ЕВРАЗИЙСКИЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ (ЕАСС)
advertisement
ЕВРАЗИЙСКИЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ (ЕАСС) EURO-ASIAN COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION (EASC) ГОСТ М Е Ж ГО СУ Д А РС Т В Е Н Н Ы Й С Т АН Д АР Т (проект, RU, первая редакция) КАРАНТИН РАСТЕНИЙ Методы выявления и идентификации картофельных цистообразующих нематод Настоящий проект стандарта не подлежит применению до его принятия Москва Стандартинформ ГОСТ (проект RU, первая редакция) Предисловие Евразийский совет по стандартизации, метрологии и сертификации (ЕАСС) представляет собой региональное объединение национальных органов по стандартизации государств, входящих в Содружество Независимых Государств. В дальнейшем возможно вступление в ЕАСС национальных органов по стандартизации других государств. Цели, основные принципы межгосударственной и основной стандартизации порядок установлены проведения в работ ГОСТ по 1.0—92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и в настоящем стандарте. 1 РАЗРАБОТАН федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский центр карантина растений» (ФГБУ «ВНИИКР») 2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии 3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации За принятие стандарта проголосовали: Краткое наименование Код страны по Сокращенное наименование страны по МК (ИСО 3166) национального органа МК (ИСО 3166) 004—97 004—97 по стандартизации Азербайджан AZ Азстандарт Армения AM Минэкономики Республики Армения Беларусь BY Госстандарт Республики Беларусь Казахстан KZ Госстандарт Республики Казахстан Кыргызстан KG Кыргызстандарт Молдова MD Молдова-Стандарт Российская Федерация RU Росстандарт Таджикистан TJ Таджикстандарт Узбекистан UZ Узстандарт Украина UA Госпотребстандарт Украины 4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ II ГОСТ (проект RU, первая редакция) Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных (государственных) стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации. В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация также будет опубликована в сети Интернет на сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге «Межгосударственные стандарты». Исключительное право официального опубликования настоящего стандарта на территории указанных выше государств принадлежит национальным органам по стандартизации этих государств. III ГОСТ (проект RU, первая редакция) Содержание 1 Область применения 2 Нормативные ссылки 3 Термины и определения 4 Правила отбора проб и пересылки образцов 4.1 Общие правила 4.2 Правила отбора проб 4.3 Правила пересылки образцов 5 Требования к аппаратуре и материалам 6 Методы выделения цист из почвы 6.1 Выделение цист с помощью цистовыделителя 6.2 Выделение цист с помощью сосудов 6.3 Анализ клубней 6.4 Определение степени зараженности почвы 7 Методы определения жизнеспособности яиц и личинок 7.1 Общие правила 7.2 Визуальный метод 7.3 Метод окрашивания 8 Правила приготовления препаратов для идентификации 8.1 Общие правила 8.2 Правила приготовления временных препаратов 8.3 Правила приготовления постоянных препаратов 9 Правила идентификации по морфологическим признакам 10 Правила проведения идентификации молекулярными методами 10.1 Общие положения 10.2 Классический анализ на основе полимеразной цепной реакции 10.3 Флуоресцентный анализ на основе полимеразной цепной реакции 10.4 Праймеры для проведения анализа на основе полимеразной цепной реакции Приложение А (справочное) Общие сведения о золотистой Globodera rostochiensis и бледной Globodera pallida картофельных цистообразующих нематодах Приложение Б (справочное) Иллюстрации для идентификации золотистой Globodera rostochiensis и бледной Globodera pallida картофельных цистообразующих нематод по морфологическим признакам IV ГОСТ (проект RU, первая редакция) Приложение В (обязательное) Схема идентификации золотистой Globodera rostochiensis и бледной Globodera pallida картофельных цистообразующих нематод Приложение Г (справочное) Определитель основных групп цистообразующих нематод Приложение Д (справочное) Определитель видов рода Globodera Приложение Е (обязательное) Форма заполнения рабочего протокола анализа на основе полимеразной цепной реакции V ГОСТ (проект RU, первая редакция) МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ КАРАНТИН РАСТЕНИЙ Методы выявления и идентификации картофельных цистообразующих нематод 1 Область применения Настоящий стандарт устанавливает методы выявления и идентификации золотистой Globodera rostochiensis (Woll.) Behrens и бледной Globodera pallida (Stone) Behrens картофельных цистообразующих нематод (далее – картофельные цистообразующие нематоды) в почве и сельскохозяйственной продукции. П р и м е ч а н и е – Общие сведения о картофельных цистообразующих нематодах приведены в приложении А. 2 Нормативные ссылки В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие межгосударственные стандарты: ГОСТ 1077−79 Горелки однопламенные универсальные для ацетилено-кислородной сварки, пайки и подогрева. Типы, основные параметры и размеры и общие технические требования ГОСТ 1625−89 Формалин технический. Технические условия ГОСТ 1770−74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия ГОСТ 3164−78 Масло вазелиновое медицинское. Технические условия ГОСТ 6259−75 Реактивы. Глицерин. Технические условия ГОСТ 6672−75 Стекла покровные для микропрепаратов. Технические условия ГОСТ 6709−72 Вода дистиллированная. Технические условия ГОСТ 9284−75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия Проект, первая редакция 1 ГОСТ (проект RU, первая редакция) ГОСТ 12026−76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия ГОСТ 12430−66 Продукция сельскохозяйственная. Методы отбора проб при карантинном досмотре и экспертизе ГОСТ 18300−87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия ГОСТ 20562−75 Карантин растений. Термины и определения ГОСТ 21240−89 Скальпели и ножи медицинские. Общие технические требования и методы испытаний ГОСТ 21507−81 Защита растений. Термины и определения ГОСТ 23932−90 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия ГОСТ 29227−91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования П р и м е ч а н и е – При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов на территории государства по соответствующему указателю стандартов, составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт изменен, то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться измененным стандартом, а при замене на другой стандарт – стандартом, действующим вместо настоящего стандарта. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку. 3 Термины и определения В настоящем стандарте организации применены термины по ГОСТ 20562 и ГОСТ 21507, а также следующие термины в соответствии с определениями: 3.1 амплификация: Избирательное копирование определенного участка ДНК. 3.2 буфер: Раствор с определенной устойчивой концентрацией водородных ионов. 3.3 вакуолизация: Заполнение пузырьками воздуха тела погибшей личинки. 3.4 супернатант: Жидкость, находящаяся над осадком. 3.5 флуоресценция: Физический процесс, разновидность люминесценции. 3.6 циста: Зрелая, неподвижная самка округлой формы, покрытая утолщенной кутикулярной оболочкой, устойчивой к гниению и защищающей личинок и яйца от внешних неблагоприятных воздействий. 2 ГОСТ (проект RU, первая редакция) 4 Правила отбора проб и пересылки образцов 4.1 Общие правила 4.1.1 Общими признаками поражения картофельными цистообразующими нематодами посадок картофеля являются участки растений со слабым ростом, увяданием, пожелтением и отмиранием листвы, в результате чего уменьшается размер клубней. 4.1.2 Для визуальной проверки на присутствие цист картофельных цистообразующих нематод на корнях растения выкапывают или берут образец почвы для тестирования. 4.1.3 Молодые самки и цисты картофельных цистообразующих нематод видны невооруженным глазом как крошечные белые, желтые или коричневые шарики на поверхности корня. 4.1.4 Отбор проб и образцов картофельных нематод проводят по ГОСТ 12430, а также с использованием методических указаний по отбору проб от подкарантинной продукции, которые установлены государственными органами исполнительной власти в области сельского хозяйства стран, указанных в предисловии. 4.2 Правила отбора проб 4.2.1 На каждом приусадебном или садовом участке по равномерной сетке отбирают 50 выемок почвы объемом около 5 см3 каждая. Выемки соединяют в один средний образец объемом 250 см3, который ссыпают в полиэтиленовый пакет или мешочек из плотной ткани, снабжают этикеткой и направляют в лабораторию для анализа. 4.2.2 На каждом гектаре поля севооборота отбирают 200 выемок объемом около 5 см3 каждая, из которых составляют четыре средних образца почвы. Это соответствует распределению точек взятия выемок по сетке с расстоянием около 6 м между продольными линиями и 7 м между поперечными. Средние образцы нумеруют согласно схеме отбора проб и снабжают этикеткой. 4.2.3 При обследовании семеноводческих хозяйств, а также для определения эффективности обеззараживания почвы и снятия карантина необходимо отбирать на каждом гектаре восемь средних образцов почвы, каждый из которых должен состоять из 50 выемок почвы. На обследуемом участке выемки берут по равномерной квадратной или прямоугольной сетке так, чтобы на каждую выемку приходилась одинаковая по размеру площадь. Крайние ряды располагают на расстоянии от 0,5 до 2,0 м от границы поля. 3 ГОСТ (проект RU, первая редакция) 4.2.4 Почву отбирают почвенным буром (щупом) или ботаническим почвенным совком. При переходе с одного участка на другой, инструменты, а также обувь необходимо тщательно очищать от приставшей к ним почвы. 4.2.5 Нормы выработки на одного обследователя при ручном отборе составляют от 15 до 20 средних образцов в день на индивидуальных и приусадебных участках и от 30 до 40 средних образцов на полях хозяйств. 4.3 Правила пересылки образцов 4.3.1 Для пересылки образов пробы почвы должны быть доведены до воздушносухого состояния. 4.3.2 При пересылке образцов для анализа в карантинную лабораторию должны быть приняты меры предосторожности, исключающие высыпание почвы из упаковки. Мешочки с пробами должны быть хорошо завязаны и уложены в целые мешки. Каждый мешок сопровождают списком проб, находящихся в нем. Копия списка остается у руководителя обследования. 5 Требования к аппаратуре и материалам 5.1 Для проведения анализа по идентификации картофельных цистообразующих нематод применяют следующую аппаратуру и материалы: - цистовыделитель; - сита лабораторные по национальным стандартам стран, указанных в предисловии; - конические колбы по ГОСТ 23932; - стерео микроскоп с увеличением в 50 раз; - микроскоп с увеличением в 400 раз; - стекло предметное для микропрепаратов по ГОСТ 9284; - стекло покровное для микропрепаратов по ГОСТ 6672; - бумагу фильтровальную лабораторную по ГОСТ 12026; - пробирки по ГОСТ 1770 и ГОСТ 23932; - скальпель медицинский по ГОСТ 21240; - спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300; - пипетки градуированные по ГОСТ 29227; - препаровальные иглы; - горелку однопламенную универсальную по ГОСТ 1077; 4 ГОСТ (проект RU, первая редакция) - штативы для пробирок на 0,5 мл; - микропробирки одноразовые на 0,5 мл; - пестик-гомогенизатор для микропипеток на 1,5 мл; - пипетки автоматические переменного объема; - наконечники одноразовые для микропипеток с аэрозольным барьером; - термостат четырехканальный программируемый; - термоциклер четырехканальный программируемый; - центрифугу для микропробирок; - микроцентрифугу с функцией встряхивания; - детектор флуоресценции; - окуляр-микрометр; - объект-микрометр; - воду дистиллированную по ГОСТ 6709; - глицерин по ГОСТ 6259; - малахитовый зеленый; - масло вазелиновое по ГОСТ 3164; - масло минеральное; - агарозу; - этидий бромистый; - формалин технический по ГОСТ 1625; - ламинарный бокс; - смесь для амплификации согласно наборам производителя. 5.2 Допускается применение аналогичных средств измерения с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а реактивов по качеству не ниже указанных в 5.1. 5 ГОСТ (проект RU, первая редакция) 6 Методы выделения цист из почвы 6.1 Выделение цист с помощью цистовыделителей 6.1.1 Средний образец помещают в сосуд-смеситель, заполняют его водой до полного объема. Тяжелые минеральные частицы почвы оседают, а легкие органические и цисты по сливному желобу смываются на два сита. Верхнее сито с диаметром ячеек 2 или 3 мм задерживает крупные всплывшие частицы, а нижнее сито с диаметром ячеек 0,16 мм – мелкие частицы и цисты. Образец промывают до появления чистой воды в сливном желобе. Продолжительность промывания зависит от объема почвенного образца и механического состава почвы. 6.1.2 Осадок с нижнего сита сливают на фильтр, вложенный в воронку, и после прохождения воды на фильтре остаются цисты. 6.1.3 После каждого образца приемную воронку, сосуд-смеситель и сита тщательно промывают чистой водой. 6.2 Выделение цист с помощью сосудов 6.2.1 Предварительно просушенную пробу просеивают через крупноячеистое сито, диаметром 2 или 3 мм, и засыпают в сосуд объемом около 1 л. Почву заливают и тщательно перемешивают шпателем или стеклянной палочкой. 6.2.2 Почвы, богатые органическими веществами (например, торфянистые), перед получением водной взвеси смачивают этиловым спиртом из расчета 20 мл на 100 см 3 почвы. Полученную суспензию отстаивают в течение 1 – 2 мин. После оседания крупных неорганических частиц почвы на дно сосуда верхние две трети содержимого сливают на сита. При сливе медленно поворачивают сосуд вокруг оси, следя за полным сливом на фильтр всех всплывших на поверхность органических веществ. Осадок на ситах промывают под струей воды. Затем осадок с нижнего сита смывают на фильтр, вставленный в воронку. После стока воды фильтры просматривают под стерео микроскопом с увеличением в 50 раз. П р и м е ч а н и е − Основная масса цист располагается по наружному краю фильтра. 6 ГОСТ (проект RU, первая редакция) 6.3 Анализ клубней 6.3.1 Анализ клубней картофеля и других корнеплодов на приставшие к ним цисты проводят с помощью цистовыделителей. При этом используют большие приемные воронки вместимостью от 8 до 10 л. Воронку снабжают крупноячеистым ситом, которое заполняют клубнями и устанавливают над сосудом-смесителем. Промывают картофель струей воды. Весь последующий анализ проводят согласно 6.1. 6.3.2 При отсутствии цистовыделителя клубни моют в любой емкости, а смыв сливают на сита. Осадок с нижнего сита фильтруют через воронку с фильтром. Фильтры просматривают под стерео микроскопом с увеличением в 50 раз и выбирают цисты для определения жизнеспособности личинок. 6.4 Определение степени зараженности почвы 6.4.1 Степень зараженности почвы картофельными цистообразующими нематодами определяют количеством личинок и яиц, содержащихся во всех цистах, выделенных из 100 см3 почвы. Эти сведения нужны для планирования различных мероприятий по борьбе с картофельной нематодой и определения их эффективности. 6.4.2 Цисты, выделенные из 100 см3 анализируемого образца, собирают в каплю дистиллированной воды на конце предметного стекла. Для сбора используют скальпель. Эту каплю закрывают концом другого предметного стекла, тем самым раздавливая цисты между ними. Содержимое смывают со стекол в химический стакан, где уровень воды доводят до 100 мл. Взвесь личинок в стакане в течение 1 – 2 мин перемешивают продуванием через пипетку или гомогенизатором при скорости вращения от 3000 до 5000 об/мин. Сразу же после продувания, не прекращая перемешивания, из стакана мерной пипеткой отбирают четыре пробы по 1 мл каждая, которые помещают в четыре ячейки счетной камеры. Подсчитав среднее количество личинок и яиц в 1 мл взвеси, рассчитывают содержание их в 100 мл. 6.4.3 Степень зараженности почвы картофельными цистообразующими нематодами характеризуется следующими значениями: - свыше 5000 личинок в 100 см3 почвы – высокая степень зараженности почвы; - до 5000 « « – средняя « « ; - менее 1000 « « – низкая « « . 7 ГОСТ (проект RU, первая редакция) 7 Методы определения жизнеспособности яиц и личинок 7.1 Общие правила Для решения вопроса о наложении или снятии карантина с очага, а также определения эффективности мероприятия, примененного в борьбе с картофельными цистообразующими нематодами, необходимо знать не только о наличии цист в почве, но и о жизнеспособности яиц и личинок. Карантин накладывают только при наличии жизнеспособных яиц и личинок в обнаруженных цистах. 7.2 Визуальный метод 7.2.1 Для того, чтобы определить жизнеспособность яиц и личинок картофельных цистообразующих нематод, цисты разрезают и вычищают их содержимое в каплю воды на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом с увеличением не менее чем в 400 раз. 7.2.2 Жизнеспособные личинки имеют типичную червеобразную форму тела и ненарушенную структуру внутренних органов (см. рисунок Б.1, приложение Б). Мертвые личинки часто имеют изогнутое, с резкими перегибами тело, для них характерна более резкая зернистость пищевода и вакуолизация внутренностей (см. рисунок Б.2, приложение Б). 7.3 Метод окрашивания 7.3.1 Для определения жизнеспособности нематод методом окрашивания используют раствор малахитового зеленого в пропорции 50 мг продукта на 100 см³ дистиллированной воды. 7.3.2 На предметное стекло в каплю воды помещают цисту, раздавливают ее препаровальной иглой и рядом с ней наносят каплю 0,05%-го водного раствора малахитового зеленого. Затем капли смешивают иглой и оставляют на 5 – 10 мин. На одно стекло можно помещать отдельно одну от другой несколько капель воды с цистами, но при этом необходимо нанести еще одну каплю воды без цисты, в которой после каждого раздавливания ополаскивают иглу, и тщательно ее вытирают, чтобы предотвратить возможность перенесения личинок из одной капли в другую. 7.3.3 После этого стекло устанавливают на предметный столик микроскопа с увеличением в 400 раз и рассматривают каждую каплю в отдельности. Мертвые личинки окрашиваются в интенсивно голубовато-зеленоватый цвет, а живые не окрашиваются, или же их окраска значительно отличается от мертвых по интенсивности. 8 ГОСТ (проект RU, первая редакция) 8 Правила приготовления препаратов для идентификации 8.1 Общие правила 8.1.1 Для того чтобы правильно определить вид картофельной цистообразующей нематоды, необходимо приготовить постоянные препараты личинок и анальновульварных пластинок. П р и м е ч а н и е – Приготовление постоянных препаратов анально-вульварных пластинок является обязательным, так как они служат документальным подтверждением при обнаружении карантинных видов цистообразующих нематод. Также можно использовать в качестве документации фотографии анальновульварных пластинок, сделанные с помощью микроскопа с увеличением не менее чем в 400 раз. 8.1.2 Постоянный препарат личинок и анально-вульварных пластинок хранят в течение двух лет. 8.2 Правила приготовления временных препаратов 8.2.1 Временные микропрепараты личинок и самцов готовят из живых нематод. Их переносят в каплю воды на предметное стекло и накрывают покровным стеклом. 8.2.2 Для того чтобы прекратить движение нематод, предметное стекло слегка подогревают над пламенем спиртовой горелки, что вызывает их тепловое оцепенение. П р и м е ч а н и е − Чтобы не раздавить нематод покровным стеклом, используют предметное стекло с лункой. 8.3 Правила приготовления постоянных препаратов 8.3.1 Цисту помещают на влажную фильтровальную бумагу и с помощью медицинской иглы и скальпеля отсекают задний конец тела, на котором находятся вульва и анус. При этом цисту в области шейки придерживают препаровальной иглой. 8.3.2 Отрезанную часть осторожно очищают от яиц и переносят на предметное стекло в каплю глицерина с дистиллированной водой в соотношении 1:1. После того как наружная (выпуклая) часть пластинки будет обращена к глазу наблюдателя, пластинку накрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом с увеличением не менее чем в 400 раз. 8.3.3 Для приготовления постоянного препарата покровное стекло по периметру обводят лаком, чтобы предотвратить высыхание. 8.3.4 Препараты личинок, самцов, анально-вульварных пластинок самок или цист рассматривают под микроскопом с увеличением не менее чем в 400 раз, измеряют с помощью окуляр-микрометра и определяют, ориентируясь на различия, по точным морфологическим признакам (см. рисунки Б.3, Б.4 и Б.5, приложение Б). 9 ГОСТ (проект RU, первая редакция) 9 Правила идентификации по морфологическим признакам 9.1 Идентификацию картофельных цистообразующих нематод проводят по схеме, приведенной в приложении В. 9.2 Предварительную диагностику различных групп цистообразующих нематод осуществляют по ряду основных морфологических признаков, характерных для каждой из этих групп. Это, прежде всего, форма цисты: она может быть лимоновидная – и тогда вульварный конус имеется, или шарообразная – в этом случае вульварный конус отсутствует. По данному признаку цистообразующие нематоды делятся на три рода: род Heterodera (сюда относятся цисты лимоновидной формы), рода Globodera и Punctodera (цисты шарообразные). П р и м е ч а н и е – Основные группы цистообразующих нематод, а также характеристики видов рода Globodera описаны в кратких определителях, приведенных в приложениях Г и Д. 9.3 Основные морфологические характеристики золотистой нематоды Globodera rostochiensis и бледной нематоды Globodera pallida приведены в таблице 1. 10 ГОСТ (проект RU, первая редакция) Таблица 1 − Основные морфологические характеристики золотистой нематоды Globodera rostochiensis и бледной нематоды Globodera pallida Размеры в микрометрах Стадия развития нематод Наименование характеристики Форма базальных вздутий стилета Личинка второго возраста Самки Цисты Самцы Длина стилета Длина тела Пересечение боковых линий поперечными складками кутикулы в хвостовой части тела Цвет в период превращения в цисты Длина тела (без шеи) Ширина тела Длина шеи Диаметр фенестры Расстояние анус – фенестра Индекс Гранека Длина стилета Длина спикул Длина рулька Содержание характеристики Globodera Globodera pallida rostochiensis заострены закруглены, оттянуты спереди, назад с выемкой 21,8+0,7 23,8+1,0 469+20 486+23 не пересекают пересекают золотистый кремовый 445+50 382+61 104+19 18,8+2,2 579+70 534+50 118+20 24,5+5,0 66,5+10,3 49,9+13,4 3,6+0,8 25,8+0,9 35,5+2,8 19,3+1,5 2,1+0,9 27,5+1,0 36,3+2,8 11,3+1,6 П р и м е ч а н и е – Индекс Гранека – это расстояние от ануса до края вульварного окна, разделенное на диаметр вульварного окна. Как видно из таблицы 1, золотистая и бледная цистообразующие нематоды морфологически и морфометрически очень близки. Самые важные отличительные особенности цист могут быть получены изучением перинеальной области (например, число кутикульных складок между анусом и вульвой и индекс Гранека), а также по размерам стилета и форме базальных головок. 9.4 Самыми надежными характеристиками ювенальных особей второй стадии являются длина стилета и форма базальных вздутий (см. рисунок Б.3, приложение Б). 9.5 Важной отличительной особенностью бледной цистообразующей нематоды является то, что в процессе онтогенеза самки отсутствует золотистая стадия. Эта особенность позволяет эффективно диагностировать бледную нематоду в полевых условиях. После окончания цветения картофеля цвет самок бледной цистообразующей нематоды остается белым до конца вегетации, затем они становятся коричневыми 11 ГОСТ (проект RU, первая редакция) цистами. У золотистой цистообразующей нематоды в это время самки золотистого цвета и постепенно темнеют, превращаясь в цисту. 10 Правила проведения идентификации молекулярными методами 10.1 Общие положения Наиболее эффективным методом диагностики картофельных цистообразующих нематод является анализ на основе полимеразной цепной реакции (далее – ПЦР-анализ), основанный на различиях в строении ДНК. П р и м е ч а н и е − В настоящем стандарте рассматривают две модификации ПЦР-анализа: классический и флуоресцентный flash-ПЦР-анализ (Fluorescent Amplification-based Specific Hybridization). 10.2 Классический анализ на основе полимеразной цепной реакции 10.2.1 Пробоподготовка 10.2.1.1 Работу по выделению ДНК проводят в специальном помещении, предназначенном для пробоподготовки. При этом работу необходимо проводить в халате, одноразовых перчатках и бахилах. 10.2.1.2 Для проведения работы необходимы следующие реактивы и оборудование: - ТЕ-буфер (10 мМ TrisHCL, 1 мМ EDTA); - дезинфицирующий раствор; - штативы для пробирок на 0,5 мл; - одноразовые микропробирки для ПЦР на 0,5 мл; - пестик-гомогенизатор для микропипеток на 1,5 мл; - отдельный набор автоматических пипеток переменного объема; - одноразовые наконечники для микропипеток с аэрозольным барьером; - термостат для микропробирок; - центрифуга для микропробирок; - микроцентрифуга с функцией встряхивания. 10.2.1.3 Цисту помещают в микропробирку на 1,5 мл, добавляют 40 мкл ТЕ-буфера и растирают до гомогенного состояния с помощью пестика-гомогенизатора, затем инкубируют 2 ч при температуре 60 оС. 10.2.1.4 Центрифугируют в течение 10 мин при скорости 7000 об/мин на настольной центрифуге. 10.2.1.5 Супернатант переносят в чистую пробирку и добавляют 40 мкл ТЕ-буфера. 10.2.2 Проведение анализа 12 ГОСТ (проект RU, первая редакция) 10.2.2.1 Анализ проводят в специальном, предназначенном для этого помещении. Для проведения анализа (из расчета на 50 определений) необходимы следующие реактивы и оборудование: - Taq-полимераза 5 U/µl − 50 мкл; - ПЦР-микс –1 125 мкл; - положительный контроль − 5 мкл; - вазелиновое масло − 1 000 мкл; - четырехканальный программируемый термоциклер; - ПЦР-бокс или отдельный стол, подвергающийся обработке ультрафиолетовыми лучами; - отдельный набор автоматических пипеток переменного объема; - штативы для пробирок на 0,5 см³; - одноразовые микропробирки для ПЦР на 0,5 см³; - одноразовые наконечники для микропипеток с аэрозольным барьером; - ламинарный бокс. 10.2.2.2 Работу с указанными в 10.2.2.1 реактивами необходимо проводить в халате, одноразовых защитных перчатках и бахилах. 10.2.2.3 Подготавливают пробирки на 0,5 мл для образцов, извлекают набор для проведения анализа из морозильной камеры и размораживают. 10.2.2.4 Пробирки с ферментами помещают в лед. Подготавливают в необходимом количестве смесь для амплификации из расчета на одну пробу: - ПЦР-микс в количестве 22,5 мкл; - Taq-полимеразы в количестве 0,5 мкл. 10.2.2.5 В каждую пробирку для ПЦР-анализа вносят 23 мкл реакционной смеси, 2 мкл исследуемого образца или положительного контроля. Смесь перемешивают, встряхивают капли. На смесь наслаивают одну-две капли минерального масла для ПЦР. 10.2.2.6 Пробирки помещают в амплификатор и проводят ПЦР-анализ по следующей программе, приведенной в таблице 2, используя режим активного регулирования температуры. Таблица 2 – Условия амплификации для проведения ПЦР-анализа Температура, оС 94 94 60 72 72 10 Время 2 мин 30 с 30 с 30 с 10 мин хранение Количество циклов 1 30 13 ГОСТ (проект RU, первая редакция) 10.2.3 Анализ ПЦР-продукта 10.2.3.1 После окончания реакции пробирки ставят в специальный штатив и переносят в комнату для анализа ПЦР-продуктов. 10.2.3.2 Если невозможно проанализировать ПЦР-продукт сразу, то микропробирки необходимо хранить при температуре 4 о С для анализа в этот же день или при температуре минус 18 оС более длительный срок. 10.2.3.3 Анализ продуктов амплификации проводят посредством электрофореза фрагментов ДНК в 2%-м агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием. Примечания 1 Для приготовления агарозного геля агарозу расплавляют в трис-ацетатном электрофорезном буфере (далее − ТАЕ-буфер), охлаждают до температуры от 50 оС до 60 оС, заливают в плашку для электрофореза и устанавливают гребенку. Дают гелю застыть. Далее осторожно покачивая, гребенку убирают. Плашку с гелем погружают в ванночку для электрофореза с ТАЕ-буфером так, чтобы гель был покрыт буфером на 2 – 3 мм. Капли буфера наносят на чистое предметное стекло, добавляют 12 мкл ПЦР-продукта каждого образца, положительного и отрицательного контроля, аккуратно перемешивают пипетированием перед загрузкой на гель. Затем аккуратно вносят подготовленные образцы в лунки геля. Необходимо внести ДНК-маркер как минимум в одну лунку. Затем ванночку подключают к источнику тока, устанавливают режим от 5 до 8 В/см и время так, чтобы передний край маркера доходил не далее 1 см от края геля. По окончании электрофореза напряжение отключают. Гель удаляют из плашек и помещают его на 30 – 45 мин в раствор бромистого этидия. 2 Бромистый этидий является сильным мутагеном. При работе с ним необходимо использовать защитные перчатки. 10.2.3.4 Гель промывают в течение 10 – 15 мин дистиллированной водой. Затем просматривают амплификационные фрагменты под ультрафиолетовым светом. П р и м е ч а н и е − Размер амплифицированных специфических фрагментов ДНК для Globodera rostochiensis − 434 п.н., для Globodera pallida − 265 п.н. Затем сравнивают с ДНК-маркером и положительным контролем. 10.2.3.5 Гель фотографируют и хранят в электронном и распечатанном виде. П р и м е ч а н и е − Отрицательный контроль должен быть отрицательным во всех случаях, если он положителен, анализ необходимо повторить. 10.2.4 В качестве положительного контроля используется ДНК, выделенные из цист бледной Globodera pallida и золотистой Globodera rostochiensis цистообразующих нематод. ДНК в наборе концентрированная. 14 картофельных ГОСТ (проект RU, первая редакция) Перед постановкой ПЦР ее необходимо развести в четыре раза. В качестве отрицательного контроля можно использовать дистиллированную воду или ТЕ-буфер. Результат отрицателен, если характерный фрагмент в образце не обнаружен, но обнаружен в положительном контроле. Результат положителен, если обнаружен характерный фрагмент. 10.3 Флуоресцентный анализ на основе полимеразной цепной реакции 10.3.1 Пробоподготовка 10.3.1.1 Работу по выделению ДНК проводят в специальном помещении, предназначенном для пробоподготовки. При этом работу необходимо проводить в халате, одноразовых перчатках и бахилах. 10.3.1.2 Для проведения работы необходимы следующие реактивы и оборудование: - ТЕ-буфер; - дезинфицирующий раствор; - штативы для пробирок на 0,5 мл; - одноразовые микропробирки для ПЦР на 0,5 мл; - пестик-гомогенизатор для микропипеток на 1,5 мл; - отдельный набор автоматических пипеток переменного объема; - одноразовые наконечники для микропипеток с аэрозольным барьером; - термостат для микропробирок; - центрифуга для микропробирок; - микроцентрифуга с функцией встряхивания. 10.3.1.3 Для выделения ДНК из цист на каждый образец (одну-две цисты) берут одну пробирку типа Эппендорф, добавляют микропипеткой в каждую пробирку по 40 мкл ТЕбуфера. Затем растирают пестиком вручную (на каждую пробирку отдельный пестик), использованные пестики помещают в дезинфицирующий раствор. 10.3.1.4 Проборки плотно закрывают и помещают в термостат на 5 мин при температуре 85 оС, затем каждую пробирку встряхивают на микроцентрифуге с функцией встряхивания в течение нескольких секунд и центрифугируют при скорости вращения 13000 об/мин в течение 1 мин для осаждения. 10.3.1.5 Затем вновь помещают в термостат при режиме согласно п. 10.3.1.4. В каждую пробирку добавляют по 40 мкл ТЕ-буфера. Встряхивают на микроцентрифуге с функцией встряхивания в течение нескольких секунд и центрифугируют при скорости вращения 13000 об/мин в течение 1 мин. 15 ГОСТ (проект RU, первая редакция) 10.3.1.6 На каждый образец добавляют еще по три пробирки для получения рабочего разведения − титра. Пробирки маркируют: «П», «П-1», «П-2», где «П» – произвольное наименование образца. 10.3.1.7 В пробирку с маркировкой «П» переносят 50 мкл суспензии из исходной пробирки. В пробирки «П-1» и «П-2» вносят по 45 мкл ТЕ-буфера. В процессе работы все пробирки держат закрытыми. 10.3.1.8 Из исходной пробирки берут 5 мкл суспензии и переносят в пробирку «П-1» и встряхивают на микроцентрифуге с функцией встряхивания. 10.3.1.9 Из пробирки «П-1» берут 5 мкл суспензии и переносят в пробирку «П-2». Встряхивают на микроцентрифуге с функцией встряхивания и центрифугируют при скорости вращения 13000 об/мин в течение 1 мин. 10.3.2 Проведение анализа 10.3.2.1 Анализ проводят в специальном помещении. Для проведения анализа (из расчета на 50 определений) необходимы следующее оборудование и реактивы: - смесь для амплификации, запечатанная парафином, в количестве 1000 мкл; - раствор Taq-полимеразы в количестве 500 мкл; - ПЦР-буфер (в комплектах в формате flash) в количестве 200 мкл; - минеральное масло в количестве 1 мл; - положительный контрольный образец (К+) в количестве 150 мкл; - четырехканальный программируемый термоциклер; - ПЦР-бокс или отдельный стол, подвергающийся обработке ультрафиолетовыми лучами; - отдельный набор автоматических пипеток переменного объема; - штативы для пробирок на 0,5 мл; - одноразовые микропробирки для ПЦР на 0,5 мл; - одноразовые наконечники для микропипеток с аэрозольным барьером; - ламинарный бокс. 10.3.2.2 Работу с указанными в 10.3.2.1 реактивами необходимо проводить в халате, одноразовых защитных перчатках и бахилах. 10.3.2.3 Для проведения анализа используют комплект реагентов для ПЦРамплификации ДНК Globodera rostochiensis и (или) Globodera pallida, который состоит из реакционной смеси, запечатанной парафином, ПЦР-буфера, минерального масла, раствора Taq-полимеразы, положительного контрольного образца ДНК. При этом необходимо составить и заполнить таблицу по форме, приведенной в приложении Е. 16 ГОСТ (проект RU, первая редакция) 10.3.2.4 Маркируют необходимое количество пробирок с запечатанной парафином реакционной смесью с учетом пробирок для положительного и отрицательного контролей и двух фоновых пробирок с маркировкой «Ф» для контроля фона флуоресценции. 10.3.2.5 Во все амплификационные пробирки (кроме пробирок «Ф», см. приложение Е) добавляют по 10 мкл тщательно перемешанного на микроцентрифуге с функцией встряхивания раствора Taq-полимеразы. В пробирки, маркированные «Ф», вносят по 10 мкл ПЦР-буфера. 10.3.2.6 В каждую пробирку добавляют по одной капле минерального масла, плотно закрывают пробирки. Пробирки упаковывают в полиэтиленовый мешочек и переносят в зону пробоподготовки. 10.3.2.7 Вносят в опытные пробирки 5 мкл препарата ДНК. В пробирку, маркированную «К-», вносят 5 мкл отрицательного контрольного образца, которым может являться ТЕ-буфер. В пробирку, маркированную «К+», вносят 5 мкл положительного контрольного образца ДНК. В пробирку, маркированную «Ф», вносят 5 мкл отрицательного контрольного образца (ТЕ-буфер). 10.3.2.8 Устанавливают все пробирки в блок амплификатора и проводят flash-ПЦРанализ в режиме амплификации, с учетом объема реакционной смеси 35 мкл. 10.3.3 Анализ ПЦР-продукта Анализ ПЦР-продуктов проводят в специальном помещении. Регистрацию и учет результатов ПЦР-амплификации ДНК проводят с помощью ДНК, согласно инструкции к этому прибору. П р и м е ч а н и е – Пороговые значения для специфического продукта составляют от 1,75 до 2,10, для внутреннего контроля – 2,50. 10.3.4 Интерпретацию результатов flash-ПЦР-анализа проводят по критериям, указанным в таблице 3. Таблица 3 − Интерпретация результатов flash -ПЦР-анализа Результат, выданный ДНК-детектором + нд Результат исследования Обнаружена ДНК исследуемого вида Не обнаружена ДНК исследуемого вида Недостоверный результат, ПЦР необходимо переставить 17 ГОСТ (проект RU, первая редакция) 10.4 Праймеры для проведения анализа на основе полимеразной цепной реакции 10.4.1 Для проведения ПЦР-анализа золотистой цистообразующей нематоды используют следующие праймеры: - Grf − прямой; - 5´− CAC AAG CGC AGA CAT GCC GGA A-3´; - Crr − обратный; - 5´ − ACG GAC ACA TGC CCG CTG TGT A-3´. 10.4.2 Для проведения ПЦР-анализа бледной цистообразующей нематоды используют следующие праймеры: - Gpf − прямой; - 5´ − CGA CGA CAA CAG CAA TGG TCC AG-3´; - Gpr − обратный; - 5´− ACG GAC ACA TGC CCG CTA TGT T -3´. 10.4.3 На обе картофельные цистообразующие нематоды используют общий зонд: - 5´ − FAM-GCG CCC CAA CAC TCA TGT GCC CAC AGG GCG C-BHQ1-3´; - FAM − флуорофор; - BHQ1 – гаситель. 18 ГОСТ (проект RU, первая редакция) Приложение А (справочное) Общие сведения о золотистой Globodera rostochiensis и бледной Globodera pallida картофельных цистообразующих нематодах Таксономическое положение: Nematoda: Tylenchida: Heteroderidae Наименование: Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Skarbilovich, 1959 Синонимы: Heterodera schachtii rostochiensis Wollenweber, 1923 Globodera schachtii solani Zimmerman, 1927 Компьютерный код Байера: HETDRO Карантинный статус: ЕОКЗР A1 № 125 Таксономическое положение: Nematoda: Tylenchida: Heteroderidae Наименование: Globodera pallida Stone, 1973 Синонимы: Heterodera pallida Stone, 1973 Компьютерный код Байера: HETDPA Карантинный статус: ЕОКЗР A1 № 124 А.1 Общие сведения Золотистая и бледная нематоды – два вида картофельных цистообразующих нематод, которые наносят огромный ущерб урожаю картофеля * . Личинки нематоды способны передвигаться в почве максимум на 1 м. Перемещение на новые территории происходит чаще всего с почвой. Главным распространителем нематоды является посадочный материал, выращенный на зараженных полях, и особенно картофель. Клубни картофеля на своей поверхности несут комочки приставшей почвы, в которой могут быть цисты картофельной нематоды. Транспортные средства, тара, в которой перевозят зараженный картофель, также являются распространителями цист нематоды. А.2 Биологические особенности Цикл развития золотистой и бледной картофельных цистообразующих нематод одинаков и типичен для всех видов рода Globodera (см. рисунок Б.7, приложение Б). Нематода зимует в стадии яиц и личинок, находящихся в цистах (см. рисунок Б.8, приложение Б). В одной цисте содержится от нескольких десятков до одной тысячи яиц и личинок. Сигналом к выходу личинок из цист служат корневые выделения растения-хозяина. Весной из сохранившихся яиц выходят личинки второго возраста и внедряются в зону роста корней. В корнях личинки теряют подвижность, питаются на группе клеток в перицикле, где и завершают свое развитие, проходя через две личиночные стадии. * По данным, приведенным van Riel H.R., & Mulder A. Potato cyst nematodes (Globodera species) in Western Europe. In: Potato Cyst Nematodes: Biology, Distribution and Control (Ed. Marks R.J. & Brodie B.B.). pp. 271-298. CAB International, Wallingford (GB), 1998. 19 ГОСТ (проект RU, первая редакция) Во время четвертой стадии личинки превращаются в самок и самцов. Самки постепенно утолщаются, становятся раздутыми и выходят наружу, оставаясь головным концом погруженными в ткани корня. Выход шарообразной самки из ткани корня наружу сопровождается сильным разрывом эпидермиса. Самцы червеобразной формы во время четвертой стадии выходят в почву и оплодотворяют самок. Самки остаются на корнях растений и продуцируют овальной формы яйца, которые остаются внутри их тела в яичниках. В этот период самки обоих видов имеют белый цвет. Затем самки золотистой картофельной нематоды проходят кремовую, лимонную и золотистожелтую фазу, благодаря чему нематода и получила свое название. У самок бледной картофельной нематоды золотисто-желтая фаза отсутствует, доминирует белый цвет, поэтому она названа бледной. Внутренние органы самок после вызревания внутри них яиц отмирают, их кутикула утолщается, затвердевает и приобретает коричневый цвет. Такие отмершие самки с яйцами внутри и называются цистами. В конце вегетационного периода картофеля цисты с корней осыпаются в почву и там перезимовывают. Биологический цикл картофельной нематоды продолжается около 60 дней, то есть оба вида за вегетационный период дают одно поколение, но в странах с жарким и влажным климатом возможны две генерации. А.3 Географическое распространение Золотистая картофельная цистообразующая нематода Globodera rostochiensis распространена во многих странах мира, возделывающих картофель. Бледная картофельная цистообразующая нематода Globodera pallida зарегистрирована в Алжире, Боливии, Великобритании, Венесуэле, Германии, Индии, Испании, Италии, Канаде, Колумбии, Нидерландах, Новой Зеландии, Норвегии, Перу, Франции, Швейцарии, Эквадоре и на Канарских островах. А.4 Поражаемые растения Основными поражаемыми картофельными цистообразующими нематодами сельскохозяйственными культурами являются: картофель (см. рисунок Б.9, приложение Б), томаты, перец и баклажаны. Картофельные цистообразующие нематоды могут размножаться также на некоторых видах сорняков из семейства пасленовых. 20 ГОСТ (проект RU, первая редакция) Приложение Б (справочное) Иллюстрации для идентификации золотистой Globodera rostochiensis и бледной Globodera pallida картофельных цистообразующих нематод по морфологическим признакам Рисунок Б.1 − Жизнеспособные личинки золотистой цистообразующей нематоды Рисунок Б.2 − Нежизнеспособные личинки золотистой цистообразующей нематоды 21 ГОСТ (проект RU, первая редакция) А − общий принцип строения анально-вульварной пластинки у нематод рода Globodera; Б − Д − пластинка и стилет Рисунок Б.3 − Морфологические различия в строении анально-вульварной пластинки и стилета инвазионных личинок между золотистой и бледной картофельными цистообразующими нематод* * 1972. 22 По данным, приведенным Деккером Х. Нематоды растений и борьба с ними. М.: Колос, ГОСТ (проект RU, первая редакция) В центре находится маленькое отверстие вульвы; близ вульварной пластинки утонченная побелевшая кутикула, за которой видны темные комковатые булли, расположенные по кругу, вокруг ануса характерные V-образные складки кутикулы. Рисунок Б.4 − Анально-вульварная пластинка зрелой самки золотистой цистообразующей нематоды * * По данным, приведенным Кирьяновой Е.С. и Кралль Э.Л. Паразитические нематоды растений и меры борьбы с ними. Л.: Наука, 1971. – Т. 2. 23 ГОСТ (проект RU, первая редакция) А – инвазионная личинка; Б – головной конец инвазионной личинки; В – боковое поле личинки; Г – строение пищевода инвазионной личинки; Д – строение пищевода самца; Е – хвост самца; Ж – боковое поле самца; З – форма тела самок; И – передний конец тела самки; К – самец; сп – спикулы Рисунок Б.5 − Строение золотистой цистообразующей нематоды* * 24 По данным, приведенным C.I.H. Descriptions of Plant-Parasitic Nematodes, Set 2, No. 16. ГОСТ (проект RU, первая редакция) А – циста; Б – корни с цистами; В – область вульвы Рисунок Б.6 − Золотистая цистообразующая нематода* * По данным, приведенным Кирьяновой Е.С. и Кралль Э.Л. Паразитические нематоды растений и меры борьбы с ними. Л.: Наука, 1971. – Т. 2. 25 ГОСТ (проект RU, первая редакция) Рисунок Б.7 − Жизненный цикл цистообразующей нематоды 26 ГОСТ (проект RU, первая редакция) - циста с яйцами; - яйца и личинки, выходящие из разорвавшейся цисты; - яйцо с жизнеспособной личинкой; - личинка второго возраста Рисунок Б.8 − Стадии развития нематоды* бледная цистообразующая нематода золотистая цистообразующая нематода Рисунок Б.9 − Корни картофеля с цистообразующими нематодами * По данным, приведенным Комаровой Е.Б. и Калнозолсом А.Э. Рекомендации по борьбе с картофельной нематодой. Рига, 1986. 27 ГОСТ (проект RU, первая редакция) Приложение В (обязательное) Схема идентификации золотистой Globodera rostochiensis и бледной Globodera pallida картофельных цистообразующих нематод* Образцы почвы Экстракция цист Круглые цисты рода Globodera да Пустая циста Циста с жизнеспособными яйцами и личинками нет да Морфологическая идентификация, основанная на перинеальной структуре неопределенная положительная положительная Идентификация невозможна положительная Globodera rostochiensis и Globodera pallida * отрицательная Морфологическая идентификация, основанная на перинеальной структуре неопределенная Молекулярные методы (ПЦРанализы) отрицательная Не Globodera rostochiensis и Globodera pallida На основе Bulletin ОЕРР/ЕРРО, v. 39, Diagnostic protocol for regulated pests. Globodera rostochiensis and Globodera pallida, PM 7/40 (2), 2009. 28 отрицательная ГОСТ (проект RU, первая редакция) Приложение Г (справочное) Определитель основных групп цистообразующих нематод 1 Анально-вульварная пластинка состоит из двух круглых фенестр примерно одинакового диаметра, одна из которых является вульварной (она, как правило, чуть больше), а другая анальной. Щель вульвы у зрелых цист не наблюдается. Цисты грушевидной или шаровидной формы, вульварный конус отсутствует.…………………………………………………Род Punctodera - Анально-вульварная пластинка состоит из одной овальной фенестры и точечного ануса. Щель вульвы различной длины имеется. Циста шаровидной (без вульварного конуса) или лимоновидной (с вульварным конусом) формы……………………………….......................................2 2 Цисты шаровидной формы. Вульварный конус отсутствует. Щель вульвы маленькая (от 8 до 12 мкм), меньше диаметра фенестры. Анус точечный, V-образной формы, обозначенный складками кутикулы, на значительном расстоянии от вульвы…………………………Род Globodera - Цисты лимоновидной формы. Вульварный конус различной длины имеется. Вульварная пластинка состоит из базина, двух полуфенестр, верхнего моста и вульварной щели различной длины (от 8 до 55 мкм)…………………………………..………………..………………………………3 3 Щель вульвы меньше 14 мкм. Полуфенестры разделены относительно широким верхним мостом………………………………………………………………..…Род Heterodera (группа avenae) - Щель вульвы больше 14 мкм. Полуфенестры сближены, верхний мост узкий…………………………………………………………..……...Род Heterodera (группа schachtii) 29 ГОСТ (проект RU, первая редакция) Приложение Д (справочное) Определитель видов рода Globodera 1 (6) Индекс Гранека (отношение расстояния фенестра – анус к диаметру фенестры) у цист в среднем 1,5 или меньше. 2 (3) Кончик хвоста у личинок тонкозакругленный. Самки с желтой фазой развития. Типовой хозяин – табак. Размножается на томате, баклажане, перце, паслене, но не на картофеле (исключение: сорт Арран Баннер). Распространена в Северо-Восточной части США (штат Коннектикут).................................................................................................................Globodera tabacum 3 (2) Кончик хвоста у личинок заостренный. Самки молочно-кремового цвета, матовые, превращаются в коричневые цисты без четко выраженной желтой фазы развития. Паразиты сложноцветных трибы антемидейных. На пасленовых, в том числе на картофеле, не размножаются. 4 (5) Растение-хозяин – полынь красночерешковая Artemisia rubripes. Распространена в Дальневосточной части России (Приморский край, Сахалинская область)…………………………………………………………...……………..…...Globodera artemisiae 5 (4) Растения-хозяева относятся к родам: тысячелистник, ромашка, трехреберник, пиретрум, нивянник, пижма, купавка, хризантема. На полыни не размножается. Распространена в Прибалтике (Эстония, Латвия)...……………………………………………..……...Globodera millefolii 6 (1) Индекс Гранека у цист в среднем превышает 2. 7 (8) Индекс Гранека в среднем 4,6 (от 2,7 до 8,9), между анусом и фенестрой обычно от 16 до 31 (в среднем 21) складок кутикулы. Самки с золотисто-желтой фазой в развитии. Длина стилета у самок от 21 до 25 мкм, длина стилета у инвазионных личинок от 21до 23 мкм. Отверстие дорсальной пищеводной железы на расстоянии от 5,0 до 6,7 мкм позади основания стилета. Головки стилета простираются назад (спереди не заострены). Типовой хозяин – картофель Solanum tuberosum L………………………………..………………………...….Globodera rostochiensis 8 (7) Индекс Гранека в среднем только от 2,1 до 2,5 (меньше трех), между анусом и фенестрой обычно только от 8 до 20 складок кутикулы. Самки белые или кремовые, переход в коричневые цисты без желтой фазы в развитии. Длина стилета у самок от 23 до 29 мкм. Длина стилета у инвазионных личинок от 21 до 26 мкм. Отверстие дорсальной пищеводной железы на расстоянии 2,8 мкм позади основания стилета. Головки стилета спереди заострены. Типовой хозяин картофель Solanum tuberosum L. Поражает как восприимчивые к золотистой картофельной нематоде (Globodera rostochiensis) сорта, так и сорта, унаследовавшие ген устойчивости от вида картофеля Solanum andigenum. Распространена во всех странах, но более редко, чем предыдущий вид………………………………………………………………………………………..Globodera pallida 30 ГОСТ (проект RU, первая редакция) Приложение Е (обязательное) Форма заполнения рабочего протокола анализа на основе полимеразной цепной реакции Дата проведения анализа __________________ RI PI R II P II П 1 8 15 18 П-1 2 9 16 19 П-2 3 10 17 20 К4 11 К+ 5 12 Ф 6 13 Ф 7 14 П, П-1, П-2 − пробирки с разным разведением, К-, К+ − отрицательный и положительный контроли, Ф – фоновая пробирка, I и II – варианты, R и P – анализы на Globodera rostochiensis и Globodera pallida соответственно. В клетках вписаны номера пробирок. 31 ГОСТ (проект RU, первая редакция) УДК _________________ ОКС 65.020.20 ОКП ________________ Ключевые слова: картофельные цистообразующие нематоды золотистая и бледная, методы выявления, методы выделения цист, морфологическая идентификация, молекулярная идентификация, анализы на основе полимеразной цепной реакции Руководитель организации - разработчика: Директор ФГБУ «Всероссийский центр карантина растений», к.с-х.н. У.Ш. Магомедов Руководитель разработки: Заместитель директора, д.б.н. М.М. Абасов Ответственный исполнитель: Начальник отдела стандартизации, эксперт по стандартизации Л.В. Калинина Исполнители: Заместитель директора, к.б.н. В.А. Яковлева Заведующая лабораторией гельминтологии Е.А. Худякова Заместитель начальника отдела стандартизации, эксперт по стандартизации Главный агроном лаборатории гельминтологии Е.П. Сорокин С.В. Сударикова Инженер-метролог отдела стандартизации, эксперт по стандартизации О.Н. Осауленко Редактор отдела научно-технической информации Т.В. Артемьева 32
