СД.Ф.3. МУ ПЗ Кинетика и термодин. ферм. рнакций
advertisement
Министерство образования и науки Российской Федерации
Сибирский федеральный университет
Кинетика и термодинамика ферментативных реакций
Учебно-методическое пособие
к практическим занятиям
Специальность 020208.65 - Биохимия
Красноярск
СФУ
2012
УДК 577.15(07)
ББК 28.072.534
Составитель: Н.М.Титова
Кинетика и термодинамика ферментативных реакций: Сборник задач к
практическим занятиям /[Текст] / сост. Н.М. Титова. – Красноярск:
Сиб. федер. ун-т, 2012. – 64 с.
Сборник задач по курсу «Кинетика и термодинамика ферментативных
реакций» составлен в соответствии с программой курса и является учебнометодическим руководством по решению задач по кинетическим свойствам
ферментов.
В учебном пособии представлены четко структурированные задачи по
основному разделу курса «Кинетика ферментативных реакций» разной
степени сложности. Предназначено для студентов биологических и медикобиологических специальностей университетов.
УДК 577.15(07)
ББК 28.072.534
© Сибирский
федеральный
университет, 2012
2
ВВЕДЕНИЕ
В ферментативной кинетике концепция стационарности применима к
концентрациям связанных с ферментом интермедиатов. Когда фермент
смешивается с избытком субстрата наблюдается начальный период,
известный как предстационарное состояние, в течение которого
концентрации этих интермедиатов достигают стационарного уровня. По
достижении интермедиатами стационарных концентраций скорость реакции
относительно медленно изменяется со временем и именно в данный период
традиционно измеряют скорости энзиматических реакций.
Стационарное состояние является аппроксимацией, поскольку субстрат
постепенно превращается в ходе эксперимента. Но, принимая во внимание,
что измерения осуществляются за короткий промежуток времени, когда
концентрация субстрата изменяется незначительно, стационарное состояние
является хорошей аппроксимацией. Хотя изучение предстационарной
кинетики позволяет анализировать механизмы ферментативного катализа,
стационарная кинетика более важна для измерения каталитической
активности фермента при стационарных состояниях в клетке.
Раздел 1. Уравнение Михаэлиса-Ментен
Впервые А. Браун (Brown A.J.) и затем В.Анри (Henri V.) в начале ХХ
века высказали предположение о том, что в основе ферментативной реакции
лежит обратимое взаимодействис субстрата с ферментом с образованием
комплекса, который далее распадается с образованием продуктов реакции и
регенерацией исходного фермента. Эта гипотеза была далее развита в
работах Михаэлиса (L. Michaelis) и Ментен (M.L. Menten) (1913 г.) и позднее
– Бригсом (G.E. Briggs) и Холденом (J.B.S. Haldane) (1925 г.).
Кинетическую схему простейшей односторонней ферментативной
реакции превращения одного субстрата в продукт можно представить
следующим образом:
(1.1)
Ферментативная реакция протекает в два этапа. На первом этапе
фермент и субстрат образуют фермент-субстратный комплекс ES. Этот этап
3
является быстрым и обратимым, он не сопровождается какими-либо
химическими изменениями субстрата. Константы скорости реакции
образования фермент-субстратного комплекса и обратного его распада равны
соответственно k+1 и k-1. В образовании фермент-субстратного комплекса
(ФСК, комплекс Михаэлиса) принимают участие нековалентные
взаимодействия.
Каталитический процесс осуществляется на втором этапе реакции с
константой первого порядка k+2 (kcat, число оборотов фермента). Комплекс
Михаэлиса распадается с образованием конечного продукта реакции Р и
регенерацией исходного фермента. Распад фермент-субстратного комплекса
может происходить по-разному: в данной кинетической схеме он распадается
в одну стадию, но в других случаях этих стадий может быть несколько.
Исходя из уравнения (1), можно расписать уравнения для скоростей
отдельных стадий реакции.
Скорость образования фермент-субстратного комплекса:
d S
k 1 E S .
dt
Скорость обратной реакции (диссоциации комплекса на исходные
вещества):
d ES
k 1 ES .
dt
Скорость распада комплекса ES с образованием продуктов реакции и
регенерацией фермента:
d ES
k 2 ES .
dt
Стационарное течение процесса возможно тогда, когда концентрация
субстрата существенно превосходит концентрацию фермента ([S]>> [E]). В
этом случае распад комплекса ES по реакциям (+2) и (-1) уравновешивается
его образованием по реакции (+1). Поэтому для условия стационарности
можно записать:
k1 ES k2 ES k1 E S
или
4
k1 k2 ES k1E S .
Обозначив общую концентрацию фермента через [E]0, при условии, что [E]0
= [E] + [ES], преобразуем предыдущее уравнение
k1 k2 ES k1 E0 ES S .
Откуда концентрация фермент-субстратного комплекса будет равна
ES
k 1 E 0 S
.
k 1 k 2 k 1 S
Обозначив
k 1 k 2
Km ,
k 1
получим
ES E 0 S .
K m S
Скорость ферментативной реакции, измеряемая согласно схеме (1) по
образованию продукта реакции Р из комплекса ES, может быть выражена
следующим образом
v
d ES
k 2 ES .
dt
Подставляя в это выражение найденное значение [ES], получаем
v
k 2 [ E ]0 [ S ]0
Km [ S ]0
(1.2
)
Данное уравнение отражает зависимость скорости ферментативной реакции
от концентрации фермента и субстрата. Константа Км носит название
константы Михаэлиса и имеет размерность концентрации субстрата.
Уравнение (2) свидетельствует, что зависимость скорости ферментативной
реакции от концентрации субстрата при [E]0=const является гиперболической
функцией (рис. 1.1).
5
Рис.1.1. Зависимость
концентрации субстрата
скорости
ферментативной
реакции
от
Кривая представляет собой равнобочную гиперболу. При достаточно малых
концентрациях субстрата, когда [S] << Км, можно принять, что Км + [S] ≈ Км и
тогда
V = k+2[E]0, [S]/ Км,
поэтому реакция имеет первый порядок по отношению к субстрату и
является линейной функцией концентрации субстрата.
Когда [S] = Км, скорость реакции является полумаксимальной, т.е. v=
1/2 Vmax. В области высоких значений концентрации субстрата, когда [S] >>
Км, можно принять, что Км + [S] ≈ [S], и тогда
v ≈ k+2[E]0 = Vmax,
а реакция имеет нулевой порядок по отношению к субстрату. Следовательно,
при достижении определенной концентрации субстрата скорость
ферментативной реакции достигает максимального значения Vmax и при
дальнейшем увеличении концентрации субстрата не изменяется.
Смысл такого рода зависимости очевиден: скорость ферментативной
реакции определяется в целом концентрацией фермент-субстратного
комплекса и при малых концентрациях субстрата концентрация комплекса
Михаэлиса пропорциональна [S], тогда как при избытке субстрата
фактически весь фермент находится в форме ES. Дальнейшее повышение
концентрации субстрата не приводит к увеличению [ES].
6
С учетом приведенного выше выражения, окончательное уравнение
зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации фермента и
субстрата приобретает вид
v0
V max[ S ]0
.
Km [ S ]0
(1.3)
Уравнение (3) является фундаментальным уравнением ферментативной
кинетики и обычно называется уравнением Михаэлиса-Ментен.
Скорость реакции приближается к максимальной достаточно медленно,
и даже при [S]= 10Км, величина скорости достигает только 0,91 Vmax. В связи
с этим значение максимальной скорости очень часто трудно измеримо и его
приходится рассчитывать из скоростей, наблюдаемых при концентрациях
субстрата ниже насыщающих.
1.1.
Характеристика кинетических констант
В уравнении Михаэлиса есть два кинетических параметра, имеющих
важное значение для характеристики любого фермента. Это константа
Михаэлиса и максимальная скорость реакции. Константа Михаэлиса
определяется соотношением констант (k-1+k+2/k+1), а величина Vmax,
называемая максимальной скоростью, ‒ произведением k+2 [E]0.
Константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата, при
которой начальная скорость ферментативной реакции равна половине
максимальной. Высокое сродство фермента к субстрату характеризуется
низкой величиной Кm и наоборот, низкое сродство – высокой величиной Км.
Величина Vmax не является фундаментальной характеристикой
фермента, поскольку зависит от его концентрации. Если концентрация
фермента известна, то целесообразно ввести величину kcat – каталитическую
константу (или число оборотов фермента), определяемую выражением
Vmax/[E]0. Для механизма Михаэлиса kcat идентична k+2, однако в общем
случае лучше пользоваться менее определенным обозначением, а именно kcat.
Константу kкат называют еще «числом оборотов» поскольку она
соответствует числу молекул субстрата, превращаемых в продукт одной
молекулой фермента за 1 с. Отношение констант kcat/Км называют константой
специфичности фермента.
7
1.2.
Методы определения Км и Vmax
Константу Михаэлиса можно определить из графика Михаэлиса
(рис.1.1), найдя графическим способом максимальную скорость и
соответствующую величину концентрации субстрата, при которой скорость
ферментативной реакции будет вдвое меньше Vmax. Эта величина [S] и будет
Км. Таким способом можно определить только приблизительную величину
константы Михаэлиса из-за трудности точного графического определения
Vmax.
Более удобными являются методы, в которых осуществлена
линеаризация уравнения Михаэлиса-Ментен, т. е. гиперболическая
зависимость v от [S] переведена в линейную.
Для того чтобы построить такой график, необходимо определить в
одинаковых условиях при различных концентрациях субстрата и [E]= const
начальные скорости ферментативной реакции.
Метод Лайнуивера-Берка. Один из способов линеаризации уравнения
Михаэлиса-Ментен предложили Лайнуивер и Берк (Lineweaver H., Burk D.)).
Это так называемый метод двойных обратных величин. Для линеаризации
необходимо взять обратные величины от левой и правой частей уравнения (),
в результате чего оно преобразуется в уравнение вида
согласно которому между величинами, обратными начальной скорости (1/v,
v-1) и концентрации субстрата (1/[S], [S]-1) соблюдается линейная
зависимость, если механизм реакции подчиняется изложенным выше
представлениям (рис.1.2).
Рис. 1.2. График зависимости 1/v от 1/[S] (график Лайнуивера-Берка)
8
Экспериментальная прямая пересекает ось абсцисс в точке (-1/[S] =
1/Км), а ось ординат – в точке (1/v = 1/Vмах). Тангенс угла наклона равен
Км/Vмах. Этим широко пользуются для определения параметров Км и Vмах,
характеризующих связывающую и каталитическую функции ферментов.
Метод Хайнса-Вульфа. В этом случае преобразуется уравнение
Лайнуивера-Берка путем умножения правой и левой частей на концентрацию
субстрата.
Графическая зависимость приведена на рис.1.3.
Рис. 1.3. График зависимости [S]/v от [S] (график Хайнса-Вульфа)
Это прямая с наклоном 1/Vmax, отсекающая на осях [S]/v и [S] отрезки
Км/ Vmax и – Км соответственно.
Метод Иди-Хофсти. При одном из таких графических преобразований
в так называемом графике Иди-Хофсти (pиc.2.3.5) строят график
зависимости v от v/[S]. В этом случае точка пересечения прямой, полученной
путем наилучшей линейной аппроксимации экспериментальных точек, с
осью ординат соответствует Vmax, а тангенс угла наклона равен – Km. Данный
способ линеаризации приведен на рис. 1.4.
9
Рис. 1.4. График зависимости v от v/[S] (график Эди-Хофсти)
Метод Эйзенталя и Корниш-Боудена. Много позднее Эйзенталь и
Корниш-Боуден предложили иной метод графического представления
результатов исследования кинетики ферментативных реакций – так
называемый прямой линейный график. Уравнение Михаэлиса-Ментен они
преобразовали в виде зависимости Vmax от Км:
КМ = v + v/[S] VMA
Для любой пары значений [S] и v можно построить зависимость Vmax от
Км. Она представляет прямую с наклоном, равным v/[S], и отрезками,
отсекаемыми на осях Км и Vmax, соответственно равными – [S] v. Если
провести прямые для нескольких пар значений [S] и v, то эти прямые
пересекутся в одной точке, координаты которой дадут единственные
значения Vmax от Км, удовлетворяющие всем парам значений [S] и v (рис.1.5).
Рис.1.5. Определение кинетических констант – Км и Vmax по методу
Эйзенталя и Корниш-Боудена
10
Преимущества такого графика очевидно: для его построения не
требуется никаких расчетов, он позволяет очень просто выявить ошибочные
данные (такие прямые будут выпадать из основной совокупности прямых).
Уравнение Михаэлиса лежит в основе всех кинетических исследований
ферментативных реакций, так как оно позволяет рассчитать количественные
характеристики ферментов и проводить анализ их ингибирования. Величины
Кm и Vmax являются важнейшими характеристиками ферментов и их можно
определить, используя линеаризованные формы уравнения МихаэлисаМентен.
Графические методы для определения Vmax и Кm не являются
оптимальными. В настоящее время данные ферментативной кинетики
обрабатывают быстрее и более объективно с помощью компьютерных
программ.
1.3.
Задачи к разделу 1
Задача 1.1.. Определить кинетические параметры реакции, катализируемой
фосфоглюкомутазой, исходя из данных, приведенных в табл.1.
Таблица 1.1
[Глюкозо-1-фосфат], мкМ
2,5
5,0
10
20
40
80
160
v, мкмоль/мин*мг белка
31,2
53,3
74,5
94,0
123,3
139,2
152,4
Задача 1.2. Исходя из данных, приведенных в табл. 1.2, определить Км и
Vmax данной ферментативной реакции.
Таблица 1.2
[S], мМ
1
2
5
v, мкмоль продукта/мин
0,9
1,4
1,9
11
10
50
100
2,3
2,6
2,8
Задача
1.3.
Измеряли
кинетику
реакции,
катализируемой
сукцинатдегидрогеназой, в зависимости от концентрации янтарной кислоты.
Данные приведены в табл. 1.3. Определите константу Михаэлиса и
максимальную скорость данного ферментативного процесса.
Таблица 1.3
[сукцинат] *10-5М
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
3,0
9,0
15,0
21,0
v,мкмоль/мин
4,1
6,4
8,7
11,0
12,0
22,6
33,8
34,5
34,6
Задача 1.4. Исходя из данных табл. 1.4, определить кинетические параметры
(КМ, VMAX и kcat) гидролиза субстрата (метилового эфира N-ацетил-Lнорвалина), катализируемого α-химотрипсином [E]0 = 2,62 10-7 М.
Таблица 1.4
[S] 10 -2 М
4,00
2,00
1,33
1,00
0,80
v 10
M сек-1
9,70
7,85
6,46
5,50
4,80
-7
Задача 1.5. Измеряли кинетику ферментативной реакции, катализируемой
рибонуклеазой, в зависимости от концентрации РНК. Данные приведены в
табл. 1.5. Определить кинетические характеристики реакции (КМ и VMAX).
Таблица 1.5
[РНК]*10-4 М
0,1
v, мкмоль/мин
1,3
[РНК]*10-4 М
3,0
12
v, мкмоль/мин
6,8
0,3
0,5
0,7
1,0
2,1
2,9
3,5
4,5
9,0
15,0
18,0
8,1
8,5
8,6
Задача 1.6. Измеряли кинетику реакции, катализируемой каталазой в
зависимости от концентрации пероксида водорода. Полученные данные
приведены в табл. 1.6. Определите КМ и VMAX.
Таблица 1.6
v, мкмоль/мин
10,4
14,5
22,5
33,8
40,5
41,5
41,6
[H2O2], M
0,3 *10-5
0,5 *10-5
1,0 *10-5
3,0 *10-5
9,0 *10-5
13,0*10-5
16,0*10-5
Задача 1.7. Определить кинетические свойства фермента, исходя из данных
приведенных в табл. 1.7.
Таблица 1.7
[S] ,М 10-4
v0 , моль/мин/мг белка
0,25
0,50
1,00
20,00
50,00
1,0
1,7
2,5
5,0
5,2
Задача 1.8. Определить кинетические характеристики очищенного препарата
печеночной глюкокиназы по данным, приведенным в табл. 1.8.
Таблица 1.8
[глюкоза], мМ
v, U/мг белка
[глюкоза], мМ
v, U/мг белка
1,00
13,3
20,25
85,0
2,00
24,0
27,00
92,0
13
3,60
38,0
32,40
97,0
5,40
48,0
36,45
98,0
10,80
67,0
38,25
98,5
14,85
76,0
Задача 1.9. При определении каталитической активности пептидазы из
тонкого кишечника, гидролизующей дипептид глицилглицин:
Глицилглицин + Н2О → 2 глицин
были получены следующие экспериментальные
Определите графически величины КМ и VMAX.
данные
(табл.
1.9)
Таблица 1.9
[S], мМ
Продукт,
мг/мин
1,5 2,0 3,0 4,0
0,21 0,24 0,28 0,33
8,0
0,40
16,0
0,45
24
0,46
Задача 1.10. Определить кинетические свойства фермента, исходя из данных
приведенных в таблице 1.10.
Таблица 1.10
[S] ,мкмоль л-1
v0 , мкмоль л-1мин-1
[S] ,мкмоль л-1
v0 , мкмоль л-1мин-1
0,020
0,19
0,20
0,83
0,025
0,22
0,50
1,17
0,04
0,32
1,00
1,41
0,10
0,59
2,00
1,63
Задача 1.11. Определить кинетические свойства фермента, исходя из данных
приведенных в таблице 1.11.
14
Таблица 1.11
[S] ,мкмоль л-1
v0 , мкмоль л-1мин-1
0,5
50,0
1,0
75,0
2,0
100,0
3,0
112,5
10,0
136,4
Задача 1.12. Определить кинетические параметры (КМ, VMAX, k+2) гидролиза
этилового эфира N-транс-циннамоил-L-тирозина, катализируемого αхимотрипсином, исходя из данных табл.1.12. Условия опыта: рН 7,8; 250С;
[Е]0 = 3,1*10-9 М.
Таблица 1.12
[S]010-4, M
v0*10-7, М*сек-1
3,6
1,94
1,8
1,84
1,2
1,75
0,90
1,67
0,72
1,59
Задача 1.13. Определить кинетические свойства фермента, исходя из данных
приведенных в таблице 1.13.
Таблица 1.13
[S], ммоль л-1
v0, ммоль л-1мин-1
1,25
1,72
1,67
2,04
15
2,50
2,63
5,00
3,33
10,00
1,12
Задача 1.14. Исходя из данных, приведенных в таблице 1.14, определите КМ
и VMAX для ферментативной реакции.
Таблица 1.14
[S], М
v0, мкмоль/л мин
[S], М
v0, мкмоль/л мин
2,5 10-6
28
4,0 10-5
112
4,0 10-6
40
1,0 10-4
128
1,0 10-5
70
2,0 10-3
139
2,0 10-5
95
1,0 10-2
140
Задача 1.15. Фермент глутаматдегидрогеназа катализирует реакцию
L-глутамат + NAD+ → α-оксоглутарат + NADH + H+ + NH3
Кинетические данные (изменение начальной скорости от концентрации Lглутамата) приведены в табл. 1.15). Начальная концентрация NAD+ во всех
опытах постоянна. Найдите КМ и VMAX этой реакции.
Таблица 1.15
[L-глутамат], ммоль/л
v0 (ΔА340 нмоль/мин)
1,68
0,172
3,33
0,250
5,00
0,286
6,67
0,303
10,00
0,334
20,00
0,384
16
Задача 1.16. В таблице 1.16 представлены данные, показывающие
зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата.
Таблица 1.16
[S], М
1*10-6
1*10-5
1*10-4
1*10-3
Скорость реакции,
мкмоль/мин
20
32
39
40
Используя данные таблицы:
а) нарисуйте график зависимости скорости реакции от концентрации
субстрата;
б) найдите значение V mах и Км.
Чему равны Vmax данной реакции и Kм каталазы?
Задача 1.17. Пенициллин гидролизуется и тем самым инактивируется
пнициллиназой – ферментом, имеющимся у ряда резистентных бактерий.
Молекулярная масса пенициллиназы из Staphylococcus aureus составляет 29,6
кДа. Измеряли количество пенициллина, гидролизуемого в 12 мл раствора в
течение 1 мин в присутствии 10-9 г очищенной пенициллиназы как функцию
концентрации пенициллина (табл. 1.17). Примем, что в ходе определения
концентрация пенициллина практически не менялась.
Таблица 1.17
[Пенициллин], М
0,1*10-5
0,3*10-5
0,5*10-5
1,0*10-5
3,0*10-5
5,0*10-5
Количество гидролизовавшегося
пенициллина, моль
0,11*10-9
0,25*10-9
0,34*10-9
0,45*10-9
0,58*10-9
0,61*10-9
А) Постройте по этим данным график в координатах 1/V против 1/[S].
Подчиняется ли пенициллиназа кинетике Михаэлиса-Ментен? Если да, то
17
чему равна Км?
Б) Чему равна Vmax?
В) Каково число оборотов пенициллиназы в этих экспериментальных
условиях? Примем, что на одну молекулу фермента приходится один
активный центр.
Задача 1.18. При исследовании кинетики ферментативной реакции были
получены следующие данные (табл. 1.18):
Таблица 1.18
[S]10-5, М
v, мкмоль/мин
0,3
10,4
0,5
14,5
1,0
22,5
3,0
33,8
9,0
40,5
Определить Км и Vmax методом Лайнуивера-Берка.
Задача 1.19. Найдите с помощью трех методов линеаризации величины Vmax,
Km, k+2, исходя из данных табл. 1.19, приведенных в таблице. Концентрация
фермента 1,0 10-9 М.
Таблица 1.19
[S], моль/л
1,0 10-4
2,0 10-4
4,0 10-4
6,0 10-4
1,0 10-3
1,5 10-3
2,0 10-3
v0, моль/(л мин)
6,70 10-6
1,10 10-5
1,70 10-5
2,00 10-5
2,40 10-5
2,65 10-5
2,80 10-5
18
Задача 1.20. Известно, что D-серингидратаза из Neurospora crassa
использует в качестве кофермента пиридоксаль-5-фосфат. Фермент
катализирует реакцию
СН2ОН-СНNH2-COOH → СН3-СО-СООН + NН3
При изучении кинетики данного процесса были получены следующие
данные (табл. 1.20):
Таблица 1.20
Концентрация
кофермента, 10-5 М
Скорость
образования
пирувата,
мкмоль/20 мин
Концентрация
кофермента, 10-5 М
Скорость
образования
пирувата,
мкмоль/20 мин
0,2
0,150
1,70
0,340
0,4
0,200
2,00
0,350
0,85
0,275
8,00
0,360
1,25
0,315
Используйте эти данные для определения константы
сериндегидратазы по отношению к пиридоксальфосфату.
Михаэлиса
Задача
1.21.
Исследовали
кинетику
окисления
L-лактата
лактатдегидрогеназой в водно-солевых экстрактах двух органов (печени и
сердца), взятых у одного животного. Перед опытами тканевые экстракты
диализовали против воды.
В 1см кювету спектрофотометра добавляли 0,5 мл экстракта, 0,3 мл 10 мМ
раствора NAD+, 0,2 мл 30 мМ раствора семикарбазида и 1,0 мл натрийфосфатного буфера, рН 7,6. Затем в кювету добавляли 100 мкМ раствор Lлактат натрия в количествах, указанных в таб. 21, и водой доводили объем
пробы в каждой кювете до 3 мл. После добавления лактата содержимое
кюветы тщательно перемешивали и измеряли через каждые 30 с оптическую
плотность пробы на спектрофотометре при длине волны 340 нм. Полученные
данные приведены в табл. 1.21.
19
Таблица 1.21
Время.
мин
0,2
0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0,016
0,050
0,084
0,117
0,149
0,180
Оптическая плотность при 340 нм
Объем добавленного L-лактата, мл 100 мМ раствора
0,25
0,5
1,0
0,2
0,25
0,5
Экстракт печени
Экстракт сердца
0,012
0,023
0,031
0,013
0,030
0,023
0,052
0,080
0,105
0,052
0,074
0,082
0,092
0,137
0,174
0,090
0,119
0,137
0,131
0,208
0,252
0,127
0,162
0,196
0,169
0,249
0,328
0,163
0,204
0,258
0,207
0,305
0,397
0,199
0,245
0,315
1,0
0,015
0,084
0,155
0,222
0,290
0,350
Необходимо: 1) построить кинетические кривые реакции (графики
зависимости оптической плотности от времени), провести касательные к
начальным участкам кривых и определить начальную скорость реакции,
катализируемой ЛДГ; 2) используя полученные значения начальных
скоростей, построить графики зависимости v0 от [S]; 3) линеаризовать
графики v0 от [S] для определения величин Км и Vmax; сравнить кинетические
характеристики ЛДГ в экстрактах печени и сердца, дать обоснование
полученным данным.
Задача 1.22. Гомогенат сердца кролика, содержащий малатдегидрогеназу,
способен окислять в присутствии NAD+ cледующие субстраты: L-малат,
мезотартрат и DL-оксибутират.
А. Окисление малата. В 4-см спектрофотометрическую кювету добавляли 4
мл 0,3 М глицинового буфера, рН 10, и 0, 4 мл 50 мМ раствора NAD+. Затем в
кювету добавляли различные объемы 5 мМ раствора L-малата натрия и
общий объем пробы доводили водой до 11,9 мл. Реакция начинали
добавлением 0,1 мл разбавленного в 10 раз экстракта сердечной мышцы и
измеряли оптическую плотность при 340 нм через каждые 30 с в течение 3
мин. Полученные результаты приведены в табл. 1.22А.
Таблица 1.22А
Время,
мин
0,5
1,0
1,5
2,0
2,4
0,085
0,162
0,236
0,310
Оптическая плотность при 340 нм
Объем добавленного 5 мМ раствора L-ьалата, мл
1,2
0,72
0,48
0,24
0,060
0,070
0,048
0,027
0,123
0,120
0,086
0,051
0,184
9,169
0,123
0,074
0,245
0,220
0,160
0,099
20
0,12
0,019
0,033
0,046
0,061
2,5
3,0
0,385
0,458
0,395
9,367
0,269
0,319
0,199
0,236
0,122
0,145
0,074
0,087
Б. Окисление мезотартрата. Условия опыта для изучения окисления
трантрата были такими же, как и в случае малата, но вследствие того, что
скорость реакции в этом случае была значительно меньше, использовали
большие количества экстракта. Все добавки были такими же, как и при
изучении окисления малата, за исключениями: 1) были изменены
концентрации субстрата (указаны в табл. 1.22Б) и 2) объем пробы доводили
водой до 11,5 мл и реакцию начинали добавлением 0,5 мл неразбавленного
экстракта. Полученные данные приведены в табл.22.2
Таблица 1.22Б
Время,
мин
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
2,4
0,034
0,068
0,100
0,133
0,166
0,198
Оптическая плотность при 340 нм
Объем добавленного 10 мМ раствора мезотартрата, мл
1,2
0,6
0,36
0,28
0,029
0,024
0,012
0,008
0,054
0,040
0,023
0,018
0,078
9,057
0,035
0,027
0,102
0,073
0,046
0,036
0,127
0,090
0,056
0,045
9,152
0,106
0,067
0,055
0,18
0,008
0,015
0,022
0,028
0,035
0,042
В. Окисление DL-оксибутирата. Этот субстрат окисляется со скоростью,
промежуточной между скоростями окисления малата и мезотартрата.
Поэтому при измерении скорости реакции брали разные объемы субстрата
(указаны в таблтице), конечный объем пробы доводили водой до 11, 9 мл и
реакцию начинали добавлением 0,1 мл неразбавленного экстракта.
Полученные данные приведены в табл. 1.22В
Таблица 1.22В
Время,
мин
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
2,4
0,068
0,117
0,164
0,213
0,259
0,307
Оптическая плотность при 340 нм
Объем добавленного 50 мМ раствора оксибутирата, мл
1,2
0,72
0,48
0,36
0,055
0,040
0,030
0,021
0,094
0,069
0,054
0,040
0,130
9,098
0,077
0,060
0,170
0,127
0,101
0,079
0,208
0,156
0,125
0,099
9,244
0,184
0,148
0,119
21
0,24
0,019
0,034
0,048
0,063
0,078
0,093
Задача 1.23. При действии фосфодиэстеразы на ее субстрат были получены
данные, приведенные в табл. 1.23.
Таблица 1.23
[S], 10-3 М
Начальная скорость,
мкмоль/мин
[S], 10-3 М
Начальная скорость,
мкмоль/мин
2,50
0,0212
0,66
0,0148
1,66
0,0198
0,50
0,0137
1,00
0,0176
0,40
0,0117
Определите величины Кm и Vmax.
РАЗДЕЛ 2. ИНГИБИТОРЫ ФЕРМЕНТОВ
На активность ферментов оказывают влияние множество факторов,
среди которых важную роль играют ингибиторы, воздействие которых
снижает активность ферментов.
Различают обратимое и необратимое ингибирование. Необратимый
ингибитор или каталитический яд, взаимодействуя с ферментом, снижает его
активность до нуля.
Яркий пример необратимого ингибирования – ингибирование
ацетилхолинэстеразы фторорганическими соединениями (рис. 2.1.).
Ацетилхолинэстераза катализирует гидролиз ацетилхолина, избыток
которого может полностью блокировать передачу нервного импульса через
синапс. Поэтому фторорганические соединения являются сильными ядами.
22
Рис. 2.1. Необратимое ингибирование ацетилхолинэстеразы
Другой пример – действие аспирина на циклооксигеназу.
Ацетилсалициловая кислота ацилирует фермент в активном центре по
остатку серина (рис. 2.2.).
Рис. 2.2. Необратимое ингибирование циклооксигеназы
Необратимым ингибитором для ферментов, содержащих SH-группу
цистеина в активном центре, является йодуксусная кислота и йодацетамид
(рис. 2.3.).
Рис.
2.3.
Необратимое
фосфатдегидрогеназы
ингибирование
глицеральдегид-3-
Обратимые ингибиторы, в отличие от необратимых образуют с
ферментом динамический комплекс, отличающийся по своим кинетическим
свойствам от свободного фермента.
Характерная черта обратимого ингибирования – наличие равновесия
между ферментом и ингибитором. При этом константа равновесия или
константа ингибирования (Кi) служит мерой сродства фермента и
ингибитора и выражает эффективность действия ингибитора.
Можно выделить четыре типа обратимого ингибирования:
конкурентное, неконкурентное, бесконкурентное и ингибирование
смешанного типа.
Общая схема ингибирования:
23
2.1. Конкурентное ингибирование
Конкурентный ингибитор – это соединение, обладающее структурным
сходством с субстратом. Поэтому такой ингибитор способен
взаимодействовать с активным центром фермента, конкурируя с истинным
субстратом.
Схема конкурентного ингибирования
График ингибирования в координатах Лайнуивера-Берка выглядит
следующим образом (рис. 2.4).
Рис. 2.4. Конкурентное ингибирование
При этом типе ингибирования увеличивается Km. Скорость реакции
снижается, так как комплекс фермент-ингибитор является неактивным (не
распадается с образованием продуктов). Однако максимальная скорость
реакции (Vmax) не изменяется.
Уравнение Михаэлиса-Ментен в данном случае имеет вид:
24
v
V max[ S ]
Km(каж ) [ S ]
(1)
Где Km(каж) равна:
[I ]
Km(каж ) Km1
Ki
(2)
Степень ингибирования зависит от концентраций субстрата и
ингибитора, и при достаточно большой концентрации субстрата
ингибирование может быть подавлено.
Пример
конкурентного
ингибирования
–
ингибирование
сукцинатдегдрогеназы малоновой кислотой (рис 2.5).
Рис. 2.5. Малонат – конкурентный ингибитор сукцинатдегидрогеназы
2.2. Неконкурентное ингибирование
В случае неконкурентного ингибирования ингибитор не оказывает
влияния на взаимодействие фермента и субстрата (рис. 2.6), уменьшая
скорость реакции (Vmax(каж)<Vmax).
Схема неконкурентного ингибирования
При этом Ki1=Ki2=Ki.
следующим образом:
Уравнение
25
Михаэлиса-Ментен
выглядит
v
V max( каж )[ S ]
Km [ S ]
(3)
Где Vmax(каж) имеет значение:
V max( каж )
V max
[I ]
1
Ki
(4)
Линейный график в координатах двойных обратных величин имеет
следующий вид (рис. 2.6.). Степень ингибирования зависит от концентрации
ингибитора и не зависит от концентрации субстрата.
Примером неконкурентного ингибирования является ингибирование αамилазы мальтозой (продуктом реакции). В промышленности применяется
противогрибковый препарат этоний, который является неконкурентным
ингибитором сахаразы грибов. В медицине его используют как антисептик.
Рис. 2.6. Неконкурентное ингибирование
2.3. Бесконкурентное ингибирование
Этот тип ингибирования наблюдается в случае, когда ингибитор
способен связываться исключительно с фермент-субстратным комплексом.
Схема бесконкурентного ингибирования:
26
При данном типе ингибирования в равной степени изменяется как
константа Михаэлиса, так и максимальная скорость реакции:
v
Где V max( каж )
V max( каж )[ S ]
.
Km(каж ) [ S ]
[I ]
V max
, а Km(каж ) Km1 .
Ki
[I ]
1
Ki
(5)
(6)
Так как и константа Михаэлиса и максимальная скорость изменяются в
равной степени, то в координатах Лайнуивера-Берка графики имеют вид
параллельных прямых (рис.2.7).
Рис. 2.7. Бесконкурентное ингибирование
Бесконкурентный тип ингибирования часто встречается в сложных
полисубстратных реакциях.
2.4. Смешанный тип ингибирования
Типы ингибирования, рассмотренные выше, являются предельными
случаями в широком спектре возможных эффектов. В случае
27
двухсубстратных реакций при определенной концентрации ингибитора часто
можно наблюдать ингибирование смешанного типа.
Общая схема ингибирования смешанного типа.
При этом Ki1 ≠ Ki2. Изменяются как константа Михаэлиса, так и
максимальная скорость, но не в одинаковой степени:
v
V max( каж )[ S ]
Km(каж ) [ S ]
(7)
Смешанное конкурентное-неконкурентное ингибирование. В этом
варианте ингибирования Ki2˃ Ki1. Сродство фермента к субстрату в
присутствии ингибитора данного типа увеличивается, а максимальная
скорость ферментативной реакции снижается (рис. 2.8).
V max( каж )
V max
,
[I ]
1
Ki2
[I ]
Km1
Ki1
Km(каж )
[I ]
1
Ki2
(8)
Рис. 2.8. Смешанное конкурентное-неконкурентное
Смешанное неконкурентное-бесконкурентное ингибирование. В этом
случае Ki1 ˃ Ki2. Этот ингибитор снижает и константу Михаэлиса и
максимальную скорость реакции (рис. 2.9).
28
V max( каж )
V max
, Km(каж ) Km
[I ]
[I ]
1
1
Ki2
Ki2
(9)
Рис. 2.9. Смешанное неконкурентное-бесконкуоентное
Примером смешанного ингибирования является воздействие
ртутьорганического соединения мертиолата на сахаразу грибов. Это
вещество широко используется в промышленности для подавления роста
микромицетов.
2.5. Методы определения константы ингибирования
Величины Кi можно измерить различными методами, как
экспериментально, так и при помощи расчетов.
Если известна только одна концентрация ингибитора, то константу
ингибирования можно определить, используя графики в координатах
Лайнуивера-Берка. Найдя кажущиеся и истинные значения константы
Михаэлиса и максимальной скорости для двух графиков (в отсутствии и в
присутствии ингибитора) и подставив эти значения в формулы (2), (4), (7),
(9), (10), рассчитывают ингибиторную константу.
Наиболее удобен для определения константы ингибирования метод
Диксона. Этот простой графический метод позволяет определять Кi
непосредственно. Если определять скорость реакции в условиях постоянной
концентрации субстрата и различных концентраций ингибитора, то график
зависимости 1/v от [I] будет представлять собой прямую (рис. 2.10.). В этом
случае для определения ингибиторной константы достаточно определить
скорость реакции всего для двух концентраций субстрата.
29
Рис. 2.10. Графическое определение ингибиторных констант (метод
Диксона). Во всех случаях S1˃S2
2.6. Субстратное ингибирование
Для многих ферментативных реакций при увеличении концентрации
субстрата начальная скорость ферментативной реакции проходит через
максимум, а затем уменьшается. Подобного рода зависимость можно
описать, исходя из предположения об образовании в процессе реакции
непродуктивного тройного комплекса ЕS2. В этом случае кинетическая схема
ферментативной реакции выглядит следующим образом:
Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата после
математической обработки этой схемы имеет вид:
v
V max[ S ]
Km [ S ] [ S ]2 / K S'
(11)
Где К′s – субстратная константа, учитывающая сродство фермента ко
второй молекуле субстрата. Анализ этого уравнения, как и уравнения
Михаэлиса-Ментен, целесообразно проводить раздельно в области низких
([S] < Кs´) и высоких ([S] ˃ Кm ) концентрациях субстрата.
При низких значениях концентрации субстрата уравнение упрощается
до классического уравнения Михаэлиса-Ментен (рис. 2.12а), при
линеаризации которого можно определить Кm, Vmax, kcat (k+2 ).
30
v
V max[ S ]
Km [ S ]
В области высоких концентраций субстрата уравнение принимает вид:
v
V max[ S ]
1 Km [ S ] / K S'
(12)
Линеаризация этого уравнения в координатах (1/v, [S]) позволяет
определить Vmax и Кs´ (рис.2.12б).
а)
б)
Рис. 2.12. Линеаризация уравнения (12) в координатах (1/v 1/[S]) –а) и
(1/v ; [S]) – б)
Зная величины Кm и Кs´, можно рассчитать оптимальную концентрацию
субстрата по формуле:
[S ]opt K m K S'
(13)
2.7. Задачи к разделу 2.
Задача 2.1. Исходя из данных табл. 2.1, определите характер ингибирования,
Km и Vmax в присутствии и отсутствии ингибитора. Определить
ингибиторную константу методом Диксона.
Таблица 2.1
Скорость, мкмоль/мин
[S], мМ
Концентрация ингибитора
31
0
1,5
3,0
4,5
0,20
0,32
0,17
0,12
0,09
0,73
1,10
0,60
0,35
0,35?
1,26
1,50
0,87
0,77
0,60
1,78
1,96
1,20
0,81
0,65
2,31
2,22
1,61
1,12
0,98
2,84
2,40
1,62
1,40
1,31
3,36
2,85
2,00
1,51
1,35
3,90
2,65
1,80
1,73
1,44
4,42
2,80
2,56
2,12
1,47
4,94
3,24
2,58
1,82
1,72
Задача 2.2. Измеряли кинетику ферментативной реакции в зависимости от
концентрации субстрата в присутствии или отсутствие ингибитора I и II.
Были получены следующие данные (табл. 2.2):
Таблица 2.2
[S], 10 -5
M
Скорость, мкмоль/мин
Без ингибитора
С ингибитором I
С ингибитором II
0,3
10,4
4,1
2,1
0,5
14,5
6,4
2,9
1,0
22,5
11,3
4,5
3,0
33,8
22,6
6,8
9,0
40,5
33,8
8,1
Задача 2.3. Определить Км и Vmax в присутствии и отсутствии ингибитора,
исходя из данных, приведенных в табл. 2.3. Установить тип ингибирования.
Таблица 2.3
32
[S], мМ
v, ммоль/мин
контроль
ингибитор
1,72
0,98
2,04
1,17
2,63
1,47
3,33
1,96
4,12
2,38
1,25
1,67
2,50
5,00
10,00
Задача 2.4. Влияние оксамата натрия на скорость реакции, катализируемой
лактатдегидрогеназой из Lactobacillis plantarum, изучали следующим
образом.
2 мл трис-буфера, рН 8,0 и 0,2 мл 2 мМ раствора NADH добавляли в
десять спектрофотометрических кювет. К пяти кюветам добавляли 0,1 мл 15
мМ раствора оксамата натрия. Во все кюветы добавляли различные объемы
0,6 мМ раствора пирувата натрия. Конечный объем проб доводили дист.
водой до 2,9 мл. Реакцию запускали добавлением 0,1 мл раствора
лактатдегидрогеназы измеряли оптическую плотность при 340 нм через мин
после перемешивания и затем с интервалом в 1 мин. Полученные результаты
оптических плотностей приведены в табл. 2.4.
Таблица 2.4
Время,
мин
0,02
оптическая плотность при 340 нм
объем пирувата, мл
без оксамата
с оксаматом
0,03
0,05
0,100 0,200
0,02
0,03
0,05
0,100
0,200
1
0,800
0,804
0,776
0,772
0,726
0,788
0,803
0,803
0,780
0,760
2
0,776
0,768
0,721
0,633
0,583
0,776
0,784
0,776
0,729
0,683
3
0,750
0,727
0,668
0,544
0,460
0,764
0,765
0,748
0,681
0,608
4
0,724
0,692
0,617
0,460
0,350
0,751
0,745
0,721
0,627
0,532
Определить тип ингибирования. Рассчитайте величины КМ и VMAX
присутствии и без ингибитора.
в
Задача 2.5. Гликоген – это полисахарид, состоящий из остатков глюкозы.
Гликогенсинтаза – фермент, ответственный за наращивание молекулы
гликогена по следующей реакции:
UDP-глюкоза + (глюкоза)n → (глюкоза)n + 1 + UDP
33
В табл. 2.5 приведены результаты двух опытов по каталитическому действию
гликогенсинтазы, в которых менялась концентрация UDP-глюкозы, а
концентрация полисахарида (акцептора) сохранялась постоянной. В одном
опыте к реакционной смеси добавляли только полисахарид, а в другом – еще
и ATP (2,5 ммоль/л). С помощью графического анализа определите вид
ингибирования фермента ATP и рассчитайте кинетические константы.
Таблица 2.5
UDP-глюкоза,
ммоль/л
0,8
1,4
3,3
5,0
Содержание (глюкоза)n+1
(начальная скорость), мкмоль/мин
Без АТР
С добавлением АТР
10,0
2,0
12,5
3,3
22,0
6,7
25,0
10,0
Задача 2.6. Исходя из данных табл. 2.6, определите тип ингибирования, Км и
Vmax.
Таблица 2.6
[S], М
27 10-7
45 10-7
91 10-7
27 10-6
81 10-6
Скорость реакции, мкмоль л -1мин-1
Без ингибитора
С ингибитором
11,96
7,80
16,68
10,11
25,88
12,99
38,87
16,04
46,58
17,41
Задача 2.7. Декарбоксилирование глиоксилата митохондриями ингибируется
малонатом. При кинетическом исследовании были получены следующие
результаты (табл. 2.7). Определите тип ингибирования, Км, Vmax и величины
Кi для двух концентраций малоната.
Таблица 2.7
Концентрация
глиоксилата,
мМ
1,00
0,75
0,60
0,50
Скорость выделения СО2 условные единицы)
в отсутствие
[малонат],
[малонат],
малоната
1,26 мМ
1,96 мМ
2,50
2,17
1,82
2,44
1,82
1,39
2,08
1,41
1,28
1,89
1,30
1,00
34
0,40
0,33
0,25
1,67
1,39
1,02
1,09
-
0,56
Задача 2.8.. Глутаматдегидрогеназа катализирует следующую реакцию:
L-глутамат + NAD+ ↔ α-кетоглутарат + NADH +H+ + NH3
За ходом реакции можно следить по поглощению при 340 нм. При изучении
влияния салицилата натрия на приведенную реакцию были получены
следующие данные (табл. 2.8).
Таблица 2.8
Концентрация
глутамата,мМ
1,5
2,0
3,0
4,0
8,0
16,0
Δ А340/мин
в отсутствие
в присутствии
ингибитора
40 мМ салицилата
0,21
0,25
0,28
0,33
0,44
0,40
0,08
0,10
0,12
0,13
0,16
0,18
Определить графически тип ингибирования. Найти Vmax, КМ и Кi (константу
диссоциации комплекса фермент-ингибитор).
Задача 2.9. Альфа-кетоглутарат является конкурентным ингибитором
реакции
окисления
N-метил-L-глутамата,
катализируемого
Nметилглутаматдегидрогеназой.
Определить
константу
диссоциации
комплекса фермент-ингибитор, исходя из данных табл. 2.9. [E]o= 6*10-2
мг/мл.
Таблица 2.9
[α-кетоглутарат]·10-3 М
0
[S]*10-4 М
vo·10-6 M·мин-1
1,00
0,625
0,500
0,417
0,264
1,67
1,67
1,43
1,33
1,25
1,00
1,67
35
1,00
0,625
0,500
0,330
5,00
1,67
1,00
0,667
0,500
0,6
3,0
1,43
1,18
1,04
0,83
1,56
1,00
0,77
0,57
0,45
Задача 2.10. Анализировали кинетику фермента в присутствии ингибитора,
добавленного в концентрации 10-4 М (табл. 2.10):
Таблица 2.10
Скорость реакции, мкмоль/мин
[S] , 10 -5 M
без ингибитора
10,4
14,5
22,5
33,8
40,5
0,3
0,5
1,0
3,0
9,0
с ингибитором
2,1
2,9
4,5
6,8
8,1
а) Каковы значения КМ и VMAX в присутствии ингибитора? Cравните их с
величинами, полученными в задаче 2-1.
б) Каков тип ингибирования?
в) Какова константа диссоциации этого ингибитора?
г) При [S] = 3 х 10-5 М какая доля молекул фермента связана с субстратом в
присутствии 10-4 М ингибитора? В отсутствие его?
Задача 2.11. Анализировали кинетику фермента, рассмотренного в задаче
2.10, в присутствии другого ингибитора, добавленного в концентрации ?????
Таблица 2.11
Скорость реакции, мкмоль/мин
[S]10-5, М
без ингибитора
0,3
10,4
0,5
14,5
1,0
22,5
36
с ингибитором
3,0
33,8
9,0
40,5
а) Каковы значения КМ и VMAX в присутствии ингибитора? Cравните их с
величинами, полученными в задаче 2-1.
б) Каков тип ингибирования?
в) Какова константа диссоциации этого ингибитора?
г) При [S] = 3 х 10-5 М какая доля молекул фермента связана с субстратом в
присутствии 10-4 М ингибитора? В отсутствие его?
Задача 2.12. Исходя из данных табл. 2.12, определить Km и Vmax в
присутствии и отсутствии ингибитора. Каков характер ингибирования?
Определить ингибиторную константу методом Диксона.
Таблица 2.12
Скорость, мкмоль/мин
[S], мМ
Концентрация ингибитора
0
1,5
3,0
4,5
0,20
0,32
0,17
0,12
0,09
0,73
1,10
0,60
0,35
0,35?
1,26
1,50
0,87
0,77
0,60
1,78
1,96
1,20
0,81
0,65
2,31
2,22
1,61
1,12
0,98
2,84
2,40
1,62
1,40
1,31
3,36
2,85
2,00
1,51
1,35
3,90
2,65
1,80
1,73
1,44
4,42
2,80
2,56
2,12
1,47
4,94
3,24
2,58
1,82
1,72
Задача 2.13. Реакция расщепления крахмала α-амилазой ингибируется
продуктами гидролиза мальтозой и α-декстрином. Исходя из данных,
37
приведенных в табл. 2.13, установите тип ингибирования и вычислите
соответствующие значения КМ и VMAX.
Таблица 2.13
Ингибитор
Нет
Мальтоза
α-декстрин
Концентрация
ингибитора,
мг/мл
0,00
6,35
12,70
25,40
1,67
3,34
6,68
Концентрация субстрата, мг/мл
11,52
5,76
2,88
1,44
Относительная скорость гидролиза
100
90
82
67
105
100
100
82
77
66
57
78
76
70
56
50
46
38
49
45
37
39
36
31
27
32
28
23
Задача 2.14. Из приведенных ниже данных для ферментативной реакции
(табл. 2.14) определите, является ли действие ингибитора конкурентным или
неконкурентным. Вычислите также величину КМ и VMAX для фермента.
Таблица 2.14
[S], мМ
Скорость образования
продукта в отсутствие
ингибитора, мкг ч-1
Скорость образования
продукта в присутствии
ингибитора, мкг ч
2,0
3,0
4,0
10,0
15,0
139
179
213
313
370
88
121
149
257
313
Задача 2.15. Фермент Х расщепляет субстрат А с образованием продукта В.
Соединения С и D ингибируют реакцию. В рассматриваемом ниже
эксперименте под действием определенного (постоянного) количества
фермента Х происходит превращение А в В в присутствии С или D.
Концентрации выражены в мкмоль/мл, начальные скорости реакций – в
мкмолях А, превращенного за 1 мин 1 мл раствора. На основании
информации, приведенной в табл. 2.15, сделайте мотивированное заключение
о типе ингибирования, вызываемом С и D.
38
Таблица 2.15
Скорость
Скорость
[C], мМ
[А] = 8 мМ
[А] = 24 мМ
0
5,0
10,0
1,0
3,4
2,5
2,3
4,0
[D], мМ
[А] = 8 мМ
[А] = 24 мМ
0
5,0
10,0
4,5
1,0
2,3
_
3,6
2,5
1,3
5,4
5,0
1,6
3,1
4,0
4,2
7,0
1,2
2,4
5,0
0,7
3,5
7,0
0,6
2,7
Задача 2.16. Исследовалось влияние β-фтормалата на активность
малатдегидрогеназы. Условия проведения эксперимента: 1 мл раствора
фермента и 0,5 мл фосфатного буфера добавляли в восемь кварцевых
пробирок сечением 1 см2. В четыре пробирки добавляли по 0,3 мл 0,5 мМ
раствора β-фтормалата (смесь двух стереоизомеров). Затем во все пробирки
добавляли различные объемы 0,5 мМ раствора оксалоацетата, объем проб
доводили до 2,8 мл водой и перемешивали. Реакцию начинали добавлением
0,2 мл 1 мМ раствора NADH и измеряли оптическую плотность при 340 нм
сразу же после добавления кофермета и затем через каждые 2 мин.
Полученные результаты приведенв в табл. 2.16.
Таблица 2.16
Время.
мин
0
2
4
6
8
Оптическая плотность при 340 нм
объем оксалоацетата, мл
без фтормалата
в присутствии фтормалата
0,10
0,15
0,30
0,60
0,10
0,15
0,30
0,60
0,415
0,387
0,358
0,332
0,320
0,413
0,380
0,346
0,314
0,283
0,411
0,370
0,329
0,281
0,250
0,407
0,358
0,312
0,269
0,225
0,416
0,400
0,383
0,368
0,352
0,417
0,396
0,375
0,355
0,335
0,415
0,385
0,355
0,325
0,296
0,414
0,376
0,337
0,301
0,263
39
Является ли фтормалат ингибитором? Если да, то определите значение его
Кi.
Задача 2.17. Определите Кi по данным зависимости v от [I] при двух
концентрациях субстрата. При определении ингибиторной константы для
ионов ацетата, действующих на гидролитический фермент, были получены
приведенные ниже данные (для уксусной кислоты и ацетата натрия
соответственно, табл. 2.17). Какие заключения качественного и
количественного характера можно сделать на основании этих данных?
Реакцию проводили при 250 С в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4), скорость
реакции выражали числом микромолей субстрата, гидролизованного за 1 мин
на 1 мг белка.
Таблица 2.17
Концентрация субстрата 3 мМ
Концентрация
ацетата или
ацетата натрия,
М
0
0,03
0,06
0,09
0,12
0,15
0,18
0,21
0,24
v реакции при
добавлении
ацетата
1,64
1,33
1,14
0,99
0,85
0,64
0,50
0,425
0,30
v реакции при
добавлении
ацетата натрия
1,64
1,33
1,15
1,00
0,89
0,81
0,735
0,675
0,625
Концентрация субстрата 5 мМ
Концентрация
ацетата или
ацетата натрия,
М
v реакции при
добавлении
ацетата
v реакции при
добавлении
ацетата натрия
0
0,03
0,06
0,09
0,12
0,15
0,18
0,21
0,24
2,1
1,79
1,59
1,40
1,23
1,08
0,83
0,61
0,42
2,1
1,79
1,60
1,45
1,30
1,18
1,09
1,01
0,94
Задача 2.18. На основании данных, приведенных в таб. 2.18 определить
константу Михаэлиса и максимальную скорость реакции в отсутствии
ингибитора. Принимая во внимание, что количество фермента одинаково в
каждом варианте эксперимента, а ингибитор А и В присутствуют в
40
концентрации 10 мМ, определить для
ингибирования и ингибиторную константу Ki.
каждого
ингибитора
тип
Таблица 2.18
[S], mM
v, ( моль/с)
v, (моль/с)
v, (моль/с)
без ингибитора
ингибитор A
ингибитор B
1
2.5
1.17
0.77
2
4.0
2.1
1.25
5
6.3
4.0
2.0
10
7.6
5.7
2.5
20
9.0
7.2
2.86
Задача 2.19. Измеряли начальную скорость ферментативной реакции как
функцию концентрации субстрата в отсутствии и присутствии ингибитора и
получили следующие данные (рис. 2.19).
Таблица 2.19
[S], М
0,0001
0,0002
0,0005
0,001
0,002
0,005
0,01
0,02
0,05
0,1
1)
2)
3)
4)
5)
v, моль мин-1
без
ингибитора
33
50
71
83
91
96
98
99
100
100
v, моль мин-1
в присутствии
ингибитора
17
29
50
67
80
91
95
98
99
100
Чему равна Vmax в отсутствие ингибитора?
Чему равна Км в отсутствие ингибитора?
При [S]=0,0004 М какова будет скорость в отсутствие ингибитора?
При [S]=0,0004 М какова будет скорость в присутствии ингибитора?
В отсутствие ингибитора, какая часть фермента будет связана
субстратом, если [S]=0,0004 М?
41
с
Задача 2.20. Исследовали скорость ферментативной реакции в отсутствии и
присутствии ингибитора при различных концентрациях субстрата.
Полученные данные представлены в табл.2.20.
Таблица 2.20
v, моль/мин
[S], мМ
контроль
ингибитор
1,25
1,72
0,98
1,67
2,04
1,17
2,50
2,63
1,47
5,00
3,33
1,96
10,00
4,12
2,38
Определить Vmax и Km в присутствии и отсутствии ингибитора, тип
ингибирования.
Задача
2.21.
3,4-Дихлорфенилэтаноламин
является
одновременно
субстратом и ингибитором реакции трансметилирования, катализируемой
фенилэтаноламин-N-метилтрансферазой.
На
основании
данных,
приведенных в табл. 2.21, определите кинетические параметры реакции (Км,
Кs′, Vmax, [S]opt.
Таблица 2.21
[S] 10-6, М
v0 10-10, М мин-1
[S] 10-6, М
v0 10-10, М мин-1
1,00
1,14
1,33
1,60
2,00
4,00
4,25
4,55
4,76
5,00
10,0
25,0
50,0
75,0
100,0
5,16
3,85
2,82
2,33
1,79
2,67
5,00
5,26
5,45
125,0
150,0
1,47
1,28
Задача 2.22. Реакция гидролиза йодида N-метил-7-ацетоксихинолина,
катализируемого ацетилхолинэстеразой, ингибируется субстратом. Исходя из
данных табл. 2.22, определите кинетические параметры ферментативной
42
реакции: Км, Vmax, Ks′, [S]opt. (Условия опыта: рН 6,85; 250С; 0,05 М
фосфатный буфер; 1,6% метанола).
Таблица 2.22
[S] 10-5, М
v0, условн. ед.
[S] 10-5, М
v0, условн.ед.
0,125
0,143
0,167
0,200
0,250
0,333
0,174
0,195
0,220
0,254
0,300
0,364
2,0
5,0
10,0
20,0
30,0
40,0
0,735
0,833
0,800
0,715
0,645
0,572
0,500
1,000
0,465
0,625
50,0
60,0
70,0
0,514
0,476
0,431
Задача 2.23. Изофермент ЛДГ1, выделенный и очищенный из cтарых
эритроцитов кролика, ингибируется высокими концентрациями пирувата. На
основании данных, приведенных в табл. 2.23, определите кинетические
характеристики реакции, катализируемой этим изоферментом: Км, Vmax,
Ks′, [S]opt. Концентрация NADH – 80 мкМ.
Таблица 2.23
[пируват], мкМ
v, мкмоль/мин/мг
белка
20
40
80
160
320
640
1280
15
33
49
68
74
66
45
Задача 2.24. Реакция восстановления пирувата, катализируемая
лактатдегидрогеназой, ингибируется высокими концентрациями субстрата.
На основании данных табл. 2.24 определите Км, Vmax, Кs′ и [S]opt данной
ферментативной реакции. (Условия опыта: рН 6,80; 27,5 0С; 0,05 М
фосфатный буфер; [NADH] = 1,29 10-5 М; [E]0 = 2 10-5 мг/мл).
Таблица 2.24
43
[S] 10-3, М
v0 10-6, М мин-1
[S] 10-3, М
v0 10-6, М мин1
0,020
0,029
0,040
0,050
0,100
0,500
3,15
3,70
4,10
4,39
4,92
4,90
0,70
1,10
3,00
5,00
7,00
10,00
4,30
3,90
2,40
1,80
1,50
1,10
Задача 2.25. n-Нитроанилид N-бензоил-Lаргинина является одновременно
субстратом и ингибитором гидролиза, катализируемого трипсиноподобным
ферментом микробного происхождения. Исходя из данных табл. 2.25, найти
кинетические параметры ферментативной реакции. Условия опыта: рН 9,0,
250 С.
Таблица 2.25
[S], 10-5 М v/[E0], c-1
[S], 10-5 М
v/[E0], c-1
1,98
4,15
20,0
7,50
2,50
4,65
50,0
6,91
3,00
5,13
100
5,72
4,00
5,89
200
4,22
6,00
6,63
300
3,30
8,00
7,15
396
2,74
10,0
7,15
Задача 2.26. Скорость реакции гидролиза )-(бензоилглицин) -2оксиизовалериановой кислоты, катализируемой карбоксипептидазой А,
уменьшается в присутствии избытка субстрата. Исходя из данных табл. 2.26,
определите кинетические и равновесные параметры. Условия опыта: рН 7,5;
250 С; [Eo] = 6,1 10-10 – 1,2 10-8 М.
Таблица 2.26
[S] 10-4, M
v/[E]o, с-1
[S] 10-4, M
v/[E]o, с-1
[S] 10-4, M
v/[E]o, с-1
0,400
0,445
9,57
10,50
2,00
3,16
29,2
33,8
31,6
44,7
21,00
16,70
44
0,500
0,572
0,667
0,800
1,000
1,410
1,780
11,50
12,80
14,50
16,70
19,60
25,00
28,00
4,00
5,62
10,00
10,60
16,80
17,80
24,00
35,6
36,2
34,7
33,4
29,2
28,4
24,8
56,2
74,1
100,0
141,0
178,0
316,0
562,0
15,00
12,50
10,60
8,35
7,50
5,83
4,80
Задача 2.27. При изучении кинетики гидролиза монофенилфосфата,
катализируемого щелочной фосфатазой, было найдено, что субстрат является
одновременно и ингибитором ферментативной реакции. На основании
данных табл. 2.27 определить кинетические и равновесные параметры
ферментативного гидролиза. Условия опыта: Рн 10,0; 37 0 С; [E]o = 4 10-3
мг/мл.
Таблица 2.27
[S] 10-3, М
V 10-5 , моль мин-1
0,5
1,0
2,0
4,0
5,0
6,0
7,0
10
12
1,60
2,80
4,10
4,65
4,64
4,36
3,45
2,60
1,84
Задача 2.28. При увеличении концентрации субстрата в реакции гидролиза
N-карбобензокси-L-триптофана,
катализируемого
карбоксипептидазой,
скорость ферментативной реакции проходит через максимум, затем
снижается и достигает постоянного уровня (табл.2.28). Определить значения
кинетических и равновесных параметров реакции. Условия опыта: рН 7,5; 5 0
С; 0,04 М фосфатный буфер; 0,5 М KCl.
Таблица 2.28
[S]10-3 М
v/[E]o, c-1
[S]10-3 М
v/[E]o, c-1
2,00
2,22
7,70
8,33
20,0
39,0
15,0
13,6
45
2,50
2,86
3,33
4,00
5,00
6,67
10,00
9,00
9,80
10,80
11,80
12,80
13,90
14,90
50,0
70,0
76,0
98,0
101,0
130,0
150,0
12,8
12,0
11,8
10,9
11,0
10,9
10,8
Раздел 3. Ферменты, не подчиняющиеся кинетике Михаэлиса-Ментен
Не все ферменты подчиняются кинетике Михаэлиса-Ментен. Для
некоторых из этих ферментов кривая Михаэлиса имеет сигмоидную, а не
гиперболическую форму. Обычно к этим ферментам относятся
аллостерические ферменты, отличающиеся от обычных ферментов по ряду
признаков:
1) имеют олигомерную структуру, т.е. обладают 4-й структурой и
состоят из субъединиц, объединенных в единое целое связями слабого
характера;
2) наряду с активными центрами имеют специальные регуляторные
(или аллостерические) центры. Активные и аллостерические центры
пространственно разобщены. К аллостерическим центрам могут
присоединяться низкомолекулярные соединения, называемы эффекторами
или модуляторами. В качестве эффекторов могут выступать промежуточные
метаболиты или конечные продукты метаболических путей;
4) молекула эффектора, связываясь в аллостерическом центре,
вызывает изменение конформации фермента. Это приводит в свою очередь к
изменению конформации активного центра, в результате активность
фермента увеличивается (активация) либо уменьшается (ингибирование).
Эффекторы обратимо взаимодействуют с аллостерическими центрами. Они
не обладают явным сходством с субстратами, а фермент проявляет
исключительно высокую специфичность к молекуле эффектора;
5) у аллостерических ферментов наблюдается отклонение зависимости
скорости ферментативной реакции (v) от концентрации субстрата (S) или
аллостерического эффектора (Э), а именно отклонение от простых
кинетических закономерностей типа гиперболического закона МихаэлисаМентен.
Термин аллостерический был предложен Ж. Мано и Ф. Жакобом в 1961
г. Они предположили, что взаимодействие эффектора с аллостерическим
центром вызывает в молекуле фермента конформационные изменения,
затрагивающие активный центр, в результате чего активность фермента
изменяется.
Не все ферменты в клетке являются аллостерическими, но многие
аллостерические
ферменты
являются
ключевыми
ферментами,
46
определяющими скорость лимитирующих стадий обменных процессов в
клетке.
Для аллостерических ферментов характерным свойством является
наличие кооперативных эффектов: присоединение первой молекулы
соответствующего лиганда (субстрата к активному центру или эффектора к
аллостерическому
центру)
сопровождается
конформационными
изменениями, которые изменяют его сродство к субстрату или эффектору.
Кооперативные эффекты подразделяют на гомотропные и
гетеротропные. Гомотропные эффекты, при которых взаимодействия с
лигандами могут быть кооперативными и антикооперативными,
наблюдаются для идентичных лигандов, например, для молекул субстрата (а
также для молекул кофермента или ингибитора). Гетеротропные эффекты,
при которых взаимодействия, также являющиеся либо кооперативными, либо
антикооперативными, наблюдаются для молекул различных лигандов.
Кооперативные эффекты, кроме того, подразделяют на положительные
и отрицательные (антикооперативные). В случае положительной
кооперативности присоединение первой молекулы лиганда вызывает
конформационные изменения в белковой молекулы, которые передаются и
облегчают присоединение последующих молекул лиганда (при этом
зависимость скорости реакции от концентрации лиганда является Sобразной) (рис. 3.1).
Рис. 3.1. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата
При антикооперативности присоединение первой молекулы лиганда
вызывает такие конформационные изменения в белке, которые затрудняют
присоединение последующих молекул лиганда к соответствующим центрам
(зависимость скорости реакции от концентрации лиганда является
гиперболической, но это не равнобочная гипербола Михаэлиса-Ментен) (рис.
2.5.1).
Такие различия легко увидеть, если линеаризовать зависимости
скорости реакции от концентрации лигандов для трех случаев:
положительной и отрицательной кооперативности и кинетики МихаэлисаМентен (рис. 3.2).
47
При построении графика в координатах двойных обратных величин Sобразная кривая преобразуется в кривую выпуклую к оси абсцисс. В
последние годы было показано, что отдельные ферменты обнаруживают
гиперболическую зависимость скорости от концентрации субстрата. Однако
форма гиперболы в этих случаях отличается от классической гиперболы
Михаэлиса-Ментен:
в
координатах
Лайнуивера-Берка
последняя
преобразуется не в прямую линию, а в кривую выпуклую к оси ординат
Рис. 3.2. Линеаризация кривых, приведенных на рис. 3.1
У аллостерических ферментов, так же как и у нерегуляторных
ферментов, наблюдается «насыщение» субстратом (рис. 3.3).
Рис. 3.3. Кривая с насыщением для аллостерического фермента
Хотя на сигмоидной кривой насыщения субстратом для
аллостерических ферментов можно найти точку, в которой скорость реакции
равна половине от максимальной скорости, эта величина не соответствует
величине Km, поскольку поведение аллостерических ферментов не
описывается гиперболической зависимостью, вытекающей и уравнения
Михаэлиса-Ментен.
48
Первым белком с олигомерной структурой, проявляющим
кооперативные эффекты при связывании кислорода, был гемоглобин.
Кооперативность у гемоглобина была установлена Бором задолго до
обнаружения подобных свойств у какого-либо фермента. Выявлению
кооперативных свойств гемоглобина при его функционировании помогло
сравнение с миоглобином, белком, не проявляющим кооперативных свойств
и служащим для запасания кислорода в мышцах.
Впервые кооперативные эффекты были описаны Хиллом при анализе
кривой насыщения гемоглобина кислородом, им же было предложено
уравнение для описания этих кооперативных взаимодействий.
Где, v – наблюдаемая скорость ферментативной реакции;
VMAX – максимальная скорость реакции при концентрации субстрата,
стремящейся к бесконечности;
К′– концентрация субстрата, при которой скорость равна половине от
максимальной. Поскольку К′ не соответствует величине Км в данном случае
вместо символа Км используют символы ([S]0,5, К0,5);
h – суммарное число связывающих центров в олигомерной молекуле
фермента или коэффициент Хилла, или коэффициент кооперативных
взаимодействий. Является мерой силы кооперативных взаимодействий при
связывании лиганда. Коэффициент Хилла должен быть целым числом, но
экспериментально определяемые величины часто не являются таковыми. В
этих случаях за число связывающих участков принимают следующее,
большее по величине целое число.
Например, экспериментально определенная величина h составляет 1,65.
Это говорит о наличии минимум двух связывающих сайтов и что сайты
проявляют уровень кооперативности выше среднего. Однако нельзя сказать,
что фермент имеет только два связывающих центра. У него может быть три
или 4 или более связывающих центров со слабо выраженной
кооперативностью. Поэтому величина два в этом примере говорит о
минимальном числе возможных связывающих центров.
3.1 Методы определения коэффициента Хилла
Существуют два метода определения коэффициента Хилла: метод,
предложенный самим Хиллом и метод, разработанный Кургановым Б.И. с
соавторами. В первом случае уравнение Хилла логарифмируется и
преобразуется, приобретая следующий вид
49
Это уравнение используют для построения графика, из которого можно
определить величину h. График строится в координатах lоgv/(VMAX – v)
против lg[S].
Пример линеаризованного графика Хилла приведен на рис. 3.4.
Степень сигмоидности на линейных участках позволяет выявить силу
кооперативности между центрами в олигомерном ферменте.
lg[v/(Vm-v)]
lg[S]0
Рис. 3.4. Линеаризованная сигмоидная зависимость
Определение коэффициента Хилла по логарифмической зависимости
требует знания Vmax. Однако не всегда эта величина известна.
Курганов Б.И. с соавт. предложили так называемый разностный метод
определения коэффициента Хилла. В этом случае строится график в
координатах 1/v от log [S] (рис. 3.5).
50
Рис. 3.5. Определение коэффициента Хилла «разностным» методом
Для нахождения коэффициента Хилла на кривой 1/v от log [S]
выбираются три точки с координатами {1/v′ ; log [S]′}, {1/v; log [S]} и {1/v′′;
log [S]′′}. Значения [S] для крайних точек отличаются отличаются от
значений [S] для средней точки на постоянный множитель, обозначаемый ϰ
(ϰ> 1): [S]′= [S]/ϰ и [S]′′=[S]ϰ.
Коэффициент Хилла рассчитывают далее по формуле:
h= log{(1/v′ - 1/v)/ (1/v - 1/v′′)}/ logχ
Суть этих преобразований сводится к следующему:
Разности обратных величин уже не содержа параметра Vmax , а
отношение разностей при определенном выборе значений [S ] ; [S]ʹ; [S]ʹʹ - не
содержит как параметра Vmax и [S]0,5.
Поэтому этот способ определения коэффициента Хилла получил
название разносного метода.
После нахождения параметра коэффициента Хилла, остальные два
параметра Vmax и [S]0,5 могут быть определены путем представления
1 1
в соответствии со
h
v [S ]
экспериментальных данных в координатах ;
следующим линейным соотношением (рис. 3.6).
S 0h,5 1
1
1
v Vmax Vmax S h
Рис. 3.6. Линеаризация уравнения Хилла с учетом величины
коэффициента Хилла в координатах Лайнуивера-Берка
51
Коэффициент Хилла является параметром уравнения Хилла и не имеет
физического смысла. Однако при достаточно сильных взаимодействиях
коэффициент Хилла близок n (число активных центров в молекуле
фермента). Таким образом, h ≤ n.
3.2. Определение коэффициента крутизны Кошланда
Оценить кооперативные взаимодействия в молекуле аллостерического
фермента возможно с помощью коэффициента крутизны – Rх,
предложенного Кошландом.
Rx
[ S ]0,9
,
[ S ]0,1
где [S]0,9 – концентрация субстрата, при которой достигается 0,9 от
VMAX; [S]0,1 – концентрация субстрата, при которой достигается 0,1 от VMAX.
Концентрации субстратов, при которых достигается 0,1 и 0,9 от
максимальной скорости реакции можно определить, построив график
зависимости скорости реакции от концентрации субстрата. Найдя по графику
максимальную скорость, рассчитываем 0,1VMAX и 0,9VMAX и, опустив
перпендикуляр на ось абсцисс, находим величины [S]0,1 и [S]0,9.
Для ферментов, подчиняющихся кинетике Михаэлиса-Ментен,
коэффициент крутизны равен 81. Ферменты, характеризующиеся
положительной кооперативностью, имеют коэффициент крутизны меньше
81, а отрицательной кооперативностью – больше 81.
Между коэффициентом Хилла и коэффициентом крутизны существует
определенная зависимость:
Rx = 811/h,
В случае, когда h=1, уравнение Хилла превращается в уравнение
Михаэлиса-Ментен.
Отношение [S]0,9/[S]0,1, индекс кооперативности, является обратной
мерой кооперативных взаимодействий. Другими словами, большая разность
в концентрации субстрата требуется для перехода от v=0,1Vmax до
v=0,9Vmax, большие величины [S]0,9/[S]0,1 свидетельствуют о слабой степени
кооперативности между центрами.
Так как коэффициент Хилла и индекс кооперативности (коэффициент
крутизны) для олигомерных ферментов связаны друг с другом, вместе они
позволяют измерить степень кооперативности между связывающими
центрами и минимальное число этих взаимодействий. В случае гомотропных
взаимодействий для молекул субстрата график зависимости v от [S] является
сигмоидной кривой.
52
Это отражает ситуацию, когда с ферментом связываются несколько
молекул субстрата, при этом связывание первой молекулы некоторым
образом ускоряет связывание второй молекулы, т.е. при связывании с
ферментом более чем одной молекулы
субстрата наблюдается
кооперативный эффект.
Такое поведение системы предполагает, что существует пороговая
концентрация субстрата, ниже которой изменение его концентрации
оказывает относительно небольшое влияние на скорость ферментативной
реакции, однако при превышении порога даже небольшие изменения
концентрации субстрата оказывают значительное влияние. Следовательно, в
пределах относительно узкой области концентрации субстрата скорость
ферментативной реакции изменяется очень резко, что весьма важно для
аллостерических ферментов, поскольку многие из них являются
регуляторными.
Для доказательства аллостерической природы положительной
кооперативности по субстрату можно использовать прием десенсибилизации
фермента. Для этого можно осуществить кратковременное его нагревание.
Например, десенсибилизацию аспартаткарбамоилтрансферазы Герхард и
Парди осуществляли в течение 4 мин при 60◦С, а UDP-глюкозо-4-эпимераза в
течение 2 мин при 41◦С. Десенсибилизация может быть вызвана другими
физическими воздействиями или химическим модифицированием фермента.
Шанжё одним из первых добился десенсибилизации треониндегидратазы из
E.coli по отношению к аллостерическому ингибитору – L-изолейцину при
помощи n-хлормеркурийбензоата. Для десенсибилизации аллостерических
ферментов (фосфофруктокиназы, глутаматдегидрогеназы и аспартаткиназы)
осуществляли облучением растворов ферментов рентгеновскими лучами.
После десенсибилизации ферменты не теряли каталитическую активность, но
утрачивали возможность регулироваться аллостерическими эффекторами.
3.3. Задачи к разделу 3.
Задача 3.1. Аспартат-карбамоилтрансфераза катализирует следующую
реакцию:
Аспартат + карбамоилфосфат → карбамоиласпартат + ортофосфат
и является первым ферментом при синтезе СТР. Активность фермента
определяли по освобождению неорганического фосфата через определенные
промежутки времени. Данные опытов, в которых определялась начальная
скорость реакции при различных концентрациях аспартата и фиксированной
концентрации карбамоилфосфата (3 мМ), приведены в табл. 3.1.
53
Таблица 3.1
Концентрация
аспартата,мМ
1,0
2,0
2,5
4,0
5,0
7,5
10,0
15,0
20,0
Скорость, мкмольфосфата/ч
нативный
фермент
фермент
после прогревания
при 600 в течение
4 мин
0,15
0,4
0,25
0,6
0,3
0,85
0,7
1,2
1,1
1,4
1,7
1,95
2,2
2,4
2,95
3,0
3,05
3,1
Определить кинетические параметры: коэффициент Хилла, коэффициент
крутизны, [S]0,5, Vmax для нативного и прогретого фермента.
Задача 3.2. Аспартат-карбамоилтрансфераза катализирует следующую
реакцию:
Аспартат + карбамоилфосфат → карбамоиласпартат + ортофосфат
и является первым ферментом при синтезе СТР. Активность фермента
определяли по освобождению неорганического фосфата через определенные
промежутки времени. Данные опытов, в которых определялась начальная
скорость реакции при различных концентрациях аспартата, фиксированной
концентрации карбамоилфосфата (3 мМ) и фиксированной концентрации
СТР (0,1 мМ) приведены в табл. 3.2.
Таблица 3.2
Концентрация
аспартата,мМ
1,0
2,0
2,5
4,0
5,0
7,5
10,0
15,0
20,0
Скорость, мкмольфосфата/ч
нативный
Нативный фермент
фермент
+ 0,1 мМ СТР
0,15
0,025
0,25
0,10
0,3
0,125
0,7
0,35
1,1
0,5
1,7
1,03
2,2
1,6
2,95
2,5
3,05
2,9
54
Определить кинетические параметры для нативного фермента и фермента в
присутствии СТР: коэффициент Хилла, коэффициент крутизны, Vmax, [S]0,5.
Задача 3.3. Аспартат-карбамоилтрансфераза катализирует следующую
реакцию:
Аспартат + карбамоилфосфат → карбамоиласпартат + ортофосфат
и является первым ферментом при синтезе СТР. Активность фермента
определяли по освобождению неорганического фосфата через определенные
промежутки времени. Данные опытов, в которых определялась начальная
скорость реакции при различных концентрациях аспартата, фиксированной
концентрации карбамоилфосфата (3 мМ) и фиксированной концентрации
СТР (0,1 мМ) приведены в табл. 3.3.
Таблица 3.3
Концентрация
аспартата,мМ
1,0
2,0
2,5
4,0
5,0
7,5
10,0
15,0
20,0
Скорость, мкмольфосфата/ч
нативный
прогретый фермент
фермент
+ 0,1 мМ СТР
0,15
0,25
0,3
0,7
1,1
1,7
2,2
2,95
3,05
0,4
0,6
0,85
1,3
1,4
2,0
2,4
2,95
3,1
Определить кинетические параметры нативного и прогретого фермента:
коэффициент Хилла, коэффициент крутизны, Vmax, [S]0,5.
Задача 3.4. Аспартат-карбамоилтрансфераза катализирует следующую
реакцию:
Аспартат + карбамоилфосфат → карбамоиласпартат + ортофосфат
и является первым ферментом при синтезе СТР. Активность фермента
определяли по освобождению неорганического фосфата через определенные
промежутки времени. Данные опытов, в которых определялась начальная
скорость реакции при различных концентрациях аспартата, фиксированной
концентрации карбамоилфосфата (3 мМ) и фиксированной концентрации
АТР (2мМ) приведены в табл. 3.4.
55
Таблица 3.4
Концентрация
аспартата,мМ
1,0
2,0
2,5
4,0
5,0
7,5
10,0
15,0
20,0
Скорость, мкмольфосфата/ч
нативный
нативный фермент
фермент
+ 2 мМ АТР
0,15
0,4
0,25
0,55
0,3
0,9
0,7
1,35
1,1
1,4
1,7
2,0
2,2
2,4
2,95
3,0
3,05
3,1
Определить кинетические параметры нативного фермента и фермента в
присутствии АТР: коэффициент Хилла, коэффициент крутизны, Vmax,
[S]0,5.
Задача 3.5. Исследовалось влияние малеата на активность аллостерического
фермента аспартат-карбамоилтрансферазы. В эксперименте использовался
как нативный, так и прогретый фермент. Результаты, полученные в
присутствии фиксированных концентраций аспартата и карьамоилфосфата (1
мМ и 3 мМ соответственно) и варьируемых концентраций малеата,
приведены в табл. 3.5а.
Таблица 3.5а
Концентрация
малеата, мМ
0
0,25
0,5
0,75
1,0
2,0
5,0
10,0
Скорость реакции,
мкмоль фосфата/ч
нативный
прогретый
фермент
фермент
(600С, 4 мин)
0,15
0,4
0,25
0,32
0,285
0,23
0,30
0,20
0,255
0,18
0,16
0,10
0,08
0,075
0,06
0,05
56
Механизм ингибирования прогретого фермента изучали, изменяя
концентрацию аспартата при двух фиксированных концентрациях малеата.
Использовали различные концентрации фермента. Полученные результаты
приведены в табл. 3.5б.
Таблица3.5б
Скорость реакции, мкмоль фосфата/ч
[Аспартат],
мМ
без малеата
1 мМ малеат
2 мМ малеат
5
8
10
20
25
40
100
0,77
0,95
1,05
1,25
1,33
1,43
1,54
0,43
0,61
0,69
0,95
1,05
1,25
1,43
0,28
0,44
0,51
0,77
0,87
1,05
1,33
Какие выводы о регуляции активности фермента можно сделать на
основании полученных данных?
Задача 3.6. Исследована кинетика действия глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
из азотфиксирующих бактерий Azotobacter beijerinckii.
Глюкозо-5-фосфат + NADP+ ↔ 6-фосфоглюконат + NADPH + H+
Изучено влияние АТР на активность фермента. Получены приведенные ниже
данные о зависимости начальной скорости реакции от концентрации
глюкозо-6-фосфата в отсутствие и в присутствии АТР (при трех различных
концентрациях); во всех опытах количество фермента (по белку) 0,75 мкг
(табл. 3.6).
Таблица 3.6
Начальная скорость восстановления NADP+,
нмоль/мин
[Глюкозо-6-Р],
мМ
концентрация АТР, мМ
57
0,375
0,500
0,625
0,750
0,875
1,000
1,250
1,500
1,750
2,000
2,250
2,500
0
1,25
0,625
0,3125
5,15
9,65
10,95
14,15
15,45
18,65
22,70
23,80
0,35
0,43
0,58
0,97
1,29
2,25
3,54
5,15
8,05
9,83
12,90
16,60
0,64
0,97
1,48
1,93
2,75
5,15
5,47
8,69
10,60
14,80
16,10
9,97
13,00
15,10
16,70
26,40
27,00
29,00
По данным табл. 3.6 построить график в координатах v ; [S] и определить по
нему Vmax. Для рассматриваемой системы Vmax = 29,5 нмоль/мин. Для
определения коэффициента h (коэффициента взаимодействия, коэффициента
Хилла) необходимо построить график Хилла.
Задача 3.7. Исследовалась кинетика глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в
гемолизатах клеток красной крови кроликов.
Раздел 4. Задачи к коллоквиумам и тестам
Задача 4.1. Фермент проявляет относительную специфичность. Определите,
исходя из величины Км тот субстрат, который будет подвеграться
каталитическому превращению с наибольшей скоростью при концентрации
субстрат а, равной : а) Км= 2*10-1М; б) Км= 2*10-3М;в) Км= 2*10-4М; г) Км=
2*10-6М.
Задача 4.2. При изучении кинетики гидролиза ацетилхолина,
катализируемого ацетилхолинэстеразой, было показано, что ферментативная
реакция ингибируется субстратом с константой диссоциации неактивного
тройного комплекса ЕS2, равной 3,2 10-2 М. Найти значение концентрации
субстрата, при которой скорость ферментативной реакции достигает
максимального значения в условиях эксперимента, если величина константы
Михаэлиса, найденная при использовании низких концентраций субстрата,
равна 2,6 х·10-4 М.
58
Задача 4.3. Фермент имеет константу Михаэлиса, равную 0,035 М. Скорость
реакции при концентрации субстрата, равной 0,110 моль/л, равна 1,15*10 -3
моль/(л*с). Найдите максимальную скорость этой реакции.
Задача 4.4. Ферментативная реакция (Км = 2,7*10-3 М) подавляется
конкурентным игибитором (КI = 3,1*10-5 М). Концентрация субстрата равна
3,6*10-4 моль/л. Сколько ингибитора потребуется для подавления реакции на
65%? Во сколько раз надо повысить концентрацию субстрата, чтобы
уменьшить степень ингибирования до 25%?
Задача 4.5. Проанализируйте уравнение Михаэлиса-Ментен и ответьте на
следующие вопросы:
а) При какой концентрации субстрата фермент, для которого максимальная
скорость превращения субстрата составляет 30 мкмолей/мин мг, а величина
КМ равна 0,005 М, будет работать со скоростью, равной 1/4 максимальной? б)
Определите, какую долю VMAX , будет составлять скорость реакции при
концентрациях субстрата, равных 1/2 КМ, 2КМ и 10Км.
Задача 4.6. Вирус иммунодефицита кодирует протеазу, которая необходима
для внедрения и созревания вируса. Протеаза катализирует гидролиз
субстрата (пентапептид) с начальной скоростью 0,0035 моль/с. Концентрация
пентапептида равна 0,045 М. Константа Михаэлиса фермента для данного
субстрата равна 0,075 М. Производное пентапептида, в котором пептидная
связь замещена на –СН2NH, не гидролизуется протеазой и является
ингибитором. В присутствии 2,5 мкМ ингибитора максимальная скорость
равнялась 0,0093 моль/с, а начальная скорость составила 0,0030 моль/с.
Определите тип ингибирования.
Задача 4.7. Вирус иммунодефицита кодирует протеазу, которая необходима
для внедрения и созревания вируса. Протеаза катализирует гидролиз
субстрата (пентапептид) с начальной скоростью 0,0035 моль/с. Концентрация
пентапептида равна 0,045 М. Константа Михаэлиса фермента для данного
субстрата равна 0,075 М. Определите VMAX фермента для пентапептида.
Задача 4.8. Гидролиз п-нитрофенилфосфата фосфатазой можно определить,
измеряя скорость образования продукта п-нитрофенола. Используя
стандартные условия (рН 7,0 и 250С) с суммарным объемом инкубационной
среды, равной 5 мл, которая содержала 1 мкмоль фосфатазы, были
определены Км и Vmax. Они были равны, соответственно, 2,0 мМ и 5
59
мМ/мин. Определите величину скорости реакции, когда 10 мкмоль пнитрофенилфосфата присутствуют в инкубационной пробе. Сходный
субстрат, о-нитрофенилфосфат имеет Км, равную 4 мМ при стандартных
условиях. К какому из субстратов, п-нитрофенилфосфату или онитрофенилфосфату фермент имеет большее сродство?
Задача 4.9. Каталитическое расщепление пептидной связи в маленьких
пептидах под действием фермента эластазы показало следующие результаты:
Субстрат
Км (М)
Число оборотов
моль S/с*моль фермента
26
РАРА-G
4,0
PAPA-A
1,5
37
PAPA-F
0,64
18
Определите пептид, который расщепляется наиболее быстро и
наиболее медленно, если все субстраты были взяты в концентрации 0,5 М.
Задача 4.10. Гидролиз п-нитрофенилфосфата фосфатазой можно определить,
измеряя скорость образования продукта п-нитрофенола. Используя
стандартные условия (рН 7,0 и 250С) с суммарным объемом инкубационной
среды, равной 5 мл, которая содержала 1 мкмоль фосфатазы, были
определены Км и Vmax. Они были равны, соответственно, 2,0 мМ и 5
мМ/мин. Определите величину скорости реакции, когда 10 мкмоль пнитрофенилфосфата присутствуют в инкубационной пробе. Сходный
субстрат, о-нитрофенилфосфат имеет Км, равную 4 мМ при стандартных
условиях. К какому из субстратов, п-нитрофенилфосфату или онитрофенилфосфату фермент имеет большее сродство?
Задача 4.11. Карбоангидраза эритроцитов, имеющая молекулярную массу
30000, - один из самых активных ферментов, известных в настоящее время.
Она катализирует обратимую реакцию гидратации СО2
Н2О + СО2 ↔
Н2СО3,
которая играет важную роль в транспорте СО2 из тканей в легкие.
Рассчитайте число оборотов карбоангидразы, если при оптимальных
условиях 10 мкг чистой карбоангидразы катализируют гидратацию 0,30 г
СО2 в 1 мин при 370С.
60
Задача 4.12. При изучении кинетики гидролиза ацетилхолина,
катализируемого ацетилхолинэстеразой, было показано, что ферментативная
реакция ингибируется субстратом с константой диссоциации неактивного
тройного комплекса ЕS2, равной 3,2 10-2 М. Найти значение концентрации
субстрата, при которой скорость ферментативной реакции достигает
максимального значения в условиях эксперимента, если величина константы
Михаэлиса, найденная при использовании низких концентраций субстрата,
равна 2,6 х·10-4 М.
Задача 4.13. После инкубации с п-хлормеркурибензоатом связывание
фермента с субстратом не изменилось по сравнению с необработанным
ферментом, но каталитическая активность фермента уменьшилась на 40%.
Какой вывод можно сделать из этого наблюдения.
Задача 4.14. Гидролиз ацетилхолина, катализируется ацетилхолинэстеразой,
число оборотов которой составляет 25000 с-1. Сколько времени потребуется
ферменту для расщепления одной молекулы ацетилхолина?
Задача 4.15. Фермент имеет константу Михаэлиса, равную 0,035 М.
Скорость реакции при концентрации субстрата, равной 0,110 моль/л, равна
1,15*10-3 моль/(л*с). Найдите максимальную скорость этой реакции.
Задача 4.16. Ферментативная реакция (Км = 2,7*10-3 М) подавляется
конкурентным игибитором (КI = 3,1*10-5 М). Концентрация субстрата равна
3,6*10-4 моль/л. Сколько ингибитора потребуется для подавления реакции на
65%? Во сколько раз надо повысить концентрацию субстрата, чтобы
уменьшить степень ингибирования до 25%?
Задача 4.17. Используя график для уравнения 1.3, изобразите завтсимость
скорости реакции от [S]. Используйте значения Vmax = 100 мкмоль с-1 и Км =
10 мкМ. Как сильно возрастет v0 при удвоении значения [S] от 0,2 до 0,4
мкМ? Чему равно v0 при [S] = 10 мкМ? Как увеличится v0 при увеличении [S]
от 100 до 200 мкМ? Обратите внимание на изменение вида графика при
двукратном увеличении или уменьшении значений Vmax или Км. Используя
уравнение лайнутвера-Берка постройте зависимость в координатах двойных
обратных величин для всех случаев перечисленных в вышеприведенных
заданиях.
61
Библиографический список
1. Варфоломеев С.Д. Химическая энзимология: Учебник. – М.:
Издательский центр «Академия», 2005. – 480 с.
2. Березин И.В., Клёсов А.А. Практический курс химической и
ферментативной кинетики. – М.: Изд-во МГУ, 1978. – 320 с.
3. Биохимия с упражнениями и задачами: Учебник / под ред. чл.-корр.
РАН, проф. Е.С. Северина. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. – 384 с.
4. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. В 3-х тт. – М.: Мир, 1982. – 1120 с.
5. Доис Э. Количественные проблемы биохимии. – М.: Мир, 1983. – 376
с.
6. Ершов Ю.А., Мушкамбаров Н.Н. Кинетика и термодинамика
биохимических и физиологических процессов.- М.: Медицина, 1990. – 208 с.
7. Келети Т. Основы ферментативной кинетики. – М.: Мир, 1990. – 348
c.
8. Керридж Д., Типтон К. Биохимическая логика. – М.: Мир, 1974. 327с.
9. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. – М.: Мир,
1979. – 277 с.
10. Курганов Б.И. Аллостерические ферменты. – М.: Наука, 1978. - 198
с.
11. Нельсон Д., Кокс М. Основы биохимии Ленинджера: в 3 т. Т.1 ; пер.
с англ. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011. – 604 с.
12. Price N.C., Stevens L. Fundamental of Enzymology. The Cell and
Molecular Biology of Catalytic Proteins. Third Edition. – Oxford, University
Press, 2003. – 478 p.
Электронные ресурсы
1. www.virginia.edu.
2. www.dehydrogenase.com.
3. www.ncbi.nlm.nih.gav.
4. www.molbiol.ru.
5. www. high.stanford.edu.
6. www.wikipedia.org.
62
Оглавление
Введение
4
Раздел 1. Уравнение Михаэлиса-Ментен
4
1.1.Характеристика кинетических констант
8
1.2.Методы определения Км и Vmax
8
1.3.Задачи к разделу 1.
11
Раздел 2. Ингибиторы ферментов
22
2.1.Конкурентное ингибирование
24
2.2.Неконкурентное ингибирование
25
2.3.Бесконкурентное ингибирование
26
2.4.Смешанный тип ингибирования
27
2.5.Методы определения константы ингибирования
29
2.6.Субстратное ингибирование
30
2.7. Задачи к разделу 2
31
Раздел 3. Ферменты, не подчиняющиеся кинетике МихаэлисаМентен
46
3.1. Уравнение Хилла
49
3.2. Методы определения коэффициента Хилла
52
3.3.Определение коэффициента крутизны Кошланда
53
3.4. Задачи к разделу 3
53
Раздел 4. Задачи к коллоквиумам и тестам
58
Библиографический список
62
63
Учебное издание
Подготовлено к изданию РИО БИК СФУ
Подписано в печать
2012 г. Формат 60х84/16
Бумага офсетная. Печать плоская
Усл. печ. л.
Уч.-изд. л.
Тираж экз. Заказ (дает РИО)
Редакционно-издательский отдел
Библиотечно-издательского комплекса
Сибирского федерального университета
660041, г. Красноярск, пр. Свободный, 79
Тел/факс (391) 206-21-49. E-mail rio@sfu-kras.ru
http://rio.sfu-kras.ru
Отпечатано Полиграфическим центром
Библиотечно-издательского комплекса
Сибирского федерального университета
660041, г. Красноярск, пр. Свободный, 82а
Тел. 206-26-58, 206-26-49
64