ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ УРАЛЬСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК На правах рукописи МАКСИМОВА Анна Валерьевна ВЛИЯНИЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ НИТРИЛОВ НА ПОЧВЕННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ 03.02.03 Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор медицинских наук Кузнецова М.В. Пермь – 2016 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ...................................................................................................................... 5 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................................. 12 ГЛАВА 1. АЛЬДОКСИМ-НИТРИЛЬНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ ПОЧВЕННЫХ БАКТЕРИЙ .................................................................................................................... 12 1.1. Ключевые ферменты альдоксим-нитрильного метаболизма ......................... 14 1.1.1. Классификация и характеристика альдоксимдегидратаз ......................... 15 1.1.2. Классификация и характеристика нитрилгидратаз .................................. 19 1.2. Молекулярные основы метаболизма нитрилов ............................................... 20 1.3. Микроорганизмы, утилизирующие азотсодержащие производные карбоновых кислот ..................................................................................................... 26 1.4. Методологические подходы и методы оценки структурно-функционального состояния почвенной микробиоты ........................................................................... 29 1.4.1. Бактериологические методы ......................................................................... 30 1.4.2. Молекулярно-генетические методы .............................................................. 31 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ............................................................................. 37 ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ........................................... 37 2.1. Выделение бактериальных культур .................................................................. 37 2.2. Условия культивирования бактерий ................................................................. 39 2.3. Трансформация субстратов ................................................................................ 39 2.4. Определение общей токсичности почвы .......................................................... 40 2.5. Определение токсичности нитрилов ................................................................. 41 2.5.1. Биотестирование............................................................................................. 41 2.5.2. Оценка минимальных подавляющих и бактерицидных концентраций токсикантов ............................................................................................................... 42 2.5.3. Атомно-силовая и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия .... 42 2.6. Модельный эксперимент по влиянию акрилонитрила на почвенную микробиоту ................................................................................................................. 43 3 2.7. Выделение ДНК .................................................................................................. 44 2.7.1. Выделение ДНК из клеток бактерий ............................................................. 44 2.7.2. Выделение тотальной ДНК из почвы ............................................................ 45 2.8. Полимеразная цепная реакция ........................................................................... 46 2.8.1. ПЦР с детекцией по конечной точке ............................................................ 46 2.8.2. ПЦР в реальном времени ................................................................................. 49 2.9. Определение нуклеотидной последовательности генов универсальной 16S рРНК и функциональных генов ................................................................................ 50 2.10. Метагеномный анализ ...................................................................................... 51 2.11. Статистическая обработка ............................................................................... 51 ГЛАВА 3. РАСПРОСТРАНЕНИЕ АЛЬДОКСИМ-НИТРИЛУТИЛИЗИРУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ В ПОЧВАХ С РАЗНОЙ АНТРОПОГЕННОЙ НАГРУЗКОЙ ................................................................................................................. 53 3.1. Распространение бактерий, обладающих системами трансформации нитрилов, в почвах умеренной и степной зон ......................................................... 53 3.2. Биоиндикация почвенной среды с использованием нитрилутилизирующих бактерий ...................................................................................................................... 57 3.3. Активность ферментов альдоксим-нитрильного метаболизма почвенных штаммов бактерий ...................................................................................................... 61 3.3.1. Трансформация ряда субстратов.................................................................. 62 ГЛАВА 4. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АЛЬДОКСИМДЕГИДРАТАЗЫ И НИТРИЛГИДРАТАЗЫ ..................................... 70 4.1. Детекция генов, кодирующих ферменты альдоксим-нитрильного метаболизма ................................................................................................................ 70 4.2. Характеристика альдоксимдегидратаз штаммов Rhodococcus ...................... 74 4.3. Характеристика нитрилгидратаз штаммов Rhodococcus ................................ 76 ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ МИКРОБНОГО СООБЩЕСТВА ЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ ............................................................................................. 86 5.1. Микробиота почв с разной антропогенной нагрузкой .................................... 86 4 5.2. Модельный эксперимент по влиянию акрилонитрила на почвенную микрофлору................................................................................................................. 89 5.3. Метагеномное секвенирование.......................................................................... 99 ГЛАВА 6. ВЛИЯНИЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ НИТРИЛОВ НА МОРФОЛОГИЮ И ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ БАКТЕРИЙ ............................. 102 6.1. Влияние субстратов на жизнеспособность бактерий .................................... 102 6.2. Микроскопические методы оценки токсичности нитрилов ........................ 107 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ........................................................................................................... 114 ВЫВОДЫ ..................................................................................................................... 121 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ......................................................................................... 122 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................... 123 ПРИЛОЖЕНИЯ ........................................................................................................... 143 5 ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования и состояние вопроса Нитрилы карбоновых кислот (цианиды) – органические вещества, содержащие одну или несколько цианогрупп –C≡N, связанных с углеводородным радикалом. В природе нитрилы существуют главным образом в виде цианогликозидов, цианолипидов, которые являются производными аминокислот более чем у 2000 различных видов растений (Legras et al., 1990). Синтетические нитрилы являются важными промежуточными продуктами при синтезе аминов, амидов, амидинов, карбоновых кислот, сложных эфиров, альдегидов, кетонов и гетероциклических соединений (Banerjee et al., 2002). В течение нескольких десятилетий нитрилы попадали в окружающую среду с промышленными сточными водами и сельскохозяйственными гербицидами (Vosahlova et al., 1997; Reinnicke et al., 2012). Важнейшим перспективным фактором объектом детоксикации для локальной нитрильных очистки загрязнений стоков и являются микроорганизмы. Бактерии, утилизирующие нитрильные соединения, были выделены из мелководных морских отложений (Langdahl et al., 1996), глубоководных донных осадков (Colquhoun et al., 1998; Heald et al., 2001), геотермальных источников (Yamaki et al., 1997; Pereira et al., 1998) и из различных почв (Martinkova´ et al., 1992; Layh et al., 1997; Забазная и др., 1998; Kato et al., 2000; Brandao et al., 2003; Максимов и др., 2007). Тем не менее, в доступной литературе нет данных о встречаемости данной группы прокариот в различных типах почв, в том числе с антропогенной нагрузкой. Описаны бактериальные системы гидролиза нитрильных соединений, которые конвертируются в соответствующие карбоновые кислоты путем сочетанного действия нитрилгидратазы и амидазы или при работе фермента нитрилазы (Kobayashi et al., 1992). Нитрилгидратаза имеет большое практическое значение в качестве биокатализатора для промышленного производства акриламида и никотинамида (Yamada, Kobayashi, 1996; Raj et al., 2006; Дебабов, 6 Яненко, 2011; Rucka´ et al., 2014), а также для биоремедиации окружающей среды (Wyatt, Knowles, 1995; Holtze et al., 2008). Большая часть штаммовсуперпродуцентов нитрилгидролизующих ферментов изолирована из почвенной среды, но оценка активности почвенной микробиоты в контексте биокаталитического и биодеструктивного потенциала не проводилась. Изучение биохимической генетической организации исследовании различных регуляции является путей активности необходимой метаболизма ферментов и составляющей бактерий. Выделены их при и охарактеризованы альдоксимдегидратазы, нитрилгидратазы и амидазы из клеток разных микроорганизмов (Астаурова и др., 1993; Kato, Asano, 2006; Prasad, Bhalla, 2010). Гены, кодирующие ферменты нитрильного метаболизма, образуют генный кластер, состоящий из гена альдоксимдегидратазы, генов, кодирующих ферменты гидролиза нитрилов, и может отличаться по их составу и взаиморасположению в зависимости от видовой принадлежности штамма (Nishiyama et al., 1991), в частности среди представителей рода Rhodococcus (Martınkova´ et al., 2010). Несмотря на то, что у представителей одного таксона выявляется высокая гомология этих ферментов, субстратная специфичность их может существенно варьировать, что обусловлено аминокислотными заменами, в том числе в локусах, не связанных с активным центром фермента (Brandao et al., 2003). Известно, что вещества с цианогруппой существенно изменяют состав и структуру почвенного микробного сообщества (Baxter et al., 2006; Pampulha, Oliveira, 2006). Большая часть таких исследований посвящена влиянию на микробиоту нитрильных традиционным гербицидов, культуральным а методом, методология либо с ограничивалась использованием денатурирующего градиентного гель-электрофореза (Baxter, Cummings, 2008), тогда как на современном этапе для комплексной оценки видового разнообразия почвенных микроорганизмов широко используются другие молекулярно- генетические технологии – полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР РВ) и метагеномное секвенирование (Андронов и др., 2012; Whiteley et al., 2012). 7 Нитрилы являются тканевыми ядами и подобно цианидам блокируют действие одного из ферментов дыхательного пути – цитохромоксидазы (LuqueAlmagro et al., 2005). До сих пор остается малоизученным вопрос о влиянии нитрилов на жизнеспособность и поверхностные структуры бактериальных клеток. Подходы, основанные на изменении биолюминесценции, определении минимальных подавляющих и бактерицидных концентраций (МПК, МБК) для бактериальных тест-штаммов при их экспозиции с растворами токсикантов, являются методически и экономически привлекательными и сертифицированы во многих странах (Данилов и др., 2002; Методика определения …, 2010; Palma et al., 2010), но не применялись для тестирования нитрильных соединений. Использование конфокальной лазерной сканирующей (КЛСМ) и атомно-силовой микроскопии (АСМ) при решении вопросов, связанных с изучением морфофункциональных особенностей бактериальных клеток при воздействии различных факторов, является актуальным направлением развития современных методов микробиологического анализа (Stoderegger, Hernd, 2004; Феофанов, 2007; Nikiyan et al., 2010; Kuyukina et al., 2014; Ерохин, 2015). Цель: изучение распространенности нитрилутилизирующих микроорганизмов в почвах с разной антропогенной нагрузкой и влияния синтетических нитрилов на почвенные бактерии с помощью традиционных и высокотехнологичных методов микробиологического анализа. Задачи исследования: 1. Проанализировать встречаемость/распространенность альдоксим- и нитрилутилизирующих микроорганизмов в почвах с разной антропогенной нагрузкой и оценить возможность их использования в качестве индикатора загрязнения окружающей среды. 2. Определить генетическое разнообразие ключевых ферментов альдоксим-нитрильного метаболизма бактерий рода Rhodococcus. 3. Изучить влияние различных концентраций акрилонитрила на численность и структуру почвенного микробного сообщества в модельном эксперименте in vitro. 8 Оценить токсическое действие синтетических нитрилов и нитрильных 4. гербицидов на морфологию и жизнеспособность некоторых видов бактерий. Научная новизна Впервые дан сравнительный нитрилутилизирующих микроорганизмов, анализ распространенности активности и генетического разнообразия ключевых ферментов бактерий, изолированных из природных и антропогенно-загрязненных почв. Показана более высокая гетерогенность ферментов альдоксим-нитрильного метаболизма у штаммов бактерий рода Rhodococcus, выделенных из антропогенно-измененных почв, и обнаружена радикальная замена в последовательности α-субъединицы нитрилгидратазы штамма Rhodococcus erythropolis Б4-4, изолированного из почвы с территории предприятия по производству акриламида. Впервые в условиях модельного эксперимента проведен комплексный анализ влияния различных концентраций нитрила акриловой кислоты на численность и структуру микробного сообщества природной почвы с помощью бактериологического и молекулярных методов – ПЦР в реальном времени и метагеномного секвенирования. Показано угнетение развития практически всех физиологических групп бактерий высокими (2000 мг/кг) концентрациями нитрила, тогда как при 200 мг/кг на фоне общего снижения количества нитрилутилизирующих представителей α- бактерий прокариот. и происходило Несмотря β-Proteobacteria, на стимулирование колебания Acidobacteria и численности Actinobacteria, качественный состав микробиоты изменялся только на уровне классов и семейств. Определена токсичность широкого ряда нитрилов и нитрильных гербицидов методом биотестирования на основе биолюминесцентного анализа, а также путем установления МПК и МБК на различные виды бактерий. Впервые с применением АСМ и КЛСМ оценена выживаемость и морфометрическая реакция бактериальных клеток Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens, Rhodococcus ruber при воздействии акрилонитрила и бромоксинила в суббактерицидных и бактерицидных концентрациях. Установлено, что для прокариот токсичность 9 нитрилов обусловлена не только инактивацией фермента дыхательной цепи, но и выраженными повреждениями клеточной стенки, при этом влияние ароматических гербицидов более выражено. Научно-практическая значимость работы Результаты выполненного исследования расширяют представления о встречаемости бактерий, обладающих системами трансформации альдоксимов и нитрилов карбоновых кислот, в почвах, характерных для Пермского края и умеренной степной зоны. Проведена оценка возможности использования данной группы прокариот в качестве биоиндикатора загрязнения окружающей среды. Показан биодеструктивный выделенных из биокаталитический антропогенно-загрязненных альдоксимдегидратаз Проанализирована и и нитрилгидратаз структура и почв. некоторых динамика потенциал штаммов, Секвенированы почвенных почвенного гены штаммов. микробиома при загрязнении различными концентрациями акрилонитрила. Результаты модельного эксперимента дополняют знания об адаптационном потенциале микробиоты незагрязненных почв и помогают устанoвить закономернoсти oтвета природных сообществ на специфические зaгрязнeния. Проведена оценка влияния нитрилов и нитрильных гербицидов на жизнеспособность и морфологию некоторых видов микроорганизмов. Устойчивость бактерий к суббактерицидным концентрациям нитрилов штаммоспецифична и связана с уровнем активности и субстратной специфичностью нитрилгидролизующих ферментов. Токсическое действие высоких концентраций нитрилов обусловлено в большей степени повреждением клеточной стенки. Комплексный подход с использованием традиционных и новых технологий микробиологического анализа позволил оценить влияние нитрилов на бактерии на популяционном и клеточном уровне. Основные положения, выносимые на защиту 1. Бактерии, обладающие системами трансформации нитрилов, распространены повсеместно с преобладанием в антропогенно-измененных 10 почвах и могут отражать нитрильное загрязнение последних. Активность ферментов нитрильного метаболизма у почвенных микроорганизмов убывает в ряду: амидаза, нитрилгидратаза, альдоксимдегидратаза. Выделенные из промышленных почв штаммы бактерий характеризуются более высокой активностью нитрилгидратазы. 2. Внесение в почву акрилонитрила вызывает изменения в структуре почвенного сообщества, которые в первую очередь проявляются в колебании численности представителей α- и β-Proteobacteria и пролонгированном угнетении бактерий филы Acidobacteria. Наиболее устойчивыми к влиянию поллютанта являются Bacteroidetes и Fungi. 3. Ароматические нитрилы, в том числе гербициды, являются для бактерий наиболее токсичными из рассмотренных субстратов, что обусловлено не только инактивацией фермента дыхательной цепи, но и выраженными повреждениями клеточной стенки. Публикации и апробация работы По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах из списка ВАК. Материалы диссертации доложены и обсуждены на II, IV, VI Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантовбиологов «Симбиоз – Россия» (Пермь, 2009; Воронеж, 2011; Иркутск, 2013); V Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 2009; Региональной студенческой научной конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в биологии и экологии», Пермь, 2010; 18-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века», Пущино, 2014; II Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии», Пермь, 2015. 11 Объем и структура диссертации Работа изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 36 рисунков и 20 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов, трех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Список литературы включает 190 наименований работ, в том числе 42 отечественных и 148 зарубежных автора. Связь работы с научными программами и собственный вклад автора Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Биохимические и генетические системы трансформации органических соединений у бактерий, перспективных для биотехнологий» (номер государственной регистрации 0120.0406511). Исследования поддержаны программами Президиума РАН «Биологическое разнообразие» (№ 2.1.1.6252), «Молекулярная и клеточная биология» (№ 2.1.1/12133), финансируемыми УрО РАН, грантом РФФИ 13-04-96050-р_урал_а, а также научным проектом молодых ученых УрО РАН 14-4-НП-218. Научные положения и выводы полностью базируются на результатах собственных исследований автора. Автор благодарит за предоставленную возможность совместных исследований и содействие в работе сотрудников и заведующих лабораториями: чл.-корр., д.б.н., профессора Ившину И.Б., д.м.н., профессора Ширшева С.В. и к.гм.н. Шишкина М.А. 12 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. АЛЬДОКСИМ-НИТРИЛЬНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ ПОЧВЕННЫХ БАКТЕРИЙ Нитрилы карбоновых кислот (цианиды) – органические вещества, содержащие одну или несколько цианогрупп –C≡N, связанных с углеводородным радикалом. В природе нитрилы существуют главным образом в виде цианогликозидов, которые являются производными аминокислот более чем у 2000 различных видов растений. При повреждении тканей эти растения синтезируют цианогликозиды для образования сахара, кетона или альдегидов, то есть цианогенез является механизмом самозащиты (Legras et al., 1990). Другой нитрил – β-циано-L-аланин, широко представлен в растениях и предположительно продуцируется при детоксикации цианидов цианоаланинсинтазой. К образованию нитрилов приводит и разрушение глюкозинолатов. Растения также могут синтезировать такие нитрильные соединения, как цианолипиды, рицинин и другие. Кроме того, простые алифатические нитрилы, например изобутиронитрил, могут быть получены при анаэробном разложении аминокислот микроорганизмами (Harper, Gibbs, 1979). Цианистый водород (HCN) является ингибитором цитохромоксидазы с и ряда других металлоферментов (Solomons et al., 1981). Несмотря на его токсичность, цианид продуцируется или разлагается некоторыми видами микроорганизмов. Бактерии рода Pseudomonas синтезируют HCN путем декарбоксилирования глицина посредством мембран-связанного чувствительного к содержанию кислорода ферментного комплекса, который включает цианидсинтазу (Pessi, Haas, 2004). Цианидсинтазный путь Pseudomonas aeruginosa закодирован в hcnABC опероне, и его экспрессия регулируется как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции (Pessi, Haas, 2000; Cody et al., 2009). Важным условием для цианогенеза является низкая концентрация кислорода и высокая плотность бактериальной суспензии. Также реакцию стимулирует присутствие в среде глицина и катионов железа. Культура P. aeruginosa может выделять в среду до 300 мкл HCN (Pessi, Haas, 2000). Эти микроорганизмы 13 избегают влияния данного токсиканта двумя способами. Первый связан с действием роданазы, которая конвертирует цианистый водород в менее токсичный тиоцианат в присутствии тиосульфата (Cipollone et al., 2007). Второй – с действием цианидрезистентной оксидазы, которая осуществляет перенос электронов от восстановленного убихинона (коэнзима Q) на кислород в обход основной цитохромной дыхательной цепи (Williams et al., 2007; Arai, 2011). HCN может действовать как сигнал для индукции других цианидрезистентных детерминант, которые действуют совместно с оксидазой (Frangipani et al., 2014). В химической промышленности различные нитрилы используются для производства полимеров (акрилонитрил, адипонитрил), в качестве растворителей (ацетонитрил), промежуточных лекарственных веществ (хиральных синтонов), фармацевтических препаратов (циталопрам) и гербицидов (дихлобенил, бромоксинил, иоксинил) (Рисунок 1). В общем, нитрилы являются важными промежуточными продуктами при синтезе аминов, амидов, амидинов, карбоновых кислот, сложных эфиров, альдегидов, кетонов и гетероциклических соединений (Banerjee et al., 2002). В течение нескольких десятилетий нитрилы попадали в окружающую среду с промышленными сточными водами и сельскохозяйственными химикатами (Wyatt, Knowles, 1995; Vosahlova et al., 1997; Reinnicke et al., 2012). Большинство нитрилов являются высокотоксичными, мутагенными и канцерогенными веществами. Риск возникновения неблагоприятных последствий для здоровья человека и окружающей среды зависит от формы, в которой присутствует цианид (Никитин, Новиков, 1986). Важнейшим перспективным фактором объектом детоксикации для локальной нитрильных очистки загрязнений стоков и являются микроорганизмы. Многие из них могут использовать нитрилы как источник углерода и/или азота. На сегодняшний день выделено большое число нитрилутилизирующих почвенных бактерий. Штаммы, использующие нитрилы и амиды в качестве ростового субстрата, обнаружены среди бактерий различных таксономических групп: Pseudomonas, Alcaligenes, Agrobacterium, Bacillus, Rhodococcus, Brevibacterium, Arthrobacter и др. (Asano et al., 1982; Asano, 1991). 14 Описан гидролиз соответствующие нитрильных соединений, карбоновые кислоты которые путем конвертируются сочетанного в действия нитрилгидратазы и амидазы или при работе только нитрилазы. Эти ферменты имеют огромное практическое применение в промышленном производстве: с их помощью получают акриламид, никотинамид и никотиновую кислоту (Yamada, Kobayashi, 1996). Наличие нитрилгидратазной активности у почвенных изолятов объясняют тем, что данный фермент участвует в метаболизме аминокислот, ключевыми интермедиатами которого являются альдоксимы. Рисунок 1. Структурные формулы ряда нитрилов, в том числе нитрильных гербицидов, альдоксимов и амидов. 1.1. Ключевые ферменты альдоксим-нитрильного метаболизма Физиологическая роль нитрилгидролизующих ферментов у бактерий до конца не исследована. В растениях эти ферменты входят в комплекс путей, контролирующих синтез и распад цианогликозидов, где альдоксимы являются ключевыми интермедиатами (Mahadevan, 1973; Sawyer et al., 1984; Bestwick et al., 1993; Sibbesen et al., 1995). У бактерий катаболизм аминокислот с участием 15 альдоксимдегидратаз представлен на схеме (Рисунок 2). Существуют различные пути метаболизма нитрилов у микроорганизмов: 1) двустадийный гидролиз, в котором участвуют два фермента – нитрилгидратаза и амидаза; 2) одностадийный гидролиз, осуществляемый нитрилазой; 3) окисление, катализируемое оксигеназой, с последующим гидролизом оксинитрилазой; 4) восстановление с участием нитрогеназы (Liu et al., 1997; Kobayashi, Shimizu, 2000; Banerjee et al., 2002). Наиболее распространенным типом превращений нитрильной группы у бактерий является гидролиз. Рисунок 2. Микробный метаболизм аминокислот (Prasad, Bhalla, 2010). 1.1.1. Классификация и характеристика альдоксимдегидратаз Первые сообщения об альдоксимдегидратирующих ферментах у бактерий были сделаны Y. Asano и Y. Kato в 1998, 1999 гг. (Asano et al., 1998; Kato et al., 1999). Из почвы были выделены микроорганизмы Bacillus sp. OxB-1 и Rhodococcus sp. YH3-3, которые конвертировали альдоксимы через нитрилы в 16 соответствующие карбоновые кислоты последовательным действием альдоксимдегидратазы и нитрилгидролизующих ферментов. Выделены и охарактеризованы альдоксимдегидратазы из разных штаммов (Таблица 1). Все описанные альдоксимдегидратазы, за исключением мономерного фермента Bacillus sp. OxB-1, субъединицы составляет являются 40-45 кДа. димерами. Нативные Молекулярная четвертичные масса структуры бактериальных альдоксимдегидратаз высоко вариабельны. Их молекулярная масса варьирует от 42 до 85 кДа (Kato, Asano, 2006). Большинство Ферменты альдоксимдегидратаз Rhodococcus sp. N-771 и являются железосодержащими. P. chlororaphis B23 имеют гем b как простетическую группу (Kato et al., 2004). Более того, спектральный анализ показал, что в состав альдоксимдегидратазы P. chlororaphis B23 входят ионы кальция как еще одного кофактора. Оба металла (железо и кальций) прочно связаны с ферментом (Oinuma et al., 2003). В связи с тем, что альдоксимдегидратаза Pseudomonas sp. K-9 идентична на 90% таковой из штамма P. chlororaphis B23 и показывает похожие спектры поглощения, было предположено, что альдоксимдегидратазы этих штаммов имеют одинаковую природу гема (Kato, Asano, 2006). Обнаружено структурное сходство аминокислотных последовательностей бактериальных альдоксимдегидратаз. Идентичность фермента, выделенного из штамма Rhodococcus sp. N-771 составила 96,3, 77,6 и 30,4% с альдоксимдегидратазами R. globerulus A-4, P. сhlororaphis B23 и Bacillus sp. OxB1 соответственно (Kato et al., 2000; Oinuma et al., 2003; Xie et al., 2003). У двух последних выявлены различия в предполагаемых аминокислотных остатках, локализованных в дистальном участке фермента: для P. chlororaphis B23 – гистидин и кислые аминокислоты (Kobayashi, Shimizu, 2000), для Bacillus sp. – гистидин и основные аминокислоты (Oinuma et al., 2003). 17 Таблица 1 Сравнение свойств альдоксимдегидратаз штаммов Bacillus sp. OxB-1, R. globerulus A-4, P. chlororaphis B23, R. erythropolis N-771 и Pseudomonas sp. K-9 (Kato, Asano, 2006) Признак Bacillus sp. OxB-1 R. globerulus A-4 R. erythropolis N-771 P. chlororaphis B23 Pseudomonas sp. K-9 Мr нативная (Да) 42000 80000 80000 76400 85000 Mr субъединицы 40972 44817 44794 40127 44511 Число субъединиц 1 2 2 2 2 Специфическая активность для фенилацетальдоксима (ЕД) Доля гема (%) 851 633 562 197 2,25 33 37 - 69 - Оптимум pH 7,0 8,0 8,0 6,5 7,0 Оптимум Т (С0) 30 30 30 45 20 pH-стабильность 6,5-8,0 6,0-9,5 6,0-9,5 6,0-8,0 5,5-6,5 Термостабильность (С0) <45 <40 <40 <50 <30 18 Ферменты активны при нейтральной рН, и оптимум температуры большинства около 30ºС. В то же время альдоксимдегидратаза P. сhlororaphis B23 была наиболее активна при рН 5,5, а оптимум температуры – 45ºС (Oinuma et al., 2003). У другой псевдомонады температурный оптимум фермента составляет 20 ºС. Остается открытым вопрос о субстратной специфичности альдоксимдегидратаз. Все описанные ферменты способны конвертировать фенилацетальдоксим (Kato фенилацетальдоксим- и et al., 2000). Одновременное пиридин-3-альдоксимдегидратазной сочетание активности не проясняет, связано ли это с тем, что один фермент может трансформировать несколько субстратов, или возможно существование в штамме двух или больше энзимов. действовала Альдоксимдегидратаза на Pseudomonas sp. K-9 Rhodococcus sp. N-771 алифатические конвертировала субстраты. как алкильные предпочтительно Альдоксимдегидратаза альдоксимы, так и арилалкильные субстраты, но детальная характеристика фермента позволила определить его в группу алифатических альдоксимдегидратаз (Kato, Asano, 2006). Наилучшим субстратом для альдоксимдегидратазы P. chlororaphis B23 был бутиральдоксим, который трансформировался в бутиронитрил (Oinuma et al., 2003). Интересно, что для нитрилгидратазы данного штамма бутиронитрил также являлся наиболее предпочтительным субстратом (Km=1,03 мМ) (Nagasawa et al., 1987). Kato и соавт. (2000) обнаружили, что все нитрилутилизирующие микроорганизмы обладали альдоксимдегидратазной активностью при условии, что они культивировались с альдоксимом (Kato et al., 2000). Сделано предположение, что альдоксимдегидратаза индуцибельна, и индуктором ее активности служат сами субстраты. Также авторы обнаружили, что альдоксимы являются хорошими индукторами не только для альдоксимдегидратазы, но и для других нитрилгидролизующих ферментов. 19 1.1.2. Классификация и характеристика нитрилгидратаз С момента открытия нитрилгидратазы Arthrobacter sp. J-1 (Asano et al., 1980) подобные ферменты выделены и описаны у различных бактерий. В настоящее время у микроорганизмов идентифицировано два типа нитрилгидратаз, различающихся простетическими группами (ионы железа или кобальта). Железосодержащие ферменты встречаются чаще и были описаны первыми. Ионы кобальта обнаружены в нитрилгидратазах штаммов R. rhodochrous J1, М8, P. putida 5B и B. smithii SC-J05-1 (Астаурова и др., 1993; Takashima et al., 2000; Рогачева, Игнатов, 2001). Нитрилгидратаза из Agrobacterium tumefaciens В-261 содержит и ионы кобальта, и ионы железа. Также выделен фермент Myrothecium verrucaria, содержащий в активном центре ионы цинка. Недавно обнаружена нитрилгидратаза, содержащая один ион кобальта, два – меди и один – цинка на одну молекулу функционального белка, однако расположение этих четырех ионов металлов в ферменте неизвестно (Okamoto, Eltis, 2007). Исследована структура микроорганизмов. Нативные нитрилгидратаз, четвертичные выделенных структуры из различных бактериальных нитрилгидратаз высоко вариабельны. Их молекулярная масса варьирует от 54 до 530 кДа (Prasad, Bhalla, 2010). За исключением гомотетрамерного фермента из A. tumefaciens d3 (Bauer et al., 1994), все остальные известные нитрилгидратазы являются -гетеромультимерами, обычно димерами или тетрамерами. Обе субъединицы необходимы для проявления активности фермента. Молекулярная масса -субъединицы составляет от 24 до 28 кДа, β-субъединицы – 25-39 кДа. У штамма R. rhodochrous J1 обнаружено образование двух видов нитрилгидратаз: высокомолекулярной, Mr 520 кДа, и низкомолекулярной, Mr 130 кДа. Низкомолекулярная нитрилгидратаза R. rhodochrous J1 имеет 22 нативную структуру белка, в отличие от 1010 структуры высокомолекулярной нитрилгидратазы. Оба фермента являются кобальтзависимыми. Молекула -гетеродимера содержит 1 атом кобальта, в отличие от железосодержащих 20 нитрилгидратаз, где 1 атом железа приходится на каждую субъединицу фермента (Kobayashi et al., 1991). Нитрилгидратазы в значительной степени различаются по физикохимическим свойствам и субстратной специфичности. Железосодержащие нитрилгидратазы гидратируют преимущественно алифатические короткоцепочечные нитрилы. Кобальтсодержащие ферменты имеют более широкий спектр субстратной специфичности и способны конвертировать также ароматические нитрилы (Cowan et al.,1998; Martınkova´ et al., 2010). Большинство нитрилгидратаз термолабильны, их операционный температурный оптимум варьирует от 20 до 35°С. Это позволило проводить реакции биосинтеза амида при низких (<25°С) температурах, при которых амидазная активность практически не регистрируется (Sharma et al., 2009). В то же время описано несколько ферментов с максимальной активностью при 40, 50 и даже 60°С (Yamaki et al., 1997; Cramр, Cowan, 1999; Kato et al., 1999). pH-оптимум большинства нитрилгидратаз варьирует в пределах от 6,5 до 8,5 (Prasad, Bhalla, 2010). Тогда как кобальтсодержащая нитрилгидратаза, выделенная из термофильной B. smithii SC-J05-1, имеет наибольшую активность при рН более 10,0 (Takashima et al., 2000). 1.2. Молекулярные основы метаболизма нитрилов Гены, кодирующие ферменты нитрильного метаболизма, обнаружены у разных видов бактерий, в основном Рseudomonas (Nishiyama et al., 1991) и Rhodococcus (Martınkova´ et al., 2010). Генный кластер состоит из гена альдоксимдегидратазы, генов, кодирующих ферменты гидролиза нитрилов, и может отличаться по их составу и взаиморасположению в зависимости от видовой принадлежности штамма (Рисунок 3). У большей части исследованных культур ген альдоксимдегидратазы находится в той же ориентации, но выше (upstream) генов нитрилгидратазы и амидазы, кодирующих ферменты гидролиза нитрилов. Так, для штамма P. chlororaphis B23 кластер включает следующие гены: nhpR, oxdA, amiA, nhpA, nhpB, nhpC, nhpS и acsA, кодирующие регулятор нитрилгидратазы, 21 альдоксимдегидратазу, амидазу, α- и β-субъединицы нитрилгидратазы, два белка неизвестной функции и ацетил-КоА синтетазу соответственно (Hashimoto et al., 2005; Sakashita et al., 2008). У штамма Rhodococcus sp. N-771 гены регуляторных белков располагаются между oxd и ami, а замыкает кластер ген активатора нитрилгидратазы (Kato et al., 2004). Рисунок 3. Сравнение генных кластеров, ответственных за альдоксимнитрильный метаболизм у некоторых штаммов бактерий (Kato et al., 2006). Альдоксимдегидратазы У бактерий описана только хромосомная локализация генов, кодирующих альдоксимдегидратазы. Клонированы и секвенированы гены альдоксимдегидратаз из Bacillus sp. OxB-1, P. chlororaphis B23, R. globerulus A-4, Pseudomonas sp. K-9. Rhodococcus sp. N-771, Сравнение нуклеотидной последовательности oxd последнего штамма показало сходство с аналогичными генами P. chlororaphis (Oinuma et al., 2003), R. erythropolis (Kato et al., 2004), R. globerulus (Xie et al., 2003) и Bacillus sp. (Kato et al., 2000). Уровень гомологии составил 90,3, 76,9, 76,0 и 32,7 %, соответственно. У бактерий с двустадийной системой гидролиза нитрилов ген альдоксимдегидратазы находится выше (upstream) генов нитрилгидратазы и 22 амидазы, а с одностадийной – ниже (downstream). Так, при клонировании гена альдоксимдегидратазы Bacillus sp. OxB-1 в E. coli оказалось, что он сцеплен с геном нитрилазы и расположен ниже его (Kato et al., 2000; 2003). Схожая локализация генов альдоксимдегидратазы и нитрилазы выявлена у Pseudomonas syringae DS3000. Также обнаружено, что альдоксим-нитрильный генный кластер штамма Acinetobacter sp. ADP1 сходен по расположению генов и структуре с аналогичным Pseudomonas sp. K-9 и P. сhlororaphis B23 (Barbe et al., 2004). Авторы предположили, что Acinetobacter sp. ADP1 приобрел способность к метаболизму большого разнообразия органических соединений путем горизонтального переноса генов альдоксим-нитрильного пути от бактерий рода Pseudomonas. О регуляторных механизмах функционирования альдоксимдегидратазы известно немного. Kato с соавт. (2004) обнаружили открытую рамку считывания (orf2), расположенную на 205 п.н. выше стартового кодона oxd, и предположили, что генный продукт orf2 является транскрипционным регулятором фермента (Kato et al., 2004). При сравнении данного полипептида с другими оказалось, что он похож на транскрипционный регулятор нитрилазы R. rhodochrous J1 (29%), ДНКсвязывающий регуляторный белок Streрtomyces coelicolor A3 (28%) и транскрипционный регулятор РА4094 Рseudomonas aeruginosa РА01 (25%). Кроме того, обнаружено сходство (25%) с orf2 альдоксимутилизирующего штамма Bacillus sр. OxB-1 (Kato et al., 2000). Нитрилгидратазы Впервые хромосомная локализация гена, кодирующего фермент нитрилгидратазу, определена у R. rhodochrous N-774 (Ikehata et al., 1989). Клонированы и секвенированы гены нитрилгидратаз R. rhodochrous N­774 (Hashimoto et al., 1992; Duran et al., 1993), R. rhodochrous J1 (Kobayashi et al., 1991), R. erythropolis (Kobayashi et al., 1998), R. rhodochrous М8 (Вейко и др., 1995), Bacillus sp. BR449 (Kim, Oriel, 2000). Структурные гены - и -субъединиц нитрилгидратаз располагаются смежно, однако порядок их кодирующих последовательностей различается (Рисунок 4). В каждом из генов 23 низкомолекулярной и высокомолекулярной нитрилгидратазы R. rhodochrous J1 кодирующая последовательность -субъединицы локализована выше гена субъединицы, в отличие от генов нитрилгидратазы R. rhodochrous N­774, P. chlororaphis В23. Гены амидазы находятся в такой же ориентации, но выше генов, кодирующих нитрилгидратазы R. rhodochrous N­774 и P. chlororaphis В23. У R. rhodochrous J1 ami находится на 1,9 т.п.н. ниже гена, кодирующего субъединицу низкомолекулярной нитрилгидратазы. Близкая локализация трех генов подтверждает теорию, что эти ферменты тесно связаны в двухступенчатой реакции деградации нитрилов. R. rhodochrous N­774 амидаза нитрилгидратаза P. chlororaphis В23 Р38К амидаза нитрилгидратаза Р47К OrtE R. rhodochrous J1-В нитрилгидратаза R. rhodochrous J1-Н нитрилгидратаза амидаза Rhodococcus sp. амидаза нитрилгидратаза R. rhodochrous М8 нитрилгидратаза Рисунок 4. Организация генов нитрилгидратазы и амидазы (Kobayashi et al., 1992; Вейко и др., 1995). Клонированы гены высоко­ и низкомолекулярной нитрилгидратазы R. rhodochrous J1 в Е. coli под контролем lac-промотора. При этом обнаружено, что уровень активности фермента в свободном клеточном экстракте Е. coli был 24 значительно ниже, чем у донора (Kobayashi et al., 1991). Нитрилгидратазная активность не проявлялась, когда фрагмент ДНК в составе 2070 пар оснований, кодирующий оба фермента биодеградации нитрилов – нитрилгидратазу и амидазу, был клонирован в Е. coli (Ikehata et al., 1989). Более выраженной была экспрессия генов - и -субъединиц нитрилгидратазы R. rhodochrous N­774, клонированных в клетках R. rhodochrous АТСС12674 (Hashimoto et al., 1992). При клонировании в E. coli фрагмента ДНК, содержащего гены нитрилгидратазы P. putida 5B, активность фермента в клетках трансформантов была в 6 раз выше, чем у штамма-донора (Wu et al., 1997). Дальнейшие исследования показали, что для эффективной продукции фермента необходимы два региона ДНК, расположенных выше и ниже локуса, кодирующего гены субъединиц. Сделано предположение, что эти последовательности могут кодировать белки, необходимые для включения ионов металла в структуру нитрилгидратазы, а также сенсорные белки, чувствительные к амидам, необходимым для индукции фермента (Komeda et al., 1996a). Предложена кодирующих схема организации ферменты, R. rhodochrous М8 (Yanenko участвующие et и регуляции в экспрессии утилизации al., 1995). Следуя этой генов, нитрилов у модели, гены нитрилгидратазы и амидазы штамма R. rhodochrous М8 объединены в регулон, контролируемый одним общим регуляторным геном. Этот регулон является объектом азотной и углеродной катаболитной репрессии. С- и N-сигналы распознаются в регионе промотора регуляторного гена, а цели этих сигналов расположены в регионах промоторов каждого из генов – нитрилгидратазы и амидазы. Rucka´ et al. (2014) показали, что у штаммов R. erythropolis A4 и R. erythropolis CCM2595 ami, nha1 и nha2 представляют собой единый оперон. Гены nha12 транскрибируются с двух промоторов: Рami и Рnha. Активность первого промотора индуцируется ацетонитрилом, а второго – ацетонитрилом и ацетамидом, используемыми в качестве источника азота (Rucka´ et al., 2014). У штамма P. chlororaphis B23 котранскрибируются 5 генов: oxdA, amiA, nhpA, nhpB, 25 nhpC. Также в виде оперона функционируют nhpS и acsA (Sakashita et al., 2008). Индукция нитрилгидратазы у этого микроорганизма осуществляется бутиральдоксимом (Hashimoto et al., 2005) и метакриламидом (Yamada et al., 1986), в присутствии которого количество нитрилгидратазы составляет около половины всех растворимых белков клетки (Nagasawa et al., 1989). Следует отметить, что у псевдомонады отсутствует промотор между oxdA и amiA. Транскрипция может начинаться с РoxdA или РnhpA, причем активность второго промотора в три раза выше в присутствии амида (Sakashita et al., 2008) (Рисунок 5). А Б Рисунок 5. Транскрипция нитрилгидратазного генного кластера у штаммов R. erythropolis A4 и R. erythropolis CCM2595 (А) и P. chlororaphis B23 (Б). Регуляция данного кластера осуществляется и на посттрансляционном уровне. Окончательное формирование нитрилгидратазы Fe-типа происходит при помощи белка-активатора, который действует как металло-шаперон (Lu et al., 2003). Механизм созревания фермента Со-типа выглядит иначе и называется «обмен субъединиц» (self-subunit swapping). Белок-активатор образует комплекс со свободной α-субъединицей, затем происходит замена α-субъединицы фермента без кобальта на содержащую металл субъединицу из активаторного комплекса (Zhou et al., 2008; Okamoto et al., 2010; Liu et al., 2013). 26 Нитрилгидратаза широко распространена среди прокариот, но есть сведения о наличии этого фермента у эукариот, например у воротничковых жгутиконосцев (Monosiga brevicollis) и гетероконтофитовых водорослей (Aureococcus anophagefferens) (Marron, 2012). У первых фермент состоит из α- и βсубъединиц, а у вторых – только из α-субъединицы. Нитрилгидратаза, состоящая из двух субъединиц, кодируется гибридным геном (fusion gene), который образуется в результате слияния генов и экспрессируется как единое целое с образованием составного белка. Такой химерный ген на 5’-конце кодирует βсубъединицу, а на 3’-конце – α-субъединицу, между ними имеется регион различной длины неизвестной функции (нет совпадений в базе данных). 1.3. Микроорганизмы, утилизирующие азотсодержащие производные карбоновых кислот Бактерии, утилизирующие нитрильные соединения, были выделены из мелководных морских отложений (Langdahl et al., 1996), глубоководных донных осадков (Colquhoun et al., 1998; Heald et al., 2001), геотермальных источников (Yamaki et al., 1997; Pereira et al., 1998) и из почв (Martinkova´ et al., 1992; Layh et al., 1997; Brandao et al., 2003). Таксономическая принадлежность выделенных культур весьма разнообразна. Они представлены различными видами бактерий, относящимися к филам Proteobacteria, Actinobacteria, Cyanobacteria и Firmicutes (Таблица 2). Показано, что нитрилгидратазной активностью обладают дрожжи и считанное количество плесневых грибов, однако их каталитические, биохимические и структурные свойства нуждаются в исследовании, т.к. они отличаются от хорошо изученных нитрилгидратаз бактерий (Prasad, Bhalla, 2010). Подробно изучены нитрилгидратазы, полученные из различных видов Rhodococcus (Watanabe et al., 1987; Nagasawa et al., 1988; Kakeya et al., 1991; Crossby et al., 1994; Layh et al., 1997; Layh, Willets, 1998; Kato et al., 1998; Prepechalova et al., 2001; Рогачева, Игнатов, 2001; Brandao et al., 2003; Precigou et al., 2004; Prasad et al., 2004; Wang, 2005). В работе (Brandao et al., 2002) авторы 27 выделили 43 нитрилутилизирующих культуры родококков из глубоководных морских осадков и почв. Они установили, что среди культивируемых нитрилутилизирующих штаммов доминирует Rhodococcus erythroрolis. Таблица 2 Таксономическое разнообразие микроорганизмов, обладающих нитрилгидратазной активностью Бактерии Proteobacteria Actinobacteria Acidovorax Amycolaptosis Agrobacterium Arthrobacter Bradyrhizobium Brevibacterium Burkholderia Corynebacterium Comanonas Microbacterium Klebsiella Micrococcus Mezorhizobium Nocardia Moraxella Pseudonocardia Pantoea Rhodococcus Pseudomonas Rhizobium Rhodopseudomonas Serratia Дрожжи Плесневые грибы Aureobasidium Candida Cryptococcus Geotricum Henseniaspora Kluyveromyces Pichia Rhodotorula Trichoderma Myrothecium Наличие нитрилгидратазной активности у штаммов, выделенных из природных источников, тесно связано с альдоксимметаболизирующей способностью (Kato et al., 2004). Выделены и охарактеризованы различные бактерии, конвертирующие альдоксимы посредством альдоксимдегидратазы и нитрилгидратазы (Asano, Kato, 1998; Kato et al., 1998). В 2000 г. Kato и Asano изучили способность утилизировать фенилацетальдоксим и пиридин-3-альдоксим у 975 культур микроорганизмов, включающих 45 родов бактерий, 11 родов актиномицетов, 22 рода дрожжей и 37 родов грибов (Kato et al., 2000). Оказалось, что исследованные микроорганизмы активно утилизируют фенилацетальдоксим и пиридин-3-альдоксим в 98 и 107 случаях соответственно. Так, среди 540 штаммов бактерий 37 (представители семи родов коллекции) были способны метаболизировать фенилацетальдоксим. Пиридин-3-альдоксим трансформировали 96 штаммов, распределённых среди 30 28 родов. Нитрилы, образованные при дегидратации альдоксимов, подвергались действию гидролитических ферментов. Всего 31 (10 – фенилацетонитрил и 21 – 3цианопиридин) штамм конвертировал нитрилы в соответствующие кислоты под действием нитрилгидратазы и амидазы. Остальные штаммы утилизировали фенилацетонитрил и 3-цианопиридин без формирования соответственных амидов. В таких штаммах нитрилы гидролизовались нитрилазой и/или комбинацией нитрилгидратазы и амидазы, в которой амидазная активность была выше, чем нитрилгидратазная. Кроме бактериальной природы альдоксимдегидратазы показана способность трансформировать альдоксимы у широкого ряда грибов (Fusarium oxysporum, Gibberella fujikuroi, Fusarium solani, Aspergillus celluosae, Mucor fragilis, Aspergillus candidus). Из 102 штаммов (представители 28 родов) 52 были способны конвертировать фенилацетальдоксим. Пиридин-3-альдоксим-трансформирующая способность была обнаружена только в ограниченном числе (n=11) штаммов грибов. Большинство грибов конвертировали фенилацетонитрил посредством нитрилгидратазы и амидазы, тогда как 3-цианопиридин трансформировался сразу в никотиновую кислоту без образования промежуточных продуктов. В дрожжах эта активность встречалась трансформировать редко. Из фенилацетальдоксим: 333 штаммов только 2 могли Candida methanolica TPU 1217 и Pichia miso TPU 1306. Было показано, что оба штамма метаболизировали фенилацетальдоксим последовательной нитрилгидролизующих ферментов. работой Культура альдоксимдегидратазы P. miso и трансформировала фенилацетонитрил, аккумулируя фенилацетамид, тогда как C. metchanolica конвертировала его без образования фенилацетамида. Ни один из штаммов дрожжей не мог утилизировать пиридин-3-альдоксим. Таким образом, альдоксимдегидратаза обнаружена среди различных микроорганизмов, способных к утилизации нитрилов. Известно, что в почвах с химической нагрузкой происходит активное размножение и накопление бактерий, способных усваивать загрязняющие вещества (Watanabe, 1987). Так, Nawaz c соавт. (1991) изолировали из 29 промышленных стоков штамм Klebsiella NCTR1, pneumonia способный трансформировать 12,4 мМ акрилонитрил и другие алифатические нитрилы (Nawas et al., 1991). В 1990 г. Narayanasamy описал штамм рода Arthrobacter, выделенный из нефтехимических отходов, использующий акрилонитрил в концентрации 30 мМ как единственный источник питания (Narayanasamy et al., 1990). Layh с коллегами (1997) показали, что штаммы, выделенные методом обогащенной культуры, имеют высокую нитрилдеградирующую способность именно к тем субстратам, которые использовались для селекции (Layh et al., 1997). Verma и Sangave (2014) выделили Bacillus thuringiensis из почвы, отобранной с предприятия по производству бензонитрила, способный утилизировать ароматические нитрилы посредством нитрилазы (Verma, Sangave, 2014). Штамм Rhodococcus бензонитрильными sр. гербицидами изолированный MTB5, сельскохозяйственной из почвы, загрязненной полностью утилизировал 30 мМ бензонитрил посредством нитрилгидратазы/амидазы и был способен расти в среде с добавлением 60 мМ субстрата. Также этот штамм оказался активен в отношении алифатических нитрилов (Mukram et al., 2015). Васильев и соавт. (2014) выделили из осадков биологических очистных сооружений штамм Alkaligenes faecalis 2, обладающий высокой амидазной активностью (Васильев, 2014). 1.4. Методологические подходы и методы оценки структурно- функционального состояния почвенной микробиоты Для микроорганизмов почва выступает как сложная система с резко различающимися условиями обитания в каждом отдельном микролокусе по доступности питательных веществ, кислорода, влажности, температуры, рН и др. (Daniel, 2005). Крайняя степень пространственной гетерогенности, мультифазовая природа (включающая газы, воду и твердое вещество) и комплекс химических и биологических свойств почвенной среды способствуют микробному разнообразию, представленному в почвенном образце. Один грамм лесной почвы содержит около 4×107 прокариотических клеток (Hassink et al., 1993), тогда как 30 один грамм пахотных земель и сенокосных угодий содержит 2×109 клеток прокариот (Рaul, Clark, 1989). 1.4.1. Бактериологические методы Для количественной оценки почвенной микробиоты традиционно используют метод прямого посева почвенной суспензии на плотные питательные среды с последующим выделением чистых культур микроорганизмов. Данный метод позволяет осуществлять не только подсчет, но и определять таксономическую принадлежность изолятов. Микроорганизмы, населяющие почву, различны по потребностям в источниках питания, поэтому универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех бактерий, не существует. Главными элементами, по отношению к которым проявляется разнообразие обмена веществ у микроорганизмов и которые определяют специфичность питательной среды, являются источники углерода и азота (Практикум по биологии почв, 2002). Зная физиологические особенности соответствующей группы прокариот, можно подобрать такие условия культивирования (состав среды, кислотность, условия аэрации, температуру и др.), при которых будут развиваться лишь представители определенной группы. Так, для выделения азотфиксирующих микроорганизмов используют безазотистую среду Эшби, нитрификаторов – среду Виноградского, содержащую аммиачные формы азота, целлюлозолитиков – среду ГетчинсонаКлейтона, основу которой составляет карбоксиметилцеллюлоза, а для грибов – среду Чапека с сахарозой (Практикум по микробиологии, 1976; Экология микроорганизмов, 2004). Зачастую необходимо выявление не физиологической группы микроорганизмов, а представителей конкретных таксонов. В таких случаях исследователи применяют родо- и даже видоспецифичные селективные среды, например желточно-солевой агар для стафилококков или цетримидный агар для P. aeruginosa (Приказ МЗ №535 от 22.04.1985). Для выделения бактерийдеструкторов химических веществ или поллютантов используют метод накопительных культур с последующим высевом суспензии на минеральную агаризованную среду с добавлением изучаемого вещества, например углеводорода (Ившина и др., 2003), бифенила (Плотникова и др., 2011), нитрила 31 (Brandao et al., 2002; Максимов и др., 2007) в качестве единственного источника углерода и/или азота. 1.4.2. Молекулярно-генетические методы Культуральные методы помимо явных преимуществ (простота выполнения, доступность используемых средств, экономичность) имеют ряд недостатков, связанных с отсутствием универсальной питательной среды, на которой могли бы расти все микроорганизмы, представленные в данной почве. Кроме этого, полный учет ограничивает различная скорость роста прокариот (на момент подсчета колоний еще не все бактерии вырастают, а спустя пару дней колонии сливаются и их уже нельзя подсчитать), наличие в почве некультивируемых форм микроорганизмов. Несмотря на то, что выделение чистой культуры является традиционным методом, разнообразие почвенных микробных сообществ остается неизученным, поскольку только от 0,1 до 1,0% почвенных бактерий являются культивируемыми (Daniel, 2005; Frisli et al., 2012; Schlaberg et al., 2012). На современном этапе при помощи бактериологического метода охарактеризована лишь малая часть почвенного генофонда. Чтобы обойти некоторые ограничения традиционных методик были разработаны молекулярные методы, основанные на выделении и анализе нуклеиновых кислот (в основном ДНК) из почвенных образцов без культивирования микроорганизмов. Теоретически, микробная ДНК, выделенная из почвы, представлена суммарной ДНК всей автохтонной микрофлоры и называется почвенным метагеномом (Handelsman et al., 1998). Опубликовано множество протоколов выделения ДНК из почвы (Jia et al., 2006; Herrera, Cockell, 2007; Thakuria et al., 2008; Ascher et al., 2009; Petric et al., 2011; Андронов и др., 2011). Учитывая разнообразие видов бактерий, большие популяции почвенных микроорганизмов и комплекс почвенного матрикса, который содержит различные соединения (например, гуминовые кислоты), связывающие ДНК и препятствующие ее ферментативной модификации, выделение микробной ДНК из почвы до сих пор остается затруднительным. Наиболее широко распространенным методом молекулярного анализа для 32 количественной оценки микробиома является полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР РВ). Он основан на детекции в реальном времени репортерных молекул, флуоресценция которых возрастает с каждым последующим циклом по мере накопления ПЦР-продукта (Higuchi et al., 1993). Регистрируемое в процессе амплификации нарастание сигнала прямо пропорционально увеличению концентрации синтезированных специфических продуктов и отражает количество ДНК в исходной матрице. Для выявления продуктов амплификации в режиме реального времени используют следующие наиболее распространенные флюоресцентной меткой подходы: (TaqMan использование анализ) и ДНК-зондов интеркалирующих с агентов (бромистый этидий, SYBR Green I, SYBR Gold, YOYO, YO-PRO-1) (Ребриков, 2009). Первый метод относится к специфичным, поскольку применение зондов исключает амплификацию сторонних копий, а второй метод – к неспецифичным, так как интенсивное свечение интеркалирующих агентов возможно при их связывании с праймерами-димерами или шмером. В последнем случае для подтверждения специфичности реакции анализируют кривые плавления, каждый пик на которых соответствует числу продуктов в пробирке. Данный метод широко используется в медицинской практике для определения титра патогенных и условно-патогенных бактерий и вирусов в различных средах и биотопах макроорганизма (Gentili et al., 2011; Gaibani et al., 2013), обнаружения мутаций в геноме (Bernard, Wittwer, 2002; Dempsey et al., 2004), а также в исследовательских работах по изучению пробиотических препаратов (Шкопоров и др., 2014). В последнее время ПЦР РВ стали широко применять в экологических исследованиях для количественной оценки почвенного микробного сообщества (Kolb et al., 2003; Okano et al., 2004; Hoppener-Ogawa et al., 2007; Петрова и др., 2010). С использованием ПЦР РВ изучены вариации в таксономической структуре бактериального, архейного и грибного сообществ в образцах почв, отобранных из солончака в окрестностях оз. Акколь, Чингирлау (Казахстан) по градиенту засоленности (Андронов и др., 2012). Получены следующие средние данные численности микроорганизмов на грамм почвы по образцам: для бактерий – 33 3,5×109, для архей – 3,0×108 (в самой засоленной пробе – 6,9×109), для грибов – 1,3×107. В наиболее засоленном образце отмечено значительное преобладание архей и постепенное снижение их количества по мере уменьшения степени засоленности. В другой работе при помощи данного метода авторы установили, что генетически модифицированный штамм Sinorhizobium meliloti АСН-5 не оказал заметного воздействия на численность и структуру микробного сообщества почвы. В то же время численность этого штамма в течение месяца снизилась более чем в триста раз (Андронов и др., 2009). ПЦР в реальном времени характеризуется возможностью проведения не только количественного, но и качественного анализа. Филогенетический анализ может выполняться посредством ПЦР амплификации генов 16S рРНК, используя универсальные праймеры для бактерий и архей. Этот анализ позволяет каталогизировать и сравнивать микробное разнообразие в различных почвах, а также анализировать изменения в структуре сообщества, связанные с изменением факторов окружающей среды. Для мониторинга микробного разнообразия могут использоваться другие маркерные гены, такие как dnaK (молекулярный шаперон HSP-70-типа) и amoA (монооксигеназа аммония). Подбирая специфичные праймеры к той или иной таксономической группе прокариот, можно выявить структуру микробного сообщества в почве. Так, Fierer и соавт. (2005) в своей работе оценили относительное содержание основных групп микроорганизмов в различных типах почвы: лесной, пустынной и степной. Авторы установили, что наибольшее представительство в почве имеют Acidobacteria, причем из трех изученных почв их оказалось больше в степных. Меньшим количеством были представлены филы представительство имели Proteobacteria бактерии из и фил Actinobacteria. Firmicutes и Наименьшее Bacteroidetes. Относительное количество грибов было максимальным в лесной почве (Fierer et al., 2005). Мишенью для ПЦР РВ могут выступать не только последовательности, кодирующие консервативные участки рРНК, но и функциональные гены. Так, Coffey с соавт. (2010) методом ПЦР РВ детектировали железосодержащую 34 нитрилгидратазу у 46 почвенных изолятов (Coffey et al., 2010). После проведения «обычной» ПЦР авторы установили, что 22 штамма содержали полные αβпоследовательности. Из оставшихся 24 изолятов у 13 амплифицированы только гены α-субъединицы фермента, а у остальных – оба гена по отдельности, что может быть связано с взаиморасположением генов, когда β-субъединица расположена перед α-субъединицей, как у штамма R. rhodochrous J1 (Komeda et al., 1996). Метод количественной ПЦР является неотъемлемой частью модельных исследований по изучению динамики основных таксономических групп микроорганизмов под влиянием различного рода токсикантов. Baxter и Cummings (2008) изучали влияние нитрильного гербицида бромоксинила в концентрациях 10 и 50 мг/кг почвы на разнообразие бактерий в поверхностном слое грунта. Авторы установили, что гербицид в выбранных концентрациях сходно действует на почвенное сообщество. На 63 день эксперимента в обоих вариантах опыта содержание нитрифицирующих бактерий было значительно выше, чем в контроле, однако на 84 сутки их количество было сопоставимо. Также на 63 сутки экспозиции отмечено снижение содержания бактерий из филы Acidobacteria и рода Pseudomonas. Более длительное влияние бромоксинила сопровождалось возрастанием количества Actinobacteria и α-Рroteobacteria, а в варианте 50 мг/кг еще и Acidobacteria (Baxter, Cummings, 2008). За последние 10 лет знания о микробном разнообразии значительно расширились благодаря применению секвенирования ДНК нового поколения (СНП, «next-generation sequencing», NGS) (Shendure, Ji, 2008). Данные технологии позволяют одновременно определять нуклеотидные последовательности множества различных нитей ДНК при осуществлении процессов их синтеза или лигирования, что обеспечивает прочтение миллиардов нуклеотидов в день (Алексеева, Бруснигина, 2014). СНП было успешно применено для характеристики микробиома почв (Fierer et al., 2011), океанов (Caporaso et al., 2011), атмосферы (Bowers et al., 2011), а также человека (Kuczynski et al., 2011). В работе, связанной с изучением комплексных бактериальных инфекций, СНП 35 выявило у пациентов с кистозным фиброзом наличие муковисцидоз- ассоциированных патогенов в легких, в то время как рутинные методы их не обнаружили (Salipante et al., 2013). Whiteley с соавт. (2012) установили, что в метаногенных системах по переработке отходов преобладали представители таких бактериальных таксонов, как Clostridium, Synergistia и Bacteroides, которые поддерживали стабильное сообщество на протяжении длительного периода. В структуре архейного сообщества доминирующие таксоны изменялись с течением времени (Whiteley et al., 2012). При исследовании длительного загрязнения почвы различными поллютантами, в основном ураном и нитратами, Green и соавт. (2012) обнаружили, что основным фактором, влияющим на структуру микробного сообщества, является концентрация ионов водорода. Денитрифицирующие бактерии из рода Rhodanobacter (класс γ-Proteobacteria) доминировали при низких значениях рН и в наиболее контаминированных районах. Другие факторы, такие как концентрация азота, уровень кислорода и сезонность, не влияли на количество Rhodanobacter (Green et al., 2012). В работе (Fierer et al., 2012) авторы сравнили 16 почвенных микробных сообществ, отобранных из холодных и горячих пустынь, лесов, лугов и тундры. Сообщества, которые образуются в отсутствии растений (холодные пустыни), обладали наименьшим функциональным и видовым разнообразием. В пустынных образцах явно преобладали гены, ассоциированные с осморегуляцией и дормантностью, но содержание генов катаболизма растительных органических веществ, было значительно меньше. Также в этих сообществах детектировано в три раза меньше генов устойчивости к антибиотикам, что позволило авторам сделать вывод о том, что в этих почвах абиотические факторы играют более важную роль, чем биотические. Таким образом, несмотря на значительные успехи в области биотехнологии нитрильных соединений, до сих пор малоизученными остаются вопросы, связанные с пространственным распределением нитрилутилизирующих бактерий 36 по почвенным экосистемам, в том числе с использованием молекулярных методов. Исследования в этой области позволят оценить возможность применения данной группы прокариот в качестве индикатора состояния окружающей среды и составить комплексное представление о биокаталитическом и биодеструктивном представляется потенциале интересным почвенной изучить микробиоты. токсическое влияние Кроме этого нитрильных соединений на структуру микробного сообщества природной почвы, в том числе на штаммовом/клеточном уровне, а именно на морфологию и жизнеспособность некоторых видов бактерий. 37 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Выделение бактериальных культур Материалом для выделения микроорганизмов служили природные и антропогенно-загрязненные почвы, в том числе подзолистые, каштановые, с повышенным засолением, солончаки, а также иловые речные отложения (Таблица 3). Выделение гетеротрофных бактерий осуществляли по стандартной методике на чашках Петри с агаризованной средой LB (Луриа­Бертани), содержащей (г/л): триптон (Sigma, США) – 10,0, дрожжевой экстракт (Helicon, Франция) – 5,0, NaCl – 10,0, агар-агар (Sigma, США) – 15,0 (Методы…, 1991; Теппер и др., 2004). Колонии подсчитывали на 3, 4, 5 и 6 разведениях после инкубации чашек в течение трех суток при 30°С. Для выделения бактерий, утилизирующих альдоксимы, нитрилы и амиды, применяли жидкую или агаризованную минеральную безазотную солевую среду N следующего состава (г/л): KH2PO4 – 1,0, K2HPO4 × 3H2O – 1,6, NaCl – 0,5, MgSO4 × 7H2O – 0,5, CaCl2 × 2H2O – 0,005, FeSO4 × 7H2O – 0,01, CoCl2 × 6H2O – 0,01, агар-агар – 6,0, рН 7,2-7,4. В качестве источника углерода и азота использовали ацетальдоксим или пропиональдоксим, ацетонитрил, ацетамид в концентрации 10 мМ. Колонии подсчитывали на 3-5 сутки под малым увеличением (×10). Для подсчета грамположительных бактерий использовали среду LB с полимиксином (10 мг/мл), грамотрицательных – с метиленовым красным (150 мкг/мл). Для исключения грибковой микрофлоры в среды добавляли актидион (100 мкг/мл). Численность микроорганизмов определяли как количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в пересчете на 1 г сухой почвы. Для выращивания и контроля чистоты использовали бульонную или агаризованную среду LB. бактериальных культур 38 Таблица 3 Характеристика образцов почв Антропогенно-измененные Естественной среды Типы почв Солончак Солончак злостный с солевой коркой Солонец Солодь Дерново-луговая с пониженным увлажнением Дерново-луговая с повышенным увлажнением То же Каштановая почва степной зоны То же Иловые речные отложения Техногеннозасоленная почва (солеотвал) Техногенные почвы Донные осадки Образец С2 С3 Глубина отбора проб, см 10 10 С6 ризосфера П25 10 10 5 П26 5 П27 НС 20 10 НО ПО 30 С1 10 г. Соликамск Х1 Х2 5 5 г. Пермь, ОАО «ХенкельПемос» ЗМУ (грядка) ЗМУ (флора) РЦ ЭЦ ТГК 5 г. Пермь, ОАО «Минеральные удобрения» О1-2 С ДО ДонО Примечание Троицкий заказник, Челябинская область Краснокамский район Саратовская область р. Волга-Ахтуба 5 10 5 5 г. Пермь, ТЭЦ №14 р. Кама В работе также использовали почвенные штаммы, утилизирующие нитрилы карбоновых кислот, изолированные ранее (2002-04 гг.) сотрудниками лаборатории ЛММБ ИЭГМ УрО РАН из образцов почв и вод естественной среды и почвы промышленных предприятий (ФГУП «ПЗ им. С.М. Кирова» и ОАО «Бератон») и селекционированные на среде с ацето- и/или изобутиронитрилом. 39 2.2. Условия культивирования бактерий Бактерии выращивали в 100 мл среды N в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, либо в 40 мл среды в конических колбах объемом 100 мл на роторной качалке при постоянном перемешивании со скоростью вращения 120 об./мин и температуре 28°С в периодическом режиме. Источником углерода служила глюкоза в конечной концентрации 0,1%, источником азота – NH4Cl в концентрации 10 мМ. Ацетамид (10 мМ) добавляли как индуктор нитрилгидратазы, а Na2SO3 (5 мМ) – альдоксимдегидратазы. Накопление биомассы контролировали на фотоэлектроколориметре КФК-3 (Россия) с использованием 0,5 см кюветы при =540 нм с учетом разведения. Одна единица ОП540 соответствует 0,42±0,12 мг сухого веса клеток Rhodococcus и 0,21±0,07 мг сухого веса клеток Pseudomonas. Активность нитрилгидратазы измеряли на спектрофотометре Ultrospec 3300 pro (Англия) по изменению оптической плотности реакционной среды при =240/260 нм с добавлением 15 мкл акрилонитрила на 4 мл пробы в течение одной минуты с использованием кварцевой 1 см кюветы. 2.3. Трансформация субстратов Бактериальную суспензию, отобранную в конце экспоненциальной фазы (ОП540=1,5-2,0), откручивали на центрифуге Heraeus Biofuge Stratos (Thermo scientific, Германия) 20 мин при 9 тыс. об./мин и ресуспендировали в 10 мМ калий­натрий фосфатном буфере следующего состава (г/л): КН2РО4 – 13,6, Na2HPO4 ×12H2O – 35,82, рН 7,2. Часовую конверсию акрилонитрила и 3-цианопиридина с использованием биомассы клеток осуществляли в объеме 1,0 мл в пробирках эппендорф. Реакцию проводили одновременно в двух температурных режимах: при 25 и 50ºС для акрилонитрила, при 30 и 50ºС для 3-цианопиридина в твердотельном термостате «Термит» (ДНК-Технология, Россия). Трансформацию пропионитрила осуществляли в объеме 5 мл при температуре 30ºС. Пробы отбирали каждые 10 мин, добавляли 50 мкл концентрированной HCl для остановки реакции и 40 центрифугировали (5415 D, Eppendorf, Германия) при 12 тыс. об./мин в течение 3 мин. В 24-часовом синтезе акриламида, пропионамида и никотинамида пробы отбирали каждый час по 200 мкл, центрифугировали при 12 тыс. об./мин в течение 3 мин, супернатанты использовали для анализа субстратов и продуктов. Во всех вариантах субстраты добавляли дробно по мере их трансформации, не превышая концентрацию 3%. Биотрансформацию пропиональдоксима проводили в 5 мл фосфатного буфера в течение 1-24 часов. Пробы отбирали по 100 мкл, центрифугировали при 12 тыс. об./мин в течение 3 мин. Количественный анализ алифатических предельных и непредельных субстратов и продуктов осуществляли методом газовой хроматографии (Shimadzu GC-2014, Япония). Ароматические органические вещества определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (Shimadzu LC-10, Япония). В качестве стандартов использовали растворы чистых альдоксима, нитрилов, амидов и карбоновых кислот. Удельную активность фермента выражали как количество продукта в мкмоль, образуемое мг сухого веса клеток за минуту (мкмоль/мг/мин). 2.4. Определение общей токсичности почвы Общую токсичность биолюминесцентного сенсора почвы оценивали «Эколюм-5» на с использованием основе рекомбинантного люминесцентного штамма E. coli K12 TG1 с полным lux-опероном из Vibrio fischeri, полученного из коллекции МГУ им. М.В. Ломоносова (Данилов и др., 2002). Данный метод является стандартизированным и сертифицированным в России (ПНД ФТ 14.1:2:3:4.11-04, ПНД ФТ 16.1:2:3:4.8-04) и в Европе (ISO 11348-2) (Методика определения…, 2010; Palma et al., 2010). Навеску почвы освобождали от корней, крупных посторонних частиц и высушивали при 105ºС в течение 1 ч. После охлаждения воздушно-сухую пробу почвы растирали в ступке, просеивали через сито. Навеску почвы (масса не менее 5 г) помещали в 41 коническую колбу, приливали 25 мл дистиллированной воды (рН 6,8-7,4), взбалтывали в течение 5 мин и оставляли для экстракции на 24 ч. Полученный экстракт фильтровали через бумажный фильтр (белая, красная лента) и тестировали на токсичность (Определение токсичности…, 1996). Для реконструкции тест-системы «Эколюм-5» добавляли 10 мл дистиллированной воды комнатной температуры (рН 6,8-7,4) во флакон с лиофилизированным сенсором. Выдерживали суспензию в течение 30 мин, периодически перемешивая, и подбирали рабочую концентрацию тест-системы. Опытные пробы разводили в 2, 4, 8, 16 раз. В качестве контроля использовали дистиллированную воду, в качестве модельного токсиканта – ZnSO4×7H2O 6-7 мг/л. Индекс токсичности (ИТ) рассчитывали по формуле: ИТ = 100×(Io-I)/Io, где Io и I соответственно интенсивность свечения сенсора «Эколюм-5» контроля и опыта через 30 мин контакта. В случаях, когда уровень биолюминесценции в анализируемой пробе был больше, чем в контроле, независимо от величины отрицательного значения ИТ делался вывод об отсутствии токсичности образца. 2.5. Определение токсичности нитрилов В экспериментах по изучению негативного влияния различных нитрилов на бактерии использовали референтный штамм E. coli K12 TG1 (pBR322) ВКМ (г. Москва), лабораторные штаммы Rhodococcus sp. A0, R. ruber gt1, П5-2, П5-8, R. erythropolis 84, Pseudomonas sp. К15-6-2, К10ж2, P. fluorescens C2. 2.5.1. Биотестирование Оценку токсичности растворов алифатических предельных (ацето-, валероизобутиронитрил), непредельных (акрилонитрил) и ароматических (бензонитрил, 3,5-дибромо-(бромоксинил), 3,5-дийодо-4-гидроксибензонитрил (иоксинил)) нитрилов (Sigma-Aldrich, США) для бактерий проводили двумя способами. В первом случае применяли подход, основанный на изменении биолюминесценции тест-штамма при его кратковременной экспозиции с растворами токсикантов. Использовали суспензию клеток штамма E. coli K12 TG1 (pXen7), содержащего полный lux-оперон Photorhabdus luminescens размером 7 тыс. п.н. («Эколюм-8») 42 (Данилов и др., 2002). Сенсор добавляли к испытуемым растворам в соотношении 1:1. Биолюминесценцию измеряли на многофункциональном микропланшетном ридере BioTek вышеописанной (BioTek Instruments формуле. Inc., Строили США). график ИТ рассчитывали зависимости по уровня биолюминесценции от %-ого содержания нитрилов в двойной логарифмической системе координат и определяли принятый в токсикологии параметр EC50 (median effective concentration). Величина ЕС50 соответствовала концентрации раствора, при которой происходит ингибирование свечения сенсора на 50%. Для сопоставления данных по токсичности использовали показатель LD50 (median lethal dose), указанный в паспортах безопасности нитрилов для крыс (www.sigmaaldrich.com). 2.5.2. Оценка минимальных подавляющих и бактерицидных концентраций токсикантов Минимальные подавляющие (МПК) и бактерицидные (МБК) концентрации нитрилов определяли в микросуспензионном тесте в лунках плоскодонного 96­луночного планшета на среде LB с токсикантом и культурой одного из исследуемых штаммов, стандартизованной до рабочей концентрации 10 6 клеток/мл. Учет результатов МБК производили путем высева на LB-агар через 24 ч, МПК оценивали по оптической плотности на планшетном спектрофотометре Tecan infinite M200 (Tecan, Швейцария) через 48 ч инкубирования. 2.5.3. Атомно-силовая и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия Для изучения влияния токсиканта на морфологию и жизнеспособность клеток использовали суточные культуры бактерий, выращенные в LB-бульоне при 30°С. Бактериальные клетки трижды отмывали калий-натрий фосфатным буфером (рН 7,0) с центрифугированием при 13 тыс. об./мин в течение 10 мин, выдерживали 60 мин в 1 М акрилонитриле, 1 мМ или 0,1 мМ бромоксиниле и снова трижды отмывали, после чего клетки ресуспендировали в 1 мл фосфатного буфера. На покровное стекло наносили 10-15 мкл бактериальной суспензии и высушивали при комнатной температуре. Изучение клеток проводили с помощью 43 комбинированной системы, состоящей из атомно-силового микроскопа (АСМ) Asylum MFP-3D-BIO (Asylum Research, США) и конфокального лазерного сканирующего микроскопа (КЛСМ) Olympus FV1000 (Olympus Corporation, Япония), в лаборатории атомно-силовой и конфокальной микроскопии на базе Rhodococcus-центра Пермского государственного национального исследовательского университета. Оценку жизнеспособности клеток выполняли после получения КЛСМ-изображений, для чего препараты предварительно окрашивали красителем Live/Dead® (Syto9/пропидиум йодид) BacLightTM Bacterial Viability Kits (Invitrogen, США) и 15 мин инкубировали в темноте. Профили поверхности клеток изучали с помощью АСМ. Сканирование осуществляли в полуконтактном режиме на воздухе с использованием кремниевого кантилевера AC240TS с резонансной частотой 50-90 кГц и константой жесткости 0,5-4,4 Н/м. Для определения линейных размеров клеток (длина, ширина, высота) и характеристики структуры поверхности клеток (шероховатость Sq, индекс I) получали двух- и трехмерные топографические изображения бактерий. Обработку микрофотографий проводили с помощью программы Igor Pro 6.22A (WaveMetrics, США). 2.6. Модельный эксперимент по влиянию акрилонитрила на почвенную микробиоту Для постановки модельного эксперимента по изучению влияния акрилонитрила на почвенную микробиоту использовали незагрязненную садовую дерново-подзолистую почву, отобранную в Кунгурском районе Пермского края. Предварительно почву просеивали через сито с диаметром пор 5 мм и помещали (по 2 кг) в стеклянные сосуды (эксикаторы), искусственно загрязняли ее акрилонитрилом в количестве 20, 200 и 2000 мг/кг, что соответствует 10, 100 и 1000 предельно допустимым концентрациям (ПДК), установленным для воды (МУК 4.1.1206–03). Поллютант вносили неоднократно в течение 2-х месяцев (3, 10, 30, 60 сутки). Спустя 2 дня после каждого внесения производили прямые высевы на 44 селективные агаризованные среды. В контрольный сосуд добавляли дистиллированную воду в том же объеме. Всего проведено 6 высевов: до внесения акрилонитрила, в течение 2-х месяцев эксперимента и через месяц после прекращения загрязнения. В динамике оценивали численность основных групп микроорганизмов в загрязненной и контрольной почве общепринятыми микробиологическими методами (Практикум по микробиологии, 1976; Экология микроорганизмов, 2004). Нитрил- и амидутилизирующие бактерии выделяли на минеральной солевой агаризованной среде N с ацетонитрилом или ацетамидом в концентрации 10 мМ в качестве единственного источника питания. Параллельно отбирали пробы почвы для молекулярно-генетического анализа. 2.7. Выделение ДНК 2.7.1. Выделение ДНК из клеток бактерий Образцы ДНК грамотрицательных бактерий для ПЦР-анализа готовили следующим образом: одну микробиологическую петлю биомассы бактерий переносили в микропробирки объемом 500 мкл, суспендировали в 100 мкл стерильной дистиллированной воды, прогревали при 95°С в течение 10 мин в твердотельном термостате «Термит» и откручивали на центрифуге СМ-50 (ELMI Ltd., Латвия) при 13 тыс. об./мин 5 мин (Stone et al., 1994). Препараты хромосомной ДНК грамположительных бактерий получали фенольным методом по следующей схеме с модификациями (Гловер, 1988). Отбирали колонию (в количестве 1 микробиологической петли) в эппендорф, добавляли 0,5 мл ТЕбуфера (10 мМ трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0), содержащего 10 мг/мл лизоцима, перемешивали и выдерживали 30 мин при 37°С. Добавляли 50 мкл 20% SDS и 10 мкл раствора проназы Е (предварительно инкубировали 30-60 мин при 37°С). Выдерживали 20 мин при 37°С. Добавляли 0,5 мл водонасыщенного фенола (желтая нижняя фаза), центрифугировали в течение 3 мин при 14 тыс. об./мин, затем отбирали водную фазу вместе с пленкой в другой эппендорф и добавляли равный объем (~0,5 мл) хлороформа, после чего снова центрифугировали в течение 3 мин при 14 тыс. об./мин. Водную фазу удаляли и переносили ее в 45 другой эппендорф, добавляли равный объем (~0,5 мл) изопропанола, 50 мкл ацетата аммония, выдерживали 30 мин при -18°С, после чего центрифугировали в течение 3 мин при 14 тыс. об./мин. Супернатант сливали, добавляли к полученному осадку 500 мкл 70% этанола, центрифугировали в течение 3 мин при 14 тыс. об./мин, затем супернатант снова сливали. Осадок подсушивали в вакуумном концентраторе (Labconco, США) и добавляли к нему 100 мкл ТЕбуфера. 2.7.2. Выделение тотальной ДНК из почвы Метагеномную ДНК выделяли из навески почвы 0,2 г в пластиковой пробирке с завинчивающейся крышкой объемом 2 мл согласно научнометодическим рекомендациям (Андронов и др., 2011). К каждой навеске добавляли приблизительно равное по объему количество матрикса (стеклянных шариков), 350 мкл раствора А (натрий-фосфатный буфер 200 мМ, гуанидина изотиоцианат 240 мМ), 350 мкл раствора Б (Трис-HCl буфер 500 мМ, SDS 1%) и 400 мкл смеси фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1). Пробирку встряхивали на вортексе TS-100C (BIOSAN, Латвия) в течение 15 мин при максимальной скорости. После центрифугирования материал экстрагировали смесью хлороформ:изоамиловый спирт (24:1), суммарную ДНК осаждали изопропанолом и растворяли в 100 мкл ТЕ-буфера (Трис-HCl 10 мМ, ЭДТА 1 мМ). Очистку ДНК производили методом фенольной экстракции легкоплавкой агарозы (LKB-Producter AB, Bromma, Швеция). Для этого раствор ДНК смешивали со 100 мкл расплавленной 2% легкоплавкой агарозы, после застывания агарозные блоки отмывали 3 раза в 2 мл ТЕ-буфера по 3 часа. Далее агарозу расплавляли при 65ºС, добавляли ацетат натрия до конечной концентрации 0,3 М, дважды экстрагировали фенолом, один раз – смесью фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1), один раз – смесью хлороформ:изоамиловый спирт (24:1), после чего отбирали 350 мкл водной фазы. ДНК осаждали изопропанолом, промывали 70% этанолом, подсушивали на воздухе и растворяли в 50 мкл ТЕ-буфера. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически в молях фосфатов, используя значение молярного 46 коэффициента экстинкции в максимуме поглощения (ε260=6.6×103 М-1см-1). Выход ДНК составлял не менее 2 мкг ДНК на 1 г почвы. 2.8. Полимеразная цепная реакция 2.8.1. ПЦР с детекцией по конечной точке Амплификацию ДНК проводили с применением термостабильной Taqполимеразы производства ООО «СибЭнзим» (Новосибирск) на термоциклере Т3 (Biometra, Германия) или DNA Engine Dyad (Bio-Rad, США) в 25 мкл реакционной смеси. Олигонуклеотидные праймеры были синтезированы ООО «Евроген», г. Москва на основе базы данных GenBank и литературных данных (Widmer et al., 1998; Turton et al., 2005) (Таблица 4). Режим амплификации для праймеров AcinetF/AcinetR включал начальный цикл денатурации – 2 мин при 94ºС, следующие 35 циклов: 94ºС – 30 сек; 50ºС – 60 сек; 72ºС – 90 сек и завершающий цикл 5 мин при 72ºС. Для праймеров Psfor/Ps-rev: начальный цикл денатурации 5 мин при 95ºС, следующие 40 циклов: 94ºС – 30 сек; 65ºС – 60 сек; 72ºС – 70 сек, завершающий цикл 10 мин при 72ºС. Для праймеров 16S рРНК Rhodococcus начальный цикл денатурации включал 1 мин при 95ºС и следующие 33 цикла: для Rh1/Rh2 – 95ºС – 30 сек; 60ºС – 30 сек; 72ºС – 70 сек; для Rub1/Rub2 – 94ºС – 20 сек; 65ºС – 30 сек; 72ºС – 60 сек; для Re1/Re2 – 94ºС – 30 сек; 57ºС – 60 сек; 72ºС – 60 сек. Завершающий цикл для всех праймеров составлял 2 мин при 72ºС. В качестве контроля использовали клетки R. erythropolis ИЭГМ62т, R. ruber ИЭГМ70т и R. rhodochrous ИЭГМ7т, предоставленных чл.-корр. РАН И.Б. Ившиной. Для грамотрицательных штаммов контролем служили P. fluorescens C3220 и A. baumannii из лабораторной коллекции. Для универсальной 16S рРНК начальный цикл денатурации составлял 70 сек при 94ºС, следующие 33 цикла: 94ºС – 20 сек; 62ºС – 20 сек; 72ºС – 60 сек, завершающий цикл 1 мин при 72ºС. 47 Таблица 4 Праймеры для ПЦР-анализа генов 16S рРНК Выявляемый вид Праймер Последовательность Фрагмент, п.н. Pseudomonas spр. Ps-for ggtctgagaggatgatcagt 969 Ps-rev ttagctccacctcgcggc AcinetF gaaggtagcttgctac AcinetR actatctctaggtattaactaaagt Rh1 gtggaaagtttttcggtgcaggatga Rh2 aaaccacatctctgcagtcgtccggta Re1 ggtctaataccggatatgacctcctatc Re2 gcaagccagcagttgagctgctggt Rub1 ggataggacctcgggatgcatgttccg Rub2 aaccccatctctggggcggtccggtgt F515 gtgccagcmgccgcggtaa R1391 gacgggcggtgwgtrca Acinetobacter spр. R. rhodochrous R. erythropolis R. ruber 16S рРНК унив Для детекции генов основных ферментов 410 801 455 830 876 альдоксим-нитрильного метаболизма использовали праймеры, указанные в Таблице 5. Режим амплификации для всех праймеров включал начальный цикл денатурации – 1 мин при 94ºС. Для праймеров PsOxd F/R использовали следующий протокол: 94ºС – 20 сек; 57ºС – 30 сек; 72ºС – 80 сек (35 циклов) и завершающий цикл 3 мин при 72ºС. ПЦР-анализ с праймерами RhOxd F/R проводился в аналогичном режиме с температурой отжига 60ºС. Для праймеров АМ2/АМ7 и АМ3/АМ9 (β- и α­cубъединица кобальтсодержащей нитрилгидратазы) режим амплификации составлял: 94ºС – 60 сек; 42ºС – 60 сек; 72ºС – 60 сек (3 цикла); 94ºС – 20 сек; 50ºС – 40 сек; 72ºС – 60 сек (3 цикла); 94ºС – 20 сек; 56ºС – 30 сек; 72ºС – 60 сек (33 цикла) и завершающий цикл 3 мин при 72ºС. Для праймеров АМ5/АМ8 и АМ4/АМ6 режим амплификации составлял 93ºС – 40 сек; 48ºС – 60 сек; 72ºС – 150 сек (5 циклов); 93ºС – 50 сек; 54ºС – 70 сек; 72ºС – 180 сек (30 циклов) и завершающий цикл 3 мин при 72ºС. Для праймеров AlcJM3 и Acidv режим амплификации 48 включал начальный этап денатурации 60 сек при 94ºС; отжиг при 58ºС – 60 сек; элонгацию при 72ºС – 80 сек (35циклов) и завершающий этап – 60 сек при 72ºС. Для праймеров AmiRhd-1/AmiRhd-2: 94ºС – 40 сек; 55-63ºС – 60 сек; 72ºС – 60 сек (35 циклов) и завершающий этап – 60 сек при 72ºС. Таблица 5 Праймеры для амплификации генов альдоксимдегидратазы (А), нитрилгидратазы (Б), нитрилазы (В) и амидазы (Г) А Штамм – источник гена oxd Праймер P. chlororaphis B23 R. rhodochrous N-774 F PsOxd-1 R PsOxd-2 F RhOxd-1 R RhOxd-2 Последовательность atggaatctgcgatcgacacgcatc tcaggtgggcgcgacaacggcatc atggaatctgcaatcggcgaacac tcagtgctcggcggttgtcaccg Фрагмент, п.н. 1058 1069 Б Штамм – источник гена nh Праймер R. rhodochrous N-774 α-СЕ Fe-НГ R. rhodochrous N-774 β-СЕ Fe-НГ R. rhodochrous J1 α-СЕ Co-НГ R. rhodochrous J1 β-СЕ Co-НГ В F AM5 R AM8 F AM4 R AM6 F AM3 R AM9 F AM2 R AM7 Штамм – источник гена nit Праймер Aicaligenes faecalis JM3 F AlcJM3-1 R AlcJM3-2 F Acidv-1 R Acidv-2 Acidovorax facilis 72W Последовательность Фрагмент, п.н. 680 catatgtcagtaacgatcgac atgcatcagacggtgggaacctg catatggatggagtacacgat 720 atgcatcaggccgcaggctcgag gtgatacatatgagcgagcacgtcaat 650 atgcatcatacgatcacttcctg gtgatacatatggatggtatccacgac 700 atgcatcacgcagagatcaggta Последовательность atgcagacaagaaaaatcgtccggg tcaggacggttcttgcaccagtagc atggtttcgtataacagcaagttcctc ctactttgctgggaccggttcttc Фрагмент, п.н. 1071 1100 Г Штамм – источник гена ami Праймер R. erythropolis (E12517) и R. rhodochrous N-774 Последовательность F AmiRhd-1 atggcgacaatccgacctgacgaca R AmiRhd-2 ctaggcggggctgagttgtggtgcaga Фрагмент, п.н. 1566 49 Электрофоретическое разделение продуктов реакции проводили в 1,2% агарозном геле в трис­боратном буфере при напряженности электрического поля 6 В/см (ДНК-Технология, Россия). Для оценки молекулярной массы фрагментов ДНК использовали молекулярные маркеры 1 kb и 100 bр (ООО «СибЭнзим»). Визуализацию полос и документирование данных осуществляли после окрашивания геля бромистым этидием с использованием системы гель­документации BioDocAnalyze (Biometra, Германия) или Gel-Doc XR (BioRad, США). 2.8.2. ПЦР в реальном времени ПЦР в реальном времени (ПЦР РВ) проводили в амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США) в 25 мкл реакционной смеси в присутствии красителя SYBR Green I (Синтол, Москва) согласно протоколу производителя. Метагеномную почвенную ДНК разводили в 10 раз и добавляли в реакцию в количестве 5 мкл. Для анализа структуры почвенных сообществ и детекции гена nha, кодирующего α-субъединицу железосодержащей нитрилгидратазы, применяли праймеры, указанные в Таблице 6. В качестве контроля матрицы использовали геномную ДНК лабораторного штамма R. erythropolis 84, содержащего nha-ген (Демаков и др., 2003). Температурный режим ПЦР включал начальную денатурацию 5 мин при 95ºС и последующие 45 циклов: 15 сек при 95ºС, 40 сек при соответствующей температуре отжига. Специфичность целевого продукта устанавливали с помощью аналитического плавления по завершении процесса амплификации в диапазоне температур от 55ºС до 94ºС (шаг: 0,5ºС/сек). Обработку результатов проводили с использованием программного обеспечения Bio-Rad CFX Manager 2.1. Количество продукта амплификации рассчитывали по формуле N=240-Ct с учетом разведения, где N – число копий гена, вступивших в реакцию, Ct – значение порогового цикла. Результат ПЦР РВ выражали в виде числа копий гена на грамм почвы. 50 Таблица 6 Праймеры, использованные для ПЦР РВ Название Последовательность Температура Ссылка отжига, °С Eub338 Eub518 Alf685 Bet680 Actino23 Lgc353 Cfb319 Acid31 ITS1f 5,8s FE-F/R actcctacgggaggcagcag attaccgcggctgctgg tctacgratttcaccyctac tcactgctacacgyg cgcggcctatcagcttgttg gcagtagggaatcttccg gtactgagacacggacca gatcctggctcagaatc tccgtaggtgaacctgcgg cgctgcgttcttcatcg ttggtacccgacggttacgt cgcgccttggactgaagt nhpA-F/R tcaagagcaaggaactcatc ttccgtccttgagcagcagc Примечание: Eub338/Eub518 – для бактерий, 60 Fierer et al., 2005 65 53 60 Coffey et al., 2010 Sakashita et al., 2008 Eub338/Alf685 – для α- Proteobacteria, Eub338/Bet680 – для β-Proteobacteria, Actino235/Eub518 – для Actinobacteria, Lgc353/Eub518 – для Firmicutes, Cfb319/Eub518 – для Bacteroidetes, Acid31/Eub518 – для Acidobacteria, 5,8s/ITS1f – для грибов, FE-F/FE-R и nhpAF/nhpA-R – для nha, кодирующего α-субъединицу железосодержащей НГ. 2.9. Определение нуклеотидной последовательности генов универсальной 16S рРНК и функциональных генов Секвенирование генов проводили с праймерами, используемыми в ПЦР, с применением набора реактивов Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit на автоматическом секвенаторе 3500XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) согласно производителю. Полученные последовательности идентифицировали с помощью программы BLAST и базы данных GenBank/EMBL/DDBJ (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Перевод нуклеотидных последовательностей в аминокислотные осуществляли в программе BLASTХ. Выравнивание последовательностей производили при помощи программы YACWGUI 1.2. 51 Построение дендрограмм производили с помощью программы Vector NTI 10 (Invitrogen, США). 2.10. Метагеномный анализ Метагеномное секвенирование фрагмента гена 16S рРНК проводили на пиросеквенаторе Roche GS Junior (США) в Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова, г. Москва. Фильтрацию химерных ридов осуществляли при помощи алгоритма Uchime (часть программы Userach v7.0). Анализ фильтрованных данных секвенирования проводился по базе данных Ribosomal Database Project (RDP) http://rdp.cme.msu.edu/. 2.11. Статистическая обработка Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием стандартных пакетов компьютерных программ Microsoft Office XP Excel и STATISTICA 6.0. Вид распределения исследуемых признаков определяли с использованием критериев Шапиро-Уилка. Все показатели представлены в виде среднего арифметического и его ошибки (M±m). Достоверность отличий определяли по критерию Стьюдента (t). Различия между независимыми группами данных считали достоверными при р≤0,05. В случае, если распределение данных в выборке не могло характеризоваться как нормальное, рассчитывали медиану (Me), квартили [Q1; Q3] и межквартильный размах. Достоверность отличий двух независимых выборок определяли по критерию Манна-Уитни (M-U-тест), зависимых – по критерию Уилкоксона (Wтест). Для оценки категориальных данных использовали тест Фишера (F-тест). При p<0,05 делался вывод о наличии статистически значимой разницы между сравниваемыми выборками. Для исследования связи двух признаков в случае их нормального распределения вычисляли коэффициент корреляции Пирсона (r), статистическая достоверность рассчитывалась при уровне значимости p=0,05. При получении отличного от нормального распределения признаков для исследования связи 52 между ними вычисляли непараметрический коэффициент ранговой корреляции Спирмена (R), достоверными считали связи при р≤0,05. Силу корреляционной связи оценивали в зависимости от значения коэффициента: |R| ≤ 0,3 – слабая корреляция; 0,3 < |R| < 0,70 – умеренная корреляция; |R| ≥ 0,70 – сильная корреляция. Все программы, которые использовались в данном исследовании, относились к классу свободного/открытого программного обеспечения или были лицензионными. 53 ГЛАВА 3. РАСПРОСТРАНЕНИЕ АЛЬДОКСИМНИТРИЛУТИЛИЗИРУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ В ПОЧВАХ С РАЗНОЙ АНТРОПОГЕННОЙ НАГРУЗКОЙ 3.1. Распространение бактерий, обладающих системами трансформации нитрилов, в почвах умеренной и степной зон Распространенность альдоксим-нитрилутилизирующих бактерий изучали в образцах почв естественной среды (n=10) и антропогенно-загрязненных территорий (n=12). Во всех почвах определено количество гетеротрофных сапрофитных микроорганизмов, в том числе грамотрицательных и грамположительных бактерий. Выявлено, что число гетеротрофов статистически значимо не различалось в двух массивах (p=0,428) и варьировало от 2,67×106 клеток/г сух. дерново-луговой почвы с пониженным увлажнением до 2,17×1010 клеток/г сух. почвы в степной почве (нижний профиль) (Приложение 1). Отмечено более высокое антропогенно-загрязненных содержание почвах грамположительных (р=0,037) (Рисунок 7). бактерий в Количество спорообразующих бактерий не превышало 105 клеток/г сух. почвы (например, 1,87×104 – образец С1, 1,14×105 – образец НС) и достоверно не различалось в двух группах. А Б Рисунок 7. Содержание грамположительных и грамотрицательных бактерий в среднем по всем почвам (А) и отдельно в почвах естественной среды (ест.ср.) и антропогенно-измененных (пром.) (Б). 54 Проанализировано амидконвертирующих распространение бактерий альдоксим-, (Рисунок 8). нитрил- Количество и бактерий, трансформирующих альдоксим, колебалось от 3×104 до 2,3×107 клеток/г сух. почвы, ацетонитрил – от 1×105 до 7,5×107, ацетамид – от 1,1×105 до 7,4×107. Отношение количества растущих на ацетальдоксиме бактерий к общему числу гетеротрофов в большинстве проб почв не превышало 3%. В среднем по всем массивам составило 1,37±0,23%, для естественных почв – 2,42±0,41%, а для антропогенно-загрязненных – 0,33±0,07%. Содержание нитрилутилизирующих бактерий было гораздо выше в антропогенно-загрязненных почвах – 6,75±3,78%, в естественных всего 1,29±0,98%, в среднем же их доля составила 4,41±2,51%. Процент амидутилизирующих бактерий практически не отличался от предыдущей группы прокариот, составив в среднем 4,35±2,39% (Рисунок 9). Из трех изучаемых групп альдоксимутилизирующие прокариоты чаще встречались в почвах естественной среды (р=0,004), в двух других группах статистически значимой разницы не обнаружено. Показано высокое содержание утилизирующих ацетальдоксим/ацетонитрил бактерий в дерново-луговых почвах, под богатой травянистой растительностью, и в иловых отложениях, отличающихся высоким органосодержанием, обширным комплексом биологически активных веществ, набором микроэлементов. Бактерии, способные к росту на ацетальдоксиме, ацетонитриле и ацетамиде широко распространены и в почвах с повышенным засолением. Более того, число альдоксимутилизирующих микроорганизмов из всех «солевых» почв было наибольшим в солончаковой (С2), а число конвертирующих амиды – в почвах с умеренным засолением. В то же время, в почве злостный солончак не обнаружено ни одной изучаемой группы микроорганизмов. Обнаружена сильная положительная достоверная корреляция (R=0,850, р=0,001) между содержанием нитрил- и амидутилизирующих бактерий, что ожидаемо, учитывая последовательное действие нитрилгидратазы и амидазы в двустадийном гидролизе нитрилов. Отмечено незначительное преобладание амидтрансформирующих микроорганизмов практически во всех типах почв 55 (Рисунок 10). По-видимому, ферменты типа амидаз участвуют не только в гидролизе нитрилов, но также вовлечены в другие метаболические системы бактерий. А КОЕ/г 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 С2 С6 C3 Риз П25 П26 П27 НС НО ПО Б КОЕ/г 1,00E+09 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 Н.о . Н.о . Н.о . Н.о . Н.о . 1,00E+01 Н.о . 1,00E+02 Рисунок 8. Содержание ТГ К ЭЦ РЦ ра ло Ф Гр я дк а 2 Х 1 Х нО До ДО С 1­ 2 О С1 1,00E+00 альдоксим-(■), нитрил-(□) и амидутилизирующих (■) бактерий в естественных (А) и антропогеннозагрязненных (Б) почвах. 56 100% 98% 96% 94% 92% 90% 88% 86% 84% 82% 80% все почвы естественные антроп.-загряз. Гетеротрофы Альдоксимутилизирующие Нитрилутилизирующие Амидутилизирующие Рисунок 9. Содержание альдоксим-, нитрил- и амидутилизирующих микроорганизмов по отношению к общему числу гетеротрофов. Ранее показано, что в почвах, отобранных с предприятий по производству акриламида, микроорганизмы, способные к утилизации нитрилов, составляли не менее 20%, а в ряде проб – более 40% от общего числа выделенных бактерий (Кузнецова и др., 2007). По нашим данным также отмечено преобладание нитрили амидконвертирующих бактерий в почвах промышленных предприятий (1,11×107 [2,95×106; 1,83×107] и 7,39×106 [4,14×106; 2,60×107]) по сравнению с природными (3,44×106 [1,21×106, 6,05×106] и 2,98×106 [1,23×106; 1,53×107]), хотя это увеличение оказалось статистически незначимым (M-U-тест: р=0,136 для бактерий, выделенных на ацетонитриле, и р=0,320 – на ацетамиде). Полученные данные навели на мысль о возможности использования этих групп микроорганизмов в качестве биоиндикаторов загрязнения окружающей среды. 57 Б А Рисунок 10. Содержание нитрил-(АцН) и амид-(АцА) утилизирующих бактерий по всем массивам (А) и в почвах естественной среды (ест.ср.) и антропогенно-измененных (пром.) по отдельности (Б). 3.2. Биоиндикация почвенной среды с использованием нитрилутилизирующих бактерий В настоящий момент для оценки токсичности сложных почвенных сред используют в основном два подхода: химический анализ компонентов среды и биотестирование. В первом случае определяется ПДК токсичного вещества, во втором – контролируется влияние токсичности среды на различные параметры жизнедеятельности (скорость роста, интенсивность дыхания и другие метаболические процессы) или гибель различных организмов. Биотесты на основе биолюминесценции дают количественную оценку токсичности и широко используются для выявления экотоксических свойств воды, экстрактов почв и отходов (Кудряшева и др., 2002; Pandard et al., 2006). Экстракты исследованных природных почв не вызывали стимуляции биолюминесценции сенсора E. coli К12 TG1. Почвы с промышленных территорий делились на не токсичные (ИТ≤20), токсичные (20<ИТ≤50) и сильно токсичные (ИТ>50) (Рисунок 11). 58 Рисунок 11. Содержание гетеротрофных, нитрил- и амидутилизирующих бактерий в почвах промышленных предприятий и индекс токсичности (ИТ). I, II, III – уровни токсичности, где I – допустимая степень токсичности, II – образец токсичен, III – образец сильно токсичен. Выявлена слабая положительная корреляционная зависимость между величиной ИТ и содержанием грамположительных микроорганизмов (R=0,33; р=0,32), но связь оказалась недостоверной. Это вполне закономерно, так как грамположительные прокариоты благодаря мощному муреиновому слою способны выдерживать длительное воздействие неблагоприятных факторов, тогда как грамотрицательные микроорганизмы более чувствительны к условиям окружающей среды ввиду строения их клеточной стенки. Несмотря на преобладание нитрилутилизирующих бактерий в антропогенно-загрязненных, и тем более в промышленных почвах, корреляционной зависимости между нитрилутилизирующими прокариотами и величиной общей токсичности почвы не обнаружено (R=0,128; р=0,71). 59 Проведен корреляционный анализ содержания бактерий, обладающих системами трансформации нитрилов, с концентрацией некоторых металлов (Pb, Zn, Cu, Ni, Fe, Cr, Cd) и бенз(а)пирена, определяемых в почвах согласно перечню загрязняющих государственного веществ, в отношении регулирования в области которых охраны применяются меры окружающей среды (распоряжение от 8.07.2015, № 1316-р), и СанПиНу 2.1.7.1287-03, утвержденному 25.04.2007. Для этого использовали образцы 40 почв, отобранные на территории г. Кудымкара сотрудниками группы физико-химических исследований ИЭГМ УрО РАН (Приложение 1). Валовое содержание металлов определяли атомноабсорбционным методом на спектрофотометре «Спектр-5». Качественный анализ бенз(а)пирена проводили с использованием хромато-масс-спектрометрической системы «Agilent 6890/5973N» (Рисунок 12). Рисунок 12. Диапазон валового содержания металлов и бенз(а)пирена (Benz) в почвах (мг/кг). Оказалось, что валовое содержание некоторых металлов (Рb, Cu, Fe) и бенз(а)пирена превышало ПДК в почве (ГН 2.1.7.2041–06). Так, содержание Cu в образце К15 превышало значение ПДК в 12,7 раза. В пробе К38 превышено содержание Рb в 1,2 раза. Проба К30 характеризовалась полиметаллическим загрязнением: валовое содержание Рb и Cu составило 5,5 и 12,6 ПДК соответственно. Концентрация Fe в образцах изменялась от 10662 до 30403 мг/кг 60 почвы. Незначительное превышение ПДК (25000 мг/кг) отмечено в четырех вариантах: К8, К10, К35 и К40. По содержанию бенз(а)пирена степень загрязнения 13 образцов характеризовалась как умеренная (n=4), значительная (n= 7) и большая (n=2). Несмотря на существенные различия почв по количеству загрязняющих веществ, значимой связи с числом нитрилутилизирующих бактерий не обнаружено ни в одном варианте. Современные подходы экологической оценки нарушения почвенного покрова базируются на том, что реакция почвенных микробных систем при антропогенных воздействиях различного рода похожа и выражается, главным образом, в изменении состава и численности активно функционирующих популяций микроорганизмов, входящих в сообщество. Так, азотфиксирующие бактерии используются как индикаторы химического загрязнения почвы (Мынбаева и др., 2011). Авторы показали, что культура свободноживущих бактерий Azotobacter чувствительна к содержанию тяжелых металлов в почве и изменение численности КОЕ можно использовать для индикации загрязнения городских почв. Нитрифицирующие бактерии являются чувствительными к присутствию нефтепродуктов в почве: их деятельность угнетается любой концентрацией нефтяных углеводородов (Забелина, 2014). По некоторым литературным данным низкая активность процессов денитрификации может свидетельствовать о том, что почва подвергалась засолению, загрязнению тяжелыми металлами или нефтепродуктами. Несмотря на то, что нитрилутилизирующие микроорганизмы тоже участвуют в круговороте азота в биосфере, по нашим данным они не являются индикаторами загрязнения окружающей среды. Вероятно, увеличение их количества в почвах с антропогенной нагрузкой является следствием того, что под действием различных поллютантов (нефть, бензин, диоктилфталат, нафталин, бромоксинил и т.д.) в почве преобладают бактерии, обладающие различными системами деградации синтетических загрязнителей, в основном это бактерии фил Proteobacteria и Actinobacteria (Baxter, Cummings, 2008; Панов и др., 2013). Учитывая, что системы гидролиза нитрилов чаще всего детектируются у 61 представителей именно этих фил, увеличение доли нитрилутилизирующих бактерий на фоне общего подавления микробиоты вполне закономерно. 3.3. Активность ферментов альдоксим-нитрильного метаболизма почвенных штаммов бактерий Как правило, при разрушении нитрилов природными микробными сообществами почвы и воды происходит их трансформация до амидов, а затем до карбоновых кислот. Деструктивный потенциал и общая эффективность таких штаммов не всегда высоки, поэтому поиск и выделение новых штаммовдеструкторов, а также повышение их активности весьма актуальны, причем, в первую очередь, для создания современных биотехнологий трансформации химических соединений и ремедиации почвы и воды, загрязненных нитрилами. Показано, что нитрилгидратазная активность (n=139) по акрилонитрилу варьировала от 0 до 95,5 ЕД, медиана [квартили] составили 0,84 [0,17-12,5]. При сопоставлении штаммов, выделенных из почв естественной среды (n=40) и антропогенно-измененных (n=99), оказалось, что третья квартиль значений для первой группы была равна 3,26 ЕД, тогда как 75% второй группы укладывались в диапазон активностей от 0 до 14,5 ЕД. Максимальная активность достигала 33,5 ЕД в первой группе, и 95,5 ЕД во второй группе штаммов. При сопоставлении способности штаммов конвертировать различные нитрилы и соответствующие амиды оказалось, что суммарная амидазная активность была сопоставима с нитрилгидратазной: средние арифметические значения равны 5,98 и 4,62 ЕД, медианы равны 1,84 и 1,75 ЕД соответственно (Рисунок 13). При исключении из выборки штаммов R. ruber gt1 и Rhodococcus sр. A0 – суперпродуцентов нитрилгидратазы (Максимов и др., 2007) уровень нитрилгидратазной активности составил 0,43 ЕД, что более, чем в 10 раз ниже амидазной. Разница между активностью двух ферментов наиболее выражена при трансформации двух- и трехуглеродных субстратов. Так, медиана значений активности по ацетонитрилу составила 2,5 ЕД, а по ацетамиду – 9,4 ЕД (Рисунок 14). 62 Рисунок 13. Суммарная нитрилгидратазная (НГ) и амидазная (Ами) активности почвенных штаммов и активность нитрилгидратазы почвенных изолятов по акрилонитрилу: А – вся выборка, Б – почвы естественной среды, В – антропогенно-загрязненные почвы. А Б В Рисунок 14. Скорость трансформации двух- (А) и трехуглеродных (Б, В) субстратов: АцН – ацетонитрил, АцА – ацетамид, АкН – акрилонитрил, АкА – акриламид, ПрН – пропионитрил, ПрА – пропионамид. Корреляционный анализ в ряду субстратов показал, что нитрилгидратазная и амидазная активности практически не зависят друг от друга у большей части культур. Значимая связь была отмечена между значениями скорости трансформации производных уксусной, пропионовой, масляной и изомасляной кислот в ряду штаммов (R=0,492; 0,474; 0,600; 0,469 соответственно), однако она не всегда была достоверной. 3.3.1. Трансформация ряда субстратов Пропиональдоксим пропиональдоксима (R. ruber gt1, и пропионитрил. бактериальной Rhodococcus sp. A0) Проведена биомассой и трансформация нитрилутилизирующих пропиональдоксимутилизирующих 63 (Pseudomonas sp. 6-1 и 6-5) штаммов (Рисунок 15). Скорость реакции оценивали по убыванию альдоксима в мкмоль на мг сухого веса клеток за час. Показано, что к 30 минуте реакции в среде остается менее 30% количества внесенного субстрата для всех штаммов. Дальнейшее уменьшение альдоксима проходило медленно, но к 5-7 ч он полностью удалялся из среды. мкмоль 50 40 А0 gt1 6_1 6_5 30 20 10 0 0 2 4 6 8 ч Рисунок 15. Динамика трансформации пропиональдоксима биомассой бактерий R. ruber gt1 (2 мг), Rhodococcus sp. A0 (3,75 мг), Pseudomonas sp. 6-1 (6 мг) и 6-5 (4,5 мг). Несмотря на то, что штаммы Pseudomonas sp. 6-1 и 6-5 выделены на альдоксиме, скорость его трансформации этими штаммами была существенно ниже (6,8 и 10,6 ЕД), чем биомассой бактерий – суперпродуцентов нитрилгидратазы R. ruber gt1, Rhodococcus sp. A0 (43,2 и 19,2 ЕД). Необходимо отметить, что в процессе трансформации пропиональдоксима биомассой штаммов Pseudomonas sp. 6-1 и 6-5 в анализируемом супернатанте не было обнаружено продуктов реакции – пропионитрила и пропионовой кислоты. Этот факт может быть объяснен либо внутриклеточным накоплением этого субстрата, либо наличием другого метаболического пути, промежуточные продукты которого не детектируются используемым аналитическим методом. У грамположительных бактерий трансформация пропиональдоксима проходила с образованием 64 соответствующего нитрила, амида и кислоты, что обусловлено работой ферментов альдоксим-нитрильного метаболического пути. Пример суточной конверсии пропиональдоксима биомассой штамма R. ruber gt1 представлен на Рисунке 16. Активность альдоксимдегидратазы в среднем составила 0,1-0,3 ЕД (мкмоль пропионитрила на мг сухого веса клеток в минуту). мкмоль 60 пропиональдоксим пропионитрил 50 пропионамид 40 пропионовая кислота 30 20 10 0 0 Рисунок 5 16. 10 Конверсия 15 пропиональдоксима 20 25 ч клетками штамма R. ruber gt1. Конверсию пропионитрила (500 мкмоль) проводили при 30С биомассой клеток штамма R. ruber gt1 (3,25 мг сух. веса) в течение 1 часа. К 10 минутам количество пропионитрила в реакционной среде резко сократилось и составило только 10% от количества вносимого субстрата. Дальнейшее убывание субстрата происходило медленно и завершилось к 50-ти мин. Нарастание продукта – пропионамида происходило в течение всего времени и к концу реакции составило 400 мкмоль. Также в супернатанте обнаруживалась пропионовая кислота, количество которой к 60-ти мин составило 50 мкмоль (Рисунок 17). Показано, что нитрилгидратазная активность составила 50-55 ЕД. 65 мкмоль 600 пропионитрил пропионамид пропионовая кислота 500 400 300 200 100 0 0 10 20 30 40 50 60 70 мин Рисунок 17. Динамика трансформации пропионитрила клетками штамма R. ruber gt1. Акрилонитрил. При изучении скорости гидролиза акрилонитрила почвенными штаммами R. ruber gt1, Rhodococcus sp. A0, R. erythropolis К10(Б), К10(О) в двух температурных режимах (25 и 50С) установлено, что акрилонитрил лучше гидратировался нитрилгидратазами первых двух штаммов, при этом наблюдалась более высокая скорость трансформации субстрата при 50С (у R. ruber gt1 – более чем в 3 раза). Необходимо отметить, что образовавшийся амид практически не конвертировался в акриловую кислоту, т.к. амидазная активность этих штаммов приближалась к нулю (Таблица 7). Активность нитрилгидратазы штаммов R. erythropolis К10(Б) и К10(О) регистрировалась на очень низком уровне и не превышала 1,5 ЕД при 25С, при 50С она еще снижалась. В то же время данные штаммы проявляли амидазную активность более 3 ЕД при 25С, которая увеличивалась при повышении температуры. 66 Та блица 7 Конверсия акрилонитрила и акриламида почвенными штаммами Rhodococcus Штамм акриламид, акриловая кислота мкмоль/мг/мин мкмоль/мг/мин 25С 50С 25С 50С R. ruber gt1 111,9 380,6 0,0519 0,0870 Rhodococcus sp. A0 276,5 338,8 0,0116 0,0835 R. erythropolis К10(Б) 1,1136 0,4181 3,8234 7,6073 R. erythropolis К10(О) 0,2392 0,0234 3,4417 11,328 Показано, что активность нитрилгидратаз 4-х штаммов Rhodococcus различным образом изменяется во времени в зависимости от температуры реакционной среды (Рисунок 18). А ЕД Б ЕД 1000 276,5 225,7 380,6 338,8 1000 193,1 190,1 210,6 182,5 100 100 gt1 96,4 101,3 111,9 gt1 10 A0 A0 10 К10(Б) 96,8 К10(Б) 1 К10(О) К10(О) 1 0,1 0,1 0,01 0 10 20 30 40 50 60 мин 0 10 20 30 40 50 60 мин Рисунок 18. Активность нитрилгидратаз штаммов R. ruber gt1, Rhodococcus sp. A0, R. erythropolis К10(Б), К10(О) по акрилонитрилу в течении 60 мин при 25С (А) и 50С (Б). Так, нитрилгидратазы всех штаммов родококков стабильно работали при 25С в течение всего периода исследования, а при 50С активность снижалась 67 уже после 10 мин реакции. Активность амидаз при 50С была высокой при 10минутной реакции, однако через полчаса она резко падала. При 25С тенденция к снижению по времени сохранялась. Хотя к 60-ти минутам активность клеток штамма R. ruber gt1, Rhodococcus sp. А0 при 50С оставалась высокой, накопление акриламида после 30 мин реакции было незначительное. Количество продукта при конверсии акрилонитрила биомассой R. ruber gt1 (0,15 мг) при 25С составило 678,9 мкмоль, а при 50С – 535,5 мкмоль, биомассой Rhodococcus sp. А0 (0,2 мг) – 780,5 и 810,0 мкмоль соответственно (Рисунок 19). Учитывая, что к окончанию реакции при 25С происходило нарастание продукта, в последующих экспериментах были увеличены время конверсии и биомасса штаммов. А Б мкмоль 1000 мкмоль 1000 1 800 600 2 800 2 600 1 400 400 200 200 0 0 0 10 20 30 40 50 60 70 мин 0 10 20 30 40 50 60 70 мин Рисунок 19. Динамика образования акриламида при 25С (1) и 50С (2) штаммами R. ruber gt 1 (А) и Rhodococcus sp. А0 (Б). При 24-часовом гидролизе акрилонитрила с дробным добавлением субстрата с использованием катализаторов R. ruber gt1 (80 мг) и Rhodococcus sp. A0 (70 мг) был получен 37,3 и 40,1% раствор акриламида (в 50 мл среды). Основное количество продукта было накоплено к 9 ч реакции. При этом в обоих случаях активность нитрилгидратаз, измеренная спектрофотометрически, в течение трех часов держалась на высоком уровне (228,41 ЕД для R. ruber gt1 и 212,13 ЕД для Rhodococcus sp. A0), а затем снижалась и составила менее 10% от исходной активности (2,86 и 1,96 ЕД соответственно), что возможно связано с 68 токсическим действием накопившегося акриламида, нельзя исключить и влияние акрилонитрила. Акриловая кислота не обнаруживалась (Рисунок 20). мкмоль 350000 300000 250000 200000 акриламид 150000 акрилонитрил 100000 акриловая кислота 50000 0 0 5 10 15 20 25 ч Рисунок 20. Динамика трансформации акрилонитрила клетками Rhodococcus sp. А0 при дробном добавлении субстрата (20000 мкмоль). 3-цианопиридин*. По отношению к удельной активности нитрилгидратазы при конверсии акрилонитрила, принятой за 100%, относительная ферментативная активность по 3-цианопиридину составила для штамма R. ruber gt1 15,5%, для Rhodococcus sp. A0 – 11,3%. Динамика ферментативной активности клеток обоих штаммов при конверсии 3-цианопиридина была аналогичной. Количество образованного за 60 мин никотинамида штаммом R. ruber gt1 при 30С составило 115,7 мкмоль, при 50С – 169,6 мкмоль, штаммом Rhodococcus sp. A0 – 148,7 и 187,1 мкмоль соответственно. При суточной конверсии нитрила клетками концентрация никотинамида к концу эксперимента R. ruber gt1 (39,0 мг) достигла 3,9%. Биомасса штамма Rhodococcus sp. А0 (39,8 мг) трансформировала 3-цианопиридин в никотинамид, концентрация которого в растворе составила 4,2%. Однако нарастание количества продукта не прекратилось и к 24 ч эксперимента, хотя темп прироста никотинамида существенно снизился (Рисунок 21). Никотиновая кислота определялась в следовых количествах. * Данные получены в соавторстве с м.н.с. ЛММБ УрО РАН Васильевым Д.М. и опубликованы в статье Максимова А.В. Гидролиз акрилонитрила и 3-цианопиридина клетками бактерий рода Rhodococcus / А.В. Максимова, Д.М. Васильев, М.В. Кузнецова, В.А. Демаков // Вестник Воронежского государственного университета. – 2012. – С. 111-115. 69 мкмоль 90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 никотинамид 3-цианопиридин никотиновая кислота 0 5 10 15 20 25 ч Рисунок 21. Динамика трансформации 3-цианопиридина клетками Rhodococcus sp. А0 при дробном добавлении субстрата (10000 мкмоль). В то же время нужно отметить, что обнаружено значительное накопление никотинамида в клетках обоих штаммов. Отработанную биомассу центрифугировали, 2-х кратно отмывали фосфатным буфером, разрушали ультразвуком, центрифугировали и супернатант использовали для анализа продуктов реакции. Клетки штамма Rhodococcus sp. А0 депонировали 8,03 ммоль никотинамида, штамма R. ruber gt1 – 28,02 ммоль, что составило 10,1 и 8,9% от количества продукта в реакционной среде. Скорость гидратации акрилонитрила и 3-цианопиридина клетками двух штаммов родококков сопоставима с таковой у штаммов R. rhodochrous J1 и M33, используемых в промышленном производстве никотинамида (Asano, 1991; Рогачева и др., 2001). Дробное добавление субстратов обеспечивало длительную работу ферментов, в результате чего было образовано большее количество акриламида и никотинамида без накопления побочных продуктов. Таким образом, сравнительный анализ почвенных штаммов естественной среды и антропогенноизмененных показал, что последние обладают большей деструктивной активностью в отношении производных карбоновых кислот, а также являются источником промышленно значимых штаммов. 70 ГЛАВА 4. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АЛЬДОКСИМДЕГИДРАТАЗЫ И НИТРИЛГИДРАТАЗЫ 4.1. Детекция генов, кодирующих ферменты альдоксим-нитрильного метаболизма В анализе использовали 99 штаммов бактерий, в том числе 47 – выделены на ацетальдоксиме, 52 – на ацето- и изобутиронитриле. На матрице ДНК 13 штаммов грамположительных бактерий (11 – R. erythropolis, 1 – R. rhodochrous К17Р, 1 – Rhodococcus sp. П-3) амплифицированы фрагменты ДНК с праймерами RhOxd1/2 размером около 1069 п.н. У 7 штаммов грамотрицательных бактерий (6 – Variovorax spp; 1 – P. fluorescens 3220) с праймерами PsOxd1/2 детектированы фрагменты, соответствующие по размеру гену альдоксимдегидратазы (1058 п.н.) (Oinuma et al., 2003) (Рисунок 21). У альдоксимутилизирующих штаммов Rhodococcus sp. ПО27, ПО29, НО34, НО35 и Р46 были амплифицированы гены, кодирующие ферменты гидролиза нитрилов: α- и β-субъединицы железосодержащей нитрилгидратазы и амидазу (Рисунок 22). У штамма ПО28 детектированы только гены субъединиц нитрилгидратазы. У трех грамотрицательных штаммов этой группы присутствовали фрагменты ДНК, соответствующие по размеру генам нитрилазы Acidovorax facilis 72W (штамм НО25) и Alcaligenes faecalis JM3 (штаммы НС1 и НС2). Среди 52 нитрилутилизирующих культур нитрилгидратазной и амидазной системой трансформации обладали по 21 штамму, а нитрилазной – 22. Нужно подчеркнуть, что у большинства изученных штаммов детектировали несколько генов комплекса ферментов гидролиза нитрилов: нитрилгидратазу/амидазу и/или нитрилазу. В ряде случаев детектировали только один из генов, ответственных за синтез гидролитических ферментов (Таблица 8). Среди 32 альдоксимутилизирующих и 10 нитрилутилизирующих штаммов амплификация не прошла ни с одной парой праймеров. 71 М Р17 Р18 НО19 НС20 НС21 НО22 НО23 НО24 НО25 НО26 Р46 П-3 П11-2 П4-1-3 Б4-1 Б20-8 Б5-5 Б2-4 К17(Р) Б4-3 ДО-1-1с Б5-2 М Б4-4 А Б Р46 Р45 Р44 Р43 НО35 НО34 С1-32 ПО29 ПО28 С1-5 Р46 Р45 Р44 Р43 НО35 НО34 С1-32 ПО29 ПО28 ПО27 НС15 М С1-5 железосодержащей нитрилгидратазы ПО27 β-субъединицы (nhb) железосодержащей нитрилгидратазы НС15 α-субъединицы (nha) Б20-8 П5 ДО-1-1с Б5-5 Б4-1 Б2-4 Б4-4 К17(Р) М П-3 Р46 НО35 НО34 ПО29 ПО27 В НО25 НС2 НС1 С3220 М Г Рисунок 22. Примеры электрофореза ПЦР-продуктов, соответствующих генам альдоксимдегидратаз (А), нитрилгидратаз (Б), амидаз (В), нитрилаз (Г) почвенных бактерий. 72 нитрилутилизирующие Таблица 8 Распределение генов, кодирующих ферменты метаболизма нитрилов, у некоторых штаммов изучаемой коллекции Культура Гены, кодирующие ферменты, участвующие в метаболизме нитрилов nhc Fe/ nha Fe/ ami nit oxd nhc Co nhb Fe Acidovorax sр. К13(13) + Acidovorax sp. К13(24) Acidovorax sp. Б5-3 + Aureobacterium sp. Б20-5 + Azomonas sp. К12(Б) + Azotobacter sр. К12(Ч) + Azomonas sp. К15-6 + + Azomonas sp. Б5-7 + Citreobacterium sр. Б20-6 + Microbacterium sp. Б2-1 Microbacterium sp. Б2-2 Microbacterium sp. Б4-5 Microbacterium sp. Б5-1 Nocardia sp. К10(Р) /+ Pseudomonas sp. + К10(Ж2) Pseudomonas sp. Б2-3 + Pseudomonas sp. Б2-6 Pseudomonas sр. Б5-6 + Pseudomonas sр. Б5-8 Pseudomonas sр. Б5-9 + Pseudomonas sр. Б20-1 Pseudomonas sр. Б20-2 + Pseudomonas sр. C3220 + + + P. fluorescens К17(Ж) Rhodococcus sр. П-3 + + + Rhodococcus sр. П1а + Rhodococcus sр. П5 + R. erythropolis Б2-4 + +/+ + + R. erythropolis К10(О) + + R. erythropolis К10(ОМ) + +/+ + + R. rhodochrous К10(Ж2)р + -/+ + R. rhodochrous К17(Р) + +/+ + + + 73 альдоксимутилизирующие нитрилутилизирующие Культура R. luteus К10(Ж1) R. erythropolis Б5-2 R. erythropolis К10(Б) R. erythropolis Б5-4 R. erythropolis Б4-1 R. erythropolis Б4-3 R. erythropolis Б4-4 R. erythropolis Б20-3 R. erythropolis Б20-4 R. erythropolis Б20-8 R. erythropolis ДО-1-1с R. erythropolis 84 R. erythropolis П6-2-1 R. erythropolis П11-1-3 R. erythropolis П4-1-3 R. erythropolis П11-8 R. erythropolis П11-8-5 R. erythropolis П11-2 R. erythropolis Б5-5 R. ruber gt1 Burkholderia sр. НО25 Pseudomonas sр. НС1 Pseudomonas sр. НС2 Rhodococcus sр. ПО27 Rhodococcus sр. ПО28 Rhodococcus sр. ПО29 Rhodococcus sр. НО34 Rhodococcus sр. НО35 R. erythropolis Р46 Variovorax sp.Р17 Variovorax sp. Р18 Variovorax sp. НС20 Variovorax sp. НС21 Variovorax sp. НО23 Variovorax sp. НО26 Продолжение таблицы 8 Гены, кодирующие ферменты, участвующие в метаболизме нитрилов nhc Fe/ nha Fe/ ami nit oxd nhc Co nhb Fe + + +/+ + + + + + + +/+ + + +/+ + + + + +/+ + + + + + + + +/+ -/+ + + +/+ + + + + + + + + + + /+ + +/+ + + + + + + +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 74 Таким образом, распределение генов альдоксимдегидратаз и нитрилгидратаз у бактерий не зависело от субстрата, на котором они были выделены (р˃0,05 по F-тесту). В то же время нитрилазы чаще встречались у прокариот, выделенных на нитрилах (р˂0,05) (Таблица 9). Таблица 9 Встречаемость генов альдоксим-нитрильного кластера Ген Альдоксимутилизирующие Нитрилутилизирующие штаммы штаммы Гр+ % (n=12) Гр- % (n=35) oxd 1 8,3 6 nhc 6 50,0 ami 5 41,7 nit - Гр+ % (n=35) 34,3 1 - 21 60,0 - - 18 51,4 3 11 31,4 11 8,6 % (n=17) 12 3 17,1 Гр- Всего Гр+ Гр- % (n=47) 5,9 % (n=52) 13 27,7 7 13,5 27 57,4 - 17,6 23 48,9 3 5,8 64,7 11 23,4 14 26,9 Примечание: Гр+ – грамположительные, Гр- – грамотрицательные штаммы. К настоящему времени изучены десятки ферментов из различных видов бактерий, но и сегодня Rhodococcus и другие актиномицеты являются наиболее распространенными источниками новых нитрилгидратаз. Поскольку среди oxd/nha/nhb положительных штаммов более половины составили родококки (≈65%), они были использованы в дальнейшем исследовании. 4.2. Характеристика альдоксимдегидратаз штаммов Rhodococcus Секвенированы фрагменты ДНК трех штаммов R. rhodochrous К17(Р) (GО1), R. erythropolis 2-4 (ЕО1) и 4-1 (НО1) (Рисунок 23). При помощи BLASTанализа установлено, что они совпадают с известными последовательностями генов альдоксимдегидратаз R. erythropolis (GenВank AB094201) и Rhodococcus globerulus (GenВank AB105912). Идентичность нуклеотидных последовательностей oxd штаммов R. rhodochrous К17(Р), R. erythropolis 2-4 и 4-1 составила 97-98%. 75 Рисунок 23. Фрагмент нуклеотидных последовательностей oxd почвенных изолятов: E01– R. erythropolis 2-4; G01 – R. rhodochrous К17(Р) H01– R. erythropolis 4-1 Выявленные аминокислотные замены расположены вне консервативных областей альдоксимдегидратаз из разных бактериальных культур (Таблица 10). Замена Arg 61 Gln, обнаруженная у двух штаммов родококков, встречается и у других бактерий, в том числе Rhodococcus sp. N-771 и P. chlororaphis B23. Аминокислотный остаток Ala-110 описан у Bacillus sp. OxB-1 (Kato et al., 2004). 76 Таблица 10 Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей фрагментов oxd R. rhodochrous К17Р, R. erythropolis 2-4 и 4-1 Штамм Размер секвенированного Сходство нуклеотидных фрагмента, п.н. последовательностей с (расположение на гене oxd R. globerulus А-4, % R. globerulus А-4) 2-4 674 с 63 по 736 94 4-1 694 с 56 по 749 95 К17Р 690 с 60 по 749 96 Аминокислотные замены Arg 61 Gln Thr 110 Ala Arg 61 Gln Thr 110 Ala Ser 191 Arg - Таким образом, установлено, что только 20,2% штаммов бактерий содержат гены альдоксимдегидратаз, последовательностей, детектируемые кодирующих совместно ферменты с гидролиза комплексом нитрилов: нитрилгидратазу/амидазу и/или нитрилазу. Однако у большинства штаммов, способных к метаболизму нитрилов, гены альдоксимдегидратаз не детектировались. Вероятно, это связано с тем, что происхождение ферментных систем метаболизма нитрилов у бактерий связано не только с формированием нитрильных производных эндогенно из аминокислот посредством фермента альдоксимдегидратазы (Kato et al., 2000), но и с выделением нитрилов в среду в составе метаболитов растений (Banerjee et al., 2002). 4.3. Характеристика нитрилгидратаз штаммов Rhodococcus Были секвенированы гены, кодирующие α- и β-субъединицы содержащей нитрилгидратазы штаммов Rhodococcus, изолированных Feиз географически различных почвенных сред. Размер прочитанных фрагментов αсубъединиц варьировал от 302 п.н. у штамма Rhodococcus sp. 84 до 630 п.н. у штамма Rhodococcus sp. ПО28, тогда как длина целого гена α-субъединицы составляет 624 п.н. (Таблица 11). Все фрагменты имели высокое сходство с последовательностями нитрилгидратаз из базы данных GenBank (от 87 до 99%). Чаще всего такое сходство обнаруживалось с генами штаммов R. erythropolis 77 CCM2595 (JQ023030.1) и R. erythropolis DCM13002 (AY223836). Также полученные прочтения оказались гомологичными генам железосодержащей нитрилгидратазы референтного штамма Rhodococcus sp. N-774 (от 84 до 96% гомологии). Таблица 11 Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов генов nha (А) и nhb (Б) А Штамм 9-32 9-33 9-37 9-38 9-60 9-83 84 I-г II-г Б20-4 9-43’ 9-63 3213 НО34 НО35 П1 9-43 2 Б5-2 ПО29 Б2-4 Б4-1 Б4-3 ПО28 Б4-4 К17р ПО27 Р46 Размер Максимально идентичный штамм, % секвенированномер в GenBank сходства ного фрагмента, п.н. 415 98 369 99 417 95 533 96 R. erythropolis CCM2595, 436 96 JQ023030.1 315 99 302 87 619 99 620 99 586 99 427 96 612 99 617 99 R. erythropolis DCM13002, AY223836 506 99 529 99 628 99 402 R. erythropolis, EU130914.1 97 613 99 R. erythropolis IND-AN014, AY223828.1 624 99 612 R. erythropolis А-4, АМ946017.1 99 340 97 625 99 R. erythropolis ENG-AN033, AY223832.1 625 99 630 98 614 99 R. erythropolis ARG-AN025, 617 99 AY223831.1 622 99 513 Rhodococcus sp. NN12, 95 GU461712.1 Сходство с nha (Rhodococcus sp. N-774), % 94 95 92 92 92 95 84 96 96 95 93 95 96 95 96 96 93 95 95 95 92 96 96 94 94 95 95 90 78 Продолжение таблицы 11 Б Штамм 9-33 9-37 9-38 9-43’ 9-60 9-61 84 3213 I-г II-г Б20-4 НО34 НО35 П1 П3 2 Б4-4 K17Р ПО27 ПО29 Б2-4 Б4-1 Б4-3 ПО28 Б5-2 9-81 Размер Максимально идентичный штамм, % секвенированномер в GenBank сходства ного фрагмента, п.н. 640 99 624 99 585 99 622 99 564 97 532 99 569 99 R. erythropolis CCM2595, 641 99 JQ023030.1 637 99 625 99 389 98 525 94 464 96 637 99 625 99 614 99 634 99 R. erythropolis ARG-AN025, 563 98 AY223831.1 586 98 586 97 470 99 519 98 R. erythropolis ENG-AN033, AY223832.1 524 95 517 96 464 R. erythropolis, AM946017.1 97 525 R. erythropolis 122-AN065, 99 AY223826.1 Сходство с nhb (Rhodococcus sp. N-774), % 92 91 92 92 89 91 92 92 92 92 91 86 88 92 92 95 96 94 94 93 96 95 92 93 94 97 Длина β-субъединицы у представителей рода Rhodococcus составляет 639 п.н. Секвенированные фрагменты этого гена находились в пределах от 389 п.н у штамма R. erythropolis Б20-4 до 641 п.н. у Rhodococcus sp. 3213. Максимально идентичными (от 94 до 99%) по этой субъединице оказались штаммы R. erythropolis CCM2595 (JQ023030.1), R. erythropolis ARG-AN025 (AY223831.1) и R. erythropolis ENG-AN033 (AY223832.1). Гомология с последовательностью штамма N-774 составила от 86 до 97%. При переводе последовательности нуклеотидов в последовательность аминокислот с помощью программы BLASTX оказалось, что и на этом уровне гомология исследуемых ферментов с известными ранее была очень высокой: 89- 79 для 99% α-субъединицы аминокислотные и 87-99% последовательности для β-субъединицы. почвенных изолятов Полученные содержали как характерные для рода Rhodococcus, так и уникальные замены аминокислотных остатков (Таблица 12). Последовательность α-субъединицы характеризуется большей консервативностью, чем β-субъединицы. Здесь располагается CSLCSC-мотив, кодирующий активный центр фермента. Данный мотив идентичен у всех известных на сегодня нитрилгидратаз (Marron, 2012). Таблица 12 Аминокислотные замены в первичной структуре α- (А) и β-субъединиц (Б) нитрилгидратазы А Аминокислотные Штамм Размер фрагмента замены (по отношению к (а.о.) Rhodococcus sp. N-774) 2 182 I156V, I201V 9-33 121 I156V, I201V 9-37 137 I156V 9-38 176 E69D, I156V, I190V, I201V 9-43’ 141 E69D, I201V 9-60 118 E69D, I156D, I201V 3213 206 F48L, E69D, I156V, I201V I-г 205 E69D, I156V, I201V II-г 205 E69D, I156V, I190V, I201V Б4-1 207 I156V, I201V Б4-3 207 I156V, I201V Б4-4 203 E69D, Y85S, I156V, I201V Б5-2 207 P125H, I156V, I201V Б20-4 195 E69D, I156V, Q184R К17р 205 E69D, I156V, I201V НО34 168 E69D, I156V, I201V НО35 167 E69D, I156V, I201V П1 207 E69D, I156V, I201V ПО27 206 E69D, I156V, I201V ПО28 206 E49Q, I156V, I201V ПО29 204 E69D, I156V, I201V 80 Продолжение таблицы 12 Б Штамм Размер Аминокислотные фрагмента замены (по отношению (а.о.) к Rhodococcus sp. N-774) 2 202 D93E, V125I, T158S 9-33 212 9-37 206 9-38 193 9-43’ 206 9-60 175 3213 212 I-г 211 II-г 197 Б4-1 173 T82A, D93E, P117R, E119D, S154A, K183T T82A, D93E, P117R, E119D, S154A, K183T T82A, D93E, P117R, E119D, S154A T82A, D93E, P117R, E119D, S154A, K183T, T82A, D93E, P117R, E119D, S154A, K183T T82A, D93E, P117R, E119D, S154A, K183T T82A, D93E, P117R, V118I, E119D, S154A, K183T T82A, D93E, P117R, V118I, E119D, S154A, K183T V125I, H155R Б4-3 173 Б4-4 209 Б5-2 154 Б20-4 129 К17р 173 НО34 173 НО35 153 П1 211 ПО27 175 ПО28 171 ПО29 175 V125I, S154P, H155G, R156K, T157G, I167V, S198G D93E I78V, K87L, G88T, D93E, V125I, T158S M84K, V85F, D93E, P117R, E119D, S154A D93E, V125I T82A, D93E, P117R, V118I, E119D, R156P, K183T M84K, V85F, D93E, P117R, V118I, E119D, R156P, K183T T82A, D93E, P117R, E119D, S154A, K183T D93E, L98P, V125I, T158S D93E, V125I, R128K, H155S, I167F D93E, V125I, R156P, T158S Примечание: красным цветом обозначены уникальные замены. Последовательность Nha содержит 3 типичных для родококков вариабельных участка: Glu 69A/Asp 69A, Val 156A/Ile 156A и Val 201A/Ile 201A. Обнаружены уникальные замены, которые не представлены в базе данных GenBank: Tyr 85 Ser у штамма Б4-4, Phe 48 Leu – 3213, Glu 49 Gln – ПО28, Pro 125 His – Б5-2, Ile 190 Val у штаммов II-г и 38. 81 Nhb характеризуется наличием 9 вариабельных участков: Thr 82B/Ala 82B, Glu 93B/Asp 93B, Pro 117B/Arg 117B, Glu 119B/Asp 119B, Val 125B/Ile 125B, Ser 154B/Ala 154B, Ser 158B/Thr 158B, Lys 183B/Thr 183B и Ala 185B/Asp 185B. Уникальные замены: Ile 78 Val у штамма Б5-2, Met 84 Lys и Val 85 Phe у штаммов Б20-4 и НО35, Leu 98 Pro – ПО27, Arg 128 Lys – ПО28, His 155 Arg – Б4-1, Ile 167 Val – Б4-3, Ile 167 Phe – ПО28, Ser 198 Gly – Б4-3. При сравнении встречаемости аминокислотных замен среди штаммов, выделенных из природных и антропогенно-измененных почв, статистическизначимой разницы не выявлено (р=0,717 по F-тесту). Однако, чаще замены встречались среди штаммов, выделенных из загрязненных почвенных образцов (66,7% для α-субъединицы и 70,0% для β-субъединицы). Несмотря на высокую гомологию первичной структуры нитрилгидратаз родококков их активность и субстратная специфичность может существенно отличаться (Brandao et al., 2003). При этом аминокислотные замены могут быть локализованы не в активном центре, а в соседних регионах. Так, Nakasako с соавт. (1999) показали, что штамм Rhodococcus sp. ACV2 содержит единичную замену (Val 40 Met), расположенную на участке β-субъединицы, формирующем входной канал к активному центру фермента. Активность такой мутантной нитрилгидратазы отличалась от активности фермента дикого типа по оптимуму рН и скорости гидролиза циановалерамида и циановалериановой кислоты в 30 и 15 раз соответственно (Nakasako, 1999). Аминокислотная последовательность штамма R. erythropolis DSM 43066, выведенная из нуклеотидной, содержит несколько уникальных для нитрилгидратаз R. erythropolis аминокислотных остатков как в α-, так и в β-субъединицах (Brandao et al., 2003). Особый интерес вызывает Pro71 (пролин) на β-субъединице, поскольку он соседствует с двумя высококонсервативными остатками тирозина (Tyr72 и Tyr73). Эти 2 аминокислотных остатка окружают структуру активного центра фермента при гидратировании молекулами воды. Нарушение этого положения может быть ответственно за «нефункциональность» фермента. Другое объяснение более низкой ферментативной активности штамма R. erythropolis DSM 43066 связывают 82 со слабым взаимодействием между α- и β-субъединицами, причиной которого является замена рядом с Tyr72В. Тирозин участвует в связывании двух субъединиц в стабильный αβ-комплекс (Nakasako, 1999). Piersma et al. (2000) путем сайт-направленного мутагенеза (Arg56B) у штамма Rhodococcus sp. N-771 обнаружили, что мутантный фермент оказался с ограниченной стабильностью и с низкой или даже отсутствующей активностью по сравнению со штаммом дикого типа. Данная аминокислота является консервативной для большинства известных нитрилгидратаз. Она необходима для каталитической активности, поскольку вовлечена не только в связывание субстрата, но также взаимодействует с железом в активном центре (Piersma et al., 2000). Во всех известных α-субъединицах нитрилгидратаз в положении 90 находится глутамин, который отвечает за формирование водородной оболочки вокруг каталитического центра. При замене глутамина на глутаминовую кислоту или аспарагин каталитическая активность нитрилгидратазы снижается на 25% и 5% по сравнению с диким типом соответственно (Takarada et al., 2006). Учитывая, что при молекулярном скрининге α- и β-субъединиц нитрилгидратазы были обнаружены уникальные аминокислотные замены, представлялось интересным установить степень их консервативности и радикальности. Консервативной заменой аминокислоты называется мутация, не приводящая к значительным изменениям структуры и функции белка. В процессе эволюции консервативные замены аминокислот происходят чаще, чем радикальные. Эти замены преимущественно встречаются в функционально важных участках белковой молекулы (например, сайтах связывания лигандов). Радикальные замены аминокислот, напротив, существенно меняют структуру и функции белка (Бутвиловский, Черноус, 2008). Характер аминокислотных замен определяли по коэффициенту П. Снита (φ, Sneath, 1966), показателю М. Волькенштейна (ΔН, Волькенштейн, 1978), показателю А. Бачинского (ФБА, Бачинский, 1976), физико-химической дистанции Р. Грэнтсема (GD, Grantham, 1974) и ее модифицированным значениям (GDM). 83 Метод Снита был предложен в 1966 г. В его основе лежит анализ всех доступных для того времени физико-химических свойств аминокислот: наличие/отсутствие –ОН групп, растворимость L-изомеров, наличие бензольного кольца, свободные электроны и т.д. Поскольку достаточно сложно установить степень влияния каждого эффекта на активность белка, априори был принят равный вклад каждого эффекта в изменение биологической активности. Одним из свойств, определяющих конформацию белка, является гидрофобность составляющих его аминокислот. В 1970-е гг. Волькенштейн показал, что наиболее многочисленны и предпочтительны замены с минимальными изменениями гидрофобности аминокислотного остатка. Для оценки степени взаимозаменяемости одной аминокислоты на другую в 1976 году А. Бачинский предложил показатель «функциональной близости аминокислот» (ФБА). Под ФБА подразумевается способность аминокислот заменять друг друга в белках с полным или частичным сохранением их активности. Величины ФБА были получены на основе анализа числа замен аминокислот в 28 семействах изофункциональных белков. Согласно представлениям Грэнтсема частота аминокислотных замен зависит от физико-химических свойств их боковых радикалов. Он предложил формулу расчета физико-химической дистанции, которая учитывает три параметра аминокислотных остатков: полярность, объем и состав. Для удобства анализа М. Джонсон предложил использовать относительные (модифицированные) значения физико-химической дистанции. Аминокислотная замена считается консервативной при φ ˃ 0,416, ΔН < 1,28 ккал/моль, ФБА ˃12,4, GD < 100 и GDM ˃ 57,9. В 2004 г. Х. Танг предложил новый метод определения характера аминокислотной замены – вычисление универсального эволюционного индекса (U) (Tang, 2004). Он был разработан на основании анализа белок-кодирующих участков 4383-х генов, т.е. универсальный эволюционный индекс является эмпирической системой классификации аминокислотных замен по степени их эволюционной изменчивости. Чем больше значение U, тем чаще происходят 84 взаимные замены аминокислот данной пары (индекс варьирует в пределах от 0,241 до 2,49) (Бутвиловский, Черноус, 2008). При анализе уникальных аминокислотных замен, обнаруженных среди штаммов рода Rhodococcus, оказалось, что большинство из них являются консервативными. Замены Pro 125 His, Met 84 Lys, Val 85 Phe, Leu 98 Pro, His 155 Arg определяются как радикальные по двум показателям из пяти, а замена Ile 167 Phe – только по показателю функциональной близости аминокислот Бачинского (Таблица 13). Таблица 13 Определение характера уникальных аминокислотных замен в белоккодирующей последовательности нитрилгидратазы Аминокислотные замены φ ΔН α-субъединица F 48 L Phe 48 Leu 0,570 0,23 E 49 Q Glu 49 Gln 0,685 0,45 Y 85 S Tyr 85 Ser 0,354 2,83 P 125 H Pro 125 His 0,172 1,20 I 190 V Ile 190 Val 0,843 1,28 β-субъединица I 78 V Ile 78 Val 0,843 1,28 M 84 K Met 84 Lys 0,482 0,20 V 85 F Val 85 Phe 0,380 0,96 L 98 P Leu 98 Pro 0,432 0,18 R 128 K Arg 128 Lys 0,733 0,77 H 155 R His 155 Arg 0,396 0,67 R 156 K Arg 156 Pro 0,733 0,77 I 167 V Ile 167 Val 0,843 1,28 I 167 F Ile 167 Phe 0,487 0,32 S 198 G Ser 198 Gly 0,323 0,04 Примечание: φ – коэффициент Снита, Показатели ФБА GD 16 25 7 3 35 22 29 144 70 29 GDM U 86 86 59 64 86 0,732 1,634 0,503 0,784 2,415 35 29 86 2,415 5 95 54 0,559 8 50 77 0,548 4 98 54 0,388 25 26 86 1,583 7 29 86 0,784 25 26 86 1,583 35 29 86 2,415 10 21 86 0,545 25 56 73 1,360 ΔН – показатель Волькенштейна, ФБА – показатель Бачинского, GD – физико-химическая дистанция Грэнтсема, GDM – относительная физико-химическая дистанция Грэнтсема, U – универсальный эволюционный индекс Танга. Красным цветом обозначены радикальные замены аминокислот. 85 Обнаруженная у штамма R. erythropolis Б4-4 мутация в 254 положении αсубъединицы нитрилгидратазы является трансверсией (С→А) и наблюдается во втором положении кодона (ТАС→ТСС) (Рисунок 24). Данная замена несинонимична, так как приводит к изменению кодируемой аминокислоты с тирозина на серин в 85 сайте, и определяется как радикальная по всем используемым показателям, за исключением GDM. Универсальный эволюционный индекс Танга U=0,503 отражает редкость такой замены. (1) 61 (2) 141 (1) 121 (2) 201 (1) 181 (2) 261 CTTCGAGGAGGACTTCAGTCCAAGGCGCGGAGCGGAATTGGTCGCGCGGGCTTGGACCGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTTCGAGGAGGACTTCAGTCCAAGGCGCGGAGCGGAATTGGTCGCGCGGGCTTGGACCGA 120 CCCCGATTTCCGGCAACTGCTTCTCACCGACGGTACCGCCGCGGTTGCCCAGTCCGGATA ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||| CCCCGATTTCCGGCAACTGCTTCTCACCGACGGTACCGCCGCGGTTGCCCAGTACGGATA 180 TCTGGGCCCCCAGGGCGAATACATCGTGGCAGTCGAAGACACCCCGACCCTCAAGAACGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCTGGGCCCCCAGGGCGAATACATCGTGGCAGTCGAAGACACCCCGACCCTCAAGAACGT 240 Рисунок 24. Участок выровненной 200 260 320 секвенированной последовательности гена, кодирующего α-субъединицу нитрилгидратазы (1 – полученный сиквенс nha штамма R. erythropolis Б4-4, 2 – участок nha штамма R. erythropolis ARG-AN025, AY223831.1). Таким образом, гены, кодирующие субъединицы нитрилгидратазы, обладают выраженной гомологией с аналогичными генами известных культур родококков. Обнаруженные в исследованных бактериальных штаммах точечные аминокислотные замены расположены вне консервативных областей субъединиц нитрилгидратазы. Радикальная замена Tyr 85 Ser выявлена у штамма, который был выделен из почвы, загрязненной акриламидом. Поскольку ферментативная активность может зависеть от модификации аминокислотной последовательности не только в активном центре и/или регуляторных областях, любой из почвенных изолятов может оказаться перспективным для биотехнологии. 86 ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ МИКРОБНОГО СООБЩЕСТВА ЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ Таксономический состав микробного сообщества почвы является важным показателем ее экологического состояния и функционирования. Изучение микробного разнообразия почвы всегда вызывало большой интерес у исследователей, однако возникает ряд трудностей, связанных в первую очередь с наличием некультивируемых микроорганизмов, а также с подбором универсальной среды, на которой бы росли все группы бактерий. Применение в почвенной экологии методов молекулярного анализа позволило обойти некоторые ограничения традиционных методик, связанных с культивированием бактерий (Fierer et al., 2005). 5.1. Микробиота почв с разной антропогенной нагрузкой Методом ПЦР РВ оценивали содержание общего микробного и грибного пула естественных и антропогенно-загрязненных почв с применением праймеров к гену универсальной рРНК (Eubacteria и Fungi) и различных филогенетических групп бактерий: α- и β-Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria, Firmicutes, Количество Bacteroidetes. детектировали с нитрилгидратазы нитрилутилизирующих использованием родококков праймеров (FE-F/R) и к микроорганизмов гену псевдомонад α-субъединицы (nhpA-F/R). Для визуализации ПЦР-продуктов использовали неспецифический краситель SYBR Green I. В этом случае анализировали постамплификационные кривые плавления продуктов (Рисунок 25). Было показано, что каждый образец характеризовался одним пиком, что свидетельствует о специфичности праймеров. Исключение составили образцы, полученные в ходе реакции с праймерами nhpA-F/R, где детектировались два разных по температуре плавления ампликона, что не позволило оценить содержание грамотрицательных нитрилутилизирующих бактерий в почвах методом ПЦР. Эффективность реакции с выбранными праймерами определяли путем построения десятикратных разведений ДНК (Рисунок 26). калибровочных кривых для 87 Рисунок 25. График кривых плавления ПЦР-продуктов, полученных при использовании праймеров к гену универсальной 16S рРНК (Eubacteria). Рисунок 26. Калибровочная кривая, построенная для десятикратных разведений ДНК, выделенной из R. erythropolis 84. Показано, что представителей фил Actinobacteria и β-Proteobacteria было меньше, чем двух других в большей части почв как промышленной, так и естественной среды (Таблица 14). Выявлено, что за исключением β- Proteobacteria, представителей всех фил было больше в почвах естественной среды, по сравнению с почвами с антропогенной нагрузкой. Средние значения содержания этих бактерий в двух группах отличались на порядок, однако разница 88 была статистически незначима (р>0,05 по M-U-тесту). Общее содержание бактерий по ПЦР РВ было выше, чем при высеве почвенной суспензии на плотные питательные среды (р=0,005), а содержание нитрилутилизирующих прокариот – ниже (р=0,014). При сопоставлении данных числа бактерий по двум методам наблюдалась умеренная корреляционная зависимость (r=0,65; р=0,05) (Таблица 15). В то же время, связь отсутствовала между показателями, характеризующими число нитрилутилизирующих микроорганизмов (r=0,21). Данный факт вполне ожидаем вследствие того, что в эту группу входят бактерии не только с нитрилгидратазно-амидазной, но и с другими системами трансформации нитрилов. Таблица 14 Содержание некоторых таксономических групп бактерий в различных почвах по данным ПЦР РВ Антропогенные Естественные Почва Actinobacteriа α-Proteobaсteria β-Proteobaсteria Eubacteria Acidobacteria С2 2,36E+10 3,37E+09 4,34E+09 2,43E+09 2,44E+08 С3 3,29E+09 8,09E+07 1,91E+07 3,28E+07 2,76E+05 С6 8,06E+09 1,48E+09 4,49E+08 4,86E+08 3,82E+07 Риз 1,61E+08 3,24E+07 1,69E+07 5,88E+07 5,56E+07 П25 5,89E+09 2,77E+08 2,32E+07 3,05E+08 4,48E+07 П26 3,90E+10 6,22E+09 5,65E+08 5,44E+09 2,18E+09 П27 3,94E+09 2,40E+08 1,75E+07 1,80E+08 2,10E+08 Флора 2,11E+09 3,24E+08 7,73E+07 9,09E+07 2,13E+07 Грядка 6,86E+09 5,74E+08 1,11E+07 4,60E+08 4,14E+08 РЦ 1,58E+09 1,20E+08 5,84E+07 4,79E+08 8,01E+07 ЭЦ 8,41E+07 2,37E+07 1,61E+07 2,66E+07 6,04E+06 ТГК 9,07E+08 2,55E+08 2,29E+07 5,24E+08 5,44E+07 С1 4,86E+09 7,36E+08 7,41E+07 9,22E+08 9,96E+07 89 Таблица 15 Сравнительная оценка данных культурального метода и ПЦР РВ Почва Гетеротрофы/ Eubacteria С1 2,68E+09 Копий ДНК/ г почвы 4,86E+09 С2 2,17E+10 2,36E+10 6,05E+06 2,24E+07 С3 1,5E+08 3,29E+09 н.о. 1,85E+05 С6 1,15E+09 8,06E+09 4,64E+06 7,30E+05 Риз 8,79E+07 1,61E+08 1,21E+06 4,25E+06 П25 2,67E+06 5,89E+09 1,00E+05 2,04E+05 П26 2,17E+10 3,90E+10 3,64E+07 1,19E+08 П27 3,18E+07 3,94E+10 1,64E+07 9,37E+04 Флора 4,58E+08 2,11E+09 5,40E+07 1,49E+05 Грядка 2,14E+08 6,86E+09 1,85E+07 3,20E+05 РЦ 5,44E+07 1,58E+09 1,06E+07 1,44E+05 ЭЦ 7,43E+07 8,41E+07 1,17E+07 5,93E+04 ТГК 1,43E+08 9,07E+08 7,04E+06 9,97E+04 Естественные КОЕ/г почвы Антропогенные Нитрилутилизирующие КОЕ/г почвы 7,50E+07 Копий ДНК / г почвы* 6,05E+06 Примечание: *– данные получены с использованием праймеров к гену αсубъединицы нитрилгидратазы родококков, н.о. – не определяли. 5.2. Модельный эксперимент по влиянию акрилонитрила на почвенную микрофлору Нитрил акриловой кислоты (акрилонитрил) – мономер, который широко используется для производства полиакрилонитрила, синтетических волокон и каучука, полимеризационных пластмасс и акриламида, применяется в синтезе красителей, лекарственных препаратов, глутаминовой кислоты. Природных источников акрилонитрила не существует. Он может поступать в окружающую среду при производстве, переработке, использовании, транспортировке и захоронении отходов вследствие аварий, сбоев в работе оборудования и несоблюдении технологии и правил работы. Попадая в окружающую среду, акрилонитрил разлагается микроорганизмами различными способами. Многочисленные работы, связанные с выделением активных штаммов-деструкторов 90 из почв, загрязненных нитрилами, не затрагивают изучение динамики микробных сообществ и изменение их состава под воздействием данного вида поллютанта. В связи с этим в условиях лабораторного эксперимента проведена оценка влияния акрилонитрила в концентрациях 20, 200 и 2000 мг/кг на численность и структуру микробного сообщества почвы (Рисунок 27). Рисунок 27. Схема постановки опыта по воздействию акрилонитрила (АкН) на почвенное сообщество. Определение общего количества микроорганизмов во всех изученных образцах бактериологическим методом показало, что число бактерий в контроле несколько снизилось к концу эксперимента (Таблица 15). Вероятно, это связано с тем, что условия in vitro отличались от условий естественной среды, так как используемый нами методологический подход подразумевал работу с «закрытой» системой, когда невозможно контролировать все физические параметры. При этом кислотность почвы, являющаяся важной экологической детерминантой, оказывающей влияние на микробное сообщество, и температурный режим были постоянными (рН 7,0±0,4; температура 22ºС). Содержание аэробных гетеротрофных бактерий во втором сосуде (10 ПДК) во все сроки достоверно не отличалось от контроля, что может свидетельствовать 91 о том, что концентрация акрилонитрила 20 мг/кг не является токсичной для аборигенной микрофлоры, а снижение численности – результат действия посторонних факторов. Внесение нитрила в концентрации 200 мг/кг (100 ПДК) на начальном этапе стимулировало развитие гетеротрофов, однако их количество приблизилось к исходному уже на 10 сутки эксперимента, спустя 2 месяца число гетеротрофов в данной почве снизилось, но было сопоставимо с контрольным сосудом (Таблица 16). Таблица 16 Динамика численности физиологических групп микроорганизмов в модельном опыте загрязнения почвы акрилонитрилом Бактерии, КОЕ/г почвы Длит. Вариант опыта опыта 3 сут. Контроль 7,23×107 1,61×106 2,24×106 9,50×105 1,50×106 10 ПДК 7,13×107 н.о. н.о. н.о. н.о. 100 ПДК 2,18×108 * н.о. н.о. н.о. н.о. 1000 ПДК 5,10×107 н.о. 10 сут. Контроль гетеротрофные грам- грам- аммони- денитри- положительные отрицательные фицирующие фицирующие 2,47×10 7α 7,70×10 н.о. 5 н.о. н.о. 1,17×10 2,00×10 6 1,40×107 α 6 10 ПДК 2,26×107 α 9,36×105 1,84×106 4,50×106 1,40×107 α 100 ПДК 7,18×107 * 5,70×105 7,26×106 *α 1,50×107 *α 1,40×107 α 1000 ПДК 5,90×106 *α 1,80×105 *α 7,50×104 *α 9,50×105 1,50×105 α 2 мес. Контроль 2,10×107 α 2,50×105 α 7,12×105 4,50×107 α 2,50×106 10 ПДК 3,50×107 α 1,68×106 2,50×107 α 9,50×105 100 ПДК 1,19×107 α 3,65×105 α 1,34×106 4,50×106 2,50×106 1000 ПДК 1,48×106 *α 7,40×104*α 7,68×104 *α 4,50×106 4,50×103 α 2,16×105 α Примечание: н.о. – не определяли; * – различия статистически значимы по сравнению с контролем на срок анализа, α – различия статистически значимы по сравнению с началом эксперимента (p<0,05). Акрилонитрил в концентрации 1000 ПДК негативно влиял на бактерии: к концу 3 месяца эксперимента их количество сократилось на 98% от исходного (с 7,81×107 до 1,73×106 КОЕ/г почвы), что статистически значимо отличалось от 92 контроля. Среди гетеротрофных бактерий наибольшим представительством на протяжении всего эксперимента при добавлении 100 ПДК нитрила обладали грамотрицательные бактерии с более коротким временем генерации, для размножения которых определяющим стало повышение влажности почвы при внесении субстрата. К концу 3 месяца соотношение сместилось в сторону грамположительных прокариот (3,61×105 против 9,50×104 КОЕ/г почвы). При концентрации 1000 ПДК, токсичной для обеих групп микроорганизмов, наблюдалось резкое снижение грамотрицательных бактерий (на 10 сутки), менее устойчивых к действию высоких доз поллютанта. Эти данные согласуются с результатами, полученными ранее (Кузнецова и др., 2007), где было показано, что некоторые штаммы грамположительных нитрилутилизирующих бактерий были устойчивы к высоким концентрациям нитрилов и амидов и способны расти при концентрациях акрилонитрила ≤ 1,25 г/л (до 1000 ПДК). В ходе эксперимента также определяли содержание групп микроорганизмов, участвующих в круговороте азота – аммонификаторов, денитрификаторов и азотфиксаторов. Количество аммонифицирующих бактерий возрастало на протяжении всего периода исследования практически во всех вариантах, что может быть объяснено как увеличением белкового пула при гибели части бактерий, так и появлением нового ростового субстрата – амида. На денитрифицирующие бактерии поллютант в концентрациях 10 и 100 ПДК практически не повлиял, тогда как внесение 1000 ПДК акрилонитрила привело к заметному снижению их числа (от 1,5×106 КОЕ/г почвы в начале эксперимента до 4,5×103 КОЕ/г почвы к концу 2 месяца). Самой чувствительной к действию поллютанта оказалась группа азотфиксирующих бактерий. Максимальное снижение численности произошло в сосуде с концентрацией нитрила 1000 ПДК (на 92,5%), менее выраженным оно было при 100 ПДК (на 83%) и при 10 ПДК (на 78,5%). Такое влияние токсиканта вполне закономерно, учитывая, что эта физиологическая группа прокариот используется в качестве биоиндикатора загрязнения окружающей среды (Мынбаева и др., 2011). 93 Особый интерес представляло определение динамики численности бактерий, утилизирующих нитрилы и амиды. Из Рисунка 28 видно, что добавление нитрила в концентрации 10 ПДК привело к увеличению количества нитрилтрансформирующих бактерий, однако спустя месяц их содержание было сопоставимо с контролем. Загрязнение почвы 100 ПДК акрилонитрила достоверно стимулировало развитие популяции микроорганизмов – деструкторов нитрилов карбоновых кислот. Увеличение их количества последовательно продолжалось в течение 2 месяцев эксперимента и статистически значимо отличалось от контроля. После 1-го месяца их количество увеличилось в 2,5 раза и составило 3,94×106 КОЕ/г почвы, а после 2-го – в 3,7 раза (5,68×106 КОЕ/г почвы). После прекращения внесения поллютанта в среду их содержание стало сокращаться. Субстрат в концентрации 1000 ПДК ингибировал рост нитрилутилизирующих бактерий и снижение их количества зафиксировано уже с 3 суток эксперимента, то есть сразу после первого внесения нитрила. А Б Рисунок 28. Динамика количества нитрил- (А) и амидутилизирующих (Б) бактерий в контрольном и опытных сосудах. Примечание: * – различия статистически значимы по сравнению с контролем на срок анализа, α – различия статистически значимы по сравнению с началом эксперимента (p<0,05). Наблюдалась корреляция между числом нитрил- и амидутилизирующих бактерий в контрольном (r=0,78; p=0,05), 10 ПДК (r=0,57) и 1000 ПДК (r=0,98) вариантах. При концентрации акрилонитрила 100 ПДК выявлены разнонаправленные эффекты: к концу 2-го месяца содержание бактерий, 94 утилизирующих амиды, было достоверно ниже (в 4 раза), чем в начале эксперимента против существенного увеличения нитрилутилизирующих бактерий. Отмечена обратная корреляционная зависимость между этими двумя группами деструкторов (r=-0,4) в данном варианте. При анализе зависимости количества различных групп бактерий от концентрации акрилонитрила выявлено отсутствие связи для аммонифицирующих и денитрифицирующих микроорганизмов (r=0,13 и r=0,01 соответственно), умеренная корреляция наблюдалась по отношению к общему числу гетеротрофов (r=0,42, р=0,05). Содержание нитрилутилизирующих бактерий сильно зависело от концентрации субстрата (r=0,86, р=0,05). Результаты, полученные в настоящей работе, свидетельствуют о том, что содержание данной группы прокариот увеличивается в условиях повышенного содержания токсиканта в почве, что может использоваться для индикации загрязнения среды нитрилами. Структуру бактериального сообщества определяли методом ПЦР РВ. Были амплифицированы фрагменты гена, кодирующего малую субъединицу рРНК разных филогенетических групп микроорганизмов, включая эукариот. Нормирование проводили по числу копий рибосомального оперона на грамм почвы. Данный параметр применяли только при сравнительной оценке численности микроорганизмов в условиях эксперимента. Для сопоставления бактериологического и молекулярного методов проводили грубую оценку абсолютной численности бактерий на грамм почвы: количество рРНК оперонов делили на среднюю копийность данного фрагмента, которая для бактерий составляет 4,09 (Андронов и др., 2012). По результатам молекулярного метода численность бактерий была выше, чем при бактериологическом анализе. Коэффициент корреляции Пирсона между показателями, полученными разными методами, был равен 0,27, вследствие того, что при определении общего микробного числа при помощи ПЦР РВ учитывались все почвенные бактерии, а при высевах – только аэробные гетеротрофные прокариоты. Следует отметить, что до двух месяцев эксперимента, когда в 95 опытные варианты систематически вносили акрилонитрил, прослеживается одинаковая тенденция снижения общей численности бактерий по данным обоих методов (Рисунок 29). А Б КОЕ/г почвы КОЕ/г почвы Контроль 1,00E+10 1,00E+10 10ПДК 1,00E+09 1,00E+09 1,00E+08 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+06 100ПДК 1,00E+05 1000ПДК 1,00E+05 0 10 сут Рисунок 29. 1 мес 2 мес Динамика 3 мес 0 численности 10 сут 1 мес бактерий 2 мес по 3 мес результатам бактериологического (А) и молекулярного (Б) методов. Результаты количественной ПЦР не только согласуются с данными бактериологического исследования, но и свидетельствуют о том, что ДНК погибших клеток практически полностью деградировала. Андронов с соавт. (2009) также отмечали высокую скорость деградации ДНК нежизнеспособных клеток генетически модифицированного штамма Sinorhizobium meliloti АСН-5 (Андронов и др., 2009). После прекращения внесения поллютанта в почвы по данным ПЦР РВ происходит восстановление численности бактерий, чего не наблюдалось при анализе данных прямого высева. Возможно, это связано с тем, что часть нитрила испарилась из почвы, снизив уровень токсичности в среде обитания, что позволило снова размножаться трудно культивируемым бактериям, которые не выявляются бактериологическим методом. На Рисунке 30 представлено соотношение различных филогенетических групп микроорганизмов Доминирующее в исходной почве по результатам положение занимали грамотрицательные ПЦР РВ. α-Proteobacteria, Acidobacteria и анаэробные бактерии из филы Bacteroidetes. В меньшем количестве представлены β-Proteobacteria и Firmicutes, тогда как представители фил Actinobacteria и Fungi оказались минорными участниками ассоциации. 96 1,00E+09 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 Б относительная численность, % копий рРНК оперонов/г почвы А 100% 80% 60% 40% 20% Fungi Firmicutes Bacteroidetes Actinobacteria β-Proteobacteria α-Proteobacteria Acidobacteria 0% Рисунок 30. Количественное содержание групп микроорганизмов (А) и их соотношение (Б) в начале эксперимента по результатам ПЦР РВ. В контрольном варианте и в варианте 10 ПДК количество почвенных микроорганизмов было сопоставимо на протяжении всего периода исследования (Рисунок 31). В сосудах с высокой концентрацией нитрила на 10 сутки наблюдалось незначительное увеличение содержания всех филогенетических групп бактерий, за исключением ацидобактерий и бактероидов (в варианте 100 ПДК). По мере накопления высоких доз загрязнителя в среде наблюдался спад числа культивируемых бактерий, причем наиболее выраженным это снижение было в сосуде с концентрацией акрилонитрила 1000 ПДК. Количество грибных рРНК оперонов не изменялось на протяжении всего эксперимента во всех вариантах опыта, что говорит об их высокой устойчивости к данному поллютанту. Установлено, что разные филогенетические группы микроорганизмов дозозависимо реагируют на загрязнение почвы акрилонитрилом. В варианте 100 ПДК токсиканта в первые 10 суток значительно увеличилось количество βProteobacteria, после чего их содержание было сопоставимо с α-Proteobacteria до конца эксперимента. Выраженное снижение числа бактерий в данном варианте показано для Acidobacteria и Actinobacteria, причем первые отреагировали на загрязнитель сразу, а вторые – только по мере накопления загрязнителя в среде. После прекращения внесения нитрила в среду (3 месяц эксперимента) отмечена 97 тенденция восстановления количества представителей фил α-, β-Proteobacteria, Firmicutes и в меньшей степени Actinobacteria. При концентрации нитрила 2000 мг/кг в первый месяц динамика бактерий была сопоставима с вариантом 100 ПДК. В конце 2 месяца исследования в среде преобладали представители фил Bacteroidetes и Acidobacteria. На момент завершения эксперимента также отмечено увеличение численности аэробных бактерий, доминирующими среди которых были протеобактерии. Ранее Панов и соавт. показали, что при загрязнении среды (вода, почва, ил и др.) нефтью, дизельным топливом, бензином, диоктилфталатом чаще всего доминируют протеобактерии, а в местах, где основным поллютантом является нафталин, в большинстве случаев, с течением времени в популяции начинают преобладать актинобактерии, постепенно замещая протеобактерий (Панов и др., 2013). А Б Копий/г почвы 1,00E+09 Копий/г почвы 1,00E+09 1,00E+08 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+05 Acidobacteria α-Proteobacteria β-Proteobacteria Actinobacteria Bacteroidetes Firmicutes Fungi 1,00E+04 1,00E+04 0 10 сут 1 мес 2 мес 10 сут 0 3 мес В Г Копий/г почвы 1,00E+09 Копий/г почвы 1,00E+09 1,00E+08 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+05 1,00E+04 1 мес 2 мес 3 мес Acidobacteria α-Proteobacteria β-Proteobacteria Actinobacteria Bacteroidetes Firmicutes Fungi 1,00E+04 0 10 сут 1 мес 2 мес 3 мес 0 10 сут 1 мес 2 мес 3 мес Рисунок 31. Динамика численности различных филогенетических групп микроорганизмов по данным ПЦР РВ в контроле (А) и при добавлении 10 ПДК (Б), 100 ПДК (В) и 1000 ПДК (Г) акрилонитрила в почву. Показано, что содержание представителей филы Bacteroidetes во всех вариантах опыта оставалось практически на одном уровне на протяжении всего 98 периода наблюдения. Это можно объяснить тем, что у входящих в ее состав бактероидов (Bacteroides) отсутствует акрилонитрила – цитохромоксидаза. мишень токсического действия Наиболее чувствительными к высокому содержанию нитрила оказались представители Acidobacteria. Даже после прекращения внесения поллютанта в среду бактерии данной группы не были способны размножаться (необратимое ингибирование). Так как ацидобактерии только недавно были обнаружены и большинство из них не культивировались, их экология и метаболизм остаются не исследованными. Тем не менее эти микроорганизмы могут быть важной составляющей экосистемы, так как они особенно многочисленны в почве. Таким образом, наше предположение о том, что восстановление численности бактерий происходит за счет анаэробных и некультивируемых бактерий не подтвердилось детекцией 16S рРНК Bacteroidetes и Acidobacteria. Следует также учесть, что выбранные филы не полностью характеризуют данные почвенные группы. Суммарную ДНК из почвенных образцов анализировали на наличие ключевого гена гидролиза нитрилов – nha, кодирующего консервативные участки нитрилгидратазы Fe-типа. Для этого применяли 2 пары праймеров: FE F/R и nhpA F/R, но реакция прошла только с первой парой. Во втором случае получали два разных по температуре плавления ПЦР-продукта, поэтому эти данные мы не анализировали. Даже при условии, что один нитрилутилизирующий микроорганизм содержит одну копию nha, в начале эксперимента количество бактерий – деструкторов нитрила, полученное методом ПЦР РВ, было на порядок ниже, чем их число КОЕ, определенное бактериологическим методом. На протяжении всего эксперимента не происходило значимых изменений по присутствию гена нитрилгидратазы во всех вариантах. Корреляционный анализ не выявил связи между результатами молекулярного и бактериологического методов (r=-0,03). Скорее всего, это связано с тем, что используемые праймеры были разработаны на основе двадцати пяти гомологичных последовательностей нитрилгидратаз, принадлежащих в основном представителям рода Rhodococcus (Coffey et al., 99 2010). В этом случае детектировались не все нитрилгидратазы грамотрицательных прокариот, которые отличаются высоким разнообразием и могут быть локализованы на плазмидах. Поэтому, несмотря на некую гомологию как α-, так и β-субъединиц, невозможно обнаружить абсолютно консервативный участок для создания праймеров (Lourenco et al., 2004). С другой стороны, рост числа нитрилутилизирующих прокариот мог происходить не только за счет увеличения количества бактерий, имеющих нитрилгидратазу, но и за счет продуцентов других ферментов, способных к деградации нитрилов: нитрилазы, оксигеназы и нитрогеназы. Последний вариант наиболее вероятен, так как бактериологический метод не показал увеличения амидутилизирующих бактерий, субстратом для которых служит амид – ключевой интермедиат, образующийся при наличии двустадийной системы гидролиза нитрилов. Необходимо также отметить, что поскольку для тестирования акрилонитрила в каждой концентрации был использован лишь один сосуд, то результаты носят предварительный характер (Проблемы экологического эксперимента, 2008). Исследование лабораторных модельных почвенных систем дает возможность понять, как разные филогенетические группы бактерий отвечают на специфические загрязнения, и помогает устанавливать закономерности в поведении и функционировании природных сообществ при таких загрязнениях (Панов и др., 2013). 5.3. Метагеномное секвенирование Для более детального анализа влияния акрилонитрила на структуру микробиоты проведено метагеномное секвенирование трех образцов почвы модельного эксперимента. В исходной пробе обнаружено 6009 последовательностей гена 16S рРНК, принадлежащих домену Bacteria. Спустя 3 месяца, после 4-х кратного внесения акрилонитрила в концентрации 200 мг/кг почвы (100 ПДК) детектировали 6615 последовательностей, а в концентрации 2000 мг/кг почвы (1000 ПДК) – 3213. Анализ таксономической структуры микробиома исходной почвы на уровне домена выявил присутствие 14 100 бактериальных фил: Proteobacteria, Bacteroidetes, Acidobacteria, Nitrospirae, Actinobacteria, Firmicutes, Armatimonadetes, Parcubacteria, Chloroflexi, Gemmatimonadetes, Planctomycetes, Candidatus Saccharibacteria, Candidate Division WPS-1 и WPS-2. Положение доминирующих групп бактерий занимали представители фил Proteobacteria (36,88%), Bacteroidetes (23,78%), Acidobacteria (13,03%) и Actinobacteria (3,20%). Таксономическую принадлежность значительной части последовательностей установить не удалось, что обусловлено неполнотой имеющихся баз данных и характерно для метагеномных исследований. После многократного внесения в почву акрилонитрила в концентрации 100 и 1000 ПДК все представленные филы сохранились, за исключением Armatimonadetes и Candidate Division WPS-1 и WPS-2 (Рисунок 32). Рисунок 32. Распределение групп бактерий (на уровне фил) в контрольном и опытных образцах. Наиболее значимые изменения бактериальной микрофлоры загрязненных образцов по отношению к контролю отмечены в группе протеобактерий, при этом различий на уровне классов не выявлено. Так, в исходной почве обнаружено 15 семейств бактерий α-Proteobacteria, а после трех месяцев эксперимента их количество сократилось до 8. Чувствительными к акрилонитрилу оказались такие семейства как Rhizobiaceae, Beijerinckiaceae, Rhodobiaceae, Rickettsiaceae и ряд 101 других. В классе β-Proteobacteria изменения носили только численный характер: в опытных вариантах увеличилось представительство бактерий семейства Burkholderiaceae. Среди γ-Proteobacteria необходимо отметить устойчивость к нитрильному загрязнению бактерий семейства Pseudomonadaceae, относительное содержание которых даже несколько Enterobacteriaceae, которые практически увеличилось, и чувствительность не детектировались в варианте 1000 ПДК. Среди грамотрицательных бактерий также следует указать прирост числа Bacteroidia при концентрации нитрила 100 ПДК и снижение разнообразия Acidobacteria с 13 классов до 8-9 в вариантах 100 и 1000 ПДК. Внесение 200 мг/кг токсиканта способствовало увеличению разнообразия Clostridia из филы Firmicutes до 10 семейств, тогда как в варианте 1000 ПДК детектировали только 2. Возможно, последняя концентрация нитрила является токсичной даже для спор бактерий. В опытных образцах также повысилось относительное содержание актинобактерий (от 3,2% в контроле до 12,4% в варианте 1000 ПДК), причем наиболее значимые количественные изменения произошли в семействе Nocardiaceae, что еще раз подтверждает их исключительную способность приспосабливаться к действию различного рода внешних факторов. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о высоком адаптивном потенциале почвенной микробиоты. Применение двух дополняющих друг друга молекулярных методов позволяет решать разные задачи: оценивать в почвах количественное содержание различных филогенетических групп бактерий и проводить глубокий качественный анализ состава почвенного сообщества. 102 ГЛАВА 6. ВЛИЯНИЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ НИТРИЛОВ НА МОРФОЛОГИЮ И ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ БАКТЕРИЙ В настоящий момент для оценки токсичности поллютантов используют в основном два подхода: химический анализ с определением ПДК токсического вещества и биотестирование. Во втором случае контролируется влияние токсичности вещества на различные параметры жизнедеятельности различных про- и эукариотических организмов. Для изучения адаптационных свойств бактерий, которые проявляются в обратимых или необратимых изменениях поверхностных структур клетки, широко применяются атомно-силовая микроскопия (АСМ) и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (КЛСМ), дополняющие традиционные методы анализа биологических объектов. До сих пор остается малоизученным вопрос о влиянии нитрилов на жизнеспособность и поверхностные структуры бактериальных клеток. 6.1. Влияние субстратов на жизнеспособность бактерий Методом биотестирования определена токсичность ряда нитрилов и нитрильных гербицидов: бромоксинила и иоксинила. Для этого были построены калибровочные графики зависимости гашения биолюминисценции тест-штамма E. coli К12 TG1 («Эколюм-8») от концентрации раствора каждого нитрила (Рисунок 33). Наименее токсичными оказались алифатические предельные ацето- и изобутиронитрилы: подавление биолюминесценции на 50% (ЕС50) происходило при 1048,32±355,01 и 616,19±63,05 мМ соответственно (Таблица 17). Пятиуглеродный представитель данной группы (валеронитрил) оказывал большее ингибирующее действие на сенсор даже по сравнению с непредельным акрилонитрилом (ЕС50 13,09±3,57 против 37,36±20,55 мМ). 103 ЕС50 Рисунок 33. Построение калибровочного графика для определения токсичности субстрата на примере валеронитрила. Нужно отметить, что величина EC50 по акрилонитрилу является сильнотоксичной и соответствует 1000 ПДК, установленной для воды. Из рассмотренных нитрилов самыми токсичными были ароматические нитрилы: бензонитрил угнетал биолюминесценцию Е. сoli К12 TG1 на 50% при 0,4 мМ, а его бром- и йодсодержащие производные при концентрациях в 5 и 10 раз меньше: 0,08±0,05 и 0,04±0,01 мМ. Vesela´ и др. (2010) в своей работе также показали, что иоксинил является более токсичным для бактерий среди нитрильных гербицидов: величина EC50 при использовании биосенсора Vibrio fischeri для бромоксинила и иоксинила составила 14 и 8 нМ соответственно (Vesela´ et al., 2010). Очевидно, что данный сенсор является более чувствительным к токсикантам, тем не менее Kurvet и др. (2011) при сравнении сенсоров V. fischeri и E. coli, содержащих термостабильную люциферазу из Photorhabdus luminescens, показали, что применение рекомбинантных E. coli является универсальной альтернативой MicrotoxTM теста, использующего в качестве сенсора V. fischeri (Kurvet et al., 2011). 104 Таблица 17 Токсикологические параметры ряда нитрилов и их производных Вещество ЕС50 для Е. сoli К12 TG1 LD50 для крыс (мг/кг)* ЕС50 для дафний (мг/л)* М±m, мМ мг/л Ацетонитрил 1048,32±355,01 43020 1320-6690 3,6 Изобутиронитрил 616,19±63,05 101185 50 – Валеронитрил 13,09±3,57 1088 191 – Акрилонитрил 37,36±20,55 1982 81 7,4-10 Бензонитрил 0,40±0,13 41 971 – Бромоксинил 0,08±0,05 22 190 0,051 Иоксинил 0,04±0,01 15 110 – Примечание: * – использованы показатели из паспортов безопасности www.sigma-aldrich.com. Считается, что тест на общую токсичность химических веществ с использованием люминесцентных бактерий соответствует показаниям EC50 для эукариот. В работе Kaiser K. (1998) показан высокий уровень корреляции между значениями EC50 для V. fischeri NRRL B-11177 тест-системы MicrotoxTM и LD50 для водорослей, дафний, простейших, рыб (Kaiser et al., 1998). При сопоставлении токсикологических параметров EC50 и LD50 оказалось, что для алифатических нитрилов среднелетальная доза была значительно ниже (примерно в 25 раз для акрило- и ацетонитрила), тогда как ароматические нитрилы проявляли большее ингибирующее действие на сенсорный штамм Е. coli К12 TG1, чем на крыс при пероральном введении. Так, показатель LD50 по бензонитрилу был больше EC50 в 23,5 раза, а по бромо- и иоксинилу – в 7,25 и 8,5 раз. Известно, что алифатические предельные и непредельные нитрилы с малой молекулярной массой более токсичны для млекопитающих, чем ароматические соединения, но введение галогенов в циклическую молекулу вещества увеличивает повреждающее действие. При этом их токсичность связана со скоростью образования CN – в макроорганизме и может существенно различаться для разных видов животных (Rao et al., 2013). На дафний изученные нитрилы оказывают еще большее токсическое действие. Поэтому тезис о корреляции между токсикологическими параметрами EC50 и LD50 корректен в отношении не всех нитрильных соединений. 105 При определении МПК всех групп нитрилов на клетки нитрилутилизирующих микроорганизмов выявлено, что токсичность напрямую зависела от структуры химического вещества: алифатические предельные < алифатические непредельные < ароматические < галогензамещенные ароматические нитрилы (гербициды). При этом для штаммов бактерий с высокой ферментативной активностью для первых трех групп субстратов МПК были не меньше 0,015 М, а для последней разброс составил 0,01-0,3 мМ (Таблица 18, А). В группе штаммов, не обладающих выраженной нитрилгидролизующей активностью, аналогичные показатели составили 7,8 мМ и 0,02-0,078 мМ соответственно. Среди рассмотренных штаммов самым устойчивым к большинству соединений был R. ruber gt1, активность нитрилгидратазы которого достигает 200 ЕД. Отмечено, что разные штаммы родококков могли существенно различаться по устойчивости к нитрилам: МПК бензонитрила для R. ruber gt1, Rhodococcus sp. A0 и R. erythropolis 84 составила 0,06, 0,03 и 0,015 М соответственно. Хотя МПК ряда нитрилов для P. fluorescens C2 были ниже или равны по отношению к родококкам, тем не менее отмечается более высокая устойчивость клеток псевдомонад к бромо- и иоксинилу. Возможно, это связано с естественной резистентностью бактерий рода Pseudomonas для больших молекул активно действующего вещества вследствие непроницаемости клеточной стенки, обусловленной повышенным содержанием ионов магния, что способствует созданию сильных связей между молекулами липополисахаридов (Thomas et al., 2005). Бактерицидные концентрации нитрилов были существенно выше (от 0,125 до 4 М и более для первых трех групп и от 1,25 до 5 мМ для четвертой) и отличались от МПК в 4 раза (P. fluorescens C2, R. erythropolis 84 – для изобутиронитрила), 8 раз (в большинстве случаев) и даже в 33 раза (R. erythropolis 84 – для акрилонитрила, Rhodococcus sp. A0 – для изобутиронитрила). Для гербицидов этот разброс был еще выше. Устойчивость изученных штаммов бактерий к высоким концентрациям нитрилов объясняется тем, что они были выделены из почв на территории предприятий по производству акриламида, где возможны разливы субстрата и 106 продукта. Нужно отметить, что чувствительность сенсора Е. сoli К12 TG1 и штаммов R. ruber gt1 и Rhodococcus sp. A0 по отношению к субстратам совпала. Исключение составил валеронитрил, EC50 которого оказалась меньше, чем акрилонитрила. При использовании R. erythropolis 84 и P. fluorescens C2 в качестве тесторных штаммов ''линейка'' токсичности субстратов выглядела иначе. Таблица 18 Минимальные подавляющие и бактерицидные концентрации нитрилов для бактерий с высокой (А) и низкой (Б) нитрилгидролизующей активностью А gt1 А0 МПК МБК МПК МБК Ацетонитрил М 1 ˃4 1 ˃4 Изобутиронитрил 0,25 2 0,06 2 Валеронитрил 0,25 2 0,25 1 Акрилонитрил 0,06 1 0,125 0,5 Бензонитрил 0,06 1 0,03 0,5 Бромоксинил мМ 0,078 5 0,02 5 Иоксинил 0,01 2,5 0,01 2,5 Б П5-2 П5-8 Вещество МПК МБК МПК МБК Ацетонитрил М 0,5 4 1 4 Изобутиронитрил 0,06 2 0,06 1 Валеронитрил 0,06 4 0,06 2 Акрилонитрил 0,015 4 0,015 2 Бензонитрил 0,06 1 0,015 2 Бромоксинил мМ 0,04 5 0,04 2,5 Иоксинил 0,02 2,5 0,02 2,5 Вещество 84 С2 МПК МБК МПК МБК 0,5 4 0,25 4 0,125 0,5 0,125 0,5 0,06 0,5 0,03 1 0,015 1 0,015 0,25 0,015 0,125 0,03 0,125 0,078 5 0,3 2,5 0,01 1,25 0,15 1,25 К15-6-2 МПК 0,06 0,06 0,06 0,015 0,0078 0,078 0,15 К10ж2 МБК МПК МБК 1 0,06 1 1 0,06 0,5 1 0,03 0,5 0,06 0,0078 0,06 0,5 0,03 0,25 1,25 0,078 0,625 1,25 0,04 0,3 Для почвенных штаммов R. ruber П5-2 и П5-8 и Pseudomonas sp. К15-6-2 и К10ж2 с низкой нитрилгидролизующей активностью выявлены аналогичные тенденции: более высокая устойчивость к алифатическим и чувствительность к ароматическим нитрилам представителей рода Rhodococcus по сравнению с псевдомонадами. В целом родококки оказались более устойчивыми к алифатическим нитрилам, чем к ароматическим (M-U-тест р=0,0013). При этом они достоверно более устойчивы, чем псевдомонады к алифатическим (M-U-тест 107 р=0,035) и менее – к галогензамещенным ароматическим нитрильным соединениям (M-U-тест р=0,0067). Тем не менее, статистически достоверной разницы для всех субстратов между двумя сравниваемыми группами бактерий с разным уровнем ферментативной активности не выявлено. 6.2. Микроскопические методы оценки токсичности нитрилов Использование АСМ и КЛСМ при решении вопросов, связанных с изучением морфо-функциональных особенностей бактериальных клеток при воздействии различных факторов, является актуальным направлением развития современных методов микробиологического анализа (Stoderegger, Hernd, 2004; Феофанов, 2007; Ерохин, 2015; Nikiyan et al., 2010). Исследовано влияние субтоксических доз нитрилов на клетки бактерий R. ruber gt1, R. ruber П5-8, E. coli K12 TG1 и P. fluorescens C2. На микрофотографиях препаратов, предварительно окрашенных красителем Live/Dead®, видно, что экспозиция родококков с 0,1 и 1 мМ бромоксинилом приводила к появлению нежизнеспособных клеток (Рисунок 34). Воздействие 1 М акрилонитрила и 1 мМ бромоксинила вызывало гибель или повреждение клеточной стенки до 70-80% клеток E. coli K12 TG1 и P. fluorescens C2, тогда как 0,1 мМ гербицид не оказывал подобного действия на бактерии. Контроль 1 М АкН 1 мМ ВХ 0,1 мМ ВХ Рисунок 34. АСМ- и КЛСМ-изображения (вставка) клеток бактерий до (контроль) и после обработки акрилонитрилом (АкН) и бромоксинилом (ВХ) на примере штамма R. ruber gt1. 108 Ширина бактерий P. fluorescens C2 E. coli K12 TG1 R. ruber П5-8 R. ruber gt1 Длина бактерий Рисунок 35. Диапазон показателей линейных размеров бактериальных клеток в АСМ-изображениях без действия токсикантов и после 1-часового воздействия акрилонитрила (АкН) и бромоксинила (ВХ). 109 Таблица 19 Жизнеспособность и морфометрические показатели клеток бактерий после воздействия различных нитрилов Вариант опыта Жизнеспособность*, % Ширина, мкм Высота, мкм 76,27 57,23 45,60 Длина, мкм R. ruber gt1 3,74±0,58 2,68±0,59 1,99±0,28 Контроль АкН 1 М ВХ 1 мМ 1,00±0,04 1,08±0,05 1,00±0,08 0,33±0,02 0,35±0,08 0,26±0,03 ВХ 0,1 мМ 56,21 2,22±0,38 0,92±0,06 0,38±0,03 1,63±0,05 1,45±0,05 0,26±0,05 0,25±0,03 2,89±0,26 1,72±0,06 0,19±0,03 р≤0,05 р≤0,05 Контроль АкН 1 М 75,12 - ВХ 1 мМ 52,31 ВХ 0,1 мМ 59,19 Контроль АкН 1 М ВХ 1 мМ 68,13 30,84 29,82 ВХ 0,1 мМ 44,30 Контроль АкН 1 М 69,25 20,87 ВХ 1 мМ 22,55 ВХ 0,1 мМ 61,19 р≤0,05α,β р≤0,05α,β R. ruber П5-8 4,35±0,55 3,51±0,40 α 4,13±0,34 р≤0,05α,β р≤0,05α β 1,72±0,09 0,21±0,03 1,13±0,05 1,16±0,05 0,92±0,05 0,32±0,04 0,17±0,02 0,22±0,02 0,95±0,05 0,17±0,06 1,16±0,09 1,00±0,06 0,17±0,04 - 0,95±0,07 0,55±0,04 0,21±0,04 р≤0,05 р≤0,05 E. coli K12 TG1 1,69±0,10 1,81±0,11 1,43±0,07 р≤0,05α,β 1,33±0,04 р≤0,05α,β P. fluorescens C2 1,89±0,10 1,66±0,07 р≤0,05α α 1,66±0,07 р≤0,05α Примечание: * - оценивали методом КЛСМ, р≤0,05β р≤0,05α,β р≤0,05α,β р≤0,05α α 1,02±0,03 р≤0,05α,γ α 0,11±0,02 – показатель достоверно отличается от контроля, β – от варианта с АкН, γ – от варианта с 1 мМ ВХ. Применение АСМ позволило визуализировать и оценить морфологию и структурные особенности поверхности бактерий, изучить изменения этих параметров при действии токсикантов в разных концентрациях (Рисунок 35, Таблица 19). Длина клеток родококков варьировала от 2,5 до 7,8 мкм, что 110 характерно для актиномицетов, в среднем размеры клеток штамма R. ruber gt1 составили 3,74×1,00×0,33 мкм, а R. ruber П5-8 – 4,35×1,63×0,26 мкм и при обработке нитрилом оставались в пределах ошибки среднего арифметического. При воздействии бромоксинила отчетливо наблюдалась фрагментация родококков на мелкие палочки и даже кокки: длина клеток R. ruber gt1 сократилась до 1,99 и 2,22 мкм при воздействии 1 и 0,1 мМ гербицида соответственно (р=0,000 и 0,004). Размеры отдельных бактерий E. coli K12 TG1 в контроле соответствовали 1,69×1,13×0,32 мкм. При воздействии на клетки штамма гербицида в обеих концентрациях происходило достоверное уменьшение их размеров (W-тест р<0,05), за исключением высоты, хотя отмечена тенденция к снижению и этого параметра. При часовой экспозиции бактерий с нитрилом акриловой кислоты среднее значение длины и ширины оказалось даже несколько выше, чем в контроле, но все изменения были недостоверными. Для штамма P. fluorescens C2 воздействие всех токсикантов характеризовалось снижением длины и ширины клетки (р<0,05), а также высоты, но это изменение, как и в случае E. coli K12 TG1, было недостоверным. Для количественного описания структурных изменений клеточной поверхности применяли показатели: индекс I, представляющий собой отношение ширина/высота, который отражает защиту формы бактериальной клетки от внешних воздействий, и величину Sq (шероховатость) (Ерохин, 2015). Оценка различных токсикантов проведена с помощью коэффициента К, представляющего собой отношение Iконтроль/Iэксперимент (Таблица 20). В случае 1 М акрилонитрила для штаммов R. ruber gt1 и П5-8 данный коэффициент был близок к единице, что показывает отсутствие влияния нитрила, связанное с особенностями строения клеточной стенки родококков. При вычислении данного показателя обнаружено сжатие/сморщивание клеток (К=2,6) штамма P. fluorescens C2 после часовой экспозиции с 1 мМ бромоксинилом (Рисунок 36). Тогда как для культуры E. coli K12 TG1 во всех вариантах К был ниже 1. Отмечено достоверное снижение шероховатости клеток штамма E. coli K12 TG1 по отношению ко всем другим вариантам при воздействии 0,1 мМ гербицида. Шероховатость клеток 111 P. fluorescens C2 увеличилась при воздействии и акрилонитрила, и бромоксинила (повышение Sq на 37%). Для R. ruber gt1 данный показатель изменялся незначительно, тогда как у штамма R. ruber П5-8 он отличался от контроля во всех вариантах. Таблица 20 Количественные показатели структурных изменений клеточной поверхности бактерий Вариант опыта Индекс I Коэффициент К (ширина/высота) (Iконтроль/Iэксперимент) R. ruber gt1 3,03 3,09 0,98 3,85 0,79 2,42 1,25 R. ruber П5-8 6,27 5,80 1,08 Контроль АкН 1 М ВХ 1 мМ ВХ 0,1 мМ Контроль АкН 1 М Шероховатость Sq, нм 218,53±23,16 222,43±41,46 200,73±35,38 229,13±29,86 277,33±10,05 202,33±15,62 р≤0,05α ВХ 1 мМ 9,05 0,69 125,33±24,67 ВХ 0,1 мМ 8,19 0,77 178,00±35,45 4,18 0,52 0,84 177,64±50,33 240,11±70,02 173,10±19,80 5,59 0,63 142,33±29,80 р≤0,05α,β р≤0,05α E. coli K12 TG1 Контроль АкН 1 М ВХ 1 мМ 3,53 6,82 ВХ 0,1 мМ р≤0,05β р≤0,05α,β, γ P. fluorescens C2 Контроль АкН 1 М 6,82 - - 113,29±29,57 155,75±21,10 ВХ 1 мМ 2,62 2,60 155,00±22,14 р≤0,05α р≤0,05α ВХ 0,1 мМ Примечание: α 9,27 0,74 – показатель достоверно отличается от контроля, варианта с АкН, γ – от варианта с 1 мМ ВХ. β – от 112 Б P. fluorescens C2 E. coli K12 TG1 R. ruber П5-8 R. ruber gt1 А Рисунок 36. Влияние 1мМ бромоксинила на клетки бактерий: А – контроль, Б – опыт. 113 Таким образом, при оценке токсического действия синтетических нитрилов и нитрильных гербицидов на некоторые виды бактерий методом биотестирования выявлено, что ароматические нитрилы являются для бактерий наиболее токсичными из рассмотренных субстратов, что существенно отличается по воздействию на эукариоты. Показано, что экспозиция с раствором бромоксинила приводила к снижению линейных параметров клеток всех штаммов и выраженному изменению клеточной поверхности для грамотрицательных бактерий. Согласно значениям МПК и МБК почвенные штаммы нитрилутилизирующих бактерий способны выдерживать высокие концентрации рассмотренных соединений. МПК нитрилов для бактерий с низкой нитрилгидролизирующей активностью оказались меньше, чем для штаммов – продуцентов нитрилгидратазы/нитрилазы. По-видимому, наличие ферментов деградации обеспечивает частичную конверсию нитрила в среде, благодаря чему клетки бактерий способны выдерживать более высокие концентрации токсиканта. В то же время, значения МБК были меньше для грамотрицательных микроорганизмов. Вероятно, токсическое действие высоких концентраций нитрилов обусловлено в большей степени с повреждением клеточной стенки, и активность нитрилгидролизирующих ферментов в этих условиях уже не является определяющим фактором. Таким образом, для прокариот влияние нитрильных гербицидов обусловлено не только инактивацией фермента дыхательной цепи, но и выраженными повреждениями клеточной стенки. Характер этих повреждений отражает адаптационные возможности различных видов микроорганизмов. 114 ЗАКЛЮЧЕНИЕ В течение нескольких десятилетий нитрилы попадали в окружающую среду с промышленными сточными водами, сельскохозяйственными химикатами и в результате техногенных катастроф (Vosahlova et al., 1997; Reinnicke et al., 2012). Так, в мае 2013 года в Бельгии произошла авария грузового поезда, перевозившего акрилонитрил, в результате которой взорвались 4 цистерны с токсикантом (http://dailynewslight.ru). В августе 2015 года произошел взрыв на химическом заводе «Шаньдун Ран химические технологии Лимитед» в городе Цзыбо в китайской провинции Шаньдун. Предприятие занимается производством и сбытом высокотехнологичных химикатов, в том числе и адипонитрила (http://lifenews.ru). Важнейшим фактором детоксикации нитрильных загрязнений и перспективным объектом для локальной очистки стоков являются микроорганизмы. Бактерии, утилизирующие нитрильные соединения, были выделены из мелководных морских отложений (Langdahl et al., 1996), глубоководных донных осадков (Colquhoun et al., 1998; Heald et al., 2001), геотермальных источников (Yamaki et al., 1997; Pereira et al., 1998) и из различных почв (Martinkova´ et al., 1992; Layh et al., 1997; Kato et al., 2000; Brandao et al., 2003). Многие из них могут использовать нитрилы как источник углерода и/или азота. Описаны системы гидролиза нитрильных соединений, которые конвертируются в соответствующие карбоновые кислоты путем сочетанного действия нитрилгидратазы и амидазы или при работе фермента нитрилазы (Kobayashi et al., 1992). В настоящей работе проанализировано распространение альдоксимнитрилметаболизирующих микроорганизмов в различных типах почв. Отмечено преобладание нитрил- и амидконвертирующих бактерий в почвах промышленных предприятий, не связанных с производством нитрила, по сравнению с природными образцами (6,75±3,83% и 1,29±0,98%). Однако корреляции между величиной общей токсичности почвы, определенной методом биотестирования с использованием биолюминесцентного сенсора «Эколюм-5», концентрацией 115 металлов, бенз(а)пирена и количеством бактерий, трансформирующих нитрилы, не обнаружено. В то же время выявлена связь численности данной группы прокариот с концентрацией нитрила в почве (r=0,86, р=0,05). Результаты, полученные в настоящей работе, свидетельствуют о том, что содержание нитрилутилизирующих бактерий увеличивается в условиях повышенного содержания токсиканта в почве, что может использоваться для индикации загрязнения среды нитрилами. Методом ПЦР РВ выявлено, что общее содержание бактерий было выше, чем при высеве почвенной суспензии на плотные питательные среды (р=0,005), а содержание продуцентов нитрилгидратазы – ниже (р=0,014). При сопоставлении данных числа бактерий по двум методам наблюдалась умеренная корреляционная зависимость (r=0,65; р=0,05). В то же время, она отсутствовала между показателями, характеризующими число нитрилутилизирующих микроорганизмов (r=0,21), что вполне ожидаемо вследствие того, что в эту группу входят бактерии не только с нитрилгидратазно-амидазной, но и с другими системами трансформации нитрилов. При сравнении активностей нитрилгидролитических ферментов оказалось, что штаммы, выделенные из антропогенно-загрязненных почв, обладали более выраженной нитрилгидратазной активностью. Данный факт объясняет рациональность выделения перспективных для биотехнологии штаммов из контаминированных почв (Narayanasamy et al., 1990; Nawas et al., 1991; Verma, Sangave, 2014). Так, штаммы R. ruber gt1 и Rhodococcus sp. A0, выделенные ранее из почв промышленных предприятий ФГУП «ПЗ им. С.М. Кирова» и ОАО «Бератон», были способны синтезировать 37,3 и 40,1% раствор акриламида и 3,9 и 4,2% раствор никотинамида. В целом, амидазная активность природных изолятов была более чем в 10 раз выше нитрилгидратазной, тогда как активность альдоксимдегидратазы в среднем составила 0,1-0,3 ЕД. Поскольку у подавляющего большинства почвенных штаммов бактерий каждый последующий фермент, участвующий в альдоксим-нитрильном метаболизме, имел более 116 высокую активность, можно говорить о высоком биодеструктивном, а не биокаталитическом потенциале микробиоты почв. При ПЦР-анализе генов альдоксим-нитрильного метаболизма установлено, что они преимущественно детектируются в комплексе. При этом распределение кодирующих последовательностей альдоксимдегидратаз и нитрилгидратаз не зависело от субстрата, на котором были выделены бактерии (р=0,32 и р=0,73 по Fтесту). В редких случаях гены детектировались по отдельности, что вероятнее всего связано с неабсолютной специфичностью использованных праймеров. Секвенирование генов альдоксимдегидратаз и нитрилгидратаз штаммов рода Rhodococcus не выявило мутаций в областях, кодирующих активные или регуляторные центры ферментов. Однако в первичной структуре белков обнаружено множество как характерных, так и уникальных для данного рода аминокислотных замен, что также может повлиять на активность ферментов (Nakasako, 1999; Brandao et al., 2003). Несмотря на то, что встречаемость аминокислотных замен в субъединицах нитрилгидратаз не различалась у штаммов, выделенных из природных и антропогенно-измененных почв (р=0,717 по F-тесту), тем не менее у последних выявлена большая гетерогенность фермента. Единственная замена, определенная нами как радикальная, обнаружена в последовательности α-субъединицы нитрилгидратазы штамма, изолированного из почвы предприятия по производству акриламида. Многочисленные работы, связанные с выделением активных штаммовдеструкторов из почв, загрязненных нитрилами, не затрагивают изучение динамики микробных сообществ и изменение их состава под воздействием данных веществ. Исследование лабораторных модельных почвенных систем дает возможность понять, как разные филогенетические группы бактерий отвечают на специфические загрязнения, и помогает устанавливать закономерности в поведении и функционировании природных сообществ при таких загрязнениях (Панов и др., 2013). При оценке влияния акрилонитрила в концентрациях 20, 200 и 2000 мг/кг на численность и структуру микробного сообщества почвы в модельном эксперименте in vitro установлено, что различные концентрации 117 акрилонитрила по-разному влияют на автохтонную почвенную микрофлору: низкие концентрации (10 ПДК) не оказывают воздействия, высокие концентрации (1000 ПДК) ингибируют развитие практически всех физиологических групп бактерий, представленных в почве, а при концентрации эквивалентной 100 ПДК на фоне общего угнетения роста бактерий индуцируется развитие нитрилутилизирующих микроорганизмов. Молекулярно-генетическим методом также показано отсутствие ингибирующего действия 10 ПДК нитрила. Более высокие дозы загрязнителя вызывали изменения в структуре почвенного сообщества, которые в первую очередь проявляются в колебании численности представителей α- и β-Proteobacteria и пролонгированным угнетением бактерий филы Acidobacteria. Влияние нитрила на грамположительные Firmicutes, представленные в почве в меньшем количестве, было менее выраженным. Самыми устойчивыми к внесению поллютанта оказались Bacteroidetes и Fungi. Показано, что хотя увеличивается содержание нитрилутилизирующих прокариот в ответ на загрязнение почвы нитрилом, роста количества нокардио- и коринеподобных бактерий с нитрилгидратазно-амидазной системой гидролиза нитрилов (ключевого гена) не происходит. Анализ таксономической структуры микробиома исходной почвы на уровне домена выявил присутствие 14 бактериальных фил. После многократного внесения в почву акрилонитрила в концентрации 100 и 1000 ПДК все представленные филы сохранились, за исключением Armatimonadetes и Candidate Division WPS-1 и WPS-2. Наиболее значимые изменения бактериальной микрофлоры загрязненных образцов по отношению к контролю отмечены в группе протеобактерий, при этом различий на уровне классов не выявлено. Методом высева почвенной суспензии на плотные питательные среды подобные изменения не регистрируются. Применение двух дополняющих друг друга молекулярных методов позволило решить разные задачи: оценить в почвах количественное содержание бактерий различных филогенетических групп и провести глубокий качественный анализ состава почвенного сообщества при загрязнении. 118 Несмотря на видимые преимущества молекулярных методов, классическая микробиология до сих пор широко используется в почвенной экологии. Алексеев и соавт. (2013) провели сравнительный анализ данных, полученных классическими и молекулярными методами. Они показали сходство результатов на 73-100% при оценке проб, отобранных близко к поверхности (0-12 см), что противоречит общепринятым данным (1% выделения бактерий при использовании классических методов) и объяснили это особенностями почв сибирского Севера. При анализе проб на глубине 20-42 см классические методы выделения микроорганизмов показали наличие 27-38% видов бактерий от обнаруженных с помощью молекулярных методов. Данный факт авторы объясняют наличием бактерий-анаэробов, а также некультивируемых форм. Таким образом, по мнению авторов, традиционный метод посева и выделения чистых культур не только следует сохранить, несмотря на появление современных молекулярно-биологических методов, но и расширить его возможности, используя для количественной и качественной характеристики микробных сообществ молекулярными (Алексеев методами и не др., 2013). регистрировали В настоящей увеличения работе числа нитрилутилизирующих микроорганизмов в ответ на загрязнение почвы нитрилом, в то время как методом прямого высева установлена сильная корреляция данной группы прокариот с концентрацией токсиканта. При давлении факторов антропогенного происхождения на природные экосистемы микроорганизмы, существование которых во многом зависит от влияния различных условий среды обитания, зачастую являются наиболее быстрореагирующим компонентом. Для оценки токсичности поллютантов используют биотестирование, при помощи которого контролируется влияние вещества на различные параметры жизнедеятельности (скорость роста, интенсивность дыхания и другие метаболические процессы) или гибель различных про- и эукариотических организмов (Kaiser et al., 1998; Данилов и др., 2002). В результате проведенного исследования методом биотестирования на основе биолюминесцентного анализа выявлено, что ароматические нитрилы, в 119 том числе гербициды, являются для бактерий наиболее токсичными из рассмотренных субстратов, при этом EC50 иоксинила оказалась самой низкой. Почвенные штаммы нитрилутилизирующих бактерий способны выдерживать высокие концентрации рассмотренных соединений, МБК для нитрилов в основном составили 0,5 М и выше. В целом родококки оказались более устойчивыми к алифатическим нитрилам, чем к ароматическим. При этом они достоверно более устойчивы, чем псевдомонады к алифатическим и менее – к галогензамещенным ароматическим нитрильным соединениям. Устойчивость бактерий к алифатическим нитрилам может быть обусловлена и более высоким сродством нитрилгидратазы к этим веществам, тем не менее, достоверной разницы между двумя группами бактерий с разным уровнем ферментативной активности не выявлено. Методами КЛСМ и АСМ получены новые данные по изменению морфофункциональных характеристик клеток ряда грамотрицательных и грамположительных бактериальных культур после воздействия токсикантов. Концентрация АкН 1 М не вызывала статистически значимых структурных конформаций бактерий E. coli K12 TG1, R. ruber gt1 и R. ruber П5-8, хотя по результатам КЛСМ около половины клеток были нежизнеспособны. В то же время под действием другого алифатического нитрила – ацетонитрила происходило укорачивание жизнеспособных клеток R. ruber ИЭГМ 231, которое, скорее всего, было обусловлено более высокой концентрацией нитрила (≈24М) (Kuyukina et al., 2014). Влияние бромоксинила на клетки всех штаммов характеризовалось достоверным снижением линейных параметров, таких как длина и ширина, и существенным изменением клеточной поверхности (шероховатость) для грамотрицательных бактерий. Таким образом, для прокариот влияние ароматических гербицидов более выражено, чем алифатических нитрилов, что обусловлено не только инактивацией фермента дыхательной цепи, но и выраженными повреждениями клеточной стенки. В целом проведенная работа позволила с одной стороны показать распространенность бактерий, обладающих системами трансформации нитрилов 120 в природных и антропогенно-измененных почвах с оценкой их биодеструктивного и биокаталитического потенциала, сравнить различные методы учета данной группы бактерий. С другой – выявить влияние различных нитрилов на структуру почвенного сообщества и их токсический эффект на уровне клетки, что отражает адаптационные возможности различных групп бактерий. Использование различных методов и подходов микробиологического и молекулярного анализа позволило дать эколого-функциональную характеристику нитрилметаболизирующих почвенных бактерий и комплексно оценить влияние нитрильных соединений на различные группы микроорганизмов in situ и in vitro. 121 ВЫВОДЫ 1. Показано, что бактерии, обладающие системами трансформации нитрилов, повсеместно распространены в почвах и преобладают в антропогеннозагрязненных образцах. Количество нитрилутилизирующих бактерий коррелировало с концентрацией нитрила в среде, тогда как с содержанием тяжелых металлов, бенз(а)пирена и величиной общей токсичности почвы связь отсутствовала. 2. Активность ферментов альдоксим-нитрильного метаболического пути природных штаммов бактерий нарастала в ряду альдоксимдегидратаза ˂ нитрилгидратаза ˂ амидаза. Культуры, выделенные из антропогенно- загрязненных почв, обладали более выраженной нитрилгидратазной активностью. 3. Встречаемость генов альдоксимдегидратаз и нитрилгидратаз у бактерий не зависела от субстрата, на котором они были выделены. В нуклеотидных последовательностях oxd и nha/nhb штаммов рода Rhodococcus не выявлено мутаций в локусах, кодирующих активные или регуляторные центры ферментов, при этом вне этих областей обнаружено множество консервативных и уникальных для данного рода замен. 4. Установлено, что 2000 мг/кг акрилонитрила ингибирует развитие практически всех физиологических групп бактерий, представленных в природной почве, а при концентрации 200 мг/кг на фоне общего угнетения роста бактерий индуцируется развитие нитрилутилизирующих микроорганизмов. Изменения в структуре микробиома в первую очередь проявляются в колебании численности представителей α- и β-Proteobacteria. 5. Выявлено, что ароматические нитрилы, в том числе гербициды, являются для бактерий наиболее токсичными из рассмотренных субстратов, при этом EC50 иоксинила оказалась самой низкой. Показано, что экспозиция с раствором бромоксинила приводила к снижению линейных параметров клеток всех штаммов и выраженному грамотрицательных бактерий. изменению клеточной поверхности 122 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АкН – акрилонитрил, нитрил акриловой кислоты АСМ – атомно-силовая микроскопия ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ЕД – единицы активности фермента (мкмоль/мг/мин) ИТ – индекс токсичности КЛСМ – конфокальная лазерная сканирующая микроскопия КОЕ – колониеобразующие единицы МБК – минимальная бактерицидная концентрация МПК – минимальная подавляющая концентрация НГ – нитрилгидратаза ОП – оптическая плотность ПДК – предельно допустимая концентрация ПЦР – полимеразная цепная реакция ПЦР РВ – полимеразная цепная реакция в реальном времени СНП – секвенирование нового поколения BX – бромоксинил Mr – молекулярная масса 123 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Алексеев, А.Ю. Сравнение методов оценки разнообразия микробных сообществ почв сибирского севера / А.Ю. Алексеев [и др.] // Cовременные проблемы науки и образования. – 2013. – № 4. – С. 286–286. 2. Алексеева, А.Е. Возможности и перспективы применения методов массивного параллельного секвенирования в диагностике и эпидемиологическом надзоре за инфекционными заболеваниями / А.Е. Алексеева, Н.Ф. Бруснигина // МедиАль. – 2014. – № 2. – С. 6–28. 3. Андронов, Е.Е. Влияние внесения генетически модифицированного штамма Sinorhizobium meliloti АСН-5 на структуру почвенного сообщества микроорганизмов / Е.Е. Андронов [и др.] // Микробиология. – 2009. – Т. 78. – № 4. – С. 525–534. 4. Андронов, Е.Е. Изучение структуры микробного сообщества почв разной степени засоления с использованием T-RFLP и ПЦР с детекцией в реальном времени / Е.Е. Андронов [и др.] // Почвоведение. – 2012. – № 2. – С. 1– 11. 5. Андронов, Е.Е. Научно-методические рекомендации по выделению высокоочищенных препаратов ДНК из объектов окружающей среды / Е.Е. Андронов, А.Г. Пинаев, Е.В. Першина, Е.П. Чижевская. – Санкт-Петербург: ВНИИСХМ РАСХН, 2011. – 23 с. 6. Астаурова, О.Б. Ассимиляция аммония у продуцента акриламида Rhodococcus rhodochrous М8 / О.Б. Астаурова, Г.А. Ларикова, И.Н. Полякова, А.С. Яненко // Микробиология. – 1993. – № 11-12. – С. 6–8. 7. Бачинский, А.Г. Структура и помехоустойчивость генетического кода / А.Г. Бачинский // Ж. общей биол. – 1976. – Т. 37. – С. 163–173. 8. Бутвиловский, А.В. Методы определения характера аминокислотных замен: учеб.-метод. пособие / А.В. Бутвиловский, Е.А. Черноус. – Минск: БГМУ, 2008. – 28 с. 124 9. Васильев, Д.М. Трансформация цианопиридинов свободными и иммобилизованными клетками нитрилутилизирующих бактерий: автореф. дис. … канд. биол. наук: 03.02.03 / Васильев Дмитрий Михайлович. – Пермь, 2014. – 24 с. 10. Вейко, В.П. Клонирование и определение нуклеотидной последовательности гена Rhodococcus rhodochrous М8 / В.П. Вейко [и др.] // Биотехнология. – 1995. – № 5-6. – С. 3–5. 11. Взрыв на заводе в Китае [Электронный ресурс]: – средство массовой информации Lifenews . – Режим доступа: http://lifenews.ru/news/159855 (23.08.2015). 12. Волькенштейн, М. Общая биофизика / М. Волькенштейн // М.: Наука, 1978. – 590 с. 13. Гловер, Д. Клонирование ДНК. Методы /Д. Гловер // М.: Мир, 1988. – 538 с. 14. ГН 2.1.7.2041–06. Предельно допустимые концентрации (ПДК) химических веществ в почве. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2006. – 3 с. 15. Данилов, В.C. Сенсорные биолюминесцентные системы на основе luxоперонов разных видов люминесцентных бактерий / В.C. Данилов [и др.] // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 16, Биология. – 2002. – № 3. – С. 20–24. 16. Егоров, Н.С. Практикум по микробиологии / Н.С. Егоров. – М.: Изд-во МГУ, 1976. – 307 с. 17. Ерохин, П.С. Атомно-силовая микроскопия как инструмент определения чувствительности бактерий к факторам биотической и абиотической природы: автореф. дис. … канд. физ.-мат. наук: 03.01.02 / Ерохин Павел Сергеевич. – Саратов, 2015. – 23 с. 18. Забелина, О.Н. Оценка экологического состояния почвы городских рекреационных территорий на основании показателей биологической активности (на примере г. Владимира): автореф. дис. … канд. биол. наук: 03.02.08 / Забелина Ольга Николаевна. – Владимир, 2014. – 19 с. 125 19. Зенова, Г.М. Практикум по биологии почв: учеб. пособие / Г.М. Зенова, А.Л. Степанов, А.А. Лихачева, Н.А. Манучарова. – М.: Издательство МГУ, 2002. – 120 с. 20. Ившина, И.Б. Применение экологически безопасной экспресс- технологии очистки нефтезагрязненных почв и грунтов (на примере районов нефтедобычи Пермской области) / И.Б. Ившина, М.С. Куюкина, С.М. Костарев // Нефтяное хозяйство. – 2003. – № 9. – С. 116–119. 21. Кудряшева, Н.С. Физико-химические основы биолюминесцентного анализа: учеб.пособие / Н.С. Кудряшева, В.А. Кратасюк, Е.Н. Есимбекова. – Красноярск: Краснояр. гос. ун-т, 2002. – 154 с. 22. Кузнецова, М.В. Распространение нитрилконвертирующих бактерий в почвах Пермского края / М.В. Кузнецова, Г.В. Овечкина, А.Ю. Максимов, В.А. Демаков // Вестн. Перм. ун-та. Сер. Биология. – 2007. – Вып. 5(10). – С. 96–99. 23. Максимов, А.Ю. Биологическое разнообразие нитрил- метаболизирующих бактерий антропогенно-измененных почв Пермского края / А.Ю. Максимов [и др.] // Экология. – 2007. – № 3. – С. 1–6. 24. Методика определения токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод и отходов по изменению интенсивности бактериальной биолюминесценции тест-системой «Эколюм» на приборе «Биотокс -10». ПНД ФТ 14.1:2:3:4.11-04. 20 с. 25. Методические указания МУК 4.1.1206–03 «Газохроматографическое определение акрилонитрила, ацетонитрила, диметилформамида, диэтиламина и триэтиламина в воде». 8 с. 26. Методы почвенной микробиологии и биохимии: учеб. пособие / под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: изд-во МГУ, 1991. – 304 с. 27. Мынбаева, Б.Н. Микробная биоиндикация почв г. Алматы с помощью культуры Azotobacter / Б.Н. Мынбаева, А.А. Курманбаев, Н.В. Воронова // Фундаментальные исследования. – 2011. – № 6. – С. 206–209. 28. Нетрусов, А.И. Экология микроорганизмов / А.И. Нетрусов [и др.] – М.: Академия, 2004. – 272 с. 126 29. Никитин, Д.П. Окружающая среда и человек: учеб. издание / Д.П. Никитин, Ю.В. Новиков. – М.: Изд-во Высшая школа, 1986. – 416 с. 30. Определение токсичности воды и водных экстрактов из объектов окружающей среды по интенсивности биолюминесценции бактерий. Метод. рекомендации. 11с. 31. Панов, А.В. Влияние загрязнения почвы на состав микробного сообщества / А.В. Панов [и др.] // Микробиология. – 2013. – Т.82. – № 2. – С. 239– 246. 32. Патент на изобретение РФ № 2196822. Штамм бактерий Rhodococcus erythropolis – продуцент нитрилгидратазы / В.А. Демаков [и др.]. – №2001120750; заявл. 25.07.2001; опубл. 18.12.2003. 33. Петрова, С.Н. Перспективы использования методов молекулярногенетического анализа в почвенной экологии / С.Н. Петрова, Е.Е. Андронов, А.Г. Пинаев, Е.В. Першина // Вестник ОрелГАУ. – 2010. – № 5. – C. 45–48. 34. Плотникова, детоксикации стойких Е.Г. Использование органических бактерий-деструкторов загрязнителей для (полихлорированных бифенилов) / Е.Г. Плотникова, Д.О. Егорова, В.А. Демаков // Вестник Пермского научного центра. – 2011. – № 2. – С. 12–23. 35. Пожар на месте взрыва поезда с акрилонитрилом в Бельгии [Электронный ресурс]: – информационное агентство Daily news light. – Режим доступа: http://dailynewslight.ru/index.php?u=050520131405 (05.05.2013). 36. Приказ Минздрава СССР № 535 от 22 апреля 1985 г. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений. 37. Проблемы экологического эксперимента (планирование и анализ наблюдений) // Под. ред. чл.-корр. РАН Г.С. Розенберга, д.б.н. Д.Б. Гелашвили; сост. и комент. д.б.н. В.К. Шитикова. – Тольятти: Сам. НЦ РАН, 2008. – 274 с. 38. Ребриков, Д.В. ПЦР «в реальном времени» / Д.В. Ребриков [и др.]; под общ. ред. Д.В. Ребрикова. – 2-е изд., испр. и доп. – М.: БИНОМ. Лаборатория 127 знаний, 2009. – 223 с. 39. Рогачева, С.М. Респираторная Rhodococcus rhodochrous М8, активность продуцирующего микробных клеток акрилонитрил-гидролизующие ферменты / С.М. Рогачева, О.В. Игнатов // Прикл. биохим. микробиол. – 2001. – Т. 37. – № 3. – С. 326–331. 40. Теппер, Е.З. Практикум по микробиологии / Е.З. Теппер, В.К. Шильникова, Г.И. Переверзева. – М.: Дрофа, 2004. – 256 с. 41. Феофанов, А.В. Спектральная лазерная сканирующая конфокальная микроскопия в биологических исследованиях / А.В. Феофанов // Успехи биологической химии. – 2007. – Т. 47. – С. 371–410. 42. Шкопоров, А.Н. Влияние приема пробиотических бактерий рода Lactobacillus и Bifidobacterium на состав микрофлоры кишечника у здоровых людей / А.Н. Шкопоров [и др.] // Техника и технология пищевых производств. – 2014. – №1. – С. 126–130. 43. Abbas, Z. Effect of buctril super (bromoxynil) herbicide on soil microbial biomass and bacterial population / Z. Abbas, M. Akmal, K.S. Khan, F. Hassan // Braz. Arch. Biol. Technol. – 2014. – V. 57. – №.1. – P. 9–14. 44. Arai, H. Regulation and function of versatile aerobic and anaerobic respiratory metabolism in Pseudomonas aeruginosa / H. Arai // Front. Microbiol. – 2011. – V. 2. – Р. 103. 45. Asano, Y. A new enzymatic method of acrylamide production / Y. Asano, T. Yasuda, Y. Tani, H. Yamada // Agric. Biol. Chem. – 1982. – V. 46. – P. 1183–1189. 46. Asano, Y. A new enzyme ‘nitrile hydratase’ which degrade acetonitrile in combination with amidase / Y. Asano, Y. Tani, H. Yamada // Agric. Biol. Chem. – 1980. – V. 44. – P. 2251–2252. 47. Asano, Y. Fungal degradation of triacrylonitrile / Y. Asano [et al.] // Agric. Biol. Chem. – 1981. – V. 45. – P. 57–62. 48. Asano, Y. Studies on the synthesis of amides and amino acids by a novel microbial enzymes / Y. Asano // Nippon Nogeikagaku Kaishi. – 1991. – V. 65. – P. 1617–1626. 128 49. Asano, Y. Z-Phenylacetaldoxime degradation by a novel aldoxime dehydratase from Bacillus sp. strain OxB-1 / Y. Asano, Y. Kato // FEMS Microbiol. Lett. – 1998. – V. 158. – P. 185-190. 50. Ascher, J. Sequential extraction and genetic fingerprinting of a forest soil metagenome / J. Ascher [et al.] // Applied Soil Ecology. – 2009. – V. 42. – P. 176–181. 51. Banerjee, A. The nitrile-degrading enzymes: current status and future prospects / A. Banerjee, R. Sharma, U.C. Banerjee // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2002. – V. 60. – P. 33–44. 52. Barbe, V. Unique features revealed by the genome sequence of Acinetobacter sp. ADP1, a versatile and naturally transformation competent bacterium / V. Barbe [et al.] // Nucleic. Acids. Res. – 2004. – V. 32. – P. 5766–5779. 53. Bauer, R. Enantioselective hydrolysis of racemic 2-phenylpropionitrile and other (R, S)-2-arylpropionitriles by a new bacterial isolate, Agrobacterium tumefaciens strain d3 / R. Bauer [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1994. – V. 42. – Р. 1–7. 54. Baxter, J. The degradation of the herbicide bromoxynil and its impact on bacterial diversity in a top soil / J. Baxter, S.P. Cummings // Journal of Applied Microbiology. – 2008. – V. 104. – P. 1605–1616. 55. Baxter, J. The impact of acrylonitrile and bioaugmentation on the biodegradation activity and bacterial community structure of a topsoil / J. Baxter, N.G. Garton, S.P. Cummings // Folia microbiol. – 2006. – V. 51. – №6. – P. 591–597. 56. Bernard, P.S. Real-time PCR technology for cancer diagnostics / P.S. Bernard, C.T. Wittwer // Clinical chemistry. – 2002. – V. 48. – P. 1178–1185. 57. Bestwick, L.A. Purification and characterization of nitrilase from Brassica nupus / L.A. Bestwick [et al.] // Phisiol. Plant. – 1993. – V. 89. – P. 611–816. 58. Bowers, R.M. Sources of bacteria in outdoor air across cities in the midwestern United States / R.M. Bowers [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2011. – V. 77. – P. 6350–6356. 59. Brandao, P.F.B. Discrimination and taxonomy of geographically diverse strains of nitrile-metabolising actinomycetes using chemometric and molecular 129 sequencing techniques / P.F.B. Brandao, J.P. Clapp, A.T. Bull // Environ. Microbiol. – 2002. – V. 4. – P. 262–276. 60. Caporaso, J. The Western English Channel contains a persistent microbial seed bank / J. Caporaso [et al.] // ISME J. – 2011. – V. 6. – P. 1089–1093. 61. Cipollone, R. Involvement of Pseudomonas aeruginosa rhodanese in protection from cyanide toxicity / R. Cipollone [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2007. – V. 73. – Р. 390–398. 62. Cody, W.L. Pseudomonas aeruginosa AlgR controls cyanide production in an AlgZ dependent manner / W.L. Cody [et al.] // J. Bacteriol. – 2009. – V. 191. – Р. 2993–3002. 63. Coffey, L. Real-time PCR detection of Fe-type nitrile hydratase genes from environmental isolates suggests horizontal gene transfer between multiple genera / L. Coffey [et al.] // Antonie van Leeuwenhoek. – 2010. – V. 98. – P.455–463. 64. Colquhoun, J.A. Taxonomy and biotransformation activities of some deepsea actinomycetes / J.A. Colquhoun [et al.] // Extremophiles. – 1998. – V. 2. – P. 269–277. 65. Cowan, D. Biochemistry and biotechnology of mesophilic and thermophilic nitrile metabolizing enzymes / D. Cowan [et al.] // Extremophiles. – 1998. – V. 2. – № 3. – P. 207–216. 66. Cramp, R.A. Molecular characterization of a novel thermophilic nitrile hydratase / R.A. Cramp, D.A. Cowan // Biochem. Biophys. Acta. – 1999. – V. 1431. – Р. 249–260. 67. Crossby, J. Regioselective hydrolysis of aromatic dinitriles using a whole cell catalyst / J. Crossby, J. Moilliet, J.S. Parratt, N.J. Turner // J. Chem. Soc. Perkin. Trans. – 1994. – V. 1. – P. 1679–1687. 68. Daniel, R. The metagenomics of soil / R. Daniel // Nature reviews. Microbiology. – 2005. – V. 3. – P. 470–478. 69. Dempsey, E. Detection of five common CFTR mutations by rapid-cycle realtime amplication refractory mutation system PCR / E. Dempsey, D. Barton, F. Ryan // Clinical Chemistry. – 2004. – V. 50. – №4. – P. 772–775. 130 70. Duran, R. Characterisation of nitrile hydratase genes cloned by DNA screening from Rhodococcus erythropolis / R. Duran , M. Nishiyama, S. Horinouchi, T. Beppu // Biosci. Biotechnol. Biochem. – 1993. – V. 57. – P. 1323–1328. 71. Fierer, N. Assessment of soil microbial community structure by use of taxonspecific quantitative PCR assays / N. Fierer, J.A. Jackson, R. Vilgalys, R.B. Jackson // Appl. Environ. Microbiol. – 2005. – V.71. – P. 4117–4120. 72. Fierer, N. Comparative metagenomic, phylogenetic and physiological analyses of soil microbial communities across nitrogen gradients / N. Fierer [et al.] // ISME J. – 2011. – V. 6. – P. 1007–1017. 73. Fierer, N. Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes / N. Fierer [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2012. – V. 109. – P. 21390–21395. 74. Frangipani, E. A novel cyanide-inducible gene cluster helps protect Pseudomonas aeruginosa from cyanide / E. Frangipani [et al.] // Environ. Microbiol. – 2014. – V. 6. – Р. 28–34. 75. Frisli, T. Estimation of metagenome size and structure in an experimental soil microbiota from low coverage nextgeneration sequence data / T. Frisli [et al.] // J. Appl. Microbiol. – 2013. – V. 114. – P. 141–151. 76. Gaibani, P. Development of a broad-range 23S rDNA real-time PCR assay for the detection and quantification of pathogenic bacteria in human whole blood and plasma specimens / P. Gaibani [et al.] // BioMed Res. Int. – 2013. – V. 2013. – P. 1–8. 77. Gentili, V. Panbacterial real-time PCR to evaluate bacterial burden in chronic wounds treated with Cutimed™ Sorbact™ / V. Gentili [et al.] // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. – 2011. – V. 31. – № 7. – P. 1523–1529. 78. Grantham, R. Amino acid difference formula to help explain protein evolution / R. Grantham // Science. – 1974. – V. 185. – P. 862–864. 79. Green, S.J. Denitrifying bacteria from the genus Rhodanobacter dominate bacterial communities in the highly contaminated subsurface of a nuclear legacy waste site / S.J. Green [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2012. – V. 78. – P. 1039–1047. 80. Handelsman, J. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil 131 microbes: a new frontier for natural products / J. Handelsman [et al.] // Chem. Biol. – 1998. – V. 5. – Р. 245–249. 81. Harper, D.B. Identification of isobutyronitrile and isobutyraldoxime Omethyl ether as volatile microbial catabolites of valine / D.B. Harper, P.A. Gibbs // Biochem. J. – 1979. – V. 182. – P. 609–611. 82. Hashimoto, Y. Development of a host-vector system in a Rhodococcus strain and its use for expression of the cloned nitrile hydratase gene cluster / Y. Hashimoto [et al.] // J. Gen. Microbiol. – 1992. – V. 138. – P. 1003–1010. 83. Hashimoto, Y. Nitrile pathway involving acyl-CoA synthetase: overall metabolic gene organization, and purification and characterization of the enzyme / Y. Hashimoto [et al.] // J. Biol. Chem. – 2005. – V. 280. – P. 8660–8667. 84. Hassink, J. Relationship between habitable pore space, soil biota, and mineralization rates in grassland soils / J. Hassink, L.A. Bouwman, K.B. Zwart, L. Brussaard // Soil. Biol. Biochem. – 1993. – V. 25. – Р. 47–55. 85. Heald, S.C. Physiology, biochemistry and taxonomy of deep-sea nitrile metabolising Rhodococcus strains / S.C. Heald, P.F.B. Brandao, R. Hardicre, A.T. Bull // Antonie Leeuwenhoek. – 2001. – V. 80. – P. 169–183 86. Herrera, A. Exploring microbial diversity in volcanic environments: A review of methods in DNA extraction / A. Herrera, C.S. Cockell // J. of Microbiol. Methods. – 2007. – V. 70. – P. 1–12. 87. Higuchi, R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions / R. Higuchi, C. Fockler, G. Dollinger, R. Watson // Biotechnology. – 1993. – V. 11. – P. 1026–1030. 88. Holtze, M.S. Microbial degradation of the benzonitrile herbicides dichlobenil, bromoxynil and ioxynil in soil and subsurface environments–insights into degradation pathways, persistent metabolites and involved degrader organism / M.S. Holtze, S.R. Sorensen, J. Sorensen, J. Aamand // Environ. Pollut. – 2008. – V. 154. – №2. – P. 155–158. 89. Hoppener-Ogawa, S. Specific detection and real-time PCR quantification of potentially mycophagous bacteria belonging to the genus Collimonas in different soil 132 ecosystems / S. Hoppener-Ogawa [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2007. – V. 73. – P. 4191–4197. 90. Ikehata, O. Primary structure of nitrile hydratase deduced from the nucleotide sequence Rhodococcus species and its expression in Esherichia coli / O. Ikehata, M. Nishiyama, S. Horinouchi, T. Berru // Biochem. – 1989. – V. 181. – P. 563– 570. 91. Jia, X. Comparisons of extraction and purification methods of soil microorganism DNA from rhizosphere soil / X. Jia, S. Han, Y. Zhao, Y. Zhou // Journal of Forestry Research. – 2006. – V. 17. – P. 31–34. 92. Kaiser, K. Correlation of Vibrio fischeri bacteria test data with bioassay data for other organisms / K. Kaiser // Environmental Health Perspective. – 1998. – V. 106. – P. 583–591. 93. Kakeya, H. Microbial hydrolysis as a potent method for the preparation of optically active nitriles, amides and carboxylic acids / H. Kakeya, N. Sakai, T. Sugai, H. Ohta // Tetrahedron. Lett. – 1991. – V. 32. – P. 1343–1346. 94. Kato, Y. A new enzymatic method of nitrile synthesis by Rhodococcus sp. strain YH3-3. J / Y. Kato, R. Ooi, Y. Asano // Mol. Catal. B Enzymatic. – 1999. – V. 6. – P. 249–256. 95. Kato, Y. A novel heme-containing lyase, phenylacetaldoxime dehydratase from Bacillus sp. strain OxB-1: purification, characterization, and molecular cloning of the gene / Y. Kato [et al.] // Biochemistry. – 2000. – V. 39. – P. 800–809. 96. Kato, Y. Aldoxime dehydratase co-existing with nitrile hydratase and amidase in the iron-type nitrile hydratase-producer Rhodococcus sp. N-771 / Y. Kato, S. Yoshida, S-X. Xie, Y. Asano // J. Biosci. Bioeng. – 2004. – V. 97. – P. 250–259. 97. Kato, Y. Distribution of aldoxime dehydratase in microorganisms / Y. Kato, R. Ooi, Y. Asano // Appl. Environ. Microbiol. – 2000. – V. 66. – P. 2290–2296. 98. Kato, Y. High level expression of a novel FMN-dependent heme-containing lyase, phenilacetaldoxime dehydratase of Bacillus sp. strain OxB-1, in heterologus hosts / Y. Kato, Y. Asano // Protein Exp. Purif. – 2003. – V. 28. – P. 131–139. 133 99. Kato, Y. Isolation and characterization of a bacterium possessing a novel aldoxime-dehydration activity and nitrile-degrading enzymes / Y. Kato, R. Ooi, Y. Asano // Arch. Microbiol. – 1998. – V. 170. – P. 85–90. 100. Kato, Y. Molecular and enzymatic analysis of the “aldoxime-nitrile pathway” in the glutaronitrile degrader Pseudomonas sp. K-9 / Y. Kato, Y. Asano // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2006. – V. 70. – P. 92–101. 101. Kato, Y. Nitrile hydratase involved in aldoxime metabolism from Rhodococcus sp. strain YH3-3 purification and characterization / Y. Kato, T. Tsuda, Y. Asano // Eur. J. Biochem. – 1999. – V. 2639. – Р. 662–670. 102. Kim, S. Cloning and expression of the nitrile hydratase and amidase genes from Bacillus sp. BR449 into Escherichia coli / S. Kim, P. Oriel // Enzyme Microb. Technol. – 2000. – V. 27. – № 7. – Р. 492–501. 103. Kobayashi, M. Characterization and distribution of IS1164 that exists in the high molecular mass nitrile hydratase gene cluster of the industrial microbe Rhodococcus rhodochrous J1/ M. Kobayashi [et al.] // Proc. Jpn. Acad. – 1997. – V. 73. – P. 104–108. 104. Kobayashi, M. Cloning, nucleotide sequence and expression in Escherichia coli of two cobalt­containing nitrile hydratase genes from Rhodococcus rhodochrous J1 / M. Kobayashi [et al.] // Biochim. Biophys. Acta. – 1991. – V. 1129. – P. 23–33. 105. Kobayashi, M. Enzymatic synthesis of acrylamide: a success story not yet over… / M. Kobayashi, T. Nagasawa, H. Yamada // Trends Bioechnol. – 1992. – V. 10. – P. 402–408. 106. Kobayashi, M. Nitrilase of Rhodococcus rhodochrous J1. Purification and characterization / M. Kobayashi, T. Nagasawa, H. Yamada // Eur. J. Biochem. – 1989. – V. 182. – № 2. – Р. 349–356. 107. Kobayashi, M. Nitrile hydralases / M. Kobayashi, S. Shimizu // Curr. Opin. Chem. Biol. – 2000. – V. 4. – P. 95–102. 108. Kobayashi, M. The catalytic mechanism of amidase also involves nitrile hydrolysis / M. Kobayashi, M. Goda, S. Shimizu // FEBS Lett. – 1998. – V. 439. – № 3. – Р. 325–328. 134 109. Kolb, S. Quantitative detection of methanotroрhs in soil by novel рmoAtarget real-time РCR assays / S. Kolb, C. Knief, S. Stubner, R. Conrad // Appl. Environ. Microbiol. – 2003. – V.69. – P. 2423–2429. 110. Komeda, H. A novel gene cluster including the Rhodococcus rhodochrous J1 nhlBA genes encoding a low molecular mass nitrile hydratase (LNHase) induced by its reaction product / H. Komeda, M. Kobayashi, S. Shimizu // J. Biol. Chem. – 1996a. – V. 271. – P. 15796–15802. 111. Komeda, H. Characterization of the gene cluster of high-molecular-masse nitrile hydratase induced by its reaction product in Rhodococcus rhodochrous J1 / H. Komeda, M. Kobayashi, S. Shimizu // Appl. Biol. Sci. – 1996b. – V. 93. – P. 4267– 4272. 112. Kuczynski, J. Experimental and analytical tools for studying the human microbiome / J. Kuczynski [et al.] // Nat. Rev. Genet. – 2011. – V. 13. – P. 47–58. 113. Kurvet, I. LuxCDABE – transformed constitutively bioluminescent Escherichia coli for toxicity screening: comparison with naturally luminous Vibrio fischeri / I. Kurvet [et al.] // Sensors. – 2011. – V. 11. – P. 7865–7878. 114. Kuyukina, M.S. Assessment of bacterial resistance to organic solvents using a combined confocal laser scanning and atomic force microscopy (CLSM/AFM) / M.S. Kuyukina, I.B. Ivshina, I.O. Korshunova, E.V. Rubtsova // Journal of Microbiological Methods. – 2014. – V. 107. – P. 23–29. 115. Langdahl, B.R. Nitrile hydrolysis by Rhodococcus erythropolis BL1, an acetonitrile-tolerant strain isolated from a marine sediment / B.R. Langdahl, P. Bisp, K. Ingvorsen // Microbiology. – 1996. – V. 142. – P. 145–154. 116. Layh, N. Enrichment strategies for nitrile-hydrolysing bacteria / N. Layh, B. Hirrlinger, A. Stolz, H.-J. Knackmuss // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1997. – V. 47. – P. 668–674. 117. Layh, N. Enzymatic nitrile hydrolysis in low water systems / N. Layh, A. Willets // Biotechnol. Lett. – 1998. – V. 20. – P. 329–331. 135 118. Legras, J.L. Natural nitriles and their metabolism / J.L. Legras, G. Chuzel, A. Arnaud, P. Galzy // World Journal of Microbiology and Biotechnology. – 1990. – V. 6. – P. 83–108. 119. Liu, J. The role of nitrogenase in a cyanide degrading Klebsiella oxytoca strain / J. Liu, C. Liu, C. Lin // Proc. Natl. Sci. Count. Repub. China. – 1997. – V. 21. – P. 37–42. 120. Liu, Y. Strategy for successful expression of the Pseudomonas putida nitrile hydratase activator P14K in Escherichia coli / Y. Liu [et al.] // BMC Biotechnol. – 2013. – V. 13. – P. 48–54. 121. Lorenco, P.M.L. Searching for nitrile hydratase using the consensusdegenerate hybrid oligonucleotide primers strategy / P.M.L. Lorenco [et al.] // J. Basic Microbiol. – 2004. – V.44. – P. 203–214. 122. Lu, J. Motif CXCC in nitrile hydratase activator is critical for NHase biogenesis in vivo / J. Lu [et al.] // FEBS Lett. – 2003. – V. 553. – P. 391–396. 123. Luque-Almagro, V.M. Bacterial degradation of cyanide and its metal complexes under alkaline conditions / V.M. Luque-Almagro, M.J. Huertas, M. Martínez-Luque, C. Moreno-Vivián // Applied and environmental microbiology. – 2005. – V. 71. – №2. –P. 940–947. 124. Mahadevan, S. Role of oximes in nitrogen metabolism in plants / S. Mahadevan // Annu. Rev. Plant Physiol. – 1973. – V. 24. – P. 69–88. 125. Marron, A.O. Nitrile hydratase genes are present in multiple eukaryotic supergroups / A.O. Marron, M. Akam, G. Walk // PLoS ONE. – 2012. – V. 7. – P. 1– 10. 126. Martinkova´, L. Catabolism of nitriles in Rhodococcus / L. Martinkova´ [et al.] // Microbiology. – 2010. – V. 16. – P. 171–206. 127. Martinkova´, L. Isolation of acetonitrile-utilising bacteria / L. Martinkova´ [et al.] // Folia Microbiol. – 1992. – V. 37. – P. 372–376. 128. Mukram, I. Isolation and identification of a nitrile hydrolyzing bacterium and simultaneous utilization of aromatic and aliphatic nitriles / I. Mukram [et al.] // International Biodeterioration and Biodegradation. – 2015. – V. 100. – P. 165–171. 136 129. Nagasawa, T. Nitrile hydratase of Pseudomonas chlororaphis B23 – Purification and characterization / T. Nagasawa [et al.] // Eur. J. Biochem. – 1987. – V. 162. – P. 691–698. 130. Nagasawa, T. Nitrile hydratase-catalyzed production of nicotinamide from 3-cyanopyridine in Rhodococcus rhodochrous J1 / T. Nagasawa, C.D. Mathew, J. Mauger, H. Yamada // Appl. Environ. Microbiol. – 1988. – V. 54. – P. 1766–1769. 131. Nagasawa, T. Superiority of Pseudomonas chlororaphis B23 nitrile hydratase as a catalyst for the enzymatic production of acrylamide / T. Nagasawa, K. Ryuno, H. Yamada // Experientia. – 1989. – V. 45. – P. 1066–1070. 132. Nakasako, M. Tertiary and quaternary structures of photoreactive Fe-type nitrile hydratase from Rhodococcus sp. N-771: roles of hydration water molecules in stabilizing the structures and the structural origin of the substrate specificity of the enzyme / M. Nakasako [et al.] // Biochemistry. – 1999. – V. 38. – P. 9887–9898. 133. Narayanasamy, K. Utilization of acrylonitrile by bacteria isolated from petrochemical wastewaters / K. Narayanasamy, S. Shukla, L.J. Parekh // Indian J. Exp. Biol. – 1990. – V. 28. – P. 968–971. 134. Nawas, M.S. Metabolism of acrylonitrile by Klebsiella pneumoniae / M.S. Nawas [et al.] // Arch. Microbiol. – 1991. – V. 156. – P. 231–238. 135. Nikiyan, H. AFM investigations of various disturbing factors on bacterial cells / H. Nikiyan, A. Vasilchenko, D. Deryabin // Microscopy: science, technology, applications and education (Microscopy book series – ISBN (13). 978-84-614-6189-9). – 2010. – V. 1. – №4. – P. 523–529. 136. Nishiyama, M. Cloning and characterization of genes resрonsible for metabolism of nitrile compounds from Pseudomonas chlororaphis B23 / M. Nishiyama [et al.] // J. Bacteriol. – 1991. – V. 173. – P. 2465–2472. 137. Oinuma, K. Novel aldoxime dehydratase involved in carbon-nitrogen triple bond synthesis of Pseudomonas chlororaphis B23. Sequencing, gene expression, purification, and characterization / K. Oinuma [et al.] // J. Biol. Chem. – 2003. – V. 278. – P. 29600–29608. 137 138. Okamoto, S. AnhE, a metallochaperone involved in the maturation of a cobalt-dependent nitrile hydratase / S. Okamoto, F. Van Petegem, M.A. Patrauchan, L.D. Eltis // J. Biol. Chem. – 2010. – V. 285. – P. 25126–25133. 139. Okamoto, S. Рurification and characterization of a novel nitrile hydratase from Rhodococcus sр. RHA 1 / S. Okamoto, L.D. Eltis // Mol. Microbiol. – 2007. – V. 65. – Р. 828–838. 140. Okano, Y. Aррlication of real-time РCR to sudy effects of ammonium on рoрulation size of ammonia-oxidizing bacteria in soil / Y. Okano [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2004. – V.70. – P. 1008–1016. 141. Palma, P. Evaluation of surface water quality using an ecotohicological approach: a case study of the Alqueva Reservoir (Portugal) / P. Palma [et al.] // Environ. Sci. Pollut. Res. Int. – 2010. – V. 3. – P. 703–716. 142. Pampulha, M.E. Impact of an herbicide combination of bromoxynil and prosulfuron on soil microorganisms / M.E. Pampulha, A. Oliveira // Current Microbiol. – 2006. – V. 53. – P. 238–243. 143. Pandard, P. Selecting a battery of bioassays for ecotoxilogical characterization of wastes / P. Pandard [et al.] // Sci. Total Environ. – 2006. – V. 363. – P. 114–125. 144. Paul, E.A. Soil microbiology and biochemistry / E.A. Paul, F.E. Clark. – San Diego.: Academic Press, 1989. – 273 p. 145. Pereira, R.A. A novel thermostable nitrile hydratase / R.A. Pereira, D. Graham, F.A. Rainey, D.A. Cowan // Extremophiles. – 1998. – V. 2. – P. 347–357. 146. Pessi, G. Cyanogenesis in The Pseudomonads / G. Pessi, D. Haas // New York, USA: Kluwer Academic/Plenum Publishers. – 2004. – V. 3. – P. 671–686. 147. Pessi, G. Transcriptional control of the hydrogen cyanide biosynthetic genes hcnABC by the anaerobic regulator ANR and the quorum-sensing regulators LasR and RhlR in Pseudomonas aeruginosa / G. Pessi, D. Haas // J. Bacteriol. – 2000. – V. 182. – Р. 6940–6949. 138 148. Petric, I. Inter-laboratory evaluation of the ISO standard 11063 «Soil quality – Method to directly extract DNA from soil samples» / I. Petric [et al.] // J. of Microbiol. Methods. – 2011. – V. 84. – P. 454–460. 149. Piersma, S.R. Arginine 56 mutation in the beta subunit of nitrile hydratase: importance of hydrogen bonding to the non-heme iron center / S.R. Piersma [et al.] // J. Inorg. Biochem. – 2000. – V. 80. – P. 283–288. 150. Prasad, S. Nitrile hydratases (NHases): At the interface of academia and industry / S. Prasad, T.C. Bhalla // Biotechnology Advances. – 2010. – V. 28. – P. 725– 741. 151. Prasad, S. Optimization of culture conditions for hyper production of nitrile hydratase of Rhodococcus rhodochrous PA-34 / S. Prasad, J. Raj, T.C. Bhalla // Indian J. Microbiol. – 2004. – V. 44. – P. 251–256. 152. Precigou, S. Rhodococcus pyridinovorans MW3, a bacterium producing a nitrile hydratase / S. Precigou [et al.] // Biotechnol. Lett. – 2004. – V. 26. – P. 1379–84. 153. Prepechalova, I. Purification and characterization of the enantioselective nitrile hydratase from Rhodococcus equi A4 / I. Prepechalova [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2001. – V. 55. – P. 150–156. 154. Raj, J. Rhodococcus rhodochrous PA-34: a potential biocatalyst for acrylamide synthesis / J. Raj, S. Prasad, T.C. Bhalla // Proc. Biochem. – 2006. – V. 41. – № 6. – P. 1359–1363. 155. Rao, P. Bhattacharya acute toxicity of some synthetic cyanogens in rats: Time-dependent cyanide generation and cytochrome oxidase inhibition in soft tissues after sub-lethal oral intoxication / P. Rao [et al.] // Food and Chemical Toxicology. – 2013. – V. 59. – P. 595–609. 156. Reinnicke, S. C and N isotope fractionation during biodegradation of the pesticide metabolite 2,6-dichlorobenzamide (BAM): potential for environmental assessments / S. Reinnicke [et al.] // Environ. Sci. Technol. – 2012. – V. 46. – P. 1447−1454. 139 157. Rucka´, L. Expression control of nitrile hydratase and amidase genes in Rhodococcus erythropolis and substrate specificities of the enzymes / L. Rucka´ [et al.] // Antonie van Leeuwenhoek. – 2014. – V. 105. – P. 1179–1190. 158. Sakashita, T. Transcriptional regulation of the nitrile hydratase gene cluster in Pseudomonas chlororaphis B23 / T. Sakashita, Y. Hashimoto, K-I. Oinuma, M. Kobayashi // J. Bacteriol. – 2008. – V.190. – P. 4210–4217. 159. Salipante, S.J. Rapid 16S rRNA next-generation sequencing of polymicrobial clinical samples for diagnosis of complex bacterial infections / S.J. Salipante [et al.] // PLoS ONE. – 2013. – V. 8. – P. 1–13. 160. Sawyer, D.T. Base (O-2, e-, OH-­) inducer autoxygenation of organic substrates: a model chemical system for cytochrome P-450-catalyzed monoxygenation and dehydrogenation by dioxygen / D.T. Sawyer, H. Sugimoto, T.S. Calderwood // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1984. – V. 81. – P. 8025–8027. 161. Schlaberg, R. A systematic approach for discovering novel, clinically relevant bacteria / R. Schlaberg, K.E. Simmon, M.A. Fisher // Emerg. Infect. Dis. – 2012. – V. 18. – P. 422–430. 162. Sharma, M. Amidases: versatile enzymes in nature / M. Sharma, N.N. Sharma, T.C. Bhalla // Rev. Environ. Sci. Biotechnol. – 2009. – V. 8. – Р. 343–366. 163. Shendure, J. Next-generation DNA sequencing / J. Shendure, H. Ji // Nat. Biotechnol. – 2008. – V. 26. – P. 1135–1145. 164. Sibbesen, O. Biosynthesis of cyanogenic glucosides. Elucidation of the pathway and characterization of the cytochrome P-450 involved in amino acids and their derivatives in higher plants / O. Sibbesen, B. Koch, P. Rouze // Wallsgrove R.M. (ed.). Cambridge: University Press. – 1995. – P. 227–241. 165. Sneath, P.H.A. Relations between chemical structure and biological activity in peptides / P.H.A. Sneath // J. Theoret. Biol. – 1966. – V. 12. – P. 157–195. 166. Solomons, L.P. Cyanide as a metabolic inhibitor / L.P. Solomons [et al.] // In Cyanide in Biology. London, UK: Academic. – P. 11–28. 140 167. Stoderegger, K.E. Dynamics in bacterial cell surface properties assessed by fluorescent stains and confocal laser scanning microscopy / K.E. Stoderegger, G.J. Hernd // Aquat. Microb. Ecol. – 2004. – V. 36. – P. 29–40. 168. Stone, G.G. Detection of Salmonella serovars from clinical samples by enrichment broth cultivation-PCR procedure / G.G. Stone [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 1994. – V. 32. – P. 1742–1749. 169. Takarada, H. Mutational study on α-Gln90 of Fe-type nitrile hydratase from Rhodococcus sp. N-771 / H. Takarada [et al.] // Bioscience, biotechnology and biochemistry. – 2006. – V. 70. – P. 881-889. 170. Takashima, Y. Factors affecting the production of nitrile hydratase by thermophilic Bacillus smithii SC-J05-1 / Y. Takashima, T. Kawabe, S. Mitsuda // J. Biosci. Bioeng. – 2000. – V. 89. – Р. 282–284. 171. Tang, H. Universal evolutionary index for amino acid changes / H. Tang [et al.] // Mol. Biol. Evol. – 2004. – V. 21. – P. 1548–1556. 172. Thakuria, D. Importance of DNA quality in comparative soil microbial community structure analyses / D. Thakuria [et al.] // Soil Biology and Biochemistry. – 2008. – V. 40. – P. 1390–1403. 173. Thomas, L. Antimicrobial activity of chlorhexidine diacetate and benzalkonium chloride against Pseudomonas aeruginosa and its response to biocide residues / L. Thomas, A.D. Russell, J.-Y. Maillard // J. Appl. Microbiol. – 2005. – V. 98. – P. 533–43. 174. Turton, J.F. Detection and typing of integrons in epidemic strains of Acinetobacter baumannii found in the United Kingdom / J.F. Turton [et al.] // J. Clinical. Microbiol. – 2005. – V. 43. – Р. 3074–3082. 175. Verma, V. Screening, isolation and identification of nitrilase producing bacteria from soil / V. Verma, P. Sangave // IJPSR. – 2015. – V. 6. – P. 1950-1957. 176. Vesela´, A.B. Hydrolysis of benzonitrile herbicides by soil actinobacteria and metabolite toxicity / A.B. Vesela´ [et al.] // Biodegradation. – 2010. – V. 21. – P. 761–770. 141 177. Vosahlova, J. Degradation of bromoxynil, ioxynil and dichlobenil and their mixtures by Agrobacterium radiobacter 8/4 / J. Vosahlova, L. Pavlu, J. Vosahlo, V. Brenner // Plastic. Sci. – 1997. – V. 49. – P. 303–306. 178. Wang, M-X. Enantioselective biotransformation of nitriles in organic synthesis / M-X. Wang // Topics Catal. – 2005. – V. 35. – P. 117–130. 179. Watanabe, I. Screening, isolation and taxonomical properties of microorganisms having acrylonitrile-hydrating activity / I. Watanabe , Y. Satoh, K. Enomoto // Agric. Biol. Chem. – 1987. – V. 51. – P. 3193–3199. 180. Whiteley, A.S. Microbial 16S rRNA Ion Tag and community metagenome sequencing using the Ion Torrent (PGM) Platform / A.S. Whiteley [et al.] // J. of Microbiol. Methods. – 2012. – V. 91. – P. 80–88. 181. Widmer, F.A. Highly selective PCR protocol for detecting 16S rRNA genes of the genus Pseudomonas ( ensu Stricto) in environmental samples / F.A. Widmer [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 1998. – V. 64. – P. 2545–2553. 182. Williams, H.D. Oxygen, cyanide and energy generation in the cystic fibrosis pathogen Pseudomonas aeruginosa / H.D. Williams, J.E. Zlosnik, B. Ryall // Adv. Microb. Physiol. – 2007. – V. 52. – Р. 1–71. 183. Wu, S. Over-production of stereoselective nitrile hydratase from Pseudomonas putida 5B in Escherichia coli: activity requires a novel downstream protein / S. Wu, R.D. Fallon, M.S. Payne // J. Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1997. – V. 48. – P. 704–708. 184. Wyatt, J.M. Microbial degradation of acrylonitrile waste effluents: the degradation of effluents and condensates from the manufacture of acrylonitrile / J.M. Wyatt, C.J. Knowles // Int. Biodeterior Biodegrad. – 1995. – V. 35. – P. 227–248. 185. Xie, S.X. A novel gene cluster responsible for alkylaldoxime metabolism coexisting with nitrile hydratase and amidase in Rhodococcus globerulus A-4 / S.X. Xie [et al.] // Biochemistry. – 2003. – V. 42. – P. 12056–12066. 186. Yamada, H. Nitrile hydratase and its application to industrial production of acrylamide / H. Yamada, M. Kobayashi // Biosci. Biotechnol. Biochem. – 1996. – V. 60. – Р. 1391–1400. 142 187. Yamada, H. Optimum culture conditions for production by Pseudomonas chlororaphis B23 of nitrile hydratase / H. Yamada [et al.] // Agric. Biol. Chem. – 1986. – V. 50. – P. 2859–2865. 188. Yamaki, T. Cloning and sequencing of a nitrile hydratase gene from Pseudonocardia thermophila JCM 3095 / T. Yamaki, T. Oikawa, I.K. Nakamura // J. Ferment. Bioeng. – 1997. – V. 83. – Р. 474–477. 189. Yanenko, A.S. Regulation of nitrile utilization in Rhodococcus / A.S. Yanenko [et al.] // Biotechnologia. – 1995. – № 7-8. – P. 139–144. 190. Zhou, Z. Discovery of posttranslational maturation by self-subunit swapping / Z. Zhou, Y. Hashimoto, K. Shiraki, M. Kobayashi // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2008. – V. 105. – P. 14849–14854. 143 ПРИЛОЖЕНИЯ Приложение 1 Общее содержание гетеротрофных бактерий в почвенных образцах Образец Образец С2 Общее микробное число, КОЕ/г сух. веса 2,17×1010 Образец К1 Общее микробное число, КОЕ/г сух. веса 1,58×107 К24 Общее микробное число, КОЕ/г сух. веса 1,60×108 С3 1,5×108 К2 1,08×108 К25 3,59×106 С6 1,15×109 К3 1,17×106 К26 6,90×107 ризосфера К4 1,48×108 К27 7,73×106 П25 8,79×107 2,67×106 К5 8,38×107 К28 1,28×107 П26 2,17×1010 К6 1,73×108 К29 1,25×106 П27 3,18×107 К7 7,33×107 К30 1,87×107 НС 4,07×108 К8 4,12×106 К31 2,28×107 НО 8,79×107 К9 3,77×107 К32 1,38×107 ПО 6,47×107 К10 4,87×107 К33 9,33×106 С1 2,68×109 К11 1,27×107 К34 1,73×107 Х1 1,44×109 К12 6,96×106 К35 1,03×109 Х2 1,08×109 К13 2,23×107 К36 2,40×106 ЗМУ(грядка) 2,14×108 К14 5,27×107 К37 3,48×107 ЗМУ(флора) 4,58×108 К15 2,40×107 К38 1,72×107 РЦ 5,44×107 К16 3,83×105 К39 1,72×1010 ЭЦ 7,43×107 К17 2,80×107 К40 7,25×107 ТГК 1,43×108 К18 1,09×107 К41 8,67×106 О1-2 1,24×109 К20 7,22×106 С 8,98×108 К21 7,17×106 ДО 4,01×108 К22 4,13×107 ДонО 1,34×108 К23 1,50×107 почвы почвы почвы Примечание: образцы К1-К41 отобраны на территории г. Кудымкара сотрудниками группы физико-химических исследований ИЭГМ УрО РАН. 144 Приложение 2 Последовательность аминокислот нитрилгидратаз почвенных штаммов α-субъединица K17Р 31 41 51 61 71 81 91 101 111 DGKGLVPDGY VEGWKKTFEE DFSPRRGAEL VARAWTDPDF RQLLLTDGTA AVAQYGYLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI Б2-4 YLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI Б4-3 DGKGLVPDGY VEGWKKTFEE DFSPRRGAEL VARAWTDPEF RQLLLTDGTA AVAQYGYLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI Б4-4 DGKGLVPDGY VEGWKKTFEE DFSPRRGAEL VARAWTDPDF RQLLLTDGTA AVAQSGYLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI 2 DGKGLVPDGY VEGWKKTFEE DFSPRRGAEL VARAWTDPEF RQLLLTDGTA AVAQYGYLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI 3213 DGKGLVPDGY VEGWKKTLEE DFSPRRGAEL VARAWTDPDF RQLLLTDGTA AVAQYGYLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI П1 DGKGLVPDGY VEGWKKTFEE DFSPRRGAEL VARAWTDPDF RQLLLTDGTA AVAQYGYLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI I-г DGKGLVPDGY VEGWKKTFEE DFSPRRGAEL VARAWTDPDF RQLLLTDGTA AVAQYGYLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI II-г DGKGLVPDGY VEGWKKTFEE DFSPRRGAEL VARAWTDPDF RQLLLTDGTA AVAQYGYLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI ПО27 DGKGLVPDGY VEGWKKTFEE DFSPRRGAEL VARAWTDPDF RQLLLTDGTA AVAQYGYLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI ПО28 DGKGLVPDGY VEGWKKTFQE DFSPRRGAEL VARAWTDPEF RQLLLTDGTA AVAQYGYLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI НО34 DGY VEGWKKTFEE DFSPRRGAEL VARAWTDPDF RQLLLTDGTA AVAQYGYLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI НО35 DGKGLVPDGY VEGWKKTFEE DFSPRRGAEL VARAWTDPDF RQLLLTDGTA AVAQYGYLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI Р46 DGKGLVPDGY VEGWKKTFEE DFSPRRGAEL VARAWTDPDF RQLLLTDGTA AVAQYGYLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI 9-32 RQLLLTDGTA AVAQYGYLGP QGEYIEAVED APTLKNVIVC SLCSCTAWPI 9-33 YLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI 9-37 RQLLLTDGTA AVAQYGYLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI 9-38 GKGLVPDGY VEGWKKTFEE DFSPRRGAEL VARAWTDPDF RQLLLTDGTA AVAQYGYLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI 9-43 YLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI 9-43’ DPDF RQLLLTDGTA AVAQYGYLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI 9-60 PRRGAEL VARAWTDPDF RQLLLTDGTA AVAQYGYLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI 9-63 DGKGLVPDGY VEGWKKTFEE DFSPRRGAEL VARAWTDPDF RQLLLTDGTA AVAQYGYLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI 9-81 9-83 KNVIVC SLCSCTAWPI Е84 GEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI Б5-2 DGKGLVPDGY VEGWKKTFEE DFSPRRGAEL VARAWTDPEF RQLLLTDGTA AVAQYGYLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI ПО29 DGKGLVPDGY VEGWKKTFEE DFSPRRGAEL VARAWTDPDF RQLLLTDGTA AVAQYGYLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI Б4-1 DGKGLVPDGY VEGWKKTFEE DFSPRRGAEL VARAWTDPEF RQLLLTDGTA AVAQYGYLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI Б20-4 DGKGLVPDGY VEGWKKTFEE DFSPRRGAEL VARAWTDPDF RQLLLTDGTA AVAQYGYLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI N-774 DGKGLVPDGY VEGWKKTFEE DFSPRRGAEL VARAWTDPEF RQLLLTDGTA AVAQYGYLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI N-771 DGKGLVPDGY VEGWKKTFEE DFSPRRGAEL VARAWTDPEF RQLLLTDGTA AVAQYGYLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI CCM2595 DGKGLVPDGY VEGWKKTFEE DFSPRRGAEL VARAWTDPDF RQLLLTDGTA AVAQYGYLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI DSM13002 DGKGLVPDGY VEGWKKTFEE DFSPRRGAEL VARAWTDPDF RQLLLTDGTA AVAQYGYLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI AJ270 DGKGLVPDGY VEGWKKTFEE DFSPRRGAEL VARAWTDPDF RQLLLTDGTA AVAQYGYLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI A-4 DGKGLVPDGY VEGWKKTFEE DFSPRRGAEL VARAWTDPDF RQLLLTDGTA AVAQYGYLGP QGEYIVAVED TPTLKNVIVC SLCSCTAWPI * 121 131 141 ** * * 151 * 161 * 171 * 181 ** 191 **** 201 K17Р LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDVEIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSQEQLQEI VTKDCLIGVA VPQVPT Б2-4 LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDVEIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSQEQLQEI VTKDCLIGV Б4-3 LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDVEIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSQEQLQEI VTKDCLIGVA VPQVPTV Б4-4 LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDVEIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSQEQLQEI VTKDCLIGVA VPQVPTV 2 LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDVEIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSQEQLQEI VTKDCLIGVA VPQVPT 3213 LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDVEIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSQEQLQEI VTKDCLIGVA VPQVPT П1 LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDVEIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSQEQLQEI VTKDCLIGVA VPQVPTV I-г LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDVEIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSQEQLQEI VTKDCLIGVA VPQVPTV II-г LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDVEIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSQEQLQEV VTKDCLIGVA VPQVPTV ПО27 LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDVEIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSQEQLQEI VTKDCLIGVA VPQVPTV * 145 ПО28 LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDVEIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSQEQLQEI VTKDCLIGVA VPQVPTV НО34 LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDVEIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSQEQLQEI VTKDCLIGVA VPQVP LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDVEIRV YDTTAETRYM VLP НО35 Р46 LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDVEIRV YDTTAETRYM VL 9-32 LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDVEIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSQEQLQEV VTKDCLIGVA VPQVPTV 9-33 LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDVEIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSQEQLQEI VTKDCLIGVA VPQVPTV 9-37 LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDVEIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSQEQLQEI VTKDCLIGVA XPQVPTV 9-38 LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDVEIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSQEQLQEV VTKDCLIGVA VPQVPTV 9-43 LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDDEIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSQEQLQEI VTKDCLIGVA 9-43’ LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDXEIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSQEQLQEI VTKDCLIGVA VPQVPTV 9-60 LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDDETPG LRHHRRXXXH G 9-63 LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDVEIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSQEQLQEI VTKDCLIGVA VPQVPTV 9-81 LSEMGT EIASDIEIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSQEQLQEI VTKDCLIGVA IPQVPTV 9-83 LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDVEIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSQEQLQEI VTKDCLIGVA VPQVPTV Е-84 LGLPPTWYKS FEYRXRVVRE PRKVLSEMGT EIASDXEIRV YDTTAETFYM VLPHXPAGTE GWSQEQLQEI V Б5-2 LGLPHTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDVEIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSQEQLQEI VTKDCLIGVA VPQVPTV ПО29 LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDVEIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSQEQLQEI VTKDCLIGVA VPQVPT Б4-1 LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDVEIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSQEQLQEI VTKDCLIGVA VPQVPTV Б20-4 LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSЕMGT ЕIASDVЕIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSREQLQEI VTKDCL N-774 LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDIEIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSQEQLQEI VTKDCLIGVA IPQVPTV N-771 LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDIEIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSQEQLQEI VTKDCLIGVA IPQVPTV CCM2595 LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDVEIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSQEQLQEI VTKDCLIGVA VPQVPTV DSM13002 LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDVEIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSQEQLQEI VTKDCLIGVA VPQVPTV AJ270 LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDVEIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSQEQLQEI VTKDCLIGVA VPQVPTV A-4 LGLPPTWYKS FEYRARVVRE PRKVLSEMGT EIASDVEIRV YDTTAETRYM VLPQRPAGTE GWSQEQLQEI VTKDCLIGVA VPQVPTV ** * ** * * * * ** * ** * * ** * * * * ** β-субъединица 31 K17Р 41 51 61 71 81 91 101 111 Б2-4 LM FAGVAELGAF SVDEVRYVVE RMEPRHYMMT PYYERYVIGV ATLMVEKGIL TQEELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPAPVET E RMEPRHYMMT PYYERYVIGV ATLMVEKGIL TQEELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPAPVET Б4-1 LM FAGVAELGAF SVDEVRYVVE RMEPRHYMMT PYYERYVIGV ATLMVEKGIL TQDELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPAPVET Б4-3 M FAGVAELGAF SVDEVRYVVE RMEPRHYMMT PYYERYVIGV ATLMVEKGIL TQDELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPAPVET Б4-4 EWEHLPYSLM FAGVAELGAF SVDEVRYVVE RMEPRHYMMT PYYERYVIGV ATLMVEKGIL TQEELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPAPVET Б5-2 VVE RMEPRHYMMT PYYERYVVGV ATLMVELTIL TQEELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPAPVET Б20-4 LKFEKGIL TQEELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPARVDT 2 EWEHLPYSLM FAGVAELGAF SVDEVRYVVE RMEPRHYMMT PYYERYVIGV ATLMVEKGIL TQEELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPAPVET 3213 EWEHLPYSLM FAGVAELGAF SVDEVRYVVE RMEPRHYMMT PYYERYVIGV AALMVEKGIL TQEELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPARVDT П1 EWEHLPYSLM FAGVAELGAF SVDEVRYVVE RMEPRHYMMT PYYERYVIGV AALMVEKGIL TQEELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPARVDT П3 EWEHLPYSLM FAGVAELGAF SVDEVRYVVE RMEPRHYMMT PYYERYVIGV AALMVEKGIL TQEELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPARVDT I-г EWEHLPYSLM FAGVAELGAF SVDEVRYVVE RMEPRHYMMT PYYERYVIGV AALMVEKGIL TQEELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPARIDT II-г EWEHLPYSLM FAGVAELGAF SVDEVRYVVE RMEPRHYMMT PYYERYVIGV AALMVEKGIL TQEELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPARIDT ПО27 SLM FAGVAELGAF SVDEVRYVVE RMEPRHYMMT PYYERYVIGV ATLMVEKGIL TQEELESPAG GPFPLSRPSE SEGRPAPVET ПО28 AGVAELGAF SVDEVRYVVE RMERRHYMMT PYYEXYVIGV ATLMVEKGIL TQEELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPAPVET ПО29 SLM FAGVAELGAF SVDEVRYVVE RMEPRHYMMT PYYERYVIGV ATLMVEKGIL TQEELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPAPVET НО34 M FAGVAELGAF SVDEVRYVVE RMEPRHYMMT PYYERYVIGV AALMVEKGIL TQEELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPARIDT НО35 E RMEPRHYMMT PYYERYVIGV AXLKFEKGIL TQEELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPARIDT 9-33 EWEHLPYSLM FAGVAELGAF SVDEVRYVVE RMEPRHYMMT PYYERYVIGV AALMVEKGIL TQEELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPARVDT 9-37 EXEHLPYSLM FAGVAELGAF SVDEVRYVVE RMEPRHYMMT PYYERYVIGV AALMVEKGIL TQEELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPARVDT 9-38 EWEHLPYSLM FAGVAELGAF SVDEVRYVVE RMEPRHYMMT PYYERYVIGV AALMVEKGIL TQEELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPARVDT 9-43’ EWEHLPYTLM FAGVAELGAL SVDEVRYVVE RMEPRHYMMT PYYERYVIGV AALMVEKGIL TQEELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPARVDT 9-60 AGVAELGAF SVDEVRYVVE RMEPRHYMMT PYYERYVIGV AALMVEKGIL TQEELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPARVDT 9-61 SLM FAGVAELGAF SVDEVRYVVE RMEPRHYMMT PYYERYVIGV AALMVEKGIL TQEELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPARIDT 9-81 M FAGVAELGAF SVDEVRYVVE RMEPRHYMMT PYYERYVIGV ATLMVEKGIL TQDELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPARVDT 146 П9(1) M FAGVAELGAF SVDEVRYVVE RMEPRHYMMT PYYERYVIGV AXLMVEKGIL TQXELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPAXXXT П10(0) SLM FAGVAELGAF SVDEVRYVVE RMEPRHYMMT PYYERYVIGV AALMVEKGIL TQEELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPARIDT Е84 EWEHLPYSLM FAGVAELGAF SVDEVRYVVE RMEPRHYMMT PYYERYVIGV AALMVEKGIL TQEELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPARVDT N-774 EWEHLPYSLM FAGVAELGAF SVDEVRYVVE RMEPRHYMMT PYYERYVIGV ATLMVEKGIL TQDELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPAPVET N-771 EWEHLPYSLM FAGVAELGAF SVDEVRYVVE RMEPRHYMMT PYYERYVIGV ATLMVEKGIL TQDELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPAPVET CCM2595 EWEHLPYSLM FAGVAELGAF SVDEVRYVVE RMEPRHYMMT PYYERYVIGV AALMVEKGIL TQEELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPARVDT DSM13002 EWEHLPYSLM FAGVAELGAF SVDEVRYVVE RMEPRHYMMT PYYERYVIGV AALMVEKGIL TQEELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPARVDT AJ270 EWEHLPYSLM FAGVAELGAF SVDEVRYVVE RMEPRHYMMT PYYERYVIGV ATLMVEKGIL TQDELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPAPVET A-4 EWEHLPYSLM FAGVAELGAF SVDEVRYVVE RMEPRHYMMT PYYERYVIGV ATLMVEKGIL TQEELESLAG GPFPLSRPSE SEGRPAPVET ** 121 K17Р * 131 141 ** 151 161 * 171 181 191 201 211 Б2-4 TTFEIGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTISHRTTEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVKFAAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP A TTFEVGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTISHRTTEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVKFDAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP AA Б4-1 TTFEIGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTISRRTTEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVKFAAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP A Б4-3 TTFEIGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTIPGKGTEK WPFPDAVGHG RNDAGEEPTY HVKFAAEELF GSDTDGGGVV VDLFEGYLEP AA Б4-4 TTFEIGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTISHRTSEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVKFAAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP AA Б5-2 TTFEIGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTISHRTSEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVKFAAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP A Б20-4 TTFEVGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTIAHRTTEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVKFAAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP A 2 TTFEIGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTISHRTSEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVKFAAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP AA 3213 TTFEVGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTIAHRTTEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVTFAAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP AA П1 TTFEVGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTIAHRTTEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVTFAAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP AA П3 TTFEVGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTIAHRTTEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVTFAAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP I-г TTFEVGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTIAHRTTEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVTFAAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP A II-г TTFEVGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTIAHRTTEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVTFAAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP A ПО27 TTFEIGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTISHRTSEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVKFAAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP AA ПО28 TTFEIGQKVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTISSRTTEK WPFPDAFGHG RNDAGEEPTY HVKFAAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP AA ПО29 TTFEIGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTISHPTSEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVKFAAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP AA НО34 TTFEVGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTISHPTTEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVTFAAEELF GSDTDVGSVV VDLFEGYLEP AA НО35 TTFEVGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTISHPTTEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVTFAAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP AA 9-33 TTFEVGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTIAHRTTEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVTFAAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP AA 9-37 TTFEVGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTIAHRTTEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVTFAAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP AA 9-38 TTFEVGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTIAHRTTEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVKFAAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP AA 9-43’ TTFEVGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTIAHRTTEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVTFAAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP AA 9-60 TTFEVGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTIAHRTTEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVTFAAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP AA 9-61 TTFEVGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTIAHRTTEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVTFAAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP AA 9-81 TTFEVGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTISHRTTEK WPFPDAIGHG RNDASEEPTY HVKFAAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP AA П9(1) TTFEVGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTVSHRTXEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVXFXAEELF GSDTDGGSVV VDLFEG П10(0) TTFEVGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTIAHRTTEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVTFAAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP AA Е-84 TTFEVGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTIAHRTTEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVTFAAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP AA N-774 TTFEVGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTISHRTTEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVKFAAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP AA N-771 TTFEVGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTISHRTTEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVKFAAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP AA CCM2595 TTFEVGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTIAHRTTEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVTFAAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP AA DSM13002 TTFEVGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTIAHRTTEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVTFAAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP A AJ270 TTFEVGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTISHRTTEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVKFAAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP AA A-4 TTFEIGQRVR VRDEYVPGHI RMPAYCRGRV GTISHRTSEK WPFPDAIGHG RNDAGEEPTY HVKFAAEELF GSDTDGGSVV VDLFEGYLEP AA * * * * * * * * * * ** Примечание: желтым выделены характерные для рода Rhodococcus аминокислотные замены, зеленым – уникальные, голубым – аминокислотные остатки, формирующие активный центр железосодержащей НГ, полужирным начертанием – аминокислотные остатки, необходимые для пространственной структуры активного центра фермента, звездочками – консервативные аминокислотные остатки Fe- и Co-содержащих НГ.
