007003 Область техники, к которой относится изобретения

007003
Область техники, к которой относится изобретения
Настоящее изобретение относится к способу выявления риска развития у субъекта заболевания,
связанного с желудочной кислотой, в частности к способу выявления риска развития синдрома желудочно-пищеводного рефлюкса и пищевода Барретта со связанным риском развития аденокарциномы. Способ также можно использовать с целью определения у субъекта риска развития язв как следствия применения НСПВС - нестероидного противовоспалительного средства, а также риска развития заболевания
пищевода после лечения, направленного на уничтожение Helicobacter pylori. Способ по настоящему изобретению основан на анализе содержания пепсиногена I, маркера Helicobacter pylori и гастрина-17 в состоянии натощак, из образца, в частности образца сыворотки крови, взятого у указанного субъекта.
Уровень техники
Синдром рефлюкса представляет собой состояние, которое может являться следствием заброса,
рефлюкса, содержимого желудка в пищевод. Конкретно, термин «синдром рефлюкса» используют, когда
указанный феномен рефлюкса вызывает повреждение или воспаление слизистой оболочки пищевода, т.е.
эзофагит. Типичным симптомом синдрома-рефлюкса является изжога.
Осложнением распространенного синдрома-рефлюкса является заболевание, которое называется
пищеводом Барретта, заболевание, при котором имеют место изменения эпителия пищевода различных
степеней. Полагают, что рефлюкс разрушает эпителий пищевода, вызывая состояние, которое, в свою
очередь, создает повышенный риск развитие аденокарциномы пищевода.
Желудок субъекта со здоровой, т.е., неатрофичной слизистой оболочкой, имеет кислую реакцию
среды в норме рН от 1 до 2. Экскреция кислоты в желудке, однако, связана с высвобождением гастрина17 таким образом, что гастрин-17 стимулирует высвобождение кислоты, а повышение кислотности в желудке приводит к уменьшению высвобождения гастрина-17 из антральных G-клеток (гастриновых клеток) с механизмом и контролем по типу обратной связи. Указанный гастрин-17 представляет собой, в
частности, гастрин-17, полученный в базовом состоянии или натощак, поскольку содержание гастрина17, которое определяют после стимуляции, такой как прием пищи с высоким содержанием белка, увеличивается благодаря нейтрализующему влиянию пищи на кислотность в желудке.
В публикации WO 96/15456, которая включена в настоящий документ в качестве ссылки, раскрыт
способ скрининга на предмет риска развития злокачественной опухоли путем определения концентрации
пепсиногена I и гастрина-17 в образце сыворотки крови субъекта. Согласно указанной публикации определенные таким способом величины концентрации затем сравнивают с выбранной пороговой величиной
и стандартной величиной для каждого объекта анализа, и полученные таким образом результаты можно
использовать для оценки наличия и локализации атрофии в желудке и связанного с ней риска развития
злокачественной опухоли.
Согласно описанному варианту осуществления настоящего изобретения указанные тесты можно
комбинировать с тестом на антитела против Helicobacter pylori, а также с так называемым тестом белковой стимуляции, согласно которому берут образец крови утром натощак, после чего пациент съедает
стандартную пищу с высоким содержанием белка, и образцы крови берут с 15-минутными интервалами в
течение 2 ч. Максимальное повышение гастрина-17 наблюдается приблизительно через 20 мин.
Helicobacter pylori представляет собой спиралевидную грамотрицательную бактерию, которая бурно размножается в слизистой оболочке в непосредственной близости от поверхностных эпителиальных
клеток слизистой оболочки желудка и в клеточном интерстиции. Бактерия, очевидно, передается пероральным путем от одного субъекта другому. Воздействие бактерии на слизистую оболочку желудка
представляет собой воспалительную реакцию, которая опосредуется комплементом путем высвобождения мощных медиаторов воспаления. После острой стадии воспаления трансформируется в хронический
гастрит. У пациентов, страдающих хроническим гастритом, в 70-90% случаев выявляют инфекцию
Helicobacter pylori (Calam, J. (1994) Helicobacter pylori (Review) Eur. J. Clin. Invest. 24: 501-510).
В международной публикация WO 00/67035, которая включена в настоящий документ в качестве
ссылки, раскрыт способ оценки риска развития пептической язвы путем количественного определения
концентрации сывороточного пепсиногена I и сывороточного гастрина-17 и сравнения полученных величин с выбранными пороговой и стандартной величинами. Полученные таким способом результаты
делают возможной оценку вероятного риска развития пептической язвы.
Специалистам известны способы измерения концентраций различных объектов анализа, и для данной цели также продаются наборы. Некоторые примеры способов для осуществления указанных измерений описаны в международной публикации WO 96/15456.
Сущность изобретения
Согласно настоящему изобретению было установлено, что возможно выявление риска развития заболеваний, связанных с кислотой желудка, у субъекта путем определения содержания пепсиногена I,
маркера инфекции Helicobacter pylori и гастрина-17, конкретно, содержания гастрина-17 натощак. Если
оно основано на пепсиногене I и маркере Нр, можно сделать заключение, что указанный субъект имеет
неатрофированную и негастритную (неинфецированную Н.pylori) слизистую оболочку желудка, т.е., содержание пепсиногена I превышает пороговую величину, указывающую на здоровый corpus mucosa, и
то, что у субъекта нет инфекции Helicobacter pylori, например, путем выявления низкого титра антител
-1-
007003
против Helicobacter pylori; низкое содержание гастрина-17 натощак является показателем чрезмерно кислого желудка и повышенного риска у субъекта развития заболевания, связанного с кислотой, такого как
заболевания, указанные выше.
В работе, которая привела к настоящему изобретению, можно было установить, что низкий уровень
гастрина-17 в состоянии натощак (G-17fast) в сыворотке крови (<1 пмоль/л) является показателем чрезмерно кислого желудка (выработка кислоты постоянно высокая); при этом внутрижелудочная концентрация Н+ ингибирует высвобождение гастрина-17 из антральных гастриновых клеток в желудке. Сывороточные уровни гастрина-17 представляют собой непрямой маркер кислотности желудка у субъектов с
нормальной и здоровой слизистой оболочкой желудка, т.е. нет антител против Helicobacter pylori и сывороточный пепсиноген I в норме.
Было установлено, что низкая величина в сыворотке крови гастрина-17 в состоянии натощак является показателем по меньшей мере 2-кратного повышения риска развития заболеваний, связанных с кислотой, из которых можно упомянуть, например, синдром желудочно-пищеводного рефлюкса (включая
варианты болезни с язвами и полипами кардиального отдела), пищевод Барретта, язвенную болезнь двенадцатиперстной кишки, не связанную с инфекцией Н.pylori, и синдром желудочно-пищеводного рефлюкса, который развивается после уничтожения инфекции Н.pylori.
Конкретно, настоящее изобретение относится к способу выявления риска развития заболевания,
связанного с желудочной кислотой, у субъекта, основанному на изучении объектов анализа пепсиногена
I, гастрина-17 в состоянии натощак и маркера инфекции Helicobacter pylori (Нр-маркера); указанный способ включает
- определение концентрации пепсиногена I, гастрина-17 в состоянии натощак и концентрации или
присутствия Нр-маркера в образце, взятом у указанного субъекта, и
- сравнение определенных таким способом величин с выбранной пороговой величиной для каждого
объекта анализа, в результате чего величина пепсиногена I, равная или превышающая его соответствующую пороговую величину, вместе с величиной Нр-маркера менее его соответствующей пороговой величины, в комбинации с величиной гастрина-17 в состоянии натощак, равной или менее его соответствующей пороговой величины, является показательной в отношении повышенного риска развития заболевания, связанного с желудочной кислотой, у указанного субъекта.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу, который делает возможной идентификацию субъекта, имеющего повышенный риск развития заболевания, связанного с кислотой, примеры
которого приведены выше, а также риск связанного с ним развития аденокарциномы.
Указанный способ можно, таким образом, использовать в качестве непрямого теста на кислотность
желудка у субъекта, с использованием образца, такого как образец крови, сыворотки или плазмы.
Подробное описание изобретения
Согласно настоящему изобретению, способ сравнения измеренной величины с пороговой величиной объекта анализа имеет целью выяснение факта - больше, равна или меньше измеренная величина
объекта анализа соответствующей пороговой величины.
В контексте настоящего изобретения индивидуум или субъект означает млекопитающее, такое как
человек или животное, такое как домашнее животное, например собака.
Настоящее изобретение, таким образом, включает первую стадию способа определения по меньшей
мере маркера Helicobacter pylori, пепсиногена I (PGI) и гастрина-17 в состоянии натощак в образце, который подвергается анализу, взятом у субъекта.
Маркер или индикатор инфекции Helicobacter pylori может, таким образом, согласно настоящему
изобретению, представлять собой антитело против Helicobacter pylori, содержание которого можно измерить в образце биологической жидкости. Выгодно, если указанным образцом является образец сыворотки крови, но он также может представлять собой образец слюны, мочи или слезной жидкости, например
доступны коммерческие наборы для измерения содержания антител. Пороговую величину для антител
против Helicobacter pylori может легко определить специалист. В одном варианте осуществления настоящего изобретения заявители использовали величину 30 EIU в качестве пороговой величины, как индикаторы наличия или отсутствия инфекции Helicobacter pylori. Специфичные антитела против Helicobacter pylori можно определять также с помощью анализа вестерн-блот.
Другой альтернативой является оценка наличия инфекции Helicobacter pylori посредством определения наличия самого антигена. Указанное измерение можно осуществить, например, анализом образца
стула пациента, и с данной целью можно использовать такие коммерчески доступные анализы как иммуноферментные анализы (сравни, например, Lancet 1999; 354, 30-33). Возможно также определить наличие антигена в выдыхаемом пациентом воздухе с использованием хорошо известной методики измерения содержания диоксида углерода, образование которого из меченой мочевины катализируется бактериями Helicobacter pylori, и системы для данного анализа также имеются в продаже (например,
Heliprobe™ от компании Noster АВ, Швеция). Другой альтернативой является определение наличия или
отсутствия антигена в биоптате, взятом у пациента во время гастроскопии. При данной альтернативе тесты являются положительными или отрицательными на предмет наличия антигена, и наличие антигена
принимаются как показатель присутствия инфекции Helicobacter pylori. В контексте настоящего изобре-2-
007003
тения, когда Нр-маркер представляет собой сам антиген, тест является положительным или отрицательным, а пороговая величина для инфекции, будучи границей раздела между указанными результатами,
может, таким образом, приниматься за нулевое значение; положительный тест указывает на наличие антигена и, следовательно, патологическое состояние, а отрицательный тест представляет собой величину
ниже пороговой для данного маркера.
Пепсиноген и гастрин предпочтительно определяют в образце биологической жидкости, особенно в
образце сыворотки, плазмы или цельной крови или в образце мочи, слюны или слезной жидкости.
Способ включает измерение объекта анализа пепсиногена I, но, согласно варианту осуществления
настоящего изобретения, возможно также, помимо этого, измерение концентрации объекта анализа пепсиногена II (PGII), и, используя соотношение PGI и PGII вместо PGI или вдобавок к нему, в качестве величины, предназначенной для сравнения с заранее определенной пороговой величиной. Пепсиноген I, а
также соотношение пепсиногенов I и II, имеют тенденцию линейно уменьшаться по мере утяжеления
атрофии corpus mucosa.
В способе по настоящему изобретению используется пороговая величина для пепсиногена I, которая представляет собой нормальную пороговую величину для того, чтобы дифференцировать нормальный и атрофический corpus mucosa. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения,
который дает надежные результаты, используется пороговая величина для сывороточного или плазменного пепсиногена I≥50 мкг/л. Указанная величина несколько превышает обычно используемую пороговую величину 25 мкг/л, и ее можно использовать, чтобы гарантировать, что у обследуемого субъекта с
определенностью имеется неатрофированная слизистая оболочка. Верхняя стандартная граница для сывороточного или плазменного пепсиногена I составляет порядка 130 мкг/л, в то время как величина,
близкая к верхней границе или превышающая ее, может использоваться для подтверждения повышенного риска развития заболевания. Однако специалист может легко выбрать пороговую величину для использования в конкретной ситуации и конкретной обследуемой популяции.
Подобно этому, для гастрина можно определить пороговую величину, и согласно настоящему изобретению определяют гастрин-17 в состоянии натощак. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения пороговая величина для гастрина-17 в состоянии натощак ≤1 пмоль/л, как было
установлено, является подходящей для большинства целей. Такая величина также, как было установлено,
является эффективной для того, чтобы отличать субъектов с повышенным риском развития от субъектов,
не имеющих риска развития и наличия заболевания, связанного с кислотой, определенного выше.
Концепция пороговых величин в анализах, включающих определение концентраций объектов анализа, хорошо известна специалистам. Пороговая величина обычно означает величину или пределы величин, выбранные в качестве границы между стандартными величинами (нормальными величинами) и отклоняющимися от нормы величинами для рассматриваемого анализа. Подобные пороговые величины
является специфичными для конкретного метода и зависят от специфичности и чувствительности, выбранных для метода анализа, используемого для определения концентраций объектов анализа; см, например, William J. Marshall, Clinical Chemistry, третье издание, 1995 г., Mosby.
Как было упомянуто ранее, способы измерения пепсиногена I, необязательно пепсиногена II и гастрина-17 хорошо известны специалистам. Измерения обычно представляют собой иммунологические методики с использованием моно- или поликлональных антител против указанных объектов анализа.
Способы обнаружения для использования включают, например, измерение поглощения, флюоресценции или люминесценции. Возможно также проведение всех трех измерений объектов анализа одновременно, например, на одном и том же микропланшете в различных лунках или в одной и той же его
лунке, что обеспечивает особенно удобный способ.
Как было упомянуто ранее, существуют также коммерчески доступные наборы для измерения концентраций различных объектов анализа, такие как GastroPanel (Biohit Oyj, Хельсинки, Финляндия) для
измерения, помимо прочего, пепсиногена I, гастрина-17 и антител против Helicobacter pylori в образце
крови. Данные - измерения затем можно оценить с использованием компьютерных программ, таких как
программа Gastrosoft®, которая ставит диагноз и дает рекомендации по дальнейшему лечению на основе
результатов, полученных для концентраций объектов анализа.
Подробное описание рисунков
На рисунках фиг. 1 показывает уровень гастрина-17 в состоянии натощак для Барреттотрицательных и Барретт-положительных пациентов с нормальным желудком. Из результатов можно
видеть, что среди Барретт-положительных пациентов 55% имеют величину гастрина-17 в состоянии натощак, равную или менее 1 пмоль/л, в то время как только 33% Барретт-отрицательных пациентов имеют
столь низкую величину гастрина-17. Разница является статистически достоверной. Таким образом, гастрин-17 в состоянии натощак является маркером, отличающим субъектов, имеющих риск развития заболевания, связанного с кислотой, от субъектов, не имеющих риска развития заболевания, связанного с
кислотой, в группе субъектов с нормальным желудком.
Фиг. 2 показывает уровень гастрина-17 в состоянии натощак для Барретт-отрицательных и Барреттположительных пациентов с нормальным желудком, и
-3-
007003
фиг. 3 показывает соответствующие уровни для гастрина-17 в состоянии после приема пищи (стимулированного гастрина-17). Очевидно, что гастрин-17 в состоянии натощак дает статистически достоверную разницу между Барретт-отрицательными и Барретт-положительными пациентами, в то время как
это не верно для гастрина-17 в состоянии после приема пищи.
Экспериментальные тесты
Результаты, показанные на фиг. с 1 по 3, основаны на следующих тестах.
Исследованный материал состоял из 300 пациентов с гастродиспепсией, проходивших эндоскопию.
Их отбирали проспективно, и сформировали две группы пациентов. Тест-группы составляли из 15 пациентов с гистологически и эндоскопически верифицированным диагнозом классического длинного сегмента Барретта. Из них 15 имели нормальную и здоровую слизистую оболочку желудка, как было определено по отсутствию гастрита, вызванного Н.pylori (титр антител IgG против Н.pylori составлял <30
EIU),и нормальному (≥50 мкг/л) сывороточному уровню пепсиногена I. У них также наблюдалась нормальная гистология эндоскопически полученных биоптатов из антрального отдела и тела желудка. Контроли (126 пациентов) состояли из пациентов, не имевших пищевода Барретта и антител против Н.pylori,
и с нормальным сывороточным пепсиногеном I. Указанные две группы (тест-группы и контроли) сравнивались между собой.
Средний уровень амидированного гастрина-17 в состоянии натощак (G-17fast) был достоверно
(Р=0,045 по критерию Манна-Уитни) у пациентов ниже, чем у контролей (4,0±6,1 пмоль/л по сравнению
с 2,0±3,0 пмоль/л). С другой стороны, не наблюдалось разницы между тест-группами и контролями по
уровням G-17 после приема пищи (G-17prand). Вместо этого, у пациентов с пищеводом Барретта G17prand был слегка выше, чем у контролей (15,7±18,2 пмоль/л по сравнению с 13,4±18,2).
В случае, когда 1 пмоль/л принимали за пороговую величину, 6 из 11 пациентов с пищеводом Барретта (55%) имели уровень G-17fast ниже данной пороговой величины, в то время как частота этих случаев у контролей оставляла 29 из 126 (23%) (Р<0,05; критерий хи-квадрат).
Имелось также 5 пациентов с язвой двенадцатиперстной кишки (DU), которая наблюдалась в сочетании со здоровой, нормальной слизистой оболочкой желудка (этиологией язвы у указанных пациентов
является применение НПВЛС или аспирина, помимо нормальной или высокой выработки кислоты). Сывороточный уровень G-17fast у указанных 5 пациентов с DU был крайне низок (0,458±0,431 пмоль/л);
т.е., достоверно ниже, чем у соответствующих контролей, не имеющих DU и пищевода Барретта.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ выявления риска развития синдрома рефлюкса или пищевода Барретта у субъекта, основанный на определении содержания пепсиногена I, гастрина-17 натощак и маркера инфекции Helicobacter pylori (Нр-маркера), причем указанный способ предусматривает
определение концентрации пепсиногена 1, гастрина-17 натощак и концентрации или присутствия
Нр-маркера в образце, взятом у указанного субъекта, и
сравнение определенных таким способом величин с выбранной пороговой величиной для каждого
объекта анализа, в результате чего содержание пепсиногена I, равное или превышающее его соответствующую пороговую величину, вместе с величиной Нр-маркера менее его соответствующей пороговой
величины, в комбинации с содержанием гастрина-17 натощак, равным или меньшим его соответствующей пороговой величины, свидетельствуют о повышенном риске развития заболевания, связанного с
кислотностью желудка, у указанного субъекта.
2. Способ по п.1, в котором маркер Helicobacter pylori представляет собой антитело против Helicobacter pylori, концентрацию которого измеряют в образце.
3. Способ по п.1, в котором маркер Helicobacter pylori представляет собой антиген Helicobacter pylori, наличие которого определяют в образце.
4. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором дополнительно измеряют содержание
стимулированного гастрина-17 (G-17st).
5. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором дополнительно измеряют концентрацию
пепсиногена II (PGII) и для сравнения рассчитывают соотношение PGI/PGII.
6. Способ по п.2, в котором содержание объектов анализа измеряют в биологической жидкости, такой как образец сыворотки крови, плазмы крови, цельной крови, мочи, слюны или слезной жидкости,
особенно образец сыворотки крови.
-4-
007003
Фиг. 1
Фиг. 2
-5-
007003
Фиг. 3
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
-6-