Модификация естественными

Радиация и риск. 2013. Том 22. № 1
Научные статьи
Модификация радиационных нарушений у животных и растений
естественными летучими выделениями
Харламов В.А., Суринов Б.П.
ФГБУ МРНЦ Минздрава России, Обнинск
В экспериментах на лабораторных мышах доказано, что воздействие летучих выделений мочи интактных особей на облучённых (1 Гр) животных стимулирует иммунную реактивность в
селезёнке и региональных лимфатических узлах. На семенах сельскохозяйственных растений получены данные о способности облучённых и необлучённых семян взаимно модифицировать начальные ростовые показатели через воздушную среду и субстрат проращивания.
Общим для растений и животных является то, что модификация пострадиационных нарушений независимо от биологического вида развивается с участием, как предполагается, физиологически целесообразных летучих хемосигналов.
Ключевые слова: «эффект свидетеля», ионизирующая радиация, мыши, семена сельскохозяйственных культур, летучие выделения.
Введение
Механизмы немишенных эффектов, к которым относится и «эффект свидетеля», являются актуальной проблемой радиобиологии. Обусловлено это тем, что влияние облучённых биологических объектов на необлучённые имеет важное значение как для учёта радиационных
рисков, так и в практике лучевой терапии пациентов. Первоначально термин «эффект свидетеля» был использован для обозначения явления индукции нестабильности генома у клеток животных, соседствующих с клеткой, облучённой узким пучком излучения [7].
С каждым годом к фактам, которые могут быть отнесены к этому явлению, постоянно добавляются всё более новые данные, получаемые на различных объектах. Доказано, что у интактных лабораторных мышей в присутствии особей, подвергнутых воздействию ионизирующей
радиации в сублетальной дозе (4 Гр), понижается способность к иммунному ответу на тимусзависимый антиген в селезенке [3-5], а у крыс приводит к уменьшению количества лейкоцитов в
крови и клеточности тимуса [5]. Эффект воспроизводится за счёт обонятельного контакта с летучими выделениями, содержащимися в моче облучённых особей. «Эффект свидетеля» обнаружен и на растительных объектах. Так, установлено, что семена пшеницы после воздействия
ионизирующей радиации в травмирующих дозах вызывают у необлучённых семян стимуляцию
или
угнетение
ростовых
показателей
в
зависимости
от
дозы
и
срока
совместного
хранения [1, 2].
Межорганизменный «эффект свидетеля» описан на рыбах и их эмбрионах [6, 8]. Более
того, «эффект свидетеля» носит обратный характер. Интактные эмбрионы рыб способны снижать частоту апоптоза у облучённых особей, контактировавших с ними через биосовместимый
субстрат [8]. В моче интактных животных обнаружено присутствие летучих выделений, которые
стимулируют гуморальный иммунный ответ особей с пострадиационным иммунодефицитным
состоянием [4]. Не исключено, что подобное может иметь место у растительных объектов.
Харламов В.А.* – научн. сотр.; Суринов Б.П. – зав. лаб., д.б.н. ФГБУ МРНЦ Минздрава России.
*Контакты: 249036, Калужская обл., Обнинск, ул. Королева, 4. Тел.: (48439) 9-71-61; e-mail: kharlamof@gmail.com.
62
Радиация и риск. 2013. Том 22. № 1
Научные статьи
Предполагается, что такой эффект имеет общебиологическую природу и носит защитный характер.
Известно, что хранение γ-облучённых семян с необлучёнными в условиях ограниченного
воздушного объёма в зависимости от срока и дозы облучения модифицирует (стимулирует или
угнетает) ростовые процессы последних [1, 2]. Считается, что такой эффект обеспечен выделением микроколичеств летучих газообразных соединений. Ранее установлено, что угнетение метаболизма понижением положительных температур (экспонирование семян при 3-5 °С) лишает
облучённые семена способности влиять на необлучённые [2]. Эффект отсутствует и при хранении тех и других семян в условиях, исключающих газообмен между ними [1, 2]. В связи с этим
возникает необходимость исследовать не только взаимовлияние на ростовые показатели облучённых и необлучённых семян, но также изменение состава их газообразных выделений.
Целью работы было выявить закономерности влияния интактных особей лабораторных
мышей на облучённые с помощью продуцируемых ими естественных летучих выделений, а
также влияние необлучённых семян сельскохозяйственных растений на облучённые семена.
Материалы и методы
Работа выполнена на лабораторных мышах-самцах гибридах (СВАхС57BL/6)F1 с массой
тела 21-23 г. Донорами летучих выделений служили интактные животные (5 особей в группе),
реципиентами (7 особей в группе) – мыши через 3 суток после тотального воздействия
γ-излучения
60
Co в дозе 1 Гр (9,5 мГр/с) или интактные мыши (контроль). Образцы мочи интакт-
ных мышей, содержащие исследуемые летучие выделения, получали на бумажную подстилку,
помещённую на сутки под дополнительное сетчатое дно (решетка из нержавеющей стали) модифицированных боксов для содержания животных. Облучённых реципиентов экспонировали в
течение третьих суток после воздействия радиации с данными образцами мочи, помещая их
также под сетчатое дно бокса. Для индукции первичного тимусзависимого гуморального иммунного ответа реципиентам вводили эритроциты барана, а затем определяли клеточность и количество антителообразующих клеток (АОК) методом Каннингема в селезёнке или подколенных
лимфатических узлах.
Другим объектом исследований были воздушно-сухие семена тритикале (гибрида ржи и
пшеницы) сорта Антей и пшеницы сорта Памяти Федина. Дистанционное взаимовлияние облучённых семян тритикале «Антей» и необлучённых семян моделировали, помещая пакеты из
фильтровальной бумаги с соответствующими семенами вплотную в картонную коробку. Семена
подвергали воздействию γ-излучения
60
Со в дозах 200, 400, 600 Гр при мощности дозы
27,0 Гр/мин. По завершении совместного хранения (1, 3, 6 месяцев) облучённых и необлучённых семян, их проращивали в чашках Петри (по 25 семян из ста проращиваемых) и на седьмые
сутки определяли интенсивность роста, оцениваемую по длине ростка и зародышевого корешка
(ГОСТ 12038-84). Семена принадлежали одной партии. Сроки хранения и проращивания семян
были одинаковы.
В следующей серии опытов γ-облучённые (400 Гр) воздушно-сухие семена пшеницы «Памяти Федина» проращивали вместе с необлучёнными семенами в полипропиленовых контей63
Радиация и риск. 2013. Том 22. № 1
Научные статьи
нерах в двух вариациях – на общем или раздельном субстратах (песок). Для этого облучённые
и необлучённые семена поочередно в 4 ряда по 10 штук (из ста проращиваемых семян) укладывали в контейнер на увлажнённый песок и накрывали пищевой полимерной пленкой. Раздельное проращивание осуществлялось с использованием водонепроницаемых желобков, наполненных песком. Контролем служили интактные семена. Во время проращивания поддерживалась температура в диапазоне 19-21 °С. В качестве показателей использовали длину ростка
и зародышевого корешка.
Эксперименты на животных и растительных объектах воспроизводили не менее чем в
трёх независимых сериях. Показатели выражали в процентах от контроля. Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ Statistica 6.0. Результаты представлены в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего. Значимость различий параметров оценивали по критерию Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при
р≤0,05.
Результаты и их обсуждение
В первой серии опытов изучали влияние естественных летучих выделений, продуцируемых интактными мышами, на антителогенез в селезёнке и лимфатических узлах облучённых
особей.
Показано, что в разгар лучевого поражения (3 суток после облучения в дозе 1 Гр) в селезёнке мышей снижается количество АОК и клеточность соответственно до 60,8±4,5 и 71,6±8,8 %
относительно интактного контроля, а в лимфатических узлах – до 30,8±2,6 и 54,9±3,9 %
(таблица 1).
Облучённых реципиентов двух групп экспонировали с летучими выделениями интактных
мышей-доноров за 1 сутки до иммунизации. Значит, в реакции реципиентов на воздействие летучих выделений участвовали предшественники клеток, способных к тимусзависимому гуморальному иммунному ответу.
Таблица 1
Иммунологические показатели (M±
±m, %) в селезёнке и лимфатических узлах
γ-облучённых мышей, экспонированных с естественными летучими выделениями (ЛВ)
Воздействие
Число АОК
Селезёнка
Контроль
100,0±2,4
Облучение 1,0 Гр
60,8±4,5*
Облучение 1,0 Гр + естественные ЛВ
96,0±11,0**
Лимфатические узлы
Контроль
100,0±2,6
Облучение 1,0 Гр
30,8±2,6*
Облучение 1,0 Гр + естественные ЛВ
50,5±3,8* **
Общее число клеток
100,0±12,9
71,6±8,8*
113,0±15,6**
100,0±2,9
54,9±3,9*
74,5±8,9*
Примечания: * – статистически значимое отличие от контроля;
** – статистически значимое отличие от облучённых мышей.
64
Радиация и риск. 2013. Том 22. № 1
Научные статьи
После экспозиции облучённых мышей с летучими выделениями до иммунизации (дистанционное воздействие летучих выделений на предшественники АОК) в селезёнке увеличивалось
содержание АОК до 96,0±11,0 и клеточность – до 113,0±15,6 % относительно облучённых особей без экспонирования с летучими выделениями. В лимфатических узлах облучённых мышей
после аналогичной экспозиции с летучими выделениями содержание АОК и клеточность увеличились до 50,5±3,8 и 74,5±8,9 % соответственно.
Таким образом, дистанционное воздействие естественных летучих выделений интактных
мышей на облучённых животных повышает содержание антителопродуцентов в лимфоидных
органах. Следовательно, данные естественные летучие выделения интактных особей обладают выраженной способностью оказывать регулирующее воздействие на иммунную систему животных, иммунная реактивность которых понижена радиационным воздействием.
В опытах с растительными объектами установлено, что хранение облучённых семян тритикале «Антей» с необлучёнными семенами влияет на их ростовые показатели. Далее представлены только статистически значимые результаты.
Длина ростка у облучённых в дозе 200 Гр семян и хранившихся 1 месяц с необлучёнными
семенами была выше (19,4±0,4 % от контроля – интактных семян), чем у облучённых в той же
дозе семян, но хранившихся отдельно от необлучённых (18,1±0,4 % от контроля).
Увеличение срока совместного хранения облучённых семян с необлучёнными семенами
до 3 месяцев сопровождалось ещё более выраженной стимуляцией роста проростков, но только в отношении семян, облучённых в дозах 400 и 600 Гр. Длина зародышевого корешка у облучённых в дозе 200 Гр семян, хранившихся с необлучёнными семенами (22,5±0,6 % от контроля),
была ниже, чем у облучённых в той же дозе семян, хранившихся отдельно от необлучённых
(24,8±0,9 % от контроля). Семена, облучённые в дозе 400 Гр и хранившиеся с необлучёнными,
напротив, отличались повышенной длиной зародышевого корешка (26,7±1,3 % от контроля – у
совместно хранившихся семян, 23,6±0,9 % от контроля – у отдельно хранившихся семян). Стимуляция интенсивности роста у облучённых семян под влиянием необлучённых семян сохранялась и после облучения первых в дозе 600 Гр (24,4±0,6 % от контроля – у совместно хранившихся семян, 19,8±0,6 % от контроля – у отдельно хранившихся семян).
Эффект совместного хранения в течение 6 месяцев облучённых в дозе 600 Гр семян с
необлучёнными выражался в увеличении длины зародышевого корешка (36,4±1,5 % от контроля) у облучённых семян по сравнению с облучёнными в той же дозе семенами, но хранившихся
отдельно от необлучённых семян (27,1±1,2 % от контроля). Длина ростка составила 12,2±0,3 %
от контроля – у первых и 11,0±0,5 % – у вторых. Сходные, но менее выраженные результаты,
получены и при дозе 200 Гр, при которой у облучённых семян, хранившихся 6 месяцев с необлучёнными семенами, была повышена длина корешка (31,1±0,9 % от контроля, против показателя у отдельно хранившихся семян – 27,7±0,9 %). Семена, облучённые в дозе 400 Гр и совместно хранившиеся (6 месяцев) с необлучёнными семенами, не отличались ростовыми показателями от облучённых в той же дозе семян, хранившихся отдельно от необлучённых.
65
Радиация и риск. 2013. Том 22. № 1
Научные статьи
Определение состава пострадиационных выделений воздушно-сухих семян тритикале
«Антей» проводили на газовом хроматографе «Кристалл 200М». Качественный состав летучих
выделений контроля (интактных семян) и семян, подвергнутых воздействию γ-излучения с мощностью дозы 27,0 Гр/мин в дозах 200, 400, 600 Гр, был одинаков. Облучение и интенсивность
его дозы повлияли на количественное содержание веществ. Заметно увеличивалось содержание гексаналя – надежного индикатора окисления липидов. Так, у семян, которые подвергли
воздействию радиации в дозе 200 Гр, содержание гексаналя было в 1,6 раза выше
(107,2 мкг/100 г семян), чем в контроле (64,6 мкг/100 г семян), но с увеличением дозы содержание гексаналя уменьшалось до 48,6 мкг/100 г – у семян, подвергнутых воздействию радиации в
дозе 600 Гр.
Аналогичное влияние величины дозы облучения на содержание летучих веществ было
найдено для кетонов (2-гептанон, 2-октанон, 3-октен-2-он, 2 нонанон) и спиртов (1-октен-3-ол,
бензиловый спирт, 2-этил-1-гексанол). В контроле и семенах, облучённых в дозе 200 Гр, содержание веществ было близким, но для доз облучения 400 и 600 Гр оно было меньше почти в
2 раза. Содержание низших кислот у облучённых семян было выше, чем в контроле.
Самым многочисленным классом веществ, обнаруженных в исследуемых семенах, были
н-алканы с числом атомов углерода от 8 до 26. Их содержание в контроле и у облучённых семян существенно не различалось.
Таким образом, в механизмах «эффекта свидетеля» у растений ведущее значение имеют
летучие метаболиты, причем не только пострадиационные, но и естественные летучие выделения. Их состав у интактных семян тритикале «Антей» и семян, подвергавшихся воздействию
радиации, существенно различался.
Дистанционные эффекты летучих веществ воздушно-сухих семян сельскохозяйственных
растений не ограничиваются индукцией облучёнными объектами нарушений у необлучённых –
имеет место также и влияние интактных на облучённые семена в виде стимуляции ростовых
показателей у облучённых семян.
В экспериментах на семенах пшеницы «Памяти Федина» установлено, что начальные
ростовые показатели необлучённых семян, проращиваемых с облучёнными в дозе 400 Гр на
раздельном или общем субстрате и в общем воздушном объёме, отличались от таковых у интактных семян (контроль).
Наблюдалась модификация ростовых процессов необлучённых семян, проращиваемых с
облучёнными семенами на раздельном субстрате и в общем воздушном объёме. Она заключалась в снижении длины ростка и зародышевого корешка на седьмые сутки проращивания (таблица 2). Необлучённые семена, проращиваемые с облучёнными семенами на общем субстрате
и в общем воздушном объёме, имели статистически значимо большую длину корешка, чем в
контроле (интактные семена).
Показано, что различались и ростовые показатели у необлучённых семян, проращиваемых с облучёнными семенами на раздельном или общем субстрате и в общем воздушном объёме. Длина ростка и корешка необлучённых семян, проращиваемых с облучёнными семенами
Авторы выражают благодарность за проведение данного анализа Т.А. Мишариной (лаборатория флейвохимии Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, г. Москва).
66
Радиация и риск. 2013. Том 22. № 1
Научные статьи
на общем субстрате и в общем воздушном объёме, оказалась выше, чем у необлучённых семян, проращиваемых с облучёнными семенами на раздельном субстрате, но в общем воздушном объёме (таблица 2).
Далее исследовали влияние совместного проращивания необлучённых семян пшеницы с
облучёнными семенами в дозе 400 Гр на ростовые процессы последних. Облучённые семена,
проращиваемые с необлучёнными семенами на раздельном субстрате и в общем воздушном
объёме, имели сниженную по сравнению с проращиваемыми отдельно облучёнными семенами
(без воздействия необлучённых семян) интенсивность ростовых процессов, оцениваемую по
длине ростка и корешка (таблица 2).
Таблица 2
Начальные ростовые показатели (M±
±m, %) после совместного проращивания
необлучённых и облучённых (400 Гр) семян пшеницы
Длина зародышевого
корешка
Необлучённые семена после совместного проращивания с семенами,
облучёнными в дозе 400 Гр
Контроль
100,0±2,2
100,0±2,8
На раздельных субстратах в общем
81,1±2,2*
87,2±2,5*
воздушном объёме
На общем субстрате в общем воздушном
,
112,6±3,9* **
105,9±3,2**
объёме
Семена, облучённые в дозе 400 Гр после проращивания
с необлучёнными семенами
Раздельное проращивание
24,0±0,9*
35,8±1,6*
На раздельных субстратах в общем
,▲
,▲
18,4±0,6*
26,3±1,1*
воздушном объёме
На общем субстрате в общем воздушном
,■
,■
22,7±0,9*
31,8±1,7*
объёме
Условия проращивания
Длина ростка
Примечания: * – статистически значимое отличие от контроля;
** – статистически значимое отличие от необлучённых семян, проращиваемых на раздельном субстрате и в общем воздушном объёме с облучёнными;
▲
– статистически значимое отличие от облучённых семян, проращиваемых отдельно от необлучённых семян (раздельное проращивание);
■
– статистически значимое отличие от облучённых семян, проращиваемых на раздельном
субстрате и в общем воздушном объёме с необлучёнными.
Сравнение ростовых показателей облучённых семян, проращиваемых с необлучёнными
семенами на общем субстрате и в общем воздушном объёме, и облучённых семян, проращиваемых с необлучёнными семенами на раздельном субстрате и в общем воздушном объёме,
показало повышение интенсивности начального роста, т.е. длины ростка и зародышевого корешка у первых (таблица 2).
Таким образом, облучённые воздушно-сухие семена пшеницы при совместном проращивании с интактными семенами той же культуры способны оказывать взаимное влияние на начальные ростовые показатели этих объектов. Выраженность и направленность влияния зависят
от участия летучих выделений, продуцируемых ими в общую воздушную среду, а также зависят
от выделения продуктов метаболизма в субстрат. Данное явление находит определённые аналогии с дистанционным взаимным влиянием хемосигналов интактных или облучённых животных на их иммунную реактивность.
67
Радиация и риск. 2013. Том 22. № 1
Научные статьи
Заключение
Результаты сравнительного анализа дистанционного влияния интактных лабораторных
мышей на облучённых особей посредством продуцируемых ими естественных летучих выделений, а также влияние необлучённых семян сельскохозяйственных растений на облучённые свидетельствуют о том, что в механизмах «эффекта свидетеля» у этих организмов, принадлежащих к различным биологическим видам, имеются общие закономерности.
Во-первых, в том и другом случаях важное значение имеют естественные летучие метаболиты. Во-вторых, как у семян сельскохозяйственных растений, так и у мышей имеет место
влияние интактных биологических объектов на облучённые «мишени». В-третьих, в радиобиологическом «эффекте свидетеля» облучённый объект и необлучённый модифицируют свойства
друг друга. Этот факт уточняет распространенное представление об однонаправленности
«эффекта свидетеля».
Сказанное позволяет выдвинуть предположение, что «эффект свидетеля» является биологически целесообразной приспособительной реакцией, направленной на повышение жизнеспособности различных видов биологических объектов.
68
Радиация и риск. 2013. Том 22. № 1
Научные статьи
Литература
1.
Еськов Е.К., Левин В.И. Специфичность дистанционного воздействия γ-облучённых семян растений
на необлучённые //Радиац. биол. Радиоэкология. 2002. Т. 42, № 3. С. 302-307.
2.
Левин В.И. Агроэкологические аспекты предпосевной обработки семян сельскохозяйственных культур
гамма-лучами. М.: ВНИИ «Агроэкоинформ», 2000. 221 с.
3.
Суринов Б.П., Духова Н.Н. Аттрактивные для интактных особей пострадиационные летучие выделения мышей //Радиац. биология. Радиоэкология. 2004. Т. 44, № 6. С. 662-665.
4.
Суринов Б.П., Исаева В.Г. Иммуномодулирующие эффекты летучих выделений животных при пострадиационных иммунодефицитных состояниях //Радиац. биология. Радиоэкология. 2008. Т. 48, № 6.
С. 665-670.
5.
Суринов Б.П., Исаева В.Г., Духова Н.Н. Пострадиационные иммуносупрессирующие и аттрактивные
летучие выделения: «эффект соседа (baystander effect)» или аллелопатия в группах животных
//Доклады Академии наук. 2005. Т. 400, № 5. С. 711-713.
6.
Mothersill C., Bucking C., Smith R.W. et al. Communication of radiation induced stress or bystander signals between fish in vivo //Environ. Sci. Technol. 2006. V. 40, N 21. P. 6859-6864.
7.
Nagasawa H., Little J.B. Induction of sister chromatid exchanges by extremely low doses of α-particles.
A defining paper of radiation-induced bystander responses in cellular models //Cancer Res. 1992. V. 52.
P. 6394-6396.
8.
Yum E.H. W., Choi V.W.Y., Nikezic D. et al. Alpha-particle-induced bystander effects between zebrafish
embryosin vivo //Radiation Measurements. 2009. V. 44. P. 1077-1080.
Modification of radiation-induced effects in animals and plants by excreted
volatile substances
Kharlamov V.A., Surinov B.P.
Medical Radiological Research Center of the Russian Ministry of Health, Obninsk
It is proved hat volatile substances excreted into urine of intact mice stimulate immune reactivity of
spleen and regional lymph nodes in mice exposed to radiation at dose of 1 Gy. Seeds of agricultural plants both intact and exposed to radiation are found to be able to reciprocally modify initial
growth parameters through aerial environment and sprouting medium. Modification of radiationinduced effects, common for both animals and plants, is thought to be carried out by the use of
volatile chemosignals released by the species.
Key words: bystander effect, ionizing radiation, mice, seeds of agricultural plants, volatile
substances.
Kharlamov V.A.* – Researcher; Surinov B.P. – Head of Laboratory, D.Sc., Biol. MRRC.
*Contacts: 4 Korolyov str., Obninsk, Kaluga region, Russia, 249036. Tel.: (48439) 9-71-61; e-mail: kharlamof@gmail.com.
69