Сверхслабые излучения морских беспозвоночных. Биофизика

Биофизика. 47 (1): 90-93
СВЕРХСЛАБЫЕ ИЗЛУЧЕНИЯ МОРСКИХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ.
А.В. Гордеева, Ю.А. Лабас*.
Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, * Иститут проблем экологии и эволюции
им. А.С. Северцова РАН, 117071, Ленинский проспект, дом 33, Москва.
Результаты ингибиторного анализа спонтанной (так называемой «сверхслабой»)
люминол-индуцированной
и
хемилюминесценции морских губок Sycon sp. и актиний
Aiptasia sp. позволяют полагать, что сверхслабое свечение морских беспозвоночных –
следствие Са2+- зависимых процессов, связанных с излучательной дезактивацией
активных форм кислорода при взаимодействии с теми или иными эндогенными
флуорофорными субстратами.
Ключевые
слова:
сверхслабые
излучения,
активные
формы кислорода,
морские
беспозвоночные.
Сверхслабые излучения водных организмов мало изучены. Считанное число работ
посвящено спонтанному свечению пресноводных беспозвоночных [1] и рыб [5]. Морские
беспозвоночные в этом отношении до настоящего времени не исследовались. До сих пор
не была выяснена также химическая природа спонтанного свечения живых организмов,
хотя многие полагали, что оно связано с активными формами кислорода (АФК) и
перекисным окислением различных субстратов как индикаторами общей метаболической
активности [8, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 18].
Мы
попытались
сделать первый шаг к
пониманию природы спонтанной хемилюминесценции ряда водных организмов и
выяснить ее отличия от усиленной люминолом посредством ингибиторного анализа.
Сокращения: АФК – активные формы кислорода; ФЭУ – фотоэлектронный умножитель;
ФМА – форбол-12-миристат-13-ацетат.
1
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Объектами исследований служили морские губки Sycon sp. и актинии Aiptasia sp.
Измерения
интенсивности
хемилюминесценции
проводили
на
сцинтилляционном
счетчике фотонов MARK-2 с фотоэлектронным умножителем (ФЭУ) EMI 9750 QB/1
(область спектральной чувствительности 300-600 нм, максимальная – 380-490нм) по
описанной ранее методике [18]. Изучали влияние различных химических воздействий –
калиевой деполяризации, достигавшейся путем добавления к морской воде изотоничного
ей ([K+]out x 25) раствора KCl, хелатора кальция ЭГТА, Са2+-ионофора иономицина,
антиоксидантов (аскорбата, Н-глутатиона), ингибитора гемсодержащих ферментов азида
натрия,
митохондриального яда ротенона, стимулятора протеинкиназы С форбол-12-
миристат-13-ацетата (ФМА), а также глюкозы - на спонтанное и усиленное люминолом
5х10-5 М свечение морских беспозвоночных.
РЕЗУЛЬТАТЫ.
У актиний и губок оба типа люминесценции (как усиленная люминолом, так и
спонтанная)
стимулируются
воздействиями,
повышающими
внутриклеточную
концентрацию Ca2+ (калиевой деполяризацией, Са2+-ионофором иономицином 300 – 560
нМ, повышением концентрации внешнего Са2+ до 0,5М при 9мМ в нормальной морской
воде) и, напротив, угнетаются агентами, понижающими [Са2+]in (ЭГТА, 4,5 мМ) – рис.1.
Оба типа люминесценции слабо стимулируются глюкозой (люминол-зависимая – 1мМ,
спонтанная – 10 мМ) и подавляются антиоксидантами (аскорбат 2,5мМ). По крайней
мере люминол-индуцированное свечение угнетается ингибитором гемсодержащих
ферментов азидом натрия 1мМ.
Люминол-зависимая
(но
не
спонтанная)
хемилюминесценция
взрывообразно
усиливается при действии стимулятора протеинкиназы С ФМА: 0,001нМ – 0,1мкМ у
2
губок, 1-10нМ – у актиний (рис.2). Ингибитор окисления НАД-зависимых субстратов
ротенон в одной и той же концентрации (1мкМ) стимулирует люминол-зависимое и
угнетает
спонтанное
свечение
губок;
аналогичные
эксперименты
на
актиниях
определенного ответа не дали (рис.3). Н-глутатион (0,1мМ), известный также как
специфический пищевой стимулятор для кишечнополостных [7], ингибирует спонтанное
свечение актиний, однако после незначительного снижения вызывает усиление люминолиндуцированной хемилюминесценции. Результаты всех экспериментов суммированы в
таблице (таблица 1).
ОБСУЖДЕНИЕ.
В настоящее время как природа сверхслабого свечения, так и наличие у него
сигнальной функции – предмет дискуссий. В экспериментах на животных и растительных
клетках показано, что оно является кислород-зависимым [2,11,15,17] и в ряде случаев
непосредственно связано с митохондриями [12,17]. В других случаях спонтанную
хемилюминесценцию
порождает перекисное окисление жирных кислот (при участии
липоксигеназы) [17] или тирозина [16]. Тем не менее, неоднократно высказывалось
предположение, что источником сверхслабого свечения является ДНК в связи с его
митогенетической функцией [2,17]. Мы попытались сделать первый шаг к выяснению его
природы на основании данных ингибиторного анализа спонтанной и люминолиндуцированной хемилюминесценции ряда водных организмов.
Судя по этим данным, спонтанное и усиленное люминолом свечение морских
беспозвоночных имеет сходную природу. И то и другое – результат Са2+- зависимых
процессов, связанных с излучательной дезактивацией АФК при взаимодействии с пока не
идентифицированными
эндогенными
флуорофорными
субстратами
и
люминолом
соответственно. В такой связи обращает на себя внимание эффект ингибитора окисления
НАД-зависимых субстратов ротенона, который угнетает спонтанное и стимулирует
3
люминол-индуцированное свечение губок, и стимулятора протеинкиназы С ФМА,
усиливающего только люминол-зависимую хемилюминесценцию. Эти данные позволяют
высказать требующее дальнейшей проверки предположение, что основной вклад в
спонтанное свечение, по крайней мере, у губок вносят АФК, образующиеся в ходе работы
дыхательной цепи митохондрий. Между тем, АФК, ответственные за люминол-зависимую
хемилюминесценцию, скорее всего внемитохондриального происхождения. Возможно,
они генерируются с участием мембранной НАДФН-оксидазы, как то имеет место при
цитотоксической секреции фагоцитов высших животных и человека. По литературным
данным, этот фермент функционирует
не только в клетках, имеющих отношение к
иммунной системе [6,13], и широко распространен в органическом мире [10]. В пользу
вышесказанного
свидетельствует
секреция
супероксид-радикалов
наружными
поверхностями губок Sycon sp., показанная методом ЭПР с тайроновыми ловушками [14].
Другое подтверждение: в растворе нитросинего тетразолия (1мг/10 мл) на поверхности
многих водных организмов (губок, актиний, сцифомедуз, гребневиков, офиур, гастропод
и др.) в участках, где клетки непосредственно граничат с внешней водной средой, а не
изолированы от нее кутикулой, хитином, кожей или наружно-скелетными образованиями,
выпадает
нерастворимый
осадок
диформазана
[4]. Из
этих
данных
следует
целесообразность проверки эффекта других митохондриальных ядов, помимо ротенона, а
также ингибиторов НАДФН-оксидазы и прочих супероксид-образующих ферментов.
Усиление люминол-индуцированного свечения актиний при воздействии Н-глутатиона
позволяет предполагать регуляцию экзосекреции АФК по принципу обратной связи через
Н2О2 - зависимый сенсор Н-глутатиона
(глутатион-пероксидазу или ее гомолог) на
наружной поверхности организма [3].
4
ВЫВОДЫ.
По крайней мере в области спектральной чувствительности применявшегося ФЭУ (300 –
600 нм) спонтанное свечение водных организмов, как и люминол-индуцированное –
следствие Са2+- зависимых процессов, связанных с излучательной дезактивацией АФК; в
первом случае, очевидно, при взаимодействии с внутриклеточными люминофорными
субстратами.
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа поддержана грантом РФФИ № 990448873. Авторы выражают благодарность
кафедре биоорганической химии биологического факультета МГУ за предоставление
приборов и реактивов, морскому аквариуму Московского зоопарка за предоставление
живого материала, а также Воейкову В.Л., Новикову К.Н., Белоусову Л.В., Ягужинскому
Л.С., Звягильской Р.А. и Намиоту В.А. за ценные рекомендации по ходу работы и
участие в обсуждении результатов.
5
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
Cборники
1. Galle M. // Recent advances in biophoton research and its applications/ Eds F.A.Popp,
K.H.Li and Q.Gu. Singapore; River Edge; London: World Scientific Publishing Co. Pte.
Ltd., 1992, p.345-355.
2. Wei-Ping Mei // Recent advances in biophoton research and its applications/ Eds
F.A.Popp, K.H.Li and Q.Gu. Singapore; River Edge; London: World Scientific
Publishing Co. Pte. Ltd., 1992, p. 243-258.
Тезисы
3. Гордеева А.В., Лабас Ю.А. // III съезд фотобиологов России, 2001, тез. докл., с. 4950.
4. Лабас Ю.А., Пескин А.В., Клебанов Г.И., Попонов С.Ю., Тихонов А.Н. // II съезд
биофизиков России, 1999, тез. докл., т.3.14.39, с.1046-1047.
5. Beloussov L.V., Burlakov A.B., Konradov A.A. // Conference on biophotons, 1999, IIB,
p.2 of 46.
Статьи
6. Гамалей И.А., Клюбин И.В. // Цитология, 1996,т.38, №12, с.1233-1247.
7. Cobb M.H., Heagy W., Danner J., Lenhoff H.M., Marshall G.R. // Mol. Pharmacol.,
1982, 21(3): 629-36.
8. Isojima Y., Isoshima T., Nagai K., Kikuchi K., Nakagawa H. // Neuroreport, 1995, 7;
6(4):658-60.
9. Kataoka Y., Cui Y., Yamagata A., Niigaki M., Hirohata T., Oishi N., Watanabe Y. //
Biochem Biophys Res Commun,2001, 27; 285(4):1007-11
10. Kim D., Nakamura A., Okamoto T., Komatsu N., Oda T., Iida T., Ishimatsu A.,
Muramatsu T. // Biochim Biophys Acta, 2000, 15; 1524 (2-3) : 220-7.
6
11. Kimura M., Roschger P., Kobayashi M., Kimura S., Inaba H // Mutat Res, 1992, 281(3):
215-20.
12. Kobayashi M., Takeda M., Sato T., Yamazaki Y., Kaneko K., Ito K., Kato H., Inaba H. //
Neurosci Res ., 1999, 34(2): 103-13
13. Matsubara S., Sato I. // Mol Hum Reprod., 2001, 7(8):779-85.
14. Peskin A.V., Labas Y.A., Tichonov A.N. // FEBS Lett. 434,1998, 201-204.
15. Tilbury R.N. // Experientia, 1992, 48(11-12):1030-41.
16. Totsune H., Nakano M., Inaba H. // Biochem Biophys Res Commun ., 1993, 16,
194(3):1025-9.
17. Van Wijk R. and Schamhart D.H.J. // Experientia , 1998, 44: 586-593
18. V.L.Voeikov, C.N. Novikov, N.D Vilenskaya // Journal of Biomedical Optics. v. 4, pp.5460, 1999.
7
Таблица 1. Влияние различных химических агентов на интенсивность
спонтанной и усиленной люминолом хемилюминесценции морских губок
Sycon sp. и актиний Aiptasia sp.
Воздействие
–
название
агента.
KCl
изотонич.
Концен
трация
Спонтанная
хемилюминесценция
губки
актинии
Хемилюминесценция,
усиленная
люминолом 5х 10-5М.
губки
актинии
500мМ
+
+
+
+
500мМ
+
+
+
+
300 нM
560нМ
+
+
?
?
+
+
?
?
4,5мМ
-
-
-
-
1нМ
10нМ
100 нМ
0
0
0
0
0
?
+
?
+
+
+
?
1мМ
?
?
-
-
1мкМ
-
0
+
0
2,5 мМ
-
-
?
-
0,1мМ
?
-
?
-+
1мМ
10 мМ
?
?
0
+
?
?
+
?
CaCl2
изотонич
иономицин
ЭГТА
Форбол-12миристат13- ацетат
NaN3
ротенон
аскорбат
Нглутатион
глюкоза
Примечания: 0 – отсутствие влияния, - -ингибирование, +- усиление, -+ ингибирование с последующим усилением, ?- опыты не проводились.
Жирным шрифтом выделены названия веществ, неодинаково влияющих на
спонтанную и усиленную люминолом хемилюминесценцию.
8
Подписи к рисункам:
Рис.1 Влияние калиевой деполяризации (добавления к морской воде изотоничного ей
([K+]out x 25) раствора KCl) и хелатора кальция ЭГТА (4,5 мМ) на интенсивность
спонтанной хемилюминесценции губок Sycon sp. Стрелками обозначен перенос губок из
нормальной морской воды в воду с KCl и ЭГТА соответственно.
Рис.2 Влияние стимулятора протеинкиназы С форбол-12-миристат-13-ацетата (10 нМ) на
интенсивность спонтанной и усиленной люминолом хемилюминесценции актинии
Aiptasia sp. Стрелкой обозначено добавление ФМА (т.121).
Рис.3 Влияние ингибитора окисления НАД-зависимых субстратов ротенона (1мкМ) на
интенсивность спонтанной и усиленной люминолом хемилюминесценции губок.
Стрелками обозначено добавление ротенона (спонт. – т. 64, люм. – т.141).
9
Ultraweak photon emission of marine invertebrates.
A.V. Gordeeva, Y.A. Labas*.
A. N. Bach Institute of Biochemistry, *A.S. Severtsov Institute of Ecology and Evolution,
Leninsky prospect 33, Russian Academy of Sciences, 117071, Moscow, Russia
The inhibitory analysis of the spontaneous (the so-called “ultraweak”) and the luminolinduced chemiluminescence of
marine Sycon sponges and Aiptasia actinias supports the
idea that the ultraweak photon emission of marine invertebrates is a consequence of a Ca2+dependent processes, mostly attributable to the interaction of reactive oxygen species with
some endogenous fluorophore substrates.
Key words: ultraweak photon emission, reactive oxygen species, and marine invertebrates.
10
Интенсивность, имп./ 0,1мин.
7000
6000
КСl
ЭГТА
5000
4000
3000
2000
1000
0
1
31
61
91 121 151 181 211 241 271 301 331 361 391
Время, мин. х 0,1.
Рис. 1.
Интенсивность, имп./ 0,1 мин.
350000
300000
250000
люм.
200000
спонт.
150000
100000
50000
0
1
21
41
61
81
101
121
141
161
181
201
221
241
261
281
301
321
Время, мин. х 0,1.
Рис. 2.
11
Интенсивность, имп./ 0,1 мин.
180000
160000
140000
120000
100000
спонт.
люм.
80000
60000
40000
20000
0
1
31
61
91
121
151
181
211
241
271
301
Время, мин. х 0,1.
Рис. 3.
12