ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ РЕМОДЕЛИРОВАНИЯ КОЖИ У ПАЦИЕНТОВ С АТОПИЧЕСКИМ ДЕРМАТИТОМ

УДК 616.5#002#056.43#092.19:611.77
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
РЕМОДЕЛИРОВАНИЯ КОЖИ У ПАЦИЕНТОВ С АТОПИЧЕСКИМ ДЕРМАТИТОМ
А.А. Денисов, В.В. Климов, С.В. Логвинов
ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России, Томск
E9mail: klimov@mail.tomsknet.ru
IMMUNOLOGICAL AND MORPHOLOGICAL FACTORS OF SKIN REMODELING
IN PATIENTS WITH ATOPIC DERMATITIS
A.A. Denisov, V.V. Klimov, S.V. Logvinov
Siberian State Medical University, Tomsk
Обследовано 20 пациентов с атопическим дерматитом и 10 здоровых добровольцев для оценки концентраций
IL#4, IFN#γ, IL#10 и IL#17 в кожных экссудатах и изучения ультраструктуры кожи методом трансмиссионной элек#
троноскопии. Были выявлены следующие особенности ремоделирования кожи: повышение содержания IL#10 в
кожном экссудате, акантоз, изменения коллагеновых волокон, увеличение стареющих форм фибробластов, лим#
фоцитарная инфильтрация, фиброз и гиалиноз. Эти черты могут служить основанием для подходов к локальной
реабилитации болезни.
70
А.А. Денисов и соавт.
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ...
Ключевые слова: атопический дерматит, ремоделирование кожи, цитокины, ультраструктура кожи.
20 patients with atopic dermatitis and 10 healthy volunteers were examined to evaluate concentrations of IL#4, IFN#γ ,
IL#10 and IL#17 in skin exudates and skin ultrastructure. Values of cytokines were defined using ELISA whereas skin
ultrastrucrure were examined by transmission electronoscopy. Following features of skin remodeling were revealed: high
level of IL#10 in skin exudate, akantosis, change of collagen fibres, and increase in aging fibroblasts, lymphatic infiltration,
fibrosis and hyalinosis. All these may serve a base for approaches to the local rehabilitation of atopic dermatitis.
Key words: atopic dermatitis, skin remodeling, cytokines, skin ultrastructure.
Атопический дерматит (АтД) является широко распро#
страненным рецидивирующим заболеванием кожи, ко#
торое сопровождается зудом и другими клиническими
проявлениями и трудно поддается лечению [1, 4]. В пос#
ледние годы вскрыты новые звенья патогенеза болезни,
которые касаются эпикутанной сенсибилизации и тка#
невого ремоделирования кожи при АтД [10], при этом дли#
тельная персистенция воспаления даже в периоде ремис#
сии поддерживается различными иммунорегуляторными
субпопуляциями Т#клеток и секретируемыми ими и дру#
гими клетками цитокинами [3, 7, 11, 14]. Ремоделирова#
ние кожи – это стойкая, но обратимая морфофункцио#
нальная перестройка кожной ткани с вовлечением им#
мунной системы, клинически проявляющаяся характер#
ными элементами (лихенификация) и сухостью [4, 10].
Цель работы: оценка иммунологических (цитокины)
и морфологических аспектов ремоделирования кожи при
атопическом дерматите.
Материал и методы
Обследованы 20 больных АтД обоих полов в возрасте
18–45 лет и 10 здоровых добровольцев 17–24 лет. Диаг#
ноз АтД устанавливался на основании национальных и
международных согласительных документов по данной
патологии, данных анамнеза, клинической картины, кож#
ного аллерготестирования, содержания IgE, также при#
нимались во внимание критерии национальных и меж#
дународных согласительных документов по данной па#
тологии [1, 4]. При исследовании соблюдались принци#
пы информированного согласия пациентов в соответ#
ствии с Хельсинской декларацией Всемирной ассоциа#
ции “Этические принципы проведения научных медицин#
ских исследований с участием человека” с поправками
2000 г. и “Правилами клинической практики в РФ”, ут#
вержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г.
№ 266.
Концентрация цитокинов определялась в бесклеточ#
ных кожных экссудатах, получаемых согласно медицин#
ской технологии “Способ оценки минимальной воспа#
лительной активности кожи при атопическом дерматите
в стадии ремиссии” ФС № 2010/217 от 10.06.2010 [5]. Пе#
реднюю сторону предплечья дезинфицировали спиртом,
затем в средней трети ладонной поверхности предпле#
чья с помощью стерильного скальпеля удаляли верхний
слой эпидермиса, не затрагивая более глубокие слои кожи.
При удалении рогового слоя на участке кожи площадью
0,5 х 0,5 см образовывалась поверхность с характерным
блеском. Слой шиповатых клеток, базальных клеток и ба#
зальная мембрана эпидермиса оставались интактными.
Исследования проводили в периоде ремиссии, при этом
выбирали два типа кожных зон: условно здоровые и ли#
хенифицированные. На скарифицированный участок по#
мещали камеру объемом 1,0 мл, предварительно запол#
ненную с помощью шприца стерильной средой 199. Ка#
меру фиксировали на коже с помощью лейкопластыря.
Круговая обвязка предплечья бинтом обеспечивала наи#
более надежную фиксацию камеры.
Через 6 ч камера снималась, ее содержимое пипеткой
собиралось и переносилось в пробирку. После центри#
фугирования экссудата получался супернатант, который
в дальнейшем использовался для определения цитокинов.
С этой целью использовался твердофазный иммуно#
ферментный анализ с применением пероксидазы хрена
в качестве индикаторного фермента. Для определения
продукции IL#4, IL#10, IL#17 и IFN#γ были использованы
наборы реагентов ЗАО “Вектор#Бест” (Новосибирск). По#
становку иммуноферментного анализа проводили в со#
ответствии с методическими рекомендациями произво#
дителя. Количество выражали в пикограммах на милли#
литр (пг/мл).
Изучение ультраструктуры проводили методом транс#
миссионной электронной микроскопии [6], ультратонкие
срезы готовили по методике Б. Уикли [8].
Для этого взятую ткань кожи фиксировали в забуфе#
ренном 0,1 М какодилатным буфером (pH 7,4) 2,5% ра#
створе глютарового альдегида в течение 2 ч при темпе#
ратуре 4 °С. Далее дважды промывали какодилатным бу#
фером (pH 7,4) по 10–15 мин, после чего постфиксиро#
вали в 1% растворе четырехокиси осмия (на 0,1 М како#
дилатном буфере) в течение 2 ч с последующим двукрат#
ным отмыванием какодилатным буфером (по 10–15 мин).
Затем материал дегидратировали в этиловых спиртах
восходящей концентрации: в 50% спирте – 15–20 мин, в
70% – оставляли на ночь, затем в 80%, 90%, 96% – по 15–
20 мин в каждом, в абсолютном спирте или ацетоне — по
20–30 мин дважды.
Дегидратированные препараты заключали в смесь
смол эпон#аралдит. Для этого готовилась смесь смол в
следующих пропорциях: эпон 812 – 4 г, аралдит 502 – 2 г,
эпон DDSA – 9 г, катализатор DMP#30 – 8 капель.
Пропитка препаратов проводилась по следующей схе#
ме: смесь смол : абсолютный ацетон 1:3 — 4–8 ч (можно
на ночь); смесь смол : абсолютный ацетон 1:1 — 4–8 ч;
смесь смол : абсолютный ацетон 3:1 — 4–8 ч; смесь смол
— от 12 до 24 ч; новая смесь смол в другой посуде — от 12
до 24 ч.
Затем препараты переносились в свежую смесь смол
для полимеризации. Полимеризацию проводили в тече#
ние 1,5–2 суток при 60 °С.
Ультратонкие срезы толщиной 60–100 нм готовили
на ультротоме “Ultrotome III” (“LKB”, Швеция). Получен#
ные срезы наносили на сетки#подложки с формваровой
пленкой#подложкой и контрастировали 2%#м раствором
71
Сибирский медицинский журнал, 2011, Том 26, № 2, Выпуск 1
уранилацетата на 50% этаноле (10–20 мин при 37 °С) и
цитратом свинца (от 3 до 10 мин при комнатной темпе#
ратуре) по E. Reynolds [13]. Полученные препараты про#
сматривали в электронном микроскопе “JEM#100 CXII”
(“JEOL”, Япония) с апертурной диафрагмой 25–30 мкм при
ускоряющем напряжении 80 кВ.
Статистическая обработка результатов исследования
осуществлялась с помощью пакета статистических про#
грамм “SPSS”. Поскольку колебания исследованных ци#
токинов не подчинялись нормальному закону распреде#
ления, для представления количественных данных ис#
пользовались описательные статистики: Ме (медиана), Q1
(1#й квартиль (25%)) и Q3 (3#й квартиль (75%)). Для всех
имеющихся выборок данных применялись непараметри#
ческие критерии Краскал–Уолиса и Манна–Уитни. Раз#
личие двух сравниваемых величин считалось статисти#
чески значимым с надежностью Р>0,95, если вероятность
их тождества оказывалась меньше 5%.
Ядра кератиноцитов шиповатого слоя были округлой
формы, богаты эухроматином, в части из них визуализи#
ровались довольно крупные ядрышки. В большинстве
клеток были видны многочисленные тонофибриллы.
Межклеточные контакты в шиповатом и базальном сло#
ях были представлены преимущественно десмосомами,
ультраструктурная организация которых, как правило,
сохранена (рис. 2). В тонких клеточных отростках вбли#
зи десмосом нередко обнаруживался мелкогранулярный
материал, возможно, являющийся следствием деструктив#
ных процессов.
В значительной части эпителиоцитов росткового слоя
Результаты и обсуждение
Результаты исследования концентраций IL#4, IFN#γ,
IL#10 и IL#17 в кожных экссудатах, взятых на разных уча#
стках кожи (условно здоровых и лихенифицированных),
отражены в таблице. Напомним, что лихенификация –
это клинический эквивалент ремоделирования кожи [4,
10].
Как видно из таблицы, место установки камеры влия#
ло только на IL#10, содержание которого существенно
возрастало в очагах лихенификации по сравнению со
здоровыми участками кожи. Это согласовывается с осо#
бенной ролью IL#10 в аллергических процессах [15].
IL#10 вырабатывается многими видами клеток (Тh2, Tr1,
дендритные клетки и др.); по#видимому, многие из них
вовлечены в процессы ремоделирования кожи.
Таким образом, в очагах лихенификации (ремодели#
рования) по сравнению со здоровыми участками кожи
отмечается повышение содержания IL#10, что может сви#
детельствовать о важной роли данного цитокина в про#
цессах ремоделирования кожи при АтД и быть диагнос#
тическим критерием этого процесса.
При электронной микроскопии эпидермиса пациен#
тов с АтД в стадии ремиссии наблюдалось уменьшение
количества клеточных слоев рогового слоя и пластов
межклеточных липидов. Отмечались выраженные прояв#
ления акантоза. Эпидермис был утолщен и формировал
тяжи в сосочковый слой. В базальном и шиповатом сло#
ях отмечалось некоторое расширение межклеточных
пространств (рис. 1).
Рис. 1. Ультраструктурная организация шиповатого слоя эпи#
дермиса при АтД в стадии ремиссии. Ув. 1900
Рис. 2. Ультраструктура десмосом в шиповатом слое эпидерми#
са при АтД в стадии ремиссии. Ув. 19000
Таблица
Содержание IL!4, IFN!γ, IL!10 и IL!17 в экссудате “кожного окна” у здоровых лиц и пациентов с АтД в периоде ремиссии в
зависимости от места установки камеры, Ме (Q1!Q3)
Группа
IL94 (пг/мл)
IFN9γ (пг/мл)
IL910 (пг/мл)
IL917 (пг/мл)
Контроль
Здоровый участок кожи в периоде ремиссии
Участок лихенификации в периоде ремиссии
0,45(0,4–0,7)n=10
0,5 (0,14–0,97)n=7
0,95 (0,4–1,2)n=6р1
46(35,5–51,75)n=10
27,6 (22–44)n=6
31 (10,3–65,7)n=7р1
7(3,5–13,5)n=10
11,6 (10–22)n=5
37,5 (30–65,5)n=5р1, р2
23(7,75–34,55)n=8
22 (11,5–36,7)n=7
15 (7–29)n=10
Примечание: Ме – медиана, Q1 – первый квартиль, Q3 – третий квартиль; р1 – статистическая значимость различий в сравнении с контрольной группой
(р<0,05), р2 – статистическая значимость различий в сравнении со здоровым участком кожи в периоде ремиссии (р<0,05).
72
А.А. Денисов и соавт.
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ...
А
Б
Рис. 3. Ультраструктурная организация кератиноцита базального слоя эпидермиса при АтД в стадии ремиссии: локальное скоп#
ление гранул меланина, низкое содержание микрофибрилл, отек митохондрий с деструкцией крист, расширение цистерн эн#
доплазматического ретикулума и перинуклеарного пространства. Ув. А – 10000, Б (фрагмент А) – 290000
наблюдалась вакуолизация цитоплазмы, которая чаще
всего возникает в результате деструкции митохондрий.
Указанные органеллы в большинстве своем были отеч#
ны, с разрушенными кристами и деструкцией внутрен#
ней мембраны, иногда содержали мембранные пластин#
чатые тельца. Содержание тонофиламентов было не ве#
лико. Комплекс Гольджи был выражен слабо. Отмечалось
расширение цистерн гранулярной эндоплазматической
сети. В большей части кератиноцитов регистрировалось
низкое содержание гранул меланина. Их скопление об#
наруживалось в околоядерной области, обычно в апикаль#
ной части (рис. 3).
В некоторых кератиноцитах выявлялось умеренное
или высокое количество меланиновых гранул, полири#
босом и тонофиламентов в цитоплазме (рис. 4).
Меланоциты, локализующиеся преимущественно в
базальном слое эпидермиса, содержали в цитоплазме
небольшое количество меланосом различной степени
зрелости. Данные клетки характеризовались реактивны#
ми изменениями, проявляющимися расширением цис#
терн эндоплазматического ретикулума, реже – их фраг#
ментацией, набуханием митохондрий, вакуолизацией
цитоплазмы.
В базальном и шиповатом слоях удалось наблюдать
клетки Лангерганса. На полутонких и ультратонких сре#
зах они отличались относительно светлой цитоплазмой
и низкой ее электронной плотностью. В ней находились
единичные цистерны эндоплазматического ретикулума
и полирибосомы. Цистерны, как правило, были расши#
рены и формировали крупные вакуоли. Визуализирова#
лись первичные и реже вторичные лизосомы, мультиве#
зикулярные тельца. Большинство митохондрий были на#
бухшими с деструкцией крипт. Выявлялись специфичес#
кие гранулы вытянутой формы, ультраструктура которых
характеризовалась периодичностью в виде поперечной
исчерченности. Тельца нередко контактировали с плаз#
молеммой. Клеточная мембрана не образовывала десмо#
сомовидных контактов с соседними клетками. Отростки
описываемых клеток могли контактировать с базальной
мембраной эпидермиса (рис. 5).
В соединительной ткани дермы на полутонких сре#
Рис. 4. Умеренное содержание гранул меланина и пучков мик#
рофибрилл, расширение цистерн гранулярного эндоплазма#
тического ретикулума, многочисленные полирибосомы в ци#
топлазме базального кератиноцита при АтД в стадии ремис#
сии. Ув. 19000
зах обнаруживались отечные изменения. Коллагеновые
волокна были утолщены, гомогенизированы в сосочко#
вом слое. Коллагеновые фибриллы были изменены, боль#
шая часть из них утратила характерную поперечную ис#
черченность (рис. 6). На некоторых участках сосочково#
го слоя и базальной мембраны имели место явления фиб#
роза и гиалиноза.
В клеточном составе дермы наблюдались изменения,
проявляющиеся умеренной лимфоцитарной инфильтра#
цией, особенно на границе сосочкового и сетчатого сло#
ев. Отмечалось увеличение стареющих форм фибробла#
стов, которые отличались пикноморфными изменения#
ми в виде повышенной базофилии и электронной плот#
ности цитоплазмы и ядра, деформацией, сморщиванием
клеточного тела и отростков. Небольшая часть фиброб#
ластов, напротив, характеризовалась выраженными при#
знаками гипертрофии.
Описанные электронномикроскопические признаки
являются оригинальными и лишь в некоторых деталях
совпадают с данными литературы [2, 9].
73
Сибирский медицинский журнал, 2011, Том 26, № 2, Выпуск 1
А
Б
Рис. 5. Клетка Лангерганса, контактирующая с базальной мембраной (БМ) эпителия и соседними кератиноцитами. В цитоплазме
специфические гранулы с характерной периодичностью ультраструктур. АтД в стадии ремиссии. Ув. А – 10000, Б – 29000
А
Б
Рис. 6. Ультраструктурные изменения коллагеновых фибрилл сосочкового слоя кожи при АтД в стадии ремиссии. Размытость
ультраструктуры, утрата характерной периодичности, локальная деструкция части фибрилл. Ув. А – 48000, Б – 58000
Таким образом, ультраструктурные особенности кожи
при АтД в периоде ремиссии характризуют ремоделиро#
вание кожи как выраженный акантоз, изменение колла#
геновых фибрилл с утратой ими поперечной исчерчен#
ности, умеренную лимфоцитарную инфильтрацию, уве#
личение стареющих форм фибробластов с пикноморф#
ными изменениями в виде повышенной базофилии и
электронной плотности цитоплазмы и ядра, фиброз и
гиалиноз сосочкового слоя и базальной мембраны.
Описанные нами впервые иммунологические и мор#
фологические характеристики ремоделирования кожи
при АтД имеют научно#практическое значение, посколь#
ку могут быть использованы в разработке локальных под#
ходов в реабилитации данной патологии.
Литература
1. Атопический дерматит: Рекомендации для практикующих
врачей. Российский национальный согласительный доку#
мент по атопическому дерматиту / под ред. Р.М. Хаитова,
А.А. Кубановой. – М. : Фармарус#Принт, 2002. – 192 с.
74
2. Белоусова Т.А., Горячкина М.В., Филиппова В.А. Современ#
ная стратегия наружной терапии воспалительных дерма#
тозов // Дерматология: приложение к журналу Consilium
Medicum. – 2009. – № 3. – С.15–20.
3. Загрешенко Д.С., Климов В.В., Денисов А.А. и др. Цитокины
“кожного окна” и параметры SCORAD при атопическом
дерматите // Сибирский медицинский журнал (Томск). –
2008. – Т. 23. – № 3, вып. 1. – С. 95–96.
4. Кочергин Н.Г. Диагностика и лечение атопического дерма#
тита у детей и взрослых / Европейская академия аллерго#
логии и клинической иммунологии; Американская акаде#
мия аллергии, астмы и иммунологии; Группа PRACTALL //
Клиническая дерматология и венерология. – 2007. – № 1. –
С. 46–53.
5. Климов В.В., Денисов А.А., Фирсова Е.К. и др. Способ оцен#
ки минимальной воспалительной активности кожи при ато#
пическом дерматите в стадии ремиссии: Медицинская тех#
нология ФС № 2010/217 от 10.06.2010.
6. Курупу В.Я. Электронная микроскопия. – Киев : Вища шко#
ла, 1984. – 208 с.
7. Система цитокинов: теоретические и практические аспек#
ты / под ред. В.А. Козлова, С.В. Сенникова. – Новосибирск :
Наука, 2004. – 324 с.
А.А. Денисов и соавт.
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ...
8. Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих / под.
ред. Ю.В. Полякова. – М : Мир, 1975. — 326 с.
9. Chamlin S.L., Kao J., Frieden I.J. et al. Ceramide#dominant barrier
repair lipids alleviate childhood atopic dermatitis: Changes in
barrier function provide a sensitive indicator of disease activity
// J. Am. Acad. Dermatol. – 2002. – Vol. 47. – P. 198–208.
10. Katayama I. Atopic dermatitis and remodeling of the skin //
Japanese Journal of Clinical Dermatology. – 2002. – Vol. 56. –
P. 39–42.
11. Leung D.Y. Atopic dermatitis: new insight and opportunities for
therapeutic intervention // J. Allergy Clin. Immunol. – 2000. –
Vol. 105. – P. 860–876.
12. Norgales K.E. et al. IL#22#producing “T22” T cells account for
upregulated IL#22 in atopic dermatitis despite reduced
IL#17#producing T(H)17 T cells // J. Allergy Clin. Immunol. –
2009. – Vol. 123. – P. 1244–1252.
13. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an
electronopaque stain in electron microscopy // J. Cell Biology.
– 1963. – No. 17. – P. 208–212
14. Sonkoly E., Muller A., Lauerma A.I. IL#31: a new link between T
cells and pruritus in atopic skin // J. Allergy Clin. Immunol. –
2006. – Vol. 117. – P. 411–417.
15. Wu K., Bi Y., Sun K. et al. IL#10#producing type 1 regulatory T
cells and allergy // Сellular & Molecular Immunology. – 2007.
– Vol. 4. – P. 269–275.
Поступила 23.03.2011
75