридии более устойчивы (до 6–10 %). Кроме того, существуют галофилы, которые делятся на факультативные (условные) и облигатные (строгие). Условные галлофилы, или солеустойчивая группа, — бациллы, клостридии, кокки, дрожжи, плесени. Типичный представитель Staphylococcus aureus хорошо развивается в средах, содержащих 10–15 % поваренной соли. Облигатные галофилы — солелюбивые, не растут в отсутствие соли (при концентрации ниже 12 %). Типовой вид — Halobacterlum sohnanum — образует красный пигмент на соленой рыбе. Осмофильные дрожжи развиваются при высоких концентрациях сахара. Лучистая энергия Солнечный свет — необходим фототрофам, остальные виды лучше развиваются в темноте. Инфракрасные лучи оказывают только тепловое действие, ультрафиолетовые лучи — вызывают фотохимические изменения в молекулах субстрата клетки. Эффективность зависит от дозы, характера облучаемого субстрата, его рН, температуры, степени обсемененности и видового состава микрофлоры. УФ-лучи применяются для обеззараживания 11 питьевой воды воздуха лабораторий, лечебных и производственных помещений, холодильных камер и т.д. В течение 6 часов может быть уничтожено до 80 % бактерий и плесеней, находящихся в воздухе. Радиоустойчивость различных микроорганизмов колеблется в широких пределах. Для вегетативных клеток бактерий губительная доза лежит в пределах от 10 тыс. до 300 тыс. рад. Чувствительны к облучению кишечная палочка, протей, сальмонеллы, Pseudomonas. Более устойчивы микрококки, споры бактерий, дрожжи (дозы от 500 тыс. до 1 млн. рад). Радуризация — частичное уничтожение микрофлоры на пищевых продуктах (в т. ч. плодах, овощах, ягодах) путем обработки гамма-лучами. При этом увеличиваются сроки хранения. Эффективность действия ультразвука зависит от природы организмов, частоты колебаний и других факторов. Шаровидные микробы (кокки) более устойчивы, чем палочковидные. Также достаточно устойчивы дрожжи (ложные), особенно устойчивы споры бацилл. Реакция среды (рН) Жизнедеятельность микроорганизмов возможна лишь в определенных границах рН. Для грибов и дрожжей характерна слабокислая среда рН = 4,5– 5,5. Большинство бактерий существуют в диапазоне рН = 6,8–7,3, т.е. нейтральной или слабощелочной. Плесневые грибы могут развиваться в широком диапазоне рН (1,2–11,0). Кислая среда более губительна, чем щелочная. Особенно губительна кислая среда для гнилостных бактерий, вызывающих пищевые отравления. Более устойчивы бактерии, которые сами в процессе жизнедеятельности образуют кислоты (уксуснокислые, молочнокислые). Некоторые виды дрожжей, плесневых грибов регулируют реакцию среды (подкисляют или подщелачивают). Химические вещества (антисептики) Соли тяжелых металлов (золото, серебро, ртуть, медь и др.) даже в ничтожно малых концентрациях оказывают губительное действие на микроорганизмы. Ограниченное применение на практике имеет серебро. 12 Бактерицидное действие проявляют многие окислители: хлор, йод, перекись водорода, перманганат калия, неорганические кислоты: сернистая, борная и пр., а также газы: СО2, SO2 и др., органические соединения: формалин, фенолы (карболовая кислота), спирты, кислоты (салициловая, сорбиновая, бензойная и др.). Биологические факторы среды В естественных условиях обитания, на сырье и пищевых продуктах совместно развиваются разнообразные виды микроорганизмов. Между ними устанавливаются многообразные биотические взаимоотношения. Симбиоз — взаимная польза (кефирные «грибки», закваски типа жидких дрожжей) и ряда других. Метабиоз — развитие одних видов за счет продуктов жизнедеятельности других, без причинения им вреда (последовательное расщепление белков, углеводов, липидов и т.д.). Паразитизм — развитие микроорганизмов за счет других живых организмов (возбудители болезней человека, животных, растений). Вирусы, фаги. Антагонизм — взаимоотношения, когда один вид угнетает развитие или вызывает гибель другого вида (антибиотики, использование антагонизма в пищевой промышленности). 2 ХАРАКТЕРИСТИКА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД Разнообразные питательные вещества, в которых нуждаются микроорганизмы и которые используются ими для синтеза основных компонентов клетки, роста, размножения и для получения энергии называются питательными веществами, а среда, содержащая питательные вещества, является питательной средой. Питательные среды имеют исключительное значение в микробиологическом мониторинге природных сред. Правильный подбор 13 питательной среды обеспечивает возможность выделения микроорганизмов из мест обитания, получения накопительных и чистых культур, изучения их морфологии и биохимических особенностей, способствует быстрой и правильной диагностике инфекционных заболеваний, дает возможность для количественного учета микроорганизмов в различных объектах (в пищевых продуктах, воздухе, воде, почве). С помощью питательных сред получают также биомассу полезных для народного хозяйства микроорганизмов и биологически активные целевые продукты. Требования, предъявляемые к питательным средам 1. В среде должны быть все необходимые для роста и развития химические элементы. 2. Среда должна быть сбалансирована по химическому составу. Это значит, что соотношение химических элементов питательной среды и главным образом соотношение органогенных элементов – С:N должно примерно соответствовать этому соотношению в клетке. 3. Среды должны иметь достаточную влажность, обеспечивающую возможность диффузии питательных веществ в клетку. Для грибов эта влажность обеспечивается содержанием влаги в субстрате не менее 12 %, для бактерий – не менее 20 %. 4. Среда должна иметь определенное значение рН среды. Среди микроорганизмов различают микроорганизмы), алкалофилы ацидофилы (щелочелюбивые (кислотолюбивые микроорганизмы) и нейтрофилы (лучше всего растут в нейтральной среде с рН около 7,0). К ацидофилам относятся грибы и дрожжи. Большинство бактерий – нейтрофилы, для которых активная кислотность среды около 4 ед. рН является губительной. Следует помнить, что при стерилизации среды и в процессе культивирования микроорганизмов, кислотность среды может сильно изменяться. Во избежание изменения рН в среду добавляют буферные системы (например: фосфатный буфер), СаСО3 14 (для нейтрализации образующихся в результате культивирования органических кислот), вещества органической природы, обладающие буферными свойствами (например: аминокислоты, полипептиды, белки) и др.; 5. Среды должны быть изотоничными для микробной клетки, т.е. осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки. 6. Среды должны обладать определенным окислительно- восстановительным потенциалом (rh2), определяющим насыщение ее кислородом. По шкале от 0 до 41 этим индексом можно обозначить любую степень аэробности: насыщенный кислородом раствор обозначают rh2 = 41, насыщенный водородом rh2 = 0. Облигатные анаэробы размножаются при rh2 не выше 5, аэробы – не ниже 10. 7. Среды должны быть стерильными, что обеспечивает рост чистых культур микроорганизмов. Классификация питательных сред По консистенции питательные среды делятся на жидкие, плотные и сыпучие. Жидкие среды применяются для накопления биомассы или продуктов обмена микроорганизмов, для обновления долго хранящихся культур, для поддержания и хранения тех чистых культур, которые плохо растут на плотных средах. Плотные среды необходимы для выделения и описания культуральных свойств чистых культур микроорганизмов, так как на них можно получить изолированные колонии (колония – популяция микроорганизмов, выросших из одной клетки). Плотные питательные среды используются также ля количественного учета микроорганизмов в пищевых продуктах, других объектах внешней среды и для хранения чистых культур. Плотные гелеобразующих среды готовятся веществ: из агар-агара, (силикагеля). 15 жидких желатина, путем геля добавления кремнекислого Лучшим гелеобразующим веществом является агар, получаемый из водорослей. Это сложный полисахарид, который образует гель с точкой плавления 96–100 °С и температурой застывания около 40 °С. Поэтому на агаризованных средах можно культивировать почти все микроорганизмы. Кроме того, агар-агар очень редко используется микроорганизмами в качестве питательного субстрата. Для уплотнения жидкой среды в нее вносят в зависимости от степени очистки от 1,5 до 2,5 % агара. В отличие от агар-агара желатин – это вещество белковой природы, которое получается из костей и хрящей животных при их вываривании, поэтому многие микроорганизмы используют желатин в качестве питательного субстрата и к концу культивирования среда с желатином разжижается. Ограниченное использование желатина в качестве уплотнителя для плотных питательных сред связано также с тем, что по сравнению с агарагаром он образует менее прочный гель, который плавится при 23–25 °С и застывает при 20 °С, в то время как большинство микроорганизмов развивается при температуре от 25 до 37 °С. Если требуется получить плотные среды, не содержащие, органических компонентов, или синтетические среды с определенным количественным и качественным составом, то в качестве уплотнителя применяют кремневокислый гель. Получают его путем смешивания равных объемов соляной кислоты с удельной массой 1,1 и жидкого стекла (Na2SiO3, К2SiO3) с последующей разливкой по 25–30 мл в чашки Петри и выдержкой 1–2 ч. Сыпучие среды применяют в основном в промышленной микробиологии. К таким средам относятся разваренное пшено, отруби, кварцевый песок, смоченный питательным раствором. Такие среды используются для культивирования аэробных микроорганизмов. По происхождению и составу натуральные (естественные), питательные среды делятся на синтетические полусинтетические. 16 (искусственные) и Натуральные среды готовятся из продуктов животного и растительного происхождения (отвары злаков, трав, овощные и фруктовые соки, различные экстракты, мясной бульон, автолизат дрожжей, молоко, молочная сыворотка, гидролизаты из растительного сырья и т.д.). Они содержат все ингредиенты, необходимые для роста и развития микроорганизмов. Основным недостатком этих сред является то, что они имеют сложный и непостоянный состав. Наиболее часто применяемыми натуральными питательными средами являются мясопептонный агар (МПА) и мясопептонный бульон (МПБ), предназначенные для культивирования бактерий, а также не охмеленное пивное сусло и сусло-агар, используемые для выращивания и накопления биомассы грибов и дрожжей. Синтетические среды имеют в своем составе химически чистые органические и неорганические соединения в строго указанных концентрациях. По набору компонентов синтетические питательные среды могут быть сложными (среды для выращивания молочнокислых бактерий) и довольно простыми. Такие среды применяются для исследования обмена веществ, выяснения закономерностей роста или биосинтеза какого-либо метаболита и т.д. Наиболее часто в практической работе используют синтетическую среду Чапека для выращивания грибов и среду Ридер для дрожжей. Основным недостатком синтетических сред является то, что на таких средах микроорганизмы очень долго растут. Полусинтетические среды в своем составе содержат химически чистые органические и неорганические вещества, (как и в синтетических средах) и вещества растительного или животного происхождения в качестве факторов роста для ускорения роста и развития микроорганизмов. Цель использования полусинтетических сред та же, что и синтетических. Так как натуральные компоненты вносятся в небольших количествах, то их химический состав не учитывается при изучении обменных микроорганизмов. 17 процессов тех или иных По назначению избирательные среды делятся (накопительные, на универсальные элективные) и (основные), дифференциально- диагностические. Универсальные среды используются для выращивания многих видов микроорганизмов. К универсальным средам, используемым для выращивания бактерий, относятся мясопептонный агар и бульон (МПА, МПБ), среда для определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (среда для определения КМАФАнМ). Грибы и дрожжи хорошо растут на не охмеленном пивном сусле, сусло-агаре (СА), среде Сабуро. Избирательные среды обеспечивают развитие только определенных микроорганизмов или группы родственных видов и непригодны для роста других. В такие среды, как правило, добавляют вещества, избирательно подавляющие развитие сопутствующей микрофлоры. Избирательные среды применяют для выделения определенных микроорганизмов из мест их естественного обитания и для получения накопительных культур. В качестве накопительных питательных используют, например жидкие среды Кесслера (используется для накопления бактерий группы кишечной палочки), Мюллера и Кауфмана (для выявления сальмонелл). Элективными средами могут быть плотные питательные среды, такие как молочно-солевой агар и желточно-солевой агар – для выявления и количественного учета в пищевых продуктах коагулазоположительных стафилококков, кровяной агар – для выявления гемолитических стрептококков, агар с гидролизованным молоком и мелом – для количественного учета молочнокислых бактерий. Дифференциально-диагностические среды используются для определения видовой принадлежности исследуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ. Состав этих сред позволяет четко выделить наиболее характерные свойства изучаемого микроорганизма. Примером таких сред является плотная среда Эндо, применяемая для определения бактерий группы кишечной палочки, в состав которой входит 18 лактоза, насыщенный спиртовой раствор фуксина, обесцвеченного перед добавлением в среду 10 % водным раствором сульфата натрия (образуется бесцветная фуксин-сернистая кислота. Кишечная палочка на такой среде ферментирует лактозу с образованием альдегидов, вследствие чего бесцветная фуксин-сернистая кислота переходит в фуксин-сернистое соединение с образованием фуксина, который окрашивает колонии кишечной палочки в красный цвет с металлическим блеском. 3 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ВОДНОЙ СРЕДЫ Вода — естественная среда обитания разнообразных микроорганизмов. На качественный состав микрофлоры основное влияние оказывает заселяющих водоемы, происхождение воды. Совокупность всех микроорганизмов, обозначается термином «микробный планктон». По времени нахождения в водной среде выделяют автохтонные и аллохтонные микроорганизмы. Таким образом, в состав водоемом могут входить представители автохтонной и аллохтонной микрофлоры. Автохтонная водная микрофлора — совокупность микроорганизмов, постоянно живущих и размножающихся в воде данного водоема. В ее состав могут входить: Micrococcus candicans, М. roseus, Sarcina spp., Pseudomonas fluorescens, различные виды родов Proteus и Leptospira, Васillиs cereus, В. micoides, Chromobacterium violaceum, Serratia marcescens, некоторые виды клостридий, фаги и др. Аллохтонная водная микрофлора — совокупность микроорганизмов, находящихся в данном водоеме временно, т.е. периодически изменяющаяся микрофлора. По происхождению, различают следующие типы вод: 1. Пресные поверхностные воды, к которым относятся проточные (текучие) воды рек, ручьев и стоячие воды — озер, прудов, водохранилищ. 19 2. Подземные — грунтовые, почвенные, артезианские. 3. Атмосферные — включающие дождь, снег. 4. Соленые (морские и озерные воды). В воде микроскопические организмы могут развиваться, если имеется достаточное количество питательных веществ. Количественный и качественный состав микрофлоры природных вод очень разнообразен. Микрофлора подземных вод (артезианских, ключевых и пр.) зависит от глубины залегания водоносного слоя. Чем глубже он, тем меньше содержится микроорганизмов. Воды открытых водоемов (реки, озера, моря, водохранилища и др.) отличаются большим разнообразием в составе микрофлоры в зависимости от химического состава воды, времени года, засоленности, промышленной активности района и многих других условий. Поверхностные воды загрязняются дождевыми, талыми и сточными водами. Вместе с различными органическими и минеральными загрязнениями в водоемы вносится масса микроорганизмов, среди которых могут попадать патогенные. В чистых водоемах до 80 % всей аэробной сапрофитной микрофлоры приходится на долю кокковых форм бактерий, остальные преимущественно составляют бесспоровые палочковидные бактерии. В реке, протекающей в районе крупных промышленных предприятий, вода может содержать сотни тысяч и миллионы бактерий в 1 см3, а выше этих пунктов — всего лишь сотни или тысячи бактерий. Больше микроорганизмов содержится также в поверхностных слоях воды, но особенно много их в иле, главным образом в его верхнем слое, где образуется как бы пленка из бактерий, играющая большую роль в процессах превращения веществ в водоеме. Среди водных организмов есть виды, массовое развитие которых может принести значительный вред. Бурное развитие микроскопических водорослей обусловливает «цветение» водоемов. Даже при небольшом цветении резко ухудшаются органолептические свойства воды, осложняется работа фильтров 20 на водопроводных станциях. Массовое развитие некоторых видов цианобактерий может служить причиной падежа скота, отравления рыбы, заболеваний у людей. По характеру использования также различают несколько типов воды: 1. Питьевая вода — централизованного и местного водоснабжения, при котором забор воды ведется из открытых водоемов (реки, водохранилища) или подземных источников (скважины родники, колодцы). 2. Вода плавательных бассейнов. 3. Лед медицинский и лед хозяйственный. Отдельно выделяют ввиду их особого санитарного значения сточные воды, поступающие в окружающую среду. Среди них различают: 1. Хозяйственно-фекальные (бытовые). 2. Промышленные. 3. Смешанные — бытовые, поступающие в окружающую среду совместно с промышленными. 4. Талые и ливневые воды, микрофлора которых приводит к загрязнению поверхностных вод. Возбудители кишечных инфекций и другие патогенные микроорганизмы в водопроводной воде сохраняют вирулентность длительное время. Так, возбудитель брюшного тифа — до 93 суток, дизентерии — до 27 суток, холеры — до 28 суток (в речной воде — до 183 суток). Даже во льду представители указанных групп микроорганизмов могут сохраняться до нескольких недель. Микрофлора хозяйственно-фекальных или смешанных сточных вод может включать возбудителей многих инфекционных болезней, чаще кишечных инфекций, поверхностного поэтому водоема может именно аллохтонная служить флора источником любого заболеваний, передающихся преимущественно водным путем (холера, брюшной тиф, гепатит А, Е и др.). Промышленные предприятия, пищевая промышленность, используя воду в технологических процессах, предъявляют определенные требования к ее 21 физико-химическим свойствам и химическому составу, а также микробному населению. Поэтому вода должна соответствовать определенным санитарноэкологическим требованиям. Питьевая вода по составу и свойствам должна быть безопасной в эпидемическом отношении, безвредной по химическому составу и иметь хорошие органолептические свойства, Общее число бактерий не должно превышать 100 клеток в 1 см3, количество кишечных палочек (коли-индекс) должно быть не более трех в 1 л, а коли-титр — не менее 300 см3; при этом учитывают все разновидности кишечной палочки (ГОСТ 2874–82. Вода водопроводная). Вода колодцев и открытых водоемов признается доброкачественной при коли-индексе не более 10 (коли-титр не менее 100 см3), общее число бактерий должно быть не более 1000 в см3. Экологическая классификация категорий качества питьевых вод, расфасованных в емкости (по СанПиН 2.1.41116–02) В качестве питьевой используют очищенную воду из водопроводной сети (кондиционированную), т.е. дополнительно обогащенную жизненно необходимыми макро- и микроэлементами. Расфасованная вода в зависимости от ее качества, улучшенного относительно гигиенических требований к воде централизованного водоснабжения, делится на 2 категории: 1) первая категория — вода питьевого качества (независимо от источника получения безопасная для здоровья, полностью соответствующая критериям благоприятности органолептических свойств, эпидемической и радиационной безопасности, безвредности химического состава и стабильно сохраняющая свои высокие свойства питьевой воды); 2) высшая категория — вода, безопасная для здоровья и оптимальная по качеству (из самостоятельных, как правило, подземных, предпочтительно 22 родниковых или артезианских водоисточников, надежно защищенных от биологического и химического загрязнения). Эпидемиологическая безопасность питьевой воды определяется ее соответствием нормативам по микробиологическим показателям. Методы отбора, хранения и транспортировки воды (по МУК 4.2.1018–01) Для отбора проб воды используют специально предназначенную для этих целей одноразовую посуду или емкости многократного применения. изготовленные из материала, не влияющего на жизнедеятельность микроорганизмов. При отборе воды из распределительных сетей пробы берут из крана, после предварительной его стерилизации и спуска воды в течение 10 минут при полностью открытом кране. Для взятия проб из глубинных открытых водоемов и колодцев или бассейнов используются специальные приборы: батометры, прибор Исаченко. При отсутствии батометров пробу воды можно отбирать с помощью бутыли, в крышку которой вмонтированы две стеклянные трубки, соединенные резиновым шлангом. Посуда обязательно должна быть стерильной. Для взятия проб питьевой воды используют стерильные склянки емкостью 0,5 л или 1,0 л. Воду наливают в бутыли с соблюдением стерильности, не смачивая горла и пробки. Родниковую воду берут непосредственно из струи или из седины текущего родника, на расстоянии 10,0–15,0 см от поверхности дна. Артезианскую и колодезную воду забирают на глубине 10,0–15,0 см. Из открытых водоемов, как правило, берут серию проб на разном удалении от берега и на различной глубине. 23 Для микробиологического анализа льда берут кусок весом не менее 2,0 кг. В лаборатории его обмывают стерильной водой и стерильным инструментом из глубины вырубают несколько кусочков так, чтобы общая масса была около 500,0 г. Пробы сточных вод также забирают в стерильные бутыли. В некоторых случаях для выяснения источника распространения инфекции приходится исследовать сточные воды из больничных отделений или жилых домов. Подготовка лабораторной посуды. Лабораторную посуду моют, ополаскивают сначала водопроводной, затем дистиллированной водой и высушивают. Пробирки, колбы, бутылки закрывают силиконовыми или ватно-марлевыми пробками и колпачками. Пипетки с тампонами из ваты укладывают в металлические пеналы или заворачивают в бумагу. Всю подготовленную посуду стерилизуют в сушильном шкафу при температуре 160 °С в течение 2-х часов или 180 °С — в течение 1 часа. Срок хранения стерильной посуды не более 10 дней. Санитарно-экологические нормативы качества и исследования воды централизованного водоснабжения (по СанПиН 2.1.4.1074–01) В соответствии с санитарными правилами и нормативами «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованной системы питьевого водоснабжения» питьевая вода должна быть безопасна в эпидемиологическом отношении, что определяется соответствующими нормативами (Приложение, табл. 1): 1) Общее число микроорганизмов (ОМЧ) (КОЕ/мл). 2. Общие колиформные бактерии (ОКБ) (КОЕ/100,0 мл). 3. Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) (КОЕ/100,0 мл). 4. Споры сульфитредуцирующих клостридий (КОЕ/20,0 мл). 5. Колифаги (БОЕ/100,0 мл). 24 Мониторинг микробиологических показателей питьевой воды должен проводиться для поверхностных источников ежемесячно (12 раз в год), в то время как для подземных источников 4 раза в год по сезонам. При обнаружении в пробе питьевой воды термотолерантных колиформных бактерий, общих клиформных бактерий или колифагов проводится их определение в повторно взятых пробах. При обнаружении в повторно взятых пробах воды общих колиформных бактерий в количестве 2 в 100,0 мл и колифагов проводится исследование проб воды для определения патогенных бактерий кишечной группы и энтеровирусов. 4 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ВОЗДУХА И ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ Воздух является средой, в которой микроорганизмы не способны размножаться, что обусловлено отсутствием в воздухе питательных веществ, недостатком влаги, губительным действием солнечных лучей. Жизнеспособность микроорганизмов в воздухе обеспечивается нахождением их в частицах воды, слизи, пыли, кусочках почвы. Микрофлору воздуха резидентную условно (автохтонную), разделяют и на транзиторную, постоянную, или или временную (аллохтонную). К представителям резидентной (автохтонной) микрофлоры, которая в основном формируется за счет микроорганизмов почвы, относятся пигментообразующие кокки (М. roseus, М. flavus‚ S. flava, S. alba), спорообразующие бациллы (В. subtilis, В. micoides, B. mesentericus), актиномиценты (Actinomyces spp.), грибы (Penicillium spp., Aspergillus). дрожжеподобные грибы рода Candida. Транзиторная (аллохтонная) микрофлора воздуха формируется преимущественно за счет микроорганизмов почвы, а также за счет видов, 25 поступающих с поверхности водоемов и из организма людей и животных. При этом каждый человек или животное при обычном дыхании, разговоре, кашле, выделяют так называемый аэрозоль, который представляет собой коллоидную систему, состоящую из воздуха, капелек жидкости или частиц твердого вещества, включающих большое количество микроорганизмов. Воздух не является благоприятной средой для развития аллохтонных микроорганизмов, они могут сохранять в воздухе жизнеспособность лишь временно (одни виды более, другие менее продолжительно). Многие виды отмирают сравнительно быстро под влиянием высушивания и солнечной радиации. Возможно также попадание микробов в воздух со слущивающимся эпидермисом кожных покровов, с пылью загрязненного постельного белья и зараженной почвы. Контаминация воздуха закрытых помещений патогенными микроорганизмами происходит в основном воздушно-капельным путем — при разговоре, кашле, чихании от больных людей или носителей возбудителей инфекционных болезней, поражающих верхние дыхательные пути. Микрофлора воздуха меняется в зависимости от климата, времени года, экологического состояния местности (наличие промышленных предприятий, уровня развития промышленного и сельскохозяйственного производства, транспортной инфраструктуры и т.д.). Большое значение для очистки воздуха имеют зеленые насаждения. В составе микрофлоры воздуха преобладают различные виды кокков, споры бацилл, грибов, дрожжи. Могут встречаться патогенные и токсигенные микроорганизмы (стафилококки, стрептококки, туберкулезные палочки и т.д.). Их количество в воздухе рабочих и жилых помещений зависит от экологического состояния. Скопление людей, плохая вентиляция, недостаточная уборка способствуют увеличению количества микроорганизмов в воздухе. 26 Экологическая оценка воздуха помещений осуществляется по двум показателям: общему количеству микроорганизмов и количеству санитарнопоказательных микроорганизмов в 1 м3 воздуха. Санитарно-показательными микроорганизмами служат гемолитические стрептококки и стафилококки. Они являются постоянными обитателями верхних дыхательных путей, слизистой носа и ротовой полости человека. Ориентировочно воздух производственных помещений должен содержать от 100 до 500 бактерий в 1 м3. В жилых помещениях — до 1500 шт., и гемолитических стрептококков — до 16 шт. в 1 м3. Загрязненным воздух жилых помещений считается при наличии (в 1 м3) 2500 всех бактерий и 38 стрептококков. Воздух холодильных камер исследуется также на загрязненность плесенями. При оценке экологического состояния воздуха закрытых помещений в зависимости от задач исследования определяется: — общее микробное число (ОМЧ) (КОЕ/м3); — количество золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus) (КОЕ/м3); — количество плесневых и дрожжевых грибов (КОЕ/дм3). Бактериологический контроль комплекса санитарно- экологических мероприятий в ЛПУ (по СанПиН 2.1.3.1375–03) Бактериологические лаборатории санитарно-эпидемиологических и дезинфекционных станций проводят контроль не реже двух раз в год, бактериологические лаборатории лечебных учреждений контролируют санитарно-гигиенический режим (обсемененность различных объектов и воздуха) один раз в месяц, а контроль стерильности инструментов, перевязочного материала, операционного белья, рук хирурга и кожи операционного поля — 1 раз в неделю. 27 Объектами исследования при проведении бактериологического контроля являются: — воздушная среда; — различные объекты внешней среды; — хирургический инструментарий, перевязочный материал, белье; — шприцы, иглы; — зонды, катетеры, бужи, резиновые перчатки и др. изделия из резины и пластикатов; — хирургический шовный материал, подготовленный к использованию; — руки хирургов и кожа операционного поля. Бактериологическое исследование воздушной среды предусматривает: — определение общего содержания микробов в 1,0 м3 воздуха; — определение содержания золотистого стафилококка в 1,0 м3 воздуха; — определение содержания плесневых и дрожжевых грибов в дм3 воздуха. Отбор проб воздуха для бактериологического исследования проводят в следующих помещениях: послеоперационных палатах, операционных отделениях блоках, и палатах перевязочных, реанимации и интенсивной терапии и др. помещениях, требующих асептических условий. Методы забора проб материала Санитарно-микробиологическое исследование воздуха включает 4 этапа: — отбор проб воздуха; — обработку, транспортировку и хранение проб; — выделение микроорганизмов из изучаемой пробы; — идентификацию выделенных культур микроорганизмов; 28 — один из наиболее ответственных моментов, поскольку лежит в основе всего проводимого в дальнейшем исследовании. Атмосферный воздух исследуют в жилой зоне на уровне 0,5–2,0 м от земли вблизи источников загрязнения, а также в зеленых зонах (парки, сады) — для оценки их влияния на микрофлору воздуха. В закрытых помещениях отбор проб проводят в 5-ти различных местах обследуемого помещения (по типу «конверта»): 4 точки отбора по углам помещения (на расстоянии 0,5 м от стен), а 5-я точка отбора — в центре помещения. Пробы воздуха забирают на высоте 1,6–1,8 м от пола — на уровне дыхания в жилых помещениях и на уровне коек — в условиях больничных палат. Пробы воздуха необходимо отбирать днем в период активной деятельности человека, после влажной уборки и проветривания помещения. При отборе проб воздуха для выделения микроорганизмов используются седиментационный и аспирационный методы. Аспирационный метод связан с осаждением микробных частиц из воздуха на какую-либо поверхность. Микробную обсемененность воздуха (ОМЧ) определяют по правилу (формуле) В. Л. Омелянского: на 100,0 см2 поверхности питательной среды за 5 минут оседает столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10,0 л воздуха (10,0 дм3). После соответствующего пересчета ОМЧ выражают в КОЕ бактерий на определенный объем исследуемого воздуха, поскольку считают, что каждая колония — потомство жизнеспособного микроорганизма. Седиментационный метод основан на происходящем под действием силы тяжести осаждении микроорганизмов на поверхность соответствующей плотной питательной среды. Чашку с питательной средой (открытую) ставят на горизонтальную поверхность на высоте рабочего стола и оставляют на определенное время. 29 Затем чашку закрывают и инкубируют 18–24 часа, после чего подсчитывают количество выросших колоний. Аспирационный метод основан на принудительном осаждении микроорганизмов на поверхность соответствующей плотной питательной среды. При осуществлении этого метода возможно использование: 1. Пробоотборника бактериологического аэрозоля, принцип действия которого основан на электризации частиц исследуемого воздуха и последующем осаждении их на электроде противоположного знака. 2. Аппарата Кротова, принцип действия которого основан на чисто механической аспирации воздуха через щель в крышке прибора. расположенной над вращающейся поверхностью питательной среды в чашке Петри, вследствие чего происходит инерционное осаждение бактерий из воздуха на поверхность питательной среды. Экологическое исследование микробной обсемененности объектов окружающей среды Эколого-бактериологическое исследование микробной обсемененности предметов внешней среды предусматривает выявление стафилококка, синегнойной палочки, бактерий группы кишечных палочек и аэромонад (строго по показаниям). Забор проб с поверхностей различных объектов осуществляют методом смывов. Взятие смывов производят стерильным ватным тампоном на палочках, вмонтированных в пробирки, или марлевыми салфетками, размером 5×5 см, простерилизованными в бумажных пакетах или в чашках Петри. Для увлажнения тампонов в пробирки с тампонами наливают по 2,0 мл стерильного физиологического раствора. Салфетку захватывают стерильным пинцетом, увлажняют физиологическим раствором из пробирки, после протирки исследуемый объект помещают в ту же пробирку. 30 При контроле мелких предметов смывы забирают с поверхности всего предмета. При контроле предметов с большой поверхностью смывы проводят в нескольких местах исследуемого предмета площадью примерно в 100,0–200,0 см2. Наиболее пристальное внимание при контроле микробной обсемененности объектов окружающей среды необходимо обращать на места, труднодоступные для мытья и дезинфекции. Контроль за стерильностью инструментов (шприцы, иглы, системы переливания крови многократного использования, зонды, бужи и другие изделия из резины), перевязочного материала, операционного белья, рук хирургов и кожи операционного поля проводят не реже 1 раза в неделю. Для контроля стерильности используют следующие среды: сахарный бульон Хоттингера (0,5 и %-ный 1 %-ный растворы глюкозы), тиогликолевую среду, бульон Сабуро. Одновременный посев изделий на 3 вышеуказанные среды обязателен. При посеве изделия или его части непосредственно в питательную среду количество среды в пробирке (колбе, флаконе) должно быть достаточным для полного погружения изделия или его части. Посевы в бульон Хоттингера тиогликолевую среду выдерживают в термостате при температуре 37 °С, среду Сабуро при температуре 20–22 °С. Посевы инкубируют в термостате в течение 14 суток. При контроле микробной обсемененности объектов окружающей среды исследованию на стерильность подлежат: — инъекционные лекарственные формы; — лекарственные формы для обработки слизистых оболочек и кожи новорожденных; — растворы для питья; — шовный и перевязочный материал; — хирургические перчатки; — материи для первичной и повторной обработки новорожденных; 31 — материал для новорожденных в стерильных коробках (биксах); — материал для операционной; — индивидуальные комплекты для приема родов; — зонды, катетеры и другие изделия медицинского назначения. 5 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОЧВЕННОЙ СРЕДЫ Почва является главным резервуаром и естественной средой обитания микроскопических организмов в природе, которые принимают активное участие в процессах формирования и самоочищения почвы, а также в круговороте веществ в почве и природе в целом. Микроорганизмы находят в почве все условия, необходимые для своего развития: пищу, влагу, защиту от прямых солнечных лучей. Микрофлора почвы по количественному и видовому составу подвержена значительным колебаниям в зависимости от многих условий: плодородия, аэрации, реакции среды (рН), климатических условий. Все основные обуславливающих процессы превращения жизнедеятельность органических разнообразных веществ, микроорганизмов интенсивно происходят, на глубине 5,0–20,0 см, поэтому в этом слое почвы отмечается их наибольшее количество, а также в слое почвы, прилегающем к корням растений, — ризосфере. Постоянные обитатели почвы — аэробные бактерии: Bacillus subtilis, В. mycoides, В. meghaterium, анаэробные C. sporogenes, C. putrificum, а также маслянокислые бактерии и микроорганизмы, расщепляющие целлюлозу, нитрифицирующие и азотофиксирующие бактерии. В более глубоких почечных слоях микрофлора скуднее — уже на глубине 1,5 метров и более (4,0–5,0 м) микроорганизмы обнаруживаются в очень малом количестве (встречаются лишь единичные особи). Качественный состав микрофлоры почвы очень разнообразен: множество видов бактерий (преимущественно спорообразующих, спирохет, микоплазм), грибы, актиномицеты, вирусы, простейшие, цианеи. Состав и соотношения между различными группами микроорганизмов меняются в 32 зависимости от вида почвы, способов ее обработки, содержания органических веществ. Микроорганизмы почвы способны размножаться при температуре от 25 до 45 °С, а термофильные — и при более высокой температуре (60 °С). Микробы являются членами сложного биоценоза, характеризующегося как антагонистическими, так и симбиотическими взаимоотношениями между собой и с окружающими их объектами, в том числе растениями. Деятельность почвенных микроорганизмов играет большую роль в создании плодородия почвы. Наряду с обычными обитателями почвы, встречаются и болезнетворные, преимущественно спорообразующие, — возбудители столбняка, газовой гангрены, ботулизма, сибирской язвы и др. Поэтому загрязнение почвой пищевых продуктов представляет опасность. Патогенные бесспоровые бактерии, например, брюшнотифозные, дизентерийные сохраняются в почве сравнительно недолго (недели, месяцы), а споры бактерий — годами. При экологической оценке почвы критерием служит титр кишечной палочки и количество сапрофитных бактерий. Имеет также значение определение C. perfringenes и энтерококков. В почвенной среде одновременно с минерализацией органических веществ происходят процессы бактериального самоочищения — отмирание несвойственных почве сапрофитных и патогенных бактерий. Микробиологическая оценка экологического состояния почвенной среды Санитарно-экологическое исследование почвы на наличие патогенных микроорганизмов регламентируется инструкциями по предупредительному и санитарному надзору (МУ 2.1.7.730–99). При этом по комплексу показаний проводится определение: 1. ОМЧ (общего количества сапрофитных микроорганизмов). 33 2. БГКП. 3. Перфрингенс-титра (количества облигатных анаэробов C. perfringens). 4. Энтерококков. 5. Термофильных бактерий. 6. Нитрифицирующих бактерий. 7. Патогенных бактерий, в том числе сальмонелл. Предупредительный экологический надзор за почвой осуществляется: — при планировке, строительстве и реконструкции вновь заселяемых участков и населенных мест; — при выборе участков для строительства лечебно-профилактических и аптечных учреждений, санаториев, детских учреждений; — при решении вопросов водоснабжения и канализации населенных территорий; — при санитарной оценке пляжей и других мест коллективного отдыха. Текущий экологический надзор за почвой осуществляется: — при оценке санитарно-экологического состояния почвы и ее способности к самоочищению после загрязнения (почвы дворов детских садов, больниц, зон отдыха исследуют 2 раза в год); — при контроле за методами обезвреживания сточных вод и отбросов (1–4 раза в месяц); — по эпидемическим показаниям для выяснения возможного пути передачи инфекционных заболеваний; Текущий экологический контроль в сокращенном виде включает в себя определение: 1. ОМЧ. 2. БГКП. 3. Облигатных анаэробов. 4. Термофильных бактерий. 34 5. Нитритфицирующих бактерий. По этим показателям, согласно общепринятой экологической классификации МУ 2.1.7.730–99, выделяют несколько типов загрязнения почв (Приложение, табл. 2): 1) чистая; 2) загрязненные; 3) сильно загрязненные почвы. Однако при проведении полного микробиологического анализа к указанным показателям добавляют определение: численности и процентного соотношения спороносных бактерий к общему числу микроорганизмов; количества актиномицетов, грибов; количества целлюлозоразрушающих бактерий; количества аммонификаторов; количества нитрифицирующих бактерий. По эпидемическим показаниям проводят дополнительное исследование на обнаружение патогенных микроорганизмов. Забор проб почвы для анализа Выбор места и методика отбора проб почв — наиболее ответственный этап лабораторных исследований. Отбор проб и подготовка их для бактериологического исследования осуществляется при его непосредственном участии и контроле согласно стандартной методике по ГОСТ 17.44.02–84. Отбор проб при этом рекомендуется производить путем вычленения цельного монолита почвы и отделения от середины образца для средней пробы. Пробы почвы с глубины более 0,25 м отбирают при помощи бура, который перед каждым взятием пробы тщательно стерилизуется. Отобранные образцы помещают в стерильную посуду и доставляют в лабораторию. Если невозможно исследовать почву немедленно, допускается хранение ее при +4,5 °С не более 24 часов. Пробы почвы для бактериологического анализа отбирают не менее чем с двух участков площадью 25,0 см2, причем один из них должен находиться 35 вблизи источников загрязнения. Для составления среднестатистического значения пробы на каждом участке почву берут в пяти точках по диагонали (в пяти точках, расположенных конвертом) с глубины до 20,0 см стерильным инструментом. Пробы почвы из более глубоко залегающих слоев (0,25–2,0 м) берут буром или стерильным совком. При изучении влияния почвы на санитарно-экологическое состояние подземных вод и водоемов пробы берут с глубины 25,0 см, а на участках для обеззараживания хозяйственно-бытовых отбросов с глубины 25,0–150,0 см. Пробу почвы массой 200,0–300,0 г помещают в стерильную банку и накрывают слоем ваты. Горлышко банки обертывают бумагой и перевязывают. На банку ставят номер и наклеивают этикетку с указанием места и даты взятия пробы. В лаборатории почву освобождают от загрязнения, после чего просеивают через стерильные сита. Перемешивают и отбирают 30,0 г для анализа. Если невозможно провести бактериологическое исследование в день отбора почвы, допускается ее хранение не более 24-х часов при +1…+2 °С. Для проведения анализа 30,0 г почвы помещают в стерильную колбу, куда добавляют 270,0 мл стерильного физиологического раствора. После этого содержимое тщательно взбалтывают в течение 10 минут, затем отстаивают в течение 5 минут. Из полученной суспензии делают ряд разведений в стерильном физиологическом растворе (от 1:10 до 1:1000000 в зависимости от уровня загрязнения почвы). Полученные разведения и используют для посева на питательные среды. 6 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ Пищевые продукты являются одним из важнейших объектов исследований в экологии. Это связано с обилием и разнообразием 36 микрофлоры в продуктах, а также использованием микроорганизмов в производстве многих продуктов питания. Большая группа условно-патогенных микроорганизмов способны вызывать пищевые токсикоинфекции. Через пищевые продукты могут передаваться возбудители таких бактериальных инфекционных заболеваний как брюшной тиф, паратиф, сальмонеллез, дизентерия, эшерихиоз, ботулизм, холера, бруцеллез, туберкулез, сибирская язва, риккетсиозы (Ку-лихорадка), и такие вирусные инфекции как ящур и полиомиелит. Молоко и молочные продукты Молоко — это среда, весьма благоприятная для жизнедеятельности и размножения не только сапрофитных, но и многих условно-патогенных и патогенных микроорганизмов. Пути попадания бактерий в молоко различны: от коров, больных маститами (Staphylococcus agalactiae, Васillиs cereus), с кожи вымени, с частицами навоза, при неправильной обработке молока, от больных людей или бактерионосителей. В молоке и молочных продуктах определяют количество (содержание): 1. КМАФАнМ. 2. БГКП. 3. Спор мезофильных анаэробных бактерий. 4. S. aureus. Микробиологическое исследование молока и молочных продуктов осуществляется в соответствии с ГОСТ 9225–84 «Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического исследования» в плановом порядке: при выпуске продукции с молокозаводов; при контроле за правильностью хранения и реализации данных продуктов в детских учреждениях, предприятиях общественного питания, торговой сети; по эпидемиологическим показаниям (при расшифровке «молочных» вспышек 37 пищевых токсикоинфекций и других заболеваний, например, брюшного тифа); при определении коли-титра молока и молочнокислых продуктов, содержащих специфическую флору. Подготовка проб молока и молочных продуктов к микробиологическому исследованию 1. Отобранные пробы молока, сметаны, сливок перед исследованием тщательно перемешивают. 2. В кисломолочных напитках и продуктах закваски отобранные пробы перед исследованием не только перемешивают, но и Нейтрализуют. для этого отбирают стерильной пипеткой 10,0 см3 исследуемого продукта в стерильную пробирку или колбочку, добавляя 1,0 см3 стерильного раствора двууглекислого натрия с массовой концентрацией 100,0 г/дм3, содержимое перемешивают. 3. Отобранные пробы фасованного мороженого разворачивают и помещают в стерильную посуду с притертой или ватной пробкой. Перед исследованием посуду с пробкой нагревают на водяной бане при температуре 40–45 °С до расплавления пробы. 4. 10,0 г сыра, творога или творожных изделий взвешивают на стерильном часовом стекле, переносят в стерильную ступку, прикрытую крышкой, и растирают. 5. Пробу масла перед исследованием расплавляют на водяной бане при температуре 40–45 °С и перемешивают до получения однородной эмульсии. 6. Поверхность банки со сгущенными молочными консервами тщательно промывают щеткой в чистой теплой воде и протирают. Открывают их стерильным консервным ножом. После вскрытия содержимое тщательно перемешивают стерильной ложкой. Затем берут стерильную сухую колбу и в нее помещают 10,0 г продукта. Приготовление продуктов для посева 1. Перед посевом готовят 10-кратные разведения продукта в стерильном растворе хлористого натрия (для сыров) или фосфатного буфера. 38 2. Из проб молока, сливок, сметаны, кисломолочных напитков и продуктов, мороженого, масла отбирают 10,0 см3 и вносят в 90,0 см3 стерильного раствора хлористого натрия или фосфатного буфера, получая разведение 1:10. Пробы масла и мороженого вносят в данные растворы подогретыми до 40–45 °С. 3. К приготовленным навескам (по 10,0 г) творога, творожных изделий, сгущенных молочных консервов и сухих молочных продуктов добавляют 90,0 см3 стерильных растворов хлористого натрия или фосфатного буфера, подогретых до 45–50 °С, и взбалтывают в течение 3–5 минут до возможно более полного эмульгирования, получая разведение 1:10. 4. Из первого разведения 1:10 готовят последующие — 1:100 и т.д. Мясо и мясные продукты Мясо здоровых гомойотермных животных обладает бактерицидными свойствами и поэтому стерильно. Загрязнение поверхности мяса микроорганизмами начинается уже в момент убоя, в дальнейшем оно происходит при транспортировке, хранении и разделке туш, поверхность которых контаминируется микроорганизмами из окружающей среды. Современные экологические требования безопасности (СанПиН 2.3.2.1078–01) мясных продуктов по микробиологическим показателям представлены на таблице 3 Приложения. Мясо, зараженное патогенными микроорганизмами, является источником многих заболеваний человека: сибирской язвы, бруцеллеза, туляремии, туберкулеза, ящура, ботулизма, сальмонеллезов, Ку-лихорадки, токсикозов стафилококковой этиологии, а также токсикоинфекций, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами. Микробиологическое исследование мясных продуктов проводится как плановое: продуктов; при контроле гигиенического состояния производства мясных при определении доброкачественности 39 мяса и мясных полуфабрикатов; по эпидемиологическим показаниям при выяснении причин заболевания людей; по требованию ветеринарной или санитарной службы на присутствие патогенной или условно-патогенной микрофлоры. Сырое мясо в соответствии с ГОСТ9958–81 «Изделия колбасные и продукты из мяса. Методы бактериологического анализа» исследуется на присутствие бактерий и степень распада мышечной ткани. Мазки-отпечатки, сделанные путем прикосновения поверхности среза кусочка мяса к предметному стеклу, окрашивают по Граму. Мясо считается свежим, если в мазках не обнаружены микроорганизмы (или единичные — до 10 клеток в поле зрения) и нет признаков распада мышечной ткани. В соответствии с ГОСТ 9958–81 микробиологическому контролю также подлежат следующие показатели: 1. КМАФАнМ. 2. БГКП. 3. Бактерии рода Salmonella. 4. Бактерии рода Proteus. 5. Cтафилококки коагулазоположительные (S. aureus). 6. C. perfringens. 7. Listeria monocytogenes. 8. Плесени. В соответствии с ГОСТ 21237–75 «Методы химического и микроскопического анализа свежести мяса» предусматривается санитарномикробиологическое исследование сырого мяса и мясных субпродуктов для выявления бацилл сибирской язвы, сальмонелл, эшерихий, протеев, листерий, пастерелл, бактерий рожи свиней, анаэробных микроорганизмов рода клостридий. В соответствии с ГОСТ 9958–81 «Изделия колбасные и продукты из мяса» постоянному микробиологическому контролю также подлежат полуфабрикаты из рубленого мяса (фарш, котлеты, битки), различные 40 колбасные изделия (колбасы, сосиски, сардельки), а также изделия без оболочки (студни, паштеты). Рыба и рыбные продукты На поверхности чешуи и жабр рыбы сразу после ее вылова выявляется огромное количество микроорганизмов, причем качественный состав сильно зависит от микрофлоры конкретного водоема. В основном это представители родов Pseudomonas, Achromobacter, Vibrio (V. parahaemolyticus, V. alginoliticus), психрофильные микроорганизмы, вызывающие гнилостные процессы. В очень загрязненных реках, прудах поверхностная микрофлора рыбы представлена эшерихиями, сальмонеллами, шигеллами, протеями и прочими представителями семейства энтеробактерий. Мышечная ткань рыб, как и мясо животных, в обычных условиях стерильна. Микробы могут попасть в ткани рыбы различными путями: с поверхности чешуи, через жабры и из кишечника. Микробиологическое производится при исследование текущем контроле рыбы за и рыбных экологическим продуктов состоянием производства, а также при расследовании случаев пищевых отравлений, связанных с употреблением продуктов из рыбы. Согласно методическим указаниям по санитарно-экологическому исследованию рыбной кулинарии определяют следующие показатели: 1. КМАФАнМ (КОЕ/г). 2. БГКП. 3. S. aureus. 4. Патогенные бактерии, в том числе сальмонеллы. 5. L. monocytogenes. 6. V. parahaemolyticus. 7. Сульфитредуцирующие клостридии. 41 Для проведения микробиологического исследования пробы рыб заворачивают в пергаментную бумагу, а затем в — обычную оберточную. Консервированные продукты Консервирование — это процесс, который применяют для сохранения пищевого продукта, заключающийся в уничтожении микроорганизмов, способных развиваться в продуктах и вызывать их порчу. Процесс консервирования это комплекс нескольких последовательных этапов, включающих тепловую обработку продукта, помещенного в герметически закупоренную тару. Консервированные продукты делятся на следующие категории. А. Консервированные продукты, имеющие рH 4,2 и выше, а также овощные, мясные, консервированные мясорастительные, продукты с рыборастительные нелимитируемой и рыбные кислотностью, приготовленные без добавления кислот; компоты, соки, пюре из фруктов с рH 3,8 и выше, сгущенные стерилизованные молочные консервы. Б. Цельно-консервированные томаты, томатные напитки (неконсервированные томат-продукты), концентрированные томат-продукты с содержанием 12 % и более сухих веществ (томатная паста, томатные соусы). В. Консервированные слабокислые: овощные маринады, салаты, винегреты и др. продукты с рН 3,7–4,2 (огурцы консервированные, маринады овощные и другие продукты с регулируемой кислотностью). Г. Консервированная квашеная капуста, овощные маринады с рH ниже 3,7; соки, компоты и фруктовые пюре с рH ниже 3,8; фруктовые и плодовоягодные консервы; консервы сербиновой кислотой и рН ниже 4,0. 42 для общественного питания с Д. Пастеризованные мясные и мясорастительные консервы (полуконсервы): шпик, соленый и копченый бекон, сосиски, ветчина и другие консервы в герметичной таре с ограниченным сроком хранения. Е. Пастеризованные газированные фруктовые соки и напитки с рН 3,7 и ниже. Микробиологическому исследованию не реже двух раз в месяц подвергаются не только консервы, но и оборудование, инвентарь, тара. При этом определяют следующие санитарно-показательные микроорганизмы: 1. Количество аэробных и анаэробных психрофильных, мезофильных и термофильных (ТАФАнМ) бактерий и их спор. 2. БГКП. 3. Бактерии рода Proteus. Подготовка проб для анализа Пробу для определения санитарного состояния инвентаря и оборудования берут влажным стерильным ватно-марлевым тампоном, протирая им 100,0 см2 поверхности. Тампоны увлажняют в стерильном пептонно-солевом растворе. После забора смыва с поверхности тампон помещают в посуду со 100,0 см3 стерильного пептонно-солевого раствора для определения мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов или непосредственно в селективную среду при выявлении БГКП или бактерий рода Proteus. Навески консервов для высева в питательные среды отбирают в соответствии с ГОСТ 26668–85 «Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологического анализа» и ГОСТ 30425–97 «Консервы. Методы определения промышленной стерильности». В подозрительных консервах при наличии кольца на границе продукта с тарой или осадка на дне банки навески отбирают без предварительного перемешивания продукта для того, чтобы в навеску попала часть осадка или кольца. При ограниченном количестве единиц упаковок допускается 43 отбирание навески консервов из упаковок, прошедших термостатирование при температуре 30–37 °С для выявления не только мезофильных, но и термофильных микроорганизмов. Навески консервов для определения рН также отбирают по ГОСТ 26668–85 или по ГОСТ 30425–97 с соблюдением правил асептики непосредственно после отбора навесок для высева в питательные среды. Одновременно отбираются навески для микроскопирования консервированного продукта, поэтому общая масса или объем навеска продукта должны составлять: — 2,0±0,1 г (см3) при выявлении аэробных, факультативно-анаэробных и анаэробных микроорганизмов для высева в 2 пробирки с жидкой питательной средой; — 10,0±0,1 г (см3) при выявлении анаэробных микроорганизмов в консервах детского и диетического питания для высева в 2 пробирки с питательной средой; — 1,0±0,1 г (см3) — для высева глубинным методом в чашку Петри; — не менее 10±0,1 г (см3) — для приготовления разведения; — в количестве, необходимом для погружения электродов в анализируемый продукт при определении его рН. После отбора навесок продукта консервы сохраняют до окончания анализа и оформления результатов при температуре 4±2°С в условиях, исключающих повторное заражение микроорганизмами. Если в посевах будут выявлены жизнеспособные микроорганизмы, то в случае необходимости, из соответствующей банки, хранящейся при температуре 4±2°С, в соответствии с требованиями нормативного документа отбирают дополнительные навески продукта для высева в питательную среду с целью количественного подсчета обнаруженных микроорганизмов. Для определения промышленной стерильности консервов в каждой единице упаковки консервов устанавливают отсутствие (присутствие) тех групп микроорганизмов, показатели и нормы к которым приведены в 44 нормативном документе на анализируемый вид консервов. При отсутствии требований к микробиологическим показателям в зависимости от принадлежности консервов к определенной группе в них выявляют следующие микроорганизмы: А) в низкокислотных консервах (группа А), предназначенных к реализации при температуре ниже 40 °С, выявляют: жизнеспособные мезофильные аэробные, факультативно-анаэробные и анаэробные микроорганизмы; Б) в низкокислотных консервах (группа А), которые могут при реализации подвергаться воздействию температуры 40°С, дополнительно выявляют: термофильные аэробные, факультативно-анаэробные и анаэробные микроорганизмы, выделяя среди них кислотообразующие бациллы; В) в консервах группы Б и В выявляют: мезофильные анаэробные микроорганизмы, дрожжи, плесневые грибы и молочно-кислые микроорганизмы; Г) в консервах группы Г выявляют: дрожжи, плесневые грибы и молочно-кислые микроорганизмы; Д) в концентрированных плодовоягодных консервах группы Г выявляют дрожжи и плесневые грибы; Е) в пастеризованнных газированных фруктовых соках и напитках группы Е определяют: культуру мезофильных аэробных и факультативноанаэробных микроорганизмов, БГКП, дрожжи, плесневые грибы, молочнокислые микроорганизмы. Кулинарная продукция Общие технические требования к кулинарной продукции 45 Кулинарная продукция, сырье и полуфабрикаты, используемые для ее изготовления, должны соответствовать требованиям госстандартов предприятий, сборников рецептов блюд и кулинарных изделий. Для изготовления кулинарной продукции не допускается использование продуктов животноводства без ветеринарных свидетельств, продукции и компонентов с истекшими сроками годности и не отвечающих требованиям нормативных документов, а также запрещенных к использованию СанIIиН 42–123–5777. В сырье и пищевых компонентах, используемых при производстве кулинарной продукции, препаратов, микотоксинов, содержание пестицидов, антибиотиков, гормональных санитарно-показательных и патогенных микроорганизмов не должно превышать нормы. При производстве кулинарной продукции не допускается использование пищевых добавок, инвентаря, упаковочных материалов. оборудования, не разрешенных к применению органами госсанэпиднадзора. Микробиологические показатели кулинарной продукции характеризуют соблюдение технологических и экологических требований при ее производстве и оцениваются следующими группами микроорганизмов: 1. КМАФАнМ (КОЕ/г). 2. БГКП (колиформные бактерии). 3. S. aureus. 4. Бактерии рода Proteus. 5. Патогенные бактерии, в том числе сальмонеллы. Санитарно-показательные и патогенные микроорганизмы определяют во всех блюдах: — наличие коагулазоположительных стафилококков определяют в большинстве блюд, за исключением некоторых видов горячих супов (борщи, щи, рассольники, суп-харчо, солянки, картофельные супы, бульоны); 46 — количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов не определяют в блюдах, содержащих по рецептуре специфическую микрофлору (салатах из маринованных овощей, квашеной капусты, соленых огурцов, окрошках, квасе, кефире, твороге, сметане); — содержание кишечной палочки определяется в блюдах или кулинарных изделиях, при изготовлении которых в технологическом процессе предусмотрены ручные операции после проведения термической обработки (салаты из сырых, маринованных овощей и фруктов, квашеной капусты, соленых огурцов с добавлением яблок, хрена, салаты с мясом, в том числе птицы, рыбы, колбасных изделий, копчености, заливные блюда, паштеты, пюре, макароны, рис, картофель, кисели, компоты, желе, муссы). 7 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОДУКТОВ ДЕТСКОГО ПИТАНИЯ Продукты детского питания по консистенции делятся на сухие и жидкие, а по составу — на пресные и кисломолочные смеси. В качестве заквасок для кисломолочных смесей используются бифидобактерии и лактобактерии, ацидофильная палочка. По назначению продукты детского питания могут быть классифицированы как предназначенные для: — смешанного и искусственного вскармливания детей; — питания детей первого года жизни в качестве прикорма; — детей дошкольного и школьного возраста; — лечебного питания детей. К продуктам первой группы относятся «заменители материнского молока» — высококачественные продукты, изготовленные преимущественно на основе коровьего молока, а также на основе белков, сои и прочих, максимально приближенных по составу к материнскому молоку и, тем 47 самым, адаптированные к особенностям метаболизма, функционального состояния и иммунореактивности ребенка первого года жизни. К этой же группе продуктов относятся и частично адаптированные формулы, включающие отечественные и зарубежные смеси прежних поколений, а также смеси для детей второго полугодия жизни (так называемые «последующие формулы»), которые также могут использоваться в питании новорожденных детей. Для детского питания в течение первого года жизни как прикорм также используют группу продуктов детского питания: на молочной основе, на зерновой основе, на плодоовощной основе, на мясной основе, на рыбной основе. Среди них наиболее широко распространены жидкие и пастообразные молочные продукты, изготовленные из цельного коровьего молока: молоко, кисломолочные продукты, творог, поскольку эти продукты используются в качестве прикорма детей от 1-го до 3-х месяцев. При организации контроля над продукцией детских молочных кухонь следует руководствоваться СанПиН № 42–123–4940–88 «Микробиологические нормативы и методы анализа продуктов детского, лечебного и диетического питания и его компонентов», методических рекомендаций «Проведение санитарно-бактериологического исследования продукции детских молочных кухонь». При этом необходимо особо обращать внимание на следующие положения: — молоко, доставленное из хозяйства или с молочных заводов должно быть натуральным или нормализованным; — помещение для приготовления молочной закваски должно быть изолировано и оборудовано холодильным шкафом или камерой для хранения кефирных грибов и молочных заквасок. Молочные закваски, также как и кефирные, должны регулярно подвергаться бактериологическим анализам; 48 лабораторным химико- — на каждой порции продукции должна быть этикетка с указанием вида, количества продукции, даты и часа приготовления; — срок хранения готовой продукции не более 1-х суток после окончания технологического процесса; — продукцию молочных кухонь необходимо доставлять на раздаточные пункты на специально оборудованном транспорте. Для оценки продукции детских молочных кухонь необходимо: 1. Определять КМАФАнМ в 1,0 см3 продукта. 2. Определять БГКП. 3. Определять содержание золотистого стафилококка (S. aureus). 4. Проводить бактериоскопию кисломолочной продукции и руководствоваться следующими показателями: — в пастеризованных и вареных смесях общее микробное обсеменение в 1,0 г/см3 продукта не должно превышать 500, а титр бактерий группы кишечных палочек более 11,1; — в кисломолочных продуктах титр бактерий группы кишечных палочек не более 11,1; бактерии S. aureus должны отсутствовать в 1,0 г/см3 исследуемого продукта. На таблицах 4–6 Приложения отражены экологические показатели безопасности питания детей изделиями из молока. Подготовка проб пищевых продуктов к исследованию Перед посевом жидкие и полужидкие продукты тщательно перемешивают, определяют рН, и в случае рН ниже 7,0–7,2 подщелачивают стерильным 10 %-ным раствором соды до нейтральной среды. Сухие продукты «Детолакт», «Новолакт», «Алеся» и другие, предназначенные для детей с первого дня жизни, перед посевом должны подвергаться предварительной инкубации в неселективной жидкой среде для восстановления физиологических свойств бактерий, поврежденных в процессе технологической обработки продукта. В качестве неселективной среды используют фосфатный буферный раствор. Без предварительной 49 инкубации исследуют сухие продукты, подвергающиеся различным способам термической обработки перед употреблением: биологически активные добавки, стерилизованные кисломолочные (сухие и жидкие) и пастообразньие продукты детского питания и составляющие его компоненты. При контроле микробиологического качества и безопасности продуктов детского питания определяют следующие группы организмов: 1. КМАФАнМ. 2. БГКП. 3. Е. соli. 4. S. aureus. 5. В. cereus. 6. Бактерии рода Salmonella. 7. Дрожжи. 8. Плесневые грибы. В кисломолочных продуктах, кроме того, проводится контроль за количеством технологически значимой флоры — молочнокислыми бактериями и бифидобактериями. 8 ПРАВИЛА СБОРА И ХРАНЕНИЯ ОТХОДОВ ЛЕЧЕБНО- ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ УЧРЕЖДЕНИЙ Санитарные правила СанПиН 2.1.7.728–99 предназначены для всех лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ), организаций, занимающихся сбором, хранением, транспортировкой отходов органов здравоохранения, а также проектированием и эксплуатацией установок переработки, обезвреживания и полигонов захоронения твердых отходов. Под отходами ЛПУ понимают все виды отходов, образующихся в больницах, поликлиниках, диспансерах, станциях скорой медицинской помощи, станциях переливания крови, научно-исследовательских институтах и учебных заведениях медицинского профиля, ветеринарных лечебницах, 50 аптеках, фармацевтических производствах, оздоровительных учреждениях, санитарно-профилактических учреждениях, медицинских лабораториях. Экологическая классификация медицинских отходов Все отходы здравоохранения разделяются по степени их эпидемиологической, токсикологической и радиационной опасности: 1) класс А — неопасные отходы ЛПУ; 2) класс Б — опасные (рискованные) отходы ЛПУ; 3) класс В — чрезвычайно опасные отходы ЛПУ; 4) класс Г — отходы ЛПУ, близкие по своему составу к промышленным; 5) класс Д — радиоактивные отходы ЛПУ. Морфологический состав соответствующего класса отходов может быть охарактеризован следующим образом. В отходы класса А включаются неопасные отходы, не имеющие контакта с биологическими жидкостями пациентов, инфекционными больными; нетоксичные отходы; пищевые отходы всех подразделений ЛПУ, кроме инфекционных; мебель, инвентарь, неисправное диагностическое оборудование, не содержащее токсичных элементов; неинфицированная бумага, строительный мусор. В отходы класса Б включаются потенциально инфицированные отходы; материал и инструменты, загрязненные выделениями, в т.ч. кровью; выделения пациентов; патолого-анатомические отходы (органы, ткани); все отходы из операционных отделений; отходы из микробиологических лабораторий, работающих с микроорганизмами 3–4 группы патогенности (согласно СанПиН 1.2.036–95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортировки микроорганизмов 1–4 группы патогенности»); биологические отходы вивариев. В отходы класса В включаются материалы, контактирующие с больными особо опасными инфекциями; отходы из лабораторий, работающих с микроорганизмами 1–4 группы патогенности; отходы 51 фтизиатрических, микологических больниц; отходы от пациентов с анаэробной инфекцией. В отходы класса Г включаются просроченные лекарственные средства, отходы от лекарственных и диагностических препаратов, лекарства, не подлежащие использованию; цитостатики и другие химиопрепараты; ртутьсодержащие предметы, приборы и оборудование. В отходы класса Д включаются все виды отходов, содержащие радиоактивные компоненты. Порядок проведения дезинфекции, хранения и удаления отходов 1. Отходы класса Б и В обязательно дезинфицируют погружением в дезраствор, а затем помещают в одноразовую упаковку непосредственно на местах первичного сбора. 2. Дезинфекция отходов класса А производится ежедневно силами ЛПУ. 3. Дезинфекцию контейнеров для сбора отходов класса Б и В производят один раз в неделю. 4. Хранение и транспортировка отходов классов А, Б и В по территории ЛПУ допускается только в герметичных многоразовых контейнерах. Отходы классов А, Б и В допускается хранить не более 1 суток в естественных условиях. Пищевые отходы всех классов необходимо хранить в холодильниках при температуре не выше + 50 °С. Вывоз отходов этих классов должен производиться ежедневно. 5. Транспортировка отходов классов А, Б, В вне территории ЛПУ допускается только в закрытых кузовах специально применяемых автомашин. 6. Хранение отходов класса Г производится в специально отведенных для этой цели вспомогательных помещениях. 7. Отходы класса А могут быть захоронены на обычных полигонах по захоронению твердых бытовых отходов. Отходы классов Б и В необходимо 52 уничтожать на специальных установках но обезвреживанию отходов ЛПУ термическими методами. 9 СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИКИ ЭКОЛОГО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ Исследования окружающей среды и продуктов питания должны осуществляться в строгой последовательности, что подробно представлено на таблицах 7–11 приложения. Санитарно-экологические нормативы исследования воды централизованного водоснабжения (по СанПиН 2.1.4.1074–01). Определение ОМЧ аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов Метод основан микроорганизмов, на определении образующих колонии общего на микробного питательном агаре числа при температуре 37 °С в течение 24 часов. Методика проведения анализа Из каждой исследуемой пробы делают высев не менее двух объемов по 1,0 мл в стерильные чашки Петри. После внесения пробы в каждую чашку вливают по 8,0–10,0 мл расплавленного и остуженного до 45–49 °С питательного агара и перемешивают содержимое чашек, равномерно распределяя по всему дну, избегая при этом образования пузырьков. После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат вверх дном и инкубируют при 37±1 °С в течение 24 часов. При учете посевов предыдущего дня подсчитывают все выросшие на чашке колонии, наблюдаемые в объектив с увеличением в два раза; количество колоний на обеих чашках суммируют и делят на два. Результат 53 выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1,0 мл исследуемой пробы. Эколого-бактериологический анализ питьевой воды (по МУК 4.2.1018–01). Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий методом мембранных фильтров. Метод основан на фильтровании установленного объема воды через мембранные фильтры, диагностической выращивании питательной среде посевов с на лактозой дифференциальнои последующей идентификацией культур из выросших колоний по культуральным и биохимическим свойствам. Пробу исследуемой воды разбивают на три объема по 100,0 мл и фильтруют. Затем фильтры помещают на среду Эндо в чашки Петри, которые ставят в термостат дном вверх и инкубируют при 37°С и при 44,5 °С в течение 24 часов. Анализ заканчивается через 24 часа. Если на фильтрах нет роста или выросли колонии пленчатые, губчатые, плесневые, то дают отрицательный ответ: отсутствие общих колиформных бактерий (ОКБ) и тсрмотолерантных колиформных бактерий (ТКБ) в 100,0 мл исследуемой воды. Если на фильтрах обнаружен рост изолированных типичных лактозопозитивных колоний темно-красных или красных с металлическим блеском или без него, или других подобного рода колоний, то подсчитывают число колоний каждого типа отдельно и приступают к подтверждению их принадлежности к ОКБ и ТКБ. С этой целью каждую колонию исследуют на: 54 — морфологию клеток и их отношение к окраске по Граму; — наличие оксидазной активности; — способность к ферментации глюкозы, лактозы до кислоты и газа при 37 °С. Как ОКБ учитываются грамотрицательные бактерии при отрицательном оксидазном тесте, ферментации глюкозы, лактозы с образованием кислоты и газа. Как ТКБ учитываются грамотрицательные палочки при отрицательном оксидазном тесте и ферментации глюкозы и лактозы при 44,5 °С с образованием кислоты и газа. При отсутствии общих колиформных бактерий и термотолерантных колиформных бактерий на всех фильтрах результат записывают как «не обнаружено КОЕ ОКБ в 100,0 мл» и «не обнаружено КОЕ ТКБ в 100,0 мл». В случаях идентификации всех выросших подозрительных колоний число колониеобразующих единиц ОКБ и ТКБ подсчитывают на всех фильтрах и выражают результат анализа в 100,0мл воды, вычисляя его по формуле: Х = (а × 100) / V, где Х — число колоний в 100,0 мл; а — число подсчитанных колоний; V — объем воды профильтрованный через фильтр. Например, при посеве 3 фильтров по 100,0 мл выросло две колонии в 100,0 мл, на остальных двух фильтрах нет роста. Число общих или термотолерантных колиформных бактерий будет определяться таким образом: (2 × 100) / 300 = 0,7 КОЕ ОКБ (ТКБ) в 100,0 мл воды. Определение общих термотолерантных колиформных бактерий титрационным методом Титрационный метод может быть использован в следующих случаях: — при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполнения анализа методом мембранных фильтров; 55 — при анализе воды с большим содержанием взвешенных веществ; — при наличии в воде посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний общих колиформных бактерий. Титрационный метод основан на накоплении бактерий при посеве установленного (определенного) объема воды в жидкую питательную среду с последующим пересевом на среду Эндо. Учет результатов анализа (рост колоний) проводится после инкубации посевов на среде Эндо при 38 ± 1 °С в течение 18–20 часов. Если нет роста, то посевы оставляют в термостате и повторно просматривают через 48 часов. При образовании помутнения и газа в среде накопления и росте на среде Эндо колоний, типичных для лактозоположительных бактерий (темнокрасных, красных с металлическим блеском, вьпуклых с красным центром), дают положительный ответ на присутствие общих колиформных бактерий в данном объеме среды. Для определения наличия термотолерантных колиформных бактерий (ТКБ) делают посев 2–3 изолированных типичных лактозоположительных колоний (темно-красных, красных с металлическим блеском) в пробирки, содержащих среду с лактозой, предварительно прогретую до 44 °С. После засева пробирки инкубируют при 44 ± 0,5 °С в течение 24 часов, хотя уже через 4–6 часов допускается первичный учет результатов роста бактерий образования кислоты и газа. При выявлении кислотообразования и газообразования у выделенных культур бактерий выдают положительный ответ о наличии в исследуемом объеме воды термотолерантных колиформных бактерий (ТКБ). При отсутствии кислоты и газа при учете (просмотре) посевов инкубацию проводят в течение еще 24 часов при 44 °С и выдают окончательный ответ. 56 Определение спор сульфитредуцирующих клостридий (Clostridium) Сульфитредуцирующие клостридии – спорообразующие облигатно анаэробные палочковидные микроорганизмы из рода Clostridium, редуцирующие сульфит натрия на железосульфитном агаре при 44 ± 1 °С в течение 16–18 часов. Метод определения содержания сульфитредуцирующих клостридий основан на выращивании посевов из анализируемых проб воды на железосульфитном агаре в условиях, приближенных к анаэробным, и подсчете числа выросших колоний. Методика определения сульфитредуцирующих клостридий методом фильтрования в чашках Петри Исследуемую пробу воды (20,0 мл) для исключения возможности развития вегетативных форм бактерий прогревают при 75 °С в течение 15 минут в пробирке на водяной бане. Прогретую пробу фильтруют через мембранный фильтр, который затем помещают на железосульфитный агар (чашки Петри залиты питательной средой тонким слоем) фильтрующей поверхностью вниз, так, чтобы под фильтром не было пузырьков воздуха. Затем всю поверхность среды с фильтром заливают расплавленным железосульфитным агаром до верхнего края чашки, чтобы крышка плотно прилегала к среде для создания анаэробных условий. Посевы культивируют при 44 ± 1 °С в течение 16–18 часов, хотя окончательный результат получают через 24 часа и выражают его числом колониеобразующих единиц (КОЕ) спор сульфитредуцирующих бактерий в 20,0 мл воды. Если не отмечен рост черных колоний на всех фильтрах, то в протоколе анализа дают ответ «не обнаружено в 20,0 мл воды». При наличии черных колоний на всех фильтрах их подсчитывают, и результат анализа вычисляют по формуле: 57 Х = (а × 20) / V, где Х — число клостридий в 20,0 мл; а — число подсчитанных колоний; V — профильтрованный объем воды. Определение колифагов Колифаги — бактериофаги (вирусы), способные лизировать Е. соli и формировать на питательном агаре при 37 °С через 18–24 часа зоны лизиса бактериального газона (бляшки). Титрационный метод определения колифагов Метод основан на определении колифагов в пробах питьевой воды путем предварительного накопления их в среде обогащения на культуре Е. соli. последующем выявлении зон лизиса газона на питательном агаре. Титрационный метод определения колифагов предназначен для проведения текущего анализа питьевой воды. Методика проведения количественного анализа В исследуемую пробу воды объемом 100,0 мл вносят 10,0 мл 10кратного разведения питательного бульона и 1,0 мл смыва тест-культуры с плотной питательной среды или 2–4-х часовой бульонной культуры. Для контроля культуры 0,1 мл смыва Е. соli помещают в чашку Петри и заливают питательным агаром. Исследуемую пробу воды (100,0 мл) и чашку Петри с контролем помещают в термостат и инкубируют при 37 ± 1 °С в течение 18 ± 2 часа, после чего из исследуемой пробы воды отливают в пробирку 10,0 мл и добавляют 1,0 мл хлороформа. Пробирку закрывают стерильной резиновой пробкой, встряхивают для равномерного распространения хлороформа по объему пробы оставляют при комнатной температуре до полного осаждения хлороформа (не менее 15 минут). В предварительно расплавленный и остуженный до 45–49 °С питательный агар добавляют смыв бактерий Е. соli (из расчета 1,о мл на 100,0 мл агара) и перемешивают. 58 В стерильную чашку Петри пипеткой из пробирки переносят 1,0 мл обработанной хлороформом пробы воды и заливают смесью расплавленного до 45–49 °С питательного агара объемом 12,0–15,0 мл и осторожно перемешивают. Аналогичным образом готовят также одну дополнительную чашку Петри для контроля культуры Е. соli. Обе чашки помещают в термостат при 37 °С на 18–24 часа, после чего в проходящем свете осуществляют просмотр посевов. Проба считается положительной, если «колифаги обнаружены в 100,0 мл воды» при наличии лизиса на чашке с пробой воды и при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке. При наличии зон лизиса в контроле культуры результат анализа считается недействительным и выдается отрицательный ответ («колифаги не обнаружены в 100,0 мл воды»). Прямой метод определения колифагов Данный метод основан на определении колифагов в нормируемом объеме питьевой воды (100,0 мл) путем прямого посева пробы воды и последующего учета зон лизиса (бляшек, негативных колоний) на культуре Е. coli, посеянной методом газона, на чашки Петри с питательным агаром. Прямой метод проводят при исследовании по эпидемическим показаниям. Методика проведения количественного анализа В предварительно расплавленный и остуженный до 45–49 °С питательный агар двойной концентрации добавляют смыв бактерий Е. соli (из расчета 2,0 мл на каждые 100,0 мл агара) и перемешивают. Исследуемую пробу воды 100,0 мл разливают по 20,0 мл в пробирки, нагревают до 35–44 °С и немедленно разливают в 5 чашек Петри. Затем в каждую чашку вносят по 20,0 мл смеси агара с культурой E. соli. Для контроля культуры Е. соli в одну чашку Петри вносят 20,0 мл стерильной водопроводной воды, нагретой до 35–44 °С, заливают 20,0 мл 59 приготовленного агара с Е. соli, перемешивают и оставляют при комнатной температуре до застывания. Чашки с застывшим агаром помещают дном вверх в термостат и инкубируют при 37 ± 1 °С в течение 18–24 часов, после чего н проходящем свете осуществляют просмотр посевов. Учет результатов проводят путем подсчета и суммирования бляшек (зоны лизиса), появившихся на 5-ти чашках. В контрольной чашке бляшки (зоны лизиса) должны отсутствовать. При высоких концентрациях фагов наблюдается разная картина лизиса. Слияние негативных колоний (зон лизиса) дает «ажурный газон» Е. coli: рост единичных колоний Е. coli на фоне сплошного лизиса либо полное отсутствие роста на чашке. Предварительный учет результатов можно проводить через 5–6 часов инкубации. На этом этапе при наличии четких зон лизиса может быть выдан предварительный ответ о присутствии колифагов в воде. Окончательный количественный учет прямого посева проводят через 18–24 часа. Результаты выражают количеством бляшкообразующих единиц (БОЕ) на 10,0 мл пробы воды. Если отмечен сливной рост бляшек и счет затруднителен, то по данным прямого посева может быть выдан окончательный ответ «колифаги обнаружены в 100,0 мл воды». При получении отрицательного результата при работе прямым методом окончательный ответ выдается по результатам титрационного метода. При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат исследования считается недействительным. Эколого-микробиологическое исследование почвы Микробиологическое исследование почвенных образцов осуществляют согласно общепринятой методике по ГОСТ 17.4402–84. 60 Определение перфрингенс-титра почвы Определение перфрингенс-титра как показателя содержания в почве облигатных анаэробов рода Clostridium (C. perfringens) является важным критерием для экологической оценки почвы и оценки процессов ее самоочищения. Методика проведения анализа Основную почвенную суспензию титруют путем 10-кратньих разведений. Затем из каждого разведения берут по 1,о мл и заливают в пробирки с молоком, разлитым по 5,0 мл. Посевы прогревают на водяной бане при 80 °С в течение 15 минут. Наличие бактерий C. perfringens регистрируется по наступившему характерному свертыванию молока с полным отделением сыворотки и образованию губчатого сгустка на поверхности благодаря газообразованию. Титром C. perfringens (верфрингенс-титр) считают предельное разведение почненной суспензии, которое дает на молочной среде развитие колоний C. perfringens. Определение титра нитрифицирующих бактерий Появление и увеличение содержания нитрифицирующих бактерий в почве указывает на развитие процессов ее самоочищения. Методика проведения анализа Готовят 10-кратные разведения почвенной суспензии (от 1:100 до 1:104) и затем производят посев во флаконы с жидкой синтетической средой Виноградского. В качестве контроля используют два флакона с незасеянной средой Виноградского. Посевы и контрольные флаконы инкубируют при температуре 28 °С в течение 14–15-ти суток. 61 Уже на 5–7-е сутки культивирования с помощью качественной пробы с дифениламином проверяют образование азотистой или азотной кислоты. Для этого к капле среды, помещенной на стеклянную пластинку, добавляют несколько капель раствора дифениламина в концентрированной серной кислоте — появление синего окрашивания указывает на присутствие нитратов. В контрольной среде изменения окраски не происходит. Для более полной оценки процесса самоочищения почвы можно также определять группы микроорганизмов, быстро разлагающих органический субстрат: бациллы, актиномицеты, грибы. На свежее фекальное загрязнение почвы указывают: 1) обнаружение энтерококков; 2) большое количество БГКП при отсутствии нитрифицирующих бактерий и термофилов; 3) относительно высокое содержание вегетативных форм клостридий. Загрязнение почвы навозом, компостом или сточными водами и стадию разложения их органического субстрата помогает оценить определение термофильных бактерий. Эколого-микробиологическое исследование пищевых продуктов (по ГОСТ 50474–93) Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, в том числе на продукты детского лечебного питания, мясо, включая мясо птицы, субпродукты и мясные продукты, рыбу, молоко и молочные продукты, маргарин, майонез, свежие и свежезамороженные овощи, картофель и т.д. Определение бактерий группы кишечных палочек (БГКП) К бактериям группы кишечных палочек (БГКП) относятся грамотрицательные, не образующие спор палочки, сбраживающие глюкозу с 62 образованием кислоты и газа при температуре 37–44 °С в течение 24–48 часов, в основном являющиеся представителями следующих родов: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia. Методика проведения анализа Посев пробы продукта проводят в среду Кесслера с лактозой и поплавками с соблюдением соотношения продукта и среды 1:10 и инкубируют при температуре 37 °С в течение 24 часов. При отсутствии признаков роста (газообразование или помутнение среды Кесслера) дают заключение об отсутствии БГКП в данной пробе продукта. При наличии признаков роста из подозрительных колб или пробирок производят высев на чашки со средой Эндо или Левина. При этом посев выполняют петлей из каждой колбы или пробирки так, чтобы получить рост изолированных колоний — на отдельный сектор, а лучше — на отдельную чашку. Посевы инкубируют при температуре 37 °С в течение 18–24 часов. Учет результатов анализа При отсутствии на среде Эндо и Левина колоний, типичных для бактерий группы кишечных палочек, дающих на среде Эндо крупные с металлическим блеском или без него, розовые или бледно-розовые колонии, на среде Левина – черные с металлическим блеском, темные с черным центром, сиреневые с черным центром, засеянная навеска продукта считается незагрязненной ими, т.е. исследуемый продукт соответствует нормативу на БГКП (колиформные бактерии). При наличии на среде Эндо и Левина типичных или подозрительных для кишечной палочки (колиформных бактерий) колоний продолжают их изучение. Для этого из изолированных колоний, характерных или подозрительных на БГКП, делают мазки, окрашивают их по Граму и на наличие спор и микроскопируют. 63 Обнаружение в мазке грамотрицательных палочек, не содержащих спор, указывает на наличие БГКП в анализируемой массе продукта и его несоответствие микробиологическому нормативу. Исследуемый продукт считается соответствующим нормативу на БГКП при подтверждении принадлежности подозрительных колоний к роду Erwinia и отсутствии других микроорганизмов, типичных для БГКГI. Для определения принадлежности к роду Erwinia типичные для БГКП колония, выросшие на среде Эндо или Левина пересевают на питательный агар с 5 %-ной сахарозой, на котором бактерии рода Erwinia дают выраженный мукоидный рост, не свойственный колиформным бактериям. Определение энтерококков Определение энтерококков проводят в случае обнаружения в партии продуктов значительного превышения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов. Методика проведения анализа По 0,1 см3 жидкого продукта засевают на поверхность молочной среды с полимиксином в 2 чашки Петри и инкубируют при 37 °С в течение 48 часов. При учете результатов на обеих чашках подсчитывают количество только типичных колоний энтерококков — красного цвета с зоной протеолиза на светло-голубом фоне среды. При этом среднеарифметическое число колоний умножают на 10 или 100, получая количество энтерококков в 1,0 г или 1,0 м3 продукта. Одновременно 3–5 типичных колоний отсевают на скошенный мясопептонный агар для накопления чистой культуры с целью дальнейшей идентификации. После инкубации при 37 °С в течение 24 часов из исследуемой культуры готовят мазки, микроскопируют. 64 окрашивают по Граму и Кроме этого, определяют каталазную активность исследуемой культуры, поскольку энтерококки перекись водорода не разлагают. Для этого культуру помещают на чистое обезжиренное предметное стекло, добавляют 1 %-ный раствор перекиси водорода, смешивают. Если при смешивании пузырьки газа не выделяются, реакция отрицательна. Известно, что энтерококки способны к росту на средах с высоким содержанием желчи, поэтому исследуемую культуру также засевают в бульон, содержащий 40 % желчь, и инкубируют при 37 °С в течение 18–24 часов. Возможный рост изучаемых культур в посевах на жидкой среде обязательно подтверждают микроскопией мазка и постановкой теста на каталазу. Обнаружение значительного роста энтерококка при посеве исследуемого материала свидетельствует о необходимости контроля за данным продуктом. Определение количества дрожжей и плесневых грибов Метод основан на количественном подсчете колоний дрожжей плесневых грибов, вырастающих на специальных плотных питательных средах с антибиотиками при температуре 24 °С в течение 5 суток после посева исследуемого материала. Методика проведения анализа Из каждой пробы делают высев по 1,0 см3 продукта или по 1,0 см3 разведений продукта 1:10 и 1:100 на две чашки Петри со средой Сабуро. Через 15–20 минут в каждую чашку добавляют по 14,0 см3 одной из агаризованных сред, охлажденных до 45–49 °С и антибиотики. После тщательного перемешивания среды, избегая при этом образования пузырьков и застывания агара, чашки с посевами помешают в термостат вверх дном и 65 инкубируют при 24 °С в течение 5 суток (120 часов) с предварительным учетом роста через 3 дня. При учете посевов проводят подсчет соответствующих колоний на каждой чашке отдельно. При этом колонии дрожжей и плесневых грибов разделяют визуально, при необходимости проводят микроскопическое исследование. Типичные колонии плесневых грибов имеют поверхность, покрытую пушистым мицелием, похожим на вату. Рост дрожжей сопровождается образованием крупных выпуклых блестящих серовато-белых или беловато-желтых колоний с гладкой поверхностью, ровным краем, сметанообразной консистенцией. Кроме того, по мере роста и увеличения размеров колонии дрожжей могут приобретать перламутровый оттенок и куполообразное возвышение. Для количественного учета результатов посевов путем подсчета выросших колоний (КОЕ) отбирают те чашки, на которых выросло от 5-ти до 50-ти колоний дрожжей и (или) от 5-ти до 50-ти колоний плесневых грибов. Метод выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes Метод основан на высеве определенного количества продукта в жидкую селективную питательную среду (с предварительным обогащением, последующем пересеве на агаризованные селективно-диагностические среды и культивировании посевов при оптимальных условиях. Принадлежность выделенных колоний к L. monocytogenes определяют по биохимическим и антигенным свойствам. Отбор и подготовка проб для анализа Масса или объем навески должны составлять 25,0 ± 0,1 г (см3) для мясных продуктов и 50,0–100,0 г (см3) для продуктов детского, лечебного и специализированного питания. 66 Методика проведения анализа Соотношение между количеством продукта детского, лечебного питания и питательной средой должно составлять 1:9, поэтому навеску исследуемого пищевого продукта массой 25,0 ± 0,1 г или объемом 25,0 ± 0,1 см3 вносят в 225,0 см3 (225,0 мл) жидкой среды для предварительного обогащения. Посевы инкубируют при температуре 30–31 °С в течение 24–26 часов, затем навеску засевают на бульон Фразера, содержащий эскулин, в соотношении 1:9. При росте листерий на бульоне Фразера отмечается почернение среды, в то время как на питательной среде без эскулина почернения не происходит. После инкубирования продукта на бульоне Фразера содержимое среды независимо от наличия в нем изменений в количестве 1,0 см3 пересевают в 10,0 см3 одной из сред обогащения и вновь посевы инкубируют при температуре 37–38 °С в течение 48 часов. После этого при отсутствии роста характерных для листерий колоний на селективно-диагностических средах дают заключение об отсутствии L. monocytogenes в исследуемой пробе продукта. При обнаружении роста листерий, сопровождающегося почернением колоний и среды, по комплексу других биологических свойств определяют принадлежность колоний к бактериям данного рода. С этой целью, используя стандартные методики, определяют: — отношение к окраске по Граму; — наличие или отсутствие капсул и спор; — подвижность бактерий при температуре 22–23 °С и 37–38 °С; — каталазную активность; — нитратредуцирующие свойства. К бактериям рода L. monocytogenes выделенные микроорганизмы могут быть отнесены, если они — грамположительные короткие тонкие палочки, не 67 образующие спор и капсул, подвижны при температуре 22–23 °С, каталазопозитивны, не восстанавливают нитраты в нитриты. Дальнейшую идентификацию до вида L. monocytogenes проводят общепринятыми методами, используя постановку реакции агглютинации по идентификации с поливалентной листериозной агглютинирующей сывороткой. Положительным результат анализа продукта на содержание L. monocytogenes считается, если из среды накопления выделены грамположительные короткие тонкие неспорообразующие палочки, капсулы не имеют, подвижны при температуре 22–23 °С, неподвижны при 37–38 °С, каталазоположительны, гидролизующие эскулин, ферментируюшие с образованием кислоты рамнозу и мальтозу, не сбраживающие маннит и ксилозу, обладающие лецитиназной активностью и дающие положительную реакцию агглютинации по идентификации с соответствующей агглютинирующей сывороткой. Определение бактерий из рода Proteus Сущность метода заключается в определении у выделенной культуры морфологических свойств, характера роста, способности гидролизовать мочевину и образовывать сероводород. Методика проведения анализа 0,5 мл анализируемой взвеси бактерий (из предварительно выделенной чистой культуры) вносят в конденсационную воду свежескошенного мясопептонного агара, разлитого в широкие пробирки, не касаясь поверхности среды (метод Шукевича). Через 18–24 часа инкубации при температуре 37 °С основное внимание уделяют возможному образованию ползучего вуалеобразного налета с голубым оттенком на поверхности скошенного агара и подъему культуры из конденсационной жидкости вверх по поверхности среды. 68 При наличии такого роста, характерного для протеев, культуру бактерий микроскопируют, изучают ее подвижность в препарате «висячая капля» и биохимические свойства стандартными методами. Обнаружение полиморфных грамотрицательных палочек, дающих ползучий рост вследствие высокой подвижности, ферментирующих глюкозу и мочевину и не ферментирующих лактозу и маннит, указывает на наличие в продукте бактерий рода Proteus. Определение мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов Метод основан на способности мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов размножаться на плотном питательном агаре при 30 °С в течение 72 часов. Для определения количества мезофильных аэробных и факультативноанаэробных микроорганизмов выбирают те разведения, при посеве которых на чашках вырастает не менее 30 и не более 300 колоний. Из каждой пробы делают высев на 2–3 чашки, причем каждое из разведений должно быть засеяно в количестве 1,0 см3 в одну чашку Петри с заранее маркированной крышкой в залито 10,0–15,0 см3 расплавленной и охлажденной до температуры 40–45 °С питательной среды для определения общего количества бактерий. Допускается посев исследуемого продукта на чашки Петри из одного и того же разведения в количестве 1,0 см3 и 0,1 см3. Сразу после заливки агара содержимое чашки Петри тщательно перемешивают путем легкого вращательного покачивания для равномерного распределения посевного материала. После застывания агара чашки Петри переворачивают крышками вниз и ставят в термостат при температуре 30 °С на 72 часа. 69 Количество выросших колоний подсчитывают на каждой чашке, поместив ее вверх дном на темном фоне, и пользуясь лупой с увеличением в 4–10 раз. При большом числе колоний дно чашки делят на 4 и более одинаковых секторов, подсчитывают число колоний на 2–3-х секторах, находят среднее арифметическое и умножают на общее количество секторов всей чашки. Таким образом находят общее количество колоний, выросших на одной чашке и вычисляют общее количество бактерий в 1,0 см3 или 1,0 г продукта по следующей справке: X = n × 10m, где n — число колоний, подсчитанных на чашке Петри; m — число десятикратных разведений. Молоко и молочные продукты При исследовании санитарно-экологического качества молока и продуктов из него пользуются методами микробиологического анализа (по ГОСТ 9225–84), а также методами определения содержания спор мезофильных анаэробных бактерий (по ГОСТ 25102–90). Определение спор мезофильных анаэробных бактерий Для определения общего количества спор мезофилыиых анаэробных бактерий в молоке и сырах производят посев 1,0 см3 исследуемого образца (для молока — из нулевого, первого и второго, а для сыров — первого и второго разведения) в пробирку с 10 ± 2,0 см3 специальной питательной среды, предварительно выдержанной перед анализом в кипящей водяной бане в течение 30 минут и охлажденной. При этом каждый образец выбранных разведений исследуемого молока и сыра засевают в 2 пробирки с питательной средой, внося посевной материал на дно пробирки, не допуская взбалтывания и заливая сразу после 70 посева пробирки слоем предварительно расплавленного и охлажденного до 45 °С водного агара, высота которого должна быть не менее 20,0 ± 5,0 мм. Посевы инкубируют при 37 ± 1 °С в течение 72 часов. Наличие спор мезофильных анаэробных бактерий в засеянных объемах исследуемого образца молока или сыр определяют по появлению разрывов агарового столбика, образуемых в результате газообразования при росте этих бактерий. Наиболее вероятное число спор мезофильных анаэробных бактерий при анализе сыра определяют по числу пробирок, в которых они дали рост с посевом 0,1 см3 и 0,01 см3 (Приложение, табл. 13). Методы анализа качества продуктов детского, лечебного и диетического питания и их компонентов (по СанПиН 42–123–4940–88) Определение Еscherichia соli в продуктах детского питания Бактерии вида Е. соli, входящие в группу колиформных бактерий, являющиеся индикатором относительно свежего фекального загрязнения, представляют собой грамотрицательные, неспорообразующие палочки, не утилизирующие цитрат, способные расти и ферментировать лактозу при температуре выше температуры тела (от 44 до 45,5 °С). Метод основан на выявлении способности кишечной палочки фементировать лаквiозу с образованием кислоты и газа при температуре 44 °С от 24 до 48 часов. Идентификацию Е. coli проводят по следующим таксономическим признакам: образование индола, положительная реакция с красным метилом, отрицательная реакция Фогес-Проскауэра и отсутствие способности утилизировать цитрат. Методика проведения анализа с предварительной инкубацией Асептически взвешивают 10,0 г сухого детского продукта «Детолакт», растворяют в колбе в 90,0 см3 разбавленного фосфатного буфера; рН доводят 71 до 7,0, для чего используют пастеризованный 1н раствор гидроокиси натрия или 1н раствор соляной кислоты, проверяя рН индикаторной бумажкой. Колбу помещают в термостат и выдерживают при температуре 37 °С в течение 24 часов. 1,0 см3 смеси из этой колбы засевают в пробирку или колбу с 9,0 см3 среды Кесслера с лактозой и поплавком и инкубируют при температуре 44 °С в течение 24 часов. При отсутствии газа, помутнения, изменения цвета среды в посевах продуктов, подвергавшихся предварительной инкубации, результат анализа считают отрицательным и дают заключение об отсутствии в нем Е. coli, т.е. соответствии продукта нормативу по этому показателю. Методика проведения анализа без предварительной инкубации Навеску продукта 10,0 г (см3) помещают в колбу с 90,о см3 среды Кесслера с лактозой и поплавком и инкубируют при 44 °С 24 часа. При отсутствии признаков роста (газообразование и помутнение среды) посевы инкубируют еще 24 часа. При отсутствии газа и других признаков роста в посевах дают заключение об отсутствии в продукте Е. coli и соответствии нормативу по этому показателю. Пробирки (колбы), в которых обнаружен газ или другие признаки роста, подвергают дальнейшему изучению, для чего производят посев штрихом или рассевом на поверхность чашки Петри с подсушенной средой Эндо или Левина так, чтобы получить изолированные колонии. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 24 часов. При просмотре посевов необходимо учитывать, что эшерихии на среде Эндо дают красные с металлическим блеском или без него розовые колонии; на агаре Левина – черные, темно-коричневые с темным центром, с металлическим блеском или без него. Если из окрашенных колоний при микроскопии мазков окрашенных по Граму и на наличие спор, обнаруживаются 72 грамотрицательные неспорообразующие палочки, то все типичные колонии подвергаются идентификации по ИМАЦ-тестам (реакция на индол, реакция с метиловым красным, реакция Фогес-Проскауэра, утилизация цитрата). При учете результатов в первую очередь обращают внимание на наличие роста и/или изменение цвета среды Симмонса, содержащей цитрат, с зеленого на синий или желтый, что характерно для цитрат-положительных культур. Для цитрат-отрицательных разновидностей бактерий характерно отсутствие роста и изменения цвета среды. При выделении из продукта грамотрицательных неспорообразующих палочек, продуцирующих газ на лактозе при температуре 44 °С, образующих или не образующих индол, дающих положительную реакцию с метиловым красным, отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра и не растущих на среде Симмонса (Козера), считают, что в 10,0 г продукта содержится E. coli. Продукт в данном случае бракуется. При обнаружении в 10,0 г продукта бактерий родов Enterobacter и Citrobacter, но при отсутствии колиморфных бактерий в 1,0 г продукт браковке не подлежит. Определение сальмонелл (бактерий рода Salmonella) в пищевых продуктах Метод основан на использовании сред обогащения для увеличения роста сальмонелл, их выделении на специальных агаровых средах, идентификации с использованием биохимических и серологических методов. Для посева используют то количество продукта, в котором регламентируется отсутствие бактерий рода Salmonella. Перед посевом проводят инкубацию продукта в фосфатном буферном растворе. Компоненты детских сухих молочных продуктов засевают без предварительной инкубации, непосредственно в колбу со средой для селективного обогащения. 73 Посев с предварительной инкубацией Продукт взвешивают в стерильных условиях в стакане и затем для предварительного обогащения навеску асептически переносят в колбу разбавленным фосфатным буфером. Соотношение массы продукта буферного раствора 1:10, рН доводят до 7,0 ± 0,2 1н раствором гидроокиси натрия, перемешивают и встряхивают. К приготовленной таким образом взвеси продукта добавляют 0,1 %ный водный раствор бриллиантового зеленого в количестве 2 % к объему (т.е. 20,0 см3 раствора красителя к 1000,0 см3 взвеси продукта), перемешивают и выдерживают в термостате при температуре 37 °С от 18 до 24 часов. На следующий день 1,0 см3 выдержанной в термостате смеси переносят пробирки с 10,0 см3 магниевой среды или среды Мюллера и инкубируют при температуре 37 °С в течение 18–24 часов. Прямой посев в среды для селективного обогащения Асептически сделанные навески сухих компонентов продукта засевают в колбы с магниевой средой или средой Мюллера, соблюдая соотношение продукта и среды 1:9. Для жидких продуктов допускается использование среды с двойной концентрацией ингредиента при соотношении продукта и среды 1:1. В обоих случаях колбы с посевами инкубируют в течение 18–24 часов при 37 °С, после чего производят высев на поверхность чашек с подсушенными дифференциально-диагностическими средами — Плоскирева и висмут-сульфит агара. Чашки с посевами инкубируют при 37 °С в течение 24–48 часов, причем просмотр посевов осуществляют дважды: через 24 и 48 часов после инкубации. При наличии смешанного роста необходимо сделать повторный пересев на питательный агар для выделения чистых культур и получения изолированных колоний. Типичные колонии сальмонелл бывают: 74 — на среде Плоскирева — бесцаетные, прозрачные, плоские; — на висмут-сульфитном агаре — черные, с характерным металлическим блеском, зеленоватые с темным ободком, при этом наблюдается окрашивание в черный цвет участка среды под колонией. При отсутствии типичных колоний сальмонелл на каждой из сред результат анализа считают «отрицательным», т.е. в исследуемой массе продукта сальмонелл нет. При наличии на чашках Петри типичных для сальмонелл колоний или колоний, подозрительных на сальмонеллы, производят их дальнейшее изучение. Для этого выбирают хорошо изолированную колонию и засевают на пробирки с трехсахарным агаром с мочевиной или средой Клиглера и инкубируют при 37 °С в течение 24 часов. Идентификацкю выделенных культур проводят, соответственно, по ферментации лактозы, глюкозы, сахарозы и расщеплению мочевины: — покраснение или пожелтение скошенной части столбика трехсахарной среды (при посеве уколом) говорит об образовании кислоты в результате ферментации лактозы или сахарозы; — покраснение столбика трехсахарной среды указывает на расщепление глюкозы; — бледно-розовый цвет столбика трехсахарной среды указывает на расщепление мочевины; — об образовании сероводорода судят по почернению в столбике трехсахарной среды. Если культуры сбраживают лактозу с образованием газа и расщепляют мочевину, то они не принадлежат к бактериям рода Salmonella, поэтому дальнейшему изучению подвергаются культуры, не ферментирующие лактозу и не расщепляющие мочевину, но ферментирующие глюкозу (с образованием или без образования газа). 75 Прямой посев в среды для селективного обогащения Асептически сделанные навески сухих компонентов продукта засевают в колбы с магниевой средой или средой Мюллера, соблюдая соотношение продукта и среды 1:9. Для жидких продуктов допускается использование среды с двойной концентрацией ингредиента при соотношении продукта и среды 1:1. В обоих случаях колбы с посевами инкубируют в течение 18–24 часов при 37 °С, после чего производят высев на поверхность чашек с подсушенными дифференциально-диагностическими средами — Плоскирева и висмут-сульфит агара. Чашки с посевами инкубируют при 37 °С в течение 24–48 часов, причем просмотр посевов осуществляют дважды: через 24 и 48 часов после инкубации. При наличии смешанного роста необходимо сделать повторный пересев на питательный агар для выделения чистых культур и получения изолированных колоний. Типичные колонии сальмонелл: — на среде Плоскирева — бесцветные, прозрачные, плоские; — на висмут-сульфитном агаре — черные, с характерным металлическим блеском, зеленоватые с темным ободком, при этом наблюдается окрашивание в черный цвет участка среды под колонией. При отсутствии типичных колоний сальмонелл каждой из сред результат анализа считают «отрицательным», т.е. в исследуемой массе продукта сальмонелл нет. При наличии на чашках Петри типичных для сальмонелл колоний или колоний, подозрительных па сальмонелл, производят их дальнейшее изучение. Для этого выбирают хорошо изолированную колонию и засевают на пробирки с трехсахарным агаром с мочевиной или средой Клиглера и инкубируют при 37 С в течение 24 часов. 76 Идентификацию выделенных культур проводят, соответственно, по ферментации лактозы, глюкозы, сахарозы и расщеплению мочевины: — покраснение или пожелтение скошенной части столбика трехсахарной среды (при посеве уколом) говорит об образовании кислоты в результате ферментации лактозы или сахарозы; — покраснение столбика трехсахарной среды указывает на расщепление глюкозы; — бледно-розовый цвет столбика трехсахарной среды указывает на расщепление мочевины; — об образовании сероводорода судят по почернению в столбике трехсахарной среды. Если культуры сбраживают лактозу с образованием газа и расщепляют мочевину, то они не принадлежат к бактериям сальмонелл поэтому дальнейшему изучению подвергаются культуры, не ферментирующие лактозу и нё расщепляющие мочевину, но ферментирующие глюкозу (с образованием или без образования газа). Культуры, ферментирующие глюкозу без образования газа, подозрительных как брюшнотифозные сальмонеллы или дизентерийные бактерии. Культуры, ферментирующие глюкозу с образованием газа, т.е. дающие в среде пузырьки, и продуцирующие сероводород, могут принадлежать к роду сальмонелл. Если во всех пробирках отсутствует характерная для сальмонелл реакция, результат считают отрицательным и дают заключение об отсутствии в исследуемой массе продукта бактерий рода сальмонелл. Если обе пробирки покажут типичную для сальмонелл реакцию, а выделенный штамм дает отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра, то в этом случае проводят серологическую идентификацию с помощью реакции агглютинации по идентификации с сальмонеллезными О-сыворотками. Если реакция агглютинации по идентификации отрицательная (агглютинации не 77 наблюдается в течение 30–60 секунд), то конечный результат анализа записывают как отрицательный. При выделении культур грамотрицательных палочек, ферментирующих глюкозу с образованием или без образования газа, не ферментирующих лактозу и сахарозу, образующих или не образующих сероводород, дающих положительную отрицательную реакцию реакцию агглютинации по Фогес-Проскауэра и идентификации с соответстнующими сальмонеллезными О-сыворотками, считают, что в исследуемой навеске продукта присутствуют бактерии рода сальмонелл, и продукт к реализации не допускается. Определение коагулазоположительных стафилококков (Staphylococcus aureus) (по СанПиН 42–123–4940–88) Метод основан на способности микроскопических организмов рода Staphylococcus расти в средах с повышенным содержанием хлорида натрия (6,5 %). При этом наибольшее экологическое значение имеет обнаружение среди всех представителей данного рода и вида коагулазоположительных S. aureus — способных коагулировать цитратную плазму крови человека или кролика. Методика проведения анализа Навеска продукта должна составлять: — 10,0 г — без предварительной термической обработки; — 1,0 г — с предварительной термической обработкой. Сухие молочные продукты типа «Детолакт», «Новолакт ММ», «Новолакт-1», восстанавливаемые перед употреблением при 37 °С и 70 °С, перед посевом подвергаются разведению в фосфатном буферном растворе. 78 В стерильных условиях взвешивают 10,0 г или, соответственно, 1,0 г продукта и помещают в колбы с 90,0 см3 или, соответственно, 9,0 см3 разбавленного фосфатного буфера, тщательно перемешивают. Полученную смесь инкубируют при 37 °С в течение 18–24 часов, затем 1,0 см3 этой смеси переносят в пробирку с соленым бульоном (6,5 % натрия хлорида) и снова инкубируют при 37 °С в течение 24 часов. Жидкие, пастообразующие и другие продукты, не подвергающиеся предварительной инкубации, в количестве 1,0 г или 10,0 г засевают в пробирки или колбы с соленым бульоном при соотношении продукта и среды 1:10. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 18–24 часов. В обоих случаях для выделения чистой культуры стафилококков делают пересев петлей из соленого бульона на чашки Петри с подсушенными средами типа Байрд-Паркер или желточно-солевой агар (ЖСА) и снова инкубируют при 37 °С в течение 18–24 часов. Учет роста колоний: — на среде Байрд-Паркер S. aureus растет в виде черных, блестящих, выпуклых выделенные колоний. из При пищевых этом штаммы продуктов золотистого и штаммы, стафилококка, продуцирующие энтеротоксин, на этой среде часто дают просветление через 24 часа инкубации при 37 °С. — на желточно-солевом агаре (ЖСА) колонии стафилококка имеют форму выпуклых дисков белого, желтого, кремового, лимонного цвета с ровным краем, окруженные зоной лецитиназной активности. Из подозрительных на стафилококк колоний в любом случае готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При обнаружении грамположительных кокков, расположенных в виде скоплений, делают пересев на скошенный агар (МПА с 0,1 % глюкозой) для накопления чистой культуры. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 24 часов. 79 Выделенную чистую культуру пересевают на среду Гисса с маннитом или мальтозой, разлитую высоким столбиком (посев производят уколом) и снова инкубируют при 37 °С в течение 24 часов. В случае роста стафилококков на среде Гисса с маннитом или мальтозой наблюдается ферментация или окисление углевода, сопровождающиеся изменением цвета среды. Выделенную чистую культуру также обязательно исследуют на наличие фермента плазмокоагулазы для проведения реакции в стерильную пробирку с 0,5–1,0 см3 цитратной плазмы крови кролика вносят одну петлю суточной агаровой культуры бактерий. Еще одну пробирку с плазмой крови оставляют незасеянной для контроля. Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют при 37 °С в течение 24 часов. Результат реакции при этом учитывают через 2, 4, 6 и 24 часа. При учете реакции плазмокоагуляции возможно 2 варианта: — реакция образовании плазмокоагуляции даже культивирования, небольшого считается сгустка соответственно, положительной плазмы исследуемую через культуру 24 при часа относят к коагулазоположительным, что в свою очередь свидетельствует о присутствии коагулазоположительных стафилококков в 10,0 г или, соответственно, 1,0 г (см3) продукта. — реакция плазмокоагуляции считается отрицательной, если свертывание плазмы не происходит через 24 часа культивирования, исследуемую культуру относят к коагулазоотрицательным. Отрицательная реакция плазмокоагуляции свидетельствует об отсутствии коагулазоположительного стафилококка в засеянной массе. При значительном росте коагулазоотрицательных стафилококков в посевах детских сухих молочных смесей необходимо обратить внимание на соблюдение санитарно-экологических норм их изготовления, т.к. у детей грудного возраста некоторые коагулазоотрицательные способны вызывать острые энтериты. 80 стафилококки Определение бактерий Васillиs cereus В. cereus — аэробные спорообразующие грамположительные палочки, некоторые штаммы которых способны продуцировать энтеротоксин. В продуктах, выработанных с соблюдением технологических правил, при посеве 0,01 г рост В. cereus должен отсутствовать, что соответствует показателю по этому микроорганизму — менее 10 клеток на грамм. При несоответствии нормативу только по В. cereus в сухих молочных продуктах типа «Детолакт» (в отдельных случаях от 100 до 200 КОЕ/г) партия однократно не задерживается для реализации, В таких случаях проводят исследование на наличие В. cereus в компонентах растительного и животного происхождения. В случае обнаружения значительного количества бактерий дают рекомендации о возможности использования их в производстве. Метод основан на выявлении и количественном подсчете колоний бактерий вида В. cereus, относящихся к спорообразующим бациллам, при росте их на специальных плотных питательных средах. Методика проведения анализа Производят посев по 0,1 см3 (0,01 г) и по 0,2 см3 (0,02 г) сухих молочных продуктов из разведения 1:10 на поверхность хорошо подсушенной плотной специальной питательной среды доiована, разлитой в чашки Петри. Посевы инкубируют при 30 °С в течение 24–96 часов. При отсутствии роста на обеих чашках дают заключение о соответствии детской сухой молочной смеси нормативу по этому показателю. При обнаружении роста на среде Донована изучают выросшие колонии, учитывал при этом, что В. cereus на среде Донована образуют крупные белые распластанные колонии с изрезанными краями, окруженные 81 зоной глубокого белого матового коагулята или зоной просветления результат проявления лецитиназной активности. Из изучаемых колоний делают мазки, окрашивают по Граму и на наличие спор, затем микроскопируют, учитывая, что В. cereus грамположительные спорообразующие палочки. Для накопления чистых культур 3–5 колоний пересевают на скошенный агар с последующей инкубацией при 30 °С в течение 24–48 часов. У выделенных чистых культур методом «висячей капли» определяют подвижность. Кроме этого, эти культуры засевают: на кровяной агар; на среду с маннитом; на среду Кларка для постановки реакции ФогесПроскауэра (в пробирки). Посевы инкубируют при 30 °С в течение 24–48 часов. Характерными признаками для бактерий вида В. cereus являются: наличие подвижности; положительная проба на лецитиназу; гемолитическая активность (образование зон просветления вокруг колоний) на кровяном агаре; отсутствие способности ферментировать маннит; положительная реакция Фогес-Проскауэра. Подсчет обнаруженных в продукте бактерий вида В. cereus проводят путем умножения количества типичных выросших на среде Донована колоний на соответствующее разведение, затем пересчитывают в расчете на 1,0 г или 1,0 см3 исследуемого продукта. Экспресс-метод определения антибиотиков в пищевых продуктах (по МУК 4.2.026–95) Допустимое значение антибиотиков для продуктов не должно превышать для тетрациклина 0,01 ЕД, стрептомицина 0,5 ЕД на 1,0 г (мл) продукта. 82 пенициллина — 0,01 ЕД, Метод качественного и количественного обнаружения антибиотиков в пищевых продуктах антибиотиками и других субстратах, основан на дегидрогеназной активности тест-культур подавлении в жидкой питательной среде. Если антибиотик оказывает цитотоксическое действие, то клетки тест-культур теряют способность восстанавливать метиленовый синий в анаэробных условиях, поскольку метиленовый синий играет в этой системе одновременно роль акцептора водорода и индикатора. Преимущество экспресс-метода заключается в возможности получения ответа через 4–5 часов, относительной простоте и значительной экономии питательной среды. Методика проведения анализа состоит из нескольких этапов: 1. Подготовка проб к исследованию при качественном и. количественном определении. 2. Получение и хранение взвеси из клеток тест-культур. 3. Определение рабочей дозы» тест-культуры. 4. Определение концентрации антибиотиков в испытуемом растворе. 5. Качественное определение антибиотиков. Подготовка проб к исследованию при качественном определении Молоко (по ГОСТ 13928–84). Сырое молоко желательно подвергать исследованию в день отбора, как можно быстрее после получения; до начала анализа сохранять в холодильнике при температуре 4 ± 1 °С. Пробу в объеме не менее 10,0 см3 переносят в пробирку. Сухие молочные продукты (сухое молоко, сухие сливки, сухие детские молочные продукты, изготовленные на основе коровьего молока). Непосредственно перед исследованием продукты подвергаются восстановлению в кипяченой воде при температуре не выше 45 ± 1 °С в соответствии с указаниями на этикетке. Образцы тщательно перемешивают, они не должны содержать нерастворенных частиц или комков. Из 83 восстановленного продукта отбирают пробы для анализа объемом не менее 10,0 см3. Мясо и субпродукты Мясо и субпродукты (печень, почки, язык и т.д.) скота и птицы, предназначенные для исследования, измельчают при помощи мясорубки или гомогенизатора, помещают полученный фарш в чашку Петри и дают стечь тканевому соку. Тканевой сок в объеме не менее 10,0 см3 переносят в пробирку. Термическая обработка проб пищевых продуктов Перед проведением исследования пробирки с отобранными пробами помещают в водяную баню с температурой 60 ± 1 °С. Параллельно с испытуемыми образцами в водяную баню помещают пробирки с аналогичным продуктом и термометром. Время прогревания — 30 минут — отмечают от момента достижения температуры внутри пробирки. Подготовка проб к исследованию при количественном определении. Молоко, молочные продукты, яйца Для определения концентрации антибиотика в молоке, жидких молочных продуктах, кроме кисломолочных, яйцах, пробы, подготовленные к исследованию в количестве 10,0 мл или 10,0 г (смешанного содержимого каждого яйца) вносят в колбы емкостью 50,0 мл и добавляют равное количество (10,0 мл) буферного раствора соответственно определяемому антибиотику: тетрапиклин цитратно-солянокислый (рН 5,8–6,0), стрептомицин – 0,066 М фосфатный буфер (рН 7,8–8,0), пенициллин — 0,066 М фосфатный буфер (рН 6,8–7,0). Таким образом, получают пробы для исследования, разведенные в два раза. Мясо и мясные продукты Навески по 10,0 г мышечной ткани, почек, печени, легкого и т.д., вырезанные из средней части образца, измельчают ножницами или микроразмельчителем тканей с последующим растиранием в ступке со стерильным кварцевым песком. Затем в ступку добавляют 10,0 мл 84 соответствующего буфера, тщательно перемешивают и переносят в центрифужные пробирки. Экстракцию антибиотика проводят в течение 90 минут в термостате при 37 ± 1 °С. Затем пробы прогревают на водяной бане при 65 ± 1 °С в течение 20 минут. Из надосадочной жидкости, являющейся первым разведением 1:2, берут 1,0 мл и прибавляют 1,0 мл соответствующего буфера, получают второе разведение 1:4 и т.д. Концентрацию антибиотика определяют в надосадочной жидкости, полученной от каждого образца мяса и мясных продуктов. Получение и хранение взвеси клеток тест-культур Тест-культурами служат вегетативные формы спорообразующих и неспорообразующих культур: Ваcillиs subtilis вар. 6633, В. subtilis вар. L2, В. micoides 537, Мiсrococcus luteum АТСС 9341, обладающих высокой чувствительностью к антибиотикам. Для определения тетрациклина предпочтительно пользоваться штаммом В. subtilis вар. L2, а для пенициллина и стрептомицина – всеми остальными. Музейные штаммы вегетативных форм тест-культур хранят в столбике полужидкого (0,4 %) питательного агара. Вначале тест-культуру рассевают на чашки с 2 % МПА для получения отдельных колоний и инкубируют при 37 ± 1 °С в течение 20–24 часов. После этого для накопления чистой культуры отсевают в пробирки с 2 % скошенным МПА и вновь инкубируют при 37 ± 1 °С в течение 20–24 часов. Микробную взвесь готовят путем смыва физиологическим раствором суточной культуры со скошенного агара. Важно чтобы смыв культур был абсолютно гомогенным и не содержал комочков. Полученную взвесь хранят в холодильнике при температуре 4 ± 1 °С не более 7 дней. По дегидрогеназной активности жизнеспособных клеток тест-культуры в смыве определяют «рабочую дозу» тест-культуры, т.е. наибольшее 85 разведение суспензии, вызывающее обесцвечивание метиленового синего в определенное время (1 час) в термостате при температуре 37 °С. Количественное определение концентрации антибиотика и расчет активности При определении концентрации антибиотика в пищевых продуктах параллельно ставят контрольный ряд с известным содержанием антибиотика в пробирках. для этого навеску стандарта антибиотика 1,0 г растворяют в 1 1,0 мл соответствующего буфера, получал, таким образом, основной раствор стандарта 1000,0 мкг/мл. Затем основной раствор десятикратно разводят до получения 100,0 мкг/мл и 10 мкг/мл. Далее концентрации, с которых начинается титрование стандарта в контрольном ряду, разводят соответствующими буферными растворами. Титрование стандарта антибиотика и испытуемых образцов проводят путем двукратных разведений в объеме 0,5мл МПБ. Последняя пробирка в контрольном ряду не содержит антибиотика и служит контролем дегидрогеназной активности клеток тест-культуры. После этого во все пробирки вносят 0,5 мл взвеси, содержащей двойную «рабочую дозу» тест-культуры, т.е. предпоследнее разведение тесткультуры, взывающее обесцвечивание метиленового синего через 1 час. В результате микробная нагрузка в пробирках уменьшается вдвое и соответствует «рабочей дозе» тест-культуры. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37 °С на 3-х часовую экспозицию тест-культуры с антибиотиком. Затем в каждую пробирку добавляют по 2,0 мл 1 % МПА с метиленовым синим и глюкозой. Содержимое пробирок вновь смешивают и инкубируют при 37 °С в термостате. Если в исследуемом объекте содержится антибиотик, то он блокирует дыхательные ферменты бактериальных клеток тест-культуры и вызывает их гибель. В этих пробирках метиленовый синий не обесцвечивается (цвет — синий). 86 О степени активности антибиотика судят по его минимальной концентрации, которая вызывает полное подавление дегидрогеназ клеток тест-культур через 1 или 2 часа инкубации в термостате при температуре 37 °С, по сравнению с контролем. Качественное определение антибиотиков Подготовленные к использованию испытуемые пробы в объеме 0,5 мл вносят в пробирки с таким же количеством МПБ и тщательно перемешивают. Во все пробирки добавляют 0,5мл взвеси, содержащей двойную рабочую дозу тест-культуры. Последняя пробирка не содержит испытуемого субстрата и служит контролем ферментативной активности тест-культуры. Пробирки встряхивают и помещают в термостат на 3-х часовую экспозицию тест-культуры с испытуемым субстратом. После этого в каждую пробирку вносят по 2,0 мл растопленного и охлажденного до 45 ± 1 °С МПА с метиленовым синим и глюкозой. Содержимое пробирок смешивают и вновь инкубируют при 37 ± 1 °С в течение 1–2 часов. Учет результатов 1. При отсутствии в пробах антибиотика дыхательные ферменты бактериальных клеток тест-систем не нарушаются и восстанавливают (т.е. обесцвечивают) в анаэробных условиях метиленовый синий. 2. В контрольной пробирке, где нет испытуемого образца, также происходит обесцвечивание в течение 1–2 часов наблюдения в термостате при 37 ± 1 °С (контроль ферментативной активности бактериальных клеток тест-культуры). 3. При наличии антибиотика в испытуемом образце дыхательные ферменты бактериальных клеток блокируются, метиленовый синий не восстанавливается и цвет в пробирке не меняется, остается синим. 4. Параллельно в качестве второго контроля можно использовать субстраты, содержащие определенную концентрацию антибиотика. 87 10 ТЕСТЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ Необходимо выбрать один правильный ответ из представленных трех вариантов. 1. Требования, предъявляемые к санитарно-показательным микроорганизмам: А) изменяют свои свойства в окружающей среде; Б) интенсивно размножаются в окружающей среде; В) не размножаются интенсивно в объектах внешней среды. 2. К санитарно-показательным микроорганизмам, определяемым в объектах окружающей среды, относятся: А) менингококки; Б) кишечная палочка; В) кампилобактерии. 3. БГКП: А) сбраживают глюкозу до кислоты и газа; Б) оксидазоположительные; В) растут только при 44 °С (термотолерантны) 4. Автохтонная микрофлора воды представлена: А) Васillиs cereus; Б) Corynebacterium diphtheriae; В) Neisseria sicca. 5. Полисапробная зона: А) микробное население обильное, видовой состав ограничен; Б) видовой состав разнообразен; 88 В) количественно бактерии от 10 до 1000 в 1,0 мл воды. 6. Для забора проб воды используют: А) фотометр; Б) батометр; В) аппарат Кротова. 7. Согласно СанПин 2.1.4.1074–01 эпидемиологическая безопасность воды определяется: А) количеством колифагов в 100,0 мл; Б) определением перфрингенс-титра; В) выявлением гемолитического стрептококка. 8. Термотолерантные колиформные бактерии: А) сбраживают лактозу с образованием кислоты и газа при 44,5 °С; Б) интенсивно размножаются в окружающей среде; В) оксидазоположительны. 9. Общие и термотолерантные колиформные бактерии определяют по формуле: А)Х = а × 100 / V; Б)Х = а ×100 / 20; В)Х = а ×V / 100. 10. Колиформные бактерии определяют: А) иммуноиндикацией по Манчини; Б) пробой на токсигенность; В) методом мембранных фильтров. 89 11. Согласно СанПин 2.1.4.559–96 вода питьевая должна регламентироваться следующим образом: А) ОМЧ не более 50 КОЕ/мл; Б) колифаги в 100,0 мл воды присутствуют; В) не более 100 спор сульфитредуцирующих клостридий на 20,0 мл воды. 12. В состав резидентной микрофлоры воздуха входят: А) Мусорlаsma hominis; Б) Chlamydia trachomatis; В) Sarcina flava. 13. Основу аспирационного метода составляет: А) принудительное осаждение микробных частиц из воздуха; Б) осаждение микробных частиц из воздуха под действием силы тяжести; В) посев на питательные среды воздушных фильтров после их использования. 14. Основные показатели санитарно-микробиологического состояния воздуха: А) учет колифагов в 100,0 мл воздуха; Б) определение кишечной палочки; В) определение Staphylococcus aureus. 15. Исследование микробной обсемененности предметов окружающей среды: А) предусматривает выявление Mycobacteriaceae; Б) осуществляется методом смывов; 90 микрофлоры семейства В) осуществляется проведением смыва с площади не более 1,0 см2. 16. Объектом исследования при проведении бактериологического контроля в лечебно-профилактических учреждениях являются: А) шприцы, иглы, инструментарий; Б) тумбочки больного; В) лабораторные приборы. 17. Забор проб для стерильности в лечебно-профилактических учреждениях проводит: А) врач-иммунолог; Б) медсестра под руководством сотрудника баклаборатории; В) врач-бактериолог. 18. Качественный состав микрофлоры почвы представлен: А) гонококками; Б) преимущественно спорообразующими бактериями; В) лактобациллами. 19. Экологическая оценка микробного показателя почвы проводится по комплексу показателей: А) количество колифагов; Б) определение перфрингенс-титра; В) количество стафилококков. 20. Отбор проб почвы для бактериологического исследования проводится согласно: А) ГОСТ 17.44.02–84; Б) аппаратом Кротова; В) методом мембранных фильтров. 91 21. На свежее фекальное загрязнение почвы указывает: А) отсутствие вегетативных форм клостридий; Б) обнаружение энтерококков; В) отсутствие БГКП. 22. Через пищевые продукты наиболее часто передаются возбудители: А) Helicobacter pylori; Б) Vibrio cholerae; В) Neisseria meningitides. 23. Молоко и молочные продукты являются главным фактором в передаче человеку: А) кишечной формы туберкулеза; Б) ВИЧ-инфекции; В) гепатита В. 24. Согласно ГОСТ регламентируется определение в молоке: А) общей обсемененности; Б) возбудителей дифтерии; В) перфрингенс-титра. 25. Метод определения мезофильных анаэробов и факультативных анаэробов в молоке основан на: А) способности агглютинировать с соответствующей сывороткой; Б) способности размножаться на плотной питательной среде; В) подсчете колиформных форм. 26. Эколого-микробиологическое исследование мясных продуктов проводится: 92 А) как плановое; Б) согласно ГОСТ 9225–68; В) с целью определения коринебактерий. 27. На поверхности чешуи рыб в основном обитают: А) псевдомонады; Б) вирусы гепатита В; В) менингококки. 28. При производстве консервов как санитарно-показательные микроорганизмы определяют: А) нитрифицирующие бактерии; Б) БГКП; В) хламидии. 29. На внутренней поверхности тары для консервов, изготовленных с применением горячего фасования, без последующей стерилизации допускается содержание: А) не более 10 бацилл группы В. cereus; Б) неспорообразующих микроорганизмов; В) много плесневых грибов. 30. Количество мезофильных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в сгущенном молоке: А) не определятся по ГОСТ; Б) определяется ГОСТ 9225; В) определяется МУК 4.2.1018–01. 31. Микробиологические показатели характеризуются определением: 93 кулинарной продукции А) сальмонелл; Б) перфрингенс-титра; В) грибов в 1,0 см3 пробы. 32. Содержание кишечной палочки определяется в блюдах или кулинарных изделиях: А) при определении пищевой ценности; Б) при наличии в технологическом процессе их приготовления ручных операций; В) по эпидемиологическим показаниям. 33. Продукты детского питания на молочной основе это: А) заменители женского молока; Б) плохо адаптированы к особенностям метаболизма ребенка; В) содержат большое количество жиров. 34. В кисломолочных продуктах проводится контроль: А) бактерий группы протея; Б) молочно-кислых бактерий; В) холерных вибрионов. 35. Определение принадлежности бактерий к роду иерсиний проводят по: А) характерному мукоидному росту на питательной среде; Б) положительным результатам теста на цитохромоксидазу; В) определению токсигенности. 36. При определении сальмонелл соотношение массы продукта и буферного раствора равно: А) 1:100; 94 Б) 1:200; В) 1:10. 37. Навеска продукта типа «Детолакт» для определения Staphylococcus aureus без предварительной термической обработки должна составить: А) 10,0 г; Б) 1,0 кг; В) 100, мг. 38. При определении наличия энтерококков в детском питании: А) у выделенной культуры определяют уреазную активность; Б) выделенную культуру засевают в бульон с 40 % желчью; В) у выделенной культуры проводят определение токсигенности. 39. Определение количества дрожжей и плесневых грибов проводят: А) методом кольцепреципитации; Б) на МПА при температуре 37 °С; В) на среде Сабуро при температуре 24 °С. 40. На питательных средах культура Pseudomonas aeruginosa растет: А) с образованием красного пигмента; Б) с образованием сине-зеленого пигмента; В) с формированием бесцветных колоний. 41. При идентификации выделенных культур Staphylococcus aureus изучают: А) способность образовывать интерферон; Б) способность ферментировать маннит в анаэробных и аэробных условиях; В) наличие жгутиков. 95 42. Правила сборки, хранения отходов лечебно-профилактических учреждений: А) соответствуют СанПиН 2.1.7.728–99; Б) соответствуют СанПиН 1.2.036–95; В) соответствуют ГОСТ 2668–85. 96 11 ОТВЕТЫ НА ВОПРОСЫ ТЕСТОВ 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) 9) 10) 11) 12) 13) 14) 15) 16) 17) 18) 19) 20) 21) 22) В Б А А Б Б А А В В А В А В Б А Б Б Б А Б Б 23) 24) 25) 26) 27) 28) 29) 30) 31) 32) 33) 34) 35) 36) 37) 38) 39) 40) 41) 42) 97 А А Б А А Б А Б А Б А Б А В А Б В Б Б А БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 1 Боровин, Э. Б. Гигиенические основы профилактики [Текст] / Э. Б. Боровин // Профилактика внутрибольничных инфекций. — М., 1995. — С. 149—159. 2 Воробьев, А. А. Медицинская и санитарная микробиология: Учебное пособие [Текст] / А. А. Воробьев, Ю. С. Кривошеин, В. П. Широбоков — М.: Академия, 2003. — 464 с. 3 ГОСТ 9958—81. Изделия колбасные и продукты из мяса. Методы бактериологического анализа [Текст]. — М.: Изд-во стандартов, 1982. — 20 с. 4 ГОСТ 4288—76. Изделия кулинарные и полуфабрикаты из рубленого мяса. Правила приемки и методы испытаний [Текст]. — М.: Изд-во стандартов, 1986. — 45 с. 5 ГОСТ 30425—97. Консервы. Методы определения промышленной стерильности [Текст]. — Минск: Изд-во стандартов, 1997. — 97 с. 6 ГОСТ 13928—84. Молоко и сливки заготовляемые. Правила приемки, методы отбора проб и подготовки их к анализу [Текст]. — М.: Изд-во стандартов, 1988. — 12 с. 7 ГОСТ 25102—90. Молоко и молочные продукты. Методы определения содержания спор мезофильных анаэробных бактерий [Текст]. — М.: Изд-во стандартов, 1990. — 12 с. 8 ГОСТ 9225—84. Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа [Текст]. — М.: Изд-во стандартов, 1985. — 15 с. 9 ГОСТ 17.44.02-84. Почва. Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического, гельминтологического анализа [Текст]. — М.: Государственный комитет по стандартам, 1986. — 10 с. 10 ГОСТ 307 12—2001. Продукты безалкогольной промышленности. Методы микробиологического анализа [Текст]. — Минск: Межгосударственный совет по стандартизации, метрологии и сертификации, 2004. — 80 с. 98 11 ГОСТ 26668—85. Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологического анализа [Текст]. — М.: Изд-во стандартов, 1986. — 12 с. 12 ГОСТ 50474—93. Продукты пищевые. Методы выявления и определения группы кишечных палочек (колиформных бактерий) [Текст]. — М.: Изд-во стандартов, 1993. — 8 с. 13 ГОСТ 21237— 75. Методы химического и микроскопического анализа свежести мяса [Текст]. — М.: Изд-во стандартов, 1976. — 11 с. 14 Ефремова, С. А. Санитарная микробиология и вирусология: Учебное пособие [Текст] / С. А. Ефремова, З. Н. Кочемасова, А. М. Рыбакова. — М.: Медицина, 1987. — 352 с. 15 Корженевич, В. И. Краткий курс медицинской микробиологии: Учебник для студентов отделения «высшее сестринское образование» медицинских вузов [Текст] / В. И. Корженевич, И. О. Лунева, И. Г. Швиденко, Г. М. Шуб. — Саратов.: Изд-во СГМУ, 2001. — 342 с. 16 Методические исследованию почвы указания МУК по санитарно-микробиологическому 1446—76 [Текст]. — М.: Изд-во Госсанэпиднадзора СССР, 1976. — 44 с. 17 Методические указания по санитарно-микробиологическому исследованию почвы МУ 2293—81 [Текст]. — М.: Изд-во Госсанэпиднадзора СССР, 1981. — 35 с. 18 Методические указания МУ 2.1.7.730—99. Почва, очистка населенных мест, бытовых и промышленных отходов, санитарная охрана почв. Гигиеническая оценка качества почвы населенных мест [Текст]. — М.: Изд-во Минздрава России, 1999. — 80 с. 19 Методы контроля, биологические и микробиологические факторы. Экспресс-метод определения антибиотиков в пищевых продуктах. МУК 4.2.026—95 [Текст]. — М.: Изд-во Госсанэпиднадзора России, 1995. — 18 с. 20 Пособие к практическим занятиям по санитарной микробиологии [Текст] / Под ред. А. А.Синицкого, П. И. Ремезова. — Л.: Наука, 1971. — 108 с. 99 22 Приказ № 215 МЗ СССР от 14.04.79 «О мерах по улучшению организации и повышению качества специализированной медицинской помощи больным гнойными хирургическими заболеваниями». Приложение и инструкция по бактериологическому контролю комплекса санитарногигиенических мероприятий в лечебно-профилактических учреждениях (отделениях хирургического профиля, в палатах и отделениях реанимации и интенсивной терапии) [Текст]. — М.: Изд-во Минздрава СССР, 1979. — 21 с. 23 Приказ МЗ РФ № 309 от 21.10.1997 г. «По санитарному режиму аптечных организаций» [Текст]. — М.: Изд-во Минздрава России, 1997. — 48 с. 24 СанПиН 2.3.2.1078—01. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы [Текст]. — М.: Изд-во Минздрава России, 2002. — 37 с. 25 СанПиН 1.2.631—97. Гигиенические требования к производству и безопасности парфюмерно-косметической продукции [Текст]. — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2000. — 34 с. 26 СанПиН 2.1.3.1375—03. Гигиенические требования к размещению, устройству оборудованию и эксплуатации больниц, родильных домов и других лечебных стационаров [Текст]. — М.: Информационно-издательский центр Минздрава России, 2003. – 25 с. 27 СанПиН 1.2.676—97. Микробиологические требования к средствам гигиены полости рта [Текст]. — М.: Информационно-издательский центр Минздрава России, 1997. — 83 с. 28 СанПиН 42—123—4940—88. Микробиологические нормативы и методы анализа продуктов детского. лечебного и диетического питания и их компонентов [Текст]. — М.: Изд-во Госсанэпиднадзора СССР, 1988. — 74 с. 29 СанПиН 42—123—4048—88. Морфологические нормативы и методы анализа продуктов детского, лечебного и диетического питания и их компонентов [Текст]. — М.: Изд-во Госсанэпиднадзора, 1988. — 72 с. 100 30 СанПиН 2.1.4.1074—01. Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованной системы питьевого водоснабжения [Текст]. — М.: Изд-во Госсанэпиднадзора, 2002. — 56 с. 31 СанПиН 2.1.7.728—99. Правила сбора и хранения отходов лечебнопрофилактических учреждений [Текст]. — М.: Информационно-издательский центр Минздрава России, 1999. — 34 с. 32 СанПиН 2.1.7.6287—03. Санитарно-эпидемиологические требования к качеству почвы [Текст]. — М.: Информационно-издательский центр Минздрава России, 2003. — 10 с. 33 Твирблянская, А. Ю. Основы санитарии и гигиены в пищевой промышленности [Текст] / А. Ю. Твирблянская, О. А. Бакушинская. — М.: Пищевая промышленность, 1977. — 205 с. 101 ПРИЛОЖЕНИЕ Таблица 1 – Санитарно-экологические показатели и нормативы качества питьевой воды (по СанПиН 2.1.4.1074–01) Санитарно-экологические показатели ОМЧ (КОЭ/мл) ОКБ (КОЭ/100,0 мл) ТКБ (КОЭ/100,0 мл) Споры сульфитредуцирующих клостридий (КОЭ/20,0 мл) Колифаги (БОЭ/100,0 мл) Нормативы качества воды Не более 50 отсутствие отсутствие отсутствие отсутствие Таблица 2 – Экологическая характеристика почв в зависимости от степени их микробного загрязнения (по МУ 2.1.7.730–99) Почва Кишечной палочки 10,0 и выше 0,9–0,01 0,09 и ниже Чистая Загрязненная Сильно загрязненная Титр (на 1,0 г почвы) Перфрингенса Ниритфицирующих бактерий 0,01 и выше 0,1 и выше 0,009–0,0001 0,9–0,001 0,00009 и ниже 0,0009 и ниже Количество термофилов 100–1000 1001–100000 100001– 1000000 Таблица 3 – Экологические требования безопасности мясных пищевых продуктов по микробиологическим показателям Мясо (все виды животных): - парное в тушах, полутушах, четвертинах, отрубах - охлажденное и подмороженное мясо в тушах, полутушах, четвертинах, 10,0 1×103 БГКП Патогенные, в том числе сальмонеллы 1,0 25,0 0,1 25,0 102 Плесени, КОЭ/г, не более Масса продукта (г), в которой не допускается Дрожжи, КОЭ/г, не более Группа продуктов КМАФАнМ, КОЭ/г, не более (по СанПиН 2.3.2.1078–01) – – – – Примечание Отбор проб из глубоких слоев Listeria monocytogenes в 25,0 г не допусткаются То же отрубах Мясо замороженное убойных животных: - в тушах, полутушах, четвертинах, отрубах 1×10 4 0,01 25,0 0,001 25,0 - блоки из мяса на кости, безкостного, жилованного 5×105 - мясная масса после дообвалки костей убойных животных Полуфабрикаты мясные (охлажденные, подморожены, замороженные), в том числе маринованные: - крупнокусковые 5×106 0,0001 25,0 5×105 0,001 25,0 - мелкокусковые Полуфабрикаты мясные рубленные (охлажденные, замороженные): - формованные, в т.ч. панированные Полуфабрикаты в тестовой оболочке, фаршированные (голубцы, кабачки) 1×106 5×106 2×106 0,001 0,0001 – – – – – – – – – – 25,0 – 500 25,0 – 500 25,0 0,0001 25,0 103 – L. monocytogenes в 25,0 г не допусткаются То же То же пробоподготовка без фламбирования поверхности L. monocytogenes в 25,0 г не допусткаются То же L. monocytogenes в 25,0 г не допускаются Для полуфабрикатов, панирован-ных со сроком годности более 1 месяца L. monocytogenes в 25,0 г не допускаются - фарш говяжий, свиной, из мяса др. убойных животных Полуфабрикаты мясокостные (крупнокусковые, порционные, мелкокусковые) 5×106 5×106 – 0,0001 0,0001 – 25,0 Для полуфабрикатов со сроком годности более 1 месяца L. monocytogenesв 25,0 г не допускаются L. monocytogenesв 25,0 г не допускаются – Таблица 4 – Экологические требования безопасности сухих молочных лечебных и диетических продуктов по микробиологическим Плесневые грибы, КОЕ/г, не более Дрожжи, КОЕ/г, не более От одного года и старше От одного года и старше Доводят до кипения Отсутствие в массе продукта (в г) Staphylococcus aureus Для детей старшего и раннего возраста Обработка перед употреблением Патогенные микроорганизмы, в т.ч. сальмонеллы Диетический калорийный (Эн-пит) Диетический низкокалорийный (Эн-пит) Противоанемический (Эн-пит) Эн-пит ацидофильный Низколактозное молоко Возраст детей БГКП Наименование продукта КоличествМАФАнМ, КОЭ/г, не более показателям (по СанПиН 2.3.2.1078–01) 25000 0,3 50,0 1,0 100,0 50,0 25000 0,3 50,0 1,0 100,0 50,0 50000 0,3 50,0 1,0 100,0 50,0 – 0,3 50,0 1,0 100,0 50,0 1,0 50,0 1,0 100,0 50,0 Восстановление при 45–50 °С Доводят до кипения 104 Таблица 5 – Экологические требования безопасности сухих молочных продуктов по микробиологическим показателям Новолакт J Малютка Малыш с С первых дней жизни до 1-го месяца С первых дней жизни до 3-х месяцев С первых дней жизни до 2-х месяцев С 2-х Васillиs cereus, КОЕ/г, не более 2000 1,0 10,0 100,0 10,0 100,0 50,0 10,0 2000 1,0 10,0 100,0 10,0 100,0 50,0 10,0 Восстановление при 37 °С 2000 1,0 10,0 100,0 10,0 100,0 50,0 10,0 Восстановление при 70 °С 3000 1,0 10,0 100,0 10,0 100,0 50,0 10,0 – 3000 1,0 10,0 100,0 10,0 100,0 50,0 10,0 – 3000 1,0 10,0 100,0 10,0 100,0 50,0 10,0 Доводят до кипения 25000 1,0 – 50,0 1,0 200,0 100,0 50,0 25000 1,0 – 50,0 1,0 200,0 100,0 50,0 Восстановление при 37 °С 105 Staphylococcus aureus Дрожжи, КОЕ/г, не более Аистенок Для недоношенных Плесневые грибы, КОЕ/г, не более Новолакт ММ С 2-х месяцев Отсутствие в массе продукта (в г) Патогенные микроорганизмы, в т.ч. сальмонеллы Солнышко С первых дней жизни Обработка перед употреблением Еscherichia соli Детолакт Детолакт, обогащенный железом Возраст детей БГКП Наименование продукта Количество МАФАнМ, КОЭ/г, не более (по СанПиН 2.3.2.1078–01) рисовой мукой Малыш с гречневой мукой Малыш с толокном месяцев и старше Виталакт Новолакт 2 Низкокалорийная смесь Малютка С первых дней жизни до 6-ти месяцев С 3-х месяцев до года С первых дней жизни до 2-х месяцев 25000 1,0 – 50,0 1,0 200,0 100,0 50,0 25000 1,0 – 50,0 1,0 200,0 100,0 50,0 Прогревание при 100 °С в течение 5 мин 25000 1,0 – 50,0 1,0 200,0 50,0 10,0 Восстановление при 85–90 °С 15000 1,0 – 50,0 1,0 200,0 100,0 50,0 Доводят до кипения 25000 1,0 – 50,0 1,0 – 50,0 10,0 Таблица 6 – Экологические требования безопасности сухих кисломолочных продуктов по микробиологическим показателям (по СанПиН 2.3.2.1078–01) Дрожжи, КОЕ/г, не более Ацидофильные бактерии, КОЕ/г, не менее 100,0 10,0 100,0 50,0 10,0 1×105 1,0 10,0 100,0 10,0 100,0 50,0 10,0 1×105 Васillиs cereus, КОЕ/г, не более 10,0 Staphylococcus aureus 1,0 Патогенные микроорганизмы, в т.ч. сальмонеллы Плесневые грибы, КОЕ/г, не более Отсутствие в массе продукта (в г) Еscherichia соli Возраст Обработка детей перед употреблением БГКП Наименование продукта Ацидофильные продукты Росток Росток-1 С первых дней жизни до года С первых дней жизни до 3-х месяцев Восстановление при 45–50 °С 106 Продукты с содержанием бифидобактерий* Бифидолакт С первых дней жизни до года Восстановление при 45–50 °С 1,0 10,0 100,0 10,0 100,0 50,0 10,0 – Примечание: *в «Бифидолакте» бифидобактерий содержится не менее 1×106 КОЕ/г. Таблица 7 – Этапы эколого-микробиологических исследований проб воды ОМЧ Исследуемую пробу воды (300,0 мл) разбивают на З объема по 100,0 мл и фильтруют. Фильтры помещают на среду Эндо. Чашки инкубируют при 37 °С в течение 24 часов БГКП Споры сульфитредуцирующих клостридий При анализе засевают Пробы объемом 20,0 мл 3–4 десятикратных прогревают на водяной объема (3,0; 30,0; бане и фильтруют, 300,0 мл) на среду фильтры помещают в Эндо чашки Петри с тонким слоем железосульфитного агара. Посевы культивируют при 44 °С в течение 16–18 часов Колифаги 100,0 мл разливают по 20,0 мл в чашки Петри с МПА и с культурой Scherichia coli. Чашки с застывшим агаром помещают дном вверх в термостат и инкубируют при 37 °С в течение 18–24 часов Таблица 8 – Начальные этапы эколого-микробиологических исследований проб воздуха ОМЧ Производят забор 1,0 м3 воздуха и засевают на 2 %ный питательный мясопептонный агар. Посевы инкубируют при 37 °С в течение часа Staphylococcus aureus Проводят забор 1,0 м3 воздуха и засевают на желточно-солевой агар. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 24–48 часов Дрожжи, грибы Проводят забор 1,0 м3 воздуха и засевают на среду Сабуро. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 120 часов (5 дней) Таблица 9 – Начальные этапы эколого-микробиологических исследований проб почвы Показатель ОМЧ БГКП Алгоритм исследований Из пробы готовят суспензию почвы, берут по 1,0 мл различных разведений и засевают в чашки Петри с МПА. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 24 часов. Из первого разведения почвенной суспензии (1:10) 10,0 мл и засевают во флаконы с 50,0 мл лактозного бульона среды Кесслера-Свенертона. 107 Clostridium perfringens Энтерококки Сальмонеллы Термофиллы Нитритфицирующие бактерии Escherichia coli Посевы инкубируют при 37 °С в течение 24 часов. Почвенную суспензию титруют путем 10-кратных разведений. Из каждого разведения берут по 1,0 мл и засевают в пробирки 5,0 мл молока. Посевы прогревают на водяной бане при 80 °С в течение 18–20 часов. В чашки Петри вносят по 0,01 мл разведений почвенной суспензии на среду Калины. Посевы инкубируют 24 часа при 37 °С 01–0,5мл взвеси средней пробы засевают на 3–5 чашек с висмут-сульфит агаром, к посевам добавляют 50,0 мл желточного бульона. Посевы инкубируют про 37 °С в течение 24 часов. Посев производят из разведений (1:10–1:106 на 2–3 параллельные чашки Петри с МПА. Посевы инкубируют при 60 °С в течение 24 часов. Производят посев почвенных разведений (0,1 мл суспензии) на среду Виноградского. Посевы инкубируют при 28 °С в течение 14–15 суток. Первый просмотр на 5-й день. Через мембранные фильтры пропускают 5,0–10,0 мл почвенной суспензии первого разведения (1:10). Фильтры помещают на среду Эндо. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 24 часов. Таблица 10 – Начальные этапы эколого-микробиологических исследований пищевых продуктов Показатель КМАФАнМ БГКП Сальмонеллы Листерии Протей Staphylococcus aureus Clostridium botulinum Pseudomonas aeruginosa Алгоритм исследований Для их определения выбирают разведения, при посевах которых на чашках вырастает не менее 30 и не более 300 колоний. Из каждой пробы делают посев на 2–3 чашки из различных разведений в количестве 1,0 см3 в одну чашку с МПА. Посевы инкубируют при 30 °С в течение 72 часов. Посев проводят в среду Кесслера с лактозой и поплавком с соблюдением соотношения 1:10. Посевы инкубируют при 30 °С в течение 24 часов. Навеску продукта помещают в фосфатный буфер, учитывая соотношение 1:10 (среды для обогащения), добавляют 0,1 %-ный раствор бриллиантового зеленого и перемешивают, затем инкубируют при 37 °С в течение 24–26 часов, после чего 10,0 см3 переносят в пробирку с 10,0 см3 магниевой среды. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 24 часов. Навеску исследуемого продукта массой 25,0 г или объемом 25,0 см3 вносят в 225,0 см3 среды для обогащения (соотношение 1:10). Посевы инкубируют при 37 °С в течение 24–26 часов, после чего 1,0 г обогащенной навески засевают в бульон Фразера с эскулином в соотношении 1:9. Посевы З7 °С течение 48 часов. 0,5 мл анализируемой взвеси вносят в конденсационную воду свежескошенного МПА. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 24 часов. 10,0 г продукта разводят в фосфатном буфере для обогащения и инкубируют при 37 °С в течение 18–24 часов, после чего 1,0 см3 из пробирки переносят в соленой бульон. Посевы инкуруют при 37 °С в течение 24 часов. Навеску продукта массой 20,0–25,0 г засевают в пробирку с высоким столбиком среды (анаэробные условия) агара для анаэробов. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 24–48 часов. 100,0 см3 исследуемого материала из разведений 1:10 вносят в стеклянный флакон объемом 200,0 см3, содержащим 100,0 см3 МПБ с 108 Escherichia coli глюкозой. Первичный посев инкубируют при З7 °С в течение 24–48 часов. 10,0 г продукта растворяют в колбе с 90,0 см3 разбавленного фосфатного буфера ля обогащения и выдерживают в термостате при 37 °С в течение 24 часов, после чего 1,0 см3 из колбы засевают в 9,0 см3 среды Кесслера с лактозой (посевы инкубируют при 44 °С в течение 24 часов). Таблица 11 – Начальные этапы эколого-микробиологических исследований продуктов детского питания Показатель КМАФАнМ БГКП Плесневые грибы, дрожжи Escherichia coli Staphylococcus aureus Сальмонеллы Васillиs cereus Алгоритм исследований По 1,0 см3 каждого соответствующего разведения пробы продукта вносят в 2 чашки Петри с МПА. Выбирают те разведения, при которых вырастает не менее 30 и не более 300 колоний. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 24 часов. 10,0 г сухого продукта детского питания растворяют в колбе в 90,0 см3 фосфатного буфера для обогащения. На следующий день 1,0 см3 засеивают в колбу с 9,0 см3 среды Кесслера с поплавком. Посев инкубируют при 44 °С в течение 24 часов. Из каждой пробы продукта делают посев по 1,0 см3 продукции или 1,0 см3 разведений 1:10 и 1:100 на 2 чашки Петри на среду Сабуро. Посевы инкубируют при температуре 24 °С в течение 120 часов (5 суток). 10,0 г сухого продукта детского питания растворяют в колбе в 90,0 см3 фосфатного буфера для обогащения. Навеску выдерживают в термостате при 37 °С в течение 24 часов, после чего по 1,0 см3 из колб засевают в 9,0 см3 среды Кесслера с лактозой. Посевы инкубируют при 44 °С в течение 24 часов. 10,0 г или 1,0г продукта помещают в колбы с 90,0 см3 или 9,0 см3 фосфатного буфера для обогащения и инкубируют при 37 °С в течение 24 часов, после чего по 1,0 см3 смеси переносят в пробирку с соленым бульоном. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 24 часов. При посеве продукта соблюдают соотношение массы продукта и буферного раствора 1:10. Смесь помещают в термостат ири 37 °С до 24 часов. Затем 1,0 см3 выдержанной в термостате смеси переносят в пробирку с 10,0 см3 магниевой среды или среды Мюллера и инкубируют при 37 °С в течение 24 часов. 0,1 см сухого продукта детского питания из разведения 1:10 засевают на поверхность питательной среды Донована. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 24–26 часов. 109 Подписано в печать 10.06.2010 Формат 60х84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Усл. печ. л. 6,0. Тираж 300. Заказ 347/2010 _________________________________________________________ Типография ОООп «Орион» 410031, г. Саратов, ул. Московская, 62 тел.: (8452) 23-60-18 110
