определение жирорастворимых витаминов а и е в пищевых

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИРОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ А И Е В ПИЩЕВЫХ
ПРОДУКТАХ МЕТОДОМ ВЭЖХ С УФ-ДЕТЕКТОРОМ
Хлякина Д.М., Мелихова Е.В.
Липецкий государственный технический университет, г. Липецк, Россия
e-mail: dashytka702@yandex.ru
Витамины занимают особое место среди биологически активных веществ таких, как
антибиотики, гормоны, гликозиды и другие, поскольку активно участвуют в обмене веществ
и каталитических процессах, повышающих защитную функцию организма. Избыток или
недостаток водо- или жирорастворимых витаминов в организме человека может негативно
влиять на его здоровье [1].
Известно большое количество гостированных методик определения витаминов:
титриметрические, спектрофотометрические, хроматографические, и другие, однако каждый
из этих методов анализа имеет ряд недостатков [2-5]. Высокоэффективная жидкостная
хроматография является одним из наиболее распространенных методов определения
жирорастворимых витаминов, благодаря возможности одновременно разделять и определять
компоненты сложных по составу смесей. В связи с появлением большого количества
витаминизированных продуктов питания, а также проблемой фальсификации лекарственных
средств, возникает необходимость контроля за содержанием витаминов.
В данной работе проводилось определение витаминов А и Е в пищевых продуктах
методом ВЭЖХ с УФ-детекцией. Определение проводилось на жикостном хроматографе LC10 фирмы Shimadzu (Япония) с градиентным насосом, термостатируемой ячейкой,
спектрофотометрическим детектором, колонкой Nucleosil C18 150х4,6 мм (Macherey-Nagel,
США).
Для выбора оптимальных условий хроматографирования было рассмотрено влияние
таких параметров, как состав элюента, скорость подвижной фазы, температура колонки.
Оценка выбора условий хроматографического определения жирорастворимых витаминов
осуществлялась по следующим характеристикам: степень разделения (Rs), коэффициент
селективности (α), число теоретических тарелок (N), коэффициент асимметрии пиков (As) и
высота, эквивалентная теоретической тарелке (Н). В работе для осуществления поставленной
задачи проводили анализ как индивидуальных витаминов, так и их смеси в этаноле с
концентрацией 50 мкг/мл. Детектирование проводилось с помощью УФ-детектора при длине
волны 285 нм, которая по литературным данным является общей для всех витаминов.
Подтверждающими пиками для витаминов являлись следующие: витамин А – максимум при
длине волны 325 нм, витамин Е – 292 нм. В качестве неизменного параметра выступал объем
вводимой пробы, который составил 10 мкл, длина колонки и неподвижная фаза.
В качестве элюента был выбран ацетонитрил:метанол:дихлорметан и рассмотрено
влияние различных соотношений элюента на хроматографические характеристики. Скорость
потока варьировалась в диапазоне 0,3-1,2 мл/мин, а температура в диапазоне 25-85 ºС.
Верхний предел температуры был выбран из технических рекомендаций эксплуатации
колонки, которые позволяют нагрев до 85 ºС.
В результате исследования для определения витаминов А и Е были подобраны
следующие условия: скорость потока подвижной фазы – 0,8 мл/мин; температура колонки –
35 ºС, состав элюента – ацетонитрил:метанол:дихлорметан в соотношении 50:45:5.
На основе полученных данных были построены градуировочные зависимости,
линейный в диапазоне 1-50 мкг/мл для витамина А и 1-100 мкг/мл для витамина Е. предел
обнаружения составил 0,4 мкг/мл для витамина А и 0,3 мкг/мл для витамина Е.
Для анализа реальных образцов была разработана методика пробоподготовки,
поскольку данная часть анализа является самой трудоемкой, долгой и вносит наибольшую
ошибку в результаты. Известные методы пробоподготовки включают в себя стадию
щелочного гидролиза витаминов, жидкостную экстракцию органическим растворителем,
осаждение белков, мешающих хроматографическому определению, упаривание экстракта
досуха и растворение в 1 мл подвижной фазы. Наибольшие потери отмечаются на стадии
экстракции, поэтому было рассмотрено влияние природы экстрагентов, объема экстрагентов
и числа ступеней экстракции на степень извлечения.
В результате исследований были подобраны следующие условия экстракции: в
качестве экстрагента с лучшей стороны себя показал этилацетат, объем экстрагента 30 мл,
число ступеней экстракции – 4. С помощью разработанной методики пробоподготовки
удалось повысить степень извлечения до 86%.
На основе разработанной методики было проведено определение витаминов А и Е в
образце детской овсяной каши фирмы «Агуша». Полученная хроматограмма представлена на
рисунке 1.
Рисунок 1. – Хроматограмма экстракта витаминов А и Е, полученная в результате анализа реального
объекта.
Содержание витаминов было найдено по градуировочному графику и пересчитано с
учетом разбавлений и взятой навески. Результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1. – Результаты определения жирорастворимых витаминов в реальном объекте (n=3; P=0,95).
Определяемое
Полученный результат,
Заявленное содержание,
Sr
Ошибка,
вещество
мг/100 г продукта
мг/100 г продукта
%
Витамин А
0,39±0,02
0,4
0,02
2,5
Витамин Е
7,41±0,37
7,5
0,02
1,2
Результаты, представленные в таблице 1, показывают, что ошибка определения
витаминов очень мала: в случае витамина А составила 2,5%, в случае витамина Е-1,2%, что
является несомненным достоинством метода ВЭЖХ.
1) Смирнов В.А. Климочкин Ю.Н. Витамины и коферменты: учебное пособие. Самара: Самар. гос.
техн. ун-т. 2008. Ч.2. 91 с.
2) ГОСТ 30627.1-98. Продукты молочные для детского питания. Метод измерения массовой доли
витамина А (ретинола).
3) ГОСТ 30627.3-98. Продукты молочные для детского питания. Метод измерения массовой доли
витамина Е (токоферола).
4) Eitenmiller R.R., Ye L., Landen W.O. Vitamin Analysis for the Health and Food Sciences // Boca Raton.
N.Y. 2008. 664 р.
5) European Pharmacopoeia: Supplement. Strasbourg: Council of Europe. 2001. 3rd ed. 1705 p.