Лабораторный практикум по технической биохимии. Молоко

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ
ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«НИЖЕГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ
УНИВЕРСИТЕТ имени Р.Е. Алексеева»
Кафедра «Нанотехнологии и биотехнологии»
ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ
ПО ТЕХНИЧЕСКОЙ БИОХИМИИ.
МОЛОКО
Методические указания к лабораторным занятиям
по дисциплине «Техническая биохимия»
для студентов, обучающихся по направлению
«Биотехнология» дневной формы обучения
Нижний Новгород 2015
1
Составители: Т.Н. Соколова
УДК 541.1
Лабораторный практикум по технической биохимии. Молоко: метод. указания к лаб. занятиям для студентов, обучающихся по направлению «Биотехнология» дневной формы обучения / НГТУ; сост.: Т.Н. Соколова, Н. Новгород, 2015. 40 с.
Методические указания предназначены для проведения лабораторных занятий по дисциплине «Техническая биохимия». Могут быть использованы для
самостоятельной и аудиторной работы студентов
Редактор Э.Б. Абросимова
Подписано в печать
Печать офсетная. Усл. п. л.
. Формат 60801/16. Бумага газетная.
. Уч.-изд. л. . Тираж 80 экз. Заказ
.
Нижегородский государственный технический университет им. Р.Е. Алексеева.
Типография НГТУ. 603950, г. Нижний Новгород, ул. Минина, 24.
 Нижегородский государственный технический
университет им. Р.Е. Алексеева, 2015
2
Тема: СОСТАВ И СВОЙСТВА БЕЛКОВ МОЛОКА
1. Классификация белков молока
Белки являются важнейшей составной частью молока. В результате
большинства технологических операций происходит обратимая или необратимая денатурация белков, которая может быть как желательной, так и нежелательной. Например, производство пастеризованного и стерилизованного молока требует устойчивости белково-молочной системы, а творога, кисломолочных продуктов, сыра, наоборот, - денатурации белков с их последующей коагуляцией.
Собственно пищевыми белками являются казеины молока. К казеинам относятся фосфопротеины, которые осаждаются из сырого обезжиренного молока при его подкислении до рН 4,6 при температуре 20 0С.
Остающиеся в фильтрате после осаждения казеиновой фракции белки
получили название сывороточных. По этому определению сывороточные
белки составляют около 20 % всех белков молока, однако 25 % от этого количества не являются по своей химической природе белками, а представляют собой пептиды и азотистые вещества небелковой природы.
При нагревании до 90 0С сывороточные белки денатурируют и при
подкислении до рН 4,6 вместе с казеинами осаждаются. Остающиеся в
фильтрате азотистые соединения получили название протеозо-пептонной
фракции. Эта фракция составляет около 0,1 % от общего содержания белков
в молоке. Протеозо-пептоны образуются при протеолизе казеинов протеолитическим ферментом плазмином. Протеозо-пептоны – это высокомолекулярные пептиды, которые не выпадают в осадок при 95-100 0С в течение 20
минут и последующем подкислении до рН 4,6, но осаждаются 12 %-м раствором трихлоруксусной кислоты.
Кроме казеинов и сывороточных белков в молоке присутствуют так
называемые оболочечные белки – белки оболочки жировых шариков,
3
включающие до 40 различных белковых компонентов, в том числе ферментов, и составляющие  1 %.
Казеин и сывороточные белки являются гетерогенными белками, т.е.
состоят из смеси различных белков. Разделение казеина и сывороточных
белков на фракции осуществляется по их растворимости в различных веществах при разной температуре, а также по электрофоретической подвижности.
Казеины классифицируются на  s1 -,  s 2 -, - и -казеины с содержанием 38, 10, 39 и 13 % соответственно от всего казеина.
К сывороточным относят -лактоглобулин, -лактальбумин, альбумин сыворотки крови, иммуноглобулины, 2-микроглобулин, лактоферрин,
трансферрин, церулоплазмин.
К группе S-казеинов относят белки, осаждаемые в 0,4 М растворе
хлористого кальция при рН 7 и температуре 0-4 0С, но не растворимые в
4,6 М растворе мочевины, они обладают наибольшей из всех фракций казеина электрофоретической подвижностью.
Фракция -казеина растворима в 4,6 М растворе мочевины, но не
растворима в 3,3 М растворе мочевины при рН 4,6. В отличие от  s1 -, и
 s 2 -казеинов -казеин растворим при низких температурах и при понижении (ниже 5 0С) температуры в значительных количествах переходит из мицелл казеина в сыворотку. Это наиболее гидрофобная часть казеина.
Фракция -казеина растворима в 0,4 М растворе CaCl2 при рН 7,0 и
температуре 0-4 0С . Он относится к гликофосфопротеинам и кроме фрагментов фосфорной кислоты содержит от одной до трех углеводных цепей в
виде три- и тетрасахаридов, состоящих из галактозы, галактозамина и Nацетилнейраминовой (сиаловой) кислоты. Вероятнее всего, О-гликозидная
связь образуется между углеводом и остатками треонина белковой молеку4
лы в положениях 131, 133, 135 и 136. В связи с чем свойства -казеина отличаются от свойств других фракций казеина. Он не чувствителен к ионам
кальция и не осаждается в его присутствии, что объясняется наличием в его
молекуле большого количества гидрофильных групп –ОН. -Казеин, в отличие от S- и -казеинов не гидролизуется плазмином, но содержит чувствительную к сычужному ферменту химозину пептидную связь Фен105 –
Мет106. При действии сычужного фермента -казеин распадается на пара-казеин и гликомакропептид. Свойства первого практически не отличаются
от свойств S- и -казеинов.
В молоке имеются производные фракций казеина: 1-, 2-, 3-казеины,
-казеин. -Казеины являются продуктами протеолиза -казеина плазмином
после лизина в положениях 28, 105 и 107 соответственно, например, 1казеин идентичен фрагменту -казеина, состоящему из аминокислотных
остатков в положении 29-209; -казеин – продукт протеолиза  s1 -казеина.
Эти белки, как правило, ухудшают технологические свойства молока. Нормальное свежее молоко содержит около 3 % -казеинов. Их количество повышается до 10 % при длительном хранении молока при температуре ниже
5 0С, в конце лактации, при заболевании животных маститом, при дефиците
в рационе питания протеина.
Протеозо-пептоны можно, в принципе, рассматривать также как
фракцию основных казеинов, они занимают
промежуточное положение
между собственно белками и полипептидами. С помощью электрофореза в
полиакриламидном геле выявлено 15 электрофоретически различных зон.
Основные из них – компоненты 3, 5 и 8. Так, компонент 8 протеозопептонов «быстрый» представляет собой фрагмент -Кн-4Р, содержащий
1-28 аминокислоты последнего, а компонент 8 протеозо-пептонов «медленный» содержит аминокислотный фрагмент 29-107 -Кн-1Р.
5
Содержание основных белков молока отражено в табл. 1.
Таблица 1
Содержание основных белков в обезжиренном молоке
Наименование белка
Содержание, г/л
 s1 -казеин (  s1 -Кн)
12 – 15
 s2 -казеин (  s2 -Кн)
3–4
-казеин (-Кн)
-казеин (-Кн)
-лактоглобулин (-Лг)
-лактальбумин (-Лг)
альбумин сыворотки крови (СА)
иммуноглобулины
протеозо-пептоны
9 – 11
2–4
2–4
0,6 – 1,7
0,4
0,45 – 0,95
0,7
Каждая из фракций казеина может находиться в виде нескольких генетических вариантов. Генетические варианты казеинов отличаются одной
или несколькими аминокислотами в
полипептидной цепи, например,
 s1 -Кн имеет пять генетических вариантов: A, B, C, D, E; -Кн представлен семью вариантами: A1, A2, A3, B, C, D, E. Так, казеин -Кн А1-5Р (содержит 5 фосфорилированных фрагментов серина) в сравнении с -Кн
А2-5Р в положении 67 вместо пролина содержит гистидин; -Кн В-5Р в положении 67 вместо пролина содержит гистидин, а в положении 112 вместо
серина – аргинин.
В табл. 2 представлен аминокислотный состав отдельных генетических вариантов казеиновой фракции полипептидной цепи.
6
2. Свойства казеинов молока
Функциональные свойства белков молока зависят, прежде всего, от
первичной структуры белка.
Под функциональными свойствами понимают широкий спектр физико-химических показателей белка, определяющих его поведение в многокомпонентных пищевых системах в процессах приготовления, обработки,
хранения и потребления, которые в совокупности определяют конечные
органолептические и качественные показатели пищевых продуктов.
Как видно из табл. 2, казеины содержат достаточно большое количество ионогенных аминокислот, причем ионогенные группы относительно
неравномерно распределены в белковой молекуле. Например, в  s1 -казеине
участок между аминокислотными остатками 1-40 несет суммарный заряд
+3, между
41-80 – заряд -22,5; 81-120 – 0; 121-160 – -1; 161-199 – -2,5. В
-казеине участок между аминокислотными остатками 1-43 несет заряд -16;
44-92 – -3,5;
93-135 – +2; 136-177 – +3; 178-209 – +2, т.е. -казеин являет-
ся типичной дифильной молекулой.
От числа ионогенных групп и их распределения в белковой молекуле
зависят такие важные свойства казеинов, как способность к гидратации,
растворимость, электрофоретическая подвижность, способность к солеобразованию, гелеобразованию, поверхностно-активные свойства, склонность
к эмульгированию, кислый или основный характер нативных белков.
Заряд казеинов в зависимости от рН среды определяется в основном
зарядом серинфосфата, глутаминовой, аспарагиновой кислот, лизина, аргинина и гистидина.
Более того, казеины являются сложными белками, содержащими в
качестве простетической группы остатки фосфорной кислоты, а -казеины
кроме фосфорной кислоты включают в свой состав углеводы.
7
Таблица 2
Аминокислотный состав казеинов
Кислота
 s2 -Кн А
-Кн А2
-Кн В
7
8
5
8 (8)
24
15
9
17
9
11
5
17
11
10
8
14
5
2
6
4
14
15
16 (11)
25
25
2
10
8
2
14
4
13
11
12
6
24
3
2
6
4
5
9
11 (5)
18
21
5
35
5
19
6
22
10
4
9
11
5
1
4
4
7
14
12 (1)
13
14
2
20
15
2
11
2
8
13
9
4
9
3
1
5
Всего: 199
207
209
169
 s1 -Кн В
1
Аспарагиновая к-та
2
Аспарагин
3
Треонин*
4
Серин (серинфосфат)
5
Глутаминовая к-та
6
Глутамин
7
Глицин
8
Пролин
9
Аланин
10 Цистеин
11 Валин*
12 Метионин*
13 Лейцин*
14 Изолейцин*
15 Тирозин
16 Фенилаланин*
17 Лизин*
18 Гистидин**
19 Триптофан*
20 Аргинин**
*
- незаменимые аминокислоты;
- аминокислоты, незаменимые только в детском организме.
**
Фосфатные группы связаны с белковой молекулой ковалентно через
образование фосфороэфирной связи с фрагментами серина, при этом формируется дополнительно отрицательный заряд.
В гликофосфопротеине – -казеине, содержащем только один фосфосериновый фрагмент, дополнительный отрицательный заряд формируется
за счет карбоксилатных групп сиаловой кислоты, связанной О-гликозидной
связью с фрагментами треонина -казеина:
8
O
N
в полипептидную цепь
C
CH
в полипептидную цепь
H
CH2
O
O
P
O-
O-
O
в полипептидную цепь
N
C
CH
H
H
CH2OH
CHOH
CHOH
C
O
CH3
O
O
H
OH
CH3
CH
в полипептидную цепь
H
NH
COOH
H
В свежем молоке (рН 6,6-6,8) молекулы белка несут как отрицательные, так и положительные заряды, причем отрицательный заряд вследствие
фосфорилирования серина и присоединения сиаловой кислоты преобладает.
Чем больше заряд белковой молекулы, тем выше степень ее сольватации и тем стабильнее она в растворе. Белки молока характеризуются
очень высокой степенью гидратации, несмотря на их в целом гидрофобный
характер.
Молекулы воды вследствие дифильности электростатически взаимодействуют с ионогенными группами, образуя вокруг белковых молекул
9
гидратную оболочку, которая служит одновременно и защитной оболочкой,
препятствующей агрегации белка в нативном состоянии.
Более того, белки молока относятся к самым активным водосвязующим компонентам биологических систем. Количество связанной воды составляет 0,3-0,4 г на 1 г сухого белка.
Водосвязующая способность белков характеризуется физисорбцией
воды при участии ионогенных (аргинин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, лизин, гистидин) и полярных (аспарагин, глутамин, серин,
тирозин, треонин, цистеин) гидрофильных фрагментов аминокислот.
При снижении рН постепенно в соответствии с константами протолитических равновесий происходит нейтрализация отрицательных зарядов
и при определенном рН (для казеина 4,6-4,7) количество положительных
зарядов белковой молекулы равно количеству отрицательных. В изоэлектрическом состоянии стабильность казеинов самая низкая и они коагулируют.
В отличие от казеинов нативные сывороточные белки растворимы
при всех значениях рН.
Одна из главных особенностей казеинов (кроме -казеина) заключается в их необычайной чувствительности к ионам кальция. Кальций включается в белковую молекулу казеинов через фосфосериновые фрагменты
двумя способами:
- с полной нейтрализацией заряда:
O
Сер)
O
CH2
O
P
Ca
O
- с частичной нейтрализацией заряда, выполняя структурообразующую
функцию (т.е. соединяя две молекулы казеина):
10
O
O
Сер)
CH2
O
O
P
O
Ca
O
-
O
P
O
(Сер
CH2
-
Реже ионы кальция присоединяются к остаткам глутаминовой и аспарагиновой кислот, также образуя кальциевые мостики и снижая отрицательный заряд:
O
Глу)
(CH2)2
O
C
O
Ca
O
C
CH2
(Асп
Эта особенность позволяет рассматривать казеины как белки, денатурированные в нативном состоянии.
Как видно из табл. 2, казеины содержат достаточно высокое количество пролина. Поскольку у пролина атом азота является частью жесткой
кольцевой структуры, вращение вокруг связи С - N невозможно, а в месте
нахождения пролина полипептидная цепь не способна ни к -спирализации,
ни к формированию -складчатых слоев. По этой причине казеины в основном обладают неупорядоченной вторичной структурой, табл. 3.
Таблица 3
Структурные характеристики казеинов молока
 s1 -Кн
 s2 -Кн
-спираль
0-2
0
9-10
23
-слой параллельный
0-7
0-6
13-25
31
-слой антипараллельный
0
0
0
24
94-100
66-77
22
Содержание, %
неупорядоченная структура 90-98
-Кн
-Кн
11
Дестабилизируют -спираль и такие аминокислоты, как аргинин, лизин, изолейцин, серин, треонин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты.
3. Мицеллообразование казеинов молока
Около 95 % казеина находится в молоке в виде сравнительно крупных частиц – мицелл. Мицеллообразование – это самопроизвольный процесс агрегатирования казеиновых молекул в более крупные частицы. Поэтому можно дать и такое определение казеинов, как группы гетерогенных
фосфопротеинов, самоассоциирующихся в мицеллы в присутствии ионов
кальция, фосфатов и цитратов кальция.
В табл. 4 приведены средние физические параметры казеиновых мицелл.
Главными белковыми компонентами казеиновых мицелл являются
 s1 -,  s2 -, - и -казеины обычно в соотношении 3:1:3:1. В целом содержание казеина в мицелле – 82-93 %. Основными компонентами их минеральной части являются кальций (органический и неорганический) – 2,72,8%; магний – 0,1-0,2 %; калий 0,2 %; натрий – 0,2 %; фосфор неорганический – 0,9 %; цитраты – 0,4 %; углеводная часть представлена сиаловой
кислотой, галактозой и галактозамином в количестве 0,3; 0,2; 0,2 % к массе
мицеллы.
Кальций в казеиновых мицеллах содержится в двух формах: так
называемый органический кальций, присоединенный к фосфатным и карбоксильным группам казеина, и неорганический кальций, входящий в состав коллоидного фосфата и цитрата кальция.
Комплекс органического кальция с казеином называют казеинатом
кальция, а комплекс казеината кальция с коллоидным фосфатом кальция –
казеинаткальцийфосфатным комплексом.
Количество органического кальция в казеиновых мицеллах эквивалентно числу серинфосфатных групп.
12
Таблица 4
Физические параметры казеиновых мицелл
Параметр
Значение
Диаметр
Площадь поверхности
Объем
Масса
Массовая доля воды
Молекулярная масса
гидратированной
дегидратированной
Число мицелл в 1 см3 молока
Среднее расстояние между мицеллами
130-160 нм
810-10 см2
2,110-15 см3
2,210-15 г
63 %
1,3109
5108
10 14-1016
240 нм
Точный состав коллоидного фосфата кальция и характер его связи с казеином до сих пор не установлены. Состав может быть представлен
Ca(H2PO4)2, CaHPO4, Са9(РО4)6.
Структурными компонентами мицелл являются сферические субмицеллы диаметром 10-20 нм. Субмицеллы состоят из 25-30 молекул казеинатов кальция, причем  s1 -,  s 2 - и
 -казеины самоассоциируют глав-
ным образом с помощью гидрофобных взаимодействий.
Гидрофобные взаимодействия по энергии малы (0,84-8,3 кДж/моль),
однако высокое содержание неполярных аминокислот в казеинах дает заметный выигрыш в энергии при образовании гидрофобного ядра. Гидрофобные взаимодействия усиливаются при повышении температуры до
60 0С, а затем ослабевают. Минимум энергии гидрофобного взаимодействия
приходится на температуру 5 0С. Под действием гидрофобных взаимодействий неполярные фрагменты казеиновых фракций локализуются внутри
ядра, а заряженные гидрофильные фрагменты – на его поверхности (рис.1).
Таким образом, в поверхностном слое субмицелл содержатся фосфосерино13
вые остатки и гликомакропептидная часть -казеина; -казеин занимает при
этом значительную часть поверхности субмицеллы.
Полярная часть
-казеина
Гидрофобное
ядро
Фосфатные группы
S- и -казеинов
а
б
Рис. 1. Модель субмицеллы (а) и мицеллы казеина (б)
(точками отмечено нахождение коллоидного фосфата кальция).
Хотя принцип формирования субмицелл одинаков, в целом их белковый состав различается: отдельные субмицеллы обогащены -казеином,
другие его содержат в меньшем количестве, в третьих -казеин может отсутствовать. Стабилизация последних осуществляется только за счет полярных фрагментов  s1 - и -казеинов, которые не в состоянии полностью
экранировать от контакта с водой гидрофобное ядро субмицеллы. Наличие
на поверхности субмицелл гидрофобных «липких» участков предопределяет механизм их дальнейшей агрегации в мицеллы.
Электростатические взаимодействия разноименно заряженных групп
казеиновых молекул обычно не играют существенной роли в формировании
субмицелл, поскольку в водных растворах ионогенные группы аминокислот
окружены диполями воды и электростатические взаимодействия между ними ослаблены. Однако кооперативное притяжение многих ионогенных
групп может также способствовать их агрегатированию в мицеллы.
С помощью коллоидного фосфата субмицеллы объединяются в мицеллы, при этом субмицеллы с незначительным содержанием -казеина или
14
без него расположены внутри мицеллы, а с большим содержанием казеина – на ее поверхности. Агрегация субмицелл продолжается до тех
пор, пока все участки поверхности гидрофобного ядра не будут экранированы от контакта с водой полярными группами -казеина. Таким образом,
ограничение роста мицелл казеина определяется в основном содержанием в
системе -казеина. Агрегация субмицелл прекращается в том случае, когда
в мицелле содержится не менее 15 % -казеина.
Особая роль в мицеллообразовании отводится ионам Са+2, которые
могут играть роль солевого мостика, соединяющего  s1 -,
 s2 - и
-казеины. Кроме того, присоединение ионов кальция к фосфосериновым
фрагментам  s1 -,  s 2 - и -казеинов снижает их отрицательный заряд, и
создается предпосылка для их гидрофобных взаимодействий. Нормальной
концентрацией ионизированного кальция считается величина, равная 110
мг/кг, если она уменьшается до 80 мг/кг, молоко становится «сычужновялым»; при концентрации его более 160 мг/кг – молоко нестабильно и легко
свертывается при повышении температуры. Рассчитано, например, что к
одной молекуле
 s1 -казеина присоединяется от 4 до 10 ионов кальция.
При низкой концентрации ионов кальция присоединение протекает по фосфосериновым фрагментам, при высокой – к остаткам глутаминовой и аспарагиновой кислот.
В последнее время важную роль в агрегации субмицелл отводят коллоидному фосфату кальция. По теоретическим подсчетам на одну мицеллу
с молекулярной массой 108 приходится 25 000 фосфатных групп, 60 % которых нейтрализовано Са+2.
Казеиновые мицеллы в свежем молоке очень устойчивые. Они могут
быть выделены в осадок при ультрацентрифугировании без нарушения це-
15
лостности и снова редиспергированы. Сохраняют свою устойчивость мицеллы при механической и тепловой обработке молока.
4. Структурообразование в белково-молочных системах
Структурообразование в молочно-белковых системах начинается с
изменения состояния поверхности казеиновых мицелл. При действии различных факторов (сычужного фермента, органических кислот, например
молочной, продуцируемой молочнокислыми бактериями, колебаний температур и др.) происходят конформационные изменения белковых молекул, и
как следствие, формирование на поверхности мицелл гидрофобных «липких» участков; нейтрализация отрицательного заряда, приводящая к снижению
эффекта
электростатического
отталкивания
между мицеллами;
уменьшение степени гидратации и толщины сольватной оболочки. Это приводит к нарушению
стабильности казеиновых мицелл и сопровождается
образованием пространственных структур, прежде всего, молочных гелей.
В зависимости от дестабилизирующего фактора молочные гели подразделяются на кислотные и сычужные.
При полной потере агрегативной устойчивости при столкновении
мицелл происходит их истинная коагуляция – объединение в более крупные
образования с последующим осаждением в виде осадка-коагулята. Причем
объединение частиц может происходить случайно по любому участку или
нескольким участкам поверхности (рис. 2, а).
При частичной потере агрегативной устойчивости казеиновыми мицеллами, т.е. при формировании мозаичной структуры поверхности с повышением доли гидрофобных участков, мицеллы агрегатируются друг с
другом только при взаимодействии гидрофобных «липких» участков. Происходит образование трехмерных сетчатых структур – гелей (рис. 2, б).
Пустоты сетчатого каркаса заполняются дисперсионной средой – молочной
16
сывороткой, а вся система из свободнодисперсного состояния переходит в
связаннодисперсное.
а
б
Рис. 2. Схематичное изображение коагулята (а) и геля (б)
В геле мицеллы теряют свою подвижность и формируют структуру
трехмерного, напоминающего соты, каркаса с полостями, заполненными
молочной сывороткой. Кроме воды, заполняющей пустоты, в состав геля
входит вода гидратных оболочек мицелл и капиллярная вода, поскольку
молочный гель можно рассматривать как
открытую капиллярную систе-
му.
В зависимости от природы взаимодействий между частицами пространственные образования классифицируют на коагуляционные и конденсационные. В коагуляционных структурах взаимодействие между частицами носит характер межмолекулярных связей Ван-дер-Ваальса. Для
таких структур свойственно явление тиксотропии.
Под тиксотропией понимают способность системы возвращаться самопроизвольно в исходное состояние после их разрушения под действием
внешних факторов (тиксотропно-обратимые системы).
В конденсационных структурах взаимодействия между частицами когезионные, или «фазовые». Главными при этом являются химические связи,
например дисульфидные, солевые мостики, образующиеся часто при участии ионов кальция, фосфосериновых и карбоксилатных фрагментов. При
действии внешних факторов такие связи разрушаются, как правило, без
восстановления (тиксотропно-необратимые системы).
17
Молочные гели по характеру связей между мицеллами являются коагуляционно-конденсационными. Тиксотропный характер гелей связан,
прежде всего, с гидрофобными взаимодействиями между неполярными
участками поверхности мицелл. Все другие типы взаимодействий – электростатические, водородные, химические – играют важную, но не определяющую роль.
Молочные гели образуются всегда только в том случае, если система
в процессе свертывания находится в покое.
Одна из главных особенностей молочных гелей – способность к
набуханию, а также к обратному сжатию после набухания. Явление самопроизвольной отдачи воды без участия внешних сил при одновременном
сжатии объема называется синерезисом. Теоретически синерезис можно
рассматривать как самопроизвольное снижение водосвязующей способности казеинов. Если не действуют никакие внешние силы, структурные частицы геля сохраняют свою первоначальную форму, но при этом наблюдается сжатие объема. Изменение объема геля в диапазоне температур от 16
0
С до 45 0С подчиняется экспоненциальному закону:
V  V0  K (T T0 ) t ,
где V – объем кубика геля через некоторое время t;
V0 – объем кубика геля через 30 мин после разрезки;
К – константа геля, равная 0,22510-3 мин-1град-1 для временного интервала
30 мин;
Т – температура протекания синерезиса;
Т0 – нулевая температура замораживания синерезиса (Т0 = 16 0С).
При Т < 16 0C нельзя установить процесс синерезиса, если Т > 45 0С
наблюдается изменение структуры геля.
При синерезисе быстрее всех отделяется вода, заполняющая пустоты.
Не отделившаяся из пустот вода часто становится причиной образования
пороков, например при производстве сыра.
18
Капиллярная вода при синерезисе отделяется не полностью. Она образует резервную воду, которая, например при созревании сыра, поглощается как гидратная.
Поскольку гидратная вода связана с гидрофильными участками казеиновых мицелл силами межмолекулярного взаимодействия Ван-дерВаальса, она при синерезисе практически не отделяется.
Поддержание синерезиса за счет капиллярной и гидратной воды происходит только при повышенных температурах, например при отваривании
сыра (нагревание до 50 0С в производстве твердых сыров).
Синерезис в молочном производстве может быть как желательным
явлением, так и нежелательным. Так, в производстве сычужных сыров
стремятся к синерезису и ускоряют процесс отделения сыворотки путем
соответствующей обработки сгустка. В производстве йогурта синерезис,
наоборот, ухудшает качество продукта и его следует предотвращать.
Наиболее сильное влияние на синерезис оказывают колебания температуры, низкие рН (ниже рI), механические воздействия – вибрация, перемешивание. Если одновременно действуют два из указанных фактора или
все три, то синерезиса не избежать. Особенно это следует учитывать при
получении кислотных гелей, где синерезис – явление нежелательное.
Сычужная коагуляция казеинов лежит в основе производства сыров и
творога.
Сычужный препарат – это смесь ферментов животного происхождения. Сырьем для получения препарата является четвертый отдел желудка
(сычужка) молодых телят и ягнят. От одного теленка по сухой массе можно
получить всего 25 г сырья, а от ягненка – 8 г. Составляющими компонентами сычужного препарата являются два фермента – химозин (реннин) и
пепсин А, реже пепсин В. Причем наибольшей протеолитической активностью обладает первый из них. В зависимости от содержания химозина раз19
личают два вида ферментных препаратов. Наиболее качественный, который предпочтителен в сыроделии, получают из сычужек телят и ягнят в
возрасте от трех дней до четырех месяцев и с обязательным условием, чтобы животные питались только молоком. Такой препарат содержит 56-92 %
химозина, 9-45 % пепсина А и от 0,2 до 1,5 % пепсина В. Второй вид сычужного препарата получают из желудков более взрослых телят, часто с
нарушением пищевого рациона. Он содержит 67,5-100 % пепсина А от 0 до
35,6 % химозина и от 0 до 2,9 % пепсина В. Этот препарат хотя и приемлем
в сыроделии, заметно уступает по качественным и функциональным характеристикам первому.
Действие сычужного фермента на белки молока представляет собой
двухстадийный процесс. Первая стадия процесса является ферментативной,
вторая стадия – собственно формирование пространственной структуры
сычужного геля, или сгустка.
Главный компонент сычужного препарата – химозин гидролизует
молекулы -казеина с отщеплением гидрофильных гликомакропептидов. В
результате -казеин превращается в пара--казеин и теряет свои свойства
стабилизировать структуру казеиновых мицелл.
Расщепление полипептидных цепей -казеина идет по пептидной
связи, образованной фенилаланином (остаток 105) и метионином (остаток
106). Связь Фен105-Мет106 своего рода уникальна: она строго специфична,
т.е. чувствительна к действию химозина и других кислых протеаз (пепсинов) только в составе казеина, но не гидролизуется в ди-, три- и тетрапептидах. Для взаимодействия фермента и субстрата большое значение имеют и
длина полипептидной цепи, и, что не менее важно, аминокислотное окружение связи Фен105-Мет106. Установлено, что протеолиз ускоряется при
наличии серина в положении 104, одного из трех остатков гистидина в положениях 98, 100 или 102, лизина (111) и (или) лизина (112), пролина в по20
ложениях 99, 101, 109, 110. В результате определенного аминокислотного
окружения связь Фен105-Мет106 выступает из молекулы -казеина и легко
входит в карман специфичности химозина.
Интересно отметить, что связь Фен105-Мет106 содержится в белках не
всех видов молока. Так, -казеины женского молока и молока свиньи содержат в этом положении связь фенилаланин-изолейцин, которая также,
хотя и немного медленнее, гидролизуется химозином. Это еще раз говорит
о том, что для работы химозина важна не сама связь Фен105-Мет106, а ее
окружение, поэтому незначительные изменения структуры субстрата влияют на действие фермента.
Поскольку стабильность казеиновых мицелл в основном обусловлена
силами электростатического и неэлектростатического отталкивания между
углеводсодержащими гидрофильными фрагментами -казеинов, находящихся на поверхности мицелл, то после действия сычужного фермента, отщепляющего от -казеинов гликомакропептиды, увеличивается гидрофобность поверхности мицеллы, снижается заряд, степень сольватации
и
уменьшается стабильность мицелл. Потеряв частично устойчивость, на второй стадии мицеллы агрегатируются в пространственную структуру сычужного геля, или сгустка.
Вначале процесса после протеолиза значительного количества казеинов на поверхности мицелл «обнажаются» и реорганизуются гидрофобные участки пара--казеина, при взаимодействии которых образуются
линейные агрегаты белковых частиц. Эта стадия сопровождается повышением вязкости молока. На следующей стадии при продолжающемся гидролизе -казеина гидрофобность поверхности возрастает, линейные цепочки
начинают соединяться так называемыми перекрестными связями, т.е.
наступает формирование пространственной сетки. При этом важным условием является наличие свободных ионов кальция. Ионы кальция связыва21
ются со свободными карбоксильными группами и фосфосериновыми остатками. Под действием ионов кальция происходит дополнительное снижение
отрицательного заряда мицелл.
Степень сычужной коагуляции зависит от температуры и рН среды.
Оптимальная температура для сычужного фермента 42,5 0С. Дальнейшее
повышение температуры приводит к увеличению продолжительности свертывания
вследствие
взаимодействия
с
денатурированным
-лакто-
глобулином, который вызывает экранирование чувствительной к химозину
пептидной связи. При температуре ниже 10 0С молоко практически не свертывается. При этом первая ферментативная стадия протекает, но вторая –
агрегация дестабилизированных мицелл – не происходит.
Ускоряет коагуляцию увеличение концентрации вносимого фермента, при этом соблюдается закономерность: произведение концентрации сычужного фермента и продолжительности образования сгустка является постоянной величиной.
Воздействие пепсина на казеиновые мицеллы, особенно на -казеин,
аналогично действию химозина. Комплексное воздействие химозина и пепсина на молоко позволяет получить до 95% казеина в виде сгустка в осадке.
При воздействии других протеолитических ферментов, как животного, так
и микробного происхождения, протеолиз идет глубже, захватывая не только
-казеины, но и другие фракции, а в сгустке обнаруживается только 40-45%
казеина от исходного.
В технологии сыра имеет значение, кроме первых двух стадий, третья
фаза, которая определяет поведение фермента уже в сформировавшемся
сгустке. Химозин очень медленно гидролизует казеин, только слегка изменяя консистенцию сычужного геля, и накопление небелкового азота практически не наблюдается. Сгусток казеина, образовавшийся при действии
других кислых протеиназ, при последующем выдерживании подвергается
22
их интенсивному воздействию, при этом наблюдается накопление небелкового азота, сгусток постепенно размягчается и растворяется.
В целом, чем меньше соотношение протеолитической активности
фермента к молокосвертывающей способности, тем выше качество препарата и он более пригоден для сыроделия.
Кислотная коагуляция основана на изоэлектрическом осаждении казеина путем введения в молоко органических (молочной, уксусной) или
минеральных кислот. При подкислении молока до рН 5,7-5,8 наблюдается
постепенная нейтрализация отрицательных зарядов (карбоксильных и фосфатных фрагментов) и удаление из состава казеиновых мицелл около 50 %
коллоидного фосфата кальция. При рН 4,9 удаляется весь коллоидный фосфат кальция и происходит полное разрушение мицелл. Разрушение мицелл
до субмицеллярных частиц сопровождается увеличением дисперсности частиц.
При приближении к изоэлектрической точке (рI = 4,6) происходит
дальнейшая нейтрализация зарядов казеинов и снижение их степени гидратации, начинается процесс структурообразования между конформационно
измененными полипептидными цепями казеиновых молекул субмицелл.
При медленном введении кислот или постепенном подкислении молока за
счет образования молочной кислоты молочнокислыми бактериями и отсутствии перемешивания наблюдается гелеобразование с развитием трехмерной структуры сгустка, причем заметное образование гелевой структуры
наблюдается при рН, отличающейся от величины pI.
Гель-точка наступает при рН 4,76-4,85. В это время структура кислотного сгустка непрочна и необратимо разрушается при механическом
воздействии.
23
Быстрое введение кислот или одновременное подкисление и нагревание молока ведут к истинной коагуляции, т.е. к образованию хлопьевидного осадка.
5. Термоустойчивость молока
Способность белковой системы молока выдерживать высокие температуры является уникальным свойством и позволяет осуществлять такие
операции, как пастеризация и стерилизация, которые в настоящее время
являются практически единственными промышленными способами уничтожения патогенных микроорганизмов в молоке перед его обработкой.
Термоустойчивость молока обусловлена в основном его кислотностью и солевым балансом. Для свежего молока не существует определенной
зависимости между кислотностью и термоустойчивостью. Повышение кислотности молока в результате жизнедеятельности молочнокислых бактерий
снижает его термоустойчивость. При накоплении молочной кислоты отрицательный заряд мицелл казеина нейтрализуется и от казеинаткальцийфосфатного комплекса отщепляется фосфат кальция, вследствие чего мицеллы
казеина утрачивают способность сохранять коллоидное состояние. Если
деминерализация умеренная, то коагуляция белков холодного молока не
происходит, но повышение температуры может катализировать этот процесс.
Термоустойчивость молока зависит также и от равновесия между катионами, присутствующими в молоке (обычно это ионы кальция, магния) и
анионами (обычно это фосфат-ионы). Избыток тех или других нарушает
солевое равновесие, что приводит к переходу солей из растворенного в нерастворимое состояние, т.е. происходит деминерализация казеиновых мицелл.
На практике часто встречается молоко с избыточным содержанием
ионов кальция, которое, являясь нормальным с точки зрения бактериальной
24
обсемененности, кислотности, содержания жира и белка, очень чувствительно к нагреванию.
Свойство
высокой термоустойчивости молока определяет казеин,
имеющий специфическую первичную и вторичную структуры, вследствие
чего казеинам уже в нативном состоянии присущи все признаки денатурации (большое содержание пролина, отсутствие цистеина).
Сывороточные белки сравнительно термолабильны и многие из них
денатурируют в процессе нагревания молока в течение 10-30 мин уже при
90 0С. При денатурации сывороточных белков водородные связи, стабилизирующие -спираль и -складчатые слои, разрываются, полипептидные
цепи -лактоглобулинов и -лактальбуминов раскручиваются. Вследствие
раскручивания -спиральных участков реакционноспособные группы аминокислот – цистеина, аргинина, лизина и других, ранее находившихся внутри глобулы, открываются и создаются предпосылки для агрегации денатурированных белков. Основную роль в агрегации играют гидрофобные взаимодействия «обнаженных» участков раскрученных полипептидных цепей,
электростатические взаимодействия и реакции образования дисульфидных
связей между цистеиновыми фрагментами.
При пастеризации молока денатурирует около 15 % всех сывороточных белков, при стерилизации – 77 %.
Если при нагревании денатурирует свыше 50 % сывороточных белков, происходит образование комплекса между -казеином и -лактоглобулином, в результате чего резко снижается способность молока к сычужному свертыванию.
Казеин в отличие от сывороточных белков термоустойчив и выдерживает без признаков коагуляции нагревание при 140 0С в течение 10-20
минут, однако влияние термообработки молока на казеины нельзя рассматривать изолированно, так как при повышении температуры изменяется рН,
25
солевое равновесие, содержание сывороточных белков. В результате изменения этих параметров во время тепловой обработки, особенно при стерилизации, казеины претерпевают ряд физико-химических изменений, которые могут отрицательно влиять на технологические и функциональные
свойства молока.
Например, могут происходить гидролиз пептидных связей, дефосфорилирование, дегидратация казеина, его комплексообразование с денатурированными сывороточными белками. В результате может наступить изменение структуры казеиновых мицелл и их дестабилизация.
Так, при температурах 110-150 0С в результате гидролиза пептидных
связей в -казеине отщепляются с переходом в сыворотку гликомакропептиды аналогично действию на -казеин сычужного фермента. Поскольку
именно углеводсодержащие фрагменты -казеина играют наиболее важную
роль в стабилизации казеиновых мицелл, в том числе и при термической
обработке, гидролиз около 20 % всего -казеина может вызвать тепловую
коагуляцию белков молока.
Тепловое дефосфорилирование казеина, т.е. гидролиз фосфорноэфирных связей с удалением из S- и -казеинов части органического фосфора, приводит к снижению суммарного отрицательного заряда казеиновых
мицелл и соответственно к уменьшению электростатического отталкивания. Дефосфорилирование казеина наступает при температурах выше
100 0С. Так, полное дефосфорилирование происходит после нагрева обезжиренного молока при 110-140 0С в течение 1 часа, при стерилизации от
казеина отщепляется 15-20 % фосфора. После дефосфорилирования ухудшается способность казеина связывать кальций, часть его уходит из казеинатов кальция, наступает разрушение или дестабилизация мицелл.
Уже при сравнительно низких температурах – 80-95 0С денатурированные и скоагулированные в очень небольшие по размерам хлопьевидные
26
частицы сывороточные белки начинают осаждение, в том числе и на поверхности казеиновых мицелл. В результате экранирования денатурированными сывороточными белками -казеинов понижается способность казеинов к реакции с сычужным ферментом. Продолжительность сычужного свертывания молока не изменяется при нагревании до 60 0С, пастеризация при 70 0С при времени, превышающем 30 минут, уже вызывает увеличение продолжительности процесса свертывания. Главной причиной замедления процесса сычужного свертывания является комплексообразование
между денатурированным -лактоглобулином и -казеином мицелл, которое ингибирует гидролиз химозином -казеина.
Другим отрицательным следствием тепловой обработки молока является образование менее плотных сычужных и кислотных сгустков, обладающих свойством плохо отделять сыворотку. Это опять-таки связано с
включением в казеиновые сгустки денатурированных сывороточных белков, которые повышают водосвязующую способность и придают сгусткам
определенную мягкость. Вместе с тем можно отметить, что переход в сгусток сывороточных белков, в том числе и иммуноглобулинов, повышает
биологическую ценность готового продукта.
При тепловой обработке снижается концентрация ионов кальция, поскольку растворимые соли кальция (СаНРО4, Са(Н2РО4)2) переходят в нерастворимое состояние (Са3(РО4)2). Твердые частицы фосфата кальция способны осаждаться на поверхности казеиновых мицелл, вследствие чего
экранируется поверхностный заряд и облегчается коагуляция. После тепловой обработки, как вследствие ассоциации казеина с денатурированным лактоглобулином, так и отложения на поверхности мицелл фосфата кальция, наблюдается увеличение размера казеиновых мицелл. Так, пастеризация молока при 72-80 0С вызывает увеличение казеиновых мицелл на 1-4 %,
27
ультравысокотемпературная обработка – на 7-25 %, а стерилизация – в 2 и
более раза.
Термообработка молока влияет на вкус и запах молока. Так, при термообработке уменьшается содержание летучих жирных кислот, что снижает
естественный аромат молока, при нагревании в интервале 100-130 0С в молоке может появиться «кипяченый», «сернистый», «пряный», «карамелизованный» и «подгорелый» вкус, что связано с образованием сероводорода,
диацетила, метилкетона, мальтола, бензальдегида, фурфурола и других низкомолекулярных продуктов. В процессе высокотемпературной обработки
молоко может приобретать «вяжущую» консистенцию, «меловой» привкус,
что обусловлено осаждением нерастворимого фосфата кальция на поверхности казеиновых мицелл. При пастеризации вследствие денатурации сывороточных белков повышается возможность образования летучих сульфидов и тиолов, которые в основном формируют привкус «пастеризации».
Молоко после автоклавирования при 150 0С имеет карамелизованный
вкус и коричневый оттенок. В целом установлено, что термообработка положительно влияет на так называемые сенсорные свойства молока, нивелируя кормовые запахи и вкусы.
6. Ферменты молока
В молоке имеются нативные ферменты, попадающие в него в процессе молокообразования из секреторных клеток альвеол молочной железы
или непосредственно переходящие из потока крови. Кроме нативных, в молоке содержатся микробные ферменты (внутриклеточные и внеклеточные),
поступающие в него вследствие инфицирования молочной железы или жизнедеятельности микроорганизмов, которые попадают в молоко из воздуха,
с доильной аппаратуры, емкостей для хранения и с рук в процессе получения, хранения и транспортировки.
28
Содержание нативных ферментов в нормальном молоке с ненарушенной секрецией вымени всегда постоянно. Бактериальные ферменты являются продуктами обмена веществ микроорганизмов, поэтому их количество зависит от количества и вида микрофлоры молока и подвержено сильным колебаниям в зависимости от степени обсеменения молока.
Одни и те же ферменты молока нативного и микробного происхождения, хотя и различаются некоторыми свойствами, практически оказывают
на компоненты молока одинаковое воздействие.
В молоке, продуцируемом здоровыми животными при нормальных
условиях, присутствует до 100 видов ферментов. Большее их число (до 60
наименований) связано с оболочками жировых шариков, часть – с белками
молока, часть находится в свободном состоянии в молочной сыворотке.
Многие ферменты молока выделены с той или иной степенью чистоты, некоторые получены в кристаллическом виде, например ксантиноксидаза, каталаза, пероксидаза, рибонуклеаза, лактозосинтаза.
Ферменты молока, как нативного, так и микробного происхождения,
существенно влияют на его качественные показатели. Так, липаза гидролизует сложноэфирные связи в триацилглицеринах. В случае повреждения
защитной оболочки молочного жира нативная липаза гидролизует связи
позиционно специфично – в положении С-1 и С-3 с образованием 2-моноацилглицерина и жирных кислот. Липазы микроорганизмов более активны,
чем нативные. В результате проявления активности различных липаз в молоке происходит накопление свободных жирных кислот, что приводит к
появлению прогорклого вкуса. Любое механическое воздействие на молоко
должно быть минимальным, чтобы избежать разрушения оболочек жировых шариков и активации нативной липазы.
При пастеризации липазы полностью разрушаются. Появление прогорклости в молоке, пастеризованном при щадящих режимах, связано с
29
действием бактериальных липаз. Так, высокая липолитическая активность
свойственна психротрофным микроорганизмам, активно размножающимся
при температуре ниже 7 0С, поэтому пораженное липазой сливочное масло
холодильного хранения особенно опасно.
В результате ферментативного гидролиза пептидных связей в белковых компонентах в молоке повышается содержание небелковых азотистых
соединений, протеозо-пептонов, -казеинов, свободных аминокислот, в результате чего снижается стабильность мицелл казеина, развиваются пороки
вкуса в молоке и молочных продуктах.
В целом, к ферментам, вызывающим заметные изменения компонентов молока, относятся окислительно-восстановительные ферменты (ксантиноксидаза, лактатдегидрогеназа, пероксидаза, пероксид-дисмутаза, каталаза, сульфгидрилоксидаза), гликолитические (-амилаза, лизоцим, -Dгалактозидаза), липолитические (карбоксилэстераза, холинэстераза, липаза,
фосфолипаза), протеолитические (аминопептидаза, щелочная протеиназа,
кислая протеиназа).
В зависимости от значения для молочной промышленности ферменты
молока можно разделить на две группы:
- ферменты, обусловливающие ряд физико-химических показателей и используемые для оценки качества молока и молочных продуктов;
- ферменты, применяемые в качестве тестов для характеристики степени
механического, теплового и других воздействий на молоко.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1
Определение массовой доли казеина
методом кислотного титрования
Цель работы: определение массовой доли казеиновой фракции в исследуемом молоке методом кислотного титрования.
30
В основе метода кислотного титрования лежит способность казеина
нейтрализоваться щелочью по фрагментам аспарагиновой и глутаминовой
кислот, а также серинфосфатным. Для этого казеин в одной пробе молока
осаждают разбавленной серной кислотой и гетерогенную систему непосредственно титруют раствором щелочи (без фильтрования). В другой пробе казеин осаждают и отфильтровывают, а полученный фильтрат без казеина вновь титруют. Количество казеина рассчитывают по разности раствора
щелочи, пошедшего на оба титрования.
Приборы и посуда: конические колбы объемом 200 мл, пипетки объемом 20 мл, мерный цилиндр объемом 100 мл, бюретки для титрования,
воронка, бумажный фильтр.
Материалы и реактивы: молоко, 0,05 N раствор серной кислоты,
0,1 N раствор гидроксида натрия, 2 %-й спиртовой раствор фенолфталеина.
Порядок выполнения работы
Отмеривают пипеткой 20 мл исследуемого молока в коническую
колбу объемом 200 мл, вливают 80 мл дистиллированной воды и тщательно
перемешивают.
Затем прибавляют по каплям при постоянном перемешивании из бюретки 0,05 N раствор серной кислоты до тех пор, пока не выпадет большими
хлопьями казеиновая фракция (обычно требуется от 14 до 24 мл кислоты).
Недостатка и избытка кислоты следует избегать, так как и в том, и в другом
случае не будет полного осаждения казеина.
После того как осадок сформировался (примерно через 15 минут),
содержимое колбы фильтруют в коническую колбу.
Во время фильтрования берут другую колбу на 200 мл, вливают в нее
20 мл молока, 80 мл дистиллированной воды и из бюретки при постоянном
перемешивании приливают столько же 0,05 N раствора серной кислоты,
сколько его было прибавлено при осаждении казеина в первой колбе. Затем,
31
прибавив к гетерогенной смеси 3-5 капель фенолфталеина, титруют 0,1 N
раствором NaOH до слабо-розового окрашивания (при титровании выпавшие хлопья казеина практически полностью растворяются).
По окончании фильтрования 100 мл фильтрата помещают в коническую колбу емкостью 200 мл, прибавляют 3-5 капель фенолфталеина и титруют 0,1 N раствором гидроксида натрия до слабо-розового окрашивания.
Расчетные формулы
Количество щелочи, пошедшей на титрование 100 мл фильтрата, пересчитывают на весь объем жидкости (общий объем жидкости складывается из количества молока, воды и серной кислоты) по формуле
x1 
a(100  b)
,
100
(*)
где а – количество 0,1 N раствора NaOH, пошедшего на титрование 100 мл
фильтрата, мл;
b – количество 0,05 N раствора H2SO4, прибавленное для осаждения казеина, мл.
Массовую долю казеина в молоке (%) рассчитывают по формуле
М
( х 2  х1 )  0,1131
100,
20
где х2 – количество 0,1 N раствора NaOH, пошедшего на титрование второй
пробы (смеси с казеином), мл;
х1 – количество 0,1 N раствора NaOH, рассчитанного по формуле (*), мл;
0,1131 – количество казеина, эквивалентное 1 мл 0,1 N раствора NaOH, г
(определено по калибровочному графику).
32
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2
Методы определения термоустойчивости молока
Цель работы: освоение методов определения термоустойчивости
молока.
Для определения термоустойчивости молока используют алкогольную и кальциевую пробы.
Приборы и посуда: водяная баня, чашки Петри, мерные пипетки объемом 2 мл, мерные цилиндры объемом 10 мл, пробирки.
Материалы и реактивы: сырое молоко, этиловый спирт концентрацией 68, 70, 72, 75 и 80 %, 1 %-й водный раствор хлорида кальция.
Алкогольная проба
Метод основан на коагуляции белков молока под действием этилового спирта. Чем ниже термоустойчивость молока вследствие повышенной
кислотности, тем меньше требуется спирта для того, чтобы вызвать уменьшение гидратной оболочки (вследствие снижения полярности растворителя) казеиновых мицелл и последующую их коагуляцию.
Порядок выполнения работы
К 2 мл исследуемого молока в чашке Петри приливают такой же объем этанола концентрацией 80 %. Смесь перемешивают круговыми движениями и через 2 мин проверяют состояние молока, фиксируя появление
мелких или крупных хлопьев или же отсутствие таковых. Чашки Петри с
пробой обычно просматривают на черном фоне.
Чашку Петри тщательно моют. В сухую и чистую чашку Петри снова
наливают 2 мл молока и операцию повторяют, как описано выше, с добавлением спирта другой концентрации.
В зависимости от того, какую концентрацию спирта выдержало молоко (без коагуляции), его подразделяют на следующие группы термоустойчивости:
33
Водный раствор этанола, %
80
75
72
70
68
Группа
I
II
III
IV
V
Кальциевая проба
Метод основан на коагуляции белков молока под действием ионов
кальция.
Порядок выполнения работы
В 5 пробирок мерным цилиндром наливают по 10 мл молока и добавляют пипеткой 0,3; 0,5; 0,7; 0,9 и 1,1 мл 1 %-го раствора CaCl2 соответственно. Тщательно перемешивают содержимое и помещают пробирки в
водяную баню с температурой 95-100 0С на 5 мин. Затем пробирки вынимают из бани, охлаждают при комнатной температуре, наблюдая за консистенцией молока. Видимая коагуляция белка свидетельствует о том, что
молоко нетермоустойчиво.
В зависимости от того, какой объем добавленного 1 %-го раствора
CaCl2 выдержало молоко, его подразделяют на следующие группы:
Объем 1 % раствора CaCl2, мл
1,1
0,9
0,7
0,5
0,3
Группа
I
II
III
IV
V
После установления термоустойчивости молока обеими методами
сделать вывод о сопоставимости полученных результатов.
34
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3
Влияние солей кальция на свертывание молока
сычужным ферментом
Цель работы: исследование влияния солей кальция на эффективность
свертывания молока сычужным ферментом.
Приборы и посуда: секундомер, химические стаканы объемом 50 мл,
мерные пробирки объемом 10 мл, пипетки объемом 2 мл.
Материалы и реактивы: сырое молоко, 1 %-й раствор сычужного
фермента (пепсина), 0,4 %-й водный раствор хлорида кальция.
Порядок выполнения работы
В четыре пронумерованных химических стакана наливают по 20 мл
сырого молока, затем
добавляют в пробы молока, кроме контрольной,
0,4 %-й водный раствор хлорида кальция следующим образом:
стакан № 1 – контрольная проба;
стакан № 2 – 0,5 мл;
стакан № 3 – 1,5 мл;
стакан № 4 – 2,0 мл.
В стакан № 1 с подготовленным молоком добавляют 2 мл 1 %-го
раствора сычужного фермента, быстро перемешивают и включают секундомер. Аналогичную операцию производят и с другими образцами молока,
записывая поправку во времени для каждой пробы (одновременно фиксируют время начала эксперимента по часам). После чего пробы молока
оставляют при комнатной температуре до появления на стенках стакана
хлопьев образовавшегося сгустка, которые можно наблюдать, перемешивая
легкими вращательными движениями содержимое в стакане.
Первые
наблюдения нужно сделать спустя несколько секунд после добавления
фермента.
35
Продолжительность свертывания
молока сычужным ферментом
определяют по секундомеру во всех четырех образцах и делают выводы о
влиянии на свертывание солей кальция.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 4
Влияние режима пастеризации молока на процесс
его свертывания сычужным ферментом
Цель работы: исследование влияния режима термообработки молока на эффективность сычужной коагуляции.
Приборы и посуда: водяная баня, электрическая плитка, секундомер,
термометр, химические стаканы объемом 50 мл, пробирки, мерные пробирки объемом 10 мл, пипетки объемом 2 мл.
Материалы и реактивы: сырое молоко, 1 %-й раствор сычужного
фермента (пепсина), 0,4 %-й водный раствор хлорида кальция.
Порядок выполнения работы
В четыре пронумерованных химических стакана наливают по 20 мл
молока. В первом стакане оставляют молоко в качестве контрольной пробы
сырым, непастеризованным.
Второй стакан с молоком помещают в водяную баню и пастеризуют в
течение 30 мин при температуре 63 – 65 0С (температура водяной бани
должна быть на 2 – 3 0С выше температуры пастеризации), температуру
пастеризации контролируют термометром.
После пастеризации молоко
охлаждают до комнатной температуры погружением стакана в холодную
воду при непрерывном перемешивании молока.
Третью пробу молока помещают в водяную баню и пастеризуют при
температуре 72 – 76 0С в течение 15 – 20 с, после чего охлаждают до комнатной температуры.
Молоко в четвертом стакане доводят до кипения на электрической
плитке и немедленно охлаждают.
36
После термической обработки всех проб молока температура его
должна быть одинаковой, равной комнатной ( 10С).
Термическую обработку можно проводить в пробирках, а затем подготовленное молоко разлить в стаканы:
стакан № 1 – сырое, непастеризованное молоко (контрольная проба);
стакан № 2 – молоко, пастеризованное при Т = 63 – 65 0С в течение 30 мин;
стакан № 3 – молоко, пастеризованное при Т = 72 –76 0С в течение 15–20 с;
стакан № 4 – молоко, доведенное до кипения и немедленно охлажденное.
В первую пробу добавляют 2 мл 0,4 %-го водного раствора хлористого кальция и 2 мл 1 %-го раствора сычужного фермента, содержимое
перемешивают и включают секундомер.
Аналогичную операцию производят и с другими образцами молока,
записывая поправку во времени для каждой пробы. После чего пробы молока оставляют при комнатной температуре до появления на стенках стакана
хлопьев образовавшегося сгустка, которые можно наблюдать, перемешивая
легкими вращательными движениями содержимое в стакане.
Первые
наблюдения нужно сделать спустя несколько секунд после добавления
фермента.
Продолжительность свертывания молока определяют по секундомеру во всех четырех образцах и делают выводы о влиянии на свертывание
способа термообработки.
Приложение: раствор сычужного фермента (или заменяющего его
ферментного препарата) готовят растворением соответствующей навески в
дистиллированной воде, подогретой до температуры 30 – 40 0С, с последующим охлаждением до комнатной.
37
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 5
Определение эффективности пастеризации молока
по реакции на пероксидазу
Цель работы: определение эффективности тепловой обработки молока по содержанию фермента пероксидазы.
Приборы и посуда: водяная баня, электрическая плитка, термометр,
пробирки, мерные пробирки, пипетки объемом 5мл, 1 мл.
Материалы и реактивы: сырое молоко, 1 %-й раствор крахмала,
10 %-й раствор KI, 0,5 %-й раствор перекиси водорода.
Метод основан на разложении перекиси водорода ферментом пероксидазой, содержащимся в молоке и молочных продуктах. Пероксидаза теряет свою активность при нагревании молока до температуры 80 0С. Если молоко пастеризуется при температуре меньшей, чем температура инактивации пероксидазы (технологический режим пастеризации обычно 76  2 0С),
то при добавлении в такое молоко перекиси водорода в присутствии субстрата иодистого калия будет протекать реакция при участии пероксидазы:
-
пероксидаза
2 I + H2O2
-
I2 + 2OH
Выделяющийся иод, адсорбируясь на определенных участках полисахаридной цепочки крахмала, придает молоку с активной пероксидазой
синий цвет (окраска должна появляться мгновенно).
Появление окраски более чем через 2 мин не служит показателем
наличия пероксидазы, так как может вызываться разложением реактивов с
течением времени.
Порядок выполнения работы
В пробирку наливают 5 мл сырого молока, добавляют 3 мл дистиллированной воды, 0,5 мл 1 %-го раствора крахмала, 2-3 капли 10 %-го раствора KI и 5 капель 0,5 %-го раствора перекиси водорода. После добавления
38
каждого реактива содержимое пробирки перемешивают вращательными
движениями и определяют окраску.
Во вторую пробирку наливают 5 мл сырого молока и нагревают на
водяной бане при температуре 40-50 0С в течение 15 –20 минут. После
охлаждения под струей холодной воды до комнатной температуры проводят
реакцию на содержание пероксидазы, как описано выше.
В третью пробирку наливают 7,5 мл сырого молока и нагревают его
при температуре 80-85 0С в течение 15-20 минут. После охлаждения 2,5 мл
пастеризованного молока переливают в сухую и чистую пробирку. С остатком проводят реакцию на содержание пероксидазы.
К 2,5 мл пастеризованного при температуре 80-85 0С молока в четвертой пробирке добавляют 2,5 мл сырого молока, перемешивают и анализируют на содержание пероксидазы.
По реакции на пероксидазу делают вывод об эффективности пастеризации молока.
Рекомендуемая литература
1. Тепер А. Химия и физика молока. – М.: Пищевая промышленность,
1979. – 623 с.
2. Горбатова К. К. Биохимия молока и молочных продуктов. – СПб.:
ГИОРД, 2003. – 320 с.
3. Состав и свойства молока как сырья для молочной промышленности/
Под ред. Я.И. Костина. – М.: Агропромиздат, 1986. – 239 с.
4. Крусь Г.Н., Шалыгина А.М., Волокитина З.В. Методы исследования молока и молочных продуктов. – М.: Колос, 2000. – 368 с.
39