Гончарова Н.Н. - Московский государственный медико

На правах рукописи
УДК: (618.177+616.697)-07-08
Гончарова Наталья Николаевна
Комплексная клиническая, медико-генетическая диагностика и
терапия бесплодия в супружеской паре
14.01.01 – Акушерство и гинекология (медицинские науки)
03.02.07 – Генетика (медицинские науки)
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва – 2013
1
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном
учреждении высшего профессионального образования «Московский
государственный медико-стоматологический университет
имени А.И.
Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ
ВПО МГМСУ имени А.И. Евдокимова Минздрава России), в Федеральном
государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный
центр» Российской академии медицинских наук (ФГБУ «МГНЦ» РАМН)
Научные руководители:
Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор
Адамян Лейла Владимировна
Доктор биологических наук, профессор
Курило Любовь Федоровна
Официальные оппоненты:
Акуленко Лариса Вениаминовна - доктор медицинских наук, профессор
(ГБОУ ВПО МГМСУ имени А.И. Евдокимова Минздрава России,
заведующая кафедрой медицинской генетики)
Андреева Елена Николаевна - доктор медицинских наук (ФГБУ
«Эндокринологический научный центр» Министерства здравоохранения
Российской Федерации, заведующая отделением эндокринной гинекологии)
Ведущее учреждение:
Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Московской
области «Московский областной научно-исследовательский институт
акушерства и гинекологии» (ГБУЗ МО МОНИАГ)
Защита состоится «____» ___________ 2013 г. в ___ часов на заседании
диссертационного совета Д 208.041.06, созданного на базе ГБОУ ВПО
МГМСУ имени А.И. Евдокимова Минздрава России по адресу: 127473,
Москва, ул. Делегатская д. 20 стр.1
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского
государственного медико-стоматологического университета имени А.И.
Евдокимова (127206, г. Москва, ул. Вучетича, д. 10а)
Автореферат разослан _____ ________________2013 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор медицинских наук
Пономарева Юлия Николаевна
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы
Бесплодие в браке - одна из наиболее важных и сложных медицинских,
социально-демографических и экономических проблем. Частота бесплодных
браков во многих странах мира колеблется от 8 до 29%. В Европе
бесплодием страдают около 10% супружеских пар, в США – 15%, в Канаде –
17%, доля бесплодных браков на территории России варьирует от 8 до 17,5%
(Глинкина Ж.И., 2005; Корнеева И.Е., 2010). Бесплодие как социальная
проблема часто является причиной потери интереса к жизни, работе,
развития тяжелых психосексуальных и эмоциональных расстройств.
Причиной бесплодного брака в 40-50% случаев является патология
репродуктивной системы у одного из супругов, реже – в 25-30% у обоих
(Фролова О.Г., 2004).
Существует
несколько
классификаций
женского
и
мужского
бесплодия, но в них недостаточно учтены возможности сочетания
нескольких факторов бесплодия и выделения ведущих из них для разработки
тактики лечения супружеской пары.
Стандартизированная программа ВОЗ (1997) по обследованию и
лечению
супружеских
пар
с
бесплодием
содержит
полный
набор
клинических и диагностических тестов, в ней выделен 21 фактор женского и
19 факторов мужского бесплодия.
По данным В.И. Кулакова и соавт.
(2005), обобщение причин
женского и мужского бесплодия даёт возможность определить структуру
бесплодного
брака,
которая
в
основном
складывается
из
трубно-
перитонеального (40-50%), эндокринного бесплодия (20-30%), мужского
бесплодия (30-40%). Другие авторы приводят следующие данные: в
супружеской паре в 40-70% случаев бесплодие определяется состоянием
жены, в 20-25% - состоянием мужа, у 10-40% пар встречаются сочетанные
формы, а у 2-5% бесплодных пар причина бесплодия остаётся неясной
(Фалеев К.П., 2005).
3
Среди клинико-патогенетических вариантов женского бесплодия
выделяют:
функциональное,
трубное,
обусловленное
хроническим
воспалением внутренних половых органов, гиперпластическими процессами
эндометрия, миомой матки, генитальным эндометриозом, перитонеальное,
иммунологическое, сочетанные формы и бесплодие неясного генеза
(Сметник В.П., Тумилович Л.Г., 2000; Кулаков В.И., 2000).
По данным Международного Конгресса по андрологии (2009) в основе
патогенеза бесплодия у большинства мужчин лежит снижение показателей
сперматогенеза, что часто сопровождается олигозооспермией (снижение
концентрации сперматозоидов в эякуляте) и астенозооспермией (снижение
подвижности сперматозоида). Разнообразные патологические процессы в
организме, оказывающие отрицательное воздействие на половые железы,
приводят к дистрофическим изменениям в семенных канальцах яичка,
нарушая сперматогенез, что в свою очередь приводит к бесплодию.
Современная диагностическая и лечебная помощь при бесплодии
опирается на основополагающие достижения в области репродукции, к
которым относятся: расшифровка механизмов гормональной и генетической
регуляции
репродуктивного
процесса,
ультразвуковая
диагностика,
эндоскопическая хирургия, а также вспомогательные репродуктивные
технологии (Адамян Л.В., Андреева Е.Н., 2006). Тем не менее, в 8-10%
случаев установить причину бесплодия не представляется возможным, что
связано с большим числом разнообразных факторов, влияющих на
репродуктивный процесс (Глинкина Ж.И., 2005; Черных В.Б.; 2007, Курило
Л.Ф., 2009). По данным некоторых авторов, на долю идиопатического
бесплодия у мужчин
приходится до 30% случаев. Такие случаи
идиопатического бесплодия связывают с ещё недостаточно изученными
генетическими аспектами регуляции сперматогенеза (Shi Y.C. et al., 2010).
Определённая доля случаев может относиться к генетически обусловленной
патологии мейоза, нарушению дифференцировки и созревания сперматид в
зрелую половую клетку и др. Но при использовании в диагностике
4
молекулярно-генетических,
молекулярно-цитогенетических,
электронно-
микроскопических методов, частота выявления нарушений репродуктивной
функции генетической природы значительно возрастает (Курило Л.Ф. и др.,
2009-2011).
Цель исследования
Оптимизировать схемы комплексного клинического и медикогенетического обследования и лечения супружеских пар с бесплодием,
определить структуру и роль генетических нарушений при бесплодии.
Задачи исследования
1.
Изучить клинико-патогенетические факторы и структуру бесплодия
при различных формах бесплодного брака.
2.
Выявить структуру генетических нарушений в бесплодном браке.
3.
Определить роль генетических нарушений в патогенезе бесплодия.
4.
Оценить эффективность комплексного (клинического и медико-
генетического) обследования и лечения с использованием ВРТ супружеских
пар с бесплодием, в том числе при наличии генетической патологии.
5.
Оценить влияние различных факторов на наступление и сохранение
беременности при лечении бесплодия с использованием ВРТ.
Научная новизна
Впервые на большой выборке пациентов с бесплодием выявлена
структура и частота пациентов с генетической патологией репродуктивной
системы,
определены
соотношения
различных
форм
генетических
заболеваний репродуктивной системы среди женщин и мужчин.
Впервые уточнена частота и структура патологии репродуктивной
системы у супругов с сочетанным бесплодием.
Разработаны
схемы
комплексного
клинического
и
медико-
генетического обследования и лечения супружеских пар с бесплодием при
различных формах бесплодного брака.
5
Практическая значимость
Результаты проведённой работы показывают, что использование
доступных диагностических методов позволяет в настоящее время при
выполнении
хромосомного
анализа
(по
лимфоцитам),
анализа
на
микроделеции в локусе AZF Y-хромосомы, выявлении мутаций в гене CFTR
и увеличения длины СAG повтора в гене AR примерно в 10% установить
генетическую природу нарушений функции репродуктивной системы при
женском, мужском и сочетанном бесплодии.
Продемонстрирована
клинического
и
высокая
эффективность
медико-генетического
обследования
комплексного
пациентов
с
бесплодием.
Полученные данные использованы для разработки схем обследования и
лечения супружеских пар с различными, в том числе с сочетанными,
формами бесплодия.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Цитогенетический (хромосомный) анализ по лимфоцитам периферической
крови является одним из первых тестов (на наличие/отсутствие числовых или
структурных ХА) при медико-генетическом обследовании обоих супругов.
2.
Проведение
молекулярно-генетического
обследования
на
наличие
микроделеций в AZF-локусе Y-хромосомы, мутаций в гене муковисцидоза
(CFTR) или гене андрогеновых рецепторов (AR) позволяет выявить
определенное число генетических заболеваний среди мужчин с бесплодием.
3. В структуре бесплодного брака генетические факторы составляют более
10% среди причин бесплодия и представлены хромосомными мутациями
(числовыми или структурными), генными мутациями или микроделециями
Y-хромосомы.
4. Результаты медико-генетического
консультирования и обследования
необходимо учитывать при выборе метода преодоления бесплодия с целью
снижения риска передачи потомству генетических нарушений от родителей.
6
Внедрение в практику
Методы,
использованные
в
данном
исследовании,
полученные
результаты внедрены в лечебный процесс и применяются на клинических
базах кафедры репродуктивной медицины и хирургии ФПДО МГМСУ им.
А.И. Евдокимова Минздрава России, в лаборатории генетики нарушений
репродукции ФГБУ МГНЦ РАМН.
Апробация диссертации
Результаты
работы
были
представлены
на
XXIV
и
XXV
Международных конгрессах с курсом эндоскопии «Новые технологии в
диагностике и лечении гинекологических заболеваний» (Москва, 2011-2012),
на Первом национальном форуме «Репродуктивное здоровье как фактор
демографической стабилизации» (Ростов-на-Дону, 2012).
Основные положения диссертации были доложены на Итоговых
конференциях молодых ученых МГМСУ (Москва, 2011-2012).
Апробация диссертации проведена 20 сентября 2012 г. (протокол № 8)
на совместном заседании кафедр репродуктивной медицины и хирургии
ФПДО, акушерства и гинекологии лечебного факультета МГМСУ им. А.И.
Евдокимова Минздрава России и сотрудников лаборатории генетики
нарушений репродукции ФГБУ МГНЦ РАМН.
Объем и структура работы
Объем научной работы составляет 110 страниц печатного текста.
Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и
методов исследования, главы результатов собственных исследований и их
обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка
использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 18
таблицами и 11 рисунками. Список литературы включает 156 наименований,
в том числе 91 на русском и 65 на иностранных языках.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 2
статьи в медицинских изданиях, рекомендуемых ВАК Минобрнауки РФ.
7
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
В исследование включено 628 человек - 314 супружеских пар с
бесплодием, которые проходили обследование и/или лечение на клинических
базах кафедры репродуктивной медицины и хирургии ФПДО МГМСУ им.
А.И. Евдокимова Минздрава России, в ФБУ МГНЦ РАМН.
Критерии включения: супружеские пары с мужским или женским
бесплодием, супружеские пары с сочетанным бесплодием.
Критерии исключения: злокачественные новообразования; тяжелая
экстрагенитальная патология; наличие психических заболеваний.
Всем
пациентам
был
проведен
цитогенетический
анализ
по
лимфоцитам периферической крови, культивируемым в условиях in vitro, в
соответствии со стандартной методикой. На основании проведенного
исследования выявлена частота и характер нарушений кариотипа в
супружеских парах с бесплодием.
Из общей группы супружеских пар, прошедших цитогенетическое
обследование, была выделена 161 супружеская пара с сочетанным или
мужским фактором бесплодия, которые были обследованы и прошли лечение
бесплодия с применением вспомогательных репродуктивных технологий.
Ретроспективно были проанализированы истории болезни данной выборки.
Эти супружеские пары были разделены на 2 группы по исходам
лечения бесплодия: группа 1 – беременность наступила и длилась более
12 недель (68 супружеских пар), группа 2 – беременность не наступила или
прервалась до 12 недель беременности (93 супружеские пары).
В родословной обследуемых отсутствовали случаи кровнородственных
браков, случаи рождения детей с умственной отсталостью, хромосомной
аномалией или врождёнными пороками развития.
Средний возраст мужчин составил 35,3±6,6 лет, средний возраст
женщин – 32,1±5,7 года.
8
Продолжительность бесплодия в браке - 5,3±3,8 года (от 1 до 20 лет).
Доля пациентов с первичным бесплодием составила 71,2% (мужчин – 71%,
женщин – 71,3%), с вторичным - 28,8% (мужчин – 29%, женщин – 28,6%).
Комплексное
общепринятой
клиническое
схеме.
обследование
Диагностика
женщин
инфекционного
проводили
статуса
по
включала
следующие этапы: исключение инфекций, входящих в TORCH-комплекс,
микроскопию вагинального мазка, окрашенного по Грамму, посев вагинального
отделяемого для выявления и оценки факультативно-анаэробной группы
микроорганизмов, ПЦР-диагностику на 12 основных ИППП. Функциональное
состояние гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы оценивали по уровню
гипофизарных (ФСГ, ЛГ, Прл) и половых стероидных гормонов (Е2,
прогестерон, тестостерон) в плазме крови. Гистеросальпингографию проводили
для оценки состояния полости матки и маточных труб. Проводили УЗИ органов
малого таза.
Клиническое обследование мужчин проводили андрологи. Изучали
клинико-анамнестические данные, сексуальную и эякуляторную функцию,
проводили оценку общефизического развития и урогенитальное обследование.
Лабораторное обследование включало двукратный анализ спермы, выявление инфекций, передающихся половым путем, бактериологический анализ
спермы, определение антиспермальных антител, УЗИ органов малого таза,
оценку гормонального статуса.
Цитогенетическое исcледование проводили на препаратах метафазных
хромосом, которые получали из лимфоцитов периферической крови,
культивируемых в условиях in vitro, в cоответствии со cтандартной
процедурой (Hungerford, 1965). В каждом случае анализировали не менее 11
метафазных
пластинок.
Результаты
цитогенетичеcкого
исследования
приведены согласно Международной сиcтеме номенклатуры цитогенетики
человека (ISCN, 2005).
При проведении спермиологического анализа оценивали количество,
цвет, консистенцию, pH, количество сперматозоидов в 1 мл и их общее
9
количество в эякуляте, степень подвижности, наличие незрелых половых
клеток,
их
состав
по
стадиям
развития,
патологические
формы
сперматозоидов. По результатам спермиологического анализа пациентов
относили к одной из шести групп, по рекомендации ВОЗ (WHO, 1992,1999).
Количественный кариологический анализ состава незрелых половых
клеток (ККА НПК) из эякулята по стадиям их развития проводили по методу,
предложенному проф. Л.Ф.Курило (патент на изобретение №2328736, 2007)
и принятому в лаборатории генетики нарушений репродукции ФГБУ МГИЦ
РАМН (Курило Л.Ф. и соавт., 1993, 1995, 1997). Анализ включает в себя
дифференцирование клеток сперматогенного эпителия по стадиям развития:
сперматогонии (общий пул), сперматоциты I на предпахитенных стадиях
(прелептотена, лептотена, зиготена), стадиях пахитены, диплотены, метафазы
I мейоза, метафазы II мейоза, сперматоциты I и II порядка, сперматиды
(общий пул), сперматозоиды. Среди общего числа подсчитанных клеток
определяли долю НПК в процентах, за исключением сперматозоидов
(Курило Л.Ф. и соавт., 1993, 1995, 1997).
Молекулярно-генетическое исследование проводили методом ПЦР на
программируемом
термоциклере
МС2
("ДНК-технология",
Россия)
с
использованием ДНК-полимераз Теrmus aquaticus и Biotaq. Для поиска
делеций локуса AZF применяли методику мультиплексной ПЦР, в основе
которой
лежит
принцип
одновременной
амплификации
нескольких
фрагментов ДНК. Набор праймеров позволял исследовать девять маркеров
У-хромосомы: SRY; ZFX/ZFY; sY84, SY86, SY615 (AZFa-регион); sY127,
sY134 (AZFb-регион), sY254 и sY255 (AZFc-регион).
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью
пакета прикладных программ Statistica 6.0. Статистический анализ данных
включал оценку формы распределения признака по критериям КолмогороваСмирнова. Поскольку распределение признаков отличалось от нормального,
были использованы непараметрические методы: критерий Манна–Уитни для
оценки межгрупповых различий, ранговая корреляция Спирмена для оценки
10
силы связи между изучаемыми факторами. Оценка влияния разных факторов
на
успех
наступления
беременности
была
проведена
с
помощью
многофакторного регрессионного анализа.
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты цитогенетического обследования супружеских пар
Проведено исследование кариотипа в культивированных лимфоцитах
крови у 314 супружеских пар. Обнаружено, что у 301 супружеской пары
нормальный кариотип (у женщин – 46,ХХ, у мужчин – 46, ХY). У остальных
13 супружеских пар один из супругов имел изменения в кариотипе
(6 женщин и 7 мужчин). Эти супружеские пары в 9 случаях страдали
первичным бесплодием, в 4 случаях – вторичным бесплодием.
Согласно рекомендациям Американского общества репродуктивной
медицины (ASRM), касающихся возраста женщин, состоящих в бесплодном
браке, и их способности к зачатию, оценивая результаты цитогенетического
исследования, мы разделили женщин и мужчин на следующие возрастные
категории: ≤25 лет, 26-34 года, 35-39 лет, 40-44 года, ≥45 лет.
При
анализе данных
кариотипа женщин
обнаружено
наличие
хромосомных изменений в комплексе половых хромосом у женщин с
первичным
бесплодием
в
возрастных
категориях
26-34
года
(mos 46,ХХ/47,ХХХ) и 40-44 года (mos 46,XX/45,X).
Хромосомные перестройки аутосом были представлены в одном
наблюдении инверсией у женщины с первичным бесплодием в возрастной
категории 26-34 года (46,ХХ,inv(9)(p12p24)) и в трех наблюдениях
транслокациями у женщин с вторичным бесплодием: 2 случая в возрастной
категории
35-39
46,ХХ,t(2;7)(q37;q22))
лет
и
(кариотипы:
1
случай
46,ХХ,t(13;16)(q34;q21);
в
возрастной
категории
40-44 года (46,ХХ,t(3;4)(q21;q34)).
При
анализе
данных
кариотипа
мужчин
обнаружено
наличие
хромосомных изменений в комплексе половых хромосом у мужчин с
первичным
бесплодием
в
следующих
11
возрастных
категориях:
26-34 года (47,ХХY), 35-39 лет (46,X,del(Y)(q11.2) и mos 46,ХY/47,ХХY),
40-44 года (46,Х,-Y,der(22)t(Y;22)).
Хромосомные перестройки аутосом были представлены инверсией у
одного мужчины с первичным бесплодием в возрастной категории
40-44 года (46,ХY,inv(7)(p22q21)) и у одного мужчины с вторичным
бесплодием в возрастной категории 35-39 лет (46,ХY,inv(7)(p11q11)).
Хромосомных изменений у женщин и мужчин младше 25 и у женщин
старше 45 лет обнаружено не было.
Анализ полученных данных позволил выявить, что среди женщин
нормальный кариотип имели 96,5% пациенток, в том числе 1,6% имели
хромосомные варианты (полиморфные варианты хромосом человека),
рассматриваемые
как вариант нормы. Хромосомные аномалии были
выявлены у 1,9% женщин: 0,6% - числовые ХА, 1,3% - структурные ХА.
Структурные ХА преимущественно встречались у женщин с вторичным
бесплодием, среди них преобладали транслокации. Числовые ХА были
выявлены только у женщин с первичным бесплодием и представлены
мозаичной формой моносомии хромосомы Х (mos 46,ХХ/45,Х), мозаичной
формой синдрома трипло-Х (mos 46,ХХ/47,ХХХ).
Среди мужчин хромосомные аномалии были выявлены у 2,2%:
0,6% - числовые ХА, 1,6% - структурные ХА. Нормальный кариотип имели
95,6% пациентов, в том числе 2,2% имели хромосомные варианты.
Сопоставление данных цитогенентического и спермиологического анализов
у мужчин позволило выявить наличие нарушений спермограммы различного
характера у всех пациентов с числовыми хромосомными аномалиями и у
всех пациентов с хромосомными вариантами.
Хромосомные варианты изучали как у мужчин, так и у женщин. Они
были выявлены у 12 человек (у 7 (2,2%) мужчин и у 5 (1,6%) женщин).
Общим для всех обследуемых лиц явилось обнаружение высокой частоты
варианта хромосомы 21 у женщин - 1,28% и изменение размеров
гетерохромотина Y хромосомы у мужчин – 0,94%. Среди женщин
12
хромосомные варианты были обнаружены как у женщин с первичным, так и
с вторичным бесплодием, среди мужчин преобладали пациенты с первичным
бесплодием. Присутствие в кариотипе нескольких хромосомных вариантов
одновременно выявлено не было. В настоящее время продолжаются попытки
определить влияние тех или иных вариантов хромосом на фенотипические
или клинические особенности их носителей, но вопрос о функциональном
значении хромосомного полиморфизма по-прежнему далек от своего
разрешения (Назаренко С.А., 1993; Баранов В.С., Кузнецова Т.В., 2007).
Частота встречаемости хромосомного полиморфизма у пациентов с
бесплодием может достигать 30%, что превышает общепопуляционную
частоту (4%) (Петрищев В.С., Кодылева Т.А., 2012).
Таким образом, при цитогенетическом обследовании нами было
выявлено, что в структуре генетических нарушений у мужчин и женщин с
бесплодием преобладают структурные хромосомные аномалии, которые
составили 1,4% от общего числа обследованных (628 человек).
Данные
нарушения в равной степени встречались у лиц как с первичным, так и с
вторичным бесплодием. Числовые хромосомные аномалии были выявлены в
0,6% случаев и только у пациентов с первичным бесплодием, в равном
количестве
у
мужчин
и
женщин.
По
данным
литературы,
при
цитогенетическом обследовании супружеских пар с бесплодием выявляется
5-10% численных и структурных хромосомных аномалий, что зависит от
количества и выборки пациентов.
Микроделеции Y-хромосомы у мужчин
После
цитогенетического
обследования
100
мужчинам
с
идиопатическим характером нарушения сперматогенеза был проведен анализ
микроделеций в локусе AZF. Возраст обследованных пациентов варьировал
от 26 до 50 лет. Длительность бесплодия в браке составила от 1 до 20 лет.
У ряда мужчин в анамнезе были неудавшиеся попытки ЭКО, в том числе
ИКСИ.
13
Делеции локуса AZF были обнаружены у 6 (6%) мужчин, все эти
мужчины по заключению спермиологического анализа имели азооспермию.
Наиболее часто делеции AZF локализовались в AZFс-регионе – 66,7%
случаев. Yq делеции, захватывающие регионы AZFb+с были обнаружены в
16,6% случаев, также как и делеции региона AZFа.
Пятеро из обследованных мужчин имели нормальный кариотип
(46,XY), у одного была выявлена делеция длинного плеча Y-хромосомы
(46, Х, del(Y)(q11.2)). Точки разрыва в этом случае были локализованы
между регионами AZFa и AZFb, поэтому делеция полностью захватывала
регионы AZFb и AZFс.
Таким
образом,
благодаря
дополнительному
молекулярно-
генетическому обследованию 100 мужчин с идиопатическим бесплодием, на
выявление микроделеций в локусе AZF Y-хромосомы, у 6% нам удалось
выявить
генетическую
субрегионов
с
причину
локализацией
нарушения
определенных
сперматогенеза
генов,
(делеция
контролирующих
сперматогенез), следствием которого и явилось бесплодие.
Данные количественного кариологического анализа состава
незрелых половых клеток (ККА НПК) из эякулята пациентов с
азооспермией
Всем пациентам с азооспермией, у которых были выявлены делеции
локуса AZF Y-хромосомы, был проведен количественный кариологический
анализ состава незрелых половых клеток из эякулята по стадиям их развития.
Проведение ККА НПК позволило обнаружить у одного мужчины с
азооспермией и микроделецией AZFс блок сперматогенеза на допахитенной
стадии (блок на стадиях прелептотены-зиготены), что явилось причиной
отсутствия нормальных сперматозоидов у данного пациента (все выявленные
у него сперматозоиды были атипичными). А также мы обнаружили
увеличение количества незрелых половых клеток в эякуляте пациента с
аномалией кариотипа (46, Х, del(Y)(q11.2)) и у двух пациентов с делецией в
локусе AZFс. По данным литературы в эякуляте пациентов с аномальным
14
кариотипом доля незрелых половых клеток варьирует от 11,3 до 100%,
что многократно превышает контрольные значения (1,5%). Увеличение
незрелых форм половых клеток происходит на фоне массовой гибели клеток,
особенно ярко это выражено при численных и структурных аномалиях
половых хромосом, включая микроделеции в локусе AZF (Федорова И.Д.,
2004; Баранов В.С., Кузнецова Т.В., 2007).
Клиническая характеристика пар с бесплодием, прошедших
лечение с применением вспомогательных репродуктивных технологий
Проведен ретроспективный анализ историй болезни 161 супружеской
пары с сочетанным и мужским бесплодием, которые были обследованы и
прошли лечение бесплодия с применением ВРТ.
Большинство супружеских пар имели в анамнезе от 1 до 8 неудачных
попыток преодоления бесплодия с использованием ВРТ. Суммарное число
неудачных попыток различных методов лечения в группе I
и
II
представлено на рисунке 1.
ИИСД
Группа I
ИИСМ
группа II
ЭКО+ДЯ
ЭКО+ДС
ЭКО+ИМСИ
ЭКО+ТЕЗА
Криоперенос
ЭКО+ИКСИ
ЭКО+ПЭ
0
10
20
30
40
50
60
70
Рисунок 1. Суммарное число неудачных попыток преодоления бесплодия с
использованием ВРТ в группах.
При сравнении данных обследования супружеских пар, у которых в
результате лечения с применением репродуктивных технологий наступила
(группа I) и не наступила (группа II) беременность, статистически значимых
15
различий по возрасту мужчин и женщин, продолжительности бесплодия в
этих группах выявлено не было.
Средняя
составила
продолжительность
5,2±3,5
лет,
во
бесплодия
второй
-
в
5,5±3,9
первой
лет.
группе
Минимальная
продолжительность бесплодия в группах не отличалась и составила 1 год.
Максимальная продолжительность – в группе I составила 15 лет,
в группе II – 20 лет. Однако 75% наблюдений в обеих группах страдали
бесплодием в течение
7-7,5 лет.
В первой группе, где беременность наступила, преобладало первичное
бесплодие – 75%, во второй группе первичное и вторичное бесплодие
распределилось практически поровну: 49,5% и 50,5%, соответственно.
Наиболее
соматическими
распространенными
заболеваниями
у
сопутствующими
женщин
хроническими
являлись
болезни
желудочно-кишечного тракта, выявленные у 13 (19,1%) из 68 пациенток первой
и у 16 (17,2%) из 93 женщины второй группы.
Среди гинекологических заболеваний в первой группе преобладали:
воспалительные заболевания органов малого таза (ВЗОМТ) - 22%,
эндометриоз - 14,7% и гиперпластические процессы эндометрия - 11,8%;
во второй группе: ВЗОМТ - 37,6%, эндометриоз - 24,7%, спаечный процесс в
малом тазу (СПМТ) - 18,3%.
На гинекологические операции в анамнезе указали 20 пациенток (29,4%)
первой группы, которым была произведена 31 (45,5%) гинекологическая
операция, основными из которых были: гистероскопия/РДВ – 16,2% и резекция
яичника/аднексэктомия
– 10,2%.
Во второй группе 36 женщин (38,7%)
перенесли ранее 51 (54,7%) оперативное вмешательство на органах малого таза,
основными
из
которых
были:
гистероскопия/РДВ
–
25,8%
и
тубэктомия – 11,8%.
Основные
репродуктивные
показатели
исследуемые группы, представлены в таблице 1.
16
женщин,
вошедших
в
Таблица 1
Репродуктивные показатели женщин с бесплодием
Репродуктивные
показатели
Бесплодие первичное
Бесплодие вторичное
Беременности
Потеря беременности
(неразвивающаяся
беременность,
самопроизвольный аборт,
эктопическая
беременность)
Искусственный аборт
Самопроизвольные роды
Кесарево сечение
Наличие детей
Группа I (n=68)
количество
женщин
51
17
17
4
11
4
2
3
%
75
25
25
5,9
Группа II (n=93)
количество
%
женщин
46
49,4
47
50,5
47
50,5
16
17,2
16
5,9
2,9
4,4
25
10
3
7
26,9
10,8
3,2
7,5
Структура основных факторов бесплодия в супружеской паре
Проведенный анализ данных позволил выделить основные факторы
бесплодия в группах.
Как в группе I, так и в группе II преобладали супружеские пары с
сочетанным бесплодием, которые составили 60,3% и 65,6% соответственно,
пары с изолированным мужским бесплодием составили 39,7% (группа I) и
34,4% (группа II).
Среди основных факторов женского бесплодия в парах с сочетанным
бесплодием
были
выявлены:
трубно-перитонеальный,
эндокринный,
эндометриоз (табл. 2).
Таблица 2
Основные факторы бесплодия в исследуемых группах
Женский фактор
Группа I
Сочетанное
Мужское
бесплодие
бесплодие
Мужской фактор
(60,3%) +
41,17%
39,7%
Трубноперитонеальное
бесплодие
Эндокринное
27,9%
бесплодие
Эндометриоз
14,7%*
* статистически значимое различие (р<0,05)
17
Группа II
Сочетанное
Мужское
бесплодие
бесплодие
Мужской фактор
(65,6%) +
43%
34,4%
26,9%
24,7%*
При регрессионном многофакторном анализе влияния различных
факторов на наступление беременности у данной выборки была получена
статистически значимая модель: χ²=9,428; р=0,00065. Выявлено, что
достоверно влияет на наступление беременности отсутствие в анамнезе у
женщин воспалительных заболеваний органов малого таза (р=0,002; р<0,05),
отсутствие эндометриоза (р=0,04; р<0,05).
В структуре патозооспермии у мужчин как в первой, так и во второй
группе преобладала астенотератозооспермия (группа I – 64%, группа II –
69%), азооспермия составила 22% и 21% соответственно, астенозооспермия –
9% и 6%, тератозооспермия – 5% и 4% (рис. 2).
Группа I
Астенот
ератозо
осперми
я
64%
Группа II
Азооспе
рмия
22%
Астенот
ератозо
осперми
я
69%
Тератоз
оосперм
ия
5%
Азооспе
рмия
21%
Тератоз
оосперм
ия
4%
Астеноз
оосперм
ия
9%
Астеноз
оосперм
ия
6%
Рисунок 2. Формы патозооспермии в группах.
Таким
образом,
в
работе
продемонстрирована
неоднородность
патозооспермии у мужчин с бесплодием, преобладание сочетания сниженной
подвижности
сперматозоидов
с
повышенной
долей
атипичных
сперматозоидов, что совпадает с данными исследования Хаят С.Ш. (2012).
Результаты медико-генетического обследования
супружеских пар с бесплодием
При цитогенетическом обследовании супружеских пар, вошедших в
исследуемые группы, ХА были выявлены у двух мужчин из группы I
(кариотипы 46,XY/47,XXY и 46,ХY,inv(7)(p22q21)) и у одного мужчины
(кариотип
46,Х,t(20;Y)(p13;q11.21))
18
и
двух
женщин
(кариотипы
46,ХХ/47,ХХХ и 46,ХХ,inv(9)(p12p24)) из группы II. У женщин из первой
группы наличия ХА при цитогенетическом обследовании выявлено не было.
Показанием
обследованию
к
мужчин
дополнительному
послужило
молекулярно-генетическому
наличие
у них
тяжелой
формы
патозооспермии. Пациенты с азооспермией (n=34) были обследованы на
наличие микроделеций в локусе AZF хромосомы Y. У одного мужчины из
группы II выявили микроделецию в AZFс-регионе, что составило 2,9% для
данной выборки.
Часть мужчин с различными формами патозооспермии неясного генеза
(n=80) были обследованы на наличие мутаций в гене трансмембранного
белка, увеличение длины СAG повтора в гене AR.
Мутации в гене CFTR (кодирует специальный трансмембранный
регуляторный белок муковисцидоза) и 5Т аллельный вариант гена CFTR
у мужчин с бесплодием встречаются в 1,5-2 раза чаще, чем в популяции,
частота носительства для отдельных мутаций гена муковисцидоза может
составлять 12% (Черных В.Б., Курило Л.Ф., 2007). Для гена андрогеновых
рецепторов (AR) характерно наличие последовательности повторов CAG,
количество которых может значительно варьировать (от 8 до 25). Показано,
что увеличение количества CAG повторов в рецепторах (>26) снижает их
активность и может приводить к нарушению сперматогенеза (Yong E.L.,
2003; Ding D., 2004).
Нами были выявлены следующие мутации в гене CFTR у мужчин:
delF508 и 5Т(IVS8-5T), что составило 2,5% случаев.
Увеличение длины
СAG повтора в гене AR выявлено у двух пациентов (2,5%) с первичным
бесплодием: у пациента с азооспермией (27(СAG)) и у пациента с
астенозооспермией (27(СAG)).
Результаты лечения супружеских пар с бесплодием
Все супружеские пары
проходили лечение с использованием ВРТ.
По показаниям применяли различные методы лечения.
19
По исходам последнего протокола эти супружеские пары были
разделены на 2 группы: группа 1 – беременность наступила и длилась более
12 недель (68 супружеских пар), группа 2 – беременность не наступила или
прервалась до 12 недель беременности (93 супружеские пары).
Учитывая то, что в исследуемые группы были включены супружеские
пары с мужским и сочетанным бесплодием, наиболее частым методом
вспомогательной репродукции явилось ЭКО с инъекцией сперматозоида в
цитоплазму ооцита (ИКСИ) в различных модификациях (ИКСИ+ТЕЗА;
ИКСИ+СД; ИКСИ+ИМСИ) (табл. 3). Эффективность проведенного лечения
(наступление беременности) составила 42%.
В супружеских парах с выявленными ХА применяли следующие
методы
лечения:
ЭКО+ИКСИ,
ЭКО+ИКСИ+ТЕЗА,
ЭКО+ДС/ДЯ,
в
зависимости от тяжести ХА и после консультации врача-генетика.
Эффективность лечения в данной выборке составила 40%. ПГД была
проведена в 30% случаев.
Таблица 3
Методы вспомогательной репродукции в последних протоколах лечения
супружеских пар в группах
Использованные методы
ЭКО (IVF)
ЭКО (IVF)
ЭКО+ДС
(IVF + Sperm Donation)
ЭКО+ДЯ
(IVF + Egg Donation)
∑
ЭКО +ИКСИ (ICSI)
ИКСИ (ICSI)
ИКСИ+ТЕЗА
(ICSI + TESЕ)
ИКСИ+СД
(ICSI + Sperm Donation)
ИКСИ+ИМСИ
(ICSI + IMSI)
∑
Криоперенос (CRIO)
ИИСД (AID)
ПГД (PGD)
20
Группа I, %
Группа II,%
14,7
8,8
7,5
6,4
-
1,0
23,5
47,0
6,3
14,9
48,3
4,3
5,0
2,1
-
1,0
58,3
19,1
1,0
55,7
19,4
4,3
4,0
Таким образом, использование доступных диагностических методов
генетического анализа, а именно: хромосомного анализа (по лимфоцитам),
анализа на микроделеции в локусе AZF Y-хромосомы, выявления мутаций в
гене CFTR, определения увеличения длины
СAG повтора в гене AR –
позволяет примерно в 10-15% случаев установить генетическую природу
нарушений функции репродуктивной системы при женском, мужском и
сочетанном бесплодии. Это позволяет выбрать более точную тактику
лечения бесплодия в каждой конкретной супружеской паре, предупредить
передачу генетической патологии потомству (применяя ПГД), и повысить
эффективность преодоления бесплодия.
ВЫВОДЫ
1. В структуре бесплодного брака, как среди женщин, так и среди
мужчин, преобладает первичное бесплодие, которое достигает 71%.
В структуре патозооспермии среди причин мужского бесплодия преобладает
астенотератозооспермия
(65%). Среди факторов женского бесплодия
основными являются: трубно-перитонеальный фактор (43 %), эндокринный
(30%) и эндометриоз (25%).
2. При цитогенетическом обследовании супружеских пар с бесплодием
(628 человек) хромосомные аберрации выявлены у 2% обследуемых.
Из числа лиц с выявленными ХА структурные хромосомные аномалии
составили 1,4%. Данные нарушения в равной степени встречались у лиц с
первичным и с вторичным бесплодием, как у мужчин, так и у женщин.
Числовые хромосомные аномалии были выявлены в 0,6% случаев и только у
пациентов с первичным бесплодием, в равном количестве у мужчин и
женщин.
3. Генетические факторы могут быть причиной идиопатического
бесплодия у мужчин. При молекулярно-генетическом обследовании мужчин
с
тяжёлыми
формами
патозооспермии
микроделеции
локуса
AZF
Y-хромосомы выявлены в 6%, мутации в гене CFTR - 2,5%, увеличение
длины СAG повтора в гене AR - в 2,5%. Это указывает на необходимость
21
разработки и использования молекулярно-генетических методов диагностики
заболеваний репродуктивной системы и проведения медико-генетического
консультирования, получения информации о прогнозе и риске передачи
наследственного заболевания потомству.
4. При комплексном обследовании и лечении с использованием ВРТ
161 супружеской пары с бесплодием эффективность лечения (наступление
беременности) составила 42%. Из 10 пар с генетической патологией
беременность наступила у 4-х супружеских пар.
5. При регрессионном многофакторном анализе влияния различных
факторов на наступление беременности выявлено, что достоверно влияет на
наступление беременности отсутствие в анамнезе у женщин воспалительных
заболеваний органов малого таза и эндометриоза.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
На
основании
полученных
данных,
разработана
общая
схема
комплексного клинического и медико-генетического обследования и лечения
супружеских пар с бесплодием, которая предполагает обязательное
медико-генетическое консультирование вторым этапом после клинического
и лабораторного обследования супружеской пары. В первую очередь данная
схема может быть применена к следующим супружеским парам с
бесплодием: если возраст одного из супругов старше 35 лет при первичном
бесплодии; патозооспермия неясной этиологии у супруга; первичное
бесплодие неясной этиологии у супругов;
первичное невынашивание
беременности у супруги. Медико-генетическое консультирование должно
включать в себя: консультирование;
необходимости);
консультирование
генетическое обследование (при
(прогноз
передачи
потомству
генетической патологии при её наличии) (рис.3). При наличии медикогенетического заключения пациенткам, имеющим высокий риск рождения
детей с наследственной патологией, проводится преимплантационная
диагностика (показанием является риск рождения детей с мутацией любого
изолированного гена или хромосомных аномалий).
22
СУПРУЖЕСКАЯ ПАРА С БЕСПЛОДИЕМ
ЖЕНЩИНА
МУЖЧИНА
КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНОЕ ОБСЛЕДОВАНИЕ, УЗИ
I ЭТАП
(выявление ф-ра
бесплодия)
ГИСТЕРОСКОПИЯ
СПЕРМОГРАММА
ЛАПАРОСКОПИЯ
ККА НПК
ЖЕНСКИЙ
ФАКТОР
СОЧЕТАННЫЙ ФАКТОР
(женский фактор +
патозооспермия)
МУЖСКОЙ
ФАКТОР
(патозооспермия)
МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ КОНСУЛЬТИРОВАНИЕ
II ЭТАП
(МГК)
ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ОБСЛЕДОВАНИЕ
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ОБСЛЕДОВАНИЕ
УЛЬТРАСТРУКТУРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГАМЕТ
III ЭТАП
Лечение
ИИСМ
ЭКО+ПЭ
ЭКО+ДЯ+ПЭ
Криоперенос
ПГД
Медикаментозная терапия
ВРТ
ИИСД
ЭКО+ИКСИ
ЭКО+ИКСИ +МЕЗА
ЭКО + ИКСИ + ТЕЗА
ЭКО + ДС
Криоперенос
ПГД
Суррогатное материнство
Рисунок 3. Схема комплексного клинического и медико-генетического
обследования и лечения супружеских пар с бесплодием.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1.
Аскольская
С.И.,
Адамян
Л.В.,
Коваль
М.В.,
Чупрынин
В.Д.,
Гончарова Н.Н., Гаврилова Т.Ю. Ретроспективный анализ клинических
особенностей течения миомы матки при различных темпах роста опухоли у
женщин репродуктивного возраста // IV Международный конгресс по
репродуктивной медицине. Проблемы репродукции. Специальный выпуск.
2010. - С.161-162.
23
2.
Гончарова
Н.Н..
Комплексная
клиническая,
медико-генетическая
диагностика бесплодия в супружеской паре // Тезисы ХХХIII Итоговой
конференции молодых ученых МГМСУ. Профессия – врач. Электронный
журнал. 2011. № 1.
3.
Курило Л.Ф., Сорокина Т.М., Черных В.Б., Брагина Е.Е., Гордеева Е.Г.,
Андреева М.В., Шилейко Л.В., Мясников Д.А., Гончарова Н.Н., Марченко
Л.А., Жахур Н.А., Сонова М.М., Коломиец О.Л. Структура генетически
обусловленных заболеваний органов половой системы // Андрология и
генитальная хирургия. 2011. №3. - С.17-26.
4. Адамян Л.В., Курило Л.Ф., Гончарова Н.Н., Мартышкина Е.Ю. Медикогенетическая диагностика бесплодия в супружеской паре // Материалы XXIV
Международного конгресса с курсом эндоскопии «Новые технологии в
диагностике и лечении гинекологических заболеваний». 2011. - С.156-157.
5. Гончарова Н.Н., Адамян Л.В., Курило Л.Ф., Мартышкина Е.Ю., Сорокина
Т.М. Структура бесплодия в супружеской паре // Материалы XXV
Международного конгресса с курсом эндоскопии «Новые технологии в
диагностике и лечении гинекологических заболеваний». 2012. - С.116.
6. Гончарова Н.Н., Адамян Л.В., Курило Л.Ф., Мартышкина Е.Ю., Сорокина
Т.М., Черных В.Б. Медико-генетическое обследование при бесплодии //
Материалы XXV Международного конгресса с курсом эндоскопии «Новые
технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний». 2012. С. 29-30.
7.
Гончарова Н.Н., Мартышкина Е.Ю., Казначеева Т.В., Арсланян К.Н.,
Адамян Л.В., Курило Л.Ф., Сорокина Т.М., Черных В.Б. Медикогенетические
аспекты
бесплодия
//
Акушерство,
гинекология
репродукция. 2012. Том 6. №2. - С.35-40.
8. Сорокина Т.М., Гончарова Н.Н., Курило Л.Ф.. Структура генетической
патологии органов репродуктивной системы // Материалы первого
национального
форума
«Репродуктивное
демографической стабилизации». 2012. - С.72-73.
24
здоровье
как
фактор
и