Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научный центр здоровья детей» Мельничук Олег Сергеевич
advertisement
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научный центр здоровья детей» На правах рукописи Мельничук Олег Сергеевич ПОКАЗАТЕЛИ ГЕМОГРАММЫ И СЫВОРОТОЧНЫЕ МАРКЕРЫ ВОСПАЛЕНИЯ ПРИ ФЕБРИЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЯХ У ДЕТЕЙ 14.03.10 – Клиническая лабораторная диагностика Диссертация на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук Н.А. Маянский Научный консультант: доктор медицинских наук Т.В. Куличенко Москва 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………... 3 ГЛАВА 1. Современные принципы диагностики тяжелых бактериальных инфекций у детей (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)……………….……………............ 10 1.1. Фебрильные инфекции у детей……………………………………………… 10 1.2. Лабораторные маркеры фебрильных инфекций…………………………… 12 1.2.1. Уровень лейкоцитов, нейтрофилов и незрелых гранулоцитов как маркер бактериального воспаления……………………...……...…..………....... 12 1.2.2. С–реактивный белок……………………………………………………….. 16 1.2.3. Прокальцитонин……………………………………………………………. 17 1.2.4. Эквивалент содержания гемоглобина в ретикулоцитах (RET-He)……... 19 1.3. Использование лабораторных маркеров при фебрильных инфекциях у детей……………………………………………………………………….............. 22 1.3.1. Стабильность показателей гемограммы………………………….............. 23 1.3.2. Референсные интервалы……………………………………………............ 24 1.3.3. Диагностические характеристики лабораторного теста ………………... 26 ГЛАВА 2. Объем и методы исследования..……………………………………... 32 2.1. Определение стабильности показателей гемограммы…………………….. 32 2.2. Расчёт референсных интервалов показателей гемограммы………………. 33 2.3. Диагностические характеристики лабораторных маркеров тяжелой бактериальной инфекции………………………………………………………… 35 2.4. Статистические методы……………………………………………………… 38 ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований………….............................. 39 3.1. Стабильность показателей гемограммы в зависимости от времени и температуры хранения образцов крови…………………………………………. 3.2. Референсные интервалы показателей гемограммы у детей………………. 3.3. Оценка диагностических характеристик лабораторных тестов у детей с фебрильными инфекциями………………………………………………………. ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………………… 39 45 ВЫВОДЫ…………………………………………………………………………. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ…………………………………………. СИСОК СОКРАЩЕНИЙ………………………………………………………… СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………..……. 77 78 79 80 52 65 3 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования и степень её разработанности Фебрильные инфекции у детей младшего возраста обусловливают до 2035% обращений к врачу и госпитализаций в этой возрастной группе [3,110,153]. Тяжелые бактериальные инфекции (ТБИ) при этом встречаются у 10-25% обратившихся, но именно эти состояния могут иметь крайне неблагоприятный прогноз в случае несвоевременной диагностики [37,76]. Для детей с ТБИ быстрое установление диагноза и назначение антибактериальной терапии являются жизненно важными [25,107]. Вместе с тем неоправданное назначение антибиотиков детям с вирусной лихорадкой способствует росту микробной резистентности, увеличивает затраты на лечение и повышает частоту лекарственных побочных эффектов. Особые трудности представляет диагностика ТБИ при отсутствии видимого очага бактериальной инфекции, а такие пациенты составляют до 20% лихорадящих детей [30,101]. Клиническая картина болезни в этих случаях представлена лихорадкой и интоксикацией различной степени. Большое значение при оценке вероятности ТБИ имеют возраст (к группе риска по развитию ТБИ относятся дети до 36 месяцев); наличие сопутствующей патологии (у иммунокомпрометированных больных риск ТБИ особенно высок); выраженность катаральных явлений (наличие катара характерно для вирусных инфекций) [55]. Исследование показателей гемограммы у детей с лихорадкой исторически является наиболее распространённым лабораторным тестом в педиатрической практике [30]. Тем не менее, опираясь на данные клинического осмотра пациента, различные клинические индексы и шкалы риска ТБИ, а также показатели гемограммы, однозначно диагностировать тяжелую бактериальную инфекцию бывает сложно [87,112,144]. Практическое использование лабораторных тестов, прежде всего различных маркеров бактериальных инфекций, в диагностике ТБИ предполагает наличие определенного стандарта (т.е. определенной величины или 4 интервала величин), с которым можно сравнить полученный результат. Очевидно, надежная интерпретация любого теста возможна только при применении адекватных стандартов. В качестве стандарта можно использовать ряд подходов: (1) сопоставление результатов лабораторного теста с референсным интервалом (РИ) и (2) сравнение результата теста с пороговым значением (cut-off). РИ параметров гемограммы у детей давно не пересматривались. Многие современные справочники до настоящего времени ссылаются на публикации 1960–70-х годов, когда основным методом оценки количества клеток крови являлся подсчёт в камере Горяева и микроскопическое исследование мазка крови – подсчёт субпопуляций лейкоцитов на 100 клеток. Данный метод недостаточно стандартизирован и отличается низкой воспроизводимостью. Cовременные гематологические анализаторы, использующие проточную цитометрию с флуоресцентными красителями, представляют результат после анализа тысяч клеток. Это позволяет надежно дифференцировать основные субпопуляции лейкоцитов в приборах с функцией 5-DIFF. Однако из-за отсутствия РИ показателей гемограммы, адаптированных к новым методикам, клиническое использование результатов автоматизированного анализа крови может быть затруднительным. Широкое применение в диагностике ТБИ нашли маркеры острого воспаления С-реактивный белок (С-РБ) и прокальцитонин (ПКТ) [108,139]. Однако их диагностическая ценность относительна и требует дополнительных исследований [1,66,100,138]. В связи с этим возникает необходимость разработки и внедрения в педиатрическую практику эффективных лабораторных подходов в дифференциальной диагностике ТБИ у детей с лихорадкой. Цель исследования – определить референсные интервалы показателей гемограммы и установить закономерности изменения этих показателей и сывороточных маркеров воспаления при тяжелых бактериальных инфекциях у детей. 5 Задачи исследования 1.Проанализировать влияние времени и условий хранения образцов крови на показатели гемограммы. 2.Определить референсные интервалы показателей гемограммы у здоровых детей и описать их возрастные особенности. 3.Выявить изменения лабораторных маркеров воспаления при фебрильных инфекциях у детей. 4.Определить и сравнить специфичность, отношение положительного и воспаления при диагностическую правдободобия отрицательного дифференциальной точность, и результатов диагностике чувствительность, посттестовую вероятность исследованных тяжелых маркеров бактериальных инфекций у детей с инфекционной лихорадкой. Научная новизна Проведенный анализ данных о влиянии времени и температуры хранения образцов крови на показатели гемограммы показал, что большинство показателей (гемоглобин, эритроциты, MCH, эквивалент гемоглобина в ретикулоцитах (RETHe), лейкоциты, нейтрофилы, лимфоциты, моноциты, базофилы, тромбоциты) стабильны в течение как минимум 24 ч вне зависимости от температуры хранения. Доказана возможность хранения образцов крови при 4-8°С в течение 72 ч без существенных изменений всех изученных параметров (за исключением гематокрита, MCV и числа эозинофилов). Эти результаты могут быть положены в основу планирования преаналитического этапа работы лаборатории. Впервые у детей рассчитаны референсные интервалы ретикулоцитов, фракций незрелых (IRF) и зрелых (LFR) ретикулоцитов, эквивалента гемоглобина в ретикулоцитах (RET-He), ширины распределения эритроцитов по объёму (RDW-CV) для гематологического анализатора. По результатам трёхлетнего исследования точности постановки пациенту диагноза тяжелой бактериальной инфекции с учетом результатов исследованных лабораторных маркеров воспаления установлено, что уровень С-РБ обладает 6 более высокой диагностической точностью, по сравнению с уровнем ПКТ, числом лейкоцитов, нейтрофилов, незрелых гранулоцитов, уровнем RET-He. Установленные пороговые значения исследованных показателей позволяют оценить влияние результата лабораторного исследования на посттестовую вероятность тяжелой бактериальной инфекции у конкретного пациента. Разработан бактериальной алгоритм инфекции оценки в посттестовой зависимости от вероятности результата тяжелой лабораторного исследования (уровень лейкоцитов, нейтрофилов, незрелых гранулоцитов, RETHe, С-РБ, ПКТ), что существенно облегчает принятие решения о терапевтической тактике у детей с фебрильными инфекциями. Теоретическая и практическая значимость В исследовании проанализировано влияние времени и температуры хранения образцов крови на основные показатели гемограммы, что обосновывает адекватное планирование преаналитического этапа выполнения анализов. Рассчитаны и внедрены в практическую работу клиник НЦЗД референсные интервалы показателей гемограммы у детей для гематологического анализатора, согласно международным рекомендациям CLSI С28-A3 [59]. Установлено, что медианы лейкоцитов, нейтрофилов, незрелых гранулоцитов, С-РБ и ПКТ были статистически значимо выше у пациентов с тяжелой бактериальной инфекцией. Впервые доказано, что уровень RET-He у детей с тяжелой бактериальной инфекцией существенно ниже по сравнению с пациентами с другими фебрильными инфекциями. Проведенный анализ диагностической точности лабораторных маркеров воспаления свидетельствует о том, что при дифференциальной диагностике тяжелой бактериальной инфекции у детей младшего возраста наиболее информативным показателем является уровень С-РБ (AUC 0,95). При уровне С-РБ ≥37 мг/л вероятность тяжелой бактериальной инфекции составляет 70%, а при уровне С-РБ <37 мг/л – 4%. 7 Положения, выносимые на защиту 1. Cтабильность показателей гемограммы в зависимости от температуры и времени хранения образцов крови позволяет правильно планировать преаналитический этап лабораторных исследований. 2. Рассчитанные референсные интервалы показателей гемограммы для гематологического анализатора могут быть использованы в клинической практике педиатров. Референсные интервалы ретикулоцитов, LFR, IRF не зависят от возраста и пола. 3. Установленный уровень порогового значения уровня лейкоцитов, нейтрофилов, незрелых гранулоцитов, RET-He, С-РБ, ПКТ может быть использован для диагностики тяжелой бактериальной инфекции у детей с фебрильными инфекциями. 4. Наибольшей диагностической точностью при дифференцировании тяжелой бактериальной инфекции у детей с инфекционной лихорадкой обладает исследование уровня С-РБ. Внедрение результатов работы в практику Полученные учитываются при результаты планировании стабильности показателей преаналитического этапа гемограммы анализа в централизованной клинико-диагностической лаборатории (ЦКДЛ) ФГБНУ НЦЗД. Рассчитанные РИ показателей гемограммы внедрены в ЦКДЛ ФГБНУ НЦЗД. Разработанный алгоритм клинико-лабораторной диагностики ТБИ у детей с фебрильными инфекциями используется на базе отделения неотложной педиатрии с группой анестезиологии и реанимации НИИ профилактической педиатрии и восстановительного лечения ФГБНУ НЦЗД. Личный вклад соискателя Все этапы диссертационной работы были выполнены при непосредственном участии автора. Автор участвовал в разработке структуры исследования, выполнял сбор клинических и лабораторных данных, непосредственно проводил 8 анализ показателей гемограммы, сывороточных маркеров воспаления С-РБ и ПКТ. Самостоятельно выполнена статистическая обработка данных исследования и интерпретация полученных результатов. Апробация работы Материалы диссертации были доложены и рекомендованы к защите на совместной научной конференции лабораторного отдела ФГБНУ НЦЗД и отделения неотложной педиатрии с группой анестезиологии и реанимации НИИ профилактической педиатрии и восстановительного лечения. Основные положения диссертации были доложены на XV-XVIII Конгрессах педиатров России (Москва, 2011, 2012, 2013, 2014 гг.), XVI Научно-практической конференции «Высокие технологии и модернизация в лабораторной медицине» (Москва, 2011 г.), Всероссийском конгрессе «Инфекционные болезни у детей» (Санкт-Петербург, 2011 г.), XIX и ХХ Европейских конгрессах по клинической химии и лабораторной медицине IFCC-Worldlab-Euromedlab (Берлин, 2011 г., Милан, 2013 г.), XVIII Всероссийской научно-практической конференции «Аналитическая надежность и диагностическая значимость лабораторной медицины» (Москва, 2013 г.), III Конгрессе пеидатров Урала (Екатеринбург, 2014 г.) XIX Всероссийской научно-практической конференции «Консолидация науки и практики в лабораторной медицине» (Москва, 2014), научно-практических региональных конференциях педиатров (Рязань, 2011 г., Казань, 2012 г., Москва, 2010-12 гг., Якутск, 2013 г., Петропавсловск-Камчатский, 2013 г., Магадан, 2014 г., Хабаровск, 2014 г.). Публикации по теме диссертации: По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 6 публикаций в российских изданиях, входящих в перечень ВАК. 9 Структура и объём диссертации Диссертация изложена на 96 страницах машинописного текста, иллюстрирована 10 рисунками и 12 таблицами. Работа содержит следующие главы: «Введение», «Обзор литературы», «Объём и методы исследования», «Результаты исследования», «Заключение», «Выводы» и «Практические рекомендации». Список литературы содержит 155 источников (21 отечественных и 134 зарубежных). 10 ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРИНЦИПЫ ДИАГНОСТИКИ ТЯЖЕЛЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ У ДЕТЕЙ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Фебрильные инфекции у детей Фебрильные инфекции у детей младшего возраста обусловливают до 20-35% обращений к врачу и госпитализаций в этой возрастной группе [80,110,153]. Каждый ребенок младше 5 лет ежегодно переносит в среднем от 3 до 6 инфекционных эпизодов, сопровождающихся лихорадкой [23,110,135]. В большинстве случаев такие инфекции протекают доброкачественно и не представляют угрозы жизни и здоровью ребенка. Однако в ряде случаев фебрильная лихорадка обусловлена тяжелой бактериальной инфекцией (ТБИ), которая требует активной тактики ведения пациента и назначения антибактериальных препаратов. ТБИ встречаются у 10-25% обратившихся детей с лихорадкой, и именно эти состояния могут иметь крайне неблагоприятный прогноз в случае несвоевременной диагностики [76]. К ТБИ относят пневмонию, пиелонефрит, менингит, бактериемию, сепсис [91,114,141]. Риск развития и неблагоприятных исходов ТБИ особенно высок у детей младше 3 лет [55]. Дополнительные трудности представляет дифференциальная диагностика ТБИ у лихорадящих детей при отсутствии видимого очага инфекции. Эти пациенты составляют до 20% всех лихорадящих детей [30,76,105]. Причиной лихорадки без видимого очага инфекции могут быть серьезные состояния, в частности, скрытая (оккультная) бактериемия. Термин «бактериемия» был предложен для обозначения роста бактерий в крови у детей в возрасте от 3 до 36 месяцев с лихорадкой без видимого очага инфекции [43]. Клиническая картина болезни в этих случаях представлена лихорадкой и интоксикацией различной степени. Во многих странах вакцинация против Haemophilus influenzae тип b и Streptococcus pneumoniae, основных возбудителей ТБИ, позволила значительно 11 (до 1-2%) снизить распространённость этих инфекций в возрастной группе детей до 36 месяцев [35,81,86,149,152]. В отсутствие вакцинации против основных возбудителей ТБИ, распространённость бактериемии достигала 12%. При этом на долю пневмококка приходилось 50-90% случаев заболеваемости, от 3 до 25% случаев вызывала H. influenzae типа b, а остальные случаи бактериемии были обусловлены Salmonella ssp. и Neisseria meningitidis [31,93]. Одновременно со снижением распространённости бактериемии и менингита на фоне вакцинации от пневмококка и гемофильной палочки во многих странах сократилась и заболеваемость пневмококковой пневмонией [117]. Для дифференциальной диагностики фебрильных инфекций у детей предложены различные клинические шкалы [38,62]. Они основаны на одновременном учете некоторого числа клинических признаков, каждый из которых делает свой вклад в общий «счет». Например, широко используемая в клинике Йельская шкала оперирует шестью признаками: характер крика, реакция на обращение родителей, положение, цвет кожных покровов, степень гидратации и эмоциональный контакт. При оценке по этой шкале в 10 и менее баллов риск ТБИ составляет 3%, оценка ≥ 16 баллам повышает риск ТБИ до 92% [39]. Очевидно, что значения 11-15 баллов не будут надежно дифференцировать ТБИ. Craig J.C. и соавторы [55] оценивали диагностическую значимость 40 клинических признаков по выявлению риска ТБИ у детей младше 5 лет с лихорадкой в условиях отделения реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) и построили математическую модель на 15781 пациенте. Данное исследование показало, что 7% всех пациентов ОРИТ поступают с диагнозами инфекции мочевыводящих путей (ИМП), пневмонии и бактериемии, но лишь 70-80% из них получают антибактериальную терапию при первичном осмотре, тогда как 20% детей неоправданно получают антибиотики. Было также установлено, что использование математической модели на основе клинических данных при первичном медицинском осмотре позволяет повысить чувствительность клинического осмотра при выявлении ТБИ в условиях ОРИТ [55]. 12 В целом, математические модели, учитывающие только клинические данные, не отличаются высокой диагностической точностью, что, вероятно, связано широким индивидуальным разнообразием симптомов, и, прежде всего, субъективностью их оценки [87,112,113,144]. Важное место в диагностике ТБИ у детей с фебрильными инфекциями занимают лабораторные исследования. Выявление возбудителя инфекции с помощью классических микробиологических методов служит «золотым стандартом» верификации ТБИ. К недостаткам культурального исследования следует отнести длительность получения результата (24-48 ч). Подобного рода промедление неприемлемо в реальной практике, поэтому данный метод не может использоваться как основное лабораторное исследование для дифференциальной диагностики ТБИ и принятия решения о терапевтической тактике [63]. 1.2. Лабораторные маркеры фебрильных инфекций В качестве маркеров бактериального воспаления в разное время было предложено использовать несколько десятков лабораторных показателей [84]. Наиболее информативными и надежными считают показатели гемограммы (общее число лейкоцитов, нейтрофилов), а также некоторые сывороточные параметры, в частности, С-реактивный белок (С-РБ) и прокальцитонин (ПКТ) [24]. Помимо этих уже ставших рутинными маркеров, современные лабораторные аналитические системы дают возможность исследовать и другие показатели, в частности, незрелые гранулоциты и RET-He [150], диагностическая значимость которых у детей с фебрильными инфекциями изучена недостаточно и требует верификации. 1.2.1. Уровень лейкоцитов, нейтрофилов и незрелых гранулоцитов как маркер бактериального воспаления Лейкоциты (в переводе с греческого leukos – белый и kytos – клетка) – группа белых клеток крови, которые образуются в костном мозге и лимфатических узлах. Основная функция лейкоцитов – защита организма от 13 микробов и чужеродных клеток. Повышение уровня лейкоцитов в периферической крови может быть связано с несколькими факторами: Опухолевая трансформация стволовой клетки, что приводит к пролиферации ростков кроветворения и увеличению клеток крови, в том числе и лейкоцитов; Повышенное образование лейкоцитов за счет ускорения их созревания в органах кроветворения под действием естественных стимулирующих факторов лейкопоэза (физические и химические факторы воспаления, продукты распада тканей, гипоксия, образование иммунных комплексов, токсины, повышенная активность гипофизарно-надпочечниковой системы); Выраженная сосудистая реакция, в результате которой из кровяных депо высвобождается большое количество лейкоцитов. Наиболее распространённым является феномен повышения уровня лейкоцитов за счёт субпопуляции нейтрофилов. Нейтрофильный лейкоцитоз – это универсальный гематологический синдром острых ситуаций, стресса различного происхождения, от психического и физического напряжения до тяжелых воспалительных и гнойно-септических процессов, разного рода болевых синдромов, травм и тканевых деструкций. В физиологических условиях продолжительность формирования зрелого гранулоцита в костном мозге составляет 10–13 суток. Родоначальницей всех клеточных элементов костного мозга является стволовая клетка, которую «ориентируют» в сторону нейтрофилов колониестимулирующие факторы: гранулоцитарный (Г-КСФ) и гранулоцитарномакрофагальный (ГМ-КСФ). Первая морфологически узнаваемая клетка в этом направлении — миелобласт, последующие стадии делящихся и развивающихся клеток — промиелоцит и миелоцит. Метамиелоцит и палочкоядерный нейтрофил более не делятся, а только созревают до сегментоядерных нейтрофилов, наиболее функционально активных) [11,12]. В норме около 90% всех зрелых сегментоядерных нейтрофилов содержится в костном мозге, 2–3% в периферической крови и 5–8% в тканях. В циркуляции находится около половины нейтрофилов периферической крови, вторую 14 половину составляет пристеночный пул клеток, который формируется за счет легко обратимой адгезии на эндотелиальной поверхности микрососудистого русла (сосудистый гранулоцитарный резерв). В крови нейтрофилы находятся около 10 часов, после чего мигрируют в ткани. Важнейшая функция нейтрофилов — способность к фагоцитозу и деструкции микробов, инородных тел и клеточного детрита. В нейтрофилах содержатся многочисленные ферменты (кислые протеиназы, миелопероксидаза, лизоцим, лактоферрин, щелочная фосфатаза и другие) [11,12]. Общее число лейкоцитов и абсолютное число нейтрофилов на протяжении длительного периода времени активно используется для оценки риска наличия ТБИ у детей с лихорадкой без видимого очага инфекции [28,30,108,121]. В последние годы появилась возможность учитывать «левый сдвиг» лейкоцитов с помощью гематологических анализаторов. Некоторые модели инструментов способны учитывать фракции незрелых гранулоцитов, что расширяет диагностические возможности при острых инфекциях. В основе технологии определения незрелых гранулоцитов лежит метод проточной цитометрии с применением происходит флюоресцентного посредством красителя. определения Дифференцировка лейкоцитов концентрации нуклеиновых кислот (интенсивность флюоресцентного сигнала пропорциональна их концентрации), оценки внутренней структуры и размера клетки. У пациентов с ТБИ при анализе основных субпопуляций лейкоцитов определяются и незрелые гранулоциты, которые свидетельствуют о «левом сдвиге» до миелоцитов и промиелоцитов (Рисунок 1.2.1). Уровень незрелых гранулоцитов использовался в ряде работ как дополнительный маркер инфекционно-воспалительного процесса. Например, число незрелых гранулоцитов может являться прогностическим фактором сепсиса [26]. 15 Рисунок 1.2.1 Скатерограмма лейкоцитарного канала образца крови пациента с ТБИ Примечание. Выделенное синее облако – незрелые гранулоциты (миелоциты и промиелоциты). Такой вывод был сделан по результатам исследования доли незрелых гранулоцитов у пациентов с положительным и отрицательным результатом культурального исследования крови. Уровень незрелых гранулоцитов был значимо выше у пациентов с положительным результатом культурального исследования крови, чем у пациентов с отрицательным результатом. Было также установлено, что содержание незрелых гранулоцитов >3% является специфическим предиктором сепсиса и может использоваться для ускорения принятия решения о тактике лечения пациента [26]. При поиске ранних маркеров неонатального сепсиса Bender L и соавторы [34] разделили 123 новорождённых на две группы: (1) пациенты с выявленной бактериемией и имеющие признаки сепсиса – n=29, и (2) новорождённые без признаков сепсиса – n=94. У каждого новорождённого проанализировали показатели гемограммы и установили, что отношение (незрелые гранулоциты/нейтрофилы) может быть использовано при скрининге сепсиса. 16 1.2.2. С-реактивный белок В 1930 году Уильям С. Тиллет (William S. Tillet) и Томас Френсис (Thomas Frances) обнаружили в сыворотке больных пневмококковой пневмонией пептид, который в присутствии ионов кальция образовывал преципитат, соединяясь с пневмококковым С-полисахаридом. Данная субстанция получила название Среактивный белок (С-РБ) [140]. С-РБ принадлежит к белкам острой фазы воспаления и является альфа2глобулином. Его молекула состоит из 5 одинаковых субъединиц, связанных между собой кольцевой структурой. С-РБ синтезируется преимущественно гепатоцитами, основным регулятором продукции негликозилированного протеина является интерлейкин-6 (IL-6) [21]. С-РБ играет важную роль при воспалении: на ранней стадии С-РБ участвует в активации фагоцитов, индуцируя хемотаксис и выработку супероксида. С-РБ связывается с бактериальными полисахаридами, поврежденными мембранами и с экспонированными ядерными антигенами [20]. Это, в свою очередь, приводит к связыванию с C1q-компонентом комплемента и активации его классического каскада. С-РБ также связывается с Fc-рецепторами и повышает фагоцитоз определенных антигенов и микроорганизмов [20]. У здоровых лиц концентрация С-РБ не превышает 5 мг/л [7]. В ответ на воспаление или повреждение тканей уровень С-РБ повышается через 4-6 ч после начала воспаления и удваивается каждые 8 ч, достигая своего максимума к 36 ч. [61,95]. Динамика С-РБ позволяет использовать этот показатель при дифференциальной диагностике ТБИ у детей с различной длительностью лихорадки [121]. Например, было показано, что диагностические характеристики С-РБ одинаково полезны при выявлении ТБИ у детей с длительностью лихорадки как ≤ 12 ч., так и > 12 ч. С-РБ используется в качестве маркера инфекции у детей c нейтропенией [109]. Было показано, что анализ С-РБ полезен при дифференциальной диагностике пневмонии от других инфекций дыхательных путей [115]. Широкое 17 применение С-РБ нашёл в лабораторной диагностике ТБИ у детей младшего возраста [108,123,139]. 1.2.3 Прокальцитонин Прокальцитонин (ПКТ) является предшественником кальцитонина (КТ) — гормона, который получил свое название благодаря тому, что он секретируется в ответ на острую гиперкальциемию, оказывая гипокальциемический эффект. При изучении патогенеза гипокальциемии у женщин с синдромом токсического шока, вызванного стафилококковой инфекцией, было обнаружено, что гипокальциемия сопровождалась увеличением в сотни раз уровня субстанции, получившей название «иммунореактивный кальцитонин», поскольку она реагировала с антисывороткой к КТ [50]. ПКТ состоит из 116 аминокислот и включает три пептида: 1) N-концевую последовательность из 57 аминокислот (N-ПКТ); 2) расположенный в середине незрелый КТ, который содержит концевой глицин; 3) 21-аминокиcлотный Сконцевой пептид КТ I (катакальцин). ПКТ кодируется геном CALC-I, экспрессия которого в обычных условиях (в отсутствии воспаления, сепсиса) ограничивается нейроэндокринными клетками щитовидной железы и легких, хотя незначительное содержание мРНК ПКТ обнаруживали также в печени и других тканях. Однако при сепсисе ситуация радикально меняется. Например, в условиях экспериментального сепсиса у хомяков повышение экспрессии мРНК ПКТ было обнаружено в тканях надпочечников, селезёнки, спинного и головного мозга, печени, поджелудочной железы, кишки, легких, жировой ткани, яичках, желудке [116]. Необычайное разнообразие тканей, которые потенциально способны экспрессировать ген CALC-I и продуцировать ПКТ, обусловливает драматическое повышение уровня ПКТ в сыворотке пациентов с сепсисом. В ответ на инфекцию и сигналы, исходящие от липополисахарида и других продуктов бактерий, а также провоспалительных цитокинов, в промоторе гена CALC-I происходят изменения, которые усиливают транскрипцию этого гена, делая ее фактически универсальной. Парадоксально, но при септическом 18 повышении ПКТ в 100–1000 раз уровень самого КТ практически не меняется. Очевидно, это свидетельствует об отклонении от обычного хода событий посттрансляционного процессинга, созревания и секреции КТ в рамках нейроэндокринной регуляции, когда скромная нейроэндокринная продукция сменяется мощным выбросом предшественников КТ из множества других типов клеток. Кроме того, ПКТ гораздо более устойчив к расщеплению по сравнению с КТ, поэтому из-за быстрой деградации в циркуляции уровень ПКТ при сепсисе может оставаться стабильным [32,42]. Эксперименты на животных показали, что при сепсисе ПКТ повышается пропорционально тяжести заболевания, а наиболее высокие его уровни ассоциируются с увеличением летальности. Подробно этот феномен был изучен на модели перитонеального сепсиса у хомяков и свиней. Животным внутрибрюшинно вводили взвесь бактерий (Escherichia coli) и мониторировали уровень ПКТ через определенные промежутки времени. При этом ПКТ прямо коррелировал как с количеством введенных бактерий, так и с летальностью экспериментальных животных [136]. У практически здоровых лиц уровень ПКТ не превышает 0,05 нг/мл. Изучение динамики изменения уровня ПКТ при бактериальных инфекциях показало, что по сравнению с ранними провоспалительными цитокинами интерлейкинами (ИЛ) 1β и ТНФ α на аналогичной модели перитонеального сепсиса было показано, что повышение ПКТ вторично по отношению к ИЛ 1β и ТНФ α [151]. Кратковременное увеличение уровня этих цитокинов в 2 раза предшествовало 100-кратному повышению продукции ПКТ, которое сохранялось в течение всего периода наблюдения (24 ч). Возможно, что ИЛ 1β и ТНФ α являются стимуляторами продукции ПКТ, который в свою очередь является вторичным медиатором сепсиса, усиливающим каскад септической реакции, но не инициирующим фактором развития сепсиса. Это заключение подтверждается данными о том, что внутривенное введение человеческого ПКТ здоровым хомякам не вызывало никаких неблагоприятных реакций и не влияло на уровень цитокинов (ИЛ 1β и ТНФ α), но обратный эксперимент, т. е. введение ТНФ α 19 здоровым животным, сопровождался 25-кратным увеличением уровня ПКТ по сравнению с контрольными животными [32,151]. Эксперименты, проведенные на добровольцах, которым вводили эндотоксин (липополисахарид Escherichia coli) и исследовали уровень ПКТ, дали представление о динамике изменения этого маркера у человека в ответ на бактериальный стимул [122]. У всех 52 добровольцев, принявших участие в исследовании, наблюдалось выраженное и длительное повышение уровня ПКТ. Он достигал пика к 24 ч после введения эндотоксина, а через 7 дней ПКТ оставался повышенным в 2–4 раза по сравнению с базальным уровнем. Период полувыведения ПКТ составил 26–46 часов [122]. Повышение ПКТ у детей младшего возраста является признаком наличия инфекции [146]. Исследования, направленные на изучение изменения показателей крови у детей с лихорадкой, показывают, что ПКТ может использоваться при дифференцировании бактериальной и вирусной инфекций [66,77,78,100]. Поиск лабораторных маркеров ТБИ у детей с лихорадкой без видимого очага инфекции показал, что при бактериальных инфекциях ПКТ стремительно повышается и его уровень коррелирует с тяжестью заболевания и смертностью [47,90]. Вместе с тем необходимо учитывать, что исследование уровня ПКТ является дорогостоящим исследованием и не доступно для рутинного повсеместного применения. 1.2.4 . Эквивалент содержания гемоглобина в ретикулоцитах (RET-He) Предшественники эритроцитов (ретикулоциты) получили своё название изза наличия в цитоплазме ретикулярно-сетчатой (зернисто-сетчатой) субстанции. Она состоит из белка и рибосомальной РНК (остатки рибосом и митохондрии). Классическим красителем для подсчёта ретикулоцитов в крови является раствор бриллиантового крезилового синего. Недостатком этого метода является невысокая скорость выполнения анализа и трудоёмкость процесса подсчёта ретикулоцитов (микроскопия). 20 Современные дополнительную гематологические информацию о анализаторы ретикулоцитах дают по уникальную сравнению с микроскопическим подсчётом. Они способны объективно оценивать степень зрелости ретикулоцитов, а также определять их гемоглобинизацию (содержание гемоглобина). Это стало возможным благодаря сочетанию технологии проточной цитометрии и использованию флуоресцентных красителей. Один из таких красителей – полиметин, даёт качественную информацию об организации ретикулоцитов благодаря своей способности проникать в интактную клетку и окрашивать ее внутренние структуры. Пример скатерограммы ретикулоцитарного канала представлен на Рисунке 1.2.2. В ходе анализа образца прибор выстраивает гистограммы распределения клеток по размерам отдельно для эритроцитов и ретикулоцитов и определяет их среднее значение. Середина облака ретикулоцитарной популяции клеток соответствует величине RET-Y, которая с помощью математического алгоритма трансформируется в эквивалент содержания гемоглобина в ретикулоцитах – RETHe, определяемый в пикограммах [13]. RET-He позволяет судить об уровне текущего обеспечения эритропоэза железом. Этот параметр отражает синтез гемоглобина в костномозговых предшественниках эритроцитов и прямо коррелирует с доступностью железа для эритропоэза [111]. Снижение гемоглобинизации ретикулоцитов свидетельствует о том, что эритропоэз протекает в условиях дефицита железа, а у детей первого года жизни оно служит чувствительным гематологическим индикатором латентного дефицита железа [41,143]. Уровень RET-He быстрее других параметров реагирует на изменения обеспеченности эритропоэза железом. При эффективной терапии внутривенными препаратами железа повышение этого параметра наблюдается в течение первых 48 часов от начала лечения, опережая на несколько дней увеличение числа ретикулоцитов [44]. 21 RET-Y Рисунок 1.2.2 Скатерограмма ретикулоцитарного канала (гематологический анализатор Sysmex XT-2000i). Примечание. По оси X откладываются данные канала флюоресценции (SFL-детекция специфического флюоресцентного сигнала; позволяет судить о содержании ДНК/РНК), а по оси Y данные канала прямого светорассеяния (FSC-forward side scatter, характеризует размеры клеток). Синее облако – это эритроциты (нефлюоресцирующие клетки), лилово-красное облако – ретикулоциты. RET-He является чувствительным индикатором изменения обмена железа на фоне воспаления [2,29]. В ответ на провоспалительные сигналы различной природы за счёт увеличения продукции гепцидина (одного из главных регуляторов метаболизма железа) происходит депонирование железа в мононуклеарных фагоцитах [14]. Это ведёт к снижению его доступности для эритропоэза, что немедленно отражается на гемоглобинизации ретикулоцитов и снижает уровень RET-He. При этом снижение уровня гемоглобина в эритроцитах 22 существенно запаздывает, и разница между уровнем гемоглобина в ретикулоцитах и эритроцитах становится отрицательной [58]. В связи с этим, исследование уровня RET-He и его динамики оказалось полезным не только для диагностики анемий и контроля за лечением препаратами железа, но и при инфекционных заболеваниях. Так, у пациентов ОРИТ результаты RET-He могут использоваться при дифференциальной диагностике бактериальных и вирусных инфекций, а также для прогноза течения заболевания [150]. Кроме того, повышение RET-He на фоне антибактериальной терапии у пациентов ОРИТ может быть ранним свидетельством правильного подбора антибактериальной терапии [131]. Приведенные данные свидетельствуют о том, что RET-He может быть использован как один из лабораторных маркеров ТБИ, однако его диагностические характеристики требуют более тщательного изучения. Отметим, что информация о применении RET-He в педиатрической практике особенно ограничена, и в доступной литературе нам не встретилось сообщений, посвященных исследованию данного маркера при инфекционной патологии у детей. 1.3. Использование лабораторных маркеров при фебрильных инфекциях у детей Получение точных результатов исследований должно быть приоритетной задачей каждой лаборатории. Современные справочные руководства охватывают широкий диапазон данных о стабильности образцов, влиянии лекарств на результаты большинства лабораторных тестов [19]. Практическое использование результатов лабораторных исследований не всегда является простой задачей [45]. Для интерпретации результата требуется некий стандарт (определенная величина или интервал величин), с которым сравнивают полученный результат. Очевидно, что интерпретация будет надежной только в том случае, если применять адекватные стандарты. 23 В качестве стандарта можно использовать следующие подходы: 1) сопоставление результатов лабораторного теста с референсным интервалом (РИ); 2) сравнение результата теста с неким дискриминационным уровнем, пороговым значением (в англоязычной литературе используется термин «cut-off», букв. отсечка). РИ лабораторного теста включает диапазон значений, содержащий 95% всех измерений этого теста, выполненных в здоровой популяции [59]. Величина cut-off определяется для конкретного состояния – это значение, которое наилучшим образом разделяет две популяции индивидов (например, с заболеванием и без заболевания). 1.3.1. Стабильность показателей гемограммы Точное измерение показателей гемограммы и клеток крови важно для правильной диагностики, лечения и последующего наблюдения за пациентами с различными заболеваниями, в том числе и у детей [8,143]. На лабораторные показатели могут влиять различные факторы преаналитической фазы выполнения анализа, как эндогенные [19,155], так и внешние, включая технику сбора и условия хранения полученного биологического материала. Стабильность лабораторных показателей при различных температурах хранения изучали в различных биологических жидкостях, в частности, в моче, цельной крови, сыворотке, плазме, спинномозговой жидкости [56,104,125]. В отличие от параметров клинической химии анализ показателей гемограммы включает в себя подсчёт и дифференцировку клеток. Существуют работы, оценивающие стабильность гематологических показателей на одном или параллельно на нескольких анализаторах в одинаковых условиях [40,85,96]. Johnson M. и соавторы [96] проанализировали параллельную работу трех приборов и определили стабильность за короткий промежуток времени (0, 15, 30 и 60 мин.) и длительную стабильность (24 ч) при комнатной температуре 24 хранения образцов крови. Все показатели красной крови были стабильны при комнатной температуре хранения, за исключением MCV. Из-за разной технологии измерения количества клеток и их характеристик стабильность параметров гемограммы может отличаться при использовании разных анализаторов. В ряде работ помимо MCV малой стабильностью также отличалось абсолютное число ретикулоцитов, которое снижалось уже после 24 часов хранения при комнатной температуре [40]. При оценке стабильности субпопуляций лейкоцитов при комнатной температуре хранения в течение 48 ч были обнаружены существенные колебания уровня эозинофилов [85]. Именно поэтому лаборатория должна точно знать, какие условия хранения оптимальны для сохранения стабильности лабораторных показателей, использующихся для диагностики различных заболеваний, в частности ТБИ. 1.3.2. Референсные интервалы РИ служат ориентиром, с которым врач сравнивает результаты анализов и на основе этого сравнения строит заключение о состоянии пациента, принимает то или иное клиническое решение. Результат анализа, выходящий за пределы РИ, может считаться не соответствующим норме. Разработка или подтверждение референсных диапазонов – это достаточно кропотливая работа, которая требует соблюдения определенных протоколов и стандартов, а также существенных временных и материальных затрат. Современные протоколы по определению РИ для мирового лабораторного сообщества разрабатывает Институт клинических и лабораторных стандартов – Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) [59]. Стандарт CLSI С28-A3 [59] рекомендует определять РИ при помощи прямой выборки относительно здоровых лиц из интересующих возрастных групп. Использование непрямой выборки, то есть результатов обследования некоторой популяции больных, полученных ранее, менее предпочтительно, поскольку включение подобных результатов в разработку РИ может привести к смещению его в сторону одной из границ или сделать его неоправданно широким. 25 Для установления референсного диапазона необходимой достоверности, приемлемой с точки зрения международных стандартов, нужно обследовать минимум 120 относительно здоровых лиц [59]. В педиатрической практике обследование 120 практически здоровых детей является трудной задачей и по силам немногим лабораториям. Для решения этой проблемы международные стандарты рекомендуют адаптировать внешние РИ. Согласно другому подходу РИ могут быть получены в ходе совместной разработки при участии нескольких лабораторий в многоцентровом исследовании. Эффективность данного подхода была показана в ряде исследований [67, 68, 72-74,127]. Проблема неполноты РИ по лабораторным исследованиям широко обсуждается в литературе [4,6,97]. При этом основное внимание уделяется биохимическим и разрабатываются иммунохимическим РИ [16,36,48,53]. тестам, Нормативные для которых показатели активно параметров гемограммы у детей давно не пересматривались. Доступные в настоящее время РИ диапазоны во многом «выработали» свой ресурс, поскольку были разработаны в основном несколько десятилетий назад – многие современные справочники (как отечественные, так и зарубежные) дают ссылки на публикации 1970–80-х, и даже 1950-х годов [12,17,33]. Между тем, методы исследования клеточного состава крови, которые применяются в настоящее время, кардинально отличаются от использовавшихся ранее методов. Автоматизированные гематологические анализаторы, практически повсеместно заменившие ручные исследования, для подсчета и дифференцировки клеток крови используют стандартизованные химические и физические методы, включая проточную цитометрию с флуоресцентными красителями, и выводят результат после анализа тысяч клеток. Это позволяет надежно дифференцировать основные субпопуляции лейкоцитов в приборах с функцией 5-DIFF. Однако в отсутствие РИ показателей гемограммы, адаптированных под новые методики, клиническое использование результатов автоматизированного анализа крови может быть затруднительным. Исследования, проведенные во взрослой популяции, свидетельствуют о том, что РИ, полученные с помощью 26 современных гематологических анализаторов, могут отличаться от нормативов, полученных ранее [4,5]. Кроме того, многие педиатрические референсные диапазоны, используемые в настоящее время, были разработаны на основе анализа результатов обследования госпитализированных по тем или иным причинам детей, что является отступлением от стандартных требований получения референсных данных от здоровых лиц [59]. 1.3.3. Диагностические характеристики лабораторного теста Главной характеристикой любого диагностического теста является его способность выявлять определенное состояние у лиц, у которых оно на самом деле имеется, а также исключать данное состояние у тех, у кого оно отсутствует. Наряду с РИ для оценки состояния пациента широко используют так называемые пороговые значения (cut-off), которые обладают рядом преимуществ по сравнению с РИ. Если рассматривать лабораторный тест, то сравнение его результата с РИ не всегда даёт ожидаемую диагностическую информацию. Альтернативным способом использования диагностического теста является определение для него уровня cut-off. Разделяя две популяции индивидов (с заболеванием и без заболевания), cut-off фактически переводит количественный тест в дихотомический качественный – даёт ответ «да» или «нет». Важными характеристиками лабораторного теста служат чувствительность (Se) и специфичность (Sp). Величина Se диагностического теста определяется как доля индивидов c искомым заболеванием, у которых результат лабораторного теста положительный, от всей популяции лиц с заболеванием. Sp рассчитывается как доля индивидов без заболевания, у которых результат лабораторного теста отрицательный, от всей популяции лиц без заболевания. Выбор уровня cut-off определяется требуемым соотношением между чувствительностью (Se) и специфичностью (Sp) [9]. Для графического представления всех вариантов Se и Sp лабораторного теста при выявлении заболевания у пациента используется анализ кривых коллектора рабочих характеристик (ROC-анализ) [45]. Se и Sp идеального лабораторного маркера 27 заболевания будут стремиться к 100%. На практике всегда приходится искать компромисс между ними в зависимости от приоритета задач диагностики: пропускать меньше пациентов с заболеванием (повышать Se) или уменьшать число ложноположительных результатов (повышать Sp). Лабораторный тест, обладающий высокой Se, наиболее информативен, когда его результат отрицательный. Такой результат с высокой вероятностью позволяет исключить заболевание. Тест с высокой Sp полезен для подтверждения заболевания в случае положительного результата, который повышает вероятность заболевания [129]. Применение на практике Se и Sp лабораторного теста ограничено, поскольку они характеризуют долю индивидов с искомым заболеванием или без него в целом по популяции больных или здоровых лиц соответственно, но не вероятность болезни у конкретного пациента. Для оценки диагностической пользы лабораторного теста непосредственно у каждого пациента был предложен ряд показателей, в частности, прогностическая ценность (ПЦ) [128]. ПЦ положительного результата (ПЦПол) определяется как доля лиц с положительным результатом теста, которые фактически имеют заболевание. ПЦ отрицательного результата (ПЦОтр) определяется как доля лиц с отрицательным результатом теста, которые не имеют заболевания. ПЦПол и ПЦОтр могут использоваться для оценки вероятности заболевания, но следует учесть, что эти показатели сильно зависят от распространенности заболевания [22]. Так, чем выше распространенность заболевания, тем выше ПЦПол, что указывает на то, что положительный результат теста может увеличить вероятность наличие заболевания. Однако, когда распространённость заболевания в популяции мала, ПЦПол будет также невелико, даже, если использовать тест с Se и Sp близкими к 100%. Это говорит о том, что данные ПЦПол и ПЦОтр, полученные в ходе одной работы, могут оказаться недостаточно точными при экстраполяции на популяцию пациентов с иной распространенностью заболевания [22]. Более практичным является объединение Se и Sp в одну диагностическую характеристику – отношение правдоподобия (ОП) результата теста [128]. Этот 28 параметр даёт представление о том, во сколько раз (больше или меньше) пациенты с заболеванием имеют определённый результат теста по сравнению с лицами без заболевания [102]. ОП положительного результата (ОППол) определяется как отношение вероятности наличия заболевания у лица с положительным результатом теста (Se) к вероятности такого же результата у человека без заболевания (величина, обратная Sp). ОППол показывает, во сколько раз положительный результат теста более вероятен у лица с заболеванием по сравнению с лицом, у которого нет заболевания. ОППол >1 свидетельствует о том, что положительный результат теста более вероятен у лица с заболеванием, чем без него. И наоборот, если ОППол <1, то положительный результат теста более вероятен у лица без заболевания [60]. В работе Pratt A. и соавторы [121] проанализировали прогностическую ценность анализа С-РБ, числа лейкоцитов и нейтрофилов при выявлении ТБИ у 128 детей в возрасте от 1 до 36 месяцев. Было установлено, что независимо от длительности лихорадки, уровень С-РБ обладал большей прогностической ценностью при диагностике ТБИ по сравнению с число лейкоцитов и нейтрофилов. При cut-off для С-РБ 50 мг/л величина ОППол составила 6,5 (в группе детей с лихорадкой ≤ 12 ч) и 4 (в группе детей с лихорадкой > 12 ч), тогда как значению cut-off лейкоцитов 15х109/л соответствовали ОППол =0,5 (в группе детей с лихорадка ≤ 12 ч) и 1,9 (в группе детей с лихорадка > 12 ч), а cut-off для нейтрофилов 11х109/л соответствовала ОППол =0,9 (в группе детей с лихорадка ≤ 12 ч) и 2,8 (в группе детей с лихорадка > 12 ч) [121]. ОП отрицательного результата (ОПОтр) определяется как отношение вероятности наличия заболевания у лица с отрицательным результатом теста (величина, обратная Se) к вероятности такого же результата у лица без заболевания (Sp). ОПОтр < 1 означает, что отрицательный результат теста более вероятен у здорового по сравнению с лицом, имеющим заболевание. ОПОтр > 1 свидетельствует о том, что отрицательный результат теста более характерен для 29 лица с заболеванием, чем без него [60]. Так, при изучении диагностической точности маркеров по выявлению детей с риском ТБИ (n=408) было установлено, что наименьшей величиной ОПОтр равной 0,19 обладает cut-off для С-РБ 20 мг/л [24]. Мета-анализ [145], включавший 1379 пациентов с лихорадкой, показал, что при дифференциальной диагностике ТБИ, уровень С-РБ обладал наибольшей величиной ОППол (3,15; 95%ДИ 2,67-3,71) и наименьшей величиной ОПОтр (0,33; 95%ДИ 0,22-0,49) [145]. При этом использование многоуровневой оценки результатов ПКТ и С-РБ несёт дополнительную диагностическую информацию при подтверждении и исключении ТБИ. Так, для подтверждения ТБИ у пациента с лихорадкой был использован cut-off для ПКТ 2 нг/мл (данные 2 исследований: ОППол = 13,7 (95%ДИ 7,4-25,3) и ОППол = 3,6 (95%ДИ 1,4-8,9)) и cut-off для С-РБ 80мг/л (ОППол =8,4 (95%ДИ 5,1-14,1)). Для исключения ТБИ у пациента для ПКТ был установлен cut-off равный 0,5 нг/мл, а для С-РБ cut-off составил 20 мг/л [145]. При дифференцировании ТБИ диагностические характеристики числа лейкоцитов оказались более скромными по сравнению с сывороточными маркерами С-РБ и ПКТ: величина ОППол лейкоцитов варьировало в диапазоне от 0,87 до 2,43, а величина ОПОтр была близка к 1 и варьировала в пределах от 0,64 до 1,41. Более эффективным было использование сочетания результатов нескольких лабораторных маркеров: объединение результатов для С-РБ, лейкоцитов и ПКТ обладало ОППол = 4,92 (95%ДИ 3,26-7,43), при этом ОПОтр= 0,07 (0,02-0,27) [145]. При диагностике ТБИ имеет значение вероятность заболевания до получения результата исследования, то есть «претестовая вероятность». Она складывается на основе данных анамнеза, клинического осмотра, знания о распространённости заболевания в конкретной популяции, опыта врача и т.п. [64]. Вероятность заболевания у пациента после получения результатов теста называют «посттестовой вероятностью». Оценить влияние ОП на посттестовую вероятность заболевания математически позволяет теорема Байеса. Применительно к лабораторному тесту, теорема описывает, как результат теста изменяет исходные предположения о 30 вероятности заболевания [79]. На практике для расчета используют номограмму Фагана, которая представляет собой графический калькулятор посттестовой вероятности заболевания в зависимости от претестовой вероятности и величины ОП [46,65] (Рисунок 1.3.1). Рисунок 1.3.1 Номограмма Фагана Примечание. На шкале слева отсчитывается претестовая вероятность заболевания (ПреВ); в центре отношение правдоподобия результата теста (ОП), справа посттестовая вероятность заболевания (ПостВ). Соединяя точку на оси «ПреВ» с точкой на оси «ОП» и продолжая линию до оси «ПостВ», получаем вероятность заболевания у конкретного пациента. 31 Интерпретация результата лабораторного теста сводится к его сравнению со значением cut-off (больше или меньше). Далее оценивается, как результаты теста изменяют посттестовую вероятность заболевания. Чем больше отличается результат лабораторного теста от cut-off, тем большее влияние такой результат оказывает на посттестовую вероятность заболевания у конкретного лица. Данную зависимость описывает многоуровневая оценка ОП и посттестовой вероятности. Фактически это оценка вероятности заболевания в зависимости от величины результата лабораторного теста. Так, в возрастной группе детей от 1 до 36 месяцев с лихорадкой без видимого очага инфекции многоуровневая оценка посттестовой вероятности ТБИ при результатах ПКТ больше 0,2 нг/мл, 0,5 нг/мл, 2 и 10 нг/мл составила 35%, 42%, 58% и 100% соответственно [108]. В большинстве работ выбор cut-off для многоуровневой осуществляется оценки ОП эмпирически и посттестовой вероятности [108,123]. Однако заболевания использование высокочувствительного (Se=95%) и высокоспецифичного (Sp=95%) cut-off позволяет конструктивно подойти к вопросу диагностики различных заболеваний, что может использоваться при выявлении детей с риском ТБИ [119]. Таким образом, важно понимать, что диагностические характеристики лабораторных маркеров ТБИ зависят условий оказания медицинской помощи. Так, данные, полученные на популяции пациентов ОРИТ, затруднительно использовать в условиях поликлиники. Применение на практике лабораторных маркеров ТБИ должно сопровождаться тщательным исследованием диагностических характеристик в конкретных условиях оказания медицинской помощи. В связи с этим необходимо изучение диагностических характеристик лабораторных маркеров ТБИ у детей с последующей валидацией и разработкой алгоритма интерпретации. 32 ГЛАВА 2. ОБЪЕМ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научный центр здоровья детей» (ФГБНУ НЦЗД) (директор – академик РАН, профессор А.А. Баранов). Исследование проводилось в период с 2011 по 2013 год. Для выполнения поставленных задач было исследовано 913 образцов крови от 716 детей, проходивших профилактическое медицинское обследование в консультативнодиагностическом центре ФГБНУ НЦЗД (главный врач к.м.н. А.К. Геворкян) и детей, обратившихся с лихорадкой в отделение неотложной педиатрии с группой анестезиологии-реанимации (заведующая отделением д.м.н. Т.В.Куличенко). Сывороточные исследования и анализ показателей гемограммы проводились на базе лабораторного отдела ФГБНУ НЦЗД (руководитель – д.м.н. Н.А. Маянский). 2.1. Определение стабильности показателей гемограммы В исследование вошли случайно отобранные образцы венозной крови, поступившие в лабораторию для рутинного исследования. Образцы крови для исследования собирали путем венепункции с помощью вакуумных систем для забора крови — одноразовых полипропиленовых пробирок с К3-ЭДТА, держателей и игл («Vacutainer», Becton Dickinson, США). Анализ показателей гемограммы выполняли не позднее 2 ч после ее забора (точка 0 ч). Для исключения случайной ошибки при измерении прибором стабильность гематологических показателей крови исследовали в 2 аналитических сериях: 40 образцов анализировали в одни 72 ч, а 14 — в другие. Далее образцы разделили в зависимости от условий хранения: 27 образцов крови хранили в холодильнике (при 4-8°С), другие 27 — при комнатной температуре (22°C). После разделения на две группы стабильность образцов оценивали через каждые 24 ч в течение трех дней на анализаторе Sysmex XT-2000i (Sysmex Corporation, Япония). Перед 33 каждым исследованием стабильности крови (0, 24, 48 и 72 ч) образцы перемешивали на вращающемся штативе IntelliMixer RM-1M в течение 3 мин. В крови оценивали стабильность следующих показателей: гемоглобин, число эритроцитов, гематокрит, MCH (mean corpuscular hemoglobin) — среднее содержание гемоглобина в 1 эритроците, MCV (mean corpuscular volume) — средний объем эритроцита, MCHC (mean corpuscular hemoglobin concentration) — средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах, абсолютное число ретикулоцитов, RET-He (reticulocyte hemoglobin equivalent) — эквивалент содержания гемоглобина в ретикулоцитах, общее число лейкоцитов, нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов и базофилов, а также число тромбоцитов. Стабильность аналитов описывали как процентное изменение среднего за каждые прошедшие 24 ч (величина ∆). Показатель считали стабильным, если ∆ его среднего значения со временем не превышала 5% величины начального среднего. Для каждого показателя с помощью критерия Фридмана проверили гипотезу о равенстве распределений для связанных выборок. Отличия результатов считали статистически значимыми при p < 0,05. Кроме того, для исследованных параметров вычисляли Me — медиану, 25 и 75-й перцентили. СVa (%) — коэффициент аналитической вариации — рассчитывали по формуле СО/среднее арифметическое Х 100, где СО — стандартное отклонение. 2.2. Расчёт референсных интервалов показателей гемограммы РИ показателей гемограммы определили у относительно здоровых детей в рамках профилактического медицинского осмотра. Дети были эмпирически разделены на 4 возрастные группы: < 12, 12–60, 61–120, > 120 месяцев. У детей < 12 месяцев исследовали капиллярную кровь, собранную в пробирки «Microvette» с К3-ЭДТА (Becton Dickinson). В капиллярной крови число лейкоцитов может отличаться на 3–12% в сторону увеличения от венозной крови [160]. РИ рассчитывали для общего числа лейкоцитов, нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов, базофилов, тромбоцитов, гемоглобина, числа 34 эритроцитов, гематокрита, MCV, MCH, MCHC, RDW-CV, общего числа ретикулоцитов, IRF, LFR и RET-He. Для определения РИ использовали статистические подходы, рекомендованные CLSI C28-A3 [6,59]. В связи с тем, что распределение результатов измерений большинства оцениваемых показателей существенно отличалось от нормального, мы использовали преобразование Бокса–Кокса [98], чтобы приблизить распределение признака к нормальному. После этого определяли и исключали из дальнейшего анализа статистические выбросы по каждому параметру по методу Тьюки [142] на основе интервала нормальных значений: [Q1–1,5xIQR, Q3+1,5xIQR], где Q1, Q3 — границы первого и третьего квартилей, IQR = Q3–Q1 — межквартильный размах. На втором этапе при помощи дисперсионного анализа (ANOVA) и post-hoc-тестов определяли целесообразность выделения групп по возрасту при расчете РИ, где группа по возрасту выступала фиксированным фактором, а показатель гемограммы — зависимой переменной [83]. При равенстве дисперсий в группах использовали поправку Бонферрони, при отсутствии такого равенства — поправку Даннета Т3. Разделение считали целесообразным при значимости различий средних между группами p < 0,05. Затем при числе наблюдений в группе > 120 для расчета РИ использовали метод на основе квантилей распределения. Для получения 95% РИ референсные границы устанавливали на уровне квантилей 2,5 и 97,5, после чего проводили обратную трансформацию Бокса–Кокса полученных значений для их возвращения к исходной шкале признака. При числе наблюдений в группе < 120 использовали робастный метод расчета РИ на исходных шкалах признака, а референсные границы устанавливали также на уровне 2,5 и 97,5 квантилей [59,88,89]. Корреляцию показателей гемограммы с возрастом оценивали с помощью коэффициента Пирсона r. Корреляцию считали сильной при r > 0,7; умеренной — при r = 0,5–0,7; слабой — при r < 0,5. Для сравнения показателей гемограммы использовали тест Манна–Уитни, различия считали статистически значимыми при p < 0,05. Кроме того, для исследованных параметров вычисляли 35 Ме – медиану, М – среднее арифметическое, СО – стандартное отклонение, CV – M коэффициент межиндивидуальной вариации – по формуле СО/М*100. 2.3. Диагностические характеристики лабораторных маркеров тяжелой бактериальной инфекции При дифференциальной диагностике ТБИ у детей с фебрильными инфекциями оценивалась диагностическая точность показателей гемограммы (лейкоциты, нейтрофилы, незрелые гранулоциты и RET-He) и сывороточных маркеров острого воспаления (С-РБ и ПКТ). Критерии включения пациентов в исследование: 1.Обратившиеся в отделение неотложной помощи дети с фебрильной лихорадкой (≥ 38°С). 2.Возраст пациентов младше 5 лет. 3.Отсутствие видимого очага бактериальной инфекции при поступлении в стационар. 4.Предшествующая антибактериальная терапия ≤ 1 дозы антибиотика. Критерии исключения пациентов из исследования: 1.Верифицированный при поступлении очаг бактериальной инфекции (острый стрептококковый тонзиллит, острый средний отит, острый гнойный риносинусит, инвазивная диарея, явления дизурии, указывающие на инфекцию мочевыводящих путей). 2.Синдром бронхиальной обструкции. 3.Инфекционный мононуклеоз. Показатели гемограммы исследовали на анализаторе Sysmex XT-2000i Уровень С-РБ измеряли с помощью иммунотурбидиметрического метода на автоматическом биохимическом анализаторе Unicel DxC 800 (Beckman Coulter, США), ПКТ исследовали на автоматическом иммунофлуоресцентном анализаторе MiniVidas (BioMereux, Франция). 36 Для определения диагностической точности исследованных показателей при выявлении ТБИ мы провели анализ коллектора рабочих характеристик (ROCанализ) [45]. Общее представление о мере аналитической точности теста даёт площадь под ROC-кривой (area under the curve, AUC), которая может принимать значения от 0 до 1. Чем больше AUC, тем выше точность лабораторного теста: высокая – AUC > 0,9; средняя – AUC = 0,7-0,9; низкая – AUC = 0,5-07; отсутствует – AUC ≤ 0,5 [70]. Диагностические характеристики лабораторного показателя рассчитывали с помощью четырёхпольной таблицы (Таблица 2.3.1) [9]. Эта таблица даёт представление о том, насколько совпадают результаты диагностического теста с результатами окончательного теста (золотого стандарта). В качестве болезни принимали ТБИ. Золотым стандартом, определяющим наличие или отсутствие ТБИ, являлась постановка диагноза на основе клинических данных, а также ряда дополнительных инструментальных и микробиологических методов исследования. Таблица 2.3.1 Четырехпольная таблица для расчета характеристик диагностического теста Болезнь Тест Присутствует Отсутствует Положительный a (ИП) b (ЛП) Отрицательный с (ЛО) d (ИО) Примечание. ИП – истинноположительный, ЛП – ложноположительный, ЛО – ложноотрицательный, ИО – истинноотрицательный результаты тестов. 37 Для исследованных показателей на основе четырёхпольной таблицы рассчитывали основные диагностические характеристики Se=a/(a+c) (1) Sp=d/(b+d) (2) ОППол=Se/(1-Sp) (3) ОПОтр=(1-Se)/Sp, (4) лабораторных маркеров: где Se – чувствительность, Sp – специфичность, ОППол – отношение правдободобия положительного результата ОПОтр теста, – отношение правдободобия отрицательного результата теста. Для каждого показателя рассчитывали пороговое значение (cut-off), которое достоверно дифференцирует ТБИ и не ТБИ. Вычисления проводили с помощью двух методов одновременно. Согласно первому методу cut-off рассчитывается как минимальное значение выражения ((1-Se)²+(1-Sp)²) [118]. Таким образом определяется оптимальное сочетание Se и Sp диагностического теста. Графически это выглядит как сочетание Se и Sp наиболее близко расположенное к точке (0;1) на диаграмме анализа ROC-кривой. Второй метод – расчёт cut-off с помощью Youden index [71]. Согласно этому методу оптимальному значению cut-off соответствует максимальное значение выражения (Se+Sp-1). На диаграмме это соответствует максимальному расстоянию по вертикали между ROC кривой и референсной линией. Кроме того, рассчитывали вероятность наличия у пациента ТБИ до получения результата лабораторного теста (претестовая вероятность, ПреВ). Учитывая, что посттетсовые шансы (ПостШ) наличия заболевания у пациента зависят от претестовых шансов (ПреШ) и ОП лабораторного теста [27], для исследованных показателей рассчитывали посттестовые шансы (ПостШ): ПостШ=ПреШ х ОП (5) ПреШ рассчитывали из ПреВ по формуле: ПреШ=ПреВ/(1-ПреВ) (6) 38 Далее ПостШ конвертировали в ПостВ по формуле: ПостВ=ПостШ/(1-ПостШ) (7) Для исследованных параметров рассчитывали Ме и 95%ДИ. Различия между показателями в группе с ТБИ и без ТБИ считали статистически значимыми при p< 0,05. 2.4. Статистические методы исследования Обработку полученных данных проводили с использованием Microsoft Office Excel и статистического пакета SPSS 20. Подробное статистических методов приведено в соответствующих разделах. описание 39 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Стабильность показателей гемограммы в зависимости от времени и температуры хранения образцов крови Анализ гемограммы является одним из наиболее востребованных лабораторных исследований. Внедрение в лабораторную практику современных гематологических анализаторов сделало доступным измерение множества различных параметров, которые активно используются клиницистами. На практике не всегда удается провести исследование гемограммы на анализаторе немедленно после получения образца, в связи с чем важной задачей является обеспечение оптимальных условий хранения крови перед проведением анализа. В данном исследовании мы установили, как различная температура (4-8°С и комнатная температура) и время хранения (до 72 ч) образцов цельной крови влияют на стабильность показателей гемограммы, оцененных с помощью гематологического анализатора Sysmex-XT 2000i. Всего проанализировали 54 образца крови, при исследовании которых было получено 2800 числовых результатов, включенных в статистическую обработку. В расчеты вошли как нормальные, так и патологические значения исследованных параметров (указаны минимум-максимум): гемоглобин 71–171 г/л, эритроциты 2,71–6,03 x 1012/л, гематокрит 33,6–60,7%, MCH 18,6–31,5 пг, MCHC 270–350 г/л, MCV 63,6–98,6 фл, ретикулоциты 13,8–129,3 x 109/л, RET-He 17,7–37,8 пг, лейкоциты 3,42–21,58 x 109/л, нейтрофилы 1,30–14,40 x 109/л, лимфоциты 1,11– 8,12 x 109/л, моноциты 0,22–2,56 x 109/л, эозинофилы 0,02–0,98 x 109/л, базофилы 0,01–0,08 x 109/л, тромбоциты 93–969 x 109/л. Для использования результатов анализа гемограммы важно иметь представление об аналитической точности измерений анализатора. Для этого был 40 рассчитан коэффициент аналитической вариации (CVa) показателей гемограммы. Наши результаты полностью укладываются в заявленные производителем характеристики, а в большинстве случаев составляют в 2–3 раза меньшую величину (Таблица 3.1.1). Более того, значения CVa всех параметров соответствовали требованиям, предъявляемым к аналитическим системам с учетом биологической вариации оцениваемых показателей. При 4-8°C эритроцитарные показатели, включая гемоглобин, эритроциты, MCH, MCHC, а также число ретикулоцитов и RET-He были стабильны в течение всего периода наблюдения, то есть 72 ч (∆ < 5%) (Рисунок 3.1.1А). В этих же условиях значения MCV и гематокрит при хранении > 24 ч возрастали статистически значимо (p = 0,005 в точке 48 ч и p < 0,001 в точке 72 ч), но в пределах начального среднего. При комнатной температуре хранения показатели MCV и гематокрит увеличивались уже после 24 ч хранения, и отклонение от начального среднего составило +8%, а на момент окончания исследования достигло +18% (p в обоих случаях < 0,001; Рисунок 3.1.1Б). При тех же условиях хранения показатель MCHC значимо снижался после 24 часов хранения (∆ = -8%) и к 72 часам достигал -16% (Рисунок 3.1.1Б). Число ретикулоцитов при комнатной температуре также не отличалось стабильностью и колебалось от -15% после 24 ч хранения до +8% после 72 ч хранения от уровня начального среднего (Рисунок 3.1.1Б; Таблица 3.1.1). При температуре 4-8°С число ретикулоцитов оставалось стабильным в течение всего периода наблюдения (до 72 ч). Абсолютные показатели тромбоцитов, общего числа лейкоцитов, а также абсолютного числа нейтрофилов, лимфоцитов и базофилов оказались стабильны на протяжении 72 ч наблюдения в обоих температурных условиях (Таблица 3.1.1; Рисунок 3.1.1В,Г). Число моноцитов, оставаясь стабильным при 4-8°С, явно снижалось с течением времени при хранении образцов при комнатной температуре более 24 ч (∆ = -38% к 72 ч, p < 0,001; Рисунок 3.1.1Г). Не отличалось стабильностью и число эозинофилов. Уже после 24 ч хранения при 4-8°С их число увеличивалось (∆ = +10%), а к окончанию срока наблюдения величина ∆ 41 достигала +32% (Рисунок 3.1.1В). При комнатной температуре к 72 ч хранения число эозинофилов также возрастало (∆ = +24%; рисунок 3.1.1Г). Несмотря на заметное относительное изменение, абсолютные величины содержания эозинофилов отличались статически незначимо (р = 0,13; Таблица 3.1.1). Рисунок 3.1.1 Влияние времени и температуры хранения на показатели гемограммы Примечание. Образцы крови после взятия хранили при температуре 4-8°С (А, В) или 22°С (Б, Г) и анализировали в указанные моменты времени от начала хранения. Рассчитывали изменение среднего (∆) в точках 24, 48 и 72 ч в % по отношению к среднему в точке 0 ч. А, Б – эритроцитарные и ретикулоцитарные показатели (MCH – среднее содержание гемоглобина в 1 эритроците, MCV – средний объём эритроцита, MCHC – средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах, RET-He – эквивалент содержания гемоглобина в ретикулоцитах). В, Г – лейкоциты, их субпопуляции, тромбоциты. 42 Таблица 3.1.1 Стабильность показателей гемограммы в зависимости от температуры и времени хранения Показатель Ед. изм. CVa, % Фактичес Техничес кий кий Гемоглобин г/л 0,61 <1,5 Эритроциты x1012/л 0,53 <1,5 MCH пг 0,69 <1,5 MCV фл 0,27 <1,5 x109/л 7,55 <15 пг 1 НД Лейкоциты 1,16 <3 Нейтрофилы 2,03 <8 2,96 <8 Моноциты 3,64 <20 Эозинофилы 3,10 <25 Базофилы 27,1 <40 Ретикулоциты RET-He Лимфоциты x109/л Медиана (25P-75P) 22°С 4-8°С 22°С 4-8°С 22°С 4-8°С 22°С 4-8°С 22°С 4-8°С 22°С 4-8°С 22°С 4-8°С 22°С 4-8°С 22°С 4-8°С 22°С 4-8°С 22°С 4-8°С 22°С 4-8°С 0 ч. 24 ч. 48 ч. 72 ч. 129 (122-140) 131 (123-134) 4,79 (4,6-5,24) 4,68 (4,40-4,90) 26,8 (26,2-27,6) 28,1 (25,5-29) 81,6 (79,8-84,9) 83,5 (79,0-88,0) 41,4 (31,9-51,4) 32,7 (24,8-43,2) 31,3 (28,8-33,1) 30,9 (29,6-33) 8,46 (5,91-9,93) 6,80 (5,30-10,66) 3,79 (3,05-6,36) 2,8 (2,22-4,93) 2,67 (1,62-3,54) 2,5 (1,94-4,16) 0,64 (0,51-0,84) 0,62 (0,51-1,18) 0,12 (0,07-0,28) 0,18 (0,08-0,26) 0,02 (0,01-0,03) 0,02 (0,01-0,03) 128(121-142) 130 (123-134) 4,79 (4,6-5,17) 4,66 (4,36-4,94) 27 (25,5-27,6) 28 (25,5-29,1) 88,7 (86,4-91,5) 85,4 (80-89,5) 36,0 (30,4-46,7) 34,0 (25,2-46,3) 30,0 (28,2-33,4) 30,8 (28,4-32,2) 8,41 (5,92-10,26) 6,98 (5,44-10,98) 4,08 (3,07-6,74) 2,83 (2,25-5,29) 2,61 (1,7-3,5) 2,8 (2,24-4,62) 0,57 (0,40-0,80) 0,67 (0,52-1,18) 0,10 (0,07-0,28) 0,20 (0,08-0,28) 0,02 (0,01-0,03) 0,02 (0,01-0,03) 128 (122-141) 130 (124-135) 4,78 (4,57-5,23) 4,69 (4,37-4,92) 27,1 (25,6-27,9) 28 (25,5-29) 93,7 (89,8—96,8) 85,8 (80,5-90,5) 42,4 (26,6-51,6) 33,7 (26,8-43,0) 29,7 (28,6-32,1) 30,7 (29,1-32,5) 8,44 (5,97-9,94) 6,92 (5,48-11,08) 4,16 (2,97-6,77) 2,83 (2,21-4,83) 2,55 (1,6-3,49) 2,94 (2,12-4,42) 0,51 (0,28-0,71) 0,66 (0,50-1,13) 0,13 (0,11-0,31) 0,20 (0,18-0,35) 0,02 (0,01-0,03) 0,02 (0,01-0,03) 127 (123-141) 130 (120-135) 4,77 (4,6-5,19) 4,62 (4,38-4,88) 27 (25,7-27,8) 28,1 (25,5-29,3) 96,3 (92,9-100) 86,5 (81,2-91) 45,5 (29,6-60,4) 31,6 (26,0-41,4) 29,4 (28,3-31,6) 30,1 (29,2-32,1) 7,96 (5,94-10,16) 6,94 (5,35-10,91) 4,14 (3,09-6,84) 3,06 (2,16-5,00) 2,48 (1,64-3,47) 2,79 (2,09-4,28) 0,41 (0,26-0,60) 0,62 (0,48-1,06) 0,12 (0,08-0,29) 0,24 (0,13-0,36) 0,02 (0,01-0,03) 0,02 (0,01-0,03) P1 P2 P3 NS <0,001 NS <0,001 0,005 <0,001 <0,001 0,013 NS 0,010 NS NS NS NS NS 0,005 NS <0,001 NS NS NS 0,02 NS NS Примечание. MCH – среднее содержание гемоглобина в 1 эритроците, MCV – средний объём эритроцита, RET-He – эквивалент содержания гемоглобина в ретикулоцитах. Данные представлены в виде: медиана (25-75-ый перцентили). CVa (%) – коэффициент аналитической вариации. НД – нет данных. P – уровень p при проверке гипотезы о равенстве распределений в связанных выборках по критерию Фридмана между начальными данными (0 ч) и результатами после 24 ч хранения (P1), 48 ч хранения (P2) и 72 ч хранения (P3). NS – отличия статистически незначимы. 43 Колебания в составе субпопуляций лейкоцитов при хранении образцов не сопровождались заметными изменениями общего уровня лейкоцитов. На Рисунке 3.2 (справа) представлена типичная скатерограмма дифференцировки лейкоцитов после 72-часового хранения образца при комнатной температуре. На данной скатерограмме отчетливо заметно сближение «облаков» различных субпопуляций лейкоцитов по сравнению с начальным измерением (Рисунок 3.1.2, слева) в основном за счет снижения флуоресцентного сигнала (ось Y на скатерограммах). Описанные изменения приводят к перераспределению числа клеток между субпопуляциями и искажению результатов их дифференцировки. Отметим, что хранение образцов крови при 4-8°С предохраняло их от подобных явлений и позволяло правильно разделить субпопуляции лейкоцитов на протяжении всех 72 ч наблюдения (Рисунок 3.2, в центре). Рисунок 3.1.2 Скатерограммы дифференцировки лейкоцитов в зависимости от температуры и длительности хранения образцов Примечание. Скатерограмма слева – 0 ч, в центре – через 72 ч при 4-8°С, справа – через 72 ч при 22°С 44 Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что большинство параметров гемограммы стабильны в течение как минимум 24 ч вне зависимости от температуры хранения. Более того, нахождение образцов при 48°С позволяет хранить их в течение 72ч без существенных изменений всех изученных параметров (за исключением гематокрита, MCV и числа эозинофилов). Эти результаты следует учитывать при планировании преаналитического этапа анализа гемограммы. В случае вероятной отсрочки проведения анализа более чем на 24 ч образцы крови для исследования следует транспортировать и хранить при 4-8°С. 45 3.2. Референсные интервалы показателей гемограммы у детей Для уверенного использования результатов исследования показателей гемограммы требуется сравнение данных анализа с референсными (нормальными) значениями, которые обычно заключены в РИ, имеющий верхнюю и нижнюю границы. Исследование клеточного состава крови (анализ гемограммы) является одним из наиболее доступных и информативных лабораторных тестов, который востребован клиницистами всех специальностей. Результаты исследования используются для оценки наличия анемии, тромбоцитопении, а также для диагностики бактериальных инфекций у детей с лихорадкой [12,108]. В настоящей работе мы приводим РИ, рассчитанные согласно стандарту CLSI C28A3 [59], для показателей гемограммы, содержание которых определяли в крови здоровых детей с помощью гематологического анализатора Sysmex XT-2000i. Всего в исследование был включен 291 ребенок. У 5 детей (1,7%) была обнаружена анемия (гемоглобин < 110 г/л), и они были исключены из дальнейшего анализа. Таким образом, для расчета РИ мы учитывали гемограммы 286 детей (167 мальчиков, 119 девочек). Медиана возраста по группам составила (в скобках указаны 25–75 перцентили): < 12 месяцев — 4 (4–5) месяца, 12–60 месяцев — 31 (26–36) месяц, 61–120 месяцев — 98 (78–108) месяцев, > 120 месяцев — 138 (131–158) месяцев. Минимальный возраст составил 3 месяца, максимальный — 207 месяцев. Результаты определения РИ лейкоцитов, их субпопуляций, тромбоцитов представлены в Таблице 3.2.1. Отметим, что сумма n в строках не всегда соответствует 286 из-за удаления из расчетов значений, соответствующих статистическим выбросам. Большинство исследованных показателей потребовали расчета отдельных РИ для разных возрастных групп. Возрастные изменения лейкоцитов, их субпопуляций и тромбоцитов показаны на Рисунке 3.2.1. При оценке влияния возраста на общее число лейкоцитов была обнаружена статистически значимая обратная корреляция умеренной силы между возрастом и 46 общим числом лейкоцитов (r = -0,53; p < 0,001). Медиана общего числа лейкоцитов снижалась с 9,0 х 109/л (95% ДИ 8,6–9,6 х 109/л) у детей < 12 месяцев до 7,6 х 109/л (95% ДИ 7,2–7,9 х 109/л) у детей > 120 месяцев (Рисунок 3.2.1А). Число основных субпопуляций лейкоцитов также зависело от возраста. Наиболее выраженные возрастные изменения происходили с числом лимфоцитов (Рисунок 3.2.1А), медиана которых снижалась с 6,1 х 109/л (95% ДИ 5,9–6,4 х 109/л) в младшей возрастной группе до 2,4 х 109/л (95% ДИ 2,3–2,5 х 109/л) — у более старших детей (сильная отрицательная корреляция между возрастом и числом лимфоцитов, r = -0,71; p < 0,001). Число нейтрофилов, напротив, с возрастом увеличивалось (положительная корреляция с возрастом умеренной силы, r = 0,53; p < 0,001). Рисунок 3.2.1 Возрастная динамика показателей гемограммы. Данные представлены в виде медианы ±95% ДИ (ДИ – доверительный интервал) 47 Это увеличение отражало повышение медианы их числа с 1,6 х 109/л (95% ДИ 1,5–2,0 х 109/л) у детей < 12 месяцев до 3,0 х 109/л (95% ДИ 2,8–3,3 х 109/л) — у детей > 120 месяцев (Рисунок 3.2.1А). Число эозинофилов также зависело от возраста и демонстрировало тенденцию к снижению у старших детей (слабая отрицательная корреляция с возрастом, r = -0,37; p < 0,001). Медиана числа эозинофилов у младших детей составила 0,27 х 109/л (95% ДИ 0,23–0,34 х 109/л), тогда как в самой старшей возрастной группе она снижалась до 0,12 х 109/л (95% ДИ 0,11–0,15 х 109/л) (Рисунок 3.2.1Б). Содержание тромбоцитов имело сильную обратную корреляцию с возрастом (r = -0,71; p < 0,001), их медиана уменьшалась с 418 х 109/л (95% ДИ 401–448 х 109/л) в группе обследованных < 12 месяцев до 258 х 109/л (95% ДИ 243–273 х 109/л) — у детей > 120 месяцев (Рисунок 3.2.1В). Влияние возраста на число моноцитов и базофилов в обследованной популяции не было статистически значимым (Рисунок 3.2.1Б). При анализе полученного РИ для числа нейтрофилов у детей < 12 месяцев мы обратили внимание на то, что его граница 0,6 x 109/л (или 600 клеток/мкл) ниже широко используемого уровня в 1000 клеток/мкл (Таблица 3.2.1). Оказалось, что у 15% детей (15 из 102) в этой возрастной группе число нейтрофилов было < 1000 клеток/мкл (Таблица 3.2.2). По сравнению с детьми аналогичного возраста, у которых число нейтрофилов было > 1000 клеток/мкл, в этой группе детей также было снижено число других субпопуляций лейкоцитов и тромбоцитов (Таблица 3.2.2). При этом показатели красной крови, включая гемоглобин, эритроциты и ретикулоциты, у детей с низким числом нейтрофилов отличались статистически незначимо от этих показателей у детей с числом нейтрофилов > 1000 клеток/мкл (Таблица 3.2.2). При повторном исследовании крови, проведенном в течение последующих 6 месяцев, у 10 из 15 детей сохранялось низкое число нейтрофилов, однако никаких особенностей по сравнению с остальными детьми выявлено не было. клинических 48 Таблица 3.2.1 Референсные интервалы лейкоцитов, их субпопуляций и тромбоцитов у детей Показатель (× 109/л) Лейкоциты Нейтрофилы Лимфоциты Моноциты Эозинофилы Базофилы Тромбоциты <12 Возраст (месяцев) 12-60 60-120 >120 6,0-13,6 3,9-11,5 n=121 n=163 0,6-3,6 1,1-5,8 n=101 n=182 3,3-9,0 1,6-7,1 0,9-5,0 1,1-3,8 n=102 n=20 n=72 n=92 0,37-1,26 n=282 0,07-0,88 0,02-0,65 n=121 n=161 0,00-0,05 n=284 267-580 175-436 n=102 n=182 Анализ РИ показателей красной крови в обследованной выборке детей выявил значимое влияние возраста на средние уровни гемоглобина, эритроцитов, гематокрита, MCV, MCH и RET-He (Таблица 3.2.3). Средние уровни гемоглобина, гематокрита, MCV у детей младшей возрастной группы и детей в возрасте 12-60 месяцев статистически значимо не различались (p > 0,05), поэтому для расчёта РИ они были объединены. Возраст не оказывал значимого влияния (p > 0,05) на средние уровни MCHC, RDW-CV, число ретикулоцитов, LFR и IRF, что при расчете РИ позволило объединить все возрастные группы (Таблица 3.2.3). Возрастное увеличение среднего уровня гемоглобина, MCV и MCH на фоне относительно стабильного количества эритроцитов свидетельствует о повышении гемоглобинизации эритроцитов у более старших детей (Таблица 3.2.3). Статистически значимые половые различия гематологических параметров в обследованной популяции зафиксированы не были. 49 Таблица 3.2.2 Сравнение показателей гемограммы у детей < 12 месяцев в зависимости от числа нейтрофилов Показатель Число нейтрофилов < 1 х 109/л (n=15) ≥ 1 х 109/л (n=87) Р Медиана (Р25-Р75) Медиана (Р25-Р75) 4 (4-5) 4 (4-5) NS Лейкоциты (х 109/л) 7,13 (6,16-7,71) 9,41 (8,30-10,25) <0,001 Нейтрофилы (х 109/л) 0,88 (0,68-0,91) 1,86 (1,3-2,36) <0,001 Лимфоциты (х 109/л) 5,77 (4,74-6,12) 6,30 (5,21-7,38) 0,024 Моноциты (х 109/л) 0,54 (0,43-0,71) 0,7 (0,58-0,87) 0,004 Эозинофилы (х 109/л) 0,13 (0,11-0,19) 0,3 (0,21-0,45) <0,001 Базофилы (х 109/л) 0,03 (0,01-0,03) 0,03 (0,02-0,04) NS Тромбоциты (х 109/л) 381 (329-458) 427 (374-486) 0,025 Гемоглобин (г/л) 119 (116-125) 122 (118-127) NS Эритроциты (х 1012/л) 4,56 (4,29-4,77) 4,59 (4,40-4,82) NS MCV (фл) 78,9 (75,2-81,9) 78,3 (75,6-80,3) NS Ретикулоциты (x109/л) 30,1 (23,1-39,3) 35,4 (28,9-44,2) NS RET-He (пг) 30,0 (28,6-31,0) 29,6 (28,8-30,6) NS Возраст (месяцы) Примечание. Данные представлены в виде: Me – медиана, Р25-Р75 – (25-75-ый перцентили). MCV- средний объём эритроцита, RET-He-эквивалент содержания гемоглобина ретикулоцитах. p – уровень значимости отличий Me, NS – отличия статистически незначимы. в 50 Таблица 3.2.3 Референсные интервалы эритроцитарных и ретикулоцитарных показателей у детей Показатель Ед. изм. Возраст (месяцев) < 12 12-60 111-133 (n=120) 122 61-120 > 120 114-147 (n=70) 130 118-155 (n=91) 135 Гемоглобин г/л РИ Ме Эритроциты х1012/л РИ Ме Гематокрит % РИ Ме фл РИ Ме MCH пг РИ Ме MCHC г/л РИ Ме 320-353 (n=65)* 342 RDW-CV % РИ Ме 12,0-14,5 (n=63)* 13,0 х109/л РИ Ме 17,8-64,9 (n=284) 33,5 ‰ РИ Ме 3,9-13,4 (n=284) 7,0 LFR % РИ Ме 91,7-99,3 (n=64)* 96,6 IRF % РИ Ме 0,7-8,3 (n=64)* 3,5 пг РИ Ме MCV Ретикулоциты RET-He 4,02-5,30 (n=121) 4,60 4,09-5,33 (n=164) 4,77 32-40 (n=122) 36 35-43 (n=72) 40 37-46 (n=89) 41 71,5-86,3 (n=120) 78,6 76,6-89,7 (n=71) 83,4 78,6-92,9 (n=90) 85,2 23,9-29,3 (n=119) 26,7 26,9-32,7 (n=102) 29,7 24,9-30,4 (n=160) 28,0 27,3-35,6 (n=184) 32,2 Примечание. РИ – референсный интервал (2,5-97,5 процентили), Ме – медиана. Здесь и в таблице 3.2.4: MCV – средний объём эритроцита, MCH – среднее содержание гемоглобина в 1 эритроците, MCHC – средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах, RDW-CV - ширины распределения эритроцитов по объёму, LFR – фракция зрелых ретикулоцитов, IRF –фракция незрелых ретикулоцитов , RET-He – эквивалент содержания гемоглобина в ретикулоцитах. РИ показателей, отмеченных * были рассчитаны на группе из n=65 здоровых детей. 51 Анализ межиндивидуальной вариации (CVM) эритроцитарных и ретикулоцитарных параметров показал, что большинство из них меняются в диапазоне 2-8% (Таблица 3.2.4). Исключение составляют количество ретикулоцитов и процентное содержание их незрелой фракции, которые колеблются в более широких пределах (от 33 до 54%). Таблица 3.2.4 Межиндивидуальная вариабельность эритроцитарных и ретикулоцитарных параметров у обследованных детей Показатель Единицы измерения М СО CVM (%) Гемоглобин г/л 132,2 10,90 8,2 Эритроциты 1012/л 4,8 0,31 6,5 MCV фл 81,6 4,08 5,0 MCH пг 27,7 1,63 5,9 MCHC г/л 339,1 9,57 2,8 RDW-CV % 130,7 6,56 5,0 109/л 37,4 12,34 33,0 LFR % 96,5 1,92 2,0 IRF % 3,5 1,92 54,0 Ret-He пг 32,6 1,70 5,2 Ретикулоциты Примечание. М – среднее значение, СО – стандартное отклонение, CVM – межиндивидуальная вариабельность, рассчитанная по формуле: СО/М×100 и выраженная в %. Расшифровка акронимов гематологических показателей дана в примечании к таблице 3.2.3. 52 3.3. Оценка диагностических характеристик лабораторных тестов у детей с фебрильными инфекциями Фебрильные инфекции у детей младшего возраста обусловливаю до 20-35% обращений к педиатрам, нередко они являются и поводом для госпитализации детей в стационары. В большинстве таких случаев причиной болезни является вирусная инфекция, но 5-15% детей с лихорадкой имеют высокий риск тяжёлой бактериальной инфекции (ТБИ): бактериемии, бактериального менингита, пиелонефрита, пневмонии, сепсиса. Несвоевременная диагностика и неадекватное лечение ТБИ могут определить крайне неблагоприятный и даже фатальных исход болезни. Назначение антибактериальной терапии пациенту с ТБИ жизненно важно [107,132]. Вместе с тем избыточное назначение антибиотиков детям с вирусными инфекциями способствует росту микробной резистентности, увеличивает затраты на лечение и повышает частоту лекарственных побочных эффектов. Особые трудности представляет диагностика ТБИ при отсутствии видимого очага бактериальной инфекции, а такие пациенты составляют до 20% лихорадящих детей [30]. Клиническая картина болезни в этих случаях представлена лихорадкой и интоксикацией различной степени. Большое значение при оценке вероятности ТБИ имеют возраст (к группе риска по развитию ТБИ относятся дети до 36 месяцев); наличие сопутствующей патологии (у иммунокомпрометированных больных риск ТБИ особенно высок); выраженность катаральных явлений (наличие катара характерно для вирусных инфекций) [52,55]. Несмотря на многочисленные исследования, направленные на выявление отдельных лабораторных маркеров ТБИ, на сегодняшний день нет ни одного теста или комбинации с клиническими данными, с помощью которых можно 53 было бы надежно верифицировать ТБИ у ребенка с лихорадкой без очага инфекции. Таким образом, существует необходимость выявления и научного обоснования наиболее эффективных лабораторных маркеров ТБИ, а также создание алгоритма интерпретации результатов лабораторных тестов, что может быть использовано при назначении лечения и оценке его эффективности. В исследование было включено 306 детей в возрасте < 5 лет. У 54 (17,6%) при обследовании в стационаре была верифицирована тяжёлая бактериальная инфекция (группа ТБИ), у остальных 252 (82,4%) пациентов тяжёлой бактериальной инфекции выявлено не было (группа без ТБИ). Структура окончательных клинических диагнозов представлена в Таблице 3.3.1. Медиана возраста у обследованных детей составила 22 месяца (Q1-Q3 12-34 месяцев), различия по полу и возрасту между группами были незначимы (p > 0,05). Таблица 3.3.1 Диагнозы пациентов с фебрильными инфекциями ТБИ Диагнозы N % ИМП 27 8,8 Пневмония 13 4,2 Бактериемия 14 4,6 Всего:54 Не ТБИ 17,6 Бронхит 20 6,5 Гастроэнтерит 28 9,2 ОРВИ 204 66,7 Всего:252 Всего: 82,4 306 100 54 В Таблице 3.3.2 приведено число исследований и представлена описательная статистика результатов лабораторных показателей у пациентов с ТБИ и без ТБИ. Значения всех исследованных показателей колебались в широких пределах, однако их медианы (за исключением медианы RET-He) были статистически значимо выше у пациентов с ТБИ (Рисунок 3.3.1). Медиана содержания RET-He в этой группе была меньше по сравнению с пациентами без ТБИ. Указанные различия свидетельствуют о том, что пациенты с ТБИ и пациенты без ТБИ могут быть разделены по уровню лабораторных маркеров, что можно использовать в диагностическом процессе. Рисунок 3.3.1 Диаграмма Box-plot для исследованных показателей у пациентов с ТБИ и без ТБИ 55 Таблица 3.3.2 Лабораторные показатели пациентов с ТБИ и без ТБИ Показатель Группа ТБИ Группа без ТБИ Всего Мe Q1 Q3 Min Max N Ме Q1 Q3 Min Max N ЛК (x109/л) 19,28 15,30 28,62 4,75 41,06 53 9,05 6,34 11,95 2,04 28,08 246 299 НФ (x109/л) 12,09 9,10 18,07 0,74 33,21 53 4,45 2,56 7,04 0,12 18,93 246 299 НГ (x109/л) 0,05 0,03 0,13 0,00 1,01 50 0,01 0,00 0,03 0,00 1,62 242 292 RET-He (пг) 23,80 21,35 28,25 16,10 34,60 32 27,10 24,80 29,00 18,60 34,50 139 171 С-РБ (мг/л) 109,38 74,14 167,19 10,91 463,4 50 8,60 3,47 23,19 1,00 131,00 154 204 8,51 0,01 192,8 46 0,14 0,06 0,40 0,01 14,80 127 173 ПКТ (нг/мл) 4,80 1,18 Примечание. Здесь и в таблицах 3.3.3-3.3.6: ЛК - лейкоциты, НФ - нейтрофилы, НГ- незрелые гранулоциты, RET-He - эквивалент содержания гемоглобина в ретикулоцитах, С-РБ - С-реактивный белок, ПКТ - прокальцитонин. Данные представлены в виде: Me – медиана, Q1 - 25 перцентиль, Q3 -75 перцентиль, Min - минимальное значение, Max - максимальное значение, N – число пациентов, у которых был исследован данный показатель. 56 Для каждого теста был проведён анализ кривых коллектора рабочих характеристик (ROC-анализ) с расчётом площади под характеристической кривой (AUC), чувствительности (Se), специфичности (Sp), отношения правдоподобия положительного (ОППол) и отрицательного (ОПОтр) результата, а также оценено влияние результата теста на посттестовую вероятность ТБИ. AUC и их значения для исследованных маркеров представлены в Таблице 3.3.3 и на Рисунке 3.3.2. Для всех исследований (за исключением RET-He) AUC превышала 0,80, при этом AUC для С-РБ была наибольшей и составила 0,95 (95%ДИ 0,92-0,98), что свидетельствует о высокой диагностической точности СРБ при выявлении ТБИ у детей с фебрильными инфекциями. Таблица 3.3.3 ROC-анализ лабораторных показателей для выявления ТБИ Тест Cut-off Se (%) Sp (%) AUC (95% ДИ) ЛК (х109/л) 14,16 79 88 0,88 (0,82-0,94) НФ (х109/л) 7,73 83 79 0,87 (0,81-0,93) НГ (х109/л) 0,03 70 78 0,81 (0,74-0,88) RET-He (пг) 24,8 56 75 0,66 (0,55-0,78) C-РБ (мг/л) 37 90 86 0,95 (0,92-0,98) ПКТ (нг/мл) 0,95 76 87 0,89 (0,84-0,95) Примечание. Здесь и в таблице 3.3.4 значения cut-off рассчитаны для оптимального сочетания чувствительности и специфичности каждого показателя. 57 Рисунок 3.3.2 ROC-кривые для лейкоцитов (ЛК), абсолютного числа нейтрофилов (НФ) и незрелых гранулоцитов (НГ), RET-He, С-РБ и ПКТ при выявлении ТБИ 58 Следует отметить, что несомненной диагностической ценностью для выявления ТБИ обладает определение абсолютного числа нейтрофилов, а не их относительного (процентного) содержания в составе общей популяции лейкоцитов. Такое заключение позволил сделать ROC-анализ и сравнение AUC указанных показателей (Рисунок 3.3.3). AUC абсолютного числа нейтрофилов составила 0,87 (95%ДИ 0,81-0,93), тогда как AUC процентной доли нейтрофилов при выявлении ТБИ не превышала 0,58 (95%ДИ 0,50-0,67). Полученный результат в очередной раз подтверждает, что при диагностике фебрильных состояний у детей следует оценивать абсолютное, а не процентное содержание нейтрофилов. Более подробно этот вопрос обсуждается в Заключении. Рисунок 3.3.3 ROC-кривые абсолютного числа нейтрофилов и их процентного содержания при выявлении ТБИ 59 По результатам ROC-анализа для исследованных показателей было установлено оптимальное сочетание Se и Sp, рассчитан уровень принятия решения – cut-off (см. раздел 2.3), выше которого результат будет считаться положительным, а ниже которого – отрицательным (Таблица 3.3.3). Оптимальным сочетанием Se (90%) и Sp(86%) обладал cut-off для С-РБ на уровне 37 мг/л. Это означает, что у 90% пациентов с ТБИ значения С-РБ будут равны или превысят 37 мг/л, а у 86% пациентов без ТБИ значения С-РБ будут меньше 37 мг/л. С другой стороны, Se=90% свидетельствует о том, что у 10% пациентов с ТБИ уровень С-РБ не превысит 37 мг/л, а Sp=86% говорит о том, что у 14% пациентов без ТБИ уровень С-РБ будет больше 37 мг/л. Значения Sp оказались примерно одинаковыми для С-РБ и ПКТ, приближаясь к 90% (Таблица 3.3.3). Сывороточные маркеры обладали более высокими значениями Se и Sp по сравнению с исследованными показателями гемограммы. В целом, уровни Se и Sp всех показателей гемограммы (кроме RET-He) превышали 70%. У всех исследованных лабораторных показателей ОППол было > 1 (кроме RET-He) (Таблица 3.3.4). Медиана уровня RET-He была больше у пациентов без ТБИ, чем у пациентов с ТБИ. В связи с этим для RET-He положительным результатом теста будет значение меньше или равно cut-off, а отрицательным результатом теста будет значение выше cut-off. Величина ОППол RET-He составила 2,23 (95%ДИ 1,47-3,40), что можно интерпретировать следующим образом: результат RET-He ≤ 24,8 пг примерно в 2 раза чаще встречается у пациента с ТБИ, чем у пациента, у которого нет ТБИ. Среди показателей гемограммы наибольшее ОППол было у ЛК – 6,50 (95%ДИ 4,52-9,34). То есть значение ЛК ≥ 14,16 x 109/л встречается в 6,5 раз чаще у пациента с ТБИ, чем у пациента без ТБИ. Для сывороточных маркеров ОППол варьировало в пределах 5,69-7,97 (Таблица 3.3.4). 60 Таблица 3.3.4 Диагностическая значимость лабораторных показателей при выявлении ТБИ Тест Cut-off ОПпол. ОПотр. Посттестовая (95% ДИ) (95% ДИ) вероятность ТБИ (%, 95% ДИ) ЛК (х109/л) 14,16 НФ (х109/л) 7,73 НГ (х109/л) 0,03 RET-He (пг) 24,8 C-РБ (мг/л) 37 ПКТ (нг/мл) 0,95 Результат Результа теста т теста положи- отрица- тельный тельный 6,50 0,24 59 5 (4,52-9,34) (0,14-0,40) (50-67) (3-8) 4,00 0,21 47 4 (3,05-5,26) (0,12-0,39) (40-54) (3-8) 3,26 0,38 42 8 (2,41-4,40) (0,25-0,59) (35-49) (5-11) 2,23 0,58 33 11 (1,47-3,40) (0,39-0,88) (24-43) (8-16) 6,93 0,11 70 4 (4,56-10,54) (0,05-0,26) (60-78) (2-8) 5,69 0,28 68 9 (3,55-9,11) (0,16-0,46) (57-77) (6-15) Примечание. Для всех тестов, кроме RET-He, результат: положительный, если значение ≥ cut-off; отрицательный, если значение < cut-off. Для RET-He положительный результат теста ≤ cut-off, а отрицательный результат > cut-off 61 Для всех лабораторных показателей ОПОтр было < 1 (Таблица 3.3.5 и 3.3.6). Наименьшая величина ОПОтр зафиксирована у С-РБ – 0,11 (95%ДИ 0,05-0,26). Это означает, что у пациента без ТБИ уровень С-РБ < 37 мг/л, будет встречаться в 10 раз чаще, чем у пациента, у которого есть ТБИ. Для лейкоцитов, нейтрофилов, незрелых гранулоцитов и ПКТ значения ОПОтр были примерно одинаковыми и варьировали в пределах от 0,21 до 0,38. Величина ОПОтр для RET-He 0,58 (0,390,88) свидетельствует о том, что RET-He недостаточно хорошо дифференцирует пациентов с ТБИ от пациентов без ТБИ. Таблица 3.3.5 Диагностическая значимость лабораторных показателей для подтверждения ТБИ: значения cut-off, соответствующие чувствительности 95% Cut-off (95% Se) ОПпол. (95% ДИ) Посттестовая вероятность ТБИ при положительном результате теста*, % ( 95% ДИ) ЛК (х109/л) 17,10 12,14 (6,89-21,38) 73 (60-82) НФ (х109/л) 10,8 12,14 (6,89-21,38) 73 (60-82) НГ (х109/л) 0,07 5,15 (3,32-8,00) 53 (42-64) RET-He (пг)* 21,7 7,45 (3,19-17,41) 62 (41-79) С-РБ (мг/л) 69 17,16 (8,20-35,92) 85 (73-92) ПКТ (нг/мл) 2,80 12,88 (5,70-29,09) 83 (68-91) Тест Примечание. *Для всех показателей (кроме RET-He) положительный результат теста ≥ cut-off. Для RET-He положительный результат теста ≤ cut-off. 62 Таблица 3.3.6 Диагностическая значимость лабораторных показателей для исключения ТБИ: значения cut-off, соответствующие специфичности 95% Cut-off (95% Sp) ОПотр. (95% ДИ) Посттестовая вероятность ТБИ при отрицательном результате теста*, % ( 95% ДИ) ЛК (х109/л) 6, 72 0,13 (0,03-0,50) 3 (1-10) НФ (х109/л) 2,2 0,20 (0,05-0,79) 4 (1-15) НГ (х109/л) 0,02 0,30 (0,17-0,52) 6 (4-10) RET-He (пг) 32,6 0,87 (0,11-7,18) 16 (2-61) С-РБ (мг/л) 25 0,08 (0,03-0,24) 3 (1-7) ПКТ (нг/мл) 0,14 0,09 (0,02-0,34) 3 (1-11) Тест Примечание. *Для всех показателей (кроме RET-He) отрицательный результат теста < cut-off. Для RET-He отрицательный результат теста > cut-off. В нашей работе частота встречаемости ТБИ у пациентов с лихорадкой младше 5 лет составила 17,6% (претестовая вероятность ТБИ) (Таблица 3.3.1). Для всех исследованных показателей положительный результат теста приводил к повышению посттестовой вероятности ТБИ, а отрицательный результат к снижению посттестововй вероятности ТБИ (Таблица 3.3.5 и 3.3.6). Из сывороточных исследований cut-off для С-РБ на уровне 37 мг/л обладал лучшей величиной посттестовой вероятности ТБИ как для положительного (70%), так и для отрицательного результата (4%). Из показателей гемограммы посттестовая вероятность ТБИ больше всего повышалась при числе лейкоцитов ≥ 14,16x109/л – с 18% до 59%. При значениях лейкоцитов < 14,16x109/л и нейтрофилов < 7,73x 109/л посттестовая вероятность ТБИ снижалась с 18% до 4- 63 5%. Посттестовая вероятность ТБИ при положительном результате RET-He (≤ 24,8 пг) повышалась с 18% до 33%, а при отрицательном результате (> 24,8 пг) вероятность ТБИ снижалась с 18% до 11%. Используя в качестве высокочувствительного теста cut-off со Se=95%, а в качестве высокоспецифичного теста cut-off с Sp=95%, мы определили посттестовую вероятность при отрицательных и положительных результатах тестов. При достижении маркером уровня cut-off, соответствующего Sp=95%, посттестовая вероятность ТБИ повышалась с 18% до 73% для лейкоцитов, нейтрофилов и до 83-85% для С-РБ и ПКТ (Таблица 3.3.5). Уровень лейкоцитов, нейтрофилов, С-РБ и ПКТ ниже cut-off, соответствующего Se=95%, снижал посттестовую вероятность ТБИ с 18% до 3% (Таблица 3.3.6). Проведённый анализ совпадения результатов С-РБ и ПКТ показал, что у 9 из 11 пациентов c ТБИ при С-РБ ≥ 37 мг/л уровень ПКТ был < 0,95 нг/мл. При этом только у 1 из 35 пациентов с ТБИ при С-РБ < 37 мг/л уровень ПКТ был ≥ 0,95 нг/мл. Это наблюдение может быть связано с разницей в кинетике С-РБ и ПКТ при бактериальной инфекции. Помимо оценки диагностических характеристик каждого маркера в отдельности, мы проанализировали способность выявлять пациентов с ТБИ по результатам сразу нескольких предикторов. За основу математической модели мы взяли С-РБ, так как результаты нашей работы показали, что С-РБ обладает самой высокой диагностической точностью (AUC = 0,95) среди исследованных маркеров (Таблица 3.3.3). Однако заметного улучшения критерия относительно СРБ получить не удалось. Потенциально полезным может оказаться комбинированный учет уровня СРБ и числа лейкоцитов, т.е. математическая модель, учитывающая результаты двух лабораторных тестов – С-РБ*лейкоциты (произведение значений двух маркеров ТБИ). При этом AUC (С-РБ*лейкоциты) = 0,957 незначительно отличается от AUC (С-РБ) = 0,951 (Рисунок 3.3.4). 64 Рисунок 3.3.4 ROC-кривые С-РБ и показателя С-РБ*лейкоциты Для С-РБ cut-off составляет 37, что обеспечивает Se = 90% и Sp = 86% (Таблица 3.3.3). Применение критерия С-РБ*лейкоциты с порогом отсечения 492 балла при том же уровне чувствительности обеспечивает чуть большую специфичность: Sp = 88,5%. Это различие свидетельствует о потенциальном превосходстве критерия С-РБ*лейкоциты над С-РБ, поскольку обусловлено разницей в классификации лишь 5 наблюдений. Для 4 из них синтетический критерий исключает ложноположительную классификацию ТБИ, которую дает СРБ. Для одного случая, наоборот, верно классифицированный одним С-РБ как пациент без ТБИ, он получил ложноположительную классификацию критерием С-РБ*лейкоциты. Таким образом, критерий на основе С-РБ и лейкоциты потенциально может работать лучше, чем только С-РБ. 65 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Основная цель лабораторной медицины заключается в предоставлении информации, полезной для принятия решения при оказании медицинской помощи. Исследование гемограммы является одним из наиболее доступных и информативных лабораторных тестов, который востребован клиницистами всех специальностей. Точное измерение показателей гемограммы и клеток крови важно для правильной диагностики, лечения и последующего наблюдения за пациентами с различными воспалительными заболеваниями, в том числе и у детей [8,143]. Для интерпретации анализа гемограммы используется сравнение результата каждого показателя с РИ. Качество РИ зависит не только от правильного подбора участников референсного исследования [59], но и от правильности выполнения анализа крови в лаборатории. Из-за разной технологии измерения количества клеток и их характеристик стабильность параметров гемограммы может отличаться при использовании разных анализаторов [40]. В свою очередь, на результат лабораторного исследования влияют техника сбора и условия хранения полученного биологического образца [19, 155]. В ряде случаев биоматериал для проведения исследований приходится транспортировать в лабораторию. Именно поэтому каждая лаборатория должна точно знать, какие условия хранения оптимальны для сохранения стабильности показателей гемограммы. В нашем исследовании стабильности показателей гемограммы хранение образцов крови при комнатной температуре приводит к повышению MCV после 24 часов хранения. Такие же результаты стабильности MCV были получены в работе Johnson и соавторов [96]. Очевидно, это происходит в связи с изменениями осмотических свойств эритроцитов при длительном хранении образца, приводящими к набуханию клеток. Параллельное повышение гематокрита при 66 этом связано с прямой зависимостью объёмной доли эритроцитов крови (гематокрита) от среднего объёма эритроцитов (MCV). Число ретикулоцитов при комнатной тепературе хранения изменялось уже после 24 часов, а при температуре хранения 4-8°С обладало длительной стабильностью (до 72 ч). В работе Коленкина С.М. [10] хранение образцов крови при 4-8°С также не влияло на число ретикулоцитов (автор изучал стабильность в течение 48 часов). Тогда как хранение при комнатной температуре искажало стабильность ретикулоцитов уже через 6 часов после взятия крови [10]. В нашей работе анализ стабильности лейкоцитов, их субпопуляций и тромбоцитов показал, что в целом все параметры (за исключением числа эозинофилов) стабильны 72 ч. при температуре хранения 4-8°С. Существенные изменения уровня эозинофилов были обнаружены при комнатной температуре хранения и другими авторами [85]. Вероятно, колебания в субпопуляциях лейкоцитов обуславливает длительное хранение образцов (более 24 ч) при комнатной температуре, что приводит к изменениям в клетках, которые меняют их физические характеристики и влияют на способность к окрашиванию флуоресцентными красителями, используемыми в анализаторе. В целом полученные нами данные о влиянии времени и температуры хранения образцов крови на показатели гемограммы свидетельствуют о том, что большинство параметров гемограммы стабильны до 24 ч вне зависимости от условий хранения. Более того, нахождение образцов при 4-8°С позволяет хранить их в течение 72ч без существенных изменений всех изученных параметров (за исключением гематокрита, MCV и числа эозинофилов). Эти результаты следует учитывать при планировании преаналитического этапа анализа гемограммы, и если ожидается отсрочка исследования более 24 ч, то образцы крови для исследования следует транспортировать и хранить при 4-8°С. Исследование показателей гемограммы используется в диагностике и мониторинге течения многих заболеваний [12,108]. Анализ показателей гемограммы является одним из наиболее востребованных исследований в педиатрической практике, а определение соотношения между отдельными 67 субпопуляциями лейкоцитов составляет важную часть клинического исследования крови [11,110,153]. Распределение субпопуляций лейкоцитов зависит от возраста [5,15]. Традиция использования относительных величин показателей гемограммы связана с тем, что довольно длительное время для подсчёта субпопуляций лейкоцитов использовался ручной метода подсчёта субпопуляций лейкоцитов (микроскопия мазка крови). Во многих случаях использование процентной лейкоцитарной формулы может привести к ошибочной трактовке результатов клинического анализа крови [120]. Вместе с тем, протоколы, использующие результаты дифференцировки клеточного состава крови для принятия клинических решений, оперируют абсолютными значениями. Так, дифференциально-диагностические критерии наличия ТБИ у детей до 36 месяцев опираются на абсолютное число нейтрофилов, а не на их долю в общем числе лейкоцитов [52]. В качестве одного из аргументов продолжения использования процентной лейкоцитарной формулы приводится необходимость отдельного учета содержания палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов, разделение которых с помощью коммерчески доступных гематологических анализаторов невозможно. Подсчет палочкоядерных нейтрофилов глубоко укоренился в клинической практике и продолжает использоваться как маркер бактериальной инфекции, несмотря на то, что большинство современных руководств, в том числе и по педиатрии, не рекомендуют подсчитывать число палочкоядерных нейтрофилов в диагностических целях. Это связано как с техническими проблемами (большая ошибка выборки при подсчете 100–200 клеток, субъективизм при дифференцировке палочкоядерных нейтрофилов), так и с низкой специфичностью теста [54]. Определенное диагностическое значение этого теста признается только для конкретного и очень ограниченного круга ситуаций: (1) лихорадящие дети в возрасте до 3 месяцев в рамках алгоритма исключения ТБИ и (2) подозрение на сепсис у новорожденных для расчета отношения незрелые нейтрофилы/общее 68 число нейтрофилов [54]. В целом, литературные данные не дают достаточного основания рассматривать подсчет палочкоядерных нейтрофилов в качестве полезного лабораторного исследования у детей в возрасте старше 3 месяцев. До появления гематологических анализаторов, основным методом оценки количества клеток крови являлся их подсчёт в камере Горяева и микроскопическое исследование мазка крови (лейкоцитарная формула) – подсчёт субпопуляций лейкоцитов на 100 клеток. Этот метод отличается низкой вопроизводимостью. Разработка и внедрение РИ в педиатрической деятельности является важной задачей. Использование результатов референсных диапазонов, полученных несколько десятилетий назад, для современного гематологического анализатора может привести к неправильной интерпретации результатов показателей гемограммы. Международные рекомендации по расчёту РИ разрабатывает Институт клинических и лабораторных стандартов – Clinical and Laboratory Standards Institute [59]. В доступной литературе мы не встретили работ, которые бы использовали стандарт CLSI для определения РИ параметров гемограммы. Вообще, за последние 10–15 лет опубликованы единичные статьи, посвященные исследованию показателей гемограммы у здоровых детей. В работе Taylor и соавторов [137], которые анализировали результаты исследования клинического анализа крови у 2135 детей школьного возраста (авторы считали таким возрастом 4–19 лет), сообщается о схожей возрастной динамике показателей гемограммы, т.е. снижении с возрастом числа лейкоцитов, лимфоцитов, эозинофилов и тромбоцитов и увеличении числа нейтрофилов. В другой публикации описана динамика показателей лейкоцитов у 112 здоровых детей первого года жизни, однако конкретные РИ в данной работе не представлены [33]. Наш опыт использования различных статистических процедур при расчете РИ, рекомендованных стандартом CLSI С28-A3 [59], позволяет заключить, что наиболее разумным является использование, как правило, более простых статистических методов. Робастный метод следует применять в тех случаях, когда 69 другие методы не подходят (нет нормального распределения признака или его не удалось достигнуть с помощью преобразования данных; небольшое число референсных значений в выборке). Полученные в нашей работе РИ по уровню нейтрофилов требуют особых комментариев. При определении нижней границы нормального числа нейтрофилов широко используют значение 1000 клеток/мкл у детей до 1 года и 1500 клеток/мкл — у старших детей [17,69,94]. Более низкие показатели считают нейтропенией, которую разделяют по степени тяжести на несколько категорий, относя к тяжелой форме уровень нейтрофилов < 500 клеток/мкл. Как указывает недавний консенсус по врожденной и приобретенной нейтропении [69], определение нейтропении базируется на экспертных оценках, основанных на многолетней клинической практике. Действительно, низкий уровень нейтрофилов является одним из главных факторов риска развития тяжелых инфекций у пациентов с наследственными заболеваниями, затрагивающими пролиферацию и созревание миелоидных клеток (например, синдромы Костманна, Швахмана–Даймонда и др.), причем этот риск обратно пропорционален абсолютному числу нейтрофилов [69,94]. С другой стороны, снижение числа нейтрофилов < 1000 клеток/мкл можно обнаружить и у детей без признаков какого-либо заболевания, которые нормально развиваются и не страдают частыми инфекциями, что было продемонстрировано в нашей работе. Bellamy G.J и соавторы [33] выявили, что число нейтрофилов <1000 клеток/мкл встречается примерно у 10% детей в возрасте 2 месяцев и определили нижнюю границу нормального числа нейтрофилов в 700 клеток/мкл. Число нейтрофилов может снижаться при вирусных и бактериальных инфекциях у детей без тяжелого преморбидного фона, при этом риск развития септических осложнений не повышается [18,51,98,147]. Более того, в некоторых этнических группах африканцев и жителей Ближнего Востока число нейтрофилов 200–600 клеток/мкл встречается с частотой до 25% и, вероятно, является конституциональной особенностью, а не патологией, поскольку низкое число нейтрофилов у этих индивидов не ассоциируется с клиническими проблемами 70 [69,82,94]. Этногеографические колебания числа лейкоцитов и нейтрофилов, несомненно, связаны с генетическими особенностями тех или иных популяций. К настоящему времени идентифицирован только один генетический маркер, который может объяснить отличия в числе нейтрофилов у различных этносов, а именно полиморфизм хемокиновых гена, рецепторов и контролирующего сильно экспрессию ассоциированный одного с из этническим происхождением [57]. Таким образом, приведенные литературные данные свидетельствуют о том, что число нейтрофилов иммунодефицита и < 1000 клеток/мкл предрасполагающих к в нему отсутствии факторов признаков может быть проявлением индивидуальных конституциональных особенностей и не всегда свидетельствует о патологии. Очевидно, что в этих условиях залогом клинического благополучия является адекватная мобилизационная и функциональная активность нейтрофилов в тканях, а не их абсолютное число в крови, которая их транспортирует. Иными словами, фактором, определяющим дальнейшую врачебную тактику при обнаружении низкого числа нейтрофилов, должно быть не столько само это число, сколько клинический статус обследуемого ребенка [94]. Такой подход в большинстве случаев позволит избежать избыточных, нередко инвазивных исследований, поскольку клинически значимая нейтропения встречается крайне редко (от 1/100 000 до 1/1 000 000 в зависимости от формы) и чаще всего манифестирует при уровне нейтрофилов < 500 клеток/мкл [69]. Полученные нами нижние границы РИ числа нейтрофилов в 600 клеток/мкл для детей < 12 месяцев и 1100 клеток/мкл для детей старше > 12 месяцев, рассчитанные согласно международным рекомендациям [59], не исключают возможность того, что используемые в настоящее время показатели в 1000 и 1500 клеток/мкл являются завышенными для здоровых детей. Аналогичные соображения высказывали и другие авторы [82]. При этом следует помнить и то, что «попадание» в границы РИ не исключает наличие клинически значимой нейтропении так же, как, например, отсутствие лейкоцитоза не исключает 71 тяжелой бактериальной инфекции. РИ являются лишь ориентирами, но последнее слово в диагностике и лечебной тактике остается за клиницистом. Анализ РИ эритроцитарных параметров показал, что на фоне относительно стабильного количества эритроцитов с возрастом происходит увеличение уровня гемоглобина, MCV и MCH. Вероятно, что эти различия приобретают очевидность в старшем возрасте, о чем свидетельствует разделение РИ между полами, в частности, по гемоглобину и эритроцитам, во взрослой популяции [5]. Анализ межиндивидуальной вариации (CVM) эритроцитарных и ретикулоцитарных параметров гемограммы показал, что большинство из них меняется от индивида к индивиду в диапазоне 2-8%. Это свидетельствует об относительно небольшой изменчивости данных показателей в детской популяции. Полученные нами данные по CVМ близки к опубликованным результатам определения межиндивидуальной вариации во взрослой популяции [124]. Таким образом, в отсутствие литературных данных по РИ лейкоцитов, их субпопуляций, тромбоцитов, эритроцитарных и ретикулоцитарных параметров в детской популяции сведения о гематологическом обследовании здоровых детей, представленные в настоящей работе, могут служить ориентиром, который позволит более полно использовать диагностическую информацию, поступающую от современного гематологического анализатора. Использование РИ для интерпретации результата лабораторного теста не всегда отвечает поставленной клинической задаче: выявить или исключить заболевание. В педиатрической практике особые трудности представляет дифференцирование ТБИ у детей с фебрильными инфекциями. Лихорадящие дети в возрасте до 5 лет обладают высоким риском наличия ТБИ [55]. Золотым стандартом диагностики ТБИ является положительный результат микробиологического посева крови, мочи или спинномозговой жидкости. Недостатком метода является длительность исследования: результат готов лишь через 24-48 ч. Подобного рода промедление нежелательно в реальной практике, поэтому данный метод не может использоваться как основное лабораторное 72 исследование для дифференциальной диагностики ТБИ и принятия решения о терапевтической тактике. В нашей работе вероятность наличия или отсутствия ТБИ мы оценивали у конкретного пациента с помощью теоремы Байеса, которая описывает, как дополнить или обновить убеждения в свете новых фактов [65]. Применительно к лабораторному тесту теорема описывает, как положительный или отрицательный результат теста изменяет априорные предположения о вероятности заболевания (то есть позволяет оценить посттестовую вероятность заболевания) [79]. Существуют два способа применения теоремы Байеса для оценки посттестовой вероятности заболевания: с помощью математических вычислений и номограммы Фагана (Рисунок 1.3) [46]. Математически посттестовая вероятность заболевания вычисляется путём объединения ОП лабораторного теста с данными претестовой вероятности (раздел 2.3). Претестовая вероятность заболевания складывается из данных о частоте встречаемости заболевания в конкретной популяции и условиях оказания медицинской помощи пациентам (отделение экстренной помощи, больница, поликлиника). Частота ТБИ в популяции наших пациентов составила 17,6% (Таблица 3.3.1). Такие же результаты были получены Pulliam P.N. и соавторами [123]. Исследование маркеров ТБИ у детей с лихорадкой в возрасте от 1 до 36 месяцев показало, что частота встречаемости ТБИ равна 29% [75], тогда как по данным Isaacman D.J. и соавторов [92] частота ТБИ у детей в указанной возрастной группе составила 11%. В ходе оценки диагностической точности для исследованных показателей рассчитывали уровень принятия решения (cut-off) о ТБИ у пациента, ОППол и ОПОтр и посттестовую вероятность ТБИ у конкретного пациента. Из всех исследованных показателей С-РБ лучше остальных дифференцировал пациентов с ТБИ от пациентов, у которых нет ТБИ (AUC = 0,95). Эффективность использования С-РБ при выявлении ТБИ у детей в возрасте от 1 до 36 месяцев была показана и другими авторами [123]. В этой работе был выполнен сравнительный анализ диагностической точности С-РБ, лейкоцитов и 73 нейтрофилов у 77 детей с лихорадкой без видимого очага инфекции. Анализ С-РБ зарекомендовал себя в качестве надёжного предиктора ТБИ: AUC для С-РБ составила 0,91 (95%ДИ 0,81-1,00) и была выше, чем для ЛК 0,76 (95%ДИ; 0,630,90) и НФ 0,81(95%ДИ; 0,71-0,91). При этом результату С-РБ больше или равному значению cut-off 70 мг/л соответствовало ОППол 8,3 (95ДИ; 3,8-27,3) [123]. В нашей работе, обладая высокой диагностической точностью, положительный результат С-РБ (≥ 37 мг/л) повышает вероятность ТБИ с 18% до 70%, а отрицательный результат (< 37 мг/л) снижает вероятность ТБИ до 4%. Оптимальный cut-off С-РБ 37 мг/л (Se=90% и Sp=86%) близок к результатам исследования диагностической пользы С-РБ при выявлении ТБИ у детей с лихорадкой, где cut-off 44 мг/л обладал Se=63% и Sp=81% [92]. В условиях ОРИТ анализ С-РБ может использоваться как независимый маркер пневмонии у пациентов с инфекциями нижних дыхательных путей (бронхиты, бронхиолиты, пневмонии), однако низкие уровни С-РБ не исключают наличие заболевания [99]. С другой стороны, исследования уровня С-РБ у детей с лихорадкой в условиях ОРИТ показали его пользу при исключении ТБИ и относительную диагностическую ценность при исключении всех остальных бактериальных инфекций [130]. Такого рода ограничение диагностической ценности связано со значительным перекрытием в результатах С-РБ у детей с вирусными и бактериальными инфекциями, особенно на ранних стадиях бактериальных инфекций [121]. В ряде работ было показано, что С-РБ является менее чувствительным и специфичным маркером бактериемии, чем ПКТ, у детей с лихорадкой при нейтропениях [148] и при аутоиммунных заболеваниях [154]. В нашей работе оптимальный сut-off для ПКТ составил 0,95 нг/мл (ОППол =5,42, ОПОтр =0,28), что отличается от результатов других работ по изучению диагностических характеристик лабораторных тестов при выявлении бактериальных инфекций у детей младше 3 лет [24,100], где cut-off варьировал от 0,5 нг/мл до 0,9 нг/мл. 74 Luaces-Cubells C. и соавторы [106] сравнили ПКТ и С-РБ у 868 детей младше 36 месяцев с лихорадкой без явного очага инфекции. Распространённость ТБИ составила 1,7%. Оптимальный cut-off ПКТ для ТБИ был равен 0,9 нг/мл (ОППол =9,13, ОПОтр =0,15), тогда как у С-РБ cut-off составил 80 мг/л (ОППол =6,45, ОПОтр =0,7). Особый интерес при сравнении диагностической точности ПКТ и С-РБ вызывают результаты обследования 275 пациентов с длительностью лихорадки менее 8 часов [106]. Проведение терапии именно в этот временной интервал характеризуется наилучшим результатом при лечении сепсиса, менингита, пиелонефрита. Диагностическая точность (AUC) ПКТ в этой группе пациентов была значимо выше по сравнению с AUC С-РБ и составила 0,97 (95%ДИ 0,940,99). Вероятно, это связано с тем, что уровень ПКТ в крови максимально повышается через 2-4 часа после бактериального заражения, в то время как С-РБ достигает максимума в крови через 12-24 часа [126]. В нашей работе длительность лихорадки составила (медиана (минимум-максимум)): 2 (1-6), возможно именно этот факт объясняет то, что величина AUC, ОППол и ОПОтр были выше у С-РБ, по сравнению с ПКТ (Таблица 3.3.4 и 3.3.6). Повышение ПКТ может предшествовать клиническим проявлениям инфекции на 24 ч. При этом измерение ПКТ в 1-ый день и 2-ой (день начала лихорадки) может быть лучшим маркером сепсиса, чем одно измерение во 2-ой день [49]. У пациентов ОРИТ с клиническими признаками сепсиса независимо от основного заболевания однократный результат измерения ПКТ не всегда надежен для решения вопроса о начале проведения лечения, так как диагностическая способность ПКТ относительна при дифференциации сепсиса и синдрома системной воспалительной реакции [103]. ПКТ является ценным диагностическим маркером для исключения бактериальной инфекции или сепсиса у пациентов с низкой претестовой вероятностью заболевания [133]. Особенности кинетики ПКТ указывают на то, что он может использоваться при оценке эффективности антибактериальной терапии [133]. Руководствуясь уровнем ПКТ в динамике, врач уже к 24 часам от начала антибактериальной терапии может остановить применение препарата, тогда как использование 75 микробиологического посева откладывает это решение на срок до 48 часов. Проведение у таких больных исследования уровня ПКТ через каждые 8-12 часов, а также разработка cut-off для дифференциации пациентов с сепсисом от пациентов с синдромом системного воспалительного ответа будут служить хорошим инструментом оценки состояния пациента. Наши результаты по оптимальному уровню сut-off для лейкоцитов 14,16x109/л (ОППол =6,5, ОПОтр =0,24) соответствуют уровню лейкоцитоза для возрастной группы младше 5 лет [15], а также близки к cut-off 15,00 x109/л из работ по сравнению диагностической точности показателей гемограммы с С-РБ при выявлении ТБИ у детей в возрасте от 1 до 36 месяцев [106,123]. В работе Luaces-Cubells C. и соавторов [106] оптимальному cut-off ЛК 15,00x10⁹/л соответствовали ОППол = 1,62 и ОПОтр = 0,8. В нашей выборке пациентов число лейкоцитов обладало большей диагностической пользой: лейкоцитозу ≥ 14,16 x 109/л соответствовали ОППол = 6,5 и ОПОтр = 0,24. Оптимальный cut-off для нейтрофилов в нашей работе составил 7,73 x 109/л (ОППол = 4, ОПОтр = 0,21), что несколько ниже результатов в работах, направленных на изучение диагностической точности лабораторных маркеров при ТБИ: cut-off для числа нейтрофилов варьировал около 10 x 109/л [24,92,121]. При этом отрицательный результат для оптимального cut-off 7,73 x 109/л практически укладывался в РИ числа нейтрофилов для возрастной группы детей от 1 года до 5 лет, но существенно превышал верхнюю границу РИ у детей до 1 года [15]. Наши данные указывают на хорошие диагностические характеристики определения незрелых гранулоцитов при фебрильных инфекциях у детей, особенно для исключения ТБИ у детей с фебрильными инфекциями (Таблица 3.3.4). Величина AUC для НГ составила > 0,8, что сопоставимо с AUC для ЛК (Таблица 3.3.3). В ходе оценки диагностической точности НГ при выявлении ТБИ у детей, Senthilnayagam B. и соавторы [134] получили cut-off 0,03 (Se=88% и Sp=96%). Авторы сравнивали пациентов с положительным и отрицательным результатом микробиологического посева. Различия наших результатов по 76 значениям Se и Sp, вероятно связаны с тем, что авторы исследовали детей младше 10 лет. Однако из описания работы не было понятно, какие диагнозы были у пациентов, вошедших в группу с отрицательным результатом микробиологического посева. В число потенциальных маркеров для дифференциальной диагностики ТБИ мы включили RET-He. Этот выбор был основан на данных литературы, которые характеризуют RET-He как чувствительный индикатор изменения обмена железа на фоне воспаления [2,29]. В ответ на провоспалительные сигналы различной природы за счёт увеличения продукции гепцидина (одного из главных регуляторов метаболизма железа) происходит депонирование железа в мононуклеарных фагоцитах [14]. Это ведёт к снижению его доступности для эритропоэза, что немедленно отражается на гемоглобинизации ретикулоцитов и снижает уровень RET-He. Вместе с тем, определение RET-He у пациентов с инфекцией может оказаться полезным для других целей. С учётом динамичности этого показателя, его повышение у пациента на фоне антибактериальной терапии будет свидетельствовать об адекватности лечения [131]. По нашим данным уровень RET-He был значимо ниже у пациентов с ТБИ. Это могло быть связано с более выраженной воспалительной реакцией в ответ на бактериальную инфекцию. Однако диагностические характеристики этого теста для дифференцировки пациентов с ТБИ и без ТБИ оказались скромнее по сравнению с другими маркерами. Это ограничивает возможности использования RET-He для диагностики ТБИ у детей с фебрильными инфекциями. Только наиболее глубокое понижение RET-He (< 21,7 пг) может ощутимо влиять на посттестовую вероятность ТБИ, повышая её до 62%. В целом была установлена диагностическая точность всех изученных показателей. Помимо оценки диагностической точности каждого маркера в отдельности, мы проанализировали способность выявлять пациентов с ТБИ по результатам сразу нескольких предикторов. Однако лишь незначительного увеличения диагностической точности удалось получить для математическоймодели, учитывающей результаты С-РБ и числа лейкоцитов. 77 ВЫВОДЫ 1. Большинство параметров гемограммы стабильны в течение как минимум 24 ч вне зависимости от температуры хранения. Хранение крови при 4-8°С обеспечивает стабильность всех изученных параметров (за исключением гематокрита, MCV и числа эозинофилов) в течение как минимум 72 часов. 2. Референсный интервал ретикулоцитов не зависит от возраста и составляет 17,8-64,9х109/л. Референсный интервал RET-He различается в зависимости от возраста; он составляет 26,9-32,7 пг в группе детей младше 12 месяцев и 27,3-35,6 пг – в других возрастных группах. 3. Референсные интервалы числа моноцитов (0,37-1,26х109/л) и базофилов (0- 0,05 х109/л) являются общими для детей всех возрастных групп, а границы референсного интервала числа нейтрофилов изменяются с возрастом, варьируя от 0,6-3,6х109/л у детей младше 12 месяцев до 1,1-5,8х109/л у детей остальных возрастных групп. Границы референсных интервалов числа лимфоцитов индивидуальны для каждой возрастной группы. 4. При дифференциальной диагностике тяжелой бактериальной инфекции наибольшей диагностической точностью обладает С-РБ (AUC=0,95). AUC ПКТ (0,89), лейкоцитов (0,88), нейтрофилов(0,87), незрелых гранулоцитов (0,81) различаются между собой статистически незначимо (p>0,05). 5. Наибольшее влияние на посттестовую вероятность тяжелой бактериальной инфекции оказывают результаты исследования С-РБ. При уровне С-РБ ≥37 мг/л вероятность тяжелой бактериальной инфекции составляет 70%, а при уровне С-РБ <37 мг/л – 4%. 78 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. При выполнении анализа показателей гемограммы следует учитывать, что хранение крови при 4-8°С обеспечивает стабильность гемоглобина, эритроцитов, MCH, MCV, MCHC, ретикулоцитов, RET-He, лейкоцитов, нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов базофилов и тромбоцитов в течение как минимум 72 часов. Показатели гематокрита, MCV и числа эозинофилов стабильны при 4-8°С на протяжении 24 часов. 2. Полученные референсные интервалы лейкоцитов, их субпопуляций, тромбоцитов, эритроцитарных и ретикулоцитарных индексов следует применять при интерпретации результатов исследования гемограммы, выполненной с помощью гематологического анализатора. 3. Предложенный алгоритм оценки посттестовой вероятности ТБИ с использованием результатов определения уровня лейкоцитов, нейтрофилов, незрелых гранулоцитов, RET-He, ПКТ и С-РБ можно использовать при обследовании детей с фебрильными инфекциями. 79 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ЛК – лейкоциты НФ – нейтрофилы НГ – незрелые гранулоциты ОРИТ – отделение реанимации и интенсивной терапии ПКТ – прокальцитонин РИ – референсные интервалы ТБИ – тяжёлая бактериальная инфекция С-РБ – С-реактивный белок CLSI – Институт клинических и лабораторных стандартов (Clinical and Laboratory Standards Institute) FRC – фрагментированные эритроциты (fragmented red cells) IRF – фракция незрелых ретикулоцитов (immature reticulocyte fraction) LFR – ретикулоциты с низкой флуоресценцией (low fluorescence ratio) Max – максимальное значение Min – минимальное значение MCH – среднее содержание гемоглобина в 1 эритроците (mean corpuscular hemoglobin) MCHC – средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах MCV – средний объем эритроцита (mean corpuscular volume) Q1 – 25-ый перцентиль Q3 – 75-ый перцентиль RDW-CV – коэффициент вариации размера эритроцитов (red cell distribution width coefficient of variation) RET-He – содержание гемоглобина в ретикулоцитах (reticulocyte hemoglobin equivalent) Y - Youden index 95%ДИ – 95% доверительный интервал 80 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Бакрадзе, М.Д. Как отличить бактериальную инфекцию от вирусной, и чем её лечить / М.Д. Бакрадзе, И.В. Чащина, В.К. Таточенко, И.Л. Митюшин // Педиатрическая фармакология — 2013. Т. 10, № 4. C. 139-144. 2. Баранов, А.А. Показатели ретикулоцитарных индексов у здоровых детей / А.А. Баранов, Е.Л. Семикина, О.С. Мельничук и др. // Вопросы диагностики в педиатрии. — 2010. — Т. 2, № 4. — С. 17-21. 3. Баранов, А.А. Лихорадочные синдромы у детей / Под ред. А.А. Баранов, В.К. Таточенко, М.Д. Бакрадзе. — М. : Союз педиатров России, 2011. — 25 с. 4. Волкова, Е.Н. Референтные значения показателей клинического анализа крови доноров / Е.Н. Волкова, С.А. Луговская, Е.М. Данилова, М.С. Тропская // Клиническая лабораторная диагностика. — 2011. — № 6. — С. 26-32. 5. Волкова, С.А. Показатели гемограммы в популяции взрослого работающего населения / С.А. Волкова, Н.А. Маянский, Н.Н. Боровков и др. // Гематология и трансфузиология. — 2008. — Т. 53, № 1. — С. 21-27. 6. Джанг, Б. Референсные интервалы лабораторных исследований в педиатрии: проект КАЛИПЕР / Б. Джанг, Х. Адели // Вопросы диагностики в педиатрии. — 2009. — Т. 1, № 3. — С. 6-13. 7. Долгов, В.В. Турбидиметрия в лабораторной практике / В.В. Долгов, О.П. Шевченко, А.А. Шарышев. — М. : Реафарм, 2007. — 175 с. 8. Долгов, В.В. Лабораторная диагностика анемий / В.В. Долгов, С.А. Луговская, В.Т. Морозова, М.Е. Почтарь. — 2-е изд., доп. — М.-Тверь : ООО «Изд-во «Триада», 2009. — 147 с. 9. Клиническая эпидемиология. Основы доказательной медицины / под ред. С.Е. Бащинского, С.Ю. Варшавского М. : Медиа Сфера, — 1998. — 352 с. 10. Коленкин, С.М. Клинико-диагностическое значение показателей автоматизированного исследования ретикулоцитов : дисс. … канд. мед. наук : 14.03.10 / Коленкин Сергей Миронович. — М., 2004. — 117 с. 81 11. Луговская, С.А. Гематологический атлас / С.А. Луговская, М.Е. Почтарь. — 2-е изд., исправ. и доп. — М.- Тверь : ООО «Изд-во «Триада», 2006. — 296 с. 12. Луговская, С.А. Лабораторная гематология / С.А. Луговская, В.Т. Морозова, М.Е. Почтарь, В.В. Долгов. — М.-Тверь : Триада, 2006. — 224 с. 13. Луговская, С.А. Ретикулоциты / С.А. Луговская, М.Е. Почтарь. — М. — 2006. — 60 с. 14. Маянский, Н.А. Гепцидин: основной регулятор обмена железа и новый диагностический маркер / Н.А. Маянский, Е.Л. Семикина // Вопросы диагностики в педиатрии. — 2009. — № 1. — С. 18. 15. Маянский, Н.А. Референсные интервалы лейкоцитов и тромбоцитов у детей, полученные с помощью автоматического гематологического анализатора / Н.А. Маянский, А.С. Балабанов, Е.А. Копыльцова и др. // Вопросы диагностики в педиатрии. — 2011. — Т. 3, № 6. — С. 5-10. 16. Маянский, Н.А. Референсные интервалы некоторых биохимических и иммунохимических лабораторных исследований у здоровых новорождённых в раннем неонатальном периоде / Н.А. Маянский, Е.Н. Понамаренко, А.С. Балабанов и др. // Вопросы диагностики в педиатрии. — 2012. — Т. 4, № 5. — С. 20-25. 17. Практическое руководство по детским болезням / под общей ред. В.Ф. Коколиной, А.Г. Румянцева / том 4 Гематология/Онкология детского возраста / под ред. А.Г. Румянцева, Е.В. Самочатовой. — М. : Медпрактика, — 2005. — 791 с. 18. Ратманова, Г.А. Нейтропении в педиатрической практике / Г.А. Ратманова, Т.В. Руссова, О.В. Кузнецова и др. // Вопросы диагностики в педиатрии. — 2009. — № 2. — С. 69-72. 19. Тиц, Н. Клиническое руководство по лабораторным тестам / под ред. Н. Тиц. — М. : Юнимед-пресс, 2013. 20. Фомин, В.В. С-реактивный белок и его значение в кардиологической практике / В.В. Фомин, Л.В. Козловская // Журнал доказательной медицины для практикующих врачей. — 2003. — № 5. — С. 17-23. 82 21. Шевченко, О.П. Белки острой фазы воспаления / О.П. Шевченко // Лаборатория. — 1996. — № 1. — С. 35-39. 22. Akobeng, A.K. Understanding diagnostic tests 1: sensitivity, specificity and predictive values / A.K. Akobeng // Acta Paediatr. — 2007. — Vol. 96, No 3. — P. 338-341. 23. Alpern, E.R. Epidemiology of pediatric emergency medicine research network / E.R. Alpern, R.M. Stanley, M.H. Gorelick et al. // Pediatr. Emerg. Care. — 2006. — Vol. 22. — P. 689-699. 24. Andreola, B. Procalcitonin and C-reactive protein as diagnostic markers of severe bacterial infections in febrile infants and children in the emergency department / B. Andreola, S. Bressan, S. Callegaro et al. // Pediatr. Infect. Dis. J. — 2007. — Vol. 26, No 8. — P. 672-677. 25. Angus, D.C. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care / D.C. Angus, W.T. Linde-Zwirble, J. Lidicker et al. // Crit. Care Med. — 2001. — Vol. 29, No 7. — P. 1303-1310. 26. Ansari-Lari, M.A. Immature granulocyte measurement using the Sysmex XE-2100. Relationship to infection and sepsis / M.A. Ansari-Lari, T.S. Kickler, M.J. Borowitz // Am. J. Clin. Pathol. — 2003. — Vol. 120, No 5. — P. 795-799. 27. Attia, J. Moving beyond sensitivity and specificity: using likelihood ratios to help interpret diagnostic tests / J. Attia // Austr. Prescr. — 2003. — Vol. 26, No 5. — P. 111-113. 28. Baker, M.D. Evaluation and management of infants with fever / M.D. Baker // Pediatr. Clin. North Am. — 1999. — Vol. 46. — P. 1061-1071. 29. Baker, R.D. Committee on Nutrition American Academy of Pediatrics. Diagnosis and prevention of iron deficiency and iron-deficiency anemia in infants and young children (0-3 years of age) / R.D. Baker, F.R. Greer // Pediatrics. — 2010. — Vol. 126, No 5. — P. 1040-1050. 30. Baraff, L.J. Management of fever without source in infants and children / L.J. Baraff // Ann. Emerg. Med. — 2000. — Vol. 36, No 6. — P. 602-614. 83 31. Bass, J.W. Antimicrobial treatment of occult bacteremia: a multicenter cooperative study / J.W. Bass, R.W. Steele, R.R. Wittler et al. // Pediatr. Infect. Dis. J. — 1993. — Vol. 12, No 6. — P. 466—473. 32. Becker, K.L. Procalcitonin and the calcitonin gene family of peptides in inflammation, infection, and sepsis: a journey from calcitonin back to its precursors / K.L. Becker, E.S. Nylen, J.C. White et al. // J. Clin. Endocrinol. Metab. — 2004. — Vol. 89. — P. 1512-1525. 33. Bellamy, G.J. Total and differential leucocyte counts in infants at 2, 5 and 13 months of age / G.J. Bellamy, R.F. Hinchliffe, K.C. Crawshaw et al. // Clin. Lab. Haematol. — 2000. — Vol. 22, No 2. — P. 81-87. 34. Bender, L. Early and late markers for the detection of early-onset neonatal sepsis / L. Bender, J. Thaarup, K. Varming et al. // Dan. Med. Bull. — 2008. — Vol. 55, No 4. — P. 219-223. 35. Black, S. Post licensure surveillance for pneumococcal invasive disease after use of heptavalent pneumococcal conjugate vaccine in Northern California Kaiser Permanente / S. Black, H. Shinefield, R. Baxter et al. // Pediatr. Infect. Dis. J. — 2004. — Vol. 23. — P. 485-489. 36. Blasutig, I.M. Analytical evaluation of the VITROS 5600 Integrated System in a pediatric setting and determination of pediatric reference intervals / I.M. Blasutig, B. Jung, V. Kulasingam et al. // Clin. Biochem. — 2010. — Vol. 43. — P. 1039-1044. 37. Bleeker, S.E. Validating and updating a prediction rule for serious bacterial infection in patients with fever without source / S.E. Bleeker, G. Derksen-Lubsen, D.E. Grobbee et al. // Acta Paediatr. — 2007. — Vol. 96, No 1. — P. 100-104. 38. Bonadio, W.A. Relationship of fever magnitude to rate of serious bacterial infections in infants aged 4-8 weeks / W.A. Bonadio, K. McElroy, P.L. Jacopy, D. Smith // Clin. Pediatr. (Phila). — 1991. — Vol. 30. — P. 478-480. 39. Bonadio, W.A. The history and physical assessments of the febrile infant. / W.A. Bonadio // Pediatr. Clin. North. Am. — 1998. — Vol. 45, No 1. — P. 65-77. 40. Bourner, G. Performance evaluation of the latest fully automated hematology analyzers in a large, commercial laboratory setting: a 4-way, side-by-side study / G. 84 Bourner, J. Dhaliwal, J. Sumner // Lab. Hematol. 2005. — Vol. 11, No 4. — P. 285297. 41. Brugnara, C. Reticulocyte hemoglobin equivalent (Ret He) and assessment of irondeficient states / C. Brugnara, B. Schiller, J. Moran // Clin. Lab. Haem. — 2006. — Vol. 28. — P. 303-308. 42. Burgess, T.L. Constitutive and regulated secretion of proteins / T.L. Burgess, R.B. Kelly // Annu Rev. Cell Biol. — 1987. — Vol. 3. — P. 243-293. 43. Burke, J.P. Pneumococcal bacteremia. Review of 111 cases, 1957-1969, with special reference to cases with undetermined focus / J.P. Burke, J.O. Klein, H.M. Gezon et al. // Am. J. Dis. Child. — 1971. — Vol. 121, No 4. — P. 353-359. 44. Buttarello, M. The new reticulocyte parameter (Ret-Y) of the Sysmex XE 2100: its use in the diagnosis and monitoring of posttreatment sideropenic anemia / M. Buttarello, V. Temporin, R. Ceravolo et al. // Am. J. Clin. Pathol. — 2004. — Vol. 121. — P. 489-495. 45. Campbell, G. Advances in statistical methodology for the evaluation of diagnostic and laboratory tests / G. Campbell // Stat. Med. — 1994. — Vol. 13. — P. 499-450 46. Caraguel, C.G. The two-step Fagan's nomogram: ad hoc interpretation of a diagnostic test result without calculation / C.G. Caraguel, R. Vanderstichel // Evid. Based Med. — 2013. — Vol. 18, No 4. — P. 125-128. 47. Carrol, E.D. Procalcitonin as a diagnostic marker of meningococcal disease in children presenting with fever and a rash / E.D. Carrol, P. Newland, F.A. Riordan et al. // Arch. Dis. Child. — 2002. — Vol. 86, No 4. — P. 282-285. 48. Chan, M. Canadian Laboratory Initiative on Pediatric Reference Interval Database (CALIPER): Pediatric Reference Intervals for an Integrated Clinical Chemistry and Immunoassay Analyzer, Abbott Architect ci8200 / M. Chan, I. Seiden-Long, M. Aytekin et al. // Clin. Biochem. — 2009. — Vol. 42. — Р. 885-891. 49. Charles, P.E. Serum procalcitonin for the early recognition of nosocomial infection in the critically ill patients: a preliminary report / P.E. Charles, E. Kus, S. Ahoc et al. // BMC Infect. Dis. — 2009. — Vol. 9. — P. 49. 85 50. Chesney, R.W. Pathogenic mechanisms of the hypocalcemia of the staphylococcal toxic-shock syndrome / R.W. Chesney, D.M. Mc Carron, J.G. Haddad et al. // J. Lab. Clin. Med. — 1983. — Vol. 101. — P. 576-585. 51. Chung, B.H. Chronic benign neutropenia among Chinese children / B.H. Chung, G.C. Chan, T.L. Lee et al. // Hong Kong Med. J. — 2004. — Vol. 10, No 4. — P. 231—236. 52. Clinical policy for children younger than three years presenting to the emergency department with fever // Ann. Emerg. Med. 2003. Vol. 42. P. 530-545. 53. Colantonio, D.A. Closing the gaps in pediatric laboratory reference intervals: a CALIPER database of 40 biochemical markers in ahealthy and multiethnic population of children / D.A. Colantonio, L. Kyriakopoulou, M.K. Chan et al. // Clin. Chem. — 2012. — Vol. 58, No 5. — P. 854-868. 54. Cornbleet, P.J. Clinical utility of the band count / P.J. Cornbleet // Clin. Lab. Med. — 2002. — Vol. 22. — P. 101-136. 55. Craig, J.C. The accuracy of clinical symptoms and signs for the diagnosis of serious bacterial infection in young febrile children: prospective cohort study of 15781 febrile illnesses / J.C. Craig, G.J. Williams, M. Jones et al. // BMJ. — 2010. — Vol. 340 — P. 1594. 56. Cuhadar, S. Stability studies of common biochemical analytes in serum separator tubes with or without gel barrier subjected to various storage conditions / S. Cuhadar, A. Atay, M. Koseoglu et al. // Biochem. Med. (Zagreb). — 2012. — Vol. 22, No 2. — P. 202-214. 57. D'Angelo, G. Ethnic and genetic causes of neutropenia: clinical and therapeutic implications / G. D'Angelo // Lab. Hematol. — 2009. — Vol. 15. — P. 25-29. 58. de Mast, Q. Mild increases in serum hepcidin and interleukin-6 concentrations impair iron incorporation in haemoglobin during an experimental human malaria infection / Q. de Mast, E.C. van Dongen-Lases, D.W. Swinkels et al. // Br. J. Haematol. — 2009. — Vol. 145. — P. 657-664. 86 59. Defining, establishing, and verifying reference intervals in the clinical laboratory; approved guideline / — third edition. CLSI document C28—A3. Wayne, PA: — CLSI; — 2008. 60. Diagnostic tests. Users’ guides to the medical literature / G. Guyatt, D. Rennie, editors. — In. : AMA Press, 2002. — P. 121-140. 61. Du Clos, T.W. Function of C-reactive protein / T.W. Du Clos // Ann. Med. — 2000. — Vol. 32. — P. 274-278. 62. Eagles, D. International survey of emergency physicians priorities for clinical decision rules / D. Eagles, I.G. Stiell, C.M. Clement et al. // Acad. Emerg. Med. — 2008. — Vol. 15, No 2. — P. 177-182. 63. Elhassanien, A.F. Fever without source in infants and young children: dilemma in diagnosis and management / A.F. Elhassanien, A.A. Hesham, F. Alrefaee // Risk Manag. Healthc. Policy. — 2013. — Vol. 29, No 6. — P. 7-12. 64. Espallardo, N.L. Decisions on diagnosis in family practice: use of sensitivity, specificity, predictive values and likelihood ratios / N.L. Espallardo // Asia Pacific Family Medicine. — 2003. — Vol. 2. — P. 229-232. 65. Fagan, T.J. Nomogram for Bayes theorem / T.J. Fagan // N. Engl. J. Med. — 1975. — Vol. 293. — P. 257. 66. Fernández Lopez, A. Spanish Society of Pediatric Emergencies. Procalcitonin in pediatric emergency departments for the early diagnosis of invasive bacterial infections in febrile infants: results of a multicenter study and utility of a rapid qualitative test for this marker / A. Fernández Lopez, C. Luaces Cubells, J.J. García García, J. Fernández Pou // Pediatr. Infect. Dis. J. — 2003. — Vol. 22, No 10. — P. 895-903. 67. Ferry-Masferrer, M. Multicentric reference values: shared reference limits / M. Ferry-Masferrer, X. Fuentes-Arderiu, V. Alvarez-Funes et al. // Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. — 1997. — Vol. 35, No 9. — Р. 715-718. 68. Ferry-Masferrer, M. Regional reference values for some quantities measured with the ADVIA Centaur analyser. A model of co-operation between the in vitro diagnostic industry and clinical laboratories / M. Ferry-Masferrer, X. Fuentes- 87 Arderiu, M. Gomа-Llongueras et al. // Clin. Chem. Lab. Med. — 2001. — Vol. 39, No 2. — Р. 166-169. 69. Fioredda, F. Congenital and Acquired Neutropenia Consensus Guidelines on Diagnosis From the Neutropenia Committee of the Marrow Failure Syndrome Group of the AIEOP / F. Fioredda, M. Calvillo, T. Coliva et al. // Pediatr. Blood Cancer. — 2011. — Vol. 57. — P. 10-17. 70. Fischer, J.E. A readers’ guide to the interpretation of diagnostic test properties: clinical example of sepsis / J.E. Fischer, L.M. Bachman, R. Jaeschke // Intensive Care Med. — 2003. — Vol. 29. — P. 1043-1051. 71. Fluss, R. Estimation of the Youden Index and its associated cutoff point / R. Fluss, D. Faraggi, B. Reiser // Biom. J. — 2005. — Vol. 47. — P. 458-472. 72. Fuentes-Arderiu, X. Multicentric reference values for some quantities measured with Tina-Quant reagents systems and RD/Hitachi analysers / X. Fuentes-Arderiu, M. Ferry-Masferrer, J.M. Gonzales-Alba et al. // Scand. J. Clin. Lab. Invest. — 2001. — Vol. 61, No 4. — Р. 273-276. 73. Fuentes-Arderiu, X. Multicentre physiological reference values for some urinary component-to-creatinine (creatininium) concentration ratios / X. Fuentes-Arderiu, R. Mas-Serra, C. de-Nу-Lengaran et al. // Clin. Chem. Lab. Med. — 2005. — Vol. 43, No 9. — Р. 958-962. 74. Fuentes-Arderiu, X. Multicentre physiological reference intervals for serum concentrations of immunoglobulins A, G and M, complement C3c and C4 measured with Tina-Quant reagents systems / X. Fuentes-Arderiu, E. Alonso-Gregorio, V. Alvarez-Funes et al. // Clin. Chem. Lab. Med. — 2007. — Vol. 45, No 3. — Р. 387390. 75. Galetto-Lacour, A. Bedside procalcitonin and C-reactive protein tests in children with fever without localizing signs of infection seen in a referral center / A. GalettoLacour, S.A. Zamora, A. Gervaix // Pediatrics. — 2003. — Vol. 112. — P. 10541060. 88 76. Galetto-Lacour, A. Identifying severe bacterial infection in children with fever without source / A.Galetto-Lacour, A. Gervaix // Expert Rev. Anti Infect. Ther. — 2010. — Vol. 8, No 11. — P. 1231-1237. 77. Gendrel, D. Comparison of procalcitonin with C-reactive protein, interleukin-6 and interferon-alpha for differentiation of bacterial versus viral infections / D. Gendrel, J. Raymond, J. Coste et al. // Pediatr. Infect. Dis. J. — 1999. — Vol. 18. — P. 875-881. 78. Gendrel, D. Procalcitonin as a marker of bacterial infection / D. Gendrel, C. Bohuon // Pediatr. Infect. Dis. J. — 2000. — Vol. 19. — P. 679-688. 79. Gill, C.J. Why clinicians are natural Bayesians / C.J. Gill, L. Sabin, H. Schmid // BMJ. — 2005. — Vol. 330. — P. 1080-1083. 80. Girodias, J.B. Approach to the febrile child: A challenge bridging the gap between the literature and clinical practice / J.B. Girodias, B. Bailey // Paediatr. Child Health. — 2003. — Vol. 8. — P. 76-82. 81. Greenhow, T.L. Changing epidemiology of bacteremia in infants aged 1 week to 3 months / T.L. Greenhow, Y.Y. Hung, A.M. Herz // Pediatrics. — 2012. — Vol. 129, No 3. — P. 590-596. 82. Haddy, T.B. Benign ethnic neutropenia: what is a normal absolute neutrophil count? / T.B. Haddy, S.R. Rana, O. Castro // J. Lab. Clin. Med. — 1999. — Vol. 133. — P. 15-22. 83. Harris, E.K. On dividing reference data into subgroups to produce separate reference ranges / E.K. Harris, J.C. Boyd // Clin. Chem. — 1990. — Vol. 36, No 2. — P. 265270. 84. Hatherill, M. Diagnostic marker of infection: comparison of procalcitonin with C reactive protein and leucocyte count / M. Hatherill, S.M. Tibby, K. Sykes et al. // Arch. Dis. Child. — 1999. — Vol. 81. — P. 417-421. 85. Hedberg, P. Aging stability of complete blood count and white blood cell differential parameters analyzed by Abbott CELL-DYN Sapphire hematology analyzer / P. Hedberg, T. Lehto // Int. J. Lab. Hematol. — 2009. — Vol. 31, No 1. — P. 87-96. 86. Herz, A.M. Changing epidemiology of outpatient bacteremia in 3- to 36-month-old children after the introduction of the heptavalent-conjugated pneumococcal vaccine / 89 A.M. Herz, T.L. Greenhow, J. Alcantara et al. // Pediatr. Infect. Dis. J. — 2006. — Vol. 25. — P. 293-300. 87. Hewson, P. Clinical markers of serious illness in young infants: a multicentre follow-up study / P. Hewson, Z. Poulakis, F. Jarman et al. // J. Paediatr. Child Health. — 2000. — Vol. 36, No 3. — P. 221-225. 88. Horn, P.S. A robust approach to reference interval estimation and evaluation / P.S. Horn, A.J. Pesce, B.E. Copeland // Clin. Chem. — 1998. — Vol. 44. — P. 622-631. 89. Horn, P.S. Reference Intervals a user’s guide / P.S. Horn, A.J. Pesce. — Washington DC : AACC Press. — 2005. — P. 29-36. 90. Hsiao, A.L. Fever in the new millennium: a review of recent studies of markers of serious bacterial infection in febrile children / A.L. Hsiao, M.D. Baker // Curr. Opin. Pediatr. — 2005. — Vol. 17, No 1. — P. 56-61. 91. Hsiao, A.L. Incidence and predictors of serious bacterial infections among 57 to 180 day old infants / A.L. Hsiao, L. Chen, D. Baker // Pediatrics. — 2006. — Vol. 117. — P. 1695-1699. 92. Isaacman, D.J. Utility of the serum C-reactive protein for detection of occult bacterial infection in children / D.J. Isaacman, B.L. Burke // Arch. Pediatr. Adolesc. Med. — 2002. — Vol. 156. — P. 905-909. 93. Jaffe, D.M. Antibiotic administration to treat possible occult bacteremia in febrile children / D.M. Jaffe, R.R. Tanz, A.T. Davis et al. // N. Engl. J. Med. — 1987. — Vol. 317, No 19. — P. 1175-1180. 94. James R.M. The investigation and management of chronic neutropenia in children / R.M. James, S.E. Kinsey // Arch. Dis. Child. — 2006. — Vol. 91. — P. 852-858. 95. Jaye, D.L. Clinical applications of C-reactive protein in pediatrics / D.L. Jaye, K.B. Waites // Pediatr. Infect. Dis. J. — 1997. — Vol. 16. — P. 735-746. 96. Johnson, M. Three-way evaluation of high throughput haematology analysersBeckman Coulter LH 750, Abbott Cell-Dyn 4000, and Sysmex XE 2100 / M. Johnson, C. Samuels, N. Josza, K. Gorney // Lab. Hematol. — 2002. — Vol. 8. — P. 230-238. 90 97. Jung, B. Clinical laboratory reference intervals in pediatrics: the CALIPER initiative / B. Jung, K. Adeli // Clin. Biochem. — 2009. —Vol. 42. — P. 1589-1595. 98. Karavanaki, K. Transient and chronic neutropenias detected in children with different viral and bacterial infections / K. Karavanaki, S. Polychronopoulou, M. Giannaki et al. // Acta Paediatr. — 2006. — Vol. 95. — P. 565-572. 99. Koster, M.J. Diagnostic properties of C-reactive protein for detecting pneumonia in children / M.J. Koster, B.D. Broekhuizen, M.C. Minnaard et al. // Respir. Med. — 2013. — Vol. 107, No 7. — P. 1087-1093. 100. Lacour, A.G. Procalcitonin, IL-6, IL-8, IL-1 receptor antagonist and C-reactive protein as identifi cators of serious bacterial infections in children with fever without localising signs / A.G. Lacour, A. Gervaix, S.A. Zamora et al. // Eur. J. Pediatr. — 2001. — Vol. 160. — P. 95-100. 101. Lacour, A.G. Score Identifying Serious Bacterial Infections in Children With Fever Without Source / A.G. Lacour, S.A. Zamora, A.A. Gervaix // Pediatr. Infect. Dis. J. — 2008. — Vol. 27. — P. 654-656. 102. Lang, T.A. How to report statistics in medicine: annotated guidelines for authors, editors, and reviewers / T.A. Lang, M. Secic. — Philadelphia : American College of Physicians, 1997. 103. Layios, N. Procalcitonin usefulness for the initiation of antibiotic treatment in intensive care unit patients / N. Layios, B. Lambermont, J.L. Canivet et al. // Crit. Care Med. — 2012. — Vol. 40. — P. 2304-2309. 104. Le Bastard, N. Longitudinal stability of cerebrospinal fluid biomarker levels: fulfilled requirement for pharmacodynamic markers in Alzheimer's disease / N. Le Bastard, L. Aerts, K. Sleegers et al. // J. Alzheimers Dis. — 2013. — Vol. 33, No 3. — P. 807-822. 105. Lee, G.M. Risk of bacteremia for febrile young children in the post- Haemophilus influenzae type b era / G.M. Lee, M.B. Harper // Arch. Pediatr. Adolesc. Med. — 1998. — Vol. 152, No 7. — P. 624-628. 106. Luaces-Cubells, C. Procalcitonin to detect invasive bacterial infection in nontoxic-appearing infants with fever without apparent source in the emergency 91 department / C. Luaces-Cubells, S. Mintegi, J.J. García-García et al. // Pediatr. Infect. Dis. J. — 2012. — Vol. 31, No 6. — P. 645-647 107. Mantadakis, E. Serum procalcitonin for prediction of renal parenchymal involvement in children with urinary tract infections: a meta-analysis of prospective clinical studies / E. Mantadakis, E. Plessa, E.K. Vouloumanou et al. // J. Pediatr. — 2009. — Vol. 155, No 6. — P. 875-881. 108. Manzano, S. Markers for bacterial infection in children with fever without source / S. Manzano, B. Bailey, A. Gervaix et al. // Arch. Dis. Child. — 2011. — Vol. 96, No 5. — P. 440-446 109. Martinez-Albarran, M. Procalcitonin and C-reactive protein serum levels as markers of infection in a pediatric population with febrile neutropenia and cancer / M. Martinez-Albarran, J. Perez-Molina Jde, S. Gallegos-Castorena et al. // Pediatr. Hematol. Oncol. — 2009. — Vol. 26. — P. 414-425. 110. Massin, M.M. Spectrum and frequency of illness presenting to a pediatric emergency department / M.M. Massin, J. Montesanti, P. Gerard, P. Lepage // Acta Clin. Bel. — 2006. — Vol. 61. — P. 161-165. 111. Mast, A.E. Reticulocyte hemoglobin content / A.E. Mast, M.A. Blinder, D.J. Dietzen // Am. J. Hematol. — 2008. — Vol. 83. — P. 307-310. 112. McCarthy, P.L. Observation scale to identify serious illness in febrile children / P.L. McCarthy, M.R. Scarpe, S.Z. Spiesel et al. // Pediatrics. — 1982. — Vol. 70. — P. 802-809. 113. McCarthy, P.L. Predictive value of abnormal physical examination findings in illappearing and well-appearing febrile children / P.L. McCarthy, R.M. Lembo, M.A. Baron et al. // Pediatrics. — 1985. — Vol. 76. — P. 167-171. 114. McGowan, J.E. Bacteraemia in febrile children seen in a “walk-in” pediatric clinic / J.E. McGowan, L. Bratton, J.O. Klein, M. Finaland // N. Engl. J. Med. — 1973. — Vol. 288. — P. 1309-1312. 115. Melbye, H. The course of C-reactive protein response in untreated upper respiratory tract infection / H. Melbye, D. Hvidsten, A. Holm et al. // Br. J. Gen. Pract. — 2004. — Vol. 54. — P. 653-658. 92 116. Muller, B. Ubiquitous expression of the calcitonin-1 gene in multiple tissues in response to sepsis / B. Muller, J.C. White, E.S. Nylen et al. // J. Clin. Endocrinol. Metab. — 2001. — Vol. 86. — P. 396-404. 117. Murphy, C.G. Clinical predictors of occult pneumonia in the febrile child / C.G. Murphy, A.C. van de Pol, M.B. Harper et al. // Acad. Emerg. Med. — 2007. — Vol. 14, No 3. — P. 243-249. 118. Perkins, N.J. The inconsistency of ‘optimal’ cutpoints obtained using two criteria based on the receiver operating characteristics curve / N.J. Perkins, E.F. Schisterman // Am. J. Epidemiol. — 2006. — Vol. 163. — P. 670-675. 119. Pewsner, D. Ruling a diagnosis in or out with "SpPIn" and "SnNOut": a note of caution / D. Pewsner, M. Battaglia, C. Minder et al. // BMJ. — 2004. — Vol. 329, No 7459. — P. 209-213. 120. Pierre, R.V. Peripheral blood film review. The Demise of the Eyecount Leukocyte Differential / R.V. Pierre // Clin. Lab. Med. — 2002. — Vol. 22. — P. 279-297. 121. Pratt, A. Duration of fever and markers of serious bacterial infection in young febrile children / A. Pratt, M.W. Attia // Pediatr. Int. — 2007. — Vol. 49. — P. 3135. 122. Preas, H.L. Effects of anti-inflammatory agents on serum levels of calcitonin precursors during human experimental endotoxemia / H.L. Preas, E.S. Nylen, R.H. Snider et al. // J. Infect. Dis. — 2001. — Vol. 184. — P. 373-376. 123. Pulliam, P.N. C-reactive protein in febrile children 1 to 36 months of age with clinically undetectable serious bacterial infection / P.N. Pulliam, M.W. Attia, K.M. Cronan // Pediatrics. — 2001. — Vol. 108. — P. 1275-1279. 124. Ricos, C. Current databases on biological variation: pros, cons and progress / C. Ricos, V. Alvarez, F. Cava et al. // Scan. J. Clin. Lab. Invest. — 1999. — Vol. 59, No 7. — P. 491-500. 125. Roberts, N.B. A study on the stability of urinary free catecholamines and free methyl-deravatives at different pH temperature and time storage / N.B. Roberts, G. 93 Higgins, M. Sargazi // Clin. Chem. Lab. Med. — 2010. — Vol. 48, No 1. — P. 8187. 126. Rossum, A.M. Procalcitonin as an early marker of infection in neonates and children / A.M. Rossum, R.W. Wulkan, A.M. Oudesluys-Murphy // Lancet Infect. Dis. — 2004. — Vol. 4. — P. 620-630. 127. Rustad, P. The Nordic Reference Interval Project 2000: recommended reference intervals for 25 common biochemical properties / P. Rustad, P. Felding, L. Franzson et al. // Scand. J. Clin. Lab. Invest. — 2004. — Vol. 64, No 4. — Р. 271-284. 128. Sackett, D.L. Evidence based medicine. How to practice and teach EBM / D.L. Sackett, S. Straus, W.S. Richardson et al. — 2nd ed. Edinburgh: Churchill Livingstone, 2000. — P. 67-93. 129. Sackett, D.L. The architecture of diagnostic research / D.L. Sackett, R.B. Haynes // BMJ. — 2002. — Vol. 324. — P. 539-541. 130. Sanders, S. The utility of serum C-reactive protein in differentiating bacterial from nonbacterial pneumonia in children: a meta-analysis of 1230 children / S. Sanders, A. Barnett, I. Correa-Velez et al. // Pediatr. Infect. Dis. J. — 2008. — Vol. 27, No 2. — P. 95-99. 131. Schoorl, M. Temporary impairment of reticulocyte haemoglobin content in subjects with community-acquired pneumonia / M. Schoorl, D. Snijders, M. Schoorl et al. // Int. J. Lab. Hematol. — 2012. — Vol. 34, No 4. — P. 390-395. 132. Schouten, J.A. Optimizing the antibiotics policy in the Netherlands. VIII. Revised SWAB guidelines for antimicrobial therapy in adults with community-acquired pneumonia / J.A. Schouten, J.M. Prins, M. Bonten et al. // Ned. Tijdschr. Geneeskd. — 2005. — Vol. 149, No 45. — P. 2495-2500. 133. Schuetz, P. Procalcitonin to guide initiation and duration of antibiotic treatment in acute respiratory infections: an individual patient data meta-analysis / P. Schuetz, M. Briel M., M. Christ-Crain et al. // Clin. Infect. Dis. — 2012. — Vol. 55. — P. 651662. 134. Senthilnayagam, B. Automated measurement of immature granulocytes: performance characteristics and utility in routine clinical practice / B. 94 Senthilnayagam, T. Kumar, J. Sukumaran et al. // Patholog. Res. Int. — http://dx.doi.org/10.1155/2012/483670. 135. Slater, M. Evaluation of the infant with fever without source: an evidence based approach / M. Slater, S.E. Krug // Emerg. Med. Clin. North. Am. — 1999. — Vol. 17, No 1. — P. 97-126. 136. Steinwald, P.M. Elevated calcitonin precursor levels are related to mortality in an animal model of sepsis / P.M. Steinwald, K.T. Whang, K.L. Becker et al. // Crit. Care. — 1999. — Vol. 3. — P. 11-16. 137. Taylor, M.R. Hematological reference ranges for schoolchildren / M.R. Taylor, C.V. Holland, R. Spencer et al. // Clin. Lab. Haem. — 1997. — Vol. 19. — P. 1-15. 138. Thayyil, S. Is procalcitonin useful in early diagnosis of serious bacterial infections in children? / S. Thayyil, M. Shenoy, M. Hamaluba et al. // Acta Paediatr. — 2005 — Vol. 94. — P. 155-158. 139. Thompson, M. Systematic review and validation of prediction rules for identifying children with serious infections in emergency departments and urgentaccess primary care / M. Thompson, A. Van den Bruel, J. Verbakel et al. // Health Technol. Assess. — 2012. — Vol. 16, No 15. — P. 1-100. 140. Tillet, W. Serological reaction in pneumonia with a non-protein somatic fraction of Pneumococcus / W. Tillet, T. Francis // J. Exp. Med. — 1930. — Vol. 52. — P. 561-571. 141. Trainor, J.L. Children with first-time simple febrile seizures are at low risk of serious bacterial illness / J.L. Trainor, L.C. Hampers, S.E. Krug, R. Listernick // Acad. Emerg. Med. — 2001. — Vol. 8. — P. 781-787. 142. Tukey, J.W. Exploratory Data Analysis / J.W. Tukey. — MA: Addison-Wesley Reading, 1977. 143. Ullrich, C. Screening healthy infants for iron deficiency using reticulocyte hemoglobin content / C. Ullrich, A. Wu, C. Armsby et al. // JAMA. — 2005. — Vol. 294, No 8. — P 924-930. 144. Van den Bruel, A. The evaluation of diagnostic tests: evidence on technical and diagnostic accuracy, impact on patient outcome and cost-effectiveness is needed / A. 95 Van den Bruel, I. Cleemput, B. Aertgeerts et al. // J. Clin. Epidemiol. — 2007. Vol. 60, No 11. — P. 1116-1122. 145. Van den Bruel, A. Diagnostic value of laboratory tests in identifying serious infections in febrile children: systematic review / A. Van den Bruel, M.J. Thompson, T. Haj-Hassan et al. // BMJ. — 2011. — Vol. 342. P. 1124-1129. 146. van Rossum, A.M. Procalcitonin as an early marker of infection in neonates and children / A.M. van Rossum, R.W. Wulkan, A.M. Oudesluys-Murphy // Lancet Infect. Dis. — 2004. — Vol. 4. — P. 620-630. 147. Vlacha, V. The clinical significance of non-malignant neutropenia in hospitalized children / V. Vlacha, G. Feketea // Ann. Hematol. — 2007. — Vol. 86. — P. 865870. 148. von Lilienfeld-Toal, M. Markers of bacteremia in febrile neutropenic patients with hematological malignancies: procalcitonin and IL-6 are more reliable than Creactive protein / M. von Lilienfeld-Toal, M.P. Dietrich, A. Glasmacher et al. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. — 2004. — Vol. 23, No 7. — P. 539-544. 149. Waddle, E. Outcomes of febrile children without localizing signs after pneumococcal conjugate vaccine / E. Waddle, R. Jhaveri // Arch. Dis. Child. — 2009. — Vol. 94, No 2. — P. 144-147. 150. Weimann, A. Laboratory haematological changes in the field of intensive care medicine — the extended differential blood count / A. Weimann, K. Weimann, A. Lun // Anasthesiol. Intensivmed. Notfallmed. Schmerzther. — 2009. — Vol. 44. — P. 164-170. 151. Whang, K.T. Procalcitonin and proinflammatory cytokine interactions in sepsis / K.T. Whang, S.D. Vath, K.L. Becker et al. // Shock. — 2000. — Vol. 14. — P. 7378. 152. Wilkinson, M. Prevalence of occult bacteremia in children aged 3 to 36 months presenting to the emergency department with fever in the postpneumococcal conjugate vaccine era / M. Wilkinson, B. Bulloch, M. Smith // Acad. Emerg. Med. — 2009. — Vol. 16, No 3. — P. 220-225. 96 153. Wing, R. Fever in the pediatric patient / R. Wing, M.R. Dor, P.A. McQuilkin // Emerg. Med. Clin. North Am. — 2013. — Vol. 31, No 4. — P. 1073-1096. 154. Wu, J.Y. Use of serum procalcitonin to detect bacterial infection in patients with autoimmune diseases: a systematic review and meta-analysis / J.Y. Wu, S.H. Lee, C.J. Shen et al. // Arthritis Rheum. — 2012. — Vol. 64, No 9. — P. 3034-3042. 155. Young, D.S. Effect of Drugs on Clinical Laboratory Tests / D.S. Young // Ann. Clin. Biochem. — 1997. — Vol. 34. — P. 579-581.
