роль дендритных клеток мыши в ответе на т
advertisement
На правах рукописи ХОЧЕНКОВ Дмитрий Александрович РОЛЬ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК МЫШИ В ОТВЕТЕ НА Т-НЕЗАВИСИМЫЕ АНТИГЕНЫ 2-ГО ТИПА 14.03.09 – «Клиническая иммунология, аллергология» Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2012 Работа выполнена в ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук. Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор Сидорова Екатерина Владимировна Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук Ахматова Нэлли Кимовна Доктор биологических наук, профессор, академик РАЕН Ярилин Александр Александрович Ведущая организация: ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития РФ Защита диссертации состоится 15 марта 2012 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 в ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН. Автореферат разослан «____» февраля 2012 г. Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Ирина Владимировна Яковлева 2 АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ Дендритные клетки (ДК) – семейство лейкоцитов костномозгового происхождения. Особенно много их в местах взаимодействия с окружающей средой (кожа и слизистые оболочки). ДК являются основными антигенпрезентирующими клетками [Banchereau, 2000]. Они наделены способностью индуцировать первичный иммунный ответ, участвуют в формировании иммунологической памяти и в поддержании толерантности. Помимо презентации клеткам антигенов (Аг), «встроенных» в МНС, активированные ДК продуцируют цитокины, стимулирующие наивные Т лимфоциты [Villadangos, 2005]. Большая часть касающихся ДК данных получена при изучении их роли в ответе на Т-зависимые антигены (ТЗ Аг). Известно, однако, что многие Аг относятся к Т-независимым (ТН Аг), ответ на которые осуществляется без участия Т хелперов [Mond, 1995]. Это связано с тем, что ТН Аг неспособны встраиваться в МНС и презентироваться таким способом Т лимфоцитам [Defrance, 2011]. В число ТН Аг входит большинство бактериальных поли- и липополисахаридов, а также синтетические полимеры с повторяющимися Агэпитопами (например, поливинилпирролидон с мол. массой 350 кДа, полимеры D-аминокислот) [Bachmann, 1993]. ТН Аг подразделяются на ТН-1 Аг, обладающие митогенной активностью и являющиеся поликлональными активаторами В клеток, и ТН-2 Аг. ТН-2 Аг митогенами не являются. Иммуногенность ТН-2 Аг относительно невелика [Mond, 1995]. Основными продуцентами антител (Ат) к ТН Аг являются В-1 лимфоциты и клетки маргинальной зоны селезенки (MZ-B клетки). Эти субпопуляции обладают рядом характерных особенностей, отличающих их от «обычных» или конвенциональных В-2 клеток [Сидорова, 2006]. Ответ В-1 и MZ-B клеток на проникшие в организм патогены не требует формирования зародышевых центров и клонов Аг-специфичных Т и В лимфоцитов, поэтому он начинается практически сразу и приводит к образованию IgM Ат [Baumgarth, 2011]. Более специфичный и мощный 3 адаптивный иммунный ответ, обусловливаемый В-2 клетками, развивается позднее, приводя как к образованию IgG Ат, так и к появлению клеток памяти. Таким образом, В-1 и MZ-B лимфоциты обеспечивают первую линию защиты организма от патогенов и относятся к клеткам, соединяющим врожденный и адаптивный иммунитет [Berland, 2002]. Значительную роль в иммунном ответе играют клеточные взаимодействия. Так, ДК необходимы для активации наивных Т клеток и индукции ответа на ТЗ Аг [Banchereau, 2000]. Клеточные и молекулярные механизмы иммунного ответа на ТЗ Аг хорошо изучены. Механизмы «запуска» В клеток ТН-2 Аг исследованы значительно хуже. Известно, что для ТН-2 ответа необходимо наличие повторяющихся Аг-детерминант, высокий молекулярный вес, «жесткость» структуры и т.д. [Mond, 1995]. В то же время неясно, какие механизмы обеспечивают пролиферацию и дифференцировку В-1 клеток под влиянием ТН-2 Аг; не исследованы клеточные взаимодействия и факторы, участвующие в процессе; неизвестна роль ДК в ответе и т.д. Ответ на все эти вопросы существенен для развития представлений об иммунитете. Вместе с тем до сих пор этот вопрос даже не ставился. Выяснение роли ДК в ответе на ТН-2 Аг может представлять определенный интерес и с практической точки зрения. Не исключено, что использование ДК позволит увеличить иммуногенность бактерильных ТН-2 Аг и найдет применение при создании «дендритных вакцин». Все это и определяет актуальность настоящей работы. ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ Целью настоящего исследования является изучение роли ДК в иммунном ответе мышей на Т-независимые антигены 2 типа. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Получить наивные ДК из костномозговых предшественников; Синтезировать флуоресцентный конъюгат (1→3) декстрана; Отработать нагрузку полученных ДК ТН Аг 1-го и 2-го типов; 4 Охарактеризовать фенотипически наивные ДК, и ДК нагруженные ТН-2 Аг; Получить и охарактеризовать субпопуляции В-1 клеток перитонеальной полости и В-2 клеток селезенки мышей; Отработать условия совместного культивирования ДК со спленоцитами, В-1 и В-2 клетками; Определить число антитело- и иммуноглобулин-образующих клеток в культурах спленоцитов, В-1 и В-2 клеток при инкубации их с ДК, нагруженными ТН-1 и ТН-2 антигенами. НАУЧНАЯ НОВИЗНА Впервые показано прямое связывание ТН-2 Аг наивными ДК, выращенными из костномозговых предшественников, Впервые исследовано взаимодействие ДК, нагруженных и не нагруженных ТН-2 Аг, с В-1 и В-2 лимфоцитами мыши в системе in vitro, Впервые продемонстрирована иммуногенность ТН-2 Аг, связанных с ДК, и установлено, что она выше таковой самих Аг, Впервые показано, что ТН-2 Аг, связанные с ДК, индуцируют как появление антитело-образующих клеток, так и увеличение числа клеток, продуцирующих поликлональные иммуноглобулины. При этом поликлональная активация ниже, чем при ответе на нативные ТН-2 Аг, Впервые показано, что xid-мутация не влияет на способность ДК, презентировать ТН-2 Аг, и индуцировать иммунный ответ в системе in vitro, Впервые установлено, что в образовании антитело- и иммуноглобулинпродуцентов, индуцированных ТН-2 Аг, связанными с ДК, существенную роль играют контактные взаимодействия между клетками, Впервые показано, что основными клетками, отвечающими на ТН-2 Аг, связанные с ДК, являются В-1 лимфоциты. 5 НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ Настоящая работа относится к числу фундаментальных исследований. Использован новый подход в изучении механизмов иммунного ответа на ТН-2 Аг – выяснение в этом процессе роли ДК. Данные об особенностях активации ДК полисахаридными ТН-2 Аг, входящими в состав ряда микроорганизмов, имеют значение для выяснения механизмов взаимодействия патогенов с иммунной системой хозяина. Выявление влияния ДК на функциональную активность В-1 и В-2 клеток и роли в этом процессе контактных взаимодействий расширяют наши представления о взаимодействиях лимфоидных и миелоидных клеток. Выявленное повышение иммуногенности полисахаридных Аг при связывании их с ДК, открывает перспективы при разработке ДК-вакцин. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ 1. ТН-2 Аг ((1→3) декстран, полисахарид S3 и поливинилпирролидон 360 кДа), связанные с ДК, индуцируют иммунный ответ в культуре спленоцитов. Для индукции ответа на ТН-2 Аг, связанные с ДК, требуется непосредственный контакт В лимфоцитов и ДК. 2. Поликлональная активация В лимфоцитов, индуцированная ТН-2 Аг связанными с ДК, ниже таковой при ответе на нативные ТН-2 Аг. 3. ДК, полученные из костномозговых предшественников xid-мышей под действием GM-CSF, по исследованным параметрам не отличаются от ДК, выделенных из костного мозга нормальный мышей. 4. Основными клетками, отвечающими на ТН-2 Аг, связанные с ДК, являются В-1 клетки. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Материалы диссертации обсуждены на конференции молодых учёных НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (Москва, 2009), международном симпозиуме «B Cells and Protection: Back to basics» (Сан 6 Фелиу-де-Гишольс, Испания, 2010), конференции FOCIS (Бостон, США, 2010), 4-й международной конференции «В клетки и аутоиммунитет» (Осака, Япония, 2010). По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 4 в изданиях, рекомендованных ВАК. Апробация диссертации состоялась 7 декабря 2011 г. на научной конференции отдела иммунологии ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН. ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Материалы диссертации изложены на 111 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов и списка литературы. Работа иллюстрирована 2 таблицами и 17 рисунками. Библиография включает 122 отечественных и зарубежных источников. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Животные. В опытах использовали самок мышей линии СВА весом 16– 18 г, полученных из НЦ биомедицинских технологий РАМН, филиал “Андреевка”. предоставлены Мыши линии CBA/N сотрудниками (самки 16–18 лаборатории г) были любезно экспериментальной иммуногенетики ЦНИИ туберкулеза РАМН. Антигены. В качестве ТН-2 Аг использовали: (1→3) декстран (Декс) из Leuconostoc mesenteroides, любезно предоставленный д.м.н. М.Е. Преображенской (НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН); полисахарид Streptococcus pneumoniae type 3 (S3), любезно предоставленный проф. Бейкером (США), и поливинилпирролидон с молекулярной массой 10 и 360 кДа – ПВП-10 и ПВП-360, соответственно (“Sigma”, США). В качестве ТН1 Аг использовали липополисахарид из Escherichia coli (“Sigma”, США). 7 Флуоресцентный конъюгат Декс с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) получали по ранее описанной методике [de Belder, 1973] с незначительными изменениями. Получение дендритных клеток. ДК выделяли по методу Lutz M.B. с незначительными модификациями [Lutz M.B., 1999]. Клетки костного мозга мышей культивировали в чашках Петри для суспензионных культур (“Corning”, США), в течение 10 сут в полной среде RPMI-1640, содержащей 10% ЭТС и GM-CSF 25 мкг/мл (“Biosource”, США). Исходная концентрация клеток при внесении в культуру составляла 250 × 103 клеток/мл. На 3-й день культивирования в чашки добавляли равное количество среды. В дальнейшем каждые 2 дня заменяли 50% среды. На 10 день клетки собирали, осаждали и подсчитывали количество живых и мертвых клеток в камере Горяева, используя 0,1% раствор трипанового синего (“Gibco”, США) в 0,9% растворе NaCl (“Serva”, Германия). Полученные ДК использовались в дальнейших экспериментах, в том числе для нагрузки Аг. Нагрузка ДК ТН-2 Аг. Для нагрузки ТН-2 Аг наивные ДК инкубировали с Аг в концентрации 100 мкг/106 ДК в CO2-инкубаторе в течение 24 ч при 37C и 5% CO2. Для получения неспецифически активированных ДК клетки инкубировали с ЛПС E. сoli в концентрации 2 мкг/106 ДК в течение 24 час. Получение суспензии спленоцитов. Моноклеточную суспензию спленоцитов получали, гомогенизируя селезенку в 5 мл среды RPMI 1640. Клетки осаждали центрифугированием при +4°С, на 1500 об/мин в течение 10 мин. Осадок ресуспендировали и удаляли эритроциты гипотоническим шоком. После лизиса эритроцитов спленоциты осаждали и дважды отмывали средой RPMI-1640. Подсчет живых и мертвых клеток проводили в камере Горяева, используя 0,1% раствор трипанового синего в 0,9% растворе NaCl. Получение В-1 и В-2 клеток мыши. В-1 клетки выделяли из брюшной полости мышей, а В-2 клетки – из селезенки. Для получения перитонеальных В-1 клеток использовали метод позитивной иммуноселекции с помощью 8 магнитных бус фирмы Miltenyi Biotec (“Miltenyi”, США), покрытых антителами крысы к CD19 мыши. Перитонеальные клетки получали, вымывая содержимое брюшной полости 7 мл ФСБ с 0,5% БСА (“Serva”, Германия) и 2 мМ ЭДТА (“Serva”, Германия). Клетки инкубировали с магнитными бусами, покрытыми крысиными Ат к CD19 мыши (15 мин при +4ºС). Перитонеальные В лимфоциты (смесь В-1 и В-2 клеток) выделяли на MACS® колонке. В-2 популяцию отделяли последовательно инкубируя перитонеальные В-клетки вначале с биотинилированными Ат к CD23 мыши (20 мин при +4ºС), а затем со стрептавидиновыми магнитными бусами (“Dynal”, Дания) (30 мин при +4ºС при постоянном перемешивании). В результате такой обработки получали В-1 лимфоциты. В-2 лимфоциты выделяли из суспензии спленоцитов при помощи магнитных бус, покрытых Ат к CD19. После этого, последовательно инкубируя полученную В клеточную популяцию с биотинилированными Ат к СD5 и CD43 мыши (20 мин при +4оС) и стрептавидиновыми магнитными бусами (30 мин при +4оС), удаляли из суспензии В-1 лимфоциты. Культивирование клеток in vitro. Для определения иммуногенной активности ТН-2 Аг, связанных с ДК, в лунки 96-луночных плоскодонных культуральных планшетов (“Nunc”, Дания) вносили по 10 105 спленоцитов и 2 105 ДК (соотношение 5 : 1) и культивировали клетки при +37°С, 5% CO2 в течение 4 сут в полной среде RPMI-1640, содержащей 10% ЭТС. По окончании инкубации клетки собирали и дважды отмывали средой RPMI 1640 с 2% ЭТС. В полученных суспензиях определяли число антитело- и иммуноглобулинобразующих клеток (АОК и ИГОК, соответственно) методом клеточного иммуноферментного анализа (ELISPOT). В качестве контроля использовали культуры, содержащие только спленоциты, ненагруженные ДК и спленоциты. 9 спленоциты и ТН-2 Аг, При изучении клеточных взаимодействий аналогичным образом культивировали ДК с В-1 клетками перитонеальной полости и В-2 клетками селезенки. Для раздельного культивирования ДК со спленоцитами использовали поликарбонатные мембранные вставки Millicell (“Millipore”, США) и 24луночные плоскодонные планшеты (“Nunc”, Дания). В лунки 24-луночного планшета вносили по 60 105 спленоцитов в объеме 1900 мкл полной среды RPMI-1640, а в мембранные вставки – 12 105 ДК в объеме 600 мкл полной среды. Вставки помещали в лунки планшета и культивировали смесь клеток в полной среде при +37°С, 5% CO2 в CO2-инкубаторе в течение 4 суток. Определение числа АОК и ИГОК с помощью ELISPOT. Количество антитело-образующих клеток (АОК) и иммуноглобулин-образующих клеток (ИГОК) определяли с использованием нитроцеллюлозных планшетов (“Millipore”, США), которые сенсибилизировали ТН-2 Аг (для выявления АОК) в концентрации 100 мкг/мл или козьими Ат к иммуноглобулинам (IgA, IgM, IgG) мыши (“Caltag”, США) (для выявления ИГОК) в концентрации 10 мкг/мл по 100 мкл в течение 18 часов. Сенсибилизацию Декс и S3 проводили в цитратно-фосфатном буфере при +20°С. Сенсибилизацию ПВП-10, ПВП-360 и козьими Ат проводили в карбонат-бикарбонатном буфере при +4°С. После сенсибилизации планшеты отмывали ФСБ. Свободные сайты связывания, блокировали 1% раствором БСА в ФСБ. Клетки (105 для выявления АОК и 104 – для ИГОК) культивировали в среде RPMI-1640 с 2% ЭТС, 24 ч. По окончании инкубации клетки удаляли, нитроцеллюлозные фильтры отмывали и последовательно добавляли усиливающую кроличью антисыворотку к μ-цепям IgM мыши, пероксидазный конъюгат Ат к IgG кролика и субстратный буфер, содержащий 1,4-хлорнафтол, этанол, трис-буферный раствор и H2O2. Число окрашенных зон (ИГОК и АОК) подсчитывали на фильтрах под микроскопом и пересчитывали на 106 клеток. 10 Фенотипирование клеток при помощи проточной цитометрии. Фенотип клеток определяли методом проточной цитометрии после окрашивания клеток флуоресцентными конъгатами Ат к поверхностным маркерам. В опытах были использованы Ат к поверхностным маркерам: ФИТЦ-I-Ak и PE-CD11c (“BD Pharmingen”, США), PE-CD80 и PE-CD86 (“Caltag”, США) – для ДК; ФИТЦ-CD5, ФИТЦ-CD3, PE-CD19, ФИТЦ-CD23 (“BD Pharmingen”, США), ФИТЦ-F4/80 (“Caltag”, США) – для В-1 и В-2 клеток. Анализ фиксированных окрашенных клеток проводили на проточном цитометре Beckman Coulter EPICS XL. Результаты обрабатывали с помощью программы SYSTEM II (“Beckman Coulter”, США) и FCS Express 3.0 (“de Novo software ”, США). Статистическая обработка результатов экспериментов. Результаты экспериментов представлены в виде среднего арифметического и его стандартного отклонения (М ± s). Проверка нормальности распределения производилась при помощи метода Колмогорова-Смирнова. Достоверность различий результатов опытов по совместному культивированию различных клеток исследовали при помощи дисперсионного анализа. Множественное сравнение средних проводили при помощи критерия Даннета. Различия рассматривались как значимые при p<0,001. Статистическая обработка проводилась при помощи программы Graph Pad Prism v.5.0 (Graph Pad Software Inc, США). РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ Нагрузка ДК ФИТЦ-конъюгатом Декс. Для выявления прямого взаимодействия ТН-2 Аг с ДК использовали культуру ДК на 10 день культивирования. К ДК добавляли ФИТЦ–Декс в концентрациях 15, 25, 50, 75, 100 и 125 мкг/мл (на 1 млн ДК). Культивирование ДК с ФИТЦ–Декс производили в течение 24 ч при +4оС. Взаимодействие ФИТЦ–Декс c ДК 11 оценивали по количеству ФИТЦ-позитивных клеток методом проточной цитометрии. Результаты приведены на рис.1. Как и следовало ожидать, с увеличением концентрации внесенного в культуру конъюгата, пропорционально увеличивалось и количество ФИТЦпозитивных клеток, т.е. ДК, связавших Аг. При концентрации конъюгата 75– 100 мкг/мл увеличение числа ДК, связавших конъюгат, выходило на стационар ный уровень, достигая максимума при 100 мкг/мл, поэтому в дальнейших опытах было решено использовать ТН-2 Аг в концентрации 100 мкг/млн. Рис.1. Зависимость количества ФИТЦ+-ДК от концентрации ФИТЦ-Декс Активация ДК ТН-2 Аг. Для определения иммуногенных свойств ТН-2 Аг ДК нагружали Декс, S3 и ПВП-350 в концентрации 100 мкг/млн ДК. Показано, что если исходно культуры ДК содержали 96, 84, 13 и 46% клеток (рис.2А), позитивных по MHC-II, CD11c, CD80 и CD86, соответственно, то после добавления Декс количество позитивных по этим маркерам клеток составило 93, 82, 22 и 96% (рис.2Б). Экспрессия маркеров MHC-II и CD11c под влиянием Декс не менялась. Очевидно, что характерным маркером активации ДК в опытах с Декс является CD86, поскольку наиболее значительные изменения при нагрузке клеток ТН-2 Аг наблюдаются именно в увеличении числа CD86+ ДК. 12 13 Рис.2. Влияние разных ТН-2 Аг на созревание ДК. (По оси ординат – количество клеток, по оси абсцисс – интенсивность флуоресценции.Темный контур – изотипический контроль, светлый контур – экспрессия характеристических маркеров) В опытах с нагрузкой ДК S3 количество позитивных по MHC-II, CD11c, CD80 и CD86 клеток составило 95, 83, 62 и 97% (рис.2В). Следует отметить, что в отличие от Декс, S3 вызывает более сильную активацию ДК, что выражается в значительном увеличении экспрессии не только CD86, но и CD80. Увеличение числа CD80- и CD86-позитивных клеток более чем в 2 раза свидетельствует об активации ДК. Активация ДК при нагрузке ПВП-360 была менее значительной; число CD80- и CD86-позитивных клеток не превышало 20% и 57% соответственно (рис.2Г). Таким образом, активация ДК при нагрузке ПВП-360 была значительно ниже, чем под действием микробных полисахаридов. Установлено также, что чем сильнее активированы клетки, тем больше снижена экспрессия F4/80 по сравнению с таковой на ненагруженных ДК. Так, в норме в ДК выявляется около 83% F4/80+ клеток, а при нагрузке ДК Декс и S3 количество F4/80+ клеток составляет 71% и 63%, соответственно. ПВП-360, стимулирует ДК слабее, и количество F4/80+ клеток оказывается сравнимо с таковым в норме – 80%. Индукция иммунного ответа in vitro Декс и S3, связанными с ДК. Для выявления иммуногенных свойств ТН-2 Аг, связанных с ДК, клетки, нагруженные Декс в концентрации 100 мкг/млн и 125 мкг/млн культивировали с нормальными спленоцитами мышей в соотношении 1 : 5 в течение 4 сут в полной питательной среде. Контролем служили культуры, содержащие наивные ДК, спленоциты и Декс, наивные ДК и спленоциты, а также только спленоциты. Иммуногенные свойства ТН-2 Аг, связанных с ДК выявляли по количеству АОК (специфическая стимуляция) и ИГОК (неспецифический поликлональный ответ) в культурах спленоцитов (рис.3). Пик ответа на Декс при внесении в культуру спленоцитов, нагруженных им ДК, достигается на 4-е сутки культивирования. При этом достоверно увеличивается как число АОК – в 2,5 раза (с 121 ± 12 до 310 ± 21 на 106 спленоцитов), так и общее число ИГОК (~на 40%). Важно, что повышение 14 Рис.3. Индукция образования АОК (А) и ИГОК (Б) спленоцитами, под действием Декс, связанного с ДК. Достоверность различий между контрольной и экспериментальными группами: р < 0,001 15 * * * Рис.4. Индукция образования АОК (А) и ИГОК (Б) спленоцитами, под действием S3, связанного с ДК. Достоверность различий между контрольной и экспериментальными группами: р < 0,001; (Б) * р < 0,001 16 концентрации Декс при нагрузке ДК до 125 мкг/млн, не влечет существенного увеличения числа АОК (330 ± 8 на 106 спленоцитов). Это может быть связано с ограниченным количеством В клеток, способных к активации или предельной способностью В клеток к активации. Иммунный ответ специфичен: ДК, нагруженные Декс, ответа на другие ТН-2 Аг (S3 и ПВП-360) не вызывают. Интересно, что иммунный ответ на Декс обеспечивают только предварительно нагруженные им ДК. Простое внесение в культуру спленоцитов наивных ДК увеличивает ответ не более чем на 34% (162 ± 10 на 106 спленоцитов). Нативный Декс вызывает достоверное двукратное увеличение числа АОК (227 ± 17 на 106 спленоцитов). Это означает, что иммуногенность ТН-2 Аг, связавшихся с ДК, выше, чем иммуногенность только ДК или нативных ТН-2 Аг. Поликлональная активация В-клеток при этом относительно невелика – число ИГОК, значительную часть которых, очевидно, составляют АОК, возрастает не более чем на 40% (с 5126 ± 389 в норме до 7175 ± 770 на 106 спленоцитов). Это отличает ответ спленоцитов на Декс-ДК от ответа на нативный Декс (9960 ± 1070 на 106 спленоцитов). Ранее было показано, что иммунизация ТН-2 Аг индуцирует не только появление АОК, но и значительно повышает число ИГОК, т.е. приводит к поликлональной стимуляции Влимфоцитов [Kato, 2000]. В настоящих опытах также показано, что нативный Декс вызывает почти двукратное увеличение числа ИГОК. По-видимому, механизм “запуска” В-лимфоцитов ДК, связавшими Декс, более специфичен и эффективен, чем активация В-клеток только нативным ТН-2 Аг. Иммуногенная активность разных ТН-2 Аг, связавшихся с ДК, неодинакова и может определяться химической природой Аг. Так, S3-ДК индуцируют появление АОК, число которых по сравнению с нормой достоверно возрастает примерно в 2,7 раза (с 73 ± 10 до 196 ± 9 на 106 спленоцитов) (Рис.4). 17 S3-ДК, индуцировали также поликлональный ответ – прирост числа ИГОК составил 40% (9140 ± 1284 против 6440 ± 512 на 106 спленоцитов в норме). Установлено, что индукция иммунного ответа ТН-2 Аг, связанными с ДК, требует непосредственного контакта с В-клетками. Разделение ДК и В-клеток полупроницаемой мембраной приводит к снижению числа АОК (112 ± 20 на 106 спленоцитов) и ИГОК (6514 ± 388 на 106 спленоцитов) в культурах, по сравнению с числом АОК и ИГОК при непосредственном взаимодействии ТН-2 Аг, связанных с ДК и спленоцитов. Следовательно, в индукции иммунного ответа на ТН-2 Аг, связанные с ДК принимают участие не только растворимые стимулирующие факторы (цитокины), но и контактные взаимодействия (через клеточные рецепторы). Индукция иммунного ответа in vitro на ПВП-360, связанный с дендритными клетками. Несмотря на то, что ПВП слабо активирует ДК, проверили, не повысится ли иммуногенность ПВП-360 при связывании его с ДК. Результаты, полученные при совместном культивировании ПВП-360–ДК со спленоцитами, представлены на рис.5. ПВП-360, связанный с ДК, вызывал образование АОК; их количество возрастало примерно в 2 раза по сравнению со спленоцитами (451 ± 22 против 230 ± 16 на 106 спленоцитов) и было сходно с таковым при прямой стимуляции спленоцитов ПВП-360 (432 ± 21 на 106 спленоцитов) (Рис.5А). Число ИГОК при этом возрастало на 60% по сравнению с числом ИГОК у чистых спленоцитов (6672 ± 798 против 4200 ± 275 на 106 спленоцитов). Разделение спленоцитов и ДК, полупроницаемой мембраной снижало образование АОК, как и в ранее описанных опытах (Рис.5). Как и в предыдущих опытах, ПВП-360, связанный с ДК, индуцировал меньший поликлональный ответ, чем нативный ПВП-360. Одной из причин более низкого иммунного ответа на ПВП-360, связанный с ДК, по сравнению с таковым на полисахариды, связанные с ДК, 18 может являться отсутствие на ДК специфических рецепторов к ПВП-360. Как известно, на ДК имеется ряд рецепторов к полисахаридам, представленных семейством лектинов С-типа, маннозным рецептором [Tzianabos, 2001, Zamze, 2002]. Захват Аг, посредством рецепторов, происходит более эффективно по сравнению с неспецифическим эндоцитозом. Возможно, в случаях с полисахаридными ТН-2 Аг захват Аг происходит не только посредством неспецифического эндоцитоза, но и с помощью рецепторов. Рис.5. Индукция образования АОК (А) и ИГОК (Б) ПВП-360, связанным с ДК. Достоверность различий между контрольной и экспериментальными группами: р < 0,001 19 Сравнение иммунного ответа in vitro на ПВП-10 и ПВП-360, связанные с дендритными клетками. ТН-2 Аг обычно имеют очень большой молекулярный вес, более 100 кДа [Mond, 1995]. Молекулы меньшего размера значительно менее иммуногены. Известно, однако, что ДК могут увеличивать иммуногенность небольших полимерных молекул. Мы сравнили иммуногенность ДК, нагруженных ПВП-360 и ПВП-10 (мол. вес 360 кДа и 10 кДа). Спленоциты, культивированные со свободными Аг, использовались в качестве контроля. Полученные результаты, выраженные в виде прироста числа АОК над их количеством в норме, представлены на рис.6. % Рис.6. Относительный прирост числа АОК, индуцированный нативными ПВП-10 и ПВП-360, а также ПВП-10 и ПВП-360, связанными с ДК, Число АОК нормальных спленоцитов принято за 100% Внесение в культуру спленоцитов ПВП-10 увеличивало число АОК по сравнению с АОК спленоцитов не более, чем на 40%, в то время как при иммунизации ПВП-360 это увеличение было в 1,8 раза. В то же время при культивировании спленоцитов с ПВП-10, связанным с ДК, увеличение числа АОК оказалось, таким же, как при ПВП-360, связанным с ДК, т.е. также двукратным. Это свидетельствует о том, что связывание с ДК может увеличивать иммуногенность низкомолекулярного процесса пока неясен. 20 Аг. Механизм этого Активация ДК при совместной нагрузке ТН-2 Аг и ЛПС. Известно, что ЛПС является классическим неспецифическим активатором ДК, поэтому важно, было выяснить как влияет на экспрессию характеристических маркеров одновременное связывание ДК ТН-2 Аг (S3, ПВП-360) и ЛПС. Для этого ДК одновременно нагружали ТН-2 Аг в концентрации 100 мкг/млн и ЛПС E.coli в концентрации 2 мкг/млн (оптимальная концентрация установленная ранее). Полученные результаты представлены в табл.1. Согласно полученным данным, ЛПС вызывает сильную активацию ДК. Это выражается в значительном увеличении экспрессии костимулирующих молекул CD80 (67% против 13% в норме) и CD86 (94% против 43% в норме). ЛПС также увеличивает экспрессию MHC-II (среднее геометрическое флуоресценции увеличивается более чем в 2 раза, число MHC-II+ клеток >95% во всех образцах). Табл.1. Экспрессия поверхностных маркеров ДК, при нагрузке ТН-2 Аг и ЛПС MHC-II CD11c CD80 CD86 ДК (ненагруженные) 96% 82% 13% 43% ДК (ЛПС) 97% 78% 67% 94% ДК (ЛПС + S3) 96% 81% 77% 95% ДК (ЛПС + ПВП-360) 97% 78% 68% 94% Одновременная нагрузка ДК ЛПС и S3 увеличивала экспрессию маркеров по сравнению с ненагруженными ДК еще больше: экспрессия CD80+ – 77%, CD86+ – 95% (среднее геометрическое флуоресценции увеличивается более чем в 1,5 раза). Совместная нагрузка ДК ПВП-360 и ЛПС, однако, такого эффекта не давала: экспрессия CD80 и CD86 оставалась сравнимой с таковой под действием одного ЛПС. Количество CD11+ клеток было ≥ 80% во всех образцах, независимо от ЛПС. 21 Взаимодействие ДК с В-1 и В-2 клетками. В предыдущих разделах были представлены опыты по индукции образования антител ТН-2 Аг, связанными с ДК в спленоцитах мышей СВА. В то же время спленоциты представляют смесь клеток, продуцентами Ат в которой являются В лимфоциты. Основной субпопуляцией В лимфоцитов в селезенке являются В-2 клетки (около 95% В-лимфоцитов). В-1 клетки составляют минорную субпопуляцию, не превышающую 2%. В составе перитонеальных клеток мышей СВА преобладают В-1 лимфоциты. Ранее было показано, что основную роль в специфическом и поликлональном иммунном ответе на ТН-2 Аг играют CD5+ В-1 клетки селезенки [Sidorova, 2003, Whitmore, 2003]. Полученные нами перитонеальные В-1 клетки экспрессировали: CD19 > 95%, CD5 ~30%, CD3 < 5%, CD23 < 5%, F4/80 < 5%. В-2 лимфоциты характеризовались поверхностными маркерами CD19 > 94%; CD5 и CD3 < 1%; F4/80 < 3% (Рис.7.). Рис.7. Цитометрическая характеристика перитонеальных В-1 клеток (А) и В-2 клеток селезенки (Б). (По оси ординат – количество клеток, по оси абсцисс – интенсивность флуоресценции) 22 Чтобы выяснить, какая субпопуляция В клеток мышей СВА участвует в ответе на ТН-2 Аг S3, связанный с ДК, смешивали с В-1 и В-2 клетками в соотношении 1 : 5 и культивировали в полной среде в течение 4 дней. Результаты эксперимента представлены на рис.8. Под влиянием S3, связанным с ДК, в культурах В-1 клеток число АОК увеличивалось в 2,8 раза (с 116 ± 20 в норме до 327 ± 52 на 106 В клеток); в то же время в культурах В-2 клеток, прирост числа АОК был незначителен – на 18% (с 76 ± 11 в норме до 90 ± 14 на 106 В клеток). Число ИГОК при совместном культивировании увеличивалось в обоих случаях; однако, прирост числа ИГОК был выше в культурах В-2 клеток – 37% (14256 ± 890 против 10370 ± 1950 на 106 В клеток), тогда как в культурах В-1 клеток – 17% (10274 ± 1360 против 8740 ± 2180 на 106 В клеток). Таким образом, данные полученными нами, подтверждают ранее сделанный вывод о ведущей роли В-1 клеток в ответе на ТН-2 Аг. * * Рис.8. Иммунный ответ В клеток индуцированный S3, связанным с ДК, * р <0,001 Всё вышеизложенное свидетельствует о том, что ТН-2 Аг, связанные с ДК, вызывают иммунный ответ спленоцитов при непосредственном контакте с ними. При взаимодействии с ДК, нагруженными ТН-2 Аг, основной отвечающий популяцией являются В-1 клетки. 23 Индукция образования АОК при помощи ТН-2 Аг, связанного с xidДК. ДК, выделенные из костного мозга CBA/N мышей, нагружали Декс и культивировали с нормальными спленоцитами мышей CBA в соотношении 1 : 5 в течение 4 сут в полной питательной среде. На 4-е сутки в культурах определяли число АОК и ИГОК (Рис.9). Рис.9. Индукция образования АОК Декс, связанным с xid-ДК, р < 0,001 Полученные данные показывают, что Декс, связанный с xid-ДК, вызывает образование АОК (329 ± 25 против 132 ± 15 на 106 спленоцитов). Эти числа полностью сопоставимы с таковыми в опытах с ДК, выделенными из костного мозга СВА мышей. Очевидно, что наличие xid-мутации не влияет на способности ДК к связыванию ТН-2 Аг и стимуляции иммунного ответа на ТН2 Аг. По-видимому, xid-мутация, функции миелоидных клеток не меняет. 24 ВЫВОДЫ 1. ДК, выращенные из костно-мозговых предшественников, способны связывать ТН-2 Аг. 2. Показано, что полисахаридные ТН-2 Аг, связанные с ДК, обладают иммуногенностью. При этом в культуре спленоцитов, ТН-2 Аг, связанные с ДК, вызывают более сильный и специфичный иммунный ответ, чем нативные ТН-2 Аг. 3. Поликлональная активация В клеток ТН-2 Аг в составе ДК, меньше, чем под действием нативных ТН-2 Аг. 4. Для индукции иммунного ответа на ТН-2 Аг требуется непосредственный контакт нагруженных Аг ДК и В лимфоцитов. 5. ДК, полученные из костномозговых предшественников хid-мышей, не отличаются по способности связывать ТН-2 Аг и индуцировать иммунный ответ от ДК, полученных от нормальных мышей. 6. При индукции иммунного ответа in vitro на ТН-2 Аг, связанные с ДК, основными продуцентами Ат являются В-1 лимфоциты. БЛАГОДАРНОСТИ Автор сердечно благодарит коллектив лаборатории биосинтеза иммуноглобулинов за помощь и поддержку при постановке экспериментов и написании настоящей работы. Особо следует отметить неоценимый вклад научного руководителя проф. Е.В. Сидоровой в обсуждение результатов и написание диссертации. Автор выражает признательность Рубаковой Э.И., сотруднице лаборатории экспериментальной иммуногенетики ЦНИИ туберкулеза РАМН, за помощь в освоении метода получения дендритных клеток. Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (Грант № 08-04-00233-а). 25 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Хоченков Дм.А. Биология дендритных клеток. // Биол. Мембраны. 2008. Т.25. С.403–419. 2. Khochenkov D.A. Biology of dendritic cells. // Biochemistry (Moscow) Suppl. Series A: Membrane and Cell Biology. 2008. V.2. P.296–311. 3. Хоченков Дм.А. Роль дендритных клеток в иммунном ответе на Тнезависимые антигены типа 2. // Биол. Мембраны. 2010. Т.27. С.307– 313. 4. Khochenkov D.A. Role of dendritic cells in the immune response on Tindependent antigens type 2. // Biochemistry (Moscow) Suppl. Series A: Membrane and Cell Biology. 2010. V.4. P.257–261. 5. Khochenkov D.A., Gavrilova M.V., Sidorova E.V. Role of dendritic cells in the immune response on T-independent antigens type 2. ESF Research Symposium B Cells and Protection: Back to basics. 2010. Sant Feliu de Guixols, Spain. 6. Khochenkov D.A., Gavrilova M.V., Sidorova E.V. Do dendritic cells participate in the immune response to T-independent antigens type 2. FOCIS. 2010. Boston, Massachusetts, USA. 26
