СВОЙСТВА ТРЕХМЕРНЫХ МАТРИКСОВ ИЗ РЕКОМБИНАНТНОГО АНАЛОГА СПИДРОИНА 1
advertisement
На правах рукописи ПУСТОВАЛОВА Ольга Леонидовна СВОЙСТВА ТРЕХМЕРНЫХ МАТРИКСОВ ИЗ РЕКОМБИНАНТНОГО АНАЛОГА СПИДРОИНА 1 Специальность 03.01.03 – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учѐной степени кандидата биологических наук Москва-2010 Работа выполнена на Биологическом факультете Московского Государственного Университета (МГУ) имени М.В.Ломоносова, в ФГУ "Федеральный Научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения и социального развития РФ Научные руководители: доктор биологических наук Агапов Игорь Иванович Федеральный Научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова кандидат биологических наук МГУ имени М.В.Ломоносова, Москва; Мойсенович Михаил Михайлович Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор ФГУП «ГосНИИгенетика» Носиков Валерий Вячеславович кандидат биологических наук ФГУ НИИ физико-химической медицины ФМБА России Демина Ирина Андреевна Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН Защита состоится «__» апреля 2010 г. в «14.00» часов на заседании диссертационного совета Д.217.013.01 при ФГУП «Государственный научноисследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545 Россия, Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика». Реферат разослан «___» марта 2010 г. Учѐный секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук Воюшина Т.Л. 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Развитие клеточных технологий и вовлечение новых методов молекулярной биологии открывает возможности для восстановления значительных дефектов тканей и органов с использованием созданных in vitro искусственных тканей. Основой искусственных тканей становятся носители трехмерного строения (их называют матриксами или матрицами), которые служат субстратом для адгезии аутологичных клеток, способствуя поддержанию их пролиферативной активности, определяют форму и физико-механические свойства медицинского изделия. В наше время предпочтение отдается полимерам биологического происхождения или композитным материалам на их основе, так как они, обладая высокой прочностью, не оказывают токсического действия, и более того, могут служить высокоэффективными биостимуляторами. Уникальным материалом, сочетающим высокую прочность и эластичность, является шелк паутинной нити. Эти свойства, наряду с хорошей биологической совместимостью, делают шелк перспективным материалом для использования в тканевой инженерии. Однако получение природного паутинного шелка связано со значительными трудностями и обычно нерентабельно, а количество шелка недостаточно для широкого практического применения. Успехи в расшифровке генов паутинных белков и создание их рекомбинантных аналогов позволило получить материалы, подобные природному шелку. В настоящее время исследуются свойства этих материалов, а также возможность их практического использования. В ГосНИИгенетика ранее был получен белок 1F9 - аналог спидроина 1 Nephila clavipes [Богуш В.Г. и др., 2006; Bogush V.G. et al., 2009], который может стать основой при создании матриксов для тканевой инженерии Цель работы: получить и исследовать биологические свойства трехмерных матриксов из рекомбинатного аналога спидроина 1 для применения в тканевой инженерии. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: Разработать методику получения искусственных матриксов, изучить их физические, морфологические, топографические свойства и скорость деградации в модельной системе. Изучить способность искусственных матриксов поддерживать адгезию, пролиферацию и жизнеспособность культивируемых эукариотических клеток. Изучить местное действие матриксов после имплантации в ткани животных. Научная новизна работы. Разработанный в ГосНИИгенетика рекомбинантный аналог природного спидроина Nephila clavipes был впервые использован для изготовления пористых трехмерных матриксов. Были изучены 3 макро- и микроструктурные особенности эти конструкций, их механические свойства и способность к деградации, а также возможности химической модификации. Мы показали, что матриксы из аналога спидроина 1 способны поддерживать адгезию и пролиферацию эукариотических клеток in vitro. Впервые было изучено местное действие матриксов из аналога спидроина 1 после имплантации в ткани животных. Показано, что после имплантации материал подвергается биодеградации и замещается васкуляризованной новообразованной тканью. Практическая значимость. Спидроины, обладают уникальным сочетанием механических свойств, являются биосовместимым, биоинертным материалом, способным к биодеградации. Разработка методов получения рекомбинантных аналогов этих белков расширила возможности практического применения спидроинов. Матриксы из рекомбинантного аналога спидроина 1 можно использовать для создания конструкций медицинского назначения, таких как имплантаты для замещения дефектов ткани, целостность которых не может быть восстановлена естественной физиологической репарацией. Матриксы могут служить основой для создания трехмерных клеточных культур in vitro для моделирования различных биологических процессов, например, для изучения процессов репарации и клеточной миграции. Культивирование клеток в трехмерной среде расширяет возможности исследования нормальных физиологических функций клеток и влияния на эти функции микроокружения и топографии субстрата. Внедрение новых медицинских технологий и создание новых моделей для исследований в клеточной биологии позволяет серьезно продвинуться в области восстановительной медицины и решить ряд значительных медицинских проблем биотехнологическими методами. Апробация работы. Результаты настоящей работы докладывались на X Китайско-Российском Симпозиуме «Новые материалы и технологии» (г. Дзясин, 2009). Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседании кафедры физиологии микроорганизмов биологического факультета МГУ от 23 октября 2009 г и секции «Молекулярная биология» Ученого Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» от 25 февраля 2010 г. Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ в рецензируемых журналах. Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих глав: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы, список литературы. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста и содержит 24 рисунка и 2 таблицы. Библиография включает 173 литературных источника. 4 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1 ФИЗИЧЕСКИЕ, МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ТОПОГРАФИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МАТРИКСОВ ИЗ АНАЛОГА СПИДРОИНА 1 1.1 МАКРОСТРУКТУРА ТРЕХМЕРНЫХ МАТРИКСОВ Пористые матрицы из спидроина 1 получали методом выщелачивания, с использованием NaCl в качестве порообразующего агента. Структуру полученных матриц изучали методами световой и электронной микроскопии. На рисунке 1А представлено изображение среза пористой матрицы из спидроина 1 с макропорами диаметром до 400 мкм, что соответствует размеру порообразующих частиц. Также мы изучили структуру матриц в водной среде, которая способствует изменению конформации макромолекул полимера [Vehoff T. et al., 2007]. Было выявлено, что в водной среде не происходит деформации макропор и изменения их диаметра (рисунок 1Б). Диаметр макропор влияет на механические свойства матрицы, скорость биодеградации, взаимодействие клеток с ее поверхностью [Lee J.J. et al., 2007; Ma P.X. and Langer R., 1999; O'Brien F.J. et al., 2007] и тканевый ответ после имплантации [Wang Y. et al., 2008]. Предпочтительным для создания имплантатов является большой диаметр макропор, как в полученных матриксах. Макропоры матрикса представляют собой незамкнутые полости, соединенные каналами и отверстиями и такая структура сохраняется в водной среде (рисунок 1). Рисунок 1. Макропористая структура матриц из аналога спидроина 1. Макропоры имеют незамкнутое строение и соединены каналами и отверстиями, что показано методами (А) сканирующей электронной микроскопии, (Б) сканирующей лазерной конфокальной микроскопии. Представлена горизонтальная проекция серии оптических срезов слоя матрицы (45 мкм), выполненных с интервалом 0,9 мкм. Материал матрицы визуализирован TRITC. Соединенность пор матрицы также подтверждена тестом на проницаемость пористых конструкций для суспендированных окрашенных 5 частиц (тушь) [Gellynck K. et al., 2008b]. Незамкнутая структура матрицы способствует миграции клеток во внутренние слои искусственного матрикса, обеспечивает обмен питательной среды и удаление продуктов метаболизма. Такое строение необходимо для трехмерного культивирования клеток и создания гомогенной среды внутри матриц. 1.2 МИКРОСТРУКТУРА ТРЕХМЕРНЫХ МАТРИКСОВ Стенки макропор матрикса имеют микропористую структуру, которую при агрегации рекомбинантный спидроин 1 формирует спонтанно (рисунок 2). Рисунок 2. Микропористая структура матриц из аналога спидроина 1. (А) Структура показана методом электронной микроскопии. (Б) Микропористое строение матрикса в водной среде показано методом лазерной конфокальной микроскопии. Матрикс визуализировали конъюгацией с TRITC Поверхность макропор матрикса пронизана отверстиями малого диаметра (2-10 мкм). Наблюдать такую структуру можно как в дегидратированном матриксе (рисунок 2А), так и в водной среде (рисунок 2Б). Ранее было показано, что пленки [Bogush V.G. et al., 2009] и фибриллы [Соколова О.С. и др., 2009] из рекомбинантного аналога спидроина 1 также имеют микропористое строение. Однако такая микроструктура не является характерной особенностью полимеров других видов шелка. Натуральные паутинные нити обычно имеют гомогенную структуру, как показано длягомогенную нитей каркасной структуру, нити как паутины показано Nephila для senegalensis [Vehoff T. et al., 2007]. Образование нитеймикропористой каркасной нити структуры паутины может Nephila быть свойственно другим аналогам паутинного senegalensis шелка, и этот [Vehoff вопрос требует T. et дальнейшего al., 2007]. изучения. Однако было показано, что гомогенное Образование строение микропористой без микропор свойственно структуры нитям из рекомбинантного миниатюрногоможет аналогабыть спидроина Euprosthenops australis [Stark M. et al., 2007] и из аналога спидроина Araneus diadematus [Lazaris A. et al., 2002]. Микроструктура поверхности матрицы влияет на адгезию клеток и на взаимодействие с окружающей тканью после имплантации [Bacakova L. et al., 2004a; Cai Q. et al., 2002; Campbell C.E. and von Recum A.F., 1989; Lampin M. et al., 1997; Mata A. et 6 al., 2003; Singhvi R. et al., 1994; Von Recum Andreas F et al., 1996]. Значение уникальной микропористой структуры полученных нами матриксов может быть выяснено при изучении роста и пролиферации в них эукариотических клеток in vitro и ответа со стороны реципиента при имплантации матриц. 1.3 ДЕСТРУКЦИЯ МАТРИКСОВ ИЗ АНАЛОГА СПИДРОИНА 1 Мы изучили деградацию матриксов из рекомбинантного спидроина 1 при продолжительной инкубации в нейтральной и окисляющей средах. Искусственные матриксы были стабильны в нейтральной среде. В течение 11 недель их масса изменялась не более чем на 20 % (рисунок 3). Рисунок 3. Деструкция матриксов из аналога спидроина 1 в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и в реактиве Фентона. После имплантации таких матриксов в ткани животных, они могут подвергнуться воздействию агрессивной окисляющей среды, которая формируется при развитии реакции на инородное тело. Химия реакций клеточного ответа может описываться реакцией Фентона [Winyard P.G. et al., 2009]. Мы смоделировали такие агрессивные условия in vitro и изучили скорость деструкции матриц из аналога спидроина 1 в реактиве Фентона. Под воздействием гидроксильных радикалов реактива Фентона матрикс из рекомбинантного спидроина 1 разрушается на 73 % к 4-й неделе и полностью разрушается к 11-й неделе. Быстрая деградация материала предполагает и биорезорбцию тканеинженерной конструкции из спидроина 1 в условиях выраженного клеточного ответа. Для повышения устойчивости к действию окисляющей среды, мы использовали метод ковалентной перешивки полимеров матрицы глутаральдегидом. Деградация обработанного матрикса в реактиве Фентона после перешивки была значительно менее интенсивной в сравнении с деградацией необработанного матрикса (рисунок 4). 7 Рисунок 4. Деструкция перешитых глутаральдегидом матриц из аналога спидроина 1 в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и в реактиве Фентона. Реактив Фентона разрушает модифицированный матрикс через 4 недели на 27 %, и только к 14-й неделе масса уменьшается на 42 % (рисунок 4). Медленная деградация матрикса, перешитого глутаральдегидом, будет способствовать его значительной устойчивости и стабильности. 1.4 МЕХАНИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МАТРИКСОВ Природные спидроины сочетают высокую прочность и эластичность [Cunniff P.M. et al., 1994]. Мы изучили механические свойства пористых матриц, изготовленных в форме брусков из рекомбинтного аналога спидроина 1. Значения предела прочности и растяжимости матриксов представлены в таблице 1. Таблица 1. Механические свойства матриц из рекомбинантного аналога спидроина 1 Тип матрикса Предел прочности на разрыв Растяжимость Матрикс из спидроина 1 9,8±0,8 Н/см2 275±20 % Модифицированный глутаральдегидом матрикс 16±0,7 Н/см2 350±34 % Полученные данные предполагают, что исследуемые трехмерные пористые матрицы могут быть хорошими кандидатами для имитации физикомеханических свойств эластичных тканей. Однако значения механической прочности полученных матриксов меньше, чем ожидалось, исходя из известных из литературы данных о прочности природного спидроина. Однако другие аналоги спидроинов 1 Nephila clavipes, которые были получены разными исследовательскими группами, также уступают в прочности природным белкам [Fahnestock SR, 1994; Seidel A. et al., 2009b]. Такая разница может быть связана со сравнительно небольшим размером макромолекул полученных белкованалогов и отличиями в аминокислотной последовательности [Candelas G.C. and Cintron J., 1981; Jackson C. and Obrien J.P., 1995; Sponner A. et al., 2005]. Метод ковалентной перешивки матриксов улучшает показатели механической прочности и растяжимости матриксов из аналога спидроина 1 (таблица 1). Возможность модификации свойств матриксов из аналога 8 спидроина 1 в будущем позволит разработать тканеинженерные конструкции, обладающие широким спектром характеристик, удовлетворяющих потребностям разных направлений тканевой инженерии. 2 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК В МАТРИЦАХ ИЗ РЕКОМБИНАНТНОГО АНАЛОГА СПИДРОИНА 1 2.1 ВЛИЯНИЕ МАТЕРИАЛА ИЗ РЕКОМБИНАНТНОГО АНАЛОГА СПИДРОИНА 1 НА АДГЕЗИЮ И ПРОЛИФЕРАЦИЮ КЛЕТОК Мы изучили возможность использования рекомбинантного аналога спидроина 1 в качестве субстрата для адгезии эукариотических клеток. Для изучения способности к адгезии и пролиферации клеток к матриксу нами был использован метод количественного подсчета прикрепившихся клеток. Для этого использовали неинвазивный метод сканирующей лазерной конфокальной микроскопии, позволяющий изучать препараты значительной толщины без нарушения их трехмерной архитектуры. В качестве контролей были выбраны хорошо изученные адгезионные поверхности - стекло и регенерированный фиброин Bombix mori. Последний является наиболее изученным типом шелка в тканевой инженерии. Способность фибробластов к адгезии на поверхности пленок из спидроина 1 оказалась выше, чем на стекле. Количество клеток на поверхности пленок из спидроина 1 и фиброина было сопоставимым, что указывает на хорошие адгезивные свойства исследуемого материала (рисунок 5). Рисунок 5. Динамика роста культуры эукариотических клеток на поверхности полимерных пленок. Для изучения влияния материала на динамику роста, фибробласты 3Т3 культивировали в течение 4 дней после их адгезии на поверхности пленок и сравнивали количество клеток на 2 поверхности площадью 1 мм . В первые сутки культивирования количество прикрепившихся клеток изменилось незначительно. На 4-е сутки на поверхности пленок из аналога спидроина был сформирован монослой клеток. Спидроин 1 по способности поддерживать рост и адгезию эукариотических клеток не уступал регенерированному фиброину, и количество клеток на поверхности пленок из этих полимеров на протяжении всего времени культивирования было сопоставимым (рисунок 5). Поскольку изделия из регенерированного шелка шелкопряда Bombix mori оказывают некоторое стимулирующее действие на рост стволовых мезенхимальных клеток 9 [Meinel L. et al., 2005b], субстрат из спидроина 1, вероятно, также может эффективно стимулировать клеточный рост. 2.2 ВЛИЯНИЕ АРХИТЕКТУРЫ ТРЕХМЕРНЫХ МАТРИКСОВ ИЗ РЕКОМБИНАНТНОГО АНАЛОГА СПИДРОИНА 1 НА АДГЕЗИЮ И ПРОЛИФЕРАЦИЮ КЛЕТОК Способность трехмерных матриц поддерживать рост и адгезию эукариотических клеток также определяется их микроархитектурой [Bacakova L. et al., 2004a]. Было изучено влияние архитектуры матриксов из спидроина 1 на адгезию мышиных фибробластов. Клетки фибробластов 3Т3 прикрепляются к поверхности матрицы в течение первых 2 часов после инокуляции. Морфотип клеток на поверхности матрицы (рисунок 6) типичен для фибробластов, что предполагает формирование хороших условий для адгезии. Рисунок 6. Морфология фибробластов 3Т3 на поверхности пористой матрицы из аналога спидроина 1. Изображение получено методом сканирующей электронной микроскопии. Представлен срез глубоких слоев матрицы с мигрировавшими в них клетками. Для оценки роста и адгезии эукариотических клеток определяли количество клеток в искусственных матриксах после инокуляции и в процессе культивирования (рисунок 7). После инокуляции количество прикрепившихся клеток было сопоставимым на поверхности матриц из спидроина и матриц из регенерированного фиброина (последние были использованы в качестве контроля адгезии и роста клеток). Рисунок 7. Изображение, использовавшееся для подсчета клеток. Представлена горизонтальная проекция серии из 100 оптических срезов от поверхности на глубину до 99 мкм, полученных методом конфокальной микроскопии. Матрикс выявлен TRITC (показан красным), ядра фибробластов 3T3 выявлены SYTOX (показаны зеленым). Мы наблюдали увеличение количества фибробластов на 3-ий и 14-ый день культивирования, свидетельствующее об активной пролиферации (рисунок 8). 10 0 Рисунок 8. Динамика роста популяции мышиных фибробластов 3T3 в пористых матриксах. На поверхности матриц из спидроина 1 через сутки после инокуляции и на протяжении всего времени культивирования были обнаружены делящиеся клетки. Присутствие таких клеток характерно для клеточной популяции, находящейся в стадии роста. 2.3 РАСПРЕДЕЛЕНИЕ КЛЕТОК В МАТРИЦЕ Для создания искусственных тканей и органов на основе искусственных матриксов необходимо равномерное распределение в нем клеток и однородное прорастание тканью [Ma P.X. and Langer R., 1999; Rose F.R. et al., 2004; Silva M.M. et al., 2006]. Мы изучили распределение клеток при культивировании их в пористых матриксах. Было показано, что фибробласты располагаются на поверхности макропор матрицы, и единичные клетки углублены в стенки макропор (рисунок 9). Рисунок 9. Фибробласты 3Т3 на стенках макропоры матрицы. Оптический срез в 50 мкм от поверхности матрицы. Матрикс выявлен TRITC (показан красным), ядра фибробластов выявлены SYTOX (показаны зеленым). Была изучена динамика изменения распределения клеток в трехмерной матрице в процессе двухнедельного культивирования при поверхностной инокуляции. усредненного по всем слоям матрицы. При культивировании было показано увеличение общего количества клеток (рисунок 10) 11 1 Рисунок 10. Увеличение общего 3 количества клеток 3Т3 в 1 мм матрицы при культивировании в течение 14 дней. Через 24 часа после инокуляции распределение клеток было крайне неравномерным по толщине матрицы. Прикрепившиеся клетки были преимущественно расположены на той же поверхности, на которую были инокулированы. На глубине более 200 мкм от поверхности были выявлены лишь единичные ядра клеток. Через две недели культивирования при общем увеличении количества клеток, их распределение по толщине стало более однородным, и плотность клеток в глубоких и наружных слоях матрицы стала сопоставимой (рисунок 11). Рисунок 11. Изменение распределения фибробластов 3T3 в матрице из спидроина 1 при культивировании. Увеличение общего количества клеток через 14 дней в наружном и внутреннем слоях было неравномерным: на глубине до 150 мкм количество клеток возрастало в 2,5 раза, а на глубине более 300 мкм в 11 раз. Наблюдаемая однородность распределения клеток могла быть достигнута благодаря активной миграции клеток во внутренние слои искусственного матрикса [Mandal B.B. and Kundu S.C., 2009b; Raeber G.P. et al., 2007], чему способствует соединенность макропор. Интенсивное увеличение количества клеток во внутренних слоях матрицы также может объясняться большей скоростью пролиферации, чем на поверхности. 2.4 ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ КЛЕТОК ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ В МАТРИЦАХ ИЗ РЕКОМБИНАНТНОГО АНАЛОГА СПИДРОИНА 1 Длительное поддержание жизнеспособности клеток необходимо для успешного применения матрицы в качестве субстрата для создания трехмерных клеточных культур. Мы культивировали фибробласты в матрицах из спидроина 1 в течение 7 дней и наблюдали за изменением соотношения живых и мертвых клеток в культуре. В это время также проявляется токсическое действие, влияющее на жизнеспособность клеток, которое могут оказывать компоненты материала. Для дифференцирования живых и мертвых клеток применили метод, основанный на избирательной проницаемости целостных и 12 2 поврежденных мембран клеток для пропидиум йодида (визуализирует ядра мертвых клеток) и SYTO 9 (визуализирует ядра живых клеток) (рисунок 12). Рисунок 12. Жизнеспособность популяции клеток при культивировании фибробластов в матрице из спидроина 1. (А) Через сутки культивирования на поверхности матрицы присутствовали живые клетки, выявленные SYTO 9 (показаны зеленым), мертвые клетки, ядра которых выявляли пропидиум йодидом, не обнаружены. (Б) Через 7 суток культивирования количество фибробластов возросло, выявлены мертвые клетки (показаны красным). В первый день инкубации все клетки, прикрепившиеся к поверхности, были жизнеспособны. При культивировании общее количество клеток увеличивалось, но появлялись мертвые клетки. В популяции присутствует значительное количество делящихся клеток, выявляемых по наличию веретена деления (рисунок 12). Увеличение количества клеток сопровождалось инфильтрацией фибробластами глубоких слоев матрицы. При культивировании клеток в тех же условиях на поверхности стекла происходило снижение количества жизнеспособных клеток (рисунок 13), но при этом клетки достигали стадии монослоя, что является пределом роста адгезионных культур на плоскости. Рисунок 13. Жизнеспособность фибробластов 3T3 при культивировании в матрице из аналога спидроина 1 или на плоской поверхности. Жизнеспособность выявляли по количеству живых клеток в культуре, ядра которых визуализированы SYTO 9. Высокая степень жизнеспособности клеток при культивировании их в матрице подтверждает отсутствие токсического действия спидроина 1 на культивируемые эукариотические клетки. Возможность длительного поддержания жизнеспособности 13 3 культивируемых клеток в матрице связывают с большей площадью поверхности в трехмерном пространстве. Но жизнеспособность культуры на поверхности и в глубине матрицы может существенно отличаться. Было показано, что количество мертвых клеток на внешней поверхности матрицы значительно превышает количество мертвых клеток на глубине более 60 мкм (рисунок 14). Рисунок 14. Жизнеспособность клеток в поверхностных и глубоких слоях матрицы через 7 дней культивирования. Показаны клетки (А) в поверхностных слоях и (Б) на глубине 20-120 мкм. Ядра живых клеток выявлены SYTO 9 (показаны зеленым).. Ядра мертвых клеток выявлены пропидиум йодидом (показаны красным). Представлены горизонтальные проекции серии оптических срезов матрицы на глубине до 20 мкм и на глубине 20-120 мкм общей площадью 0,6 мм2 На поверхности соотношение живых и мертвых клеток достигало 3:1, а на глубине более 60 мкм было менее 8:1. Таким образом, даже при однородном распределении клеток в толщине матрикса, в глубоких слоях популяция более жизнеспособна, чем на поверхности. Таким образом, поддержание адгезии, пролиферации и жизнеспособности клеток в матриксе из спидроина 1 свидетельствуют о формировании благоприятного микроокружения в глубоких слоях матрицы. 2.5 АДГЕЗИЯ И ПРОЛИФЕРАЦИЯ КЛЕТОК В МОДИФИЦИРОВАННЫХ МАТРИКСАХ ИЗ РЕКОМБИНАНТНОГО АНАЛОГА СПИДРОИНА 1 Выше было показано, что ковалентная перешивка матриксов глутаральдегидом замедляет деградацию матриц и повышает их механическую прочность. Для изучения влияния ковалентной перешивки матриц на адгезию и пролиферацию эукариотических клеток, мы культивировали на перешитых матрицах фибробласты 3T3 в течение двух недель. В качестве положительного контроля были использованы немодифицированные образцы. После инокуляции количество клеток на поверхности матриксов, перешитых глутаральдегидом, было значительно меньше, чем в контроле, что предполагает формирование менее благоприятных условий для адгезии. При двухнедельной инкубации общее количество клеток в матриксе, модифицированном глутаральдегидом, было в среднем в 20 раз меньше, чем в необработанном (рисунок 15). Применение других агентов для перешивки может улучшить 14 4 физические характеристики матриксов из рекомбинантного спидроина 1 без негативного влияния на рост эукариотических клеток. Структура рекомбинантного шелка значительно отличается от макромолекул межклеточного матрикса животных тканей [Craig C.L. and Riekel C., 2002], и трехмерные искусственные матриксы, изготовленные из полимеров шелка, не могут создать естественное микроокружение для культивирования клеток. Поскольку к свойствам материалов, служащих субстратом для создания трехмерных клеточных культур, предъявляются повышенные требования, используются различные методы модификации поверхности полимеров, призванные повысить их биосовместимость. Одним из методов является обработка культуральной поверхности веществами, такими как коллаген, облегчающими адгезию клеток. Через сутки на поверхности матриксов обработанных коллагеном и не обработанных было сравнимое количество клеток (рисунок 15). В первые три дня культивирования количество клеток в матриксах, обработанных коллагеном, возросло в 2,5 раза и было больше, чем в контроле. Через 2 недели количество клеток возросло в 7,8 раз, и было сопоставимо с количеством клеток в контроле (рисунок 15). Рисунок 15. Рост и адгезия мышиных фибробластов 3T3 в матрицах с модифицированной поверхностью. Таким образом, обработка коллагеном матриксов из спидроина 1 существенно не повлияла на адгезию и клеточный рост при двухнедельном культивировании. Статистически значимое отличие в количестве клеток наблюдалось на третий день культивирования, когда в функционализированном коллагеном матриксе было в 1,5 раза больше клеток, чем в контроле. Отсутствие значительного преимущества культивирования клеток в матриксах, обработанных коллагеном, может быть связано с неравномерным или недостаточным распределением молекул коллагена в пористой структуре. Так, согласно литературным данным, обработка материала коллагеном может влиять на адгезию клеток, но, как и в нашем эксперименте, не влияет на пролиферацию при долговременном культивировании [Li X. et al., 2008]. 15 5 2.6 ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ПОЛИМЕРА ПРИ ИЗГОТОВЛЕНИИ МАТРИЦ ИЗ СПИДРОИНА 1 НА АДГЕЗИЮ И ПРОЛИФЕРАЦИЮ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК Плотность материала и структура матрицы определяется условиями ее изготовления, и концентрация раствора полимера, из которого формируется матрикс, играет немаловажную роль. Поскольку структура искусственного матрикса влияет на адгезию и рост клеток, уменьшение концентрации полимера повлечет за собой изменения в способности поддерживать клетки в культуре. Для изучения влияния на биологические свойства концентрации полимера при изготовлении искусственных матриксов, получили пористые матрицы из растворов полимера 300 мг/мл, 100 мкг/мл и 60 мкг/мл (рисунок 16). Полученные матрицы были использованы для культивирования клеток. Через сутки после инокуляции, количество фибробластов на поверхности матриц, изготовленных из раствора с концентрацией полимера 300 мг/мл, было в 3 раза больше, чем в матрицах из раствора с концентрацией 60 мкг/мл. Последнее позволяет заключить, что в матрицах, изготовленных из растворов с меньшей концентрацией, формируются менее благоприятные условия для адгезии клеток. При двухнедельном культивировании разница в количестве клеток сохраняется. Рисунок 16. Динамика роста фибробластов 3Т3 в матрицах, изготовленных из аналога спидроина 1 с концентрацией 60, 100 и 300 мг/мл. В матрицах из раствора с меньшей концентрацией прирост количества клеток был более интенсивным. Это может быть связано с меньшей площадью поверхности культивирования, которая формируется в матриксах, изготовленных из концентрированных растворов. Меньшая площадь поверхности культивирования сокращает период времени, необходимый клеткам для формирования монослоя, после чего их пролиферативная активность уменьшается за счет контактного торможения. 3. ИССЛЕДОВАНИЕ МЕСТНОГО ДЕЙСТВИЯ МАТРИКСОВ ИЗ АНАЛОГА СПИДРОИНА 1 ПОСЛЕ ИМПЛАНТАЦИИ Было изучено местное действие трехмерных матриксов в экспериментальной модели in vivo для выявления возможного негативного влияния материала на ткани реципиента, способности матриксов поддерживать ангиогенез и новообразования ткани. Матрицы были имплантированы под кожу лабораторным мышам и через два месяца после имплантации матриксы извлекли. Для изучения были использованы традиционный анализ 16 6 гистологических срезов имплантата и новообразованной ткани и in situ выявление сосудов флуоресцентными красителями для трехмерной реконструкции сосудистого дерева методом конфокальной микроскопии. Работа проводилась совместно с к.б.н., ст.н.с. кафедры клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ Васильевой Т.В. 3.1 ИНТЕГРАЦИЯ В ОКРУЖАЮЩИЕ ТКАНИ МАТРИЦЫ ИЗ РЕКОМБИНАНТНОГО АНАЛОГА СПИДРОИНА 1 ПОСЛЕ ИМПЛАНТАЦИИ Процесс формирования новой ткани вокруг и внутри матрикса и прорастание еѐ сосудами является признаками хорошей интеграции имплантата. На процессы интеграции в значительной степени влияют особенности макро– и микроархитектуры имплантируемого матрикса [Campbell C.E. and von Recum A.F., 1989; Sharkawy A.A. et al., 1997]. Через два месяца после имплантации вокруг пористого имплантата из аналога спидроина 1 образовалась тонкая (до 40 мкм) соединительнотканная (фиброзная) капсула, что является естественной реакцией ткани на внедрение инородного тела (рисунок 17). Рисунок 17. Соединительнотканная капсула вокруг импланта из аналога спидроина 1 пронизана сосудами (показаны стрелкой). Окраска гематоксилином и эозином. Волокна межклеточного вещества соединительной ткани, окружающей матрикс, ориентированы параллельно поверхности имплантата или расположены рыхло. Вокруг имплантата также обнаружена жировая ткань, в некоторых участках замещающая тонкую фиброзную капсулу. Наблюдается прорастание кровеносных сосудов в соединительнотканную капсулу (рисунок 17). Таким образом, капсула вокруг имплантата не приводит к его изоляции, в отличие от капсулы плотного аваскулярного типа [Sieminski A.L. and Gooch K.J., 2000]. Соединительная ткань прорастает внутрь матрикса через отверстия макропор. Прорастающая соединительная ткань также имеет вид тяжей с ориентированными вдоль них вытянутыми фибробластоподобными клетками. Клетки новообразованной ткани контактируют с поверхностью макропор матрикса (рисунок 18), которая обладает хорошими адгезивными свойствами. Обнаружены сайты активного замещения матрикса молодыми фибробластами. Последние выявлены по морфологическим признакам, таким как рыхлвый хроматин ядра (эухроматин и каличие 1-2 ядрышек) (рисунок 18). 17 7 Рисунок 18. Прорастание новообразованной ткани в искусственный матрикс из спидроина 1. (А) Фибробластоподобные клетки и (Б) клетки жировой ткани прорастают в искусственный матрикс. Молодые фибробласты показаны стрелкой. Окраска гематоксилином и эозином. 3.2 КЛЕТОЧНЫЙ ОТВЕТ НА ИМПЛАНТАЦИЮ РЕКОМБИНАНТНОГО АНАЛОГА СПИДРОИНА 1 IN VIVO МАТРИЦЫ ИЗ Клеточный ответ на инородное тело развивается в рамках естественного ответа ткани на внедрение инородного материала [Anderson J.M. et al., 2008]. Внедрению иммунных клеток в имплантированный материал способствует микропористая текстура поверхности [Campbell C.E. and von Recum A.F., 1989; Padera R.F. and Colton C.K., 1996]. Изготовленный нами матрикс с микропористой поверхностью способствовал проникновению и адгезии макрофагов (рисунок 19). 8 Рисунок 19. Клеточный ответ на имплантацию матрицы из аналога спидроина 1. Среди клеточных элементов, прорастающих в макропоры обнаружены (А) макрофаги (показаны синими стрелками) и (Б) единичные гигантские клетки инородных тел (показана оранжевой стрелкой). Окрашен гематоксилином и эозином. На поверхности макропор имплантированного матрикса, а также в толще материала обнаружены макрофаги и гигантские клетки инородных тел. Они участвуют в разрушении инородного материала и способствуют миграции, пролиферации и дифференцировки клеток, обеспечивая васкуляризацию соединительной ткани вокруг имплантата [Moldovan L. and Moldovan N.I., 2005; Padera R.F. and Colton C.K., 1996]. 18 3.2.1 АНГИОГЕНЕЗ И НЕЙРОГЕНЕЗ В МАТРИЦАХ ИЗ РЕКОМБИНАНТНОГО АНАЛОГА СПИДРОИНА 1 IN VIVO Активные процессы ангиогенеза необходимы для успешного новообразования ткани [Kaully T. et al., 2009]. Было показано прорастание кровеносных сосудов в имплантированный матрикс из рекомбинантного аналога спидроина 1 (рисунок 20). 9 Рисунок 20. Ангиогенез в новообразованной ткани и деградация матрикса из аналога спидроина 1. Через 2 месяца после имплантации пористого матрикса из аналога спидроина 1 19 происходит прорастание новообразованной ткани в имплантат и частичная его деструкция. В новообразованной ткани (А), окружающей и (Б-Е) прорастающей в матрикс, выявлены сосуды (показаны желтыми стрелками) разного диаметра и нервные волокна (показаны зелеными стрелками). Деградация матрикса происходит неравномерно. По всей толщине материала стенок матрицы в результате его разрушения (Б, В, Г, Е) образовались многочисленные отверстия разного диаметра. Отдельные участки стенок макропор (Д) разрушены в меньшей степени, сохраняя исходную структуру матрицы. Окраска гематоксилином и эозином. Среди сосудов, прорастающих в имплантат, можно различить капилляры, артериолы и венулы. Кровеносные сосуды полнокровны, что свидетельствует о соединенности сосудов с кровеносным руслом. Признаки деградации васкулярной ткани отсутствуют. Были обнаружены как хорошо оформленные сосуды, так и вновь образовавшиеся (32 %), которые отличаются структурой эндотелия с крупными ядрами (“высокий эндотелий”), имеющими в зрелом сосуде более уплощенную форму. Большое количество новообразованных сосудов свидетельствует об активных процессах ангиогенеза и тканеобразования, продолжающихся в матриксе даже через 2 месяца после имплантации. Присутствие сосудов разного типа и диаметра (рисунок 20) свойственно естественной сосудистой архитектуре ткани [Sieminski A.L. and Gooch K.J., 2000]. Большой интерес представляют выявленные нервные волокна в прорастающей искусственные матриксы из аналога спидроина 1 ткани (рисунок 20Б, 20Г и 20Д). Прорастание нервов в имплантированный матрикс отмечается сравнительно редко. Например, это было показано при имплантации силикатного синтетического имплантата Actifuse и при восстановлении роговицы имплантатом на основе кополимера коллагена [Li F. et al., 2003]. Врастание нервной ткани в имплантат может быть связано с аккумуляцией макрофагов и ангиогенезом, поскольку рост нервных волокон регулируется факторами роста, секретируемыми макрофагами [Miyauchi A. et al., 1997] и эндотелиальными клетками [Gibran N.S. et al., 2003]. При исследовании трехмерной архитектуры сосудистого русла в имплантированной пористой матрице, было показано, что сосуды равномерно прорастают трехмерный искусственный матрикс (рисунок 21). Прорастание сосудов сопровождает рост соединительной ткани, и, поскольку не было обнаружено аваскулярных областей в имплантате, подтверждается равномерное заполнение внутреннего пространства имплантата новообразованной тканью. Отсутствие аваскулярной капсулы вокруг имплантата, васкуляризация окружающих матрикс тканей и прорастание сосудов и соединительной ткани в имплантированную матрицу подтверждает возможность применения в тканевой инженерии матриц с описанной структурной конфигурацией: большой диаметр макропор с микропористой поверхностью. 20 0 Рисунок 21. Сосуды прорастают сквозь имплантированную матрицу из спидроина 1. Представлена горизонтальная проекция серии оптических срезов. Сосуды выявлены Evans Blue (показаны красным). 3.2.2 ДЕГРАДАЦИЯ МАТРИЦ ИЗ РЕКОМБИНАНТНОГО АНАЛОГА СПИДРОИНА 1 IN VIVO Деградация матриксов после имплантации in vivo способствует замещению искусственного имплантата новообразованной тканью и происходит под воздействием химических компонентов межклеточной среды и при активном участии клеток-деструкторов [Mano J.F. et al., 2007; Sachlos E. and Czernuszka J.T., 2003]. Биодеградации при участии клеток иммунного ответа подвергаются изделия из разных видов шелка [Wang Y. et al., 2008; Fredriksson C. et al., 2009]. Макрофаги и гигантские клетки инородных тел, обнаруженные в контакте с поверхностью имплантата, способны к фагоцитозу и секретируют в окружающую среду свободные радикалы кислорода, ферменты и кислоты [Anderson J.M. et al., 2008]. В экспериментах in vivo через два месяца после имплантации, нативная структура имплантата из аналога спидроина 1 значительно разрушается и лишь отчасти сохраняет нативную структуру (рисунки 19 и 20). Макропоры деформированы прорастающей тканью, перегородки между порами разрушены и в отдельных участках трехмерный матрикс представлен изолированными фрагментами. Поверхность макропор матрикса имеет неровный рельеф, и в сайтах нарушения структуры их поверхности обнаруживаются макрофаги и единичные гигантские клетки инородных тел (рисунок 22). Рисунок 22. Иммунные клетки принимают участие в резорбции имплантированного матрикса. Гигантская клетка инородных тел показана стрелкой. Окраска гематоксилином и эозином. В цитоплазме макрофагов с признаками активного фагоцитоза (зернистость цитоплазмы) наблюдаются фрагменты фагоцитированного материала матрикса. При разрушении стенок матрицы образовались многочисленные отверстия 21 1 разного диаметра (от нескольких микрометров до сопоставимых по диаметру с толщиной стенок). Отверстия в стенках макропор также инфильтрированы макрофагами (рисунок 19). Внедрившиеся в поверхность материала клетки являются признаком деградации структур искусственного матрикса в процессе тканевого ответа на инородное тело. Разрушение материала матрицы через два месяца после имплантации, а также активное участие клеток в этом процессе, позволяет предположить быструю биорезорбцию имплантата и его полное замещение новообразованной тканью. Однако следует отметить, что через два месяца матрикс разрушен неравномерно и, кроме описанных деградирующих фрагментов, встречаются участки, сохранившие структуру, близкую к нативной (рисунок 19, 20). Такая деградация является характерной особенностью изделий из шелка разных видов. 3.3 ОТСУТСТВИЕ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ МАТРИЦ IN VIVO Эффективному замещению имплантата новообразованной тканью может препятствовать токсичность компонентов материала, из которого он изготовлен. Однако, есть данные о токсичном действии in vitro очищенного по стандартной методике шелка шелкопрядов (Bombix mori и Antheraea pernyi), также как и очищенного натурального шелка паука Nephila edulis [Hakimi O. et al., 2009]. Токсичностью обладают компоненты натуральной нити шелка, которые не удаляются стандартными методами очистки. Мы показали, что материал из рекомбинантного аналога спидроина 1 не оказывает токсического действия на эукариотические клетки в экспериментах in vitro. Гистологическое изучение имплантатов не показало никаких фенотипических изменений прорастающих в имплантат тканей, которые могли бы свидетельствовать о нарушениях физиологии контактирующих с матрицей клеток: адипоциты и фибробласты имеют характерные для клеток этого типа морфологию и размер. Высокий уровень васкуляризации подтверждает отсутствие токсического действия на эндотелиальные клетки. Таким образом, в отличие от природных регенерированных типов шелка, спидроин 1 нетоксичен по отношению к разным типам клеток in vivo, что является его несомненным преимуществом. Продукты деградации нетоксичных материалов, таких как полигликолиевая кислота (PGA), полимолочная кислота (PLA) и полиортоэфир (POE), обладают токсическим или ингибирующим действием за счет снижения уровня pH среды [Sachlos E. and Czernuszka J.T., 2003; Taylor M.S. et al., 1994]. Такие изменения могут оказывать негативное действие на формирование новой ткани в месте имплантации. При разрушении белковых полимеров, таких как аналог спидроина 1, образуются аминокислоты, не оказывающие токсического действия на клетки. Признаков формирования неблагоприятных условий для роста клеток в местах активной деструкции имплантата не обнаружено. Наоборот, как было отмечено выше, в местах разрушения матрикса происходит активный рост ткани и обнаруживаются молодые фибробласты. 22 2 ВЫВОДЫ 1. Трехмерные матриксы из рекомбинантного аналога спидроина 1 получены методом выщелачивания. Матриксы имеют характерную незамкнутую макропористую структуру с уникальным микропористым строением стенок макропор, характеризуются высокими показателями растяжимости и прочности на разрыв, демонстрируют стабильность in vitro в нейтральной среде и разлагаются при окислении. Механическая прочность и стабильность матриксов увеличивается после химической перешивки. 2. Матриксы из рекомбинантного аналога спидроина 1 могут быть использованы для долговременного культивирования эукариотических клеток. Модификация структуры и свойств поверхности матриксов химической перешивкой глутаровым альдегидом, а также изменение концентрации полимера при изготовлении матрикса может влиять на рост клеток. 3. Матриксы из аналога спидроина 1 не вызывают отторжения при имплантации, происходит биорезорбция матриксов и замещение их новообразованной собственной тканью животного, что сопровождается активными процессами неоваскуляризации и нейрогенеза. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Пустовалова О.Л., Агапов И.И., Мойсенович М.М., Еремин П.С., Казюлина А.А., Архипова А.Ю., Рамонова А.А., Богуш В.Г., Севастьянов В. И., Кирпичников М.П. Использование метода конфокальной микроскопии для изучения биологических свойств матрикса из рекомбинантной паутины. / Вестник трансплантологии и искусственных органов. – 2009. – Т.11, №2. - С. 54-59 2. Пустовалова О.Л., Мойсенович М.М., Еремин П.С., Архипова А.Ю., Рамонова А.А., Соколова О.С., Богуш В.Г., Агапов И.И., Кирпичников М.П. Культивирование клеток на трехмерной матрице из рекомбинантного спидроина 1. / Российский иммунологический журнал. – 2009. –Т.3(12), № 2. - С. 139-146 3. Агапов И.И., Пустовалова О.Л., Мойсенович М.М., Богуш В.Г., Соколова О.С., Севастьянов В.И., Дебабов В.Г., Кирпичников М.П. Трехмерный матрикс из рекомбинантного белка паутины для тканевой инженерии. / Доклады академии наук. – 2009. –Т.426, №1. -С. 115-118 4. Коньков А.С., Пустовалова О.Л., Агапов И.И. Биосовместимые материалы из регенерированного шелка для тканевой инженерии и лекарственной терапии. / Биотехнология. - 2010, №1 5. Agapov I.I., Pustovalova O. L., Moisenovich M. M., Bogush V. G., Sokolova O. S., Sevastyanov V. I., Debabov V. G., Gotye S.V., Kirpichnikov M. P. Recombinant spider silk scaffold for tissue engineering. / Rare metals. – 2009. V.28, P. 84-87. 23 3
