Попова Елена Юрьевна - РХТУ им. Д.И. Менделеева

На правах рукописи
Попова Елена Юрьевна
РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ
ДЕКОНТАМИНАЦИИ И ДИАГНОСТИКИ СПЕЦИФИЧЕСКИХ
МИКРОБНЫХ КОНТАМИНАНТОВ
Специальность: 03.00.23 - "Биотехнология"
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата технических наук
Москва 2008
1
Работа выполнена в Московском государственном университете инженерной экологии (МГУИЭ) на кафедре «Экологическая и промышленная биотехнология».
Научный руководитель:
- Минаева Людмила Павловна,
кандидат технических наук
Официальные оппоненты: - Тулякова Татьяна Владимировна,
доктор технических наук
- Юсупова Галина Георгиевна,
кандидат биологических наук
Ведущая организация: Московский государственный университет пищевых
производств
Защита состоится 2 декабря 2008 г. в 1030 на заседании диссертационного
совета ДМ 212.204.13 в Российс
ком химико-технологическом университете
им. Д.И.Менделеева по адресу: 125047, Москва, Миусская пл., д.9, ауд. 443
С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре
РХТУ им. Д.И.Менделеева.
Автореферат разослан «___»_____________2008 г.
Учёный секретарь
диссертационного совета ДМ 212.204.13,
кандидат технических наук
И.В.Шакир
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы
Споровые и неспоровые термоустойчивые контаминанты в сырье создают
трудности в получении стабильных по микробиологическим показателям качества продуктов. Инактивация их происходит только при жестких режимах термообработки, однако, такая обработка негативно сказывается на технологических свойствах и биологической ценности получаемого в результате продукта.
Пастеризация не обеспечивает необходимой защиты продукта из-за развития
устойчивых микроорганизмов. Альтернативой может быть сочетание воздействия двух факторов: мягкая тепловая обработка и внесение бактериоцина низина
для снижения термоустойчивых контаминантов, распространенных в пищевом
сырье. При этом важно изучить чувствительность к низину споровых и неспоровых термоустойчивых контаминантов и особенности их развития в диапазоне
температур пастеризации, а также найти способ сохранения свойств продукта в
мягких условиях термообработки.
Другой проблемой является зараженность муки спорами бактерий рода
Bacillus, вызывающих картофельную болезнь хлеба (КБХ). Известно, что бактерии рода Bacillus могут провоцировать у ослабленных людей заболевания
желчного пузыря, менингиты, артриты, перитониты, эндокардиты. Оценка качества муки важна, с одной стороны, для производства безопасного для здоровья потребителя хлеба, с другой стороны Россия после вступления в ВТО становится потенциальным экспортером муки, что повлечет за собой обеспечение
соответствия международным стандартам по показателям безопасности.
В настоящее время для оценки качества муки используется только метод
пробной лабораторной выпечки, являющийся длительным, требующий специального оборудования и технологических навыков. Для создания объективных
методов оценки качества муки и хлеба, и введения их в практику, сегодня недостаточно информации в изучении биологии возбудителей КБХ и проявления
3
их биохимических свойств с позиций постановки лабораторного метода. Вышесказанное и определяет актуальность данной работы.
Цель работы: изучение специфических микроорганизмов-возбудителей
порчи молока и пшеничной муки, разработка способов их устранения и диагностики при изготовлении продуктов на их основе.
Основные задачи:
- провести экспериментальное изучение влияния бактериоцина низина на
кинетику гибели споровых микроорганизмов в диапазоне температур пастеризации на примере контаминантов, выделенных из молока;
- разработать математическое описание кинетики гибели споровых контаминантов в присутствии низина;
- исследовать влияние низина на микрофлору молока и возможность его
применения для увеличения сроков резервирования молока на предприятиях
молочной промышленности при повышенных температурах;
- выявить газообразующие контаминанты кисломолочных продуктов и
изучить влияние на них низина;
- исследовать развитие споровых контаминантов в опытных образцах
хлеба в процессе хранения;
- исследовать динамику развития спор бактерий-возбудителей картофельной болезни хлеба в модельной среде;
- исследовать амилолитическую и протеолитическую активности бактерий-возбудителей картофельной болезни хлеба;
- исследовать термоустойчивость спор бактерий-возбудителей КБХ;
- разработать методы диагностики картофельной болезни в муке и хлебе.
Научная новизна:
- изучено влияние добавок низина на кинетику термической деконтаминации споровых контаминантов и установлены значения стерического коэффициента А и энергии активации Е;
4
- разработаны инженерные методы расчета комбинированного способа
деконтаминации, сочетающего тепловую обработку с добавлением биоконсерванта низина;
- установлено ингибирующее действие низина на неспоровые газообразующие контаминанты Lactobacillus fermentum, выделенные из молочнокислых десертов;
- изучена динамика развития спо
ровых бактерий-возбудителей картофельной болезни в образцах хлеба и на модельной среде;
- предложено в качестве методов диагностики картофельной болезни хлеба использовать протеолитическую и амилолитическую активность бактерий и
разработаны экспресс-методы для оперативной оценки этих параметров.
Практическая значимость:
- исследована чувствительность газообразующих контаминантов к низину
и молочной кислоте, определена рациональная доза низина - 40 мг/кг, обеспечивающая деконтаминацию творожных десертов;
- установлена рациональная доза внесения препарата низина в молоко - 10
мг/л для снижения уровня теплового воздействия на компоненты молока, обеспечивающая микробиологическую безопасность готовых продуктов в сезон повышенного микробного фона молока;
-изучено влияние остаточного низина на развитие заквасочной микрофлоры молочных продуктов и установлено, что низин не влияет на общее время
сквашивания молока с массовой долей жира 0,5 % и 3,5 %;
- разработаны методики оценки качества муки и хлеба по содержанию
споровых бактерий-возбудителей КБХ;
- предложены показатели диагностики картофельной болезни хлеба по
протеолитической и амилолитической активности бактерий-возбудителей КБХ.
Апробация работы Результаты диссертационной работы докладывались:
на 2-й Международной конференции: Наука-Бизнес-Образование. Биотехнология-Бизнес-Окружающая среда в Пущино, ИБФМ, 2005 г; на 10-й и 11-й Меж-
5
дународной Пущинской школе-конференции молодых учёных в уПщино,
ИБФМ, 2006, 2007 гг.; на Научной конференции студентов и молодых ученых
МГУИЭ, 2008 г; на Всероссийской выставке научно-технического творчества
молодежи НТТМ, Москва, 2008 г.
Публикации По материалам диссертации опубликовано 7 работ.
Структура и объём работы Диссертационная работа включает: введение, обзор литературы, объекты и методы исследования, результаты экспериментов и их обсуждение, выводы, список литературы.
Диссертация изложена на 140 страницах, содержит 31 таблицу и 28 рисунков, список литературы включает 110 наименований.
2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ВВЕДЕНИЕ
Обоснована актуальность темы, сформулированы положения, выносимые
на защиту, научная новизна, сведения о личном вкладе соискателя.
Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Рассмотрены причины и источники микробиологической порчи пищевых
продуктов, контаминанты молока и хлеба. Изложены методы предотвращения
порчи пищевых продуктов, особенно термические, а также имеющиеся в настоящее время данные о кинетике термической деконтаминации продуктов.
Представлена сравнительная характеристика методов борьбы и определения зараженности муки и хлеба возбуд
ителями КБХ. Проанализированы работы:
Афанасьевой О.В, Ереминой И.А., Мазохиной-Поршняковой Н.Н, Матвеева
В.Е., Богатыревой Т.Г., Поляковой С.П., Delves-Broughton J., J.C., Hurst A.,
Mansour M., Peskera T.I. и др. На основе анализа литературы сформулированы
цель и задачи исследования.
Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Объекты исследований - сырье для молочной и хлебопекарной промышленности: молоко, пшеничная мука.
6
Термостойкие споровые контаминанты выделяли путем прогрева сырого
молока при 98?С в течение 15 минут, получения накопительной культуры и последующего высева на МПА. Неспоровые контаминанты выделяли из вздувшихся творожных десертов на селективной среде для лактобацилл. Споровые
контаминанты идентифицировали с использованием определителя Берги, а неспоровые с использованием системы API® производства «BioMerieux». Термоустойчивость контаминантов определяли путем прогрева суспензии контаминантов на водяной бане при разных температурах в фосфатном буфере. Влияния низина на лактобациллы оценивали по изменению значения оптической
плотности при культивировании в жидкой среде MРС. Определение КМАФАнМ проводили по ГОСТ 9 2 2 5-8 4. Определение низина в пробах молочных
продуктов проводили методом диффузии в агар с тест-культурой Bacillus
coaqulans ВСБ 15-204. В опытах использовали российский препарат низина
«БИЗИН 1000» фирмы ООО ПКФ "БИГОР".
Хлеб выпекали методом пробной лабораторной выпечки по ГОСТ 2766988. Общее количество бактерий КБХ в муке и хлебе определяли поверхностным
высевом на идентификационную среду, обеспечивающая визуальное определение амилолитически активных колоний по реакции с йодом. Определение амилолитической активности непосредственно проводили по ГОСТ 20264.4-89, а
также по косвенному показателю – изменению кинематической вязкости суспензии муки после прогрева и термостатирования. Измерения проводили вискозиметром ВПЖ-2. Определение протеолитической активности непосредственно проводили по ГОСТ 20264.2-89, а также по косвенному показателю - величине зон казеиновой преципитации модифицированным методом.
Все экспериментальные исследования проведены не менее чем в трех повторностях. Для статистической оценки результатов использовали расчет дисперсии воспроизводимости относительного отклонения величины, усредненный по большому массиву экспериментов, расчет доверительных интервалов
средних значений и разницы двух значений.
7
Глава 3. ВЛИЯНИЕ НИЗИНА НА ИНАКТИВАЦИЮ
КОНТАМИНАНТОВ ПРИ ТЕПЛОВОЙ ОБРАБОТКЕ
Кинетика инактивации споровых контаминантов в присутствии низина
Изучали действие низина на споровые формы в условиях пастеризации.
Споровый контаминант выделяли из сырого молока, полученного с приемного
пункта Лианозовского молочного комбината. В результате идентификации установлено, что культура относится к роду Bacillus вид lentus. В экспериментах
исходная концентрация спорового контаминанта была не менее 017спор/мл.
Прогрев проводили в фосфатном буфере с рН=6,8 при температурах 750,5;
850,5; 970,5 С в термостатированной водяной бане. Время выдержки проб
составляло 5, 7, 10, 20, 30, 45 и 60 мин. В работе исследовали концентрации
8
8
7
7
7
6
6
6
5
5
5
lgN
8
N
gl
N
gl
низина 25, 50, 75, 100 и 125 МЕ/мл.
4
4
4
3
3
3
2
2
0
10 20 30 40 50 60 70
время, мин
Без низина
50 МЕ/мл
100 МЕ/мл
25 МЕ/мл
75 МЕ/мл
125 МЕ/мл
Рис.1. Температура 75 °С
2
0
10 20 30 40 50 60 70
время, мин
Без низина
50 МЕ/мл
100 МЕ/мл
25 МЕ/мл
75 МЕ/мл
125 МЕ/мл
Рис.2. Температура 85 °С
8
0
10 20 30 40 50 60 70
время, мин
Без низина
50 МЕ/мл
100 МЕ/мл
25 МЕ/мл
75 МЕ/мл
125 МЕ/мл
Рис.3. Температура 97 °С
Кривые гибели спорового контаминанта с начальной концентрацией спор
4?10 7 КОЕ/мл при концентрациях низина 25, 50, 75, 100 и 125 МЕ/мл представлены на рисунках 1, 2, 3.
По экспериментальным данным рассчитаны значения удельной скорости
гибели контаминантов К. Для определения кинетических характеристик контаминантов А и Е (табл. 1) использовали уравнение Аррениуса:
К=А*е-Е/(RT)
или
lnK=lnA-E/(RT).
(2)
Таблица 1
Значения кинетических характеристик А, lnA и Е при разных
концентрациях низина
Концентрация низина, МЕ/мл
А, мин-1
ln A
Е, кДж/моль
17
0
4,2*10
41
134
15
25
1,4*10
35
116
11
50
2,6*10
26
90
8
75
7,6*10
20
72
7
100
3,0*10
17
62
6
125
3,4*10
15
55
На рисунке 4 представлены зависимости кинетических параметров А и Е
от концентрации низина, которые можно описать уравнениями в экспоненци-
,Е
и
ц
ав
тк
я
гр
ен
э
ь
л
ом
/ж
Д
к
альной форме:
160
140
120
100
80
60
40
20
0
60
50
lnA=40.9e-0.0085С
(3)
Е=133.6e-0.0075С
(4)
Более простое описание получается при
30
аппроксимации зависимости линейными
A
n
l
40
20
уравнениями (рис.4):
10
0
0 25 50 75 100 125
концентрация низина, МЕ/мл
Экспоненциальный (lnA)
Линейный (lnA)
Экспоненциальный ( Е)
Линейный ( Е)
Рис.4 Зависимость энергии активации Е
и ln А от концентрации низина
lnA=39.2 - 0.22С
(5)
Е=129.2 - 0.66С
(6)
С - концентрация низина, МЕ/мл.
При аппроксимации экспериментальных
данных экспоненциальной зависимостью
величина достоверности R составляет
9
0,98, а линейной зависимостью - 0,95. Так как обе эти величины имеют высокие
значения, то целесообразней принять для расчетов более простые - линейные
уравнения (5) и (6). Преобразовав уравнение (2) с учетом уравнений (5) и (6),
получили уравнение зависимости удельной скорости гибели от концентрации
низина:
lnK = 39.2-0.22С - (129.2-0.66С) /(RT)
K=e(39.2-0.22С
- (129.2-0.66С) /(RT))
(7)
(8)
Задавая критерий стерилизации  для конкретного случая по уравнению
(9) с учетом уравнения (8) можно подобрать разные режимы тепловой обработки пищевых продуктов в зависимости от концентрации низина:
 = ln Nо/Nк =   К,
(9)
где Nо и Nк – количество контаминантов до и после прогрева.
Принятый ранее подход расчета тепловых режимов по наиболее термостойкому контаминанту B. stearothermophilus 1518 дает жесткую обработку, позволяющую получить стерильный продукт, но с ухудшением его качества. Введение низина позволяет снизить температуру и время обработки сырья (полупродукта), в отношении молока - приблизить его по качеству к натуральному.
Применение низина при тепловой обработке молока
Сезонные повышения микробного фона молока в весенне-летний период
приводят к ужесточению режимов пастеризации с 75-85?С до 95?С, что негативно сказывается на технологических свойствах молока. Увеличение объемов
молока, поступающего на приемный пункт в летний период, приводит к вынужденному продолжительному хранению молока-сырья при неконтролируемых
температурах прежде, чем оно поступит на следующую стадию переработки.
Для обеспечения микробиологической стабильности на этой стадии необходимо исследовать действие низина на микрофлору молока.
Изучали влияние низина на сохранность молока при различной температурной обработке. В термизированное молоко (t=68±2?C, выдержка 15 мин)
10
вносили низин 10 МЕ/мл (мг/л), затем молоко пастеризовали: с низином при
84±2°С в течение 5 минут; без низина при 84±2°С - 5 минут и при 95±2°С - 5
минут (контроль). Полученные образцы хранили при температурах, представляющих интерес в
производственных условиях, 102С и 242С в течение
24 ч. В процессе хранения определяли остаточное количество низина и общее
количество микроорганизмов КОЕ/мл (КМАФАнМ) (табл.2).
Таблица 2
Общее количество микроорганизмов (КМАФАнМ) и концентрация низина в
молоке после термической обработки и в процессе хранения
Время хранения молока при
Время хранения молока при
температуре 10°С, ч
температуре 24°С, ч
0
18
24
0
18
24
После термизации при 68°С в течение 15 минут без низина:
5,5х103
2,0х104
4,0х105
После термизации при 68°С в течение 15 минут с низином 10 МЕ/мл:
5.5х103
2,0х104
4,0х104
После пастеризации при 84°С в течение 5 минут без низина:
2,6х102
3,2х104
4,9х105
После пастеризации при 84°С в течение 5 минут с низином 10 МЕ/мл:
2,6х102
1,0х103
6,0х104
После пастеризации при 95°С в течение 5 минут без низина:
2,6х102
3,0х103
2,0х104
Содержание низина в процессе хранения снижалось на 30% после стерилизации. Общее количество микроорганизмов в образцах с низином после хранения при температурах 102С и 242С в течение 23-24 ч на порядок меньше,
чем в аналогичных образцах без низина. Причем порядок КОЕ в образцах после
пастеризации с низином при 84±2°С тот же, что и при 95±2°Сбез низина.
Применение низина позволяет снизить температуру пастеризации с 952 С до
842 С без заметного ухудшения микробиологических показателей.
Влияние остаточного низина на развитие заквасок
Изучали влияние остаточного низина на развитие мезофильной микрофлоры заквасок, используемых при производстве творога (L.lactis, L.cremoris)
11
(рис.5). Температура пастеризации молока для контрольных образцов 952С.
В пастеризованное молоко с массовой
7
долей жира 0,5 и 3,5% вносили заква-
Н
р.де
6.5
6
ску из мезофильных культур. В про-
5.5
цессе сквашивания определяли актив-
5
ную кислотность. В молоке с 0,
5%
4.5
жира скорость нарастания кислотно0
1
2 3 4
Время, ч
5
6
сти происходит быстрее в низин
со-
7
держащем образце в сравнении с кон-
30С,ж =0,5% (контроль)
30С, ж = 0,5% с низином
30С ж =3,5% с низином
30С, ж = 3,5% (контроль)
тролем, а при 3,5% жирности скорости
в образце с низином и в контрольном
Рис.5.Влияние низина на скорость
сквашивания молока с различной массовой
долей жира творожной закваской-301 С
практически одинаковы.
Таким образом, предварительная пастеризация молока с низином не
ухудшает качества кисломолочных продуктов.
Экономическая оценка: при применении низина стоимостью 7000 руб./кг
в рекомендованных дозах 10 мг/л затраты для молока составят примерно
70 руб./т молока, что составляет 0,33±0,02% от стоимости молока.
Глава 4. ВЛИЯНИЕ НИЗИНА, МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ И ЛАКТАТА
КАЛЬЦИЯ НА РАЗВИТИЕ ГАЗООБРАЗУЮЩИХ КОНТАМИНАНТОВ
Очевидно, что при производстве молочных продуктов из пастеризованного молока, даже подвергшихся термизированию, существует опасность попадания в готовый продукт остаточной микрофлоры.
Были выделены контаминанты, вызывающие порчу – вздутие герметически упакованных молочных продуктов. Выделенные штаммы были идентифицированы как Lactobacillus fermentum. Источником контаминации сырого молока бактериями этого вида могут служить ферментированные корма для животных. Штаммы лактобацилл отличались по спектру сбраживания углеводов, по
степени
газообразования
они
распределились
12
в
следу
ющем
порядке:
L.fermentum 2 (Lb2) (наибольшая) -L.fermentum 1 (Lb1) - L.fermentum 8 (Lb8)
(наименьшая). Для исследований выбраны штаммы Lb1 и Lb2. Штамм Lb8 как
наименее газообразующий не представляет опасности для вздутия герметически упакованных продуктов.
Наиболее газообразующий штамм Lb 2, был проверен на термоустойчивость. Культура выдерживала прогрев при 80 С в течение 9 минут и только
при 90 С - 7 минут рост культуры не наблюдался. Эти результаты подтверждают возможность контаминирования кисломолочных продуктов лактобациллами, выжившими после пастеризации молока.
Влияние молочной кислоты и лактата кальция на развитие L. fermentum
Было изучено влияние молочной кислоты на рост выделенных контаминантов на модельных средах в опыте in vitro. Исследовали действие молочной
кислоты в диапазоне 11?12,6 г/кг при рН 4,00±0,02 при разных стартовых нагрузках тестовых штаммов. Рост штамма Lb2 полностью подавлялся при стартовых нагрузках 102 и 105 КОЕ/мл, а штамм Lb1 проявлял слабый рост при
105 КОЕ/мл.
Содержание молочной кислоты, образуемой естественным путем в твороге 9 г/кг, а концентрация 11 г/кг может придавать кислый вкус продукту, поэтому изучена возможность замены молочной кислоты частично или полностью лактатом кальция. Суммарная концентрация лактат-иона в опыте оставалась такой же 1112,6 г/л, значение рН на уровне 4,84±0,02. Подавление роста
не наблюдалось ни в одном из вариантов. Действие молочной кислоты в предыдущем опыте обусловлено в большей степени более низким уровнем рН, в
отличие от последнего.
Влияние низина на развитие L.fermentum
Следующим этапом было определение чувствительности лактобацилл к
низину в опыте in vitro на модельной среде (табл. 3). Среду MRS-бульон инокулировали штаммами Lb1, Lb2 так, чтобы стартовая нагрузка составляла 104 и
13
Таблица 3
Влияние низина на рост газообразующих
штаммов L.fermentum
Lb1
Lb2
Низин,
МЕ/мл
104
106
104
106
0
20
40
60
+++
+
-
+++
+
-
+++
-
+++
+
-
Примечание:(ОП-оптическая плотность),
«+++» максимум по ОП на 20 ч,
«+» максимум по ОП на 40 ч, «-» роста нет
106 КОЕ/мл. Концентрация низина в опыте была 20, 40, 60 МЕ/мл,
пробы
термостатировали
при
300,5 С. Контролем служила
среда без низина. Развитие Lb1 и
Lb2 полностью подавлялось при
концентрации низина 40 МЕ/мл
во всех вариантах.
Влияние низина и молочной кислоты на развитие L.fermentum
в творожных десертах
В промышленных условиях были приготовлены опытные образцы («Чудо-творог» с черносливом - 175 г, жирность 4 %), в которые вносили низин и
искусственно контаминировали штаммом Lb2. Образцы инкубировали при
температуре 251С и определяли в них концентрацию тестовых штаммов через 5 суток хранения (табл. 4).
Таблица 4
Прирост численности (lgКОЕ/г) лактобацилл в творожных десертах
в процессе хранения
Lb2
Вариант
стартовая нагрузка, lgКОЕ/г
min
max
Стартовая нагрузка, lg КОЕ/г
2,4
5,4
Прирост lgКОЕ/г:
Контроль
6,0
3,0
+ 2,0 г/кг лактата (из молочной кислоты)
1,4
1,5
+ 2,0 г/кг лактата (из лактата кальция)
5,4
2,8
+ 40 мг/кг низина
нет
0,4
+ 60 мг/кг низина
нет
0,1
1
Примечание: Стартовая нагрузка (подчеркнуто) это lg KOE в начале инкубирования,
а прирост – увеличение относительно стартовой нагрузки к концу инкубирования.
Закономерности поведения штамма Lb2, отмеченные в опытах in vitro,
справедливы и для экспериментов с десертами. Низин в концентрациях 40 и
60 мг/кг задерживал развитие с эффективностью большей, чем молочная кисло14
та. Действие лактата из молочной кислоты, вводимого в продукт в количестве
2,0 г/кг, подавляло развитие штамма Lb2. Однако, при введении такого количества молочной кислоты изменяется активная кислотность продукта до рН
3,990,01.
В образцах продукта измеряли концентрацию низина в начале эксперимента, а также на 1-е и 5-е сутки. На 5-е сутки в пробах творога с контаминантом Lb 2 количество низина в продукте не уменьшилось ни в одном варианте.
Была выработана опытная партия "Чудо-творога" в количестве 2500 кг
с содержанием низина 40 мг/кг. Хранение десерта при температуре 60,5С в
течение 21 дня не выявило никаких отклонений в органолептических показателях.
Таким образом, применение низина позволит получать безопасные микробиологически стабильные молочные продукты.
При применении низина стоимостью 7000 руб/кг в рекомендованных дозах 40 мг/кг затраты для творожных десертов составят примерно 280 руб/т продукции, что составляет 0,24±0,02 % от стоимости продукции.
Глава 5. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ СПЕЦИФИЧЕСКИХ
КОНТАМИНАНТОВ - ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КАРТОФЕЛЬНОЙ
БОЛЕЗНИ ХЛЕБА (КБХ)
Исследование корреляции органолептических характеристик
с микробиологическими показателями хлеба в процессе хранения
Изменение экологической обстановки, нерациональное использование
химических удобрений, снижение устойчивости сортов пшеницы и другие факторы приводят к увеличению объема муки, пораженной КБХ. Кроме того, расширяется ареал проявления болезни и увеличивается продолжительность этого
сезонного заболевания. Своевременная диагностика контаминантов муки поможет контролировать и предотвратить заболеваемость хлеба.
15
Для изучения динамики развития микробного заражения из исследуемых
образцов муки выпекали хлеб по методу пробной лабораторной ыпечки
в
(ГОСТ 27669-88). Образцы помещали в провоцирующие условия. В образцах в
процессе хранения на 18, 24, 40 и 48 ч определяли наступление КБХ по органолептическим и микробиологическим показателям (рис. 6). Прорастая при благоприятных условиях,
споровые бактерии синтезируют активный фермента-
тивный комплекс, что приводит к изменению органолептических показателей
хлеба. Результатом деятельности протеолитических ферментов является гидролиз белков с выделением ароматообразующих веществ и появлением специфического запаха гнилой картошки. Деятельность амилолитических ферментов
приводит к гидролизу углеводов муки и образованию липкого мякиша с тем-
ы
ллаб,яинавелобазиканзирП
ными пятнами.
70
65
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
резкий
специфический
запах 9
14 15
11 12
3
слабый
специфический
запах
незначительный
специфический
запах
8
2
8 9 11 12
здоровый
хлеб
6
10
2
456
10
16
1
14
7
6 8
11 12
9
23 4 5 7
15
1415
1
10
1
7
16
34 5
16
18 ч
24 ч
40 ч
Рис.6 Динамика развития КБХ по микробиологическому показателю
Вид столбцов соответствует степени нарастания заболевания, сверху над
ними указаны номера образцов муки.
Первые признаки заболевания по
являлись при содержании бактерий
106 КОЕ/г – незначительный специфический запах,
16
при увеличении их до
107 КОЕ/г - добавлялся слабый специфический запах, свыше 107 КОЕ/г - резкий
специфический запах.
Показано, что по органолептическим признакам болезнь может не проявляться, а содержание бактерий в нем превышает нормы, допустимые для пищевых продуктов, то есть больше 103 КОЕ/г по показателю КМАФАнМ согласно
СанПиН 2.3.2.1078-01 (п.1.4.7.1-1.4.7.4).
Обычно для определения общего количества спор в муке используется
метод глубинного посева. Однако, бактерии-возбудители КБХ - аэробы. Поэтому был проведен сравнительный анализ по оценке количества бактерий выросших на агаризованной среде при глубинном и поверхностном способах посева.
При глубинном способе количество выросших бактерий занижено более чем в
10 раз. В дальнейших исследованиях для количественной оценки бактерий КБХ
в муке и хлебе использовали способ поверхностного посева.
Для определения в муке количества бактерий-возбудителей КБХ подобрана идентификационная агаризованная среда, позволяющая определять визуально амилолитически активные колонии по реакции с йодом.
В итоге разработана методика оценки качества хлеба по содержанию споровых бактерий-возбудителей КБХ, предусматривающая переход с глубинного
способа посева на поверхностный с использованием идентификационной среды. Показано, что воспроизводимость метода не превышает доверительный интервал ±5,6%.
Исследование термоустойчивости бактерий-возбудителей КБХ
Из заболевшего хлеба были выделены колонии контаминантов и исследована их термоустойчивость в опыте in vitro: суспензия спорового контаминанта
в фосфатном буфере рН=6,8 с исходной концентраций 106–107 спор/мл, прогрев
на водяной бане при температуре 970,5?С в течение 60 минут. Контаминанты,
проявившие наибольшую термоустойчивость, встречались при анализе всех образцов хлеба и муки. Менее термоустойчивые контаминанты обнаруживались
гораздо реже в заболевшем хлебе.
17
Исследование развития бактерий-возбудителей КБХ в суспензии муки
Для выделения споровых бактерий образцы муки обычно суспендируют в
воде, прогревают и затем делают высевы на питательные среды.
В литературе описаны различные режимы прогрева для получения спор
возбудителей КБХ: 70-75?С - 5 мин, 80?С - 30 мин, 90-95?С - 10 мин. Споры Bacillus могут выживать в процессе выпечки хлеба в центре мякиша, где температура 96-100?С. Поэтому для уточнения метода обработки суспензии муки проведена оптимизация по четырем параметрам: концентрация муки в суспензии,
температура, время, состав жидкой среды для прорастания спор.
Подбор концентрации суспензии по сухим веществам. В ранее опубликованных источниках используется 10%-ная суспензия муки, при прогреве которой получается сгусток. Определение количества спор при таком способе приводит к увеличению ошибки опыта. Были исследованы более низкие концентрации муки - 1% и 5%. При содержании спор в муке при концентрации около
100 КОЕ/г определение такого количества в 1%-ной суспензии невозможно.
Поэтому для работы была выбрана 5%-ная концентрация муки.
Подбор режима прогрева суспензии муки. Исследовали три режима прогрева суспензии муки: 70-75?С - 5 мин, 80?С - 30 мин, 90-95?С - 10 мин. Сравнение бактерий, выделяемых из заболевших образцов хлеба и из тех же образцов муки после указанных способов прогрева, показало, что не все колонии из
муки обладали амилолитической активностью. Однако, при анализе заболевшего хлеба, выпеченного из этих образцов муки, все колонии были амилолитически активны. В связи с этим было предложено повысить режим температурной
обработки до 96?С с выдержкой 10 минут. Высевы показали, что при таком режиме все колонии были амилолитически активны и соответствовали высеваемым из хлеба.
Подбор жидкой питательной среды для прорастания спор бактерий
КБХ. Для оценки ферментативной активности бактерий КБХ необходимо прорастить споры, получив накопительную культуру. В качестве модельной среды
18
была выбрана суспензия муки. Муку суспендировали в МПБ и 2,5%-ном водном растворе поваренной соли (в соответствии с соотношением соль : мука в
тесте при приготовлении хлеба), прогревали, термостатировали и высевали на
идентификационную среду. Развитие спор в мучной суспензии с МПБ происходило быстрее, чем в мучной суспензии с 2,5% соли. На 18 ч термостатирования
уровень в ферментативной активности разных образцов муки в мучной суспензии с МПБ был высок и отличия для разных образцов менее заметны, поэтому
для дальнейшей работы была выбрана суспензия муки в 2,5%-ном водном растворе соли.
В итоге для методики оценки качества муки по содержанию споровых бактерий-возбудителей КБХ и их ферментативной активности приняты следующие
условия обработки муки: 5%-ная суспензия муки в водном 2,5%-ном растворе
соли, объем суспензии 100 мл, прогрев при 96±1?С в течение 10 минут.
Исследование протеолитической активности бактерий КБХ
в суспензии муки
Характерный признак бактерий КБХ - протеолитическая активность.
Проведен сравнительный анализ методов определения протеолитической активности: по ГОСТ 20264.2-89, в тонком слое желатина и в пробирках с желатиновой средой. Однако, эти методы не позволили получить четких значений
протеолитической активности по ряду причин: низкая чувствительность, отсутствие количественной оценки.
Учитывая невысокий уровень протеолитической активности бактерий
КБХ в муке, нами был предложен метод, основанный на гидролизе казеината
натрия.
Проведен подбор условий, при окторых протеолитическая активность
бактерий КБХ проявляется наиболее отчетливо. Активность определяли в суспензии муки после прогрева при 96±1?С в течение 10 минут и термостатирования при 37±1?С в течение 18 ч.
19
Подбор концентрации казеината натрия. Исследовали влияние концентрации казеината 0,5% и 1% на величину зон преципитации. Уменьшение концентрации казеината натрия до 0,5% приводит к увеличению зон и дает более
четкую картину.
Подбор времени гидролиза. Показания фиксировали через 2, 3, 4 и 5 часов. Величина зон при гидролизе 5 ч наибольшая (рис. 7).
Подбор рН казеинатной среды. Исследовали рН 6,8±0,05; 6,5±0,05; и
5,85±0,05. Последнее значение соответствует кислотности теста после выбраживания. Для всех образцов муки при рН = 5,85±0,05 зоны преципитации наибольшие (рис. 8).
Подбор температуры. Сравнение степени гидролиза при температурах 37±1,
40±1, 45±1 и 50±1?С показало, что во всех вариантах активность возрастает с
увеличением температуры (рис. 8). Наибольший уровень протеолитической активности проявляется при рН=5,85±0,05, причем значительный рост в диапазоне температур 37 - 45?С сменяется умеренным, достигая наибольшего значения
при 50 ?С (рис.8).
20
20
18
15
16
14
12
м
м
,нозртем
аид
м
м
,нозртем
аид
10
5
0
1
Мука №1
Мука №3
2
3
время, ч
4
5
6
10
35
40
45
температура, С
№3 - рН=5,85
№3 - рН=6,5
Мука №2
Мука №4
Рис.7 Зависимость диаметра зон преципитации
от времени гидролиза на казеинатной среде
50
№3 - рН=6,8
Рис.8 Зависимость диаметра зон преципитации от температуры и рН среды для различных образцов муки при гидролизе 5 ч
Подбор толщины агарового слоя. Толщина агарового слоя
влияет на
размер зон и на погрешность. Воспроизводимость результатов увеличивается
при толщине слоя 4 мм. Возможно, это связано с повышенным количеством
20
пробы, вносимой в лунку по сравнению со слоем толщиной 2 мм.
В итоге для методики сравнительной оценки протеолитической активности бактерий КБХ в образцах суспензии муки приняты следующие условия:
время гидролиза - 5 ч; рН среды- 5,85; температура - 50°С; концентрация казеината натрия - 0,5%; толщина агарового слоя - 4 мм; проба - 0,1 г.
Изучение амилолитической активности бактерий КБХ в муке
При прогреве муки суспензия становится вязкой, но в дальнейшем при
термостатировании по мере развития бактерий КБХ и нарастания амилолитической активности происходит снижение вязкости. Количественное изменение
вязкости можно оценить вискозиметром.
Подбор вискозиметра. Оценивали кинематическую вязкость до и после
термостатирования вискозиметрами ВПЖ-2 с диаметром капилляра 0,56; 1,31 и
1,77. Для работы выбран вискозиметр ВПЖ-2 с диаметром капилляра 1,31 мм,
который позволяет определить вязкость суспензии до и после прогрева.
Изучение доступности кислорода. Возбудители КБХ - аэробы и доступность кислорода влияет на их развитие.
700
Исследовали вязкость в зависимости
50 мл
600
от площади поверхности суспенз
ии,
100 мл
500
контактирующей с воздухом. Суспен-
с
/2м
,ь
тсо
кзя
В
400
300
зию по 50 мл вносили в колбы мев
200
стимостью 250, 100 и 50 мл. Поверх-
100
250 мл
ность контакта с воздухом составила
1.12
при этом: 55,9; 28,3 и 12,9 см2, а соот-
0
0.26
0.57
Соотношение S/V
Рис. 9 Зависимость вязкости от условий
роста споровых контаминантов в
стационарных условиях на 18 часов
ношение поверхности к объему S/V,
соответственно, 1,12; 0,57 и 0,26.
Из рисунка 9 видно, что вязкость значительно зависит от площади контакта с
воздухом, то есть доступность кислорода оказывает существенное влияние на
уровень амилолитической активности.
21
Изучение условий термостатирования. Учитывая влияние кислорода на
развитие контаминантов, был поставлен опыт в стационарных условиях и при
с
/2
м
,ь
то
кзя
В
перемешивании. В колбы вместимостью 250 мл вносили по 100 мл и 50 мл
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
прогретой
стац
суспензии,
терм
остатировали
в
стационарных условиях и на качалке со скоростью перемешивания 180 об/мин. В эксперименте через 18 часов контролировали колиперем
чество бактерий КБХ, протеолитическую акстац
перем
100 мл
50 мл
тивность и вязкость. Большая оступность
д
кислорода стимулировала больший прирост
бактерий, протеолитическая активность также
Рис.10 Зависимость вязкости от
условий роста споровых бактерий
достигала максимального значения при перемешивании. В наибольшей степени
аэрация оказывала влияние на амилолитическую активность, что видно по низкому уровню вязкости в пробах при перемешивании (рис.10). При объеме суспензии 50 мл при перемешивании наблюдали самые низкие значения вязкости,
которые для разных образцов муки были примерно одинаковы.
Таким образом, чтобы зафиксировать отличия в образцах с большей точностью были выбраны условия: экспозиция прогретой суспензии - перемешивание, температура - 37 ?С, объем суспензии - 100 мл.
Сравнение различных образцов муки. Для практической проверки метода
исследовали различные образцы муки. Начальное содержание спор в образцах
было 102 - 103 спор/г муки. Количество бактерий КБХ в суспензиях муки после
термостатирования находилось в пределах одного порядка 108 – 109 спор/г муки
и не давало четкой картины о степени заражения муки. Разница уровней протеолитической активности в этих образцах находилась в небольшом диапазоне
зон преципитации в пределах 18-22 миллиметров. В наибольшей степени отличия были выявлены в уровнях амилолитической активности, которые и отражали заболеваемость хлебных образцов (рис. 11).
22
с
/2м
,ь
тс
о
кзя
В
Таким образом, было показано, что
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
заболеваемость хлеба в большей степени
определяется амилолитической активностью
споровых
контаминантов
муки.
О
бразцы
№ 1, 3, 4, 7 относятся к слабо
зараженной
муке по результатам выпечки (рис.6) и вязкость у этих образцов имеет наибольшие
значения 18-97 мм2/с. Хлеб из образцов му1 3 4 7 8
Образцы муки
10 14
Рис.11 Вязкость для разных
образцов муки при перемешивании
ки № 8, 10, 14 сильно зараженный на 24 часа
хранения, и в этих суспензиях муки вязкость
наименьшая 2-7 мм2/с.
В результате проведенных исследований была разработана методика
сравнительной оценки амилолитической активности бактерий КБХ в образцах
суспензии муки, в которой определяемым параметром является вязкость.
Предложенные методы могут быть использованы для оценки качества
муки в лабораториях на мукомольных и хлебопекарных предприятиях.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ
1. Изучено влияние низина на кинетические характеристики гибели клеток контаминанта. Показано, что в присутствии низина увеличивается удельная
скорость инактивации К, но снижается стерический коэффициент А и энергия
активации Е. С помощью математического анализа получено описание кинетики гибели клеток контаминанта с учетом концентрации низина в среде.
2. Изучено действие низина на штаммы газообразующих лактобацилл.
Показано, что добавление низина в творожные изделия в концентрации 40 мг/кг
практически
полностью
подавляет
активность
наиболее
газообра
зующего
штамма Lactobacillus fermentum 2, что позволяет использовать низин для предотвращения вздутия творожных изделий.
23
3. Установлено, что рациональной дозой низина для сырого молока при
сезонном
повышенном
микробном фоне является 10 мг/л, при этом режим
пастеризации 951°С может быть заменен более мягким режимом - 832°С без
увеличения микробного заражения.
4. Показано, что использование предварительной пастеризации молока с
низином не оказывает существенного влияния на скорость сквашивания обезжиренного молока и молока с массовой долей жира 0,5 % и 3,5%, что позволяет
использовать низин в молоке при производстве кисломолочных продуктов.
5. Проведено изучение влияния протеолитической и амилолитической активностей бактерий-возбудителей на развитие картофельной болезни хлеба.
Установлено преимущественное влияние на этот процесс амилолитической активности.
6. Разработана методика диагностики качества муки по содержанию спор
бактерий-возбудителей картофельной болезни хлеба и предложены экспрессметоды сравнительной оценки протеолитической и амилолитической активности споровых контаминантов муки.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Нгуен, Вьет Ань. Влияние низина на кинетику гибели споровых контаминантов/ Вьет Ань Нгуен, Л.П. Минаева, Е.Ю. Попова, Н.И. Ду
нченко,
В.В.
Бирюков
// Наука-Бизнес-Образование.
Биотехнология-Биомедицина-
Окружающая среда: тез. докл. 2-й Международ. конф. – 2005. – С.35.
2. Попова, Е.Ю. Исследование термоустойчивости газообразующих контаминантов Lactobacillus fermentum/ Е.Ю. Попова, Е.А. Гула, Л.П. Минаева,
Н.И. Дунченко, И.Н. Мозговая, Т.Ф. Вустина, В.В. Бирюков // Биология – наука
XXI века: сб. тезисов 10-й Международ. Пущинской школы-конф. молодых
ученых. – 2006. – С. 390.
24
3. Попова, Е.Ю. Изучение кинетики гибели споровых контаминантов, выделенных из молока/ Е.Ю. Попова, Л.П. Минаева, В.В. Бирюков // Сб. научн.
тр. МГУИЭ: Вып.3. – 2006. – С.237-243.
4. Попова, Е.Ю. Повышение срока хранения мясных и молочных продуктов с применением низина/ Е.Ю. Попова, Л.П. Минаева, В.В. Бирюков // Биология – наука XXI века: сб. тезисов 11-й Международ. Пущинской школыконф. молодых ученых. – 2007. – С. 214-215.
5. Попова, Е.Ю. Влияние низина на кинетику термической инактивации
споровых микроорганизмов/ Е.Ю. Попова, Л.П. Минаева, В.В. Бирюков // Биотехнология. –2008.–№2.–С. 69-73.
6. Попова, Е.Ю. Разработка методики определения протеолитической активности споровых бактерий в муке/ Е.Ю. Попова, Л.П. Минаева // Доклады
молодых ученых и студентов МГУИЭ. – 2008. – С 28-29.
7. Попова, Е.Ю. Интенсификация технологии производства отечественного препарата "БИЗИН 1000" – консерванта из молочнокислых бактерий/ Е.Ю.
Попова, В.В. Бирюков // Всероссийская выставка научно-технического творчества молодежи НТТМ: сборник научных докладов. – 2008. – С. 260-261.
25