referat Bulushova
advertisement
На правах рукописи Булушова Наталья Владимировна Взаимодействие энтомоцидных белков Bacillus thuringiensis c пищеварительной системой чувствительных насекомых на примере δ-эндотоксинов Cry3A и Cry9A 03.01.03 – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2010 Работа выполнена в лаборатории химии белка им. В.М. Степанова научно-исследовательский «Государственный институт генетики и ФГУП селекции промышленных микроорганизмов» Научный руководитель: кандидат химических наук Залунин Игорь Арсеньевич Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, Вейко Владимир Петрович ФГУП «ГосНИИгенетика» доктор химических наук, профессор, Руденская Галина Николаевна Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова Ведущая организация: Защита состоится « диссертационного совета Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН » ________________ Д.217.013.01 при 2010 года в 14 часов на заседании ФГУП «Государственный научно- исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, Москва, 1-ый Дорожный пр., д. 1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика» Автореферат разослан « » __________________ 2010г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук Т.Л. Воюшина ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Насекомые - вредители запасов наносят существенный экономический ущерб. По данным Организации по продовольствию и сельскому хозяйству (ФАО) ООН, они ежегодно уничтожают не менее 5-10% мировых запасов зерновых культур. Из насекомых – вредителей запасов на территории нашей страны одним из наиболее опасных является большой мучной хрущак Tenebrio molitor . В свою очередь, гусеницы пчелиной огневки Galleria mellonella наносят ощутимый вред пчеловодству. Так, потери воска, связанные с размножением этого насекомого, достигают по меньшей мере 20 % от его производства, а пораженность пчелиных семей составляет 10-28 % от их общего числа. Применение химических методов борьбы с насекомыми-вредителями в большинстве случаев не возможно, так как делает продукцию не пригодной к употреблению. Значительно более перспективными являются биоинсектициды, и, прежде всего, препараты, полученные на основе микроорганизма Bacillus thuringiensis. Для различных подвидов B. thuringiensis характерно образование инсектицидных белков (δ-эндотоксинов, Cry-белков), отличающихся высокой специфичностью биологического эффекта. Как правило, эти токсины активны против личинок насекомых из отрядов Lepidoptera, Coleoptera и Diptera, а также нематод. В то же время, они абсолютно безвредны для большинства видов животных и человека. Создание высокоэффективных биоинсектицидов данного класса для конкретных насекомых-вредителей, а также разработка путей предохранения от возникновения у них резистентности к этим препаратам требует знания процессов, происходящих при попадании эндотоксинов в организм насекомого-мишени. Таким образом, изучение различных стадий патологического эффекта δ-эндотоксинов (активации под действием кишечных протеиназ, связывания со специфическими токсинсвязывающими белками в мембранах кишечного эпителия, образования трансмембранных пор) является весьма актуальным. Цели и задачи исследования. Целью работы было изучение взаимодействия энтомоцидных белков Cry3A (B. thuringiensis ssp. tenebrionis) и Cry9A (B. thuringiensis ssp. galleriae) с пищеварительной системой чувствительных к ним насекомых, личинок T. molitor и гусениц G. mellonella, соответственно. Для ее достижения были определены следующие задачи: - изучить первичные характеристики пищеварительных протеиназ средней кишки гусениц G. mellonella и их участие в активации δ-эндотоксина Cry9A; - выделить из апикальных мембран кишечного эпителия личинок T. molitor и гусениц G. mellonella белки, специфически связывающие токсины, эффективные против этих насекомых (Cry3A и Cry9A, соответственно); - изучить действие δ-эндотоксина Cry3A на ионную проницаемость апикальных мембран кишечного эпителия личинок большого мучного хрущака. Научная новизна. В работе впервые: - охарактеризован комплекс пищеварительных протеолитических ферментов гусениц G. mellonella; получен препарат электрофоретически чистого трипсина из этого насекомого; доказана способность кишечных протеиназ G. mellonella эффективно активировать белок Cry9A, токсичный против этого насекомого; - методом аффинной хроматографии из апикальных мембран кишечного эпителия личинок T. molitor выделены белки 66 и 58 кДа, специфически связывающие δ-эндотоксин Cry3A, а из аналогичных мембранных препаратов гусениц G. mellonella - 67 кДа белок, специфически связывающий активированный токсин Cry9A; произведена предварительная идентификация указанных белков; - показано наличие в апикальных мембранах клеток кишечного эпителия личинок T. molitor ионных каналов и частично изучены их свойства; установлено, что δ-эндотоксин Cry3A увеличивает проницаемость этих мембран, что связано либо с активацией собственных ионных каналов, либо с образованием новых, обладающих сходными свойствами. Практическая ценность Полученные работы. данные о взаимодействии энтомоцидных токсинов Cry3A и Cry9A c элементами пищеварительной системы личинок T. molitor и гусениц G. mellonella создают базу для дальнейших исследований механизма энтомоцидного эффекта этих белков, а также путей адаптации патогенного микроорганизма к физиологическим и биохимическим особенностям организма-хозяина. В свою очередь, результаты проведенных исследований могут быть использованы при создании биоинсектицидов нового поколения с существенно повышенной эффективностью против насекомых - вредителей запасов и уменьшенной вероятностью возникновения устойчивых форм насекомых. Апробация работы. Результаты исследований были представлены на международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2008) и IV Симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009). Диссертационная работа была апробирована на заседании секции молекулярной биологии Ученого совета ФГУП «ГосНИИгенетика» Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 3 статьи. Структура и объем работы. введение, обзор Диссертация состоит из следующих разделов: литературы, материалы и методы, обсуждение результатов, выводы, список цитируемой литературы. Работа изложена на 160 страницах машинописного текста и содержит 36 рисунков и 7 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 235 источников, в том числе 6 на русском языке. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Изучение комплекса пищеварительных протеиназ гусениц G. mellonella (состав, свойства, ограниченный протеолиз δ-эндотоксина Cry9A) Анализ ферментного состава протеолитического комплекса средней кишки гусениц G. mellonella с помощью различных субстратов протеиназ. Изучение протеолитической активности проводили на экстрактах передней (anterior midgud, АМ) и задней (posterior midgud, РМ) частей средней кишки гусениц G. mellonella достигших III-IV стадии роста. Энзиматические активности выражали в единицах приходящихся на одно насекомое. Суммарную протеолитическую активность изучали по способности экстрактов из АМ и РМ G. mellonella гидролизовать белковый субстрат – азоказеин. 0,6 АМ 0,5 РМ А450 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 2 4 6 8 10 12 14 рН Рисунок 1. Определение рН оптимума общей протеолитической активности экстракта из АМ и РМ G. mellonella. В качестве субстрата использовали азоказеин. Требуемые значения рН создавали с помощью 30 мМ универсального буфера. Эта активность была максимальной при рН 10,7 (рис. 1). Ниже рН 8,0 активность начинала быстро падать и к рН 6,0 доходила практически до нуля. Было показано, что рН содержимого средней кишки гусениц G. mellonella равен 8,5. При этом рН активность составляла 62 и 58% от максимальной (для АМ и РМ, соответственно). Как видно из таблицы 1, при рН 8,5 суммарная протеолитическая активность экстракта из АM составляет около 0,53 единицы, из PM - 0,28 единицы. Таким образом, 65% протеолитической активности средней кишки G. mellonella сосредоточено в ее переднем отделе, 35% - в заднем отделе. Содержание представителей различных классов протеиназ (сериновых, цистеиновых и металлопротеиназ) субстратов. определяли Максимальную с помощью активность мы специфических наблюдали по р-нитроанилидных гидролизу BzRpNA, специфическому субстрату трипсиноподобных и цистеиновых протеиназ. Однако, отсутствие увеличения (и даже уменьшение) интенсивности гидролиза данного субстрата при прибавлении 5мМ дитиотреитола (ДТТ) говорит об отсутствии активности цистеиновой протеиназы в кишечном экстракте данного насекомого при рН 8,5. Таблица 1. Определение протеолитической активности экстрактов из АМ и РМ G. mellonella с помощью различных субстратов протеолитических ферментов. Активность (единиц/насекомое) Субстрат * рН 8,5 рН 10,7 АМ РМ АМ РМ Азоказеин 0,528 0,275 0,851 0,481 Азоказеин5мМ ДTT* 0,321 0,180 BzRpNA 0,114 0,068 0,157 0,106 BzRpNA5мМ ДTT* 0,089 0,054 ForAAFpNA 0,011 0,005 0,014 0,006 GlpAALpNA 0,018 0,015 SucAAPFpNA 0,068 0,066 DnpAALR-NH2 0,016 0,015 ZAAPpNA** 0,0018 0,00044 Инкубацию проводили в присутствии 5 мМ ДТТ Определение активности проводили при рН 8,0 BzRpNA - бензоил-аргинин-пара-нитроанилид; DnpAALR-NH2 - амид 2,4-динитрофенил-аланилаланил-лейцил-аргинина; ForAAFpNA - формил-аланил-аланил-фенилаланин-пара-нитроанилид; GlpAALpNA - пироглутамил-аланил-аланил-лейцин-пара-нитроанилид; SucAAPFpNA - сукцинил-аланил-аланил-пролил-фенилаланин-пара-нитроанилид; Z-AAPpNA бензилоксикарбонил-аланил-аланил-пролин-пара-нитроанилид ** Из трёх использованных нами субстратов химотрипсина, ForAAFpNA, GlpAALpNA и SucAAPFpNA, только в случае последнего отщепление р-нитроанилина протеиназами средней кишки G. mellonella происходит с относительно высокой скоростью, хотя и с меньшей, чем в случае BzRpNA. Это не удивительно, поскольку показано, что химотрипсины насекомых предпочитают более длинноцепочечные субстраты, чем химотрипсины млекопитающих. Результаты, полученные при использовании в качестве субстрата DnpAALR-NH2, (таблица 1) дают возможность предположить наличие в кишечных экстрактах G. mellonella металлопротеиназы. Однако утверждать этого нельзя, поскольку аналогичный эффект может быть достигнут с помощью других протеиназ, например химотрипсина или эластазы. Активность по ZAAPpNA (таблица 1) (0,0018 ед./насекомое) предполагает наличие в средней кишке пчелиной огневки постпролиновой эндопептидазы. Таким образом, протеолитическая активность кишечных экстрактов G. mellonella связана с наличием сериновых протеиназ, в основном, трипсина и химотрипсина. Ингибиторный анализ кишечных протеиназ G. mellonella. анализ (таблица 2) подтвердил сделанные выше выводы о Ингибиторный ферментном составе протеолитического комплекса кишечных экстрактов G. mellonella. То, что основной вклад в его активность вносят сериновые протеиназы – трипсин и химотрипсин – доказывается сильным подавлением гидролиза азоказеина диизопропилфторфосфатом (DFP). Гидролиз специфичных субстратов подавлялся DFP полностью. (PMSF) ингибировал гидролиз Фенилметилсульфонилфторид данных субстратов менее эффективно, а вот соевый ингибитор трипсина STI, как правило, был близок по эффективности ингибирования DFP. Под действием тозил-L-лизин-хлорометилкетона (TLCK), специфического ингибитора трипсина, гидролиз азоказеина уменьшался примерно наполовину (58% остаточной активности в случае экстракта АМ и 45% - РМ) (таблица 2). Следовательно, в ходе гидролиза белковых субстратов кишечным экстрактом этого насекомого роль трипсина и химотрипсина приблизительно одинакова. К сожалению, специфический ингибитор химотрипсинов млекопитающих тозил-L-фенилаланин-хлорометилкетон (ТРСК) не всегда ингибирует химотрипсины насекомых, поэтому подтвердить полученные данные при использовании этого ингибитора нам не удалось. Ингибиторы цистеиновой протеиназы (Е-64 и иодацетамид) не влияли на гидролиз ни азоказеина, ни специфических субстратов. Это подтверждает, что указанные ферменты, либо вообще отсутствуют в кишечном соке, либо не вносят ощутимого вклада в его активность при рН 8,5. Таблица 2. Ингибиторный анализ протеолитической активности экстракта АМ и РМ средней DFP 1 АМ РМ АМ РМ АМ РМ 17,5 9,5 1,4 0,0 0,9 0,0 3 PMSF DnpAALR-NH2 GlpAALpNA ForAAFpNA BzRpNA aзоказеин Концентрация ингибитора, мМ Ингибиторы кишки гусениц G. mellonella по отношению к различным субстратам. АМ РМ АМ РМ 0,18 0,0 29,5 28,0 5 43,5 34,1 25,0 13,6 33,3 9,9 STI 0,01 20,7 12,8 6,8 0,0 40,4 0,0 TLCK 0,135 57,6 45,0 4,5 0,0 102 94,9 94,7 83,9 TPCK 0,285 95,7 101 99,6 99,5 87,5 79,7 89,2 90,6 5 60,8 65,6 75,9 75,4 0,1 41,4 1,75 1 16,2 0,0 107 90,0 121 98,3 DTT Бензамидин Е-64 0,001 103 0,01 101 102 Е-64+DFP 10 Иодацетамид 0,1 102 1 97,2 ЭДТА 10 147 122 ЭГТА 10 141 106 о-фенантролин 2,5 106 90,0 о-фенантролин +DFP 92,9 106 93,1 34,7 101 92,2 51,8 59,1 0,0 66,7 65,3 22,9 В таблице представлены значения остаточной активности кишечного сока G. mellonella в процентах от его исходной активности по указанному субстрату. Из ингибиторов металлопротеиназ о-фенантролин лишь незначительно подавляет гидролиз азоказеина кишечными экстрактами, а ЭДТА и ЭГТА даже активируют его. Это говорит об отсутствии существенного вклада металлопротеиназы в гидролиз белков. В то же время, активность по гидролизу субстрата DnpAALR-NH2, используемого обычно для тестирования активности металлопротеиназ, на 70-72% подавлялась ДФФ и на 33-35% - офенантролином, что позволяет предположить, что эта активность обусловлена в значительной степени сериновыми химотрипсиноподобными протеиназами, а также и металлопротеиназами. Поскольку одновременное добавление в инкубационную среду DFP и о-фенантролинa всё равно не привело к полному ингибированию гидролитической активности по DnpAALR-NH2, можно предположить наличие в средней кишке гусениц фермента, не относящегося ни к сериновым, ни к металлопротеиназам. Возможно, он относится к ферментам с неидентифицированным типом активности, описанным для некоторых членистоногих. Изучение ферментного состава протеолитического комплекса средней кишки Для многих видов гусениц G. mellonella методом зимографии. характерно продуцирование целого ряда изоформ экстракта пищеварительных ферментов. Существование множественных форм трипсина и химотрипсина связано с адаптацией насекомого к потреблению растительной пищи, содержащей различные ингибиторы протеиназ. Ферментный состав протеолитического комплекса средней кишки гусениц G. mellonella был изучен методом зимографии. Для этого белки кишечного экстракта разделили с помощью электрофореза в нативных условиях и определили их протеолитическую активность. Для определения общей протеолитической активности в качестве субстрата был использован желатин, а триптическую и химотриптическую активности изучали с помощью специфичных р-нитроанилидных субстратов (BzRpNA, ForAAFpNA и GlpAALpNA). На рисунке 2(а) можно видеть три компонента, мигрирующих к аноду при рН 7,4 (анионные формы (G1-3)), и гидролизующих желатин. Среди белков, заряженных при рН 7,4 положительно (катионные формы) (рис. 2б), имеется два медленно мигрирующих компонента, способных гидролизовать желатин (G4-5). Это говорит о наличие в экстракте средней кишки не менее пяти протеолитических ферментов. Также здесь мы видим, что трипсиноподобные ферменты представлены в кишечном экстракте G. mellonella в виде трёх анионных (Т1-3) и двух катионных форм (Т4-5), химотрипсины представлены одной анионной формой (C1) и одной катионной формой (C 2), плохо входящей в гель. Аналогичные результаты получены при изучении изоформ протеолитических ферментов РМ. Рисунок 2. Использование метода зимографии для выявления компонентов протеолитического комплекса средней кишки гусениц G. mellonella, обладающих желатинолитической, триптической и химотриптической активностями. Белки кишечного экстракта из АМ разделяли в: (а) анионной и (б) катионной электрофоретических системах. На электрофоретические гели накладывали гели, содержащие желатин, или нитроцеллюлозные фильтры, пропитанные одним из указанных на рисунке субстратов, и полученные сэндвичи инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Стрелками указано положение полос, в которых была обнаружена желатинолитическая (G1-5), триптическая (Т1-5) и химотриптическая (C1-2) активности. Изучение ферментного состава протеолитического комплекса средней кишки G. mellonella методом ионообменной хроматографии. Экстракт средней кишки гусениц G. mellonella был хроматографирован при рН 7,4 на анионообменнике HiTrapQ. На рисунке 3 показано, что белки, обладающие триптической активностью, элюировались с колонки тремя пиками (ТrI, ТrII и ТrIII), тогда белки с химотриптической активностью – одним (ChI), частично совпадающим с третьим пиком триптической активности. Выделение и характеристика фермента с триптической кишечного экстракта гусениц G. mellonella. активностью Комбинацией из ионообменной хроматографии на колонке MonoQ и аффинной хроматографии на колонке с бензамидинсефарозой из кишечного экстракта гусениц был получен препарат трипсина Tr II. Использование метода зимографии показало, что препарат трипсина содержит один компонент, обладающий одновременно как желатинолитической активностью, так и способностью гидролизовать BzRpNA (рис. 4). Рисунок 3. Хроматография экстракта средней кишки гусениц G. mellonella на анионообменнике HiTrapQ. На рисунке изображены профили элюции белков (ОЕ280), а также ----- триптической и ------- химотриптической активностей. а б Рисунок 4. (а) Очистка трипсина из экстракта средней кишки гусениц G. mellonella на бензамидинсефарозе. (б) Анализ препарата очищенного трипсина методами электрофореза в денатурирующих условиях (1) и зимографии (2,3). Препарат очищенного трипсина подвергали электрофорезу в нативных условиях в анионной электрофоретической системе. Для детекции энзиматической активности использовали в качестве субстрата желатин (2) или BzRpNA (3). молекулярной массы. M - стандарты Электрофорез в денатурирующих условиях выявил наличие одной полосы с молекулярной массой 28 кДа (рис. 4). Для данного белка была установлена следующая Nконцевая последовательность аминокислот: Ile-Val-Gly-Gly-Glu-Leu-Thr-Thr-Ile-Glu, полностью совпадающая с N-концевой последовательностью зрелого трипсина из гусеницы Plodia interpunctella. Кроме того, она имеет 70 – 90 % совпадения с N- концевыми последовательностями трипсинов из таких представителей семейства Lepidoptera, как Sesamia nonagrioides, Heliothis virescens, Helicoverpa armigera, а также из Aedes aegypti и некоторых видов Drosophila (все - Diptera). Комбинацией ионообменной хроматографии на колонке и MonoQ гель- проникающей хроматографии на колонке Superdex 75 из кишечного экстракта гусениц был получен препарат химотрипсина. Электрофорез в денатурирующих условиях показал, что этот препарат содержит примеси других белков. Однако в нём полностью отсутствовала триптическая активность, что было очень важно для последующих исследований. Протеолиз белков кристаллов B. thuringienses ssp. galleriae экстрактом средней кишки гусениц G. mellonella и некоторыми присутствующими в нём ферментами. Энтомоцидные кристаллы B. thuringienses ssp. galleriaе содержат вместе с высокотоксичным Cry9A, другие Cry-белки, слабо токсичные для гусениц G. mellonella. Мы изучили ход протеолиза суммарного раствора Cry-белков, составляющих кристалл ssp. galleriaе, кишечным экстрактом этого насекомого и отдельными протеолитическими ферментами, выделенными из него. На рисунке 5 видно, что в процессе часовой инкубации токсинов с кишечным экстрактом происходит постепенное уменьшение молекулярной массы исходных токсинов (130 кДа). Наименьшее количество кишечного сока, необходимое для начала протеолиза 0,05х10-3 единиц триптической активности на 1 мг белка токсинов. При соотношении 6,25х10-3 ед /мг кишечный экстракт гидролизует большую часть исходного белка до фрагментов с мол. весом 65 кДа. Следовательно, для активации летального количества токсина (6 мкг на насекомое, установлено ранее в нашей лаборатории) требуется 3,75х10-5 единиц триптической активности, что в 3000 раз меньше того количества, что присутствует в средней кишке одной гусеницы (табл. 1). Таким образом, активация протоксина Cry9A не является скорость-лимитирующей стадией при действии этого белка на пчелиную огнёвку. Препараты трипсина и химотрипсина, выделенные нами из кишечного экстракта данного насекомого, действуют похожим образом при аналогичных соотношениях фермент:белок. Из этого следует, что оба фермента принимают участие в ограниченном протеолизе Cry-белков. Рисунок 5. Ход ограниченного протеолиза белков кристаллов В. thuringiensis ssp. galleriae. 20 мкг раствора кристаллов инкубировали с экстрактом средней кишки гусениц G. mellonella (а, д), препаратами трипсина (б) и химотрипсина (в), выделенными из данного насекомого, а также коммерческим препаратом бычьего химотрипсина (г). Ход протеолиза детектировали с помощью окраски гелей раствором Кумасси R250 (а-г), или посредством вестерн-блоттинга с использованием специфической поликлональной антисыворотки к эндотоксину Cry9A (д). Кишечный экстракт и препарат очищенного трипсина добавляли в количестве, указанном внизу рисунка х10-3, в единицах триптической активности на мг белка δ-эндотоксинов; препарат химотрипсина и препарат бычьего химотрипсина – в единицах химотриптической активности на мг энтомоцидных белков. В лунке «токсин» – исходный раствор кристаллов, в лунке «х/тр» – препарат химотрипсина. М– стандарты молекулярной массы. Стрелки указывают на фрагменты 46 и 49 кДа, полученные при гидролизе токсинов ssp. galleriae препаратом химотрипсина гусениц. Ранее в нашей лаборатории было показано, что бычий химотрипсин способен к более глубокому протеолизу белка Cry9A до фрагмента 49 кДа. Выделенный нами из гусеницы химотрипсин также способен образовывать фрагменты с молекулярным весом 49 и 46 кДа, причем при меньшем соотношении единиц активности на 1 мг белка, нежели бычий химотрипсин. Для подтверждения того, что кишечный экстракт пчелиной огнёвки в числе прочих гидролизует и δ-эндотоксин Cry9A, мы применили метод вестерн-блоттинга с использованием специфической сыворотки на данный токсин. Полученные данные показывают (рис.5), что Сry9A подвергается протеолизу с той же эффективностью, что и другие δ-эндотоксины ssp. galleriaе. . 2. Выделение токсинсвязывающих белков из апикальных мембран кишечного эпителия личинок T. molitor и гусениц G. mellonella. Взаимодействие с токсинсвязывающим белком, экспонированным в апикальной мембране эпителиальных клеток средней кишки насекомого, является одним из основных этапов патологического действия Cry-белков. В настоящее время на роль рецепторов различных δ-эндотоксинов В. thuringiensis претендуют представители следующих классов мембранных белков: аминопептидазы N, кадгериноподобные белки, щелочные фосфатазы, α-амилазы, ADAM металлопротеиназа, А и В субъединицы V-АТФазы и ряд других. В данной работе для выделения из апикальных мембран кишечного эпителия личинок T. molitor и гусениц G. mellonella белков, способных специфически связывать токсины Cry3A и Cry9A, соответственно, была использована аффинная хроматография. Белковый состав апикальной мембраны клеток кишечного эпителия. качестве источника токсинсвязывающих белков были использованы В препараты апикальных мембран кишечного эпителия, полученные в форме везикул BBMV (brush border membranes vesicles). Метод получения BBMV основан на осаждении ионами магния компонентов кишечного гомогената и дифференциальном центрифугировании. За степенью очистки BBMV следили по повышению удельной активности маркера апикальных мембран – лейцинаминопептидазы. Препараты BBMV были получены из обоих отделов средней кишки T. molitor (АМ и РМ). В случае РМ апикальные мембраны были очищены в 22 раза. В случае АМ оценить степень очистки не удалось, поскольку в этом отделе средней кишки данного насекомого активность лейцинаминопептидазы отсутствует. В случае гусеницы G. mellonella, BBMV были выделены из полноразмерной средней кишки, причём была достигнута 18-кратная степень очистки апикальных мембран. Для экстракции мембранных белков из BBMV, полученных из АМ и РМ T. molitor, были использованы буфера, содержащие различные детергенты: DS-Na, NONIDET P40, CHAPS, н-октилгликозид. Белковый состав полученных экстрактов очень близок. На электрофорезе можно видеть около двадцати полос с молекулярной массой от 20 до 200 кДа (рис. 6). В дальнейших экспериментах был использован экстракт, полученный под действием н-октилгликозида. Похожая, хотя и неидентичная картина получалась и при обработке буферами, содержащими вышеперечисленные детергенты, препаратов BBMV G. mellonella (данные не приводятся). Рисунок 6. Белковый состав экстракта, полученного при обработке BBMV из РМ T. molitor DS-Na. На 10% ПААГ нанесены: 1-экстракт, М – стандарты молекулярной массы. Выявление Cry3A-связывающих белков в составе BBMV T. molitor. Идентификацию токсинсвязывающих белков в полученных препаратах BBMV проводили посредством лиганд-блоттинга. Экстракты BBMV из AM и РМ личинок T. molitor были подвергнуты электрофорезу с последующим переносом на нитроцеллюлозную мембрану. Инкубация полученных реплик с биотинилированным токсином Cry3A показала наличие четырёх окрашивающихся полос с молекулярной массой 120, 95, 58 и 30 кДа (рис. 7). Рисунок 7. Визуализация токсинсвязывающих белков из BBMV, полученных для AM (2) и PM (1,3,4) T. molitor с помощью лиганд-блоттинга. Нитроцеллюлозные реплики подвергали следующей обработке: (1,2) инкубировали с биотинилированным Cry3A и окрашивали с помощью биотин-стрептавидиновой системы; (3) окрашивали также, но без предварительной инкубации с токсином; (4) окрашивали Понсо S. (М) - стандарты молекулярной массы. Стрелками обозначены визуализированные полосы с указанием молекулярной массы соответствующих белков. Полоса 30 кДа окрашивается и при инкубации с одним конъюгатом и, видимо, соответствует неидентифицированному мембранному белку, содержащему биотин. Полоса, соответствующая белку 120 кДа, являлась мажорной при окрашивании нитроцеллюлозных фильтров с помощью Понсо S, так что мы не наблюдали относительного усиления её окрашивания при лиганд-блоттинге. А вот интенсивность окрашивания полос 95 и 58 кДа в случае лиганд-блоттинга резко возрастает по сравнению с картиной, наблюдаемой при окраске на белок, что делает соответствующие компоненты кандидатами на роль токсинсвязывающих белков из BBMV T. molitor. Результаты лигандблоттинга для BBMV, полученных из АМ и РМ, похожи, в силу чего, дальнейшие эксперименты проводили с препаратами, полученными из РМ. К сожалению, эксперименты по лиганд-блоттингу имеют тот недостаток, что мембранные белки претерпевают денатурацию в ходе взаимодействия с буфером для образцов, содержащим DS-Na. Поэтому данные лиганд-блоттинга требуют проверки в системе, в которой с токсинами взаимодействуют нативные мембранные белки. В нашей лаборатории был разработан метод выделения нативных специфических токсинсвязывающих белков посредством аффинной хроматографии, который и был использован в работе. Выделение токсинсвязывающих белков из ВВМV кишечного эпителия T. molitor и G. mellonella. Для выделения токсинсвязывающих белков из апикальной мембраны кишечного эпителия гусеницы G. mellonella был синтезирован аффинный сорбент на основе активированного токсина Сry9A: Сry9A65кДа- аминогексилагароза. В ходе хроматографии на данном сорбенте экстракта белков, полученного при действии на BBMV G. mellonella неионного детергента н-октилгликозида, 0,1 М N-ацетилгалактозамин элюировал с колонки белок с мол. массой 67 кДа, связывающий биотинилированный Cry9A65кДа в условиях лиганд-блоттинга (рис. 8а). Рисунок 8. Электрофоретический анализ фракций, полученных в ходе аффинной хроматографии (а) белков BBMV G. mellonella на сорбенте Cry9А65кДа–аминогексилагароза: 1- белок, элюированный с сорбента 0,1 М N-ацетилгалактозамином, М – стандарты молекулярного веса. (б) белков BBMV T. molitor на сорбенте Cry3А49кДа–аминогексилагароза: 2- белки не связавшиеся с сорбентом, 3 -белки, элюированные с сорбента 1 М NaCl. Гели проявляли методом лиганд- блоттинга, используя в качестве лиганда соответствующие биотинилированные токсины. К сожалению, Cry3A обладает плохой растворимостью при рН ниже 10,0, что затрудняет его применение для синтеза аффинных сорбентов. Использование для этой цели 49 кДа продукта ограниченного протеолиза Cry3A, обладающего существенно большей растворимостью, было более перспективным, но требовало доказательства наличия у этого фрагмента биологической активности по отношению к личинкам T. molitor. С этой целью был получен химотриптический гидролизат δ-эндотоксина Cry3A, содержавший фрагменты 65; 59; 55,5 и 49 кДа, причём последний был преобладающим (рис. 9). В ходе хроматографии этого гидролизата на анионообменнике MonoQ были получены четыре фракции (рис. 9). Фракция 1 содержала химотрипсин, тогда как во фракциях 2-4 с колонки элюировали продукты гидролиза Cry3A, причём в пике 2 компоненты гидролизата присутствовали в приблизительно одинаковых количествах, тогда как во фракциях 3 и 4 фрагмент с молекулярной массой 49 кДа содержал лишь небольшую примесь других фрагментов (рис. 9). Рисунок 9. (а) Анионообменная хроматография химотриптического гидролизата δ-эндотоксина Cry3A на колонке MonoQ, уравновешенной 50 мМ карбонатным буфером, рН 9,4. Элюцию осуществляли градиентом концентрации NaCl (0-1М) в том же буфере. (б) Электрофорез фракций, полученных в ходе анионообменной хроматографии химотриптического гидролизата Cry3A. (исх) – исходный гидролизат; (1,2,3,4) – фракции, соответствующие полученным при хроматографии. Изучение биологической активности показало, что гибель личинок T. molitor от продуктов протеолиза Cry3A, элюировавшихся с колонки в составе фракций 2 и 4, практически не отличается от их гибели от кристаллов ssp. tenebrionis, как на 15-е, так и на 21-е сутки (таблица 3). Величины ЛВ50, т.е. время, за которое гибнет 50% насекомых, для обеих фракций также статистически не отличаются от соответствующего показателя для кристаллов. Таблица 3. Смертность личинок T. molitor при действии кристаллов B. thuringiensis ssp. tenebrionis и продуктов протеолиза δ-эндотоксина Cry3A Белок (мг/г корма) Препарат Кристаллы B. thuringiensis ssp. tenebrionis Фракции, полученные в ходе хроматографии химотриптического гидролизата Cry3A: фракция 1 фракция 2 фракция 4 Смертность (%, М±∆) 15 сут. 21 сут. ЛВ50 (сутки, мин÷макс) 0,3 47±13 80±23 14÷16 1,4 0,3 0,3 0 59 ±2 9 53 ± 4 0 89 ± 1 87 ± 13 15÷17 15÷17 Из полученных данных следует, что 49 кДа фрагмент Cry3A (Cry3A49кДа) не отличается от исходного δ-эндотоксина по токсичности для личинок T. molitor, что делает правомерным его использование для выделения Cry3A-связывающих белков. При хроматографии на колонке Cry3A49кДа-аминогексилагароза экстрактов, полученных при обработке BBMV из PM T. molitor н-октилгликозидом, большая часть мембранных белков не связывалась с сорбентом и выходила в проскоке. В тоже время 1 М NaCl элюировал белки с мол. массой 66 и 58 кДа, способные реагировать с биотинилированными токсинами Cry3А и Cry3A49кДа в условиях лиганд-блоттинга (рис. 8). Поскольку связывание с аффинным сорбентом происходит в условиях, близких к нативным, то можно сделать вывод, что выделенные нами белки способны связываться с токсинами не только в денатурированном (условия лиганд-блоттинга), но и в нативном состоянии. Взаимодействие выделенных из BBMV T. molitor и G. mellonella белков с токсинами В. thuringiensis, обладающими различной специфичностью энтомоцидного эффекта. Изучение специфичности связывания является важным этапом в доказательстве участия данного токсинсвязывающего белка в исполнении рецепторной функции in vivo. В условиях лиганд-блоттинга белки, элюируемые 1M NaCl с Cry3А49кДа- аминогексилагарозы, одинаково реагируют с биотинилированными δ-эндотоксином Cry3А, и его 49кДа фрагментом, взятыми в концентрации 4 мкг/мл. В тоже время, они практически не взаимодействуют с биотинилированными токсинами Cry11A (обладающим москитоцидной активностью) и Сry9A65кДа (действующим на гусениц), используемыми в концентрации 8 мкг/мл (рис. 10). Эти результаты доказывают высокую специфичность, проявляемую 66 кДа и 58 кДа белками из T. molitor при взаимодействии с эндотоксином Cry3A. В свою очередь, 67 кДа белок, элюированный аминогексилагароза 0,1 М N-ацетилгалактозамином, с колонки Cry9A65кДа- не проявлялся при обработке нитроцеллюлозных реплик биотинилированными токсинами Cry3A, Cry3А49кДа и Cry11A, не эффективными против гусениц G. mellonella, а также биотинилированным БСА (данные не приводятся), что говорит о специфичности его связывания с Cry9A65кДа. Рисунок 10. Изучение связывания белками, элюированными с Cry3А49кДа-аминогексилагарозы, δэндотоксинов В. thuringiensis различной специфичности. Нитроцеллюлозные реплики, содержащие 66 и 58 кДа белки, инкубировали со следующими биотинилированными токсинами: 1- Cry3A, 2 – Cry9A65кДа, 3- Cry11A. Обработка нитроцеллюлозных реплик, содержащих белки, элюированные с аффинного токсина сорбента, Cry3А и Cry3А49кДа-аминогексилагароза, 20-кратного избытка его смесью биотинилированного небиотинилированного варианта (гомологическая конкуренция) не приводила к визуализации соответствующих полос. Из этого следует, что связывание указанных белков с Cry3A не является следствием биотинилирования небиотинилированных последнего. Cry11A и Зато присутствие Cry9A65кДа. 20-кратного (гетерологическая избытка конкуренция) не отражалось на способности биотинилированного Cry3A окрашивать полосы 66 и 58 кДа, что лишний раз свидетельствует о специфичности связывания. Полученные данные суммированы в таблице 4. Аналогичные результаты были получены при использовании в экспериментах по гомологической и гетерологической конкуренции биотинилированного Cry3A49кДа . Таблица 4. Специфичность взаимодействия белков, полученных в ходе аффинной хроматографии, с различными Cry-токсинами в экспериментах по лиганд-блоттингу. Токсины Элюированные белки 66 и 58 кДа белки из BBMV T. molitor 67 кДа белок из BBMV G. mellonella Окрашивание полос биотинилированный токсин (2,5 мкг/мл) небиотинилированный токсин (50 мкг/мл) Cry3A49 - есть Cry3A49 Cry3A49 нет Cry3A49 Cry9A65 есть Cry3A49 Cry11A есть Cry9A65 - нет Cry11A - нет Cry9A65 - есть Cry3A - нет Cry11A - нет Идентификация токсинсвязывающих белков BBMV T. molitor и G. mellonella. Материал, содержащийся в полосе, соответствующей 67 кДа белку из BBMV G. mellonella, был проанализирован автоматическим методом Эдмана и установлена следующая последовательность остатков аминокислот: Leu-Asn-Leu-Asn-Gln-Asn-Leu. В ресурсе “Proteins” в NCBI последовательности белков G. mellonella отсутствуют. Использование ресурса первичных структур белков Lepidoptera позволило обнаружить 71% совпадения при сравнении указанной последовательности с последовательностью аминокислот аминопептидазы N4 Plutella xylostella (accession number AAS75552) на отрезке между остатками 98 – 104. Более того, среди банка расшифрованных последовательностей белков Lepidoptera отсутствуют другие кандидаты на роль ортологов изучаемого белка. Аминопептидазы являются одним из наиболее распространенных классов рецепторов Сry-токсинов. К сожалению, по величине мол. массы выделенный нами белок меньше аминопептидазы N4 P. xylostella (106,6 кДа,) и других аминопептидаз чешуекрылых (100-170 кДа). Остаётся предположить, что нами был выделен продукт ограниченного протеолиза аминопептидазы N G. mellonella. Исходя из данных масс-спектрометрии, 58 кДа-белок был идентифицирован нами как α-амилаза T. molitor (Р56634). Имеются сообщения о том, что некоторые белки, относящиеся к семейству α-амилаз, служат рецепторами ряда токсинов В. thuringiensis. Эти белки связаны с мембраной посредством GPI-якоря, в то время как описанная α-амилаза T. molitor является растворимым белком и не имеет потенциального сайта GPI-модификации. Однако 58кДа белок выделен нами из BBMV насекомого. Можно предположить, что он является неописанной до настоящего времени мембранной формой α-амилазы T. molitor. С другой стороны, нельзя исключить, что растворимая α-амилаза T. molitor может образовывать комплекс с мембранными белками кишечного эпителия. Масс-спектрометрическое исследование показало, что 66 кДа белок из BBMV T. molitor обладает сходством с A-субъединицей V-АТФазы из малого мучного хрущака Tribolium castaneum. Факт, что субъединица V-АТФазы демонстрирует специфическое сродство к Cry-белку не является неожиданностью, поскольку ранее похожие результаты были получены при идентификации Cry1Ac-связывающих белков из BBMV Heliothys virescens. Таким образом, в ходе проведенных исследований нам удалось идентифицировать токсинсвязывающие белки из кишечного эпителия гусениц G. mellonella и личинок T. molitor. Однако, требуются дополнительные исследования для доказательства того, что эти белки действительно выполняют роль рецепторов активированного токсина Cry9A и δэндотоксина Cry3A в организме указанных насекомых in vivo. 3. Изучение действия δ-эндотоксина Cry3A на ионную проницаемость апикальной мембраны эпителиальных клеток средней кишки личинок T. molitor Следующая стадия токсического эффекта Cry-белков заключается в том, что конформационные изменения в молекулах токсина, вызванные его взаимодействием с рецептором, приводят к образованию им пор или ионных каналов в апикальной мембране эпителиальных клеток чувствительного насекомого. До настоящего времени большинство исследований мембранотропного эффекта Cry-белков проводилось на препаратах мембран кишечного происхождения из гусеницфитофагов, которые существенно отличаются от личинок многих других насекомых по физиологическим и биохимическим особенностям пищеварительной системы. Вместе с тем аналогичные исследования для личинок жуков практически не проводились. Для доказательства способности Cry-белков образовывать в апикальных мембранах чувствительных насекомых поры или ионные каналы применяются несколько модельных систем, одной из которых является использование потенциал-чувствительных красителей. Эти красители способны проникать внутрь мембраны, причем их проникающая способность зависит от трансмембранного потенциала. Краситель, связанный с мембраной, существенно отличается по своим оптическим свойствам от свободного красителя. Обычно с этой целью применяется краситель Dis-C3-(5). В данной работе впервые использованы другие потенциал-чувствительные красители, сафранин О и оксонол VI, а также акридиновый оранжевый, чья поглощающая способность зависит не от трансмембранного потенциала, а от градиента концентраций ионов водорода. В настоящее время в литературе существуют довольно противоречивые данные о наличии собственных ионных каналов в апикальных мембранах эпителиальных клеток средней кишки насекомых, поэтому первая серия экспериментов была направлена на изучение собственной проводимости препарата апикальных мембран T. molitor. Помещение BBMV, нагруженных в ходе выделения ионами магния, в бессолевую буферную среду приводило к возникновению трансмембранного потенциала со знаком «-» на внутренней стороне мембраны, что детектировалось с помощью потенциал чувствительного красителя сафранина О, который менял свои оптические свойства (рис.11а). Очевидно, это связано с выходом ионов магния через собственные ионные каналы по градиенту концентраций. Действительно, добавление во внешнюю среду 20 мM MgSO4, CaCl2 или липофильного катиона тетрафенилфосфония (TPP+) приводило к подавлению трансмембранного потенциала (рис.11а). Тот факт, что блокаторы кальциевых каналов, такие как верапамил и соли лантана, кобальта и никеля, имели аналогичный эффект, позволяет предположить, что собственные ионные каналы BBMV T. molitor родственны кальциевым каналам клеточных мембран млекопитающих. Рисунок 11. Спонтанная генерация в BBMV мембранного потенциала («минус» внутри везикул) (а) и кислотного сдвига рН (∆рН) внутри везикул (б) при их инкубации в бессолевой буферной среде и чувствительность этих процессов к сантимолярным концентрациям сульфата магния и калия, хлорида кальция, TPP+ и к блокаторам Са2+-каналов клеточных мембран. BBMV, нагруженные ионами магния в ходе выделения, суспендировали, в буферной среде (рН 8,6), содержащей сафранин О (а) или акридиновый оранжевый (б). К суспензии добавлено (указано стрелкой) 20 мМ MgSO4, K2SO4 и CaCl2, 0,6 мМ TPPCl, 100 мкМ LaCl3, CoCl2, NiCl2 и верапамила (Ver.), 2 мкМ FCCP и 4 мкМ валиномицина. Добавление везикул возникновению на в среду с высокой концентрацией соли, приводило к мембране потенциала со знаком «+» внутри везикул, что детектировалось с помощью другого красителя – оксонола VI (рис. 12). Рисунок 12. Генерация диффузионного потенциала К+ в BBMV, запускаемая добавлением к ним сантимолярных концентраций сульфата калия и действие на этот процесс δ-эндотоксина Cry3А. Интересный эффект был обнаружен при использовании акридинового оранжевого (рис.11б). Помещение нагруженных ионами магния BBMV в бессолевую среду сопровождалось также снижением рН внутри везикул. По всей видимости, наблюдаемый сдвиг рН, вызван транспортом протонов внутрь везикул, в ответ на выход ионов Mg2+ наружу. Об этом свидетельствует существенное ускорение процесса закисления среды внутри везикул в присутствии протонофора FCCP, а также быстрое обращение его после добавления к везикулам MgSO4 , К2SO4, валиномицина и вышеуказанных блокаторов Саканалов. Таким образом, мы показали, что в апикальной мембране кишечного эпителия T. molitor имеются собственные ионные каналы, проницаемые для таких катионов как калий, кальций и магний и слабопроницаемые для анионов. Вторая серия экспериментов была направлена на изучение проницаемости везикулярных мембран под действием δ-эндотоксина Cry3А. Как видно из рисунка 12, добавление Cry3А приводит к увеличению проницаемости мембран для ионов калия, причем это увеличение зависит от концентрации токсина, потому что последовательное добавление новых порций этого белка усиливает эффект. В свою очередь, если нагруженные ионами магния везикулы поместить в бессолевую среду, добавление токсина вызывает увеличение поляризации мембраны со знаком «-» внутри везикул (сафранин О), которое снимается добавлением в среду сульфата магния (рис. 13а). Интересно, что и в этом случае происходит компенсационное изменение транспорта протонов и закисление среды внутри везикул, как и в случае собственных каналов (рис. 13б). Рисунок 13. Гиперполяризация BBMV (а) и стимуляция кислотного сдвига рН внутри везикул (б) в бессолевой буферной среде (рН 8,6), запускаемые добавлением к везикулярной суспензии δэндотоксина Cry3A. BBMV, нагруженные Mg2+, суспендировали в буферной среде (рН 8,6), содержащей сафранин О (а) или акридиновый оранжевый (б). К суспензии добавлено (указано стрелкой) 40 нМ Cry3A, 20 мМ MgSO4 и 2 мкМ FCCP. Подводя итог, можно заключить, что Cry3А увеличивает проницаемость мембраны BBMV T. molitor для ионов щелочных и щелочноземельных металлов в заметно большей степени, чем для соответствующих анионов (противоионов) за счет образования новых (или активации собственных) ионных каналов. ВЫВОДЫ 1. Впервые охарактеризован комплекс протеолитических ферментов средней кишки гусениц Galleria mellonella, осуществляющий высокоэффективный ограниченный протеолиз токсичного для этого насекомого белка Cry9А. Показано, что преобладающими протеиназами кишечного экстракта являются сериновые протеиназы. Выявлено наличие 5 форм трипсина и 2 форм химотрипсина. 2. Выделена и частично охарактеризована одна из форм трипсина. Показано, что в протеолизе δ-эндотоксина Cry9А принимают участие как трипсин, так и химотрипсин. 3. С помощью аффинной хроматографии из BBMV Galleria mellonella выделен белок, специфически связывающий активированный δ-эндотоксин Cry9А, относящийся к классу аминопептидаз. Аналогичным образом из BBMV Tenebrio molitor выделены Cry3A-связывающие белки - α-амилаза и А-субъединица вакуолярной АТФ-азы. 4. Показано, что апикальные мембраны эпителиальных клеток личинки мучного хрущака имеют собственные ионные каналы, проницаемые для ионов K+, Mg2+ и Ca2+, но не проницаемые для крупных анионов. δ-Эндотоксин Cry3A увеличивает проницаемость данных мембран за счет образования новых (или активации собственных) каналов. ионных Список публикаций по теме диссертации 1. Жужиков Д.П., Залунин И.А., Лютикова Л.И., Булушова Н.В., Ревина Л.П., Честухина Г.Г. (2010) растворимого 49 кДа Сравнительное изучение действия эндотоксина Cry3A и его фрагмента на личинок жуков-чернотелок (Coleoptera: Tenebrionidae). Биотехнология, 3, 43-49. 2. Андреев И.М., Булушова Н.В., Залунин И.А., Честухина Г.Г. (2009) Действие энтомоцидных белков из бактерии Bacillus thuringiensis на ионную проницаемость апикальных мембран кишечного эпителия личинок Tenebrio molitor. Биохимия, 74(10), 1346-1355. 3. Булушова Н.В, Андреев И.М., Залунин И.А.,. Честухина Г.Г. Увеличение ионной проницаемости апикальной мембраны кишечного эпителия личинок Tenebrio molitor под действием δ-эндотоксина Cry3A, продуцируемого ssp. tenebrionis Bacillus thuringiensis. Материалы симпозиума, IV Российский симпозиум «Белки и пептиды», Казань 2009, с. 334. 4. Goptar, . I. A.,. Filippova, I.Yu., Lysogorskaya, E.N.,Oksenoit, E.S., Vinokurov, K.S., Zhuzhikov, D.P., Bulushova, N.V., Zalunin, I.A., Dunaevsky, Y.E.,. Belozersky, M.A., Oppert, B. and Elpidina, E.N (2008) Localization of post-proline cleaving peptidases in Tenebrio molitor larval midgut. BIOCHIMIE, 90, 508-514. 5. Булушова Н.В., Залунин И.А. Выделение токсинсвязывающего белка из кишечного эпителия личинок мучного хрущака Tenebrio molitor. Материалы конференции, Международная школа-конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология», Москва-Пущино, 2008, с. 109.
