Филогенетический анализ видов рода Diphyllobothrium

Дипломная работа
Филогенетический анализ видов рода
Diphyllobothrium
(Diphyllobothriidae, Pseudophyllidea,
Cestoda, Platyhelminthes)
Кафедра цитологии и генетики
Сулейманов Марат Михайлович
Научный руководитель:
к.б.н, с.н.с. Катохин А.В.
Лаборатория молекулярной и
клеточной биологии, ИЦиГ СО РАН
Актуальность проблемы
1.
Серьѐзное заболевание, обусловленное
инвазией паразитов
2.
Широкое распространение
3.
Неконтролируемость современной
эпидемиологической обстановки
4.
Необходимость точной видовой
диагностики
•
D.hottai
•
D.dendriticum, D.ditremum
•
D.klebanovskii,D.nihonkaiense
•
D.latum
Молекулярно-генетические исследования видов рода
Diphyllobothrium
1.Филогения и филогеография
2.Молекулярная эпидемиология
3.ДНК-диагностика заболевания
Исследователь
Год
исследования
Ядерный
маркер
Митохондриаль
ный маркер
Logan et al.
2004
ITS2
Yera et al.
2008
ITS1, ITS2
CO1
Shimizu et al.
2008
ITS1
CO1, ND3
Arizono et al.
2009
ITS1, ITS2
CO1, ND3
Ono et al.
2010
Наша лаборатория
(ИЦиГ)
2009-2011
CO1
ITS1
CO1
Цель и задачи
Цель:
• Проанализировать генетическое
разнообразие видов рода
Diphyllobothrium.
Задачи:
• Создание коллекции препаратов ДНК из
образцов видов рода Diphyllobothrium.
• Выявление и анализ генетического
разнообразия по ряду ядерных и
митохондриальных маркеров.
Описание объекта исследований
В общей сложности 14 из более чем 50 когда-либо определѐнных видов
рода Diphyllobothrium считаются валидными в настоящее время (Ashford,
Crewe, 2003).
Возбудители дифиллоботриоза у человека насчитывают 10 видов
лентецов, из которых на территории России встречаются D. latum, D.
dendriticum, D. ditremum, а также D.nihonkaiense, D. klebanovskii, D.
hottai, распространѐнные только на Дальнем Востоке.


1


2
3
Морфология семейства лентецов на примере D. latum (по Pappas, Wardrop,
1997):
1. Стробила - два смежных членика (масштабный отрезок – 5 мм)
2. Сколекс (масштабный отрезок – 1 мм)
3. Яйцо (масштабный отрезок – 15 мкм)
Методы
•Выделение ДНК – метод фенол-хлороформной экстракции
•Анализ концентрации и качества ДНК – спектрофотометрия и электрофорез
нуклеиновых кислот в агарозном геле
•ПЦР
•Визуализация ПЦР-продуктов - электрофорез нуклеиновых кислот в
агарозном геле
•Выделение ДНК из агарозного геля – центрифугирование через спинмикроколонки
•Секвенирующая реакция по Сэнгеру, и очистка продуктов секвенирующей
реакции (для капиллярного электрофореза в ЦКП) - центрифугирование через
спин-микроколонки с суспензией сефадекса
•Множественные выравнивания (VectorNTI 10)
•Филогенетический анализ и оценка генетических дистанций – MEGA 5.03
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Создана коллекция образцов гельминтов и из них
выделены 28 препаратов ДНК.
Вид, определённый
Место сбора
Последовательно
сти (ITS1)
Последовательност
и (CO1)
D.ditremum
Тюменская область
6
5
D.dendriticum
р.Селенга,Бурятия
10
3
D.sp
р.Селенга,Бурятия
8
3
D.nihonkaiense
р.Камчатка,
Камчатка
1
1
D.cf.hottai
Приморский край
3
1
морфологами
Филограмма видов рода Diphyllobothrium по
маркеру ITS1
(алгоритм объединения ближайших
соседей)
94 : устойчивые ветвления.
Двухпараметрическая модель
Кимуры. Бутстрепная поддержка:
500 повторов.
Укоренение на ITS1 Ligula sp.
(Ligulidae, Pseudophyllidea, Cestoda,
Platyhelminthes) как представителя
внешней группы.
Кладограмма видов рода Diphyllobothrium по
маркеру ITS1
(алгоритм максимальной парсимонии)
94 : устойчивые ветвления.
Бутстрепная поддержка: 500
повторов.
Укоренение на ITS1 Ligula sp.
(Ligulidae, Pseudophyllidea, Cestoda,
Platyhelminthes) как представителя
внешней группы.
Филограмма видов рода Diphyllobothrium
по маркеру CO1, по 3 позиции в кодоне
(алгоритм объединения ближайших
соседей)
94 : устойчивые ветвления.
Двухпараметрическая модель
Кимуры. Бутстрепная поддержка:
500 повторов.
Укоренение на CO1 Ligula sp.
(Ligulidae, Pseudophyllidea, Cestoda,
Platyhelminthes) как представителя
внешней группы.
Кладограмма видов рода Diphyllobothrium по
маркеру CO1, по 3 позиции в кодоне
(алгоритм максимальной парсимонии)
94 : устойчивые ветвления.
Бутстрепная поддержка: 500
повторов.
Укоренение на CO1 Ligula sp.
(Ligulidae, Pseudophyllidea, Cestoda,
Platyhelminthes) как представителя
внешней группы.
Выводы

Впервые по молекулярно-генетическим маркѐрам ITS1 и CO1
были проанализированы образцы и установлены
нуклеотидные последовательности лентецов 4-х видов (D.
nihonkaiense, D. hottai, D. ditremum, D. dendriticum),
собранные на территории России.

Проведены сравнение и систематизация гаплотипов этих и
описанных во внешних базах данных образцов.
Молекулярно-генетический анализ разнообразия по маркеру
ITS1 с последующим уточнением по маркеру CO1 позволил
достоверно определить видовую принадлежность всех
образцов этих четырех видов рода Diphyllobothrium.

Филогенетический анализ по обоим маркѐрам с
использованием алгоритмов объединения ближайших соседей
и максимальной парсимонии выявил таксономические
проблемы для некоторых видов: дает основание для
подтверждения валидности вида D. hottai и предоставляет
новые свидетельства в пользу гипотезы о возможной
синонимичности видов D. nihonkaiense и D. klebanovskii.
Жизненный цикл
представителей рода
Схема жизненного цикла широкого
лентеца (D. latum) –одного из
возбудителейдифиллоботриоза: 1 —
гельминт, паразитирующий в тонкой
кишке окончательных хозяев (человека,
кошки, собаки); 2 — яйцо широкого
лентеца, выделенное окончательным
хозяином в окружающую среду (в
пресноводный водоем); 3 — личинка,
сформировавшаяся из яйца в воде
(корацидий); 4 — промежуточный
хозяин рачок (циклоп, диаптомус),
заглатывающий личинку, которая в
полости его тела превращается в
процеркоид (5); 6 — дополнительный
хозяин — рыба, проглотившая рачка, в
организме которой происходит
дальнейшее развитие личинки и
превращение ее в плероцеркоид (7).
Окончательные хозяева заражаются
при питании рыбой, содержащей
личинки лентеца.
классификация
Отряд: Pseudophyllidea
Типы строения сколексов цестод (из
разных авторов).
А - Tetrarhynchus (Trypanorhyncha);
Б - Hymenolepis (Cyclophyllidea);
В - Diphyllobothrium(Pseudophyllidea);
Г - Phyllobothrium (Tetraphyllidea):
1 - присоски, 2 - присасывательные
ямки, 3 - крючья, 4 - хоботки,
вооруженные крючьями, 5 влагалища, в которые втягиваются
хоботки. В
тягиваются хоботки
Опасность!!!
Вид
Второй
промежуточный
хозяин
Место сбора
D.ditremum
ряпушка
сибирская
Тюменская
область
D.dendriticum
омуль, белый
хариус
р.Селенга,Бурятия
D.sp
пелагический
омуль
р.Селенга,Бурятия
D.nihonkaiense
кета
р.Камчатка,
Камчатка
D.cf.hottai
корюшка-зубатка
Приморский край