Oddo S - Биологический факультет МГУ
advertisement
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА ____________________________________________________________________ Факультет Биоинженерии и Биоинформатики и отдел биохимии животной клетки НИИ Физико-Химической Биологии им. А.Н. Белозерского На правах рукописи Сергей Владимирович Стогов УДК 577.152.121 ВЛИЯНИЕ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ И АГРЕГАЦИОННОЕ СОСТОЯНИЕ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ 03.01.04-биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва-2010 Работа выполнена на факультете биоинженерии и биоинформатики Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Муронец Владимир Израилевич доктор химических наук, профессор Изумрудов Владимир Алексеевич Официальные оппоненты: доктор биологических наук, Чеботарѐва Наталья Александровна доктор химических наук, профессор Байков Александр Андреевич Ведущая организация: институт Биоорганической Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН * Химии имени М.М. Защита состоится “__” ____________2010 г. в “___” часов на заседании Диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, ББА. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ. Автореферат разослан__________________________2010 г. Ученый секретарь Диссертационного совета Медведева М.В. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа* катализирующая реакцию окисления глицеральдегид-3-фосфата до 1,3дифосфоглицерата с образованием NADH, наряду с основной гликолитической активностью проявляет многочисленные негликолитические функции. Имеются данные об участии ГАФД в различных процессах посредством взаимодействия с природными полимерами (белками, нуклеиновыми кислотами), в том числе вовлечение ее в процесс белковой агрегации. На наш взгляд, важным представляется изучение белковой агрегации, по той причине, что она лежит в основе ряда патологических процессов. ГАФД в них принимает самое активное участие как благодаря достаточно высокой концентрации, так и способности специфически связываться с определенными биомакромолекулами (например, амилоидогенными белками). В представленной работе для изучения взаимодействия этого фермента с природными заряженными полимерами мы применяли модельный подход, основанный на использовании различных природных и синтетических полиэлектролитов. Помимо изучения роли полианионов в подавлении агрегации белков мы исследовали возможность их использования для разрушения уже сформировавшихся белковых агрегатов. Изучение данного вопроса представляется нам важным в связи с тем, что переход рекомбинантных белков в состав «телец включения» существенно усложняет или даже делает полностью невозможным получение белковых препаратов в ходе биотехнологических процессов, а определенные типы полиэлектролитов могут быть использованы для их разрушения. Важным представляется проведенное исследование и с фундаментальной точки зрения. Оно позволяет лучше понять процессы, протекающие в живых организмах. Ведь как в случае созданных нами систем, так и in vivo в основе взаимодействия макромолекул лежат электростатические и гидрофобные взаимодействия. Такой подход позволяет сблизить науку о полимерах с биологическими науками. Цели исследования. А) Выявление характеристик полианионов, позволяющих им наиболее эффективно предотвращать термоагрегацию ГАФД. Б) Выявление характеристик полианионов, позволяющих им оказывать минимальное воздействие на функциональное состояние и структуру фермента. В) Исследование возможности использования полисульфоанионов для растворения «телец включения», состоящих из зелѐного флуоресцентного белка или сперматозоидной изоформы ГАФД. *Список сокращений: ГАФД – глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, ГАФДс – сперматозоидная изоформа глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, ДС – декстрансульфат натрия, ДСК – дифференциальная сканирующая калориметрия, ПАК – полиакриловая кислота, ПАМС - поли-2-акриламид-2-метил-1пропансульфонат калия, ПАС – полианетолсульфонат натрия, ПВС – поливинилсульфат калия, ПМАК – полиметакриловая кислота, ПСС – полистиролсульфонат натрия, 3-ФГА – 3-фосфоглицериновый альдегид, ЭДТА – этилендиаминтетраацетат, GFP – green fluorescent protein – зелѐный флуоресцентный белок, NAD+ – никотинамидадениндинуклеотид окисленный, NADH – никотинамидадениндинуклеотид восстановленный 3 Научная новизна. В настоящей работе была выявлена группа полиэлектролитов полисульфоанионов, наиболее эффективно предотвращающих термоагрегацию белка. Были выявлены параметры полисульфоанионов, определяющие их эффективность при подавлении термоагрегации. Также при помощи измерения каталитической активности, аналитического ультрацентрифугирования, дифференциальной сканирующей калориметрии, получении спектров кругового дихроизма были изучены параметры полисульфоанионов, определяющие степень их воздействия на ферментативную активность и структуру ГАФД. Таким образом было показано, что наиболее эффективно предотвращают агрегацию и оказывают минимальное воздействие на ферментативную активность и структуру белка гидрофильные высокомолекулярные полисульфоанионы. В этой связи наиболее перспективными соединениями нам представляются сульфатированные полисахариды. Впервые было показано, что наиболее сильное денатурирующее воздействие на белок оказывают короткие гидрофобные заряженные цепи. Также впервые была показана возможность использования полиэлектролитов для разрушения белковых агрегатов. Практическая значимость работы. На основании установленных в нашей работе факторов, определяющих способность полиэлектролитов наиболее эффективно предотвращать белковую агрегацию и при этом оказывать минимальное воздействие на структуру и активность белка, могут быть предложены перспективными соединения (прежде всего сульфатированные полисахариды) для регенерации денатурированных белков. Продемострированная нами возможность разрушения белковых агрегатов при помощи полиэлектролитов, позволяет использовать их для увеличения эффективности биотехнологических процессов, в ходе которых целевой продукт нарабатывается в виде «телец включения». Апробация работы. Результаты работы были доложены на совместном заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ и отдела биохимии животной клетки НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, а также на конференциях «Ломоносов-2007» , «Ломоносов-2008», пятом съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (2008) и на международной конференции «FEBS-2009». Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ (3 статьи и 4 тезиса докладов). Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (244 ссылки) . Объем работы составляет _120 страниц, содержит _29 рисунков и _5_ таблиц. 4 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Методы исследования Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу из скелетных мышц кролика выделяли по методике Хилла (Hill et al., 1975). Белок хранили при 4оС в виде суспензии в полунасыщенном растворе (NH4)2SO4. Рекомбинантная сперматозоидная изоформа глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы была любезно предоставлена Ю.Л. Элькиной. Зелѐный флуоресцентный белок нарабатывали в культуре E.coli BL 21 (DE 3), трансформированная плазмидой pET 21. Индукцию синтеза белка осуществляли при помощи IPTG. Клонирование рекомбинантной сперматозоидной изоформы ГАФД. Клон MGC:26494 со штаммом E.coli, содержавшим плазмиду с кДНК вставкой полной кодирующей последовательности спермоспецифичной глицеральдегид3-фосфатдегидрогеназы человека (ГАФДс) был получен через компанию Geneservice Ltd. Концентрацию белка определяли спектрофотометрическим методом, измеряя оптическую плотность при 280 нм, при этом использовали значение А 2800,1% равное 1 (Kirchenbaum, 1972). Определение активности ГАФД проводили спектрофотометрически по увеличению поглощения NADH при длине волны 340 нм в реакционной среде рН 8,9, содержащей 100 мМ глицин, 100 мМ KH2PO4, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ 3-ФГА и 1 мМ NAD+. Реакцию начинали внесением белка в реакционную среду. Растворы полиэлектролитов готовили на 10 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,5. Концентрацию полианинов в растворе рассчитывали относительно заряженных групп полимера. Кинетику термоагрегации ГАФД измеряли на термостатированном спектрофотометре "SIM Aminco DW – 2000", США. За увеличением количества агрегатов белка следили по увеличению оптического поглощения при 320 нм. В кварцевую кювету вносили 10 мМ калий-фосфатный буфер, рН 7,5, нагревали до 60°С, вносили белок (t = 37°С) в небольшом объѐме до конечной концентрации 0,7 мкМ, быстро перемешивали и записывали увеличение оптического поглощения. При работе с полиэлектролитами препараты полимеров вносили в кювету с буферным раствором до необходимой концентрации, процесс термоагрегации начинали внесением белка. Полученные результаты кинетических кривых агрегации обрабатывали при помощи программного обеспечения “OriginPro 7.5” (MicroCal Inc, США). Относительную гидрофобность мономерных звеньев полисульфоанионов оценивали используя коэффициент гидрофобности Ганша – log P (Hansch and Klein 1986) и рассчитывали с помощью программы ACD Labs. 5 Термоинактивацию ГАФД (концентрацией 0,7 мкМ) проводили в 10 мМ калийфосфатном буфере, рН 7,5, содержащем 0,5 мМ ЭДТА в присутствии различных полианионов при температуре 45 °С. Измерения коэффициента седиментации методом аналитического ультрацентрифугирования проводили при помощи аналитической ультрацентрифуги Beckman Spinco E, оснащѐнной фотоэлектрической сканирующей приставкой. Скорость вращения ротора AnF составляла 56000 об/мин. Оптическую плотность определяли при длине волны 280 нм. В пробах, содержащих 10 мМ фосфатный буфер рН 7,5, концентрация ГАФД составляла 3,5 мкМ, полисульфоанионов – 0,5 мМ. Анализ термодинамических параметров методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) проводили на адиабатическом микрокалориметре "ДАСМ-4" ("Биоприбор", Россия). Измерения проводили при скорости нагрева 1,0 оС/мин в диапазоне температур от 20 до 90оС. Спектры кругового дихроизма получали с помощью спектрополяримертра Chirascan (Applied Photophysics Ltd. UK). Концентрация ГАФД составляла 1,4 мкМ, полисульфоанионов – 200 мкМ. Спектры регистрировали при 25º и 45 ºС с интервалом 5 минут в диапазоне 260 – 180 нм. Электрофорез белков в полиакриламидном геле проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970). РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Влияние полианионов на термоагрегацию ГАФД В данной работе ГАФД была нами использована в качестве модельного белка для изучения влияния полианионов на процесс белковой термоагрегации. Ранее была обнаружена крайне высокая эффективность полистиролсульфоната натрия (ПСС) при подавлении термоагрегации белка (Shalova et al. 2005). Однако оставалось невыясненной причина этого явления: она могла заключаться как в большей гидрофобности данного соединения, так и в наличии сульфогрупп. Для того чтобы установить причину этого явления, было проведено сравнение эффективности подавления белковой термоагрегации различными полисульфоанионами и карбоксилсодержащими полианионами. Структурные формулы их мономерных звеньев представлены на Рис. 1 и 2. За ходом термоагрегации следили следующим образом. Измеряли нарастание оптической плотности растворов, содержащих свободную ГАФД или фермент в смесях с различными полианионами, при 60 ºС при 320 нм. На Рис. 3 представлены типичные кинетические кривые термоагрегации свободного белка (кривая 1) и его же в смесях с ПСС (кривые 2-4). Из них мы видим, что даже при относительно небольшой концентрации полианиона (15 мкМ) уровень агрегации значительно снижается (кривая 2). При дальнейшем увеличении концентрации этот эффект лишь усиливается: при наличии 50 мкМ ПСС в пробе агрегация подавлена практически полностью (кривая 4).Также из кинетических кривых мы видим, что основное нарастание 6 n O n n SO3 - K+ SO3 - Na+ SO3 - Na+ Поливинилсульфат калия, ПВС СН-СН2 O Полистиролсульфонат натрия, ПСС Полианетолсульфонат натрия, ПАС СН2-СН n COOН СН2-СН n COOН SO3 Na+ n HO SO3 - Na+ n HN Полиметакриловая кислота, ПМАК O O SO3 - Na+ Полиакриловая кислота, ПАК Полистиролсульфонат натрия, ПСС SO3 - K+ Поли-2-акриламид-2-метил1-пропансульфонат калия, ПАМС Декстрансульфат натрия, ДС Рис.1 Структурные формулы мономеров полисульфоанионов. Рис.2 Структурные формулы карбоксильных полианионов. оптической плотности происходит в течение первых 2 минут. Для дальнейших расчетов нами бралось значение оптической плотности через 5 минут после начала инкубации. D320 0,4 1 Рисунок 3. Кинетические кривые термоагрегации свободного фермента (1) и смесей ГАФД с ПСС. 0,3 0,2 Концентрация ПСС равнялась: 15 мкМ (2), 20 мкМ (3) и 50 мкМ (4). 10 мМ фосфатный буфер рН 7,5. Температура 60 ºС. Концентрация ГАФД 0,7 мкМ. 2 0,1 3 0,0 4 0 2 4 6 n СН3 8 10 Время, мин Эффективность подавления термоагрегации оценивали следующим образом. Брали значение оптической плотности смеси ГАФД и полиэлектролита через 5 минут после начала инкубации D320. Сравнивали его со значением оптической плотности, которое регистрировали в растворе свободного фермента через 5 минут после начала инкубации D320, ГАФД. Чем ближе отношение D320/D320, ГАФД к нулю, тем эффективнее подавлена агрегация. Если же значение этого отношения близко к 1, значит полианион не оказывает влияния на ход белковой агрегации. На Рис. 4 представлены результаты сравнения эффективности подавления термоагрегации ГАФД рядом полисульфоанионов (кривые 1-6) и карбоксильными полианионами (кривые 7, 8). Мы видим, что при концентрации 0,1 мМ любой из полисульфоанионов полностью подавляет термоагрегацию ГАФД. Для достижения подобного эффекта при помощи карбоксильных полианионов необходимо повысить концентрацию заряженных групп более чем на два порядка. 7 D320/D320, ГАФД 0,6 5 Рисунок 4. Термоагрегация ГАФД в смесях с различными полисульфоанионами (1-6) и карбоксильными полианионами (7, 8): ПВС (1), ДС 1000 кДа (2), ПСС со степенью полимеризации 430 (3), ПАМС (4), ПАС (5), гепарин (6), полиакриловая кислота (7) и полиметакриловая кислота (8). 8 6 2 0,4 1 4 7 3 0,2 Остальные условия те же, что и в подписи к рисунку 3. 0,0 0,01 0,1 1 10 Полианион, мM Крайнее левое положение на графике занимают кривые 1 и 2, отражающие подавление агрегации в присутствии поливинилсульфата калия и декстрансульфата натрия 1000 кДа. Таким образом, наибольшую эффективность показали не гидрофобные, а, напротив, гидрофильные полисульфоанионы. В то время как наиболее гидрофобные ПСС и ПАС (кривые 3 и 5) подавляют агрегацию значительно менее эффективно. Это свидетельствует о том, что наличие сульфогрупп является основным фактором, определяющим эффективность полианиона при подавлении агрегации. На Рис. 5 представлены результаты сравнения эффективности подавления термоагрегации при помощи фракций ДС, отличающихся молекулярной массой. Для оценки эффективности действия полиэлектролита можно использовать значение его концентрации в точке помутнения (отношение D320/D320,ГАФД близко к нулю). В таком случае можно заключить, что ДС с молекулярной массой 1000 кДа (кривая 1) в 4 раза эффективнее ДС с молекулярной массой 100 кДа (кривая 2) и в 10 раз эффективнее ДС с молекулярной массой 5 кДа (кривая 3). D320/D320, ГАФД 2 Рисунок 5. Темоагрегация ГАФД в смесях с ДС различных молекулярных масс: 1000 (1), 100 (2) и 5 кДа (3) после 5 минут инкубации. 0,6 0,4 1 3 Остальные условия те же, что и в подписи к рисунку 3. 0,2 0,0 0,01 0,1 Полианион, мM Схема, представленная на Рис. 6, иллюстрирует зависимость эффективности подавления агрегации от длины цепи полиэлектролита. Как мы видим на правой части рисунка, высокомолекулярный полиэлектролит предотвращает агрегацию максимально эффективно: белок не агрегирует вовсе. При уменьшении длины цепи эффективность подавления агрегации снижается. Это происходит по той причине, что при одной и той же концентрации 8 мономерных звеньев часть коротких цепей остаѐтся свободной. В то время как все длинные цепи входят в состав белок-полиэлектролитных комплексов (Зайцев и др. 1992). При отсутствии полиэлектролита белковые агрегаты образуются значительно быстрее и достигают максимальных размеров. Рисунок 6. Схема, иллюстрирующая влияние полиэлектролитов различной степени полимеризации на белковую термоагрегацию. Влияние полисульфоанионов на структуру и функциональное состояние ГАФД Нами было показано, что полисульфоанионы способны наиболее эффективно предотвращать термоагрегацию ГАФД. Дальнейшей нашей задачей было выявление характеристик полисульфоанионов, позволяющих им оказывать минимальное воздействие на функциональную активность и структуру ГАФД. Для этого мы использовали ряд методов: измерение ферментативной активности, аналитическое ультрацентрифугирование, дифференциальная сканирующая калориметрия, круговой дихроизм. Влияние полисульфоанионов на функциональное состояние ГАФД При изучении влияния полисульфоанионов на ферментативную активность ГАФД мы основное внимание уделяли двум параметрам: относительной гидрофобности мономерного звена и степени полимеризации. Для того чтобы определить влияние относительной гидрофобности мономерного звена на активность фермента мы сравнили действие двух полисульфоанионов: относительного гидрофильного ПВС и относительно гидрофобного ПАС. 9 Как мы видим из Рис. 7А, уже при температуре 25ºС относительно гидрофобный ПАС вызывает инактивацию фермента: за 20 минут инкубации ГАФД теряет более 60% активности (кривая 3). В то время как относительно гидрофильный ПВС не оказывал никакого влияния на активность ГАФД (кривая 2). При более высокой температуре 45 ºС (Рис. 7 Б) ПВС приводил к ускорению термоинактивации фермента (кривая 2), однако в значительно меньшей степени, чем более гидрофобный ПАС (кривая 3). Активность свободного фермента при этом оставалась практически неизменной (кривая 1). Активность, % Активность, % 1,2 100 80 80 60 60 А 1 100 Б 2 40 40 3 20 0 20 0 5 10 15 0 20 Время, мин 3 0 2 4 6 8 10 Время, мин Рисунок 7. Каталитическая активность свободного фермента (1) и ГАФД в смеси с ПВС (2) и ПАС (3) при 25 ºС (А) и 45 ºС (Б). 10 мМ фосфатный буфер рН 7,5. Концентрация ГАФД 0,7 мкМ. Концентрация полисульфоанионов 50 мкМ. Для изучения влияния степени полимеризации полисульфоанионов на активность фермента нами было проведено сравнение воздействия двух фракционированных образцов относительно гидрофильного ДС (с молекулярными массами 5 и 1000 кДа). Ни один из образцов относительно гидрофильного ДС при температуре 25 ºС не оказывал влияния на активность фермента. Поэтому сравнение проводили при 45 ºС. Из Рис. 8 мы видим, что оба образца ДС ускоряли термоинактивацию ГАФД. Однако в присутствии более низкомолекулярного образца фермент терял свою активность быстрее: через 20 минут после начала инкубации разница между двумя образцами полиэлектролитов составила около 25% исходной активности ГАФД. Активность, % 1 100 Рисунок 8. Каталитическая активность свободной ГАФД (1) и ГАФД в смесях с ДС различных молекулярных масс: 1000 (2) и 5 кДа (3). 80 60 Температура 45ºC. Концентрация полисульфоаниона 100 мM. Остальные условия те же, что и в подписи к рисунку 7. 40 2 20 3 0 0 5 10 15 20 Время, мин 10 Таким образом, минимальное воздействие на ферментативную активность ГАФД оказывают относительно гидрофильные высокомолекулярные полисульфоанионы. Влияние полисульфоанионов на четвертичную структуру ГАФД Для того чтобы изучить воздействие полисульфоанионов на четвертичную структуру фермента, мы воспользовались методом аналитического ультрацентрифугирования. Нами было установлено, что комплексообразование с гидрофильными полисульфоанионами не вызывает никаких изменений в четвертичной структуре фермента. В случае низкомолекулярного ДС с молекулярной массой 5 кДа, значение коэффициента седиментации практически совпадало с таковым у свободного фермента: 9,2 S и 9,0 S соответственно. Комплекс ГАФД с высокомолекулярным ДС 103 кДа осаждается несколько быстрее: значение коэффициента седиментации составляет 10,2 S. Примерно с той же скоростью осаждается комплекс фермента с ПВС. Коэффициент седиментации равнялся 10,5 S. Совершенно иная картина наблюдалась при изучении смесей ГАФД с гидрофобным ПСС (Рис. 9, Табл. 1). В левой части рисунка представлены значения коэффициента седиментации свободного ПСС. Образец со степенью полимеризации 31 не осаждался. Для свободного ПСС наблюдается рост значений коэффициента седиментации от 2,35 S до 4,4 S при увеличении степени полимеризации от 77 до 430 (колонка 2 Табл. 1). В центральной части рисунка отображены значения коэффициентов седиментации, определѐнные в смесях ГАФД с ПСС различных степеней полимеризации (колонка 3 в Табл. 1.). Здесь также наблюдается рост значений коэффициента седиментации при увеличении длины цепи ПСС. Следует отметить, что во всех случаях значения коэффициента седиментации, полученные для свободного ПСС, меньше, чем определѐнные в смесях ПСС с ГАФД. Это позволяет сделать вывод о том, что в смесях ГАФД Рисунок 9. Значения коэффициентов седиментации свободного фермента (правая часть), ПСС с различными степенями полимеризации (левая часть) и их смесей (центральная часть). 11 10 мМ фосфатный буфер рН 7,5. Концентрация ГАФД 3,5 мкМ. Концентрация ПСС 0,5 мМ. Таблица 1. Значения коэффициентов седиментации свободного фермента, белокполиэлектролитных комплексов и свободного ПСС. Степень полимеризации 31 77 170 360 430 ПСС ПСС + ГАФД Форма фермента Свободная ГАФД -2,35 S 2,9 S 3,7 S 4,4 S 3,9 S 4,75 S 5,37 S 8,2 S; 10,2 S 8,6 S; 12,8 S мономер димер тетрамер 3,0 S 4,7 S 8,9 S с ПСС белок и полисульфоанион существуют не отдельно, а в составе белокполиэлектролитных комплексов. В смесях с ПСС со степенями полимеризации 31, 77, 170 определяется одно значение коэффициента седиментации. Следовательно, в системе присутствует один вид комплексов. В то же время при значении степени полимеризации 360 и 430 в смесях определяется 2 компонента. Что указывает на существование двух типов комплексов в системе. Значение коэффициента седиментации в смеси ГАФД и ПСС со степенью полимеризации 31 составило 3,9 S. Это больше, чем у мономера ГАФД, но меньше, чем у димера: 3,0 S и 4,7 S соответственно. Это даѐт основания предполагать, что мы имеем дело с комплексом ПСС с мономерной формой фермента. Мы полагаем, что во всех смесях ГАФД с ПСС существуют комплексы с мономерной формой фермента. В случае ПСС со степенями полимеризации 360 и 430 присутствуют комплексы, характеризующиеся более высоким значением коэффициента седиментации. Вероятно, в этих комплексах фермент находится в форме димеров или даже тетрамеров. На четвертичную структуру ГАФД оказывают воздействие лишь гидрофобные полисульфоанионы: они вызывают диссоциацию фермента на субъединицы. Сила этого воздействия увеличивается при уменьшении степени полимеризации полисульфоаниона. Возможные варианты комплексов ГАФД с ПСС представлены на Рис. 10. 12 Рисунок 10. Предполагаемая структура белок-полиэлектролитных комплексов, образующихся в смесях ГАФД с ПСС. Влияние полисульфоанионов на третичную структуру ГАФД Для изучения влияния комплексообразования на третичную структуру фермента мы воспользовались дифференциальной сканирующей калориметрией (ДСК). При этом мы анализировали такие параметры как калориметрическая энтальпия (Hcal), температура, соответствующая максимуму теплопоглощения (Tm) и полуширина пика на кривой теплопоглощения (ΔTm). Сначала мы сравнили воздействие высокомолекулярных полисульфоанионов. Данные ДСК, полученные таким образом (Рис. 11), говорят о сильном изменении термодинамических параметров плавления и, следовательно, изменениях структуры молекулы ГАФД в присутствии полисульфоанионов. Кривые теплопоглощения могут быть разделены на три группы. В первой окажутся кривые, полученные при изучении воздействия гидрофильных полимеров: ПАМС, ДС и гепарина (кривые 2,3,6). Все они характеризуются относительно большой высотой и малой полушириной пиков теплопоглощения. Иными словами, плавление связанной ГАФД происходит кооперативно при сохранении большей части структурных элементов, хотя и при существенно более низкой температуре, чем свободного белка. Весьма сильно от них отличаются кривые теплопоглощения, выделяемые в третью группу: ПСС и ПАС (кривые 5, 7). Пики на них низкие и широкие, что говорит о снижении кооперативности плавления и уменьшении доли упорядоченных структур в молекуле фермента. Промежуточное положение между этими группами занимает ПВС (кривая 4). 13 CP, кДж/моль*К Рисунок 11. Кривые теплопоглощения свободного фермента (1) и ГАФД в смесях с различными полисульфоанионами: ПАМС (2), гепарин (3), ПВС (4), ПСС со степенью полимеризации 430 (5), ДС, 103 кДа (6) и ПАС (7). 1 400 2 6 3 300 200 4 100 5 7 Концентрация полианионов 1 мМ. Остальные условия те же, что и в подписи к рисунку 3. 0 20 30 40 50 60 70 Температура,оС Таким образом, было показано, что с ростом гидрофобности полисульфоаниона возрастает его денатурирующее воздействие. После этого мы исследовали влияние другого параметра: длины цепи. Как уже было известно, длина цепи полиэлектролита – один из ключевых параметров, определяющих эффективность предотвращения агрегации. Однако не было в достаточной степени изучено влияние этого параметра на стабильность белка. На рис. 12 представлены кривые теплопоглощения свободного фермента (кривая 1) и ГАФД в смесях с ДС, различающимися молекулярными массами (кривые 2-4). Как мы видим из представленного графика и таблицы 4, с уменьшением длины цепи значение максимума и полуширина пика на кривой теплопоглощения изменяются крайне незначительно. В то же время высота пика и, соответственно, калориметрическая энтальпия изменятся весьма существенно. При уменьшении молекулярной массы ДС с 1000 до 5 кДа значение калориметрической энтальпии уменьшается почти в два раза. CP, кДж/моль*К 1 400 Рисунок 12. Кривые теплопоглощения свободного фермента (1) и ГАФД в смесях с ДС различных молекулярных масс: 1000 (2), 100 (3) и 5 кДа (4). 2 300 3 4 200 Условия те же, что и в подписи к рисунку 11. 100 0 20 30 40 50 60 70 Температура,оС Таблица 4. Зависимость термодинамических характеристик плавления ГАФД от молекулярной массы связанного с ним ДС. Молекулярная масса, кДа 1000 100 5 ΔНcal 2014,96 1307,24 1022,96 14 Tm, ºС 49,1 48,3 48,3 ΔTm, ºС 5,2 5,1 5,1 Наиболее ярко дестабилизирующее воздействие коротких заряженных цепей проявилось в смесях ГАФД с относительно гидрофобным ПСС (Рис. 13). Связывание с наиболее высокомолекулярным образцом со степенью полимеризации 430 уже приводило к сильной дестабилизации фермента (кривая 2). При снижении степени полимеризации происходило уменьшение значений ΔHcal и Tm. Когда же степень полимеризации ПСС достигла 8 звеньев, максимум на кривой теплопоглощения не был зарегистрирован вовсе – столь значительны были нарушения структуры белка. CP, кДж/моль*К Рисунок 13. Кривые теплопоглощения свободного фермента (1) и ГАФД в смесях с ПСС различных степеней полимериизации: 430 (2), 77 (3) и 31 (4). 1 400 300 200 Условия те же, что и в подписи к рисунку 11. 2 100 4 3 0 20 30 40 50 60 70 Температура,оС Эти данные хорошо согласуются с ранее выявленным сильным денатурирующим воздействием ПСС на ГАФД (Shalova et al. 2005) и лизоцим (Cousin et al. 2005). Есть основания полагать, что повышение денатурирующего воздействия полимера при уменьшении длины его цепи не является отличительной особенностью изучаемой системы, а носит более общий характер. Так ранее были получены интересные результаты при изучении влияния карбоксильных полианионов на термодинамические параметры плавления лизоцимы (Ivinova et al. 2003). Было обнаружено, что в результате уменьшения степени полимеризации полиакрилата калия с 2400 до 70 высота пика на кривой теплопоглощения уменьшилась более чем в два раза. Таким образом, было показано, что с ростом гидрофобности структурных звеньев или уменьшением степени полимеризации полисульфоанионов возрастает и их денатурирующее воздействие. Влияние полисульфоанионов на вторичную структуру ГАФД Для изучения воздействия комплексообразования с различными полисульфоанионами на вторичную структуру фермента мы использовали регистрацию спектров кругового дихроизма. Мы не ставили перед собой задачу соотнести изменения в спектре с перераспределением доли элементов вторичной структуры. Нас интересовало, происходят ли эти изменения и в каких случаях они более выражены. Нами было установлено, что при 25ºС ни один из гидрофильных полисульфоанионов не оказывал сколь либо заметного влияния на спектр кругового дихроизма ГАФД (кривая 2 на Рис. 14). В то время как присутствие 15 относительно гидрофобного ПСС приводило к изменениям спектра кругового дихроизма (кривая 3 на Рис. 14). , град/ М*см Рисунок 14. Спектры кругового дихроизма свободного фермента (1) и ГАФД в смесях с ПВС (2) и ПСС со степенью полимеризации 8 (3). 15000 10000 1 5000 2 10 мМ фосфатный буфер рН 7,5. Температура 25 ºС. Концентрация ГАФД 1,4 мкМ. Концентрация полианионов 200 мкМ. 0 -5000 3 -10000 200 220 240 нм При более высокой температуре (45 ºС) изменения в спектре кругового дихроизма стали более значительны (Рис. 15). К наибольшим изменениям спектра ГАФД (кривая 1) приводило наличие гидрофобного ПСС со степенью полимеризации 8 (кривая 2). , град/ М*см Рисунок 15. Спектры кругового дихроизма свободного фермента (1) и ГАФД в смеси с ПСС со степенью полимеризации 8 (2). 15000 10000 5000 0 1 -5000 -10000 10 мМ фосфатный буфер рН 7,5. Температура 45 ºС. Концентрация ГАФД 1,4 мкМ. Концентрация ПСС 200 мкМ. 2 200 220 240 260 нм Для того чтобы провести сравнение степени воздействия различных полисульфоанионов мы использовали значение эллиптичности при длине волны 222 нм. Минимум, наблюдаемый на спектре при этой длине волны, возникает благодаря α-спиралям. Таким образом, возрастание значения эллиптичности сообщает об уменьшении их доли и дезорганизации структуры белка в целом. Результаты сравнения представлены на Рис. 16. Из него мы видим, что инкубация при 45ºС при полном отсутствии полианионов (кривая 1) вызывает небольшое возрастание эллиптичности. Все без исключения полисульфоанионы в той или иной степени нарушают структуру ГАФД. Гидрофильные ДС (кривые 2 и 3), вне зависимости от своей молекулярной массы, оказывают одинаковое воздействие на фермент, лишь немного увеличивая значение эллиптичности. Наибольшее воздействие на белок оказывает ПСС со степенью полимеризации 8 (кривая 6). Следует 16 , град/ М*см Рисунок 16. Кинетические кривые эллиптичности свободного фермента (1) и ГАФД в смесях с ДС, 5 кДа (2), ДС, 1000 кДа (3), ПВС (4), ПСС со степенью полимеризации 430 (5), ПСС со степенью полимеризации 8 (6). 10 мМ фосфатный буфер рН 7,5. Температура 45 ºС. Концентрация ГАФД 1,4 мкМ. Концентрация полисульфоанионов 200 мкМ. -6000 6 5 4 -7000 2,3 1 -8000 0 5 10 15 20 Время, мин отметить, что в его присутствии значение эллиптичности не изменяется во времени. Несколько меньшее возрастание эллиптичности наблюдали в присутствии ПСС со степенью полимеризации 430. ПВС занимает промежуточное положение: он приводит к значительному возрастанию эллиптичности, однако оно не столь велико, как в случае гидрофобных ПСС. На основании представленных данных можно сделать следующее заключение. С ростом гидрофобности полисульфоаниона возрастает его денатурирующее воздействие. Наибольшие нарушения структуры белка наблюдаются в случае низкомолекулярного ПСС. Изучение возможности использования полисульфоанионов для растворения белковых агрегатов В качестве объектов исследования нами были выбраны «тельца включения», состоящие из зелѐного флуоресцентного белка (GFP) или рекомбинантной спермоспецифической ГАФД (ГАФДс). Следует отметить, что в литературе имеются данные о разрушении белковых агрегатов при помощи хаотропных агентов (мочевина, гуанидингидрохлорид) и/или детергентов (SDS). Однако нами не было найдено упоминаний об использовании для этой цели полиэлектролитов. Сначала нами было проведено разрушение агрегатов GFP («телец включения» выделенных из клеток продуцентов этого белка) при помощи полисульфоанионов. Было показано, что инкубация «телец включения» с полисульфоанионами приводит к их частичному растворению. За переходом белка GFP в раствор можно следить по изменению его спектральных характеристик. Так было показано, что характерное для белков поглощение при 280 нм в растворе возрастает. Однако появления характерной для GFP флуоресценции в зеленой области спектра обнаружно не было. Мы предположили, что отсутствие флуоресценции может быть обусловлено ее тушением или денатурацией белка при связывании с полианиоми. Полученные результаты были подтверждены при помощи динамического лазерного светорассеяния. Как мы видим из рис. 17, большинство исходных белковых агрегатов имеет гидродинамический диаметр около 600 нм. Наличие в пробе 0,2 17 мМ поливинилсульфата калия (ПВС) приводит к тому, что уменьшается доля крупных белковых агрегатов и появляются частицы диаметром 19 нм. Дальнейшее увеличение концентрации ПВС приводит к тому, что крупные агрегаты практически исчезают. Основная масса частиц имеет гидродинамический диаметр около 14 нм. Сам же ПВС в растворе образует частицы диаметром всего 9 нм. Это позволяет предположить, что образующиеся в ходе растворения частицы диаметром около 14 нм представляют собой белокполиэлектролитные комплексы. 20 А 600 нм 15 10 5 0 10 100 1000 10000 20 Б Рисунок 17. Гидродинамический диаметр частиц, определѐнный для телец включения GFP при различных концентрациях ПВС, мМ: 0 (А), 0,2 (Б), 0,3 (В) и 1,0 (Г) и свободного ПВС (Д). 15 19 нм 10 800 нм 5 Объемная доля, % 0 В Г 10 100 1000 10000 10 100 1000 10000 100 1000 10000 100 1000 10000 20 15 10 5 0 10 мМ фосфатный буфер рН 7,5. Температура 25ºС. Концентрация GFP 0,28 мкМ. 20 15 14 нм 10 5 0 Д 10 20 15 9 нм 10 5 0 10 Размер Также возможность растворения «телец включения» при помощи полисульфоанионов была показана на другом объекте: рекомбинантной сперматозоидной изоформе ГАФД (ГАФДс). Особенностью данного фермента является наличие гидрофобного участка, богатого остатками пролина. Это приводит к тому, что в клетках E. coli этот белок практически полностью находится в нерастворимом состоянии в виде «телец включения». Для изучения растворения этого типа «телец включения» кроме описанных выше спектральных методов мы использовали электрофоретический анализ и определение ферментативной активности. Было показано, что также как и в случае белка GFP, «тельца включения» содержащие ГАФДс могут быть переведены в растворимое состояние с помощью полисульфоанионов. Однако, обнаружить ферментативную активность в растворенных форм ГАФДс на не удалось. Был также проведен анализ растворенных препаратов ГАФДс с помощью электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия. Для проведения этих экспериментов мы смешивали равные объѐмы суспензии «телец включения» с ГАФДс и 100 мМ полисульфоаниона поливинилсульфата калия (ПВС) и инкубировали 30 минут. Затем нерастворимые белки отделяли 18 центрифугированием (15 мин при 5000 g). Из полученного таким образом супернатанта отбирали пробы для электрофоретического разделения. Результаты представлены на Рис. 18. Рисунок 18. Электрофореграмма супернатантов после инкубации ГАФДс (1) с ПВС (2). Дорожка 1 – белки-маркѐры (слева указаны их молекулярные массы). Дорожка 2 – супернатант после инкубации ГАФДс с ПВС. Дорожка 3 – супернатант после инкубации ГАФДс без ПВС. Как видно из прведенных данных, в отсутствии ПВС в пробе (дорожка 3) весь белок остаѐтся в нерастворимом состоянии. В то же время, совместная инкубация с ПВС приводит к тому, что существенная часть белка переходит в растворимое состояние (дорожка 2). При этом в раствор переходит белок с молекулярной массой, соответствующей ГАФДс (около 40 кДа), а также минорные компоненты с более низкой молекулярной массой (возможно, продукты протеолиза ГАФДс). Таким образом, нами было показано, что полисульфоанионы могут быть использованы для переведения в растворимое состояние белков, содержащихся в «тельцах включения». Растворенные белки в виде комплексов с полимерами могут быть использованы для решения ряда задач, прежде всего при их применении в качестве антигенов для получения антител. Однако получение таких растворенных белков в функционально активном состоянии требует индивидуального подбора условий для их правильного сворачивания. 19 ВЫВОДЫ 1. Показано, что полисульфоанионы (синтетические, природные и модифицированные природные) наиболее эффективно предотвращают термоагрегацию ГАФД, при этом основную роль в их действии играет сильное электростатическое связывание, обусловленное наличием сульфогрупп. 2. Показано, что эффективность защитного действия полисульфоанионов от термоагрегации увеличивается при повышении степени их полимеризации и относительной гидрофильности. 3. Показано, что полисульфоанионы, способные подавлять термоагрегацию и оказывать при этом минимальное денатурирующее воздействие на белок, должны обладать высокой степенью полимеризации и относительной гидрофильностью. 4. Обнаружено, что наиболее сильное денатурирующие действие на олигомерный белок глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу оказывают короткие гидрофобные полисульфоанионы, а также нефракционированные образцы сульфоанионов. 5. Показано, что полисульфоанионы могут быть использованы для растворения телец включения, состоящих из зелѐного флуоресцентного белка или глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Yu.L. Elkina, M.L. Kuravsky, M.A. El'darov, S.V. Stogov, V.I. Muronetz, E.V. Schmalhausen (2010) Recombinant Human Sperm-Specific Glyceraldehyde-3Phosphate Dehydrogenase: Structural Basis for Enhanced Stability. Biochim. Biophys. Acta, DOI:10.1016/j.bbapap.2010.09.002. 2. С.В. Стогов, В.А. Изумрудов, В.И. Муронец (2010) Изменение структуры белка определяется гидрофобностью и длиной цепи связанного с ним полиэлектролита. Биохимия. 75(4), с. 437 – 442. 3. С.В. Стогов, В.И. Муронец, В.А. Изумрудов (2009) Короткие синтетические полиэлектролиты наиболее эффективно дестабилизируют белки. Доклады Академии наук. 427(2), с. 265-269. 4. S. Stogov, V. Muronetz, V. Izumrudov (2009) Synthetic polyelectrolytes as a tool for artificial chaperons creation. FEBS Journal (Suplement) 276(1), p. 166-167. 5. В.И.Муронец, А.П. Плетень, И.Н. Налетова, Г.Г. Киселев, С.В. Стогов, Е.В. Шмальгаузен (2008) Активаторы системы шаперонов как средства профилактики и лечения нейродегенеративных заболеваний амилоидной природы. Материалы пятого съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, с. 239-240. 20 6. C.В. Стогов (2008) Введение гидроксильных групп в поли-N-этил-4винилпиридиниевый катион как способ повышения эффективности подавления термоагрегации белков синтетическими полиэлектролитами. XV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», Секция Биологии, Подсекция Биохимии, Москва, с. 46-47. 7. С.В. Стогов (2007) Влияние сополимера N,N-диметилакриламида и Nакрилоил-m-аминофенилборной кислоты на активность и термоагрегацию ГАФД из скелетных мышц кролика. Тезисы докладов XIV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007» Секция Биологии, Подсекция Биохимии, Москва, с. 39-40. 21
