Клеточные биотехнологии в эндокринологии
advertisement
Учебное пособие Малышев И.Ю., Филатов О.Ю., Иванова Е.О. Синтез рекомбинантного инсулина Синтез рекомбинантных гонадотропинов Синтез гормона роста Синтез инсулина бактериальными клетками Получение инсулина из клеток дрожжей. Модификация нормального человеческого инсулина Селекция бактерий, содержащи х рекомбина нтные гены Пятый этап Введение вектора в бактерию Четвертый этап Помещени е гена гормона в вектор Третий этап Получение гормона Второй этап Первый этап Стадии биотехнологического процесса Синтез рекомбина нтного гормона бактериям и Методы получения гена гормона Выделение из нативной ДНК Синтез по матрице выделенной РНК Химический синтез ДНК В качестве вектора используют плазмиды – кольцевидные самореплицирующиеся нехромосомные формы организации ДНК, присутствующая в большинстве бактерий 1. разрезание ДНК «молекулярными ножницами» рестриктазами 2. «пришивание» гена ДНК-лигазой Бактерии, содержащ ие ген инсулина размножа ются и продуциру ют инсулин Отщеплен ие спейсера Пятый этап Отщеплен ие прорегиона в аппарате Гольджи дрожжей Четвертый этап Отщеплен ие пререгиона в ЭПР дрожжей Третий этап Добавлени е лидерной последоват ельности к гену инсулина Второй этап Первый этап Стадии биотехнологического процесса Секреция рекомбина нтного гормона дрожжами Особенностью биосинтеза инсулина в клетках дрожжей является необходимость добавления к гену, кодирующему инсулин, лидерной последовательности, благодаря которой и становится возможным осуществление посттрансляционных модификаций «объединенного» белка. С этой целью наиболее часто используется препролидерная последовательность -фактора дрожжей Присоединенная к гену инсулина препролидерная последовательность -фактора опосредует в дальнейшем его транслокацию в ЭПР, а оттуда – в аппарат Гольджи. В ЭПР сигнальная пептидаза отщепляет пре-регион лидерной последовательности, а в аппарате Гольджи эндопротеаза Kex2 отщепляет ее про-регион. Далее дипептидиламинотрансфераза, кодируемая геном STE13, отщепляет от белка пептидный спейсер, после чего гетерологичный белок (инсулин) высвобождается в межклеточное пространство Аналоги инсулина Аналоги инсулина короткого действия Аналоги инсулина длинного действия • реверсия пролина в 28 позиции и лизина в 29 позиции В-цепи Инсулин лизпро • замена пролина в 28 позиции В-цепи на аспарагиновую кислоту Инсулин аспарт • элонгация С-конца В-цепи добавлением двух остатков аргинина, и замена аспарагина в 21 позиции А-цепи на глицин Инсулин гларгин • ацилирование инсулина по остатку лизина в 29 позиции В-цепи Инсулин детемир Выращивани е клона клеток СНО, содержащих гены ФСГ Четвертый этап Введение вектора в клетки CHO (яичников китайского хомячка, Chinese hamster ovary) Третийэтап Помещение генов ФСГ в вектор Второй этап Первый этап Стадии биотехнологического процесса Секреция рекомбинант ного гормона клетками СНО Аликвоту выбранного клона CHO-клеток выращивают в колбе, называемой «Т-flask», потом переносят в роллерные колбы и содержат там в течение 36 дней. ФСГпродуцирующие клетки помещаются в микроячейки биореактора на время до 3-х мес, перфузируемые раствором, содержащим ростовые факторы. Супернатант собирают, содержат при температуре 4ºС до момента очистки и затем выделяют из него рекомбинантный ФСГ. Введение гена СТГ в плазмиду Перенос гена вектором в непатоген ные штаммы кишечной палочки и синтез ими гормона Шестой этап Объединен ие обоих фрагменто вв гибридны й «синтетич ескинатуральн ый» ген СТГ Пятый этап Синтезир уют фрагмент ДНК, кодирую щий первые 23 а/к гормона и и содержащ ий кодон ATG Четвертый этап С помощью рестрикт азы HaeIII получают фрагмент, кодирую щий последов ательнос ть 24-191 а/к гормона роста Третийэтап Ген, кодирую щий СТГ, получаю т обратно й транскр ипциейм атрично й РНК, взятой из гипофиз Второй этап Первый этап Стадии биотехнологического процесса Диабет и клеточная трансплантация Диабет и стволовые клетки Трансфекция (перенос) гена человеческого инсулина с глюкозочувствительным промотором в неинулинпродуцирующие клетки с последующей аутологичной их трансплантацией Выделение ОЛ из ткани донорской ПЖ •Разрушение ткани ПЖ энзиматически (либераза) и механически с последующим центрифугированием Введение ОЛ в воротную вену •ОЛ образуют микроэмболы в синусоидах печени Приживление ОЛ в ткани печени •В печени в ОЛ прорастают капилляры и устанавливается нормальное кровоснабжение • Основные этапы получения ОЛ: 1) выбор донора и изоляция ЩЖ, 2) хранение и транспортировка ЩЖ в двухслойной среде, 3) обработка ЩЖ коллагеназой и ее разрушение в камере Рикорди, 4) изоляция и очистка ОЛ из ткани ПЖ Решение проблемы иммунного отторжения трансплантата ОЛ Снижение иммуногенности трансплантата Изоляция трансплантируемых клеток мембраной (альгинатные микрокапсулы) Генетическая инженерия клеток трансплантата (введение gp19К или bcl-2) Подавление иммунного ответа иммуносупрессоры Эмбриональные стволовые клетки • формирование «эмбриоидного тела» • культивирование ЭСК в адгезивной среде • создание гибридных стволовых клеток Стволовые клетки из поджелудочной железы • полипотентные стволовые клетки (нестинэкспрессирующие мезенхимальные клетки в ОЛ) Стволовые клетки иного происхождения • костномозговые стволовые клетки • культуры моноцитов крови Описаны эксперименты, в которых удалось «заставить» мышиные ЭСК дифференцироваться в инсулинсекретирующие структуры, напоминающие ОЛ. ЭСК взяли из внутренней клеточной массы бластулы и культивировали их так, что сформировались эмбриоидные тела. Затем из этих эмбриоидных тел была выделена популяция клеток, экспрессирующая маркер нестин. Затем, используя сложную пятистадийную технику культивирования, индуцировали клетки к формированию ОЛподобных структур, секретирующих инсулин в ответ на повышение концентрации глюкозы. При инъекции мышам с диабетом, эти клетки оставались жизнеспособными и продолжали секретировать инсулин. Lumelsky, N., Blondel, O., Laeng, P., Velasco, I., Ravin, R., and McKay, R. (2001). Differentiation of Embryonic Stem Cells to Insulin-Secreting Structures Similiar to Pancreatic Islets. Science. 292, 1389–1394. помещение гена человеческого инсулина с глюкозочувств ительным промотором в вектор (плазмиды, вирусы: Герпес I типа, ВИЧ, аденовирусы) введение вектора в неинсулинпро луцирующие клетки трансплантац ия модифицирова нных вектором клеток, секретирующи х инсулин компьютерно е моделировани яе геометрии стромальнососудистого каркаса щитовидной железы конструкция стромально=с осудистого каркаса с использовани ем полиэфиров гидроксикисл от, эфиров гиалуроновой кислоты, молекул коллагена I типа выделение и культивирова ние жизнеспособн ых пролифериру ющих тиреоцитов заселение тиреоцитов в стромальнососудистый каркас в компании с эндотелиальн ососудистыми клеткамипредшественн иками (предварител ьно культивирова нными в присутствие определенных ростовых факторов)
