Диссертация - Всероссийский центр экстренной и
advertisement
Cеверо-западный государственный медицинский университет им. И.И.Мечникова МЗ России На правах рукописи УДК 616.34:616-07 Вохмянина Наталья Васильевна ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ЦЕЛИАКИИ: ПРИНЦИПЫ И АЛГОРИТМЫ 14.03.10 – Клиническая лабораторная диагностика Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Т.В. Вавилова Санкт-Петербург 2016 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ О ЦЕЛИАКИИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 1.1 Исторические аспекты и эпидемиология целиакии . . . . 17 1.2 Группы риска больных целиакией . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 1.3 Клинические проявления и классификация целиакии . . 22 1.4 Целиакия как мультифакторная болезнь . . . . . . . . . . . . . 25 1.5 Патогенез целиакии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 1.5.1 Влияние глютена на врожденный иммунитет . . . . . . . . . 26 1.5.2 Влияние глютена на адаптивный иммунитет . . . . . . . . . 1.5.3 Результаты полногеномного анализа ассоциаций 28 (Genome Wide Association Studies – GWAS) как альтернативное понимание патогенеза целиакии . . . 31 1.5.4 Значение основных генов целиакии для развития патогенеза глютеновой энтеропатии . . . . . . . . . . . . . . . . 1.5.5 33 Роль тканевой трансглутаминазы в патогенезе целиакии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 1.6 Антитела как сывороточные маркеры целиакии . . . . . . . 38 1.6.1 Антитела к глиадину: антиглиадиновые антитела (АГА) и антитела к дезаминированным пептидам глиадина (ДПГА) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.6.2 Аутоантитела к ретикулину (ARA, АРА), эндомизию (ЭМА) и тканевой трасглутаминазе (ТТА) . . . . . . . . . . . 1.7 38 41 Значение сывороточных маркеров для выявления целиакии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 1.8 Новые методы и маркеры в диагностике целиакии . . . . 45 1.9 Неспецифические (дополнительные) маркеры целиакии 48 3 1.10 Морфологические изменения слизистой оболочки тонкого кишечника и гистологическая классификация целиакии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ГЛАВА 2. 52 1.11 Диагностические критерии целиакии . . . . . . . . . . . . . . . . 56 1.12 Осложнения целиакии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 1.13 Реабилитация больных целиакией . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 1.14. Заключение по литературному обзору . . . . . . . . . . . . . . . 65 Материалы и методы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66 2.1 Материалы исследования . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66 2.1.1 Клиническая характеристика больных по группам . . . . 67 2.2 Методы исследования . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 2.2.1 Методы определения антител . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 2.2.2 Определение свободного карнитина и ацилкарнитинов 73 2.2.3 Молекулярно-генетические исследования . . . . . . . . . . . . . . 76 2.2.4 Определение состава авенина сортов овсов, используемых в питании больных целиакией . . . . . . . . . . 2.2.5 78 Исследование биоптатов слизистой оболочки тонкой кишки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79 2.3 ГЛАВА 3. Методы статистического анализа данных . . . . . . . . . . . . 80 АНТИТЕЛА К ТКАНЕВОЙ ТРАНСГЛУТАМИНАЗЕ И ЭНДОМИЗИЮ КАК ЗНАЧИМЫЕ МАРКЕРЫ ЦЕЛИАКИИ . . . . 84 3.1 Диагностическая информативность антител к тканевой трансглутаминазе (ТТА) и эндомизию (ЭМА) для дифференциальной диагностики воспалительных заболеваний кишечника . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84 4 3.2 Целесообразность модификации верхнего предела референтного интервала ТТА, соответствующего 100% предсказательной ценности положительного результата, для сокращения сроков обследования на первом этапе диагностики целиакии . . . . . . . . . . . . . . . . ГЛАВА 4. 96 ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ВОЗМОЖНОСТИ СЫВОРОТОЧНЫХ АНТИТЕЛ К ДЕЗАМИНИРОВАННЫМ ПЕПТИДАМ ГЛИАДИНА И АНТИТЕЛ К ТКАНЕВОЙ ТРАНСГЛУТАМИНАЗЕ В КАПИЛЛЯРНОЙ КРОВИ . . . . . . . . . . 4.1 105 Диагностическая информативность антител к дезаминированным пептидам глиадина . . . . . . . . . . . . . . 105 4.2 Оценка аналитических возможностей иммунохроматографического экспресс-метода для определения ТТА в капиллярной крови . . . . . . . . . . . . . . 113 ГЛАВА 5. ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ СУБЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ДЕПОЗИТОВ К ТКАНЕВОЙ ТРАНСГЛУТАМИНАЗЕ В СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКЕ ТОНКОГО КИШЕЧНИКА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СУБКЛИНИЧЕСКИХ ФОРМ И РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ ЦЕЛИАКИИ. ВЗАИМОСВЯЗЬ СООТВЕТСТВИЯ ДЕФИЦИТА КАРНИТИНА СО СТЕПЕНЬЮ ПОРАЖЕНИЯ СОТК У БОЛЬНЫХ ЦЕЛИАКИЕЙ ДЛЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1 119 Прогностическая значимость субэпителиальных депозитов к тканевой трансглутаминазе в слизистой оболочке тонкого кишечника для выявления субклинических форм и ранней диагностики целиакии 5.2 119 Взаимосвязь соответствия дефицита карнитина со степенью поражения СОТК у больных целиакией . . . . . 131 ГЛАВА 6. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ HLA-ГАПЛОТИПОВ (HLA-DQ2, 5 HLA-DQ8), АССОЦИИРОВАННЫХ С ЦЕЛИАКИЕЙ, В РОССИЙСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ. ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ИНФОРМАТИВНОСТЬ ИХ ТЕСТИРОВАНИЯ . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1 140 Распределение HLA-гаплотипов (HLA-DQ2, HLA-DQ8), ассоциированных с целиакией, в Российской популяции . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140 6.2 Диагностическая информативность тестирования HLA-гаплотипов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143 ГЛАВА 7. ЛАБОРАТОРНАЯ ОЦЕНКА ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ТОЛЕРАНТНОСТИ У БОЛЬНЫХ ЦЕЛИАКИЕЙ К НАИБОЛЕЕ РАСПРОСТРАНЕННЫМ ПИЩЕВЫМ СОРТАМ ОВСОВ ДЛЯ ВКЛЮЧЕНИЯ ИХ В ДИЕТОТЕРАПИЮ . . . . . . . . . 158 ГЛАВА 8. ПРИНЦИПЫ, КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ И АЛГОРИТМЫ ЛАБОРАТОРНОГО ВЫЯВЛЕНИЯ ЦЕЛИАКИИ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170 ЗАКЛЮЧЕНИЕ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 187 ВЫВОДЫ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 188 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 190 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193 6 ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования. Целиакия (coeliakia; греч.: koilikos; англ.: coeliac disease — кишечный, страдающий расстройством кишечника; син.: глютеновая энтеропатия, нетропическая спру, идиопатическая стеаторея; шифр по МКБ Х - К90.0) — генетически детерминированное заболевание, которое характеризуется стойким отсутствием толерантности к глютену (клейковинный белок злаковых культур - пшеница, рожь, ячмень, овес) и приводит к атрофической энтеропатии. Долгое время целиакия считалась редким заболеванием раннего возраста. В настоящее время момент признано, что она имеет высокую частоту встречаемости (1-3% от численности Европейской популяции) и может манифестировать в любом возрасте [204, 87]. Целиакия, как мультифакторное заболевание, характеризуется клиническим полиморфизмом и многочисленностью трудно диагностируемых форм, составляющих до 59% у взрослого контингента больных и до 40% - в детской возрастной категории [225, 308, 137, 236]. Запаздывание с диагностикой и лечением сказывается на тяжести клинических проявлений, часто приводит к развитию аутоиммунных осложнений и онкологических заболеваний желудочнокишечного тракта со снижением трудоспособности и увеличением риска инвалидизации и смертности, в том числе у молодого, трудоспособного контингента населения [209]. Сложности в постановке диагноза целиакии усугубляются несовершенством лабораторной диагностики. Одной из особенностей сывороточных маркеров является установленная зависимость чувствительности диагностических тестов от степени поражения слизистой оболочки тонкого кишечника (СОТК), которая определяет возможность получения ложноотрицательных результатов (по данным разных авторов, от 6,0% до 22%) при начальных признаках поражения СОТК [284, 182, 126]. Кроме этого, диагностическим пропускам способствуют необоснованные ограничения в употреблении глютенсодержащих продуктов до проведения первичного 7 обследования, а также неправильная интерпретация результатов гистологического исследования биопсийного материала [66, 179]. Недостаточная диагностическая эффективность и увеличивающаяся распространенность целиакии привели к необходимости разработки новых рекомендаций с учетом гистологических критериев и акцентом на отсутствие ограничений в употреблении глютенсодержащих продуктов до постановки диагноза. В 2012 гастроэнтерологии, году Европейским гепатологии и обществом нутрициологии педиатрической (ESPGHAN) были опубликованы последние рекомендации по диагностике и лечению целиакии у детей. Представленные результаты и подробный анализ по изучению известных маркеров расширили диагностические возможности выявления целиакии [185]. Однако, оптимизированное и комплексное использование лабораторных маркеров с учетом эффективности мониторинга, снижения частоты формирующихся осложнений, введения в алгоритм новых маркеров (антитела к дезаминированным пептидам глиадина и субэпителиальные тканевые трансглутаминазные депозиты СОТК) окончательно не определены. В настоящее время рекомендации ESPGHAN широко обсуждаются, и проводится их апробация. Для взрослой категории пациентов последние практические рекомендации приняты в 2013 году Американской коллегией гастроэнтерологов (ACG- American College of Gastroenterology), а также Всемирной организацией гастроэнтерологов [87, 292]. Однако, в принятых рекомендациях имеют место отличия в диагностическом подходе и отличающаяся оценка диагностических возможностей лабораторных тестов, что определяет необходимость дальнейшего совершенствования протоколов обследования. В России в 2014 году приняты Национальные рекомендации по диагностике и лечению целиакии взрослых [53]. В 2015 году утверждены Федеральные клинические рекомендации по оказанию медицинской помощи детям с целиакией [64]. Тем не менее, задача своевременного выявления целиакии продолжает оставаться актуальной в связи с отсутствием четко обозначенных принципов лабораторной диагностики, диагностической информативности новых тестов и 8 единого комплексного диагностического подхода с учетом системного анализа накопленных данных, реализованного в алгоритме обследования. В рекомендациях отсутствует этапность обследования, критерии мониторинга диетотерапии, а также адаптация к отечественным лабораторным тестам алгоритмов обследования ESPGHAN (2012г.), положенных в основу диагностики у детей (Федеральные клинические рекомендации по оказанию медицинской помощи детям с целиакией, 2015г.). Отечественные лабораторные тесты, которые используются для диагностики целиакии в России, отличаются от зарубежных другими операционными характеристиками и верхним пределом референтного интервала, что отражается на достижении того уровня предсказательной ценности, которое применяется в алгоритмах обследования ESPGHAN (2012 г.). Таким образом, возможность проведения своевременного лечения для снижения тяжести исходов при высокой распространенности целиакии определяет необходимость создания и совершенствования диагностических протоколов [7]. Четкое обозначение принципов и формирование алгоритмов лабораторной диагностики целиакии, с учетом вновь сформулированных и известных клинико-диагностических критериев позволит своевременно выявлять целиакию, существенно снизит процент не диагностируемых форм и будет способствовать эффективному лечению и мониторингу диетотерапии. Успешное выполнение адекватных лечебно-оздоровительных мероприятий, предупреждающих формирование осложнений заболевания, значительно повысит уровень социальной адаптации и психологической реабилитации больных целиакией. Все вышесказанное определяет актуальность темы диссертационного исследования. Цель исследования На основе оценки диагностической информативности современных биохимических и молекулярно-генетических лабораторных методов обосновать клинико-диагностические критерии, принципы лабораторной диагностики 9 целиакии и разработать алгоритмы обследования для своевременного выявления заболевания и оптимизации терапии. Задачи исследования 1. Изучить диагностическую информативность определения тканевых трансглутаминазных (ТТА) и эндомизийных антител (ЭМА), как основных маркеров целиакии, для дифференциальной диагностики воспалительных заболеваний кишечника и целиакии и проанализировать целесообразность модификации верхнего предела референтного интервала ТТА, соответствующего 100% предсказательной ценности положительного результата, для сокращения сроков обследования на первом этапе диагностики. 2. На основании операционных характеристик лабораторных тестов для определения антител к дезаминированным пептидам глиадина (ДПГА) и к тканевой трансглутаминазе в капиллярной крови (ТТА-к) провести анализ диагностических возможностей этих лабораторных тестов для выявления целиакии. 3. Установить прогностическую значимость субэпителиальных тканевых трансглутаминазных депозитов (ТТ-д) в слизистой оболочке тонкого кишечника для выявления субклинических форм и ранней диагностики целиакии. Изучить взаимосвязь соответствия дефицита карнитина, как дополнительного маркера целиакии со степенью поражения СОТК у больных целиакией для оценки эффективности проводимого лечения. 4. Изучить ассоциированных распределение с целиакией, HLA-гаплотипов в Российской (HLA-DQ2, популяции и HLA-DQ8), установить диагностическую значимость их тестирования. 5. Исследовать иммунологическую толерантность к авенинам овсов у больных целиакией для включения наиболее распространенных пищевых сортов, не вызывающих иммунной реакции, в диетотерапию больных целиакией 6. На основании проведенной оценки диагностической ценности лабораторных тестов обосновать основные принципы лабораторной диагностики 10 целиакии и разработать новые алгоритмы обследования для групп риска и пациентов с подозрением на целиакию. . Научная новизна и теоретическая значимость работы На основании проведенных исследований охарактеризована значимость сывороточных маркеров целиакии, которые дают четкое представление о механизмах длительно протекающего воспалительного (иммунологического) процесса, вызванного действием глютена. Наличие субэпителиальных тканевых трансглутаминазных депозитов в слизистой оболочке тонкой кишки подтверждает генерализацию патологического иммунного процесса. Установленная высокая специфичность антител к дезаминированным пептидам глиадина, в отличие от антител к глиадину, подтверждает феномен молекулярной (эпитопной) мимикрии, предполагающей формирование антигенной детерминанты, похожей на эпитоп тканевой трансглутаминазы. Отсутствие ложноположительных результатов при определении эндомизийных антител в группах пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника (болезнь Крона и неспецифический язвенный колит), позволяет включать эндомизийных антител в алгоритм дифференциальной диагностики этих заболеваний для снижения ошибок в постановке диагноза. Выявлено отсутствие зависимости субэпителиальных депозитов к тканевой трансглутаминазе от степени поражения слизистой оболочки тонкой кишки и показано значение депозитов к тканевой трансглутаминазе, как дополнительного маркера, для ранней диагностики целиакии и ее субклинических форм. Установлена диагностическая трансглутаминазе слизистой эффективность оболочки тонкой депозитов кишки к для тканевой выявления эпизодического нарушения диетотерапии. Впервые определено значение дополнительных маркеров целиакии, на примере карнитина и его эфиров (ацилкарнитинов), для оценки поражения слизистой оболочки тонкой кишки и эффективности лечения. 11 Изучены HLA-гаплотипы в Российской популяции, ассоциированные с целиакией, определена распространенность и подтверждена их значимость для развития болезни. Установлено, что резкое увеличение доли носителей рисковых гаплотипов при нарастании степени поражения слизистой тонкого кишечника позволяет прогнозировать клиническое течение целиакии. Выявлена иммунологическая толерантность у больных целиакией к определенным сортам овсов (Пушкинский и Астор) и предложено диагностическое решение для расширения диеты. Впервые разработаны новые клинико-диагностические критерии для исключения целиакии – комбинация тестов ЕМА+IgA-ТТА (прогностическая ценность отрицательного результата - 100%) и подтверждения целиакии – комбинация тестов IgA-ТТА+определение субэпителиальных депозитов в биоптатах СОТК (прогностическая ценность положительного и отрицательного результатов 100%); Сформулированы основные принципы лабораторной диагностики и построены алгоритмы обследования больных с подозрением на целиакию и групп риска заболевания. Практическая значимость работы: Обоснована возможность замены определения неспецифических антиглиадиновых антител на антитела к дезаминированным пептидам глиадина, как более информативного теста для диагностики целиакии. Доказана необходимость определения антител к дезаминированным пептидам глиадина IgG-класса вместо неспецифических антител к тканевой трансглутаминазе и к глиадину IgG-класса ( IgGТТА и IgG-АГА) для достоверного выявления целиакии у больных с селективным IgA–иммунодефицитом. Определены условия использования иммунохроматографического экспрессметода для мониторирования диетотерапии у больных целиакией Предложен лабораторный метод определения субэпителиальных тканевых трансглутаминазных антител в слизистой оболочке тонкой кишки, позволяющий выявлять субклинические формы целиакии и проводить мониторинг диетотерапии. 12 Определены иммунологически неактивные сорта овсов, являющиеся наиболее безопасными для включения в рацион питания больных целиакией. Разработаны алгоритмы лабораторного обследования больных с подозрением на целиакию и групп риска, которые позволяют своевременно выявлять данное заболевание и эффективно мониторировать диетотерапию у больных с глютеновой энтеропатией. Положения, выносимые на защиту: 1. IgА–ТТА являются специфичными и высоко чувствительными маркерами целиакии, но вероятность получения ложноположительных результатов вызывает необходимость специфичного интервала их подтверждения ЭМА-теста. ТТА для положительными Модификация соответствия верхнего 100% результатами предела более референтного предсказательной ценности положительного результата с целью сокращения сроков обследования, не исключает ложноотрицательные результаты и не решает проблем с ранней диагностикой целиакии. 2. Применение ДПГА для диагностики целиакии повышает диагностическую эффективность обследования за счет замены неспецифических АГА на ДПГА и использования высокоспецифичного IgG–ДПГА для выявления селективного IgA-дефицита. Лабораторные характеристики экспресс-теста для определения антител к тканевой трансглутаминазе в капиллярной крови хуже, чем у других лабораторных тестов (ЭМА, ТТА), поэтому использование этого теста в настоящее время диагностически не оправдано. 3. Протективный ретротрансцитоз объясняет возможность раннего субэпителиального депонирования в СОТК антител к тканевой трансглутаминазе (IgA-ТТ-д), независимо от степени ее повреждения, что отражается на повышении диагностической эффективности определения IgA-ТТ-д для своевременного выявления целиакии и эпизодического нарушения диетотерапии. Вторичный дефицит карнитина и его эфиров (ацилкарнитинов), связанный с поражением 13 СОТК, служит дополнительным критерием эффективности терапии, позволяющей избегать развитие осложнений заболевания. 4. Мультифакторность целиакии является причиной низкой специфичности теста для HLA-генотипирования и не позволяет использовать этот тест для выявления целиакии. Тем не менее, отсутствие носительства HLA-DQ2 и HLADQ8 гаплотипов у лиц групп риска исключает целиакию на начальном этапе обследования, способствуя снижению количество повторных лабораторных исследований, сокращению цикла обследования, уменьшению ошибок и задержек в принятии клинического решения. 5. Больные целиакией имеют разную иммунологическую толерантность к авенинам овсов, что составляет основу индивидуализации диетотерапии, сбалансированности питания и повышения социальной адаптации больных целиакией. 6. Основными принципами лабораторной диагностики целиакии являются этапность выполнения интеграция, исследований, синергизм, которые их вместе взаимозависимость, с разработанными системная клинико- диагностическими критериями определяют построение алгоритмов с высокой диагностической эффективностью для раннего выявления целиакии. Возможные области применения и формы внедрения. Клиническая лабораторная диагностика, гастроэнтерология, терапия. Экономический эффект от внедрения будет определяться своевременным выявлением целиакии, а также оценкой успешного выполнения адекватных лечебно-оздоровительных мероприятий, предупреждающих формирование многочисленных осложнений и инвалидизацию пациентов. Методология и методы исследования. Методoлогической основой диссертационного исследования явилось последовательное применение методов научного познания. Рaбота выполнена в дизайне сравнительного открытого исследования с использованием клинических, лабораторных, аналитических и статистических методов. Для реализации цели исследования и обоснования 14 основных положений был проведен аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы. Степень достоверности и апробация результатов исследования. Достоверность полученных результатов обеспечивалась как теоретическим анализом проблемы, так и репрезентативностью объема выборок обследованных пациентов, использованием современных методов исследований и достоверным статистическим анализом данных. Основные положения работы, а также результаты исследований доложены на Международных Славяно-Балтийских научных форумах «Санкт-Петербург – Гастро – 2003, 2004, 2005, 2006, 2007, 2008, 2009, 2010, 2011, 2012, 2013, 2014»; 3ем Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2004); 11-ом Конгрессе детских гастроэнтерологов России «Актуальные вопросы абдоминальной патологии у детей» (Москва, 2004); юбилейной конференции «Медико-генетическая служба Санкт-Петербурга (к 35летию медико-генетического центра, Санкт-Петербург, 2004); 5-ом съезде Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005); 6-ом съезде Научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2006); 4-ом съезде медицинских генетиков Украины (Львов, 2008); 2-ом Российском форуме «Здоровье детей: профилактика социально-значимых заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008); 3-ем Международном конгрессе «Наследственные метаболические заболевания» (Харьков, Украина, 2008); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Оптимизация диалога клинициста и лаборатории у постели больного» (Санкт-Петербург, 2008); юбилейной конференции «Современные технологии профилактики наследственных болезней и детской инвалидности» (к 40-летию Медико-генетического центра, Санкт-Петербург, 2009); 4-ой Междисциплинарной конференции по акушерству, перинатологии, неонатологии «Здоровая женщина-здоровый новорожденный» (Санкт-Петербург, 2009); Конгрессе с международным участием «Актуальные проблемы акушерства и гинекологии, клинической иммунологии и медицинской генетики» (Киев, 2010); Первой Всероссийской конференции по редким болезням и редко применяемым 15 медицинским технологиям «Дорога жизни» (Санкт-Петербург, 2010); Заседании Санкт-Петербургского филиала Российского научного общества детских гастроэнтерологов (Санкт-Петербург, 2010); Симпозиуме «Плюсы и минусы современной диагностики целиакии» в рамках XII съезда Научного общества гастроэнтерологов России «Классическая и прикладная гастроэнтерология» (Москва, 2012); Научно-практической конференции «Новые аспекты дието- и фармакотерапии при патологии органов пищеварения у детей» (Санкт-Петербург, 2012); Всероссийской 5-ой конференции с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт – основа профилактической медицины в век нанотехнологий» (Санкт-Петербург, 2012); 2-ом Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины – возможное и реальное» (Санкт-Петербург, 2012); 39 научной сессии Центрального научно-исследовательского «Мультидисциплинарный подход к института гастроэнтерологии гастроэнтерологическим проблемам» (Москва, 2013). Результаты проведенной работы используются в практической деятельности СПб ГКУЗ «Медико-генетический центр», ГБУЗ «Городская поликлиника №23», в гастроэнтерологическом отделении клиник СЗГМУ им. И.И. Мечникова Минздрава России, специализированного Узбекистан. отделения гастроэнтерологии научно-практического Теоретические результаты центра работы Республиканского педиатрии и Республики апробированные диагностические методы целиакии нашли применение в учебном процессе на кафедре клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины ГБОУ ВПО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова Минздрава России. По теме диссертации опубликовано 48 работ, среди них монография, учебное пособие и методические рекомендации, 17 статей в изданиях, определенных перечнем ВАК. Личное участие автора. Диссертант лично участвовал в планировании и организации работы, проведении большей части лабораторных исследований, 16 обработке, анализе, формулировании выводов, рекомендаций и алгоритма обследования. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 228 странице машинописного текста, иллюстрирована 27 таблицами и 37 рисунками. Состоит из введения, основной части, включающей обзор литературы, описание материалов и методов исследования, 6 глав результатов собственных исследований, заключение, список сокращений и условных обозначений, список литературы из 69 отечественных и 287 иностранных источников. 17 ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ О ЦЕЛИАКИИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 1.1. Исторические аспекты и эпидемиология целиакии Целиакия (глютеновая энтеропатия) — заболевание, которое относится к одной из самой частой пищевой непереносимости, вызванной клейковинным белком глютеном злаковых культур (пшеница, рожь, ячмень), что приводит к воспалительным изменениям в слизистой оболочке тонкого кишечника и развитию атрофической энтеропатии у лиц с наследственной предрасположенностью. По международной классификации болезней десятого пересмотра (МКБ-10: К 90.0.) целиакия имеет синонимы: глютенчувствительная энтеропатия, идиопатическая стеаторея, нетропическая спру, болезнь Ги-ГертераГейбнера. Самые ранние упоминания о кишечных нарушениях у человека появились еще в древние времена, когда люди перешли к оседлому образу жизни и стали заниматься возделыванием злаковых культур. Первое описание пациентов с хронической диареей дал греческий врач Arateus (Каппадония) во втором веке н.э., впервые применивший термин «coeliac», который произошел от латинской версии слова «koilia» (брюшная полость), с дословным переводом «coeliac disease» как «болезнь брюшной полости» [80]. Значительная веха в изучении целиакии началась в 19 веке, когда английский врач Samuel Gee в 1888 году, впервые детально описал клиническую картину этого заболевания у детей, ставшую классической, и указал на необходимость соблюдения диеты [169]. Позже, в 1908 году американский врач Herter, подробно изучая целиакию у детей, обратил внимание на повышенную толерантность жиров, развитие другой микрофлоры кишечника и задержку полового развития у детей, больных целиакией, что послужило поводом назвать глютеновую энтеропатию интестинальным инфантилизмом [177]. В 1909 году Heubner в Германии объяснил развитие целиакии тяжелой недостаточностью пищеварения. С тех пор 18 глютеновую энтеропатию стали называть в честь ученых, внесших наибольший вклад в представление о целиакии, болезнью Ги–Гертера–Гейбнера [81]. Фундаментальное открытие в 1950 году сделал Dicke (Нидерланды), впервые установивший причину развития целиакии в наличие токсических фракций, содержащихся в хлебных злаках [140]. Несколько позже, в 1953 году, английский врач J. Paulley стал первым, кто продемонстрировал изменения в слизистой тонкого кишечника при целиакии, которые как самые достоверные, с 1970 года [273,250,340]. считаются «золотым» Продолжавшиеся диагностическим диагностические стандартом исследования целиакии установили циркулирующие в крови больных целиакией антитела к глиадину (АГА, AGA), которые впервые были описаны в 1958 году Berger [11] и активно вошедшие в диагностику целиакии спустя некоторое время (Ferguson A and Carswell F, 1972) [156]. Очевидное преимущество и возможность широкого использования антител позволило осуществить проведение скрининговых исследований, изменивших первоначально существовавшее представление о целиакии как о редкой болезни, с установленной средней частотой как 5.44 больных на 1000 здоровых или 1:184 соответственно [112]. Проведение массовых исследований впервые выявило проблему трудно и недиагностируемой целиакии, в результате чего Ричард Логан (Ноттингем, Англия) в 1991 году предложил представить целиакию в виде айсберга, где только видимую часть составляет хорошо диагностируемая целиакия [228]. По данным разных авторов соотношение диагностируемой целиакии к недиагностирумой в настоящее время составляет 1:6 (М.О. Ревнова, 2005; А.И.Парфенов, 2007; С.В. Бельмер, 2010; О.В. Анциферова, 2014; J.E. Botero-Lopez et.al.,2011) или 1:7 (E. Lionetti, C. Catassi, 2011), при разбросе показателей от 1:5 до 1:13 соответственно [225,236,87,292,182]. Дальнейшее изучение глютеновой энтеропатии и необходимость обобщения закономерностей развития этого заболевания привели к новым массовым исследованиям, проведенным в четырех европейских странах (Финляндия, Германия, Италия, Великобритания), установивших среднюю Европейскую распространенность целиакии, равную как 1% больных в популяции [260]. 19 Эпидемиологические исследования, проведенные в странах Ближнего Востока и Северной Африки, подтвердили общую тенденцию в распространенности глютеновой энтеропатии [225,114]. Что касается стран центральной Африки и Дальнего Востока (Япония, Китай, Корея, Конго, Нигерия и др.), то проведенные исследования в этих странах выявили низкую частоту целиакии. Анализ представленных результатов показал, что установленная частота, по всей вероятности, не отражает реальный уровень болезни из-за другого характера питания, в котором злаки представлены преимущественно просом и рисом, не содержащих глютена [352,197,113]. В России массовых скринирующих исследований до сих пор не проводилось. По мнению отдельных авторов, средняя частота целиакии в России не отличается от Европейской и может составлять 1:250 - 1:100 [23]. Частота целиакии в детской популяции составляет 1:392 (Анциферова О.В., 2015) и 1 случай на 133–380 новорожденных (Орешко Л.С., 2011, Парфенов А.И.,2007) [3,37,44]. Изучение распространенности целиакии в разных возрастных категориях выявило ее неодинаковую частоту встречаемости. Так, результаты массового скрининга, проведенного в Испании, показали, что средняя частота целиакии, которая составила 1:204, отличается от средней частоты в детской популяции (1:71) и в популяции взрослых – 1:357 [245]. Такие же результаты были получены и в других Европейских странах, подтвердившие ранее полученные выводы [249]. Проведенный анализ показал, что для детской целиакии, более характерна классическая (типичная) форма, с выраженной клинической симптоматикой, которая хорошо диагностируется, в отличие от взрослых, у которых целиакия чаще проявляется субклинически, что объясняет трудности в диагностике и другую частоту встречаемости, по сравнению с детской [127,151,227]. Была также подтверждена разная встречаемость целиакии в зависимости от половой принадлежности. Установлено, что целиакия чаще встречается у лиц женского пола, при соотношении частоты встречаемости к мужскому полу 2:1 [87,39,56]. Анализ эпидемиологических исследований, проведенный в развитых странах, выявил постоянно увеличивающуюся частоту целиакии. Так, распространенность 20 целиакии в Финляндии удвоилась в течение двух десятилетий, поднявшись с 1.05% в 1978-1980гг. до 1.99 % в 2000-2001гг [229]. Возрастание частоты также было зарегистрировано и в американской популяции, которая, как подтвердил проведенный анализ, увеличивается приблизительно в два раза за каждые 15 лет, что не может быть объяснено только улучшением диагностики целиакии [110]. Изучение этого факта показало, что на возрастание распространенности целиакии прежде всего влияют меняющиеся характер питания, качество и длительность брожения пшеничного теста, изменение микробиоты кишечника человека, загрязнение окружающей среды, что в целом воздействует на состояние иммунной системы и способствует развитию целиакии [110]. 1.2. Группы риска больных целиакией Проведение скринирующих исследований позволило выявить более высокую частоту целиакии в группах пациентов, имеющих в анамнезе определенные заболевания. Была установлена ассоциация с целиакией заболеваний кожи (герпетиформный дерматит Дюринга, псориаз, угревая болезнь, дерматиты), заболевания крови (анемия, тромбоцитоз); нервной системы (полинейропатия, мозжечковая атаксия, эпилепсия), заболеваний, связанных с нарушением костного метаболизма (идиопатическая остеопения, остеопороз, патологические глосситами; переломы); афтозными онкологическими поражениями заболеваниями ротовой (лимфомы полости, кишечника); аутоиммунными заболеваниями (сахарный диабет, ювенильный ревматоидный артрит, аутоиммунные тиреоидит и миокардит, системная красная волчанка,), болезнью Аддисона, хромосомными аномалиями (синдромы ШерешевскогоТернера, Дауна, Тернера, Вильямса), заболеваниями гепатобилиарной системы (первичный билиарный цирроз печени, синдром Шегрена, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный холангит), миастенией, IgA-селективным дефицитом, IgA- нефропатией [351,165,347,297,221,155,67,87,27,53]. Некоторые авторы считают, что большое количество ассоциированных с целиакией заболеваний, особенно 21 аутоиммунных, является как самостоятельным заболеванием, так и симптомом атипичной целиакии [17]. В настоящее время определенно установлено, что прекращение поступления глютена, выполняющего функцию триггера для активизации генов предрасположенности, предотвращает развитие аутоиммунных осложнений и онкологических заболеваний [339,7,41]. Эти выводы объяснили результаты анализа, выявившего зависимость между длительностью протекания целиакии (до назначения безглютеновой диеты) и вероятностью развития аутоиммунной патологии. Проведенные исследования (Fasano А.et. al., 2003) также показали высокую распространенность целиакии у родственников первой степени родства - 1:18 – 1:22, у родственников второй степени – 1:24 – 1:39, среди пациентов с клинической симптоматикой – 1:56 по сравнению с частотой в общей популяции 1:100 [153]. Кроме этого, было установлено, что целиакия в указанных группах пациентов, имеет чаще атипичное течение или может протекать с минимальными клиническими проявлениями. Высокая распространенность целиакии вместе с возможностью субклинического и атипичного течения в указанных группах объяснили необходимость создания групп риска для их обязательного обследования с целью своевременного выявления болезни [320]. В группы риска, согласно российским рекомендациям по диагностике и лечению целиакии у взрослых (2014 г.), были включены: пациенты с гастроинтестинальными симптомами (диарея, запоры, синдром ма-лабсорбции, снижение массы тела, метеоризм, вздутие); пациенты с аутоиммунными эндокринопатиями; пациенты с повышенными трансаминазами, билирубином, железодефицитной анемией; пациенты с нарушением репродуктивной функции; пациенты с персистирующим афтозным стоматитом, гипоплазией зубной эмали, дистопией зубного ряда, остеопений, остеопорозом; пациенты с аутоиммунными и ассоциированными заболеваниями, периферической нейро- и миопатией, церебральной атаксией; ближайшие родственники больных целиакией [53]. 22 1.3. Клинические проявления и классификация целиакии Подробное изучение многочисленных клинических проявлений глютеновой энтеропатии выявили чрезвычайный клинический полиморфизм целиакии что [149,320,274], привело к попыткам систематизировать клиническую симптоматику, например, с выделением типичных и атипичных [45,152], основных и дополнительных [51], гастроинтестинальных и экстраинтестинальных проявлений [115,227,39], клинической симптоматики взрослой и детской целиакии [117,151,283]. Разделение клинических проявлений с учетом возрастных особенностей (целиакия взрослых и детская целиакия) сегодня представляется условным, так как клиническая картина целиакии у взрослых и детей имеет много общего. Считается, что для детской целиакии более характерна классическая манифестная форма, которая (гастроинтестинальных) протекает симптомов, с преобладанием неврологической кишечных симптоматикой и снижением массы тела. У детей старшего возраста присоединяются другие клинические проявления, что максимально приближает их к клинической симптоматике взрослой целиакии, часто имеющей атипичное течение [225]. В настоящее время такие клинические симптомы целиакии, как боли в животе, раннее начало остеопороза, усталость, слабость, необъяснимая анемия, диарея, запоры, дефицит витаминов, газообразование, синдром раздраженного кишечника, потеря в весе, признаны общими для всех возрастных групп [231]. Современная клиническая систематизация целиакии в настоящее время опирается на манифестные формы, с учетом клинических и морфологических проявлений [72,150,108]. Типичная мультисистемным (классическая) фенотипом форма с целиакии характеризуется преобладанием кишечных (гастроинтестинальных) симптомов, прежде всего патологическим характером стула (обильный, зловонный, светлый стул), диареей, болями в животе, увеличением окружности живота, рецидивирующей рвотой, нарушением аппетита, отставанием в массе тела и росте. Как правило, манифестирует в 23 детском возрасте. Высокая частота типичной формы целиакии зарегистрирована в возрастной группе детей от шести месяцев до двух лет, что связывают с началом введения прикорма и переходом на питание с содержанием глютена. Характерны положительные серологические тесты с присутствием гистологических изменений в слизистой оболочке тонкого кишечника (СОТК). Атипичная форма манифестирует у детей старших возрастных групп и взрослых, с преобладанием экстраинтестинальных симптомов, которые часто представлены полового развития, дерматитом, анемиями артралгиями, остеопенией/остеопорозом, артритами, утомляемостью, и т.д. гипоплазией слабостью, Характерны зубной задержкой эмали, неврологическими положительные роста, атопическим нарушениями, серологические тесты с присутствием гиперрегенераторной атрофии СОТК. Исключение составляют: Молчащая, или скрытая (silent), форма, которая протекает без клинических проявлений или с минимальной клинической симптоматикой, с положительными серологическими тестами и типичными морфологическими изменениями в слизистой тонкого кишечника. Часто выявляется в группах риска. Латентная форма характеризуется положительными сывороточными тестами, но при разной степени выраженности морфометрических маркеров, вплоть до их отсутствия. Клинические признаки могут отсутствовать или быть минимальными (рисунок 1.1). А й сб е р г ц ели а ки и П овреж денная сл изистая Н орм аль ная сл изистая С им птом атич еская ц елиакия С к р ы т а я (м о л ч а щ а я ) ц елиакия Л атентная ц елиакия Рисунок 1.1. Распределение клинических форм целиакии [108] 24 Приведенная клиническая классификация целиакии не является официальной и общепринятой. До сих пор она активно обсуждается и вносятся предложения по ее усовершенствованию [54,69,3,30,27,23,59,6,23]. Так, некоторые авторы предлагают за классификационную основу взять только степень тяжести болезни (легкая, средняя, тяжелая), аргументируя клинической условностью при разделении манифестных форм и едином подходе к лечению [51]. Близко к этой позиции стоит предложение других авторов, которые во избежание путаницы, объединили все малосимптомные формы, как похожие, в одну субклиническую форму [291,348]. Были также внесены предложения о разделении целиакии на бессимптомную и симптоматическую формы [282]. Однако, несмотря на предпринимаемые попытки систематизировать многочисленные формы целиакии и облегчить ее клиническую диагностику, атипичные формы продолжают увеличивать количество не диагностируемой целиакии. Попытка объяснить этот факт и разобраться в значительном превалировании трудно- и не диагностируемых форм привела к появлению новой нозологической формы – глютеновой чувствительности (gluten sensitivity, GS), или непереносимость глютена. Подробное изучение этого заболевания и проведенная сравнительная характеристика с целиакией показали, что для глютеновой чувствительности не характерны аутоиммунные заболевания, которые, как правило, ассоциированы с целиакией. Кроме этого, клинические проявления не имеют такого широкого полиморфизма как при целиакии и, в основном, представлены кишечной симптоматикой (диарея, газообразование, боли в животе, потеря в весе). Изучение причин манифестации глютеновой чувствительности, позволило определить, что при этом заболевании, в отличие от целиакии, нет нарушений в барьерной функции кишечного эпителия, пептиды глютена не проникают в собственную пластинку слизистой тонкого кишечника и не вызывают развитие адаптивного иммунного ответа, приводящего к диффузной энтеропатии. Сегодня предположительно установлено, что развитие этого заболевания поддерживают механизмы врожденного иммунного ответа, которые 25 определяют другие иммунологические нарушения и, следовательно, создают необходимость введения иных диагностических маркеров. Этим объясняют характерные для глютеновой чувствительности отрицательные значения специфичных для целиакии сывороточных и морфометрических маркеров. В настоящее время предположительно установлена частота глютеновой чувствительности, которая намного выше целиакии и составляет 6% в Европейской популяции, что требует дальнейшего подробного изучения этого заболевания [149,344,295,100,32,63]. 1.4. Целиакия как мультифакторная болезнь Как одна из задач по уменьшению не диагностированной целиакии является понимание и достаточная изученность патогенеза. В настоящее время в этом направлении сделан революционный прорыв с помощью полногеномного анализа ассоциаций (Genome Wide Association Studies – GWAS), сумевшего объяснить все стороны патогенеза, подтвердив мультифакторность целиакии, развитие которой контролируется множественными взаимодействующими факторами, как генетической, так и средовой природы [209]. К наиболее значимым внешним (средовым) факторам относят инфекции, особенно ротавирусную у детей и кампилобактериоз у взрослых, а также такие факторы, как: раннее отнятие ребенка от груди, характер питания, лекарственные препараты, экологические, социально-экономические факторы [217,349]. Так, установлено, что тяжелая манифестация болезни, как правило, наблюдается при раннем переводе грудного ребенка на искусственное вскармливание (от четырех до шести месяцев жизни) и изменение пищевого рациона у лиц с наследственной предрасположенностью к целиакии, включающего высокое содержание злаковых белков. Кроме этого, проведенные исследования, установили, что определенные лекарственные препараты, например, препараты железа, которые принимаются во время беременности, могут воздействовать на врожденную иммунную систему и повышать риск развития целиакии у ребенка, также как изменение микрофлоры 26 кишечника под воздействием антибиотиков [217,244]. Как один из главных факторов риска, определяющий наследственную предрасположенность к целиакии, были признаны HLA-гены, которые, помимо участия в патогенезе целиакии, у грудных детей могут определять другую микробиоту [349]. Было также установлено, что курение беременной, кесарево сечение также повышают риск развития целиакии у ребенка. Проведенные исследования подтвердили многофакторность целиакии и выделили из достаточно большого количества внешних факторов основные: глютен, генетическая предрасположенность, кишечные, вирусные инфекции [209,28]. 1.5. Патогенез целиакии 1.5.1. Влияние глютена на врожденный иммунитет Общепризнанным остается факт, что начальными, но не определяющими событиями для формирования иммунного ответа у больных целиакией являются изменение проницаемости поверхности кишечного эпителиального слоя и несостоятельность кишечных пептидаз, что позволяет проникнуть необработанным пептидам глютена в собственную пластинку слизистой оболочки тонкого кишечника (lamina propria). Обычно олигопептиды глютена эффективно обрабатываются кишечными пептидазами, локализованными в щеточной кайме мембраны энтероцитов до аминокислот, ди- и/или трипептидов, прежде чем транспортируются через эпителий кишечника [4]. При целиакии содержание большого количества пролина и глутамина в пептидах глютена выявляет недостаточную эффективность ферментов кишечника и обеспечивает резистентность пептидов к кишечному протеолизу. Необработанные пептиды глютена, попадая в собственную пластинку слизистой тонкого кишечника, предположительно приводят к стимуляции как врожденного, так и приобретенного иммунитетов, как это будет показано ниже в разделе 1.5.2. В настоящее время токсико-иммуногенными пептидами глютена признаны 33-mer, 27 состоящий из 33 аминокислот, и 25 mer (25 аминокислот) которые, как показали проведенные исследования, продолжают оставаться активными в условиях in vivo после приема глютена [243,262]. Главным медиатором клеточного стресса и активации врожденного иммунитета после поступления в собственную пластинку слизистой тонкого кишечника пептидов глютена считается интерлейкин-15 (ИЛ15, IL-15), который вырабатывается кишечным эпителием, активированными макрофагами, патогенезе дендритными целиакии клетками. является Основными наращивание функциями цитотоксической ИЛ-15 в активации межэпителиальных лимфоцитов (IELs, МЭЛ), апоптоза эпителиоцитов, а также снижение устойчивости СОТК к глиадину [90,252,254,43]. Кроме этого, ИЛ-15 стимулирует созревание антигенпредставляющих клеток, тем самым расширяя презентацию глиадиновых пептидов. Это приводит к активации CD4+Тлимфоцитов и иммунитетами инициирует [354,94,73]. связь между Выявлено врожденным влияние ИЛ-15 на и адаптивным ингибирование трансформирующего фактора роста бета (ТФР-β, TGF-β), который приводит к развитию и поддержанию воспалительных процессов в слизистой тонкого кишечника [190]. Помимо иммунологических механизмов токсичности глютена, изучение протеомики целиакии позволило понять и биохимические процессы, определяющие повреждения СОТК, связанные с действием глютена [159]. Было показано, что высокая концентрация глутамина и пролина в тонком кишечнике, может формировать токсические эффекты у пациентов с наследственной предрасположенностью к целиакии [328]. Так, накопление пептидов глиадина в лизосомах активизирует перекисное окисление липидов, что влияет на изменение сигнальной трансдукции и накопление свободных радикалов (активные формы кислорода, оксида азота, липидов) [216,319,18]. Усиление процессов пероксидации липидов способствует изменению поверхностного заряда мембран, уменьшению гидрофобного объема липидного слоя мембран, с увеличением их микровязкости, отражаясь на окислительно-восстановительном потенциале клетки, а также на рецепторных функциях мембран кишечного эпителия 28 Перечисленные [314,289]. морфологии, процессы пролиферации, приводят к дифференцировке, изменению клеточной апоптозу, модуляции генетической экспрессии [234,302,138]. Изменение окислительного баланса становится причиной активации ядерного фактора транскрипции (NF-κB) и стимулирует продукцию провоспалительных цитокинов, а также таких ферментов, как циклооксигеназа COX, липоксигеназа LOX, индуцибельная синтаза оксида азота iNOS, участвующих в синтезе простагландинов, простациклинов, тромбоксанов и оксида азота, способствующих усилению оксидативного стресса [174,240]. Увеличение активного кислорода, как следствие оксидативного стресса, меняет свойства убиквитин-зависимой системы протеолиза, что приводит к уменьшенной деградации тканевой трасглутаминазы (TG2) и к ее не контролируемой активации. Все эти процессы способствуют изменению экспрессии воспалительных генов и являются причиной формирования патологических изменений в СОТК [234,132]. Таким образом, основным итогом воздействия глютена на врожденный иммунитет является избыточная продукция ИЛ-15, цитотоксическая активизация МЭЛ и активация глютеном оксидативного стресса, приводящие в целом к процессам активного апоптоза и воспалительным изменениям в СОТК. 1.5.2. Влияние глютена на адаптивный иммунитет Воздействие глютена на адаптивный иммунный ответ вовлекает сложные процессы взаимодействия пептидов глютена с ферментом тканевой трансглутаминазой, а также молекулами HLA-генов второго класса. Как было упомянуто выше, отличительной особенностью эпитопов глютена является наличие большого количества пролина и глутамина. Такие пептиды не только увеличивают шанс связывания с HLA-молекулами DQ2 и DQ8, но и являются идеальным субстратом трансглутаминазы распознаются (TG2) для многофункционального [251,261,356]. HLA-молекулами (DQ2 фермента тканевой Большинство пептидов и модифицированной DQ8) в глютена 29 (дезаминированной) форме, которую формирует тканевая трансглутаминаза, трансформирующая нейтральные остатки глутамина в отрицательно заряженную глутаминовую кислоту в пептидах глютена [158,233]. Дезаминированные пептиды глютена подвергаются привилегированному связыванию с молекулами HLA-DQ2/ DQ8 [257]. Только такие переработанные пептиды глютена в комплексе с молекулами HLA-DQ2/DQ8 презентируются на поверхности зрелых дендритных клеток и распознаются CD4+Т-клетками с последующей их активацией (рисунок 1.2). Рисунок 1.2. Патогенез целиакии [159] Активизированные CD4+Т-клетки становятся способными воздействовать на эффекторные нормальные киллерные Т-лимфоциты (НK-клетки), экспрессирующие FasL-лиганд, а также вызывать дифференциацию В-клеток в составе плазматических клеток (IgA-, IgG-антитела). FasL-Т-клетки, в свою 30 очередь, начинают продуцировать провоспалительные цитокины с преобладанием в них важнейшего провоспалительного цитокина гамма-интерферона (ИФН-γ). Среди многочисленных функций ИФН-γ одной из значимой для развития целиакии является активация микробицидности и цитотоксичности макрофагов. Значимой для целиакии является влияние ИФН-γ на экспрессию антигенов HLA I и II классов на разных клетках, даже на тех, которые не экспрессируют их конститутивно, и тем самым повышать эффективность презентации антигенов с дальнейшим их распознаванием Т-лимфоцитами [196]. ИФН-γ также стимулирует взаимодействие лиганда Fasl на поверхности эффекторных НK-клеток с рецептором Fas на клетках-мишени (в данном случае энтероциты), что приводит к активации апоптозного сигнала в энтероцитах [120]. Апоптоз при адаптивном иммунном ответе может дополнительно инициироваться таким цитотоксическим фактором, как гранзим (семейство сериновых протеаз), который содержится активизированных в гранулах ИФН-γ [321]. межэпителиальных Воздействие ИФН-γ на лимфоцитов, макрофаги и фибробласты собственной пластинки слизистой оболочки тонкого кишечника, lamina propria, проявляется усиленным синтезом матричных металлопротеиназ и интенсивной матричных продукцией тканевой металлопротеиназ у трансглутаминазы. больных целиакией Усиленный является синтез причиной деградации внеклеточного матрикса, формирования лигандов для Fas-рецепторов, активации хемокинов, с последующей активизацией процессов апоптоза и формированием характерных изменений в слизистой оболочке тонкого кишечника [141,196]. Помимо ИФН-γ, цитотоксический эффект оказывают и другие провоспалительные цитокины (ИЛ-15, ИЛ-21), которые продуцируются активизированными CD4+Т-лимфоцитами. Нужно отметить, что ИЛ-21 вместе с ИЛ-15, определяют синергичный эффект, который способствует не только экспансии межэпителиальных лимфоцитов, но и их цитотоксической активации, с выработкой супероксидных и нитроксидных радикалов, простагландинов. Кроме этого, провоспалительные цитокины способствуют поддержанию дифференцировки Т-лимфоцитов в направлении Т-лимфоцитов воспаления, или 31 хелперных Т-лимфоцитов первого порядка (Тh1). Помимо формирования Тh1лимфоцитов, адаптивный иммунный ответ вызывает параллельную дифференцировку CD4+Т-лимфоцитов в хелперные клетки второго порядка (Th2), которые активируют специфические В-лимфоциты для продукции соответствующих антител [196]. Таким образом, глютен провоцирует стимуляцию врожденного и адаптивного иммунитетов, которые являются взаимосвязанными. Сигналы, индуцированные распознаванием глютена, запускают врожденную иммунную систему на цитотоксическую активацию межэпителиальных лимфоцитов с помощью IL-15, а адаптивную иммунную систему посредством ИФН-γ на активацию CD4+Т-лимфоцитов. Взаимосвязь регулирующих механизмов обеих иммунных систем, в частности, воздействие CD4+Т-лимфоцитов на врожденный иммунитет за счет секреции IL-21, а также воздействием дендритных клеток посредством IL-15 патологического на адаптивный иммунного каскада, ответ [141] приводящего обеспечивают к запуск воспалительным и структурным изменениям в СОТК. 1.5.3. Результаты полногеномного анализа ассоциаций (Genome Wide Association Studies – GWAS) как альтернативное понимание патогенеза целиакии Существенные дополнения в патогенез целиакии были сделаны полногеномным анализом ассоциаций (Genome Wide Association Studies – GWAS), подтвердившим, что развитие полигенных заболеваний определяется количественными изменениями интенсивности транскрипции кодирующих участков генома, имеющих нормальную структуру и зависящих от меняющихся внешних условий. Основным итогом GWAS для целиакии явилось установление ее главных (HLA-гены) и определение новых генов (39 генетических локусов, 115 генов). Результаты GWAS показали, что большинство вновь выявленных генов (81%), ассоциированных с целиакией, являются не кодирующими, а 32 регуляторными, что объяснило их влияние на многочисленные иммунные изменения, происходящие при развитии целиакии [209]. Был определен незначительный вклад новых генов в наследственную предрасположенность к глютеновой энтеропатии (14%), с подтверждением установленного факта, что развитие комплексных заболеваний зависит от сочетания большого числа малых эффектов [328]. Результаты GWAS установили механизм активизации вирусной инфекцией иммунных реакций врожденного иммунитета при развитии целиакии. Было определено, что распознавание инфекции происходит внутриклеточными толлподобными рецепторами (TLR7 и TLR8). Такое взаимодействие запускает активацию транскрипционного интерферон-регулирующего фактора 4 (ИРФ4), который контролирует продукцию интерферонов (ИФН-α, ИФН -β, ИФН -ω, ИФН-τ, ИФН-δ, ИФН -κ, ИФН -ε, ИФН -ζ/limitin) в ответ на заражение вирусом и способствует созреванию антигенпрезентирующих клеток, мобилизует макрофаги и натуральные киллеры, производит секрецию цитокинов, которые активируют Ти В-лимфоциты. Было также установлено воздействие вирусной инфекции на экспрессию гена BACH2, являющимся ключевым регулятором антительного ответа в противовирусном ответе [328]. Кроме этого, результаты GWAS подтвердили значение универсального ядерного транскрипционного фактора NF-κB в развитии целиакии и объяснили нарушения регуляции NF-kB при врожденном иммунном ответе с вовлечением большого числа генов, которые поразному влияют на функцию NF-kB. Было показано, что разные генетические воздействия на ядерный транскрипционный фактор NF-kB приводят к нарушениям в сигнальном NF-kB-пути и определяют, помимо процессов воспаления, развитие аутоиммунных, онкологических заболеваний, вирусных инфекций [329]. Проведенные исследования GWAS также установили влияние определенных генов на дифференцировку Т-хелперов первого порядка (Th1), регулирующих Т-хелперов (Threg) и Т-хелперов 17 (Th17), а также на регуляцию Тh2-клеточного ответа [70,280,330]. Значительным оказалось доказательство влияния ассоциированных с целиакией SNPs (Single nucleotide polymorphism, 33 однонуклеотидный полиморфизм) на экспрессию локусов количественных признаков (ЛКП), или eQTLs, expression quantitative traits loci Количественные признаки различаются по степени своего выражения и могут быть отнесены к полигенным эффектам, т.е. являются продуктом двух или более генов. Локусы количественных признаков являются участками ДНК, содержащими гены, либо сцепленными с генами, которые отвечают за тот или иной количественный признак. При этом было показано, что приблизительно 50% SNPs затрагивают экспрессию локусов количественных признаков (ЛКП), или eQTLs, expression quantitative traits loci только соседних генов (cis-eQTLs). Были также идентифицированы trans-eQTL эффекты, которые влияют на экспрессию целого ряда генов, расположенных на разных генетических локусах и хромосомах. Открытие eQTL эффектов стало важным и значительным событием, так как смогло объяснить зависимость серьезных нарушений в биологических процессах от характера экспрессии большого количества генов, объяснив тем самым клинический полиморфизм и большое количество ассоциированных с целиакией заболеваний, а также обозначить возможность участия одинаковых генетических локусов в развитии разной мультифакторной патологии [330]. Таким образом, результаты GWAS, существенно дополнили и расширили представление об иммунных процессах, имеющих место при развитии целиакии. 1.5.4. Значение основных генов целиакии для развития патогенеза глютеновой энтеропатии HLA-гены являются основными генами целиакии, вклад которых в наследственную предрасположенность составляет 40% (остальные гены в совокупности вносят в наследственную предрасположенность целиакии всего 14%) и без которых развитие целиакии представляется маловероятным [290, 38]. Гены второго класса HLA-системы, продукты которых активно участвуют в патогенезе целиакии, расположены в HLA-регионе на коротком плече 6хромосомы (6р21.3). Одной из основных физиологических функций HLA-генов 34 второго класса является связывание экзогенных иммунодоминантных пептидов и последующее их представление Т-лимфоцитам, с последующей их активацией и развитием иммунного ответа [49]. Для развития целиакии важен процесс связывания пептидов глютена с HLAмолекулами, который происходит в антигенсвязывающей полости, представляющей структуру сложной формы, с субцентрами связывания в виде складок (карманов), где возможно взаимодействие с боковыми цепями аминокислотных остатков пептидов глютена [49]. Молекулы HLA класса II имеют определенное число карманов, но только некоторые из них имеют строгую специфичность, обуславливающую связывание пептида. В процесс связывания с HLA-молекулами избирательно вовлекаются дезаминированные пептиды глютена, которые подвергаются процессу олигомеризации, приводящему к формированию определенной аминокислотной последовательности в пептидах глютена, созданию так называемого «мотива», после чего связываются с HLAмолекулами и презентируются на поверхности антигенпредставляющих клеток, активизируя Т-лимфоциты. Сегодня определены ключевые «мотивы», которые размещаются внутри карманов антигенсвязывающей полости и по которым, в основном, происходит связывание пептидов [294,204]. Изучение молекулярных механизмов связывания подтвердило, что именно процессы дезаминирования пептидов глютена ферментом тканевой трансглутаминазой приводят к 25кратному увеличению аффинности связывания за счет формирования водородных связей между глутаминовой кислотой дезаминированного пептида глютена и HLA-молекулой. Без трансформации глутамина в отрицательно заряженную глутаминовую кислоту, в которой присутствует карбоксильный кислород, как мощный акцептор водородной связи, не происходит взаимодействия пептида глютена с HLA-молекулой [239,71]. Изучение процессов связывания пептидов с HLA-молекулами выявило, что риск развития целиакии зависит от возможности HLA-молекул связывать большое количество разнообразных пептидов глютена. Установлено, что DR3DQ2 связывает больший репертуар глютеновых пептидов по сравнению с DR7- 35 DQ2, что согласуется с разным риском развития глютеновой энтеропатии у таких пациентов [204]. Проведенные генетические исследования у больных целиакией показали, что больше 90% больных целиакией являются носителями молекул HLA-DQ2 и только приблизительно 5% - молекул HLA-DQ8 [253,258]. Сегодня известно, что самый высокий генетический риск имеют гомозиготы с DR3-DQ2 гаплотипом, приводящим к формированию двух копий DQ2.5 димеров в цис-комбинации, а также димер DR3-DQ2/DR7-DQ2, передающийся как в цис-, так и в транс-формах. Средний генетический риск определяет присутствие одной копии DR3-DQ2 вместе с другими, не предрасполагающим к целиакии гаплотипами, а также гетерозиготная форма DR5-DQ7/DR7-DQ2, которые приводят к формированию одного функционального DQ2.5 димера в цис- и транс-формах. Низкий генетический риск формируют гомозиготы DR5-DQ7 / DR5-DQ7 и гетерозиготы DR5-DQ7 с другими, не предрасполагающими к целиакии гаплотипами [290]. При изучении носителей HLA-генов была выявлена закономерность между тяжестью гистологических повреждений слизистой оболочки тонкого кишечника и DQB1*02 аллелями, что позволило сделать вывод, что DQB1*02 аллели у гомозиготных носителей предрасполагают к серьезным морфологическим повреждениям слизистой тонкого кишечника. При этом не было выявлено закономерной зависимости между выраженностью клинических проявлений целиакии и тяжестью гистологических изменений в слизистой оболочке тонкого кишечника при гомозиготном наследовании DQB1*02. Изучение гомозиготного наследования для DR3-DQ2 гаплотипа определило предрасположенность к таким осложнениям целиакии, как кишечная лимфома и рефрактерная глютеновая энтеропатия и показало, что 44-62% пациентов с рефрактерной целиакией 2 типа гомозиготы по DR3-DQ2 гаплотипу [143,204]. Проводимые популяционные геномные исследования определили, что только 0,4%-0,7% больных целиакией не имеют указанных выше молекул и подтвердили необходимость HLA-молекул для манифестации целиакии. В то же время установлено, что 30%-40% здоровых индивидуумов экспрессируют HLA- 36 DQ2 и HLA-DQ8. Выявленные доказательства показали, что присутствие только аллельных вариантов HLA генов класса II недостаточно для развития целиакии [196]. Результаты GWAS подтвердили полученный вывод, представив большое количество других не HLA генов, участвующих в развитии целиакии. Популяционные геномные исследования также показали возможно разную популяционную частоту встречаемости HLA-DQ2 и HLA-DQ8. Так, геномные исследования, проведенные в Индии, выявили в разных расах разную частоту встречаемости HLA-DQ2 и HLA-DQ8. Другая частота HLA-DQ2 и HLA-DQ8, по сравнению с европейской, определена у больных целиакией в Томске - 76,9%, в Краснодаре - 81,2%, в Узбекистане – 69,2%, Казахстане - 26,4% [50,69,21,68]. Однако, достоверность полученных данных вызывает сомнение из-за маленьких выборок. Результаты полногеномного анализа ассоциаций GWAS, определившие HLA-генам роль основных генетических маркеров наследственной предрасположенности к целиакии, привели к подробному их изучению для оптимального использования в диагностике целиакии, особенно для ее субклинических форм, что сегодня представляется особенно важным. Также отмечается большое диагностическое значение HLA-генов для групп риска, проведения дифференциального обследования, когда возникают большие сомнения при вынесении окончательного диагноза. Отсутствие в отечественной литературе статистически значимых результатов исследований по диагностическим характеристикам HLA-генов, рекомендаций по оптимальному их использованию, приводят к закономерному игнорированию HLA-генов как маркеров целиакии [66]. Представляется актуальным и необходимым проведение генетических исследований в России с целью научного подтверждения необходимости, независимо от популяционных различий, участия HLA-генов в патогенезе целиакии, а также для оптимизации диагностики этого заболевания. 37 1.5.5. Роль тканевой трансглутаминазы в патогенезе целиакии Установлено, что для развития целиакии, помимо HLA-генов, необходимо обязательное участие фермента тканевой трансглутаминазы, TG2. Тканевая трансглутаминаза TG2 (ЕС 2.3.2.13) принадлежит к семейству структурно и функционально связанных ферментов, которые катализируют Са2+зависимое формирование внутри- и межмолекулярных белок-белковых перекрестно-поперечных Nε(γ-глутамил)-лизиновых изопептидных связей, инкорпорацию а глутаматные остатки, аминов, также дезаминируют трансформируя их в глутаминовую кислоту [158,233], что активно проявляется в патогенезе целиакии. Локализация TG2 может быть внутриклеточной (цитозоль, митохондрии, ядро) и внеклеточной [202]. Внутриклеточная локализация определяет функции TG2 как ко-рецептора адгезии, а внеклеточная - формирование внутри- и межмолекулярных белок-белковых перекрестно-поперечных Nε(γ-глутамил)лизиновых изопептидных связей [195,276], которые объясняют многофункциональность TG2, с возможностью участия в таких процессах, как: апоптоз, организация внеклеточного матрикса, клеточный цикл, процессы адгезии и ангиогенеза, клеточная поляризация и др. [251,261,356]. Доказано, что TG2 является единственным аутоантигеном, на который вырабатываются все известные сегодня аутоантитела целиакии, структурная идентичность которых была подтверждена проведенными исследованиями [142,188]. Известна также роль TG2 в дезаминировании пептидов глютена, благодаря которому происходит связывание экзогенных иммунодоминантных пептидов и последующее их представление Т-лимфоцитам, с дальнейшей продукцией специфичных антител [256]. Подробное изучение свойств и структуры тканевой трансглутаминазы, помогло установить антигенный эпитоп TG2, который, взаимодействуя с антителами, определяет специфические конформационные изменения в структуре TG2, способствующие активизации фермента [307]. Предполагают, что такие конформационные изменения в 38 структуре TG2, могут быть определяющими для развития патогенеза и аутоиммунного ответа при целиакии [180,192]. Проведенные научные исследования показали, что внеклеточная TG2 значительно активируется восстановительный определенной белок). конформации тиоредоксином Тиоредоксин TG2, (TRX, способствует уменьшающей окислительноформированию поперечно-перекрестную сшивающую активность TG2 и приводит к изменениям в организации межклеточного матрикса и адгезии. Установлено также, что антитела к тканевой трансглутаминазе могут способствовать образованию активированных кластеров интегрина с увеличением экспрессии 1-интегрина. Эти процессы приводят к запуску RhoA сигнального пути, с последующей активацией транскрипционного фактора NF-κB и, как следствие, к экспрессии ядерных генов, обусловливающих изменения в клеточной поляризации и миграции, усиленной секреции хемокинов, цитокинов, ухудшению сосудистой проницаемости [194]. Таким образом, TG2 выполняет функцию не только главного аутоантигена, но и способствует формированию воспалительных процессов и характерных для целиакии изменений в слизистой оболочке тонкого кишечника. 1.6. Антитела как сывороточные маркеры целиакии 1.6.1. Антитела к глиадину: антиглиадиновые антитела (АГА) и антитела к дезаминированным пептидам глиадина (ДПГА) Антиглиадиновые антитела (АГА) относятся к самым давним антителам, которые были предложены для диагностики целиакии в 1972 году (Ferguson A and Carswell F, 1972) [156]. Установлено, что на активацию Т-клеток могут влиять различные эпитопы глиадина, однако эпитопы -фракций глиадина у больных целиакией встречаются намного чаще. Именно поэтому в качестве антигена была выбрана, как более специфичная, -фракция глиадина [313]. Измерение АГА проводилось разными методами (радиоиммунный, флюоресцентный, 39 электрофоретический) [345]. Однако, лучшие лабораторные характеристики были получены у иммуноферментного метода, который был предложен в 1983 году (O'Farrelly et al., 1983) и преимущественно используется в настоящее время [266,350]. Широкое использование этих антител для диагностики целиакии подтвердило независимое, не связанное с повреждением слизистой тонкого кишечника их появление в крови пациентов, например, у здоровых лиц, а также у пациентов с другими заболеваниями [293,199]: – аутоиммунные (синдром Сьегрена, ревматоидный артрит, пемфигоид, сахарный диабет 1типа, системная красная волчанка, саркоидоз) [206,287,248,105,222]; – постинфекционный синдром мальабсорбции, болезнь Крона, муковисцидоз, лактазная недостаточность, пищевая аллергия, атопическая экзема, которые сопровождаются желудочно-кишечными нарушениями [160,220,208]; – энтероколит, гастродуоденит, энтерит и др., протекающие с желудочнокишечным воспалением [310,161,226]; Ложноотрицательные результаты были зарегистрированы у пациентов с кишечной лимфомой, что связывают с низкой иммунной реактивностью при лимфоме [89,111] и у пациентов с атипичной или латентной целиакией [91]. Определены специфичность и чувствительность этого теста (87% и 73% соответственно), которые позволили не рекомендовать эти антитела для диагностики целиакии [83,179]. Однако, установленный факт более высокой чувствительности у детей до 18 месяцев (94-99%), который нашел объяснение в недостаточной выработке аутоантител в этой возрастной категории (12%) из-за неокончательного созревания компонентов системы комплемента, оправдывал активное использование АГА для диагностики целиакии в этой возрастной группе [61,213]. По данным Анциферовой О.В., 2014 г. выявление аутоантител (ТТА) у детей до 2 лет наблюдалось только в 0,09% случаев целиакии [3]. Несмотря на большую чувствительность, недостаточная специфичность АГА вызывала определенные трудности в диагностике целиакии у детей до 18 месяцев, особенно, когда возникала необходимость дифференциального диагноза, 40 например, между целиакией и неспецифической энтеропатией или инфекционным поражением слизистой В [186,102,238,213]. упомянутых исследованиях Анциферовой О.В. была показана неспецифичность антиглиадинолвых антител и подтверждено, что нарушение толерантности к глютену может встречаться при других заболеваниях тонкого кишечника [3]. Доказанная сегодня неспецифичность антиглиадиновых антител, определяет им роль дополнительных маркеров, предназначенных для выявления повреждений в СОТК и эффективности проводимого лечения [139,152]. Однако, в России антиглиадиновые антитела продолжают использоваться для диагностики целиакии во всех возрастных категориях, что не противоречит действующим сегодня Российским рекомендациям [6,8,65,59,67]. Поиски специфичности оптимальной антигенной антиглиадиновых детерминанты антител привели для к повышения использованию дезаминированных пептидов глиадина как нового эпитопа, который повышал аффинность связывания с антителами и значительно улучшал лабораторные характеристики теста [256,337,269,333]. В 2001 году (Aleanzi M, Demonte AM, et al, 2001) впервые были предложены антиглиадиновые антитела нового поколения (DGP, ДПГА), для определения которых в качестве антигена стали применять синтетические испытания дезаминированные новым тестом пептиды подтвердили глиадина его [75]. превосходство Проведенные (IgA-ДПГА- специфичность 90%), как диагностического, по сравнению с тестом для определения АГА. Предполагают, что выявленная высокая специфичность ДПГА связана с некоторым сходством дезаминированных пептидов с TG2-эпитопами [102,213,333]. Были проведены сравнительные исследования по изучению чувствительности ДПГА у взрослых и детей, которые подтвердили, что эти антитела могут успешно заменить АГА в возрастной группе до 18 месяцев [224,267,279]. В настоящее время изучается аминокислотная последовательность для формирования антигенной детерминанты дезаминированного пептида глиадина, c целью дальнейшего улучшения лабораторных характеристик теста по определению ДПГА [88]. В России подробное изучение антител к 41 дезаминированным пептидам началось сравнительно недавно (Вохмянина Н.В., 2012, Сабельникова Е.А., 2014), которое подтвердило высокие специфичность и чувствительность теста и показало их превосходство по сравнению с АГА [11]. Была определена высокая специфичность IgG-ДПГА, которая улучшает диагностику ассоциированного с целиакией селективного IgA-дефицита. Однако отсутствие в России стандартизованного протокола по диагностике целиакии до сих пор определяет не востребованность IgG-ДПГА для диагностики селективного IgA-дефицита у больных целиакии. 1.6.2. Аутоантитела к ретикулину (ARA, АРА), эндомизию (ЭМА) и тканевой трасглутаминазе (ТТА) Первые попытки определения аутоантител проводились с применением методов непрямой иммунофлюоресценции, где вместо субстратов использовались секционные тканевые срезы, по которым определяемые антитела получали свое название. Так, антиретикулиновые аутоантитела (ARA, АРА) были определены в 1971 году Seah и соавт. при инкубации сыворотки больных пациентов с секционными тканевыми срезами печени и почек крысы, в которых происходило специфичное связывание антител с ретикулином (белок ретикулярных волокон, по составу близкий к коллагену) [78]. Выявленное в ретикулине большое количество тканевой трансглутаминазы (ТG2) изменило представление об антигене [241]. Дальнейшее изучение и проведенные исследования продемонстрировали специфичное связывание моноклональных TG2-антител с вышеперечисленными субстратами, содержащими ретикулиновые волокна, что подтвердило роль TG2 как антигена для антиретикулиновых антител [255]. Антитела к ретикулину некоторое время являлись сывороточными маркерами целиакии и активно определялись у нелеченных пациентов методом непрямой флуоресценции с использованием печени и почки крысы как тканевых субстратов. Но выявленное несоответствие высокой специфичности (98.8%) и низкой чувствительности (71.2%, с разбросом 41-92%) теста по определению 42 антител к ретикулину и связанные с этим определенные трудности в диагностике, привели к поиску новых субстратов [317,296]. Антитела к эндомизию (ЭMA) были открыты в 1983 году Chorzelski и соавт., которые, изучая метод непрямой иммунофлюоресценции для применения в дерматологии, использовали криостатные срезы пищевода обезьяны в качестве субстрата для обнаружения циркулирующих аутоантител, формирующихся в коже и подкожных структурах [121]. Позже было замечено, что сывороточные антитела IgA-класса специфично связываются с подкожными волокнами ретикулина и эндомизием гладкомышечных клеток соединительной ткани у пациентов с герпетиформным дерматитом и целиакией, что стало определяющим для понимания важности связывания антител IgA-класса. Именно с тех пор антитела IgA-класса получили значимость специфичных антител, которые в настоящее время преимущественно используются для диагностики целиакии [118]. Были достигнуты высокие специфичность и чувствительность теста для определения эндомизийных антител, приближавшиеся к 100% (99%-100% и 93,5-95% соответственно) [327,296,346]. Однако, несмотря на диагностические достоинства, этот метод с использованием криостатных срезов пищевода обезьяны не находил широкого применения из-за этических проблем, а также высоких затрат, связанных с применением такого антигена. Проведенные исследования (Ladinser et al.1994) с хорошо развитым эндомизием в пупочном канатике человека, показали, что по специфичности и чувствительности этот тест не уступает методу с криостатными срезами пищевода обезьяны, что позволило широко использовать его при диагностике целиакии [212,353]. Практическое использование этого теста показало все-таки меньшую чувствительность (87.9%), оставив преимущество за эндомизием в криостатных срезах пищевода обезьяны [136]. Дальнейшее изучение выявило недостатки непрямого иммунофлюоресцентного метода для определения ЭМА – это субъективность при интерпретации и полуколичественная оценка результатов, выраженная в титрах (ступенчатое разведение образцов). 43 Продолжающиеся исследования, проводимые для совершенствования используемых субстратов, позволили немецкой группе ученых в 1997 году (Dieterich et al.) впервые выявлять антитела с применением нового, не тканевого субстрата, который был представлен в виде очищенной TG2 [142,188]. Эти антитела, по используемому субстрату, получили название антител к тканевой трансглутаминазе (tTG-ab, ТТА) и могли определяться доступным иммуноферментным методом, ИФА. Дальнейшие эксперименты показали разрушение антител к эндомизию при обработке сыворотки больных целиакией тканевой трансглутамизазой и убедительно продемонстрировали значение TG2 как эндомизийного аутоантигена, еще раз доказательно представив общность TG2-антигена для всех аутоантител целиакии и их структурную идентичность (Korponay-Szabo et al., 2000) [324]. Удобство и быстрота, объективность при получении результатов, приемлемая стоимость теста ИФА для определения ТТА хорошо подходили для проведения скрининговых исследований. Первые тесты по определению ТТА использовали TG2 из печени морской свинки. Однако недостаточная чувствительность теста (85.7%) показала необходимость использования нового, более специфичного антигена [79,270]. В настоящее время широко используется человеческая TG2 (рекомбинантная или очищенная эритроцитарная TG2), которая значительно повысила чувствительность теста (от 94.3% до 97%) и способствовала улучшению его диагностической эффективности [327,101,203,346]. Достигнутая чувствительность ТТА в настоящее время превосходит чувствительность ЭМА, но уступает по своей специфичности. Было установлено, что повышение ТТА может наблюдаться не только при целиакии, но и при таких заболеваниях, как псориаз, первичный билиарный цирроз печени, аутоиммунные, инфекционные заболевания и др. [129,157,93,232]. Недостаточную специфичность антител к тканевой трансглутаминазе объясняют повсеместной тканевой экспрессией фермента TG2 и его участием во многих важных биологических трансмембранная кератиноцитов, процессах клеточная стабилизация (клеточный трансдукция апоптоз, сигналов, внеклеточного ядерная и дифференцирование матрикса, формирование 44 цитоскелета и т.д.) [147]. Подробное изучение сывороточных маркеров выявило зависимость чувствительности тестов от степени поражения СОТК [336,84]. Эту закономерность объяснили проведенные исследования, которые показали, что отсутствие воспалительных (иммунных) процессов в СОТК, снижает выработку антител за счет низкой активности TG2 и является причиной ложноотрицательных результатов, например, при латентных формах и начальных стадиях развития целиакии. Как показали проведенные исследования, количество ложноотрицательных [182,126,271,331]. результатов Однако, может варьировать возможность получения от 6% до 22% ложноотрицательных результатов сывороточных маркеров при атрофии СОТК, может быть связана с селективным IgA-дефицитом, ошибочной постановкой диагноза (например, другие воспалительные заболеваниями кишечника), иммуносупрессорной терапией и представляет случайную редкость [133]. 1.7. Значение сывороточных маркеров для выявления целиакии В настоящее время определено назначение сывороточных маркеров, которые активно используют для диагностика целиакии, мониторировании эффективности и соблюдения диеты, формирования групп пациентов с целью дальнейшего обследования (проведение биопсии) и динамического наблюдения для вынесения диагноза при обязательном учете результатов обследования на сывороточные маркеры [87]. Однако, несмотря на диагностическую значимость сывороточных маркеров, были выявлены недостатки методов по их определению: 1. Присутствие элементов субъективности при проведении исследования (например, непрямой иммунофлюоресцентный метод обнаружения ЭМА, конечный результат которого зависит не только от квалификации специалиста, но и от точности разведения образца). 2. Недостаточная специфичность аутоантител, объясняющаяся поликлональными антителами, представленными в сывороточных образцах, 45 которые могут по-разному связываться с эпитопами TG2, что может быть причиной позитивного результата при других заболеваниях. 3. Зависимость результатов исследования от разных субстратов предполагает, что взаимодействия антигенных детерминант с антителами вызывает определенные конформационные изменения эпитопа, влияющие на аффинность и авидность связывания антител, что обеспечивает разные специфичность и чувствительность тестов [192]. 4. Прямая зависимость чувствительности серологических тестов от степени поражения слизистой тонкого кишечника, не позволяющая получать достоверные результаты на ранней стадии болезни и некоторых формах целиакии. Таким образом, несмотря на установленные преимущества широко применяемых в настоящее время для диагностики целиакии антител, они не обеспечивают выявление манифестныех форм, протекающих с незначительными изменениями в СОТК. Поэтому поиски новых маркеров и необходимость совершенствования диагностического подхода, изменяющего тактику выявления целиакии, продолжают оставаться актуальными. 1.8. Новые методы и маркеры в диагностике целиакии Дальнейшие разработки, связанные с поиском доступного и удобного субстрата, привели к новым методам детекции тканевых трансглутаминазных антител. Впервые был предложен иммунохроматографический метод определения антител в капиллярной крови пациента с использованием эндогенной тканевой трансглутаминазы как субстрата, получаемой при лизисе собственных эритроцитов пациента [125]. Этот метод, как POCT-тест (англ. point of care testing - проведение теста на месте оказания помощи) был предложен как скринирующий тест, предполагающий возможность постановки диагноза в кабинете врача. Принцип иммунохроматографического метода основывается на применении подвижных моноклональных мышиных антител, конъюгированных с коллоидным золотом (краситель), которые взаимодействуют с образовавшимся комплексом 46 антиген (эндогенная тканевая трансглутаминаза) и антитела, присутствующие в крови пациента. Образование такого комплекса обеспечивает накопление коньюгированных с коллоидным золотом антител и появлением индикаторной линии как маркера тканевых трансглутаминазных антител. Проведенные исследования показали хорошую специфичность и чувствительность метода (97%), а простота, надежность и быстрое получение результатов давали возможность снять подозрение на целиакию в кабинете врача и решить проблемы доступности мониторирования диетотерапии в домашних условиях [230,278]. Подробное изучение этого метода в России для использования его в диагностических целях было проведено в 2010 году (Вохмянина Н.В., 2010), которое выявило ряд существенных недостатков (недостаточная чувствительность, субъективность в интерпретации полученных результатов, необходимый опыт работы или профессиональное обучение), что определило ограничения в его широком использовании [13]. Как вариант иммунохроматографического экспресс-метода на основе латерального проточного иммуноанализа (ЛПИА, LFIA от англ. lateral-flow immunochromatographic assay) был предложен в 2012 (Bienvenu et al., 2012) для одновременного определения антител к дезаминированным пептидам глиадина (IgA, IgG) и общему IgA с целью исключения селективного IgA–дефицита, ассоциированного с целиакией [97]. Специфичность и чувствительность ЛПИА –теста для диагностики целиакии составили 89.2% (74.6-97.0) и 100% (63.1-100) соответственно [96]. Другой новый электрохимический метод, имеющий большую надежность в достоверности получаемых результатов, основан на иммуносенсорной технологии, с изменением физико-химических свойств мембраны или другого носителя, связанного с антителами или антигенами. Уменьшение мембранного потенциала, изменение оптических или химических свойств среды, прилегающей к носителю, выявляются с помощью специального электрода или оптического устройства и выражаются в виде электрического сигнала определения реакции антиген– антитело [298,247]. Полученная корреляция с иммуноферментным анализом, дает хорошие перспективы при внедрении этих тестов в практическую медицину 47 [200,268,7]. В России как электрохимический иммуносенсорный метод, так и ЛПИА применяются, в основном, для научных целей и пока не рассматриваются как перспективные методы в диагностике целиакии [1,47,48,57]. Для выявления атипичных и латентных форм, и особенно ранней целиакии, был предложен метод для определения антител в СОТК [85]. Этому способствовало выявление антител в экстраинтестинальных тканях у больных целиакией (печень, аппендикс, мезентеральный лимфатический узел, почки, скелетная мускулатура), что определило патогенетическую роль гуморального иммунитета и мультисистемность поражения при целиакии [311]. Кроме этого, было зарегистрировано субэпителиальное IgA-депонирование в биопсийных образцах тонкой кишки у пациентов с целиакией еще до развития в ней характерных гистологических изменений. Проведенные наблюдения за пациентами с субэпителиальным IgA-депонированием в слизистой тонкой кишки показали, что спустя некоторое время у них развилась активная целиакия [311,188,14]. Таким образом, полученные результаты показали возможность использования депозитных комплексов для диагностики целиакии, протекающей без выраженных изменениях в СОТК, а также ранней целиакии, что является важным и актуальным для диагностики целиакии [325]. Однако инвазивная процедура забора материала, а также выявленные недостатки в виде недостаточной чувствительности и специфичности метода не дают возможности для широкого его применения [14]. Проведенный анализ по исследованиям субэпителиальных депозитов (Simona Gatti et.al.,2014), показал, что хотя они и обнаруживаются у 68%-100% больных целиакией, но не являются прогностическими маркерами [168]. Много обсуждений было связано с открытием актина как нового маркера для диагностики целиакии. Актин — глобулярный белок, входит в структуру ворсинок СОТК и опосредуют их сокращение [58]. Изучение антител к актину выявили у них преимущества по сравнению с другими сывороточными маркерами целиакии, показав, что присутствие антител к актину всегда сопровождает характерные для целиакии изменения в слизистой тонкого кишечника. Были 48 выдвинуты предложения о возможности замены биопсии, как инвазивной процедуры, на менее травматичную процедуру забора крови для определения антител к актину, особенно в случаях, когда проведение биопсии было затруднительно [133,171,299]. Однако полученные результаты требуют дальнейшего изучения и подтверждения. Совсем недавно (Heather J Galipeau et.al., 2014) было заявлено еще об одном маркере целиакии – элафине как эпителиального ингибитора протеиназ (эластазаспецифический ингибитор, ЭСИ) [166]. Предполагается, что он играет важную роль в регуляции процессов воспаления и в защите от тканевых повреждений в многослойном эпителии. Элафин, признанный субстрат для тканевой трансглутаминазы, взаимодействуя с ней, снижает ее активность, способствуя количественному уменьшению дезаминированных пептидов глютена у больных целиакией и, как следствие, снижающий воспалительные процессы в кишечнике. В экспериментальных исследованиях элафин был введен в Lactococcus lactis и Lactobacillus casei - две пищевые бактерии, которые содержатся в молочных продуктах. Действие элафина было протестировано на подопытных мышах и образцах тканей человека в лабораторных условиях и выявлены значительные улучшения в поражённых тканях стенок кишечника. Снижение активности воспалительных процессов приводит к восстановлению барьерной функции кишечника при целиакии. [166,301]. Таким образом, значение новых методов и маркеров продолжает изучаться для возможности их эффективного использования в диагностике и лечении целиакии. 1.9. Неспецифические (дополнительные) маркеры целиакии В настоящее время для диагностики целиакии наряду со специфическими маркерами широко применяются и неспецифические (дополнительные) маркеры. Использование неспецифических оптимизацию лечения маркеров глютеновой прежде энтеропатии, всего что направлено повышает на его 49 эффективность. Именно поэтому неспецифическим маркерам уделяется много внимания, они постоянно изучаются, и их перечень регулярно обновляется. Широкое применение получили неспецифические маркеры, определяющие липидные нарушения при целиакии, прежде всего отношение фекальной экскреции неэстерифицированных жирных кислот (НЭЖК) к триглицеридам (ТГ). Было показано, что данный коэффициент является высокоинформативным и нарушается в 100% случаев в острую фазу целиакии [5]. В связи с накоплением при развитии глютеновой энтеропатии высокореакционных радикалов, активизирующих перекисное окисление липидов, определение показателей активности перекисного окисления липидов (гидроперекиси жирных кислот, малоновый диальдегид и др.), а также определение обратной закономерности между активностью перекисного окисления липидов и абсорбционной способностью тонкой кишки считают оправданным [35]. Завершают список неспецифических маркеров нарушений липидного обмена холестерин, липопротеиды высокой и низкой плотности [119], а также карнитин, как важный кофактор метаболизма жирных кислот [211]. Его интегральное воздействие на организм проявляется в уменьшении оксидативного стресса и ингибировании апоптоза, стабилизации мембраны клеток путем нормализации уровня Ca2+, стимуляции иммунного ответа и уменьшение активности воспалительных цитокинов, активизации G-протеинов, определении возможности проведения нервных импульсов за счет изменения химического состава миелиновой оболочки и многое другое. Установлено значение его дефицита для формирования серьезности патологических нарушений в организме человека, таких как: анорексия, энцефалопатия, неврологические нарушения, повышенная утомляемость, кардиомиопатия, мышечные атрофия и дистрофия и т.п., которые часто сопровождают клинические проявления целиакии [216]. Популярные неспецифические показатели, такие как фекальные химотрипсин и эластаза, также помогают определить нарушения в ферментной экскреции тонкого кишечника [219,144]. Недавнее изучение фермента тонкого кишечника – дипептидилпептидазы (DPP IV) выявило строгую корреляцию 50 между снижением активности DPP IV и степенью повреждения слизистой тонкого кишечника [135]. Положительная динамика в показателях маркеров, определяющих степень повреждения слизистой оболочки тонкого кишечника, является важной, так как помогает судить об эффективности проводимого лечения. Исследование эндокринных нарушений при целиакии позволило использовать такие маркеры, как пролактин, лептин, которые, как было доказано, показывают опосредованное иммуномодуляторное воздействие на клеточный рост, воспроизводство и осморегуляцию, которые меняются при целиакии [131,134,98]. Определение тромбоцитоза как маркера аутоиммунных процессов и увеличенного риска злокачественного образования является важным для целиакии [277,343,275]. Такое частое проявление целиакии, как анемии, нашло свое подтверждение в доступном определении трансферрина как показателя железодефицитной анемии [326]. Много исследований направлено на изучение повышенной проницаемости слизистой тонкого кишечника, характерной для целиакии. Использование нагрузочных тестов с маннитолом, лактулозой, простота выполнения которых, а также безобидность используемых сахаров для организма, экономическая доступность определили им широкое применение, но недостаточная специфичность не позволяет использовать их как самостоятельные тесты [300]. Сравнительно недавно введен нагрузочный тест с сахарозой для определения повышенной проницаемости слизистой желудка при лимфоцитарном гастрите, как частом проявлении целиакии [342]. Нельзя не отметить такой важный и в то же время простой и доступный дополнительный маркер для диагностики целиакии, как копрограмма, где диагностическим критерием является стеаторея. В настоящее время предполагается, что появление стеатореи связано с масштабностью и тяжестью поражения слизистой тонкого кишечника. Нарушенные процессы пищеварения в копрограмме при целиакии представлены, помимо мыл и жирных кислот, большим количеством внеклеточного крахмала, который является косвенным показателем нарушения микробного пейзажа кишечника [46,259]. Заслуживает внимание дополнительный маркер целиакии кальпротектин, который является 51 продуктом нейтрофильных гранулоцитов, обнаружение его в кале указывает на воспаление слизистой оболочки кишечника. Метод дает хорошую корреляцию с воспалительным процессом в кишечнике (95%), но, к сожалению, не позволяет дифференцировать целиакию с воспалительными болезнями кишечника [106]. В конце XX столетия большое внимание уделялось оксиду азота (NO) в диагностике целиакии. Это находило объяснение в его активном участии в перекисном окислении липидов [56]. Однако, несмотря на неспецифичность, оксид азота до сих пор используется как маркер целиакии для оценки тяжести поражения слизистой тонкого кишечника как показателя эффективности проводимого лечения [335]. Изучение дендритных клеток, которые вовлечены в патогенез целиакии, выявило значительное и достоверное снижение всей популяции дендритных клеток, что послужило поводом считать этот показатель периферической крови как весомый дополнительный маркер изменения иммунного статуса у больных целиакией [193]. В настоящее время большое внимание уделяется значению кишечной микробиоты и изменению кишечного биоценоза у больных целиакией. Показано, что изменение биоценоза у больных целиакией способствует активному воспалению СОТК [104,62,39]. Ключевым моментом в исследованиях микробиоты явилось ее значение как пускового фактора для нарушения толерантности к глютену. Предполагается, что оценка биоценоза и профилактическое применение пробиотиков, позволит предотвратить развитие толерантности к глютену [28]. Таким образом, неспецифические маркеры целиакии оптимально дополняют диагностику целиакии, позволяя определить степень тяжести поражения слизистой тонкого кишечника, эффективность проводимого лечения, необходимость повторного проведения биопсии. 52 1.10. Морфологические изменения слизистой оболочки тонкого кишечника и гистологическая классификация целиакии Гистологические изменения в слизистой оболочке тонкого кишечника в настоящее время активно используются для диагностики целиакии [62]. Характерными особенностями поражения СОТК у больных с нелеченой целиакией являются атрофия ворсинок, гипертрофия крипт, выраженная инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки мононуклеарными клетками, структурные изменения в клетках кишечного эпителия. При этом в составе кишечного эпителия значительно увеличивается число межэпителиальных лимфоцитов (МЭЛ), которое, как правило, превышает 40% и может достигать 100% и более [87,32]. Степень выраженности гистологических изменений СОТК принято классифицировать в соответствии с морфологическими критериями, впервые установленными в 1992 году для СОТК M.N. Marsh [246] и модифицированной в 1999 году Oberhuber G., которая предусматривает определение количества межэпителиальных лимфоцитов (в пересчете на 100 эпителиальных клеток), а также дает более детальную градацию III стадии [265]. Используемая в настоящее время версия классификации Marsh - Oberhuber включает: Marsh I. Характеризуется увеличением МЭЛ, а также плазматических клеток и лимфоцитов (в основном за счет гамма/дельта-лимфоцитов) в собственной пластинке СОТК (инфильтративная стадия). Эти изменения являются ранним, но недостаточно специфичным признаком целиакии. В дальнейшем они всегда сопровождают последующие стадии целиакии. Marsh II. Первым проявлением гиперрегенераторной атрофии слизистой оболочки тонкой кишки является удлинение крипт (гиперпластическая стадия целиакии). На данной стадии соотношение длины ворсинки к глубине крипты уменьшается (в норме не менее 2:1) и составляет 1:3-1:5. При этом параллельно с удлинением крипт происходит некоторое расширение ворсинок с проявлениями атрофии. По мнению некоторых авторов, увеличение глубины крипт не объясняет 53 гиперрегенераторную атрофию СОТК, а является способом защиты кишечного эпителия от воздействия глютеном [33]. Marsh III. В последующих, атрофических стадиях целиакии происходит постепенное укорочение и расширение ворсинок с умеренной их атрофией и параллельным углублением крипт (Marsh IIIа), с дальнейшей выраженной атрофией ворсинок (Marsh IIIв), вплоть до их полного исчезновения (Marsh IIIс). В таких случаях строение слизистой оболочки тонкой кишки напоминает толстую кишку. Характерными поверхностного для эпителия, этой связанные стадии с его также являются повреждением и изменения попыткой регенерации [15,4]. Marsh IV (гипопластическая атрофия) – необратимая тотальная атрофия ворсинок с резким истончением слизистой оболочки тонкой кишки. В 2005 году итальянскими учеными G.R. Corazza, V.Villanacci была предложена более удобная гистологическая классификация целиакии, в которой выделяют всего два типа повреждений СОТК: не атрофический (тип А) и атрофический (тип В1 и В2). Не атрофический тип по данной классификации соответствует 1 и 2 стадии по Marsh-Oberhuber, при соотношении ворсин/крипты 3:1. Атрофический тип В1 включает стадии Marsh IIIа и Marsh IIIв, при соотношении ворсин/крипты 1:3, тип В2 - Marsh IIIс, при соотношении ворсин/крипты 0 [128]. В 2006 году в России была предложена гистологическая классификация целиакии, основанная на морфометрических критериях (Лысиков Ю.А., 2006), таблица 1.1 [32,33]. При изучении структурных изменений СОТК было замечено, что степень выраженности атрофии ворсинок уменьшается в дистальном направлении. Это подтвердил факт полной атрофии ворсинок в двенадцатиперстной кишке с возможным одновременным сочетанием нормальной структуры ворсинок в подвздошной кишке. Степень же проксимального поражения в значительной степени зависит от тяжести заболевания. 54 Таблица 1.1 Модифицированная морфологическая классификация целиакии [32] Проксимальное поражение СОТК может быть очень умеренным при бессимптомных формах с незначительными или даже гистологически не выявляемыми изменениями в средней части тощей кишки, что существенно при доминировании скрытых (латентных) и атипичных формах целиакии. Таким образом, отчетливый проксимально-дистальный градиент токсического действия глютена может определять различную степень выраженности синдрома мальабсорбции у разных больных целиакией, находящихся на одной и той же стадии болезни. В связи с этим рекомендовано проводить биопсию с забором нескольких образцов [23,272]. По рекомендациям Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ, 2013) забор биоптатов (от четырех до шести) необходимо проводить из двенадцатиперстной кишки (ДПК), дистальнее фатерова соска (3-4 биоптата) и один из луковицы ДПК [87]. По мнению других специалистов, оптимальным для получения адекватных результатов, являются биоптаты, полученные из ДПК в области фатерова соска и тощей кишки в области связки Трейтца [32,43]. Подробное изучение гистологических характеристик выявило серьезные диагностические недостатки дуоденальной биопсии, которые не позволяют в 55 настоящее время относить ее к диагностическим стандартам целиакии со 100% специфичностью. Так, увеличение МЭЛ с различной степенью атрофии СОТК может наблюдаться при белок-индуцированной энтеропатии у детей (коровье молоко, соя, рыба, курица), аутоиммунной энтеропатии, тропической спру, лямблиозе ДПК, микроспоридиозе, Т-клеточной лимфоме, ассоциированной с энтеропатией [304,116]. Атрофия слизистой оболочки тощей кишки и дистальных отделов ДПК встречается при общем вариабельном иммунодефиците, болезни Уиппла, эозинофильном гастроэнтерите, аутоиммунной энтеропатии [250]. Согласно литературным данным, повреждения СОТК, соответствующие Marsh I, могут сопровождать болезнь Крона, употребление нестероидных противовоспалительных средств, лимфоцитарный или коллагенозный колит, аутоиммунные заболевания (тиреоидит Хашимото, рассеянный склероз, псориаз, ревматоидный артрит), тропическую спру, синдром избыточного роста бактерий и только в 2–43% правильно диагностировать ранние проявления целиакии [15,116]. Для повышения достоверности морфологических изменений СОТК были сформированы условия, выполнение которых обеспечивало надежность постановки диагноза. Это - прежде всего взятие нужного количества биоптатов СОТК (не менее четырех), соблюдение качества образцов (получение правильно ориентированных гистологических препаратов) и должная их обработка, необходимость сопоставления морфометрических данных с установленными референсными пределами. Однако соблюдение перечисленных условий пока не приносит значимых результатов из-за имеющихся существенных недостатков, таких, как: субъективная интерпретация гистологических изменений СОТК; разная степень ее повреждения (проксимально-дистальный градиент токсического действия глютена) и зависимость проксимального поражения СОТК от тяжести течения заболевания [32,87,116,15]. При диагностике инфильтративной стадии, когда отсутствуют другие гистологические характеристики, рекомендовано проведение иммуногистохимического исследования для идентификации /-рецепторов на поверхности кишечного эпителия. Было установлено, что /-Т-клетки при 56 целиакии составляют 20-30% от общего количества МЭЛ, в то время как в СОТК без глютенового повреждения всего 2-3%. Однако, использование этой техники лимитируется формалиновой и парафиновой фиксациями. Предпринимаемые попытки повысить успех морфологической диагностики определили использование капсульной эндоскопия (CE, КЭ), которая показала возможность достаточного увеличения для проведения подробного анализа и изучения морфофункциональных изменений СОТК, с обзором всей слизистой тонкого кишечника, получения высококачественных изображений, что также способствует своевременному выявлению онкологических осложнений целиакии. Капсульная эндоскопия определила 100% специфичность и 93% чувствительность и особенно рекомендована пациентам, которые не могут проводить ЭФГДС [162,74,43]. Таким образом, гистологические изменения СОТК при целиакии в настоящее время требуют дальнейшего совершенствования морфологических маркеров с целью повышения их диагностической значимости. 1.11. Диагностические критерии целиакии Стандартизация и прогрессивное развитие диагностики целиакии, как детского заболевания, произошло после принятия в 1969 году Европейским обществом педиатрической гастроэнтерологии и питания (ESPGAN, European Society for Pediatric Gastroenterology and Nutrition) первых стандартов по диагностике целиакии, которые включали только гистологические изменения СОТК, определяющие морфологический этап как обязательный «золотой» стандарт диагностики целиакии. Диагностический протокол включал проведение трех кишечных биопсий для диагностики целиакии (в начале заболевания, после начала безглютеновой диеты и проведения провокации) [250]. Доминирование атипичных форм целиакии вместе с широким использованием сывороточных маркеров привели к пересмотру ESPGHAN (Европейское общество педиатрической гастроэнтерологии, гепатологии и питания, European Society for 57 Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition) в 1990 году диагностических критериев и принятию нового протокола, с включением сывороточных маркеров [288]. Продолжающееся изучение эпидемиологии, патогенеза и лабораторных маркеров, способствовало развитию новых направлений в диагностике целиакии, которые нашли свое отражение в новом диагностическом подходе, разработанном на большом научно-практическом материале спустя 20 лет, в 2012 году [185]. Для взрослой категории пациентов в 2004 году национальным институтом здоровья США был принят консенсус по целиакии. В 2005 году Всемирная организация гастроэнтерологов (ВОГ, WGO-OMGE), учитывая данные консенсуса, опубликовала практическое руководство по диагностике и лечению целиакии [86,263], в котором были представлены эпидемиология, формы, группы риска и диагностические критерии целиакии. В 2013 году Американская коллегия гастроэнтерологов (ACG, The American College of Gastroenterology), а также Всемирная организация гастроэнтерологов обновили практическое руководство и рекомендации по диагностике и лечению целиакии [87,292]. Согласно алгоритму обследования ESPGHAN для детской популяции выделены два протокола обследования. Протокол обследования для симптоматических пациентов целиакии начинается с IgA-ТТА + общий сывороточный IgA (для исключения селективного IgA-дефицита, как альтернатива может использоваться IgG-ТТА или IgG-ДПГА). При достижении у пациента уровня IgA-ТТА, соответствующего 100% предсказательной ценности положительного результата и превышающей референтный предел для данного теста в десять раз, биопсия не проводится, что значительно сокращает время обследования и позволяет не проводить ЭФГДС. Для отрицания диагноза рекомендуется проведение HLA-генотипирования и выполнение ЭМА-теста, как подтверждающего теста. Однако достижение 100% предсказательной ценности положительного результата не может быть выполнено при диагностике малосимптомных и бессимптомных форм целиакии из-за зависимости чувствительности диагностического теста от степени поражения СОТК. В связи с этим для выявления этих форм был предложен другой протокол обследования с 58 учетом превышения референтного предела IgA-ТТА в три раза. Этот протокол начинается с HLA-теста, который используется как скринирующий тест. Отсутствие HLA-DQ2 и HLA-DQ8 молекул у пациента определяет отрицание целиакии без дальнейшего обследования. Наличие HLA-DQ2 и HLADQ8 молекул рекомендует определение IgA-ТТА-теста. Достижение уровня ТТА, превышающего референтный предел для данного теста в три раза, предполагает проведение ЭФГДС, при получении других результатов – используется ЭМА как подтверждающий тест и биопсия при положительном значении ЭМА [185]. Единый протокол для взрослых и детей был представлен Американской коллегией гастроэнтерологов (ACG) и Всемирной организацией гастроэнтерологов (WGO), которые разделили пациентов на две группы: с высокой и низкой вероятностью развития целиакии. По алгоритму ACG для группы с высокой вероятностью развития целиакии предусматривается одновременное определение сывороточного теста (IgA-ТТА) и биопсии. Диагноз выставлялся в случае двух положительных результатов (биопсия + ТТА) и не рассматривается при двух отрицательных результатах. При получении разных результатов – рекомендовано проведение HLA-генотипирования для отрицания целиакии при отсутствии HLADQ2 и HLA-DQ8 молекул. В группах с низкой вероятностью целиакии предусматривается сначала выполнение сывороточного теста (IgA-ТТА), с последующим взятием биоптатов СОТК в случае превышения референтного предела для ТТА-теста. При отрицательном результате ТТА-теста и исключении селективного IgA-дефицита диагноз целиакия не выставляется. Для исключения разночтений полученных результатов предложены рекомендации, согласно которым в случае отрицательных результатов биопсии и сывороточных маркеров – целиакия исключена, гистоморфометрические в случае показатели положительных соответствуют – целиакия. целиакии, а Если уровень сывороточных маркеров укладывался в референтные пределы – выполнение HLAгенотипирования. Если уровень сывороточных маркеров превышает референтный предел, а гистоморфометрические показатели не соответствуют целиакии – наблюдение за пациентом и повторное взятие биоптатов через 1-2 года. 59 Алгоритм Всемирной организации гастроэнтерологов для группы с высокой вероятностью развития целиакии начинается с определения IgA-ТТА (IgA-ЭМА) + IgG-ДПГА + биопсия. Для группы с низкой вероятностью развития целиакии сначала выполняются IgA-ТТА (IgA-ЭМА) + IgG-ДПГА и только в случае положительных результатов двух или одного показателя проводится биопсия. Рекомендации по интерпретации полученных результатов даны такие же, как у Американской коллегии гастроэнтерологов (изложены выше) [87,292]. Анализ изложенных протоколов обследования показал, что ESPGHAN максимально уменьшает использование биопсии для диагностики целиакии, с акцентом на 100% предсказательную ценность положительного результата IgAТТА, в то время как Американская коллегия гастроэнтерологов и Всемирная организация гастроэнтерологов рекомендуют проведение биопсии для всех пациентов как подтверждающий тест. Кроме этого, прослеживается разное отношение к ЭМА-тесту. Несмотря на высокую специфичность, не предусматривается использование ЭМА-теста (ACG) или рекомендуется его проведение только в экспертных лабораториях (WGO) из-за субъективности при интерпретации результатов, в то время как ESPGHAN широко использует его как подтверждающий тест. Кроме этого, для диагностики селективного IgA-дефицита в рекомендациях ESPGHAN, используется общий сывороточный IgA, в то время как в рекомендациях WGO - IgG-ДПГА для всех возрастных категорий, ACG – использование IgG-ДПГА предусмотрено для пациентов младше двух лет. Таким образом, анализ принятых зарубежных практических руководств показал отсутствие единой диагностической стратегии для обследования пациентов и разную оценку диагностических возможностей сывороточных маркеров целиакии. В России первые стандарты (протоколы) по диагностике и лечению болезней органов пищеварения, в том числе целиакии, были приняты в 1998 году [60]. Рабочие протоколы и рекомендации для диагностики целиакии у детей в Санкт-Петербурге и Москве были опубликованы в 2010 году [6,65]. 60 В 2014 году были приняты Национальные рекомендации по диагностике и лечению целиакии взрослых, в 2015 году утверждены Федеральные клинические рекомендации по оказанию медицинской помощи детям с целиакией [53,64]. Рекомендуемые Федеральными клиническими рекомендациями по оказанию медицинской помощи детям с целиакией протоколы ESPGHAN не адаптированы к отечественным лабораторным тестам, которые отличаются от зарубежных, другими операционными характеристиками и верхним пределом нормы, что определяет другое превышение верхнего предела референтного интервала, как следствие, диагностические ошибки. Все перечисленные практические рекомендации, к сожалению, не обеспечивают диагностическую ясность для выявления манифестных форм целиакии. Не изложены диагностическая информативность лабораторных тестов, не представлено их оптимизированное и комплексное использование в виде алгоритма обследования и не сформулированы методические решения. В связи с этим по-прежнему продолжает оставаться проблемным и спорным своевременное выявление целиакии, мониторинг диетотерапии и, как следствие, минимизация осложнений. 1.12. Осложнения целиакии Многочисленные целиакии, могут иммунные приводить к нарушения, развитию сопровождающие ассоциированных с развитие целиакией заболеваний, а также закономерно влиять на развитие таких осложнений, которые определяют риск инвалидизации и летального исхода [174,250]. Коллагенозная спру. Заболевание тонкой кишки, характеризующееся субэпителиальным отложением коллагена, атрофией ворсинок и клинической картиной тяжелого синдрома мальабсорбции. Коллагенозная спру считается осложнением целиакии, но не исключено, что данное заболевание может иметь самостоятельный характер и развиваться при отсутствии целиакии. В редких случаях коллагенозная энтеропатия может отвечать на аглютеновое питание, более характерным считается резистентность к диете и персистирование как 61 клинической симптоматики, так и морфологических изменений. Считается, что депозиты коллагена, обнаруживаемые в СОТК являются паранеопластическим морфологическим маркером, а также могут сопровождать развитие Т-клеточной лимфомы. Стоит отметить, что часто коллагенозную спру принимают за рефрактерную форму целиакии, что требует обязательного проведения дифференциальной диагностики [163,164]. Язвенный еюноилеит. Осложнение целиакии, характеризующееся наличием множественных хронических язв в тонкой кишке. Клинически развитие язвенного еюноилеита характеризуется значительным ухудшением в состоянии пациента (хроническая диарея, боль в животе, снижение веса), возникающие без видимой причины. При рентгеноконтрастном исследовании тонкой кишки в пользу данного осложнения свидетельствуют сужение тонкого кишечника, сглаживание рельефа слизистой оболочки, появление стриктур. Заболевание может осложняться развитием тонкокишечной непроходимостью или перфорацией кишки. Язвенный еюноилеит часто ассоциируется с Т-клеточной лимфомой кишечника, а также может имитировать болезнь Крона. Рекомендована капсульная эндоскопия для подробного изучения повреждений кишечника [223,303]. Злокачественные опухоли. Установлено, что риск развития онкологических заболеваний у больных целиакией увеличен в два раза по сравнению со здоровой популяцией. При целиакии наблюдается повышение риска развития аденокарциномы тонкой кишки [183]. Проведенные в Финляндии исследования за десять лет (2002 - 2011 гг.) показали, что стандартизованное отношение заболеваемости (SIR- standardized incidence ratio или отношение наблюдаемого числа заболеваемости к ожидаемому) было увеличено для неходжкинской лимфомы, раке тонкой и толстой кишки, базалиомы кожи у больных целиакией. Кроме этого, это же отношение было увеличено для пациентов с целиакией, болеющих больше пяти лет. Показано, что своевременное выявление целиакии и переход на безглютеновую диету снижает риск развития онкологических заболеваний до популяционных показателей [187]. 62 Классическим представителем злокачественной опухоли, развивающейся при целиакии, является лимфома тонкой кишки – Т-клеточная лимфома, ассоциированная с энтеропатией. Ее клинические признаки обычно появляются в возрасте старше 60 лет и заключаются в возобновлении диареи, абдоминальной боли и потери веса. Опухоль обычно не поддается химиотерапевтическому лечению и быстро приводит к летальному исходу. Опубликованы клинические случаи развития Т-клеточных лимфом у больных с бессимптомной (молчащей) целиакией, которым долгое время не был поставлен диагноз «целиакия» [312,99]. Целиакийный криз. Это редкое осложнение целиакии, встречающиеся преимущественно у детей до 2 лет и характеризующиеся острым развитием профузной диареи с дегидратацией, гипокалиемией, гипопротеинемией, ацидозом. Описаны случаи возникновения этого осложнения у взрослых с ранее не диагностированной целиакией. Своевременное назначение аглютеновой диеты, как правило, приводит к быстрому улучшению состояния [178]. Рефрактерная целиакия. Отличается постоянством клинической симптоматики и отклонениями в лабораторных маркерах, несмотря на строгое соблюдение безглютеновой диеты. В настоящее время установлено, что рефрактерная целиакия встречается у 10% больных глютеновой энтеропатией, являясь ее осложнением. Различают два типа рефрактерной целиакии. Пациенты с первым типом имеют более благоприятное течение при использовании иммуносупрессивной терапии. Второй тип рефрактерной целиакии имеет неблагоприятный прогноз и связан с формированием аберрантного фенотипа у межэпителиальных которые помогают лимфоцитов. Разработаны идентифицировать тип диагностические критерии, рефрактерной целиакии. Характеризуется прогрессированием клинической симптоматики и развитием лимфом [341,264]. 63 1.13. Реабилитация больных целиакией Реабилитация больных целиакией связана с эффективным лечением, способствующим раннему возвращению больных к активной трудовой и профессиональной деятельности. Для больных целиакией реабилитация связана с безглютеновой диетой (БГД), своевременное назначение которой предотвращает развитие осложнений и способствует нормализации клинического состояния пациентов. В тоже время, переход на БГД снижает качество жизни, связанное с необходимостью строгого и пожизненного соблюдения БГД, постоянным подбором продуктов с допустимым количеством глютена, их дороговизной. В России к этим проблемам добавляются отсутствие санаторно-курортного лечения и организации питания в школах и детских садах. Нельзя не упомянуть социально-экономические проблемы, особенно для развивающихся стран, которые отражаются на возможности строго соблюдения БГД. До 2008 года по рекомендации комиссии по организации питания и сельского хозяйства ВОЗ (Всемирная Организация здравоохранения,) безглютеновые продукты должны были содержать не более 200 ppm (partition per million=0,00001%) на 1кг глютена [40]. С 2008 года содержание глютена в пищевых продуктах было пересмотрено и в соответствии с международным стандартом, регламентирующим качество продуктов специализированного питания (CODEX STAN 118-1979, ALINORM 08/31/26 para 64, appendix III, 2008), безглютеновые продукты питания на настоящий момент не должны содержать более чем 20мг/кг глютена [124]. Однако, допустимое увеличение содержания глютена в пищевых продуктах не улучшило их качество по отношению к глютену и проблема «чистых» безглютеновых продуктов пока остается [52]. Опросы пациентов, показали, что многие из них нарушают БГД. Так, согласие больных точно следовать БГД составило от 23 до 80%. Одной из причин нарушения БГД, является отсутствие быстрого ухудшения после её нарушения [289,313,333,1,309]. Сюда же можно отнести клиническую толерантность к глютену (например, бессимптомная форма), несмотря на присутствие характерных изменений в СОТК. Было 64 замечено, что более тщательно соблюдают БГД больные, с установленным в детстве диагнозом и у которых целиакия протекала тяжело, с выраженными клиническими проявлениями [1,309]. Проблемы социально-правовой, медикореабилитационной, финансовой помощи помогают решать общества больных целиакией, созданные в Москве, Санкт-Петербурге, Екатеринбурге, которые проводят большую работу по адаптации больных целиакией, формированию мотивации для соблюдения БГД. Необходимость введения безопасного альтеративного БГД лечения, привело к разработке новых лечебных подходов, направленных на ингибирование основных этапов патогенеза, влияющих на активизацию Т-лимфоцитов. Изучается возможность селекции определенных сортов пшеницы без содержания токсичных фракций глютена и подбор определенных сортов овса, которые смогли бы решить проблему как сбалансированности в питании, так и социальной адаптации у больных целиакией. Как одно из направлений, разрабатывается ферментная терапия для полной деградации глютена, не предусматривающая образование его иммуногенных пептидов. Протеолиз глютена в организме человека осуществляется ферментом пролилэндопептидазой, который оказывается несостоятельным у больных целиакией. Пролилэндопептидаза имеет свой рН-оптимум, несовместимый с рН желудка человека, что приводит при пероральном применении к деградации этого фермента. Как альтернативный ферментный вариант (пролилэндопептидаза предлагаются Flavobacterium бактериальные meningosepticum и ферменты пролилпротеаза Aspergillus niger), способствующие полному перевариванию глютена [232,172]. Другие терапевтические подходы включают непосредственное блокирование глютен-реактивных T–клеток. Например, трансаминирование глютеновых пептидов в пшеничной муке с помощью микробной трансглутаминазы и лизинметилового эфира как аминодонора, может привести к образованию другой аминокислотной последовательности в пептидах глютена (вместо глутамина – лизин) и не вызывать активацию Т-клеток. Сегодня доказано вовлечение кишечных глиальных клеток (EGC) в патогенез воспалительных 65 заболеваний кишечника, в том числе и целиакии, связанное с повреждением СОТК. Активация кишечных глиальных клеток приводит к экспрессии глиального нейротрофического фактора (GDNF), регулирующего у больных целиакией апоптоз энтероцитов и белка S100B, вовлеченного в трансдукцию сигналов, контролирующих активность ферментов оксидативного стресса. Рассматривается, как эффективный подход к лечению больных, возможность ингибирования ИЛ-15, вызывающего безудержную цитотоксическую активацию МЭЛ с повреждением СОТК. Установлено, что ИЛ-15 также способствует понижению активности рецептора трансформирующего ростового фактора бета (ТРФ-бета), активирующего путем фосфорилирования такие цитоплазматические медиаторы, как белки SMAD [354,190]. Предлагаемые новые альтернативные методы лечения больных целиакией требуют дальнейшего тщательного анализа и всестороннего изучения во избежание опасности появления новых, неизвестных форм целиакии. 1.14. Заключение по литературному обзору Установленные механизмы патогенеза целиакии показали необходимость вовлечения глютена, тканевой трансглутаминазы и основных HLA-генов в развитие целиакии. Их взаимодействие определяет формирование антител и повреждение СОТК. Именно поэтому антитела к тканевой трансглутаминазе и к глиадину, а также морфологические характеристики СОТК, как лабораторные маркеры, должны быть положены в основу диагностики целиакии. Однако, показанное несовершенство всех известных на сегодня диагностических маркеров вместе с клинической многоликостью и большим количеством манифестных форм серьезно затрудняет выявление целиакии, которое приводит, как было показано, к тяжелым исходам при длительном отсутствии лечения. Проведенный литературный обзор позволил сформулировать цель и задачи настоящего диссертационного исследования. 66 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Материалы исследования Материалом для исследования служили образцы венозной крови, полученной у 1551 пациентов, проходивших обследование и лечение в государственном бюджетном профессионального образовательном образования, учреждении Санкт-Петербургском высшего педиатрическом медицинском университете (ГБОУ ВПО СПбГПМУ), в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования, Северо-Западном государственном медицинском университете им. И.И.Мечникова (ГБОУ ВПО СЗГМУ Петербургском государственном им. казенном И.И. Мечникова) учреждении и Санкт- здравоохранения «Диагностический (медико-генетический) центр» (СПб ГКУЗ МГЦ) в период с 2004 по 2013 гг. Клинические лабораторные исследования проводились на базе СПб ГКУЗ МГЦ. Использовались также результаты обследования 2491 пациентов для формирования группы популяционного контроля с целью обработки результатов HLA-генотипирования, которые были получены из опубликованных в открытой литературе данных. На использование результатов исследований популяционных групп получены разрешения авторов. Критерии включения в обследование: 1. Наличие у пациента кишечной клинической симптоматики неясного генеза (хроническая диарея, запор, изменение характера стула, боли в животе, увеличение окружности живота, газообразование, дефицит массы тела и т.д.); 2. Наличие у пациента клинических проявлений синдрома мальабсорбции: ранний остеопороз, остеомаляция, анемия неясного генеза, рецидивирующий афтозный стоматит, задержка роста, полового созревания, уменьшение массы тела, алопеция, дерматиты, бесплодие и др.; 3. Наличие в анамнезе заболеваний, ассоциированных с целиакией 67 (аутоиммунный тиреоидит, аутоиммунные заболевания печени, герпетиформный дерматит, ревматоидный артрит, инсулинозависимый сахарный диабет, воспалительные заболевания кишечника, селективный IgA-дефицит и др.); Подтвержденный диагноз целиакия у пациентов, находящихся на 4. безглютеновой диете (БГД) не менее 6 месяцев, для оценки эффективности проводимого лечения. Родственники больных целиакией (первая и вторая степень родства). 5. Критерии исключения из обследования: 1. Использование БГД до постановки диагноза и включения в исследование; 2. Наличие злокачественных новообразований; 3. Тяжелые хронические инфекционные заболевания, такие как ВИЧ или туберкулез; 4. Наличие противопоказаний к проведению эндоскопии/забору биопсии. 2.1.1. Клиническая характеристика больных по группам Распределение больных по группам представлено в таблице 2.1. Основная группа. В эту группу вошли 354 больных целиакией. Из них 92 пациентов с впервые выявленной целиакией до начала терапии и 262 пациента с установленным диагнозом «целиакия», находящиеся не менее года на безглютеновой диете. Женщины составили 55% или 194 больных от общего количества обследованных, 160 мужчин - 45%. Средний возраст составил 26,7±12,8 лет. Диагноз выставлялся на основании данных анамнеза, клинической симптоматики, результатов лабораторного обследования и морфометрических показателей согласно стандартам по диагностике и лечению целиакии (Целиакия у детей. Стандарты диагностики и лечения, СПб, 2010; Практическое руководство Всемирной организации гастроэнтерологов ((ВОГ, WGO-OMGE), 2013 год). 68 Таблица 2.1 Распределение больных, включенных в исследование, по группам Группы Диагноз целиакии Количество Основная Сравнения Популяционный контроль Установлен Не подтвержден Без хр.заболеваний 354 1197 I – (n = 414) – аутоиммунные I – (n=115) – типичная целиакия с заболевания доминирующими кишечными проявлениями, положительными II – (n = 367) – хронические лабораторными и заболевания желудочноморфометрическими критериями, кишечного тракта III – (n = 332) – синдром II – (n=207) – атипичная целиакия, нарушенного кишечного Подгруппы с доминирующими внекишечными всасывания проявлениями при наличии лабораторных и IV – (n = 39) – болезнь Крона морфометрических критериев III – (n=32) – латентная целиакия, с лабораторными критериями V – (n = 45) – диагноза, но при отсутствии или недифференцированный колит, слабой степени выраженности морфометрических маркеров 2491* I – (n=2099) – оценка рисковых аллельных вариантов HLAмолекул DQ2 (n=1054) и DQ8 (n=1045) – СЗФО, Москва, Западная Сибирь II – (n=392) – оценка HLAгаплотипов и их частот (данные РНИИГТ, Санкт-Петербург и «ГНЦ Институт Иммунологии», Москва) 69 Больные целиакией были распределены на подгруппы: I подгруппа (115 пациентов) - типичная целиакия с характерным превалированием кишечных клинических симптомов, а также наличием клинических проявлений, связанных с синдромом мальабсорбции, при значениях лабораторных показателей, превышающих установленные референтные пределы и характерных для целиакии морфометрических данных; II подгруппа (207 пациентов) - атипичная целиакия, с доминирующими внекишечными клиническими проявлениями (например, ведущий клинический симптом – остеопороз или железо-дефицитная анемия), с превышающими референтные пределы лабораторными и типичными для целиакии морфометрическими показателями; III подгруппа (32 пациентов) - латентная целиакия (клинические признаки отсутствуют или минимальны), с превышающими референтные значения лабораторными показателями, но при отсутствии или слабой степени выраженности морфометрических маркеров. Группа сравнения. Группу сравнения (1197) составили пациенты, у которых диагноз «целиакия» не был подтвержден с учетом установленных критериев. Средний возраст пациентов группы сравнения 30,5±11,6 лет. По половой принадлежности женщины составили 52%, мужчины 48 %. Клиническая симптоматика группы сравнения, связанная с аутоиммунной патологией (аутоиммунный тиреоидит, аллергическая энтеропатия, себорейный дерматит, псориаз, нейродермит, атопический дерматит, сахарный диабет первого типа и т. д) была представлена у 414 пациентов; с болезнями желудочнокишечного тракта (язвенная болезнь желудка и 12-перстной кишки, хронический гастродуоденит, эрозивный гастрит, хронический панкреатит, катаральный колит, синдром раздраженного кишечника) – у 367 пациентов; синдромом нарушенного кишечного гипохромная всасывания анемия, (остеопороз хронический смешанного генеза, рецидивирующий остеомаляция, афтозный стоматит, задержка полового созревания, очаговая алопеция, дерматиты и др.) – у 332 70 пациентов. Кроме этого, в группу сравнения вошли пациенты с диагнозом болезнь Крона (39 чел.) и недифференцированный язвенный колит (45 чел.). Группа популяционного контроля. Эта группа (n=2491) была сформирована по опубликованным в открытой литературе результатам HLA-генотипирования в различных популяциях, полученным при обследовании лиц, не имеющих хронических заболеваний и не предъявлявших жалоб на момент обследования. Группа включает: - подгруппу условно здоровых лиц, составленную отдельно по локусам DQA1 (n=1054) и DQB1 (n=1045) из Санкт-Петебурга, Северо-Западного округа, Москвы, Архангельска и Западной Сибири. Данные по HLA–генотипированию в этой подгруппе использовались для изучения численности, частот и диагностической значимости рисковых аллельных вариантов HLA-молекул DQ2 и DQ8. - подгруппу (392 условно здоровых лиц), сформированную по результатам HLA–типирования индивидуальных генотипов, которые использовались для изучения гаплотипов и их частот (данные ФГУ «Российский научноисследовательский институт гематологии и трансфузиологии ФМБА России, Санкт-Петербург и ФГБУ «ГНЦ Институт Иммунологии» ФМБА России, Москва). 2.2. Методы исследования Для проведения исследований использовались образцы цельной венозной и капиллярной крови, а также аликвоты образцов сывороток, хранившихся при -20С не более 6 месяцев, биоптаты СОТК. Были включены лабораторные иммунологические методы для выявления антител (иммуноферментный анализ, метод непрямой иммунофлуоресценции, иммунохроматографический метод), метод тандемной масс-спектрометрии для определения уровня свободного карнитина и ацилкарнитинов, метод вертикального электрофореза для определения состава авенина сортов овсов, 71 молекулярно-генетический (ПЦР) метод для типирования генов HLA класса II (DQA1, DQB1), метод элюирования антител при исследовании биоптатов слизистой оболочки тонкой кишки. 2.2.1. Методы определения антител Для определения антител использовалась сыворотка, полученная путем центрифугирования крови (3000 об/мин) не менее 10 минут. Анализ выполнялся в соответствии с инструкцией, прилагаемой к тест-системам. Концентрацию антител к глиадину (АГА), тканевой трансглутаминазе (ТТА), дезаминированным пептидам глиадина (ДПГА) определяли «сэндвич» вариантом твердофазного иммуноферментного метода тест-системами фирмы «Хема-Медика», Москва иммуноферментном и Orgentec, анализаторе DigiScan Германия Hitech, на планшетном Австрия. Оптическую плотность измеряли при длине волны =450 нм. В качестве антигенов в тестсистемах использовались высокоочищенный природный глиадин (-фракция) для определения АГА, синтетический линейный дезаминированный глиадин для определения ДПГА и человеческая рекомбинантная тканевая трансглутаминаза – для ТТА. При выполнении исследования предварительно разведенную сыворотку, полученную центрифугированием из образца крови пациента, вносили в лунки планшета, где происходило связывание антител из сыворотки пациента с антигеном, нанесенным Образовавшийся на комплекс внутреннюю поверхность лунок антитело-антиген инкубировали планшета. с конъюгатом (мышиные моноклональные антитела к иммуноглобулинам класса IgА или IgG человека, коньюгированные с пероксидазой хрена). После отмывки в связанный с пластиком лунки планшета «сэндвич», содержащий пероксидазу хрена, добавляли тетраметилбензидин (ТМБ) и инкубировали. Катализируемое пероксидазой окисление ТМБ, представляющее совокупность радикальных реакций, приводило к образованию продуктов окисления (феноксильные и аминильные радикалы), имеющих синюю окраску. Ингибировали пероксидазное окисление ТМБ 72 добавлением стоп-раствора, что обеспечивало переход окраски в желтый цвет. Аналитические характеристики тест-систем: воспроизводимость (коэффициент вариации, CV%) –5% (ДПГА) и 8% (АГА, ТТА); минимальная достоверно определяемая концентрация 1 ед/мл (ДПГА) и 5 ед/мл (АГА, ТТА); процент открытия – 90-110% (АГА, ТТА) и 86,7% (ДПГА); линейность 25-200 ед/мл (АГА, ТТА) и 0 – 100 ед/мл (ДПГА). Результаты оценивали согласно референтным пределам, установленным для данного теста. Антитела к эндомизию (ЭМА) определяли методом непрямой иммунофлуоресценции (тест-системы фирмы IMMCO Diagnostics, США) с использованием криостатных срезов эндомизия пищевода приматов в качестве антигена, который инкубировали с образцами сывороток пациентов. Все не связавшиеся компоненты сыворотки удаляли при промывке фосфатно-солевым буфером (PBS). Связавшиеся антитела выявляли инкубированием субстрата с коньюгатом (меченные флуоресцентной меткой FITC козьи поливалентные антитела к иммуноглобулинам человека). Результат реакции регистрировали с помощью микроскопа МИКМЕД-6, имеющего люминесцентную насадку (ОАО «ЛОМО», Санкт-Петербург), объектив SP 40x/0,65/0,17, окуляр К10х. Присутствие антител к эндомизию проявлялось появлением яблочно-зеленой флуоресценции эндомизия гладкомышечных волокон пищевода примата, которую выражали полуколичественно, в титрах. Титр определялся при анализе серийных разведений опытного образца. Аналитические характеристики теста: специфичность 99%, точность (процент открытия) 100%, чувствительность (минимально определяемая концентрация ЭМА, выраженная в титрах < 2.5) равнялась 100%, воспроизводимость 5%. Антитела к тканевой трансглутаминазе в капиллярной крови (ТТА-к) пациентов определяли иммунохроматографическим методом с применением подвижных моноклональных мышиных антител, коньюгированных коллоидным золотом как красителем (наборы реагентов «Biocard Лабсистемс», Финляндия). В качестве стационарной фазы использовался иммобилизованный белок (желатин как гидролизат коллагена), субстратом служила эндогенная тканевая 73 трансглутаминаза, полученная при лизисе собственных эритроцитов пациента. Присутствие в крови пациента антител к тканевой трансглутаминазе приводило к их взаимодействию с субстратом и моноклональными мышиными антителами, маркированными коллоидным золотом. Образование такого комплекса связывало тканевую трансглутаминазу со стационарной фазой, с последующим накоплением мышиных антител, коньюгированных коллоидным золотом в тест-зоне. Процесс завершался появлением красной линии как индикатора присутствия в крови пациента ТТА-к. Аналитические характеристики теста: воспроизводимость (CV) - 5%, чувствительность 96,3%, специфичность - 89,7%, точность (процент открытия) -96,9%. 2.2.2. Определение свободного карнитина и ацилкарнитинов Для одномоментного определения уровня свободного карнитина и эфиров карнитина (ацилкарнитины, таблица 2.2) применялся метод тандемной массспектрометрии, основанный на соотношении заданной массы определенных ионов к их заряду. Исследования проводились диагностическим набором реактивов NeoBase non-derivatized (PerkinElmer, Турку, Финляндия) с использованием капиллярной крови пациента в качестве биологического образца, нанесенного на фильтровальные тест-бланки (Германия, Whatman 903®). Кровь высушивалась при комнатной температуре +18°- +23°С не менее двух часов. Хранение фильтровальных тест-бланков с высушенной кровью осуществлялось при комнатной температуре +18°- +23°С от одного до трех месяцев. Для проведения анализа опытные образцы вместе с внутренними контролями, нанесенными на такую же фильтровальную бумагу, что и опытные образцы, выбивались дисками диаметром 3мм на автоматическом устройстве (DELFIA Dried Blood Spot DBS Puncher, Финляндия) в лунки планшета. После чего сухие кровяные бумажные диски подвергались инкубации при комнатной температуре (+18°- +23°С) с 74 экстрагирующим реагентом, позволяющим элюировать кровь из бумажных дисков. По окончании инкубации осуществлялся трансфер элюата в планшет для измерения и запускался процесс масс-спектрометрического анализа. Для данных измерений использовался масс-спектрометр с тройным квадруполем, «Waters», США. Каждый квадруполь (масс-фильтр), состоящий из четырех горизонтальных металлических стержней, осуществлял с помощью магнитного поля вокруг стержней, фильтрацию ионов на основании масс-спектра системой жидкостной хроматографии, состоящей из автоматического пробоотборника, микронасоса и вакуумного дегазатора для растворителей. При распылении ионным источником небольшого количества раствора, содержащего заряженные частицы (ионы), проводилось испарение растворителя, после которого ионы вводились в масс-анализатор через вакуумную поверхность, устранявшую незаряженные частицы (молекулы). Оставшиеся ионы переносились через вакуумную поверхность в ту часть, где происходит селекция нужных ионов, после чего сфокусированный ионный луч вводился в первый квадрупольный масс-фильтр Q1. В области Q1 ионы выделяются по отношению массы к заряду (m/z) и продвигаются в камеру соударения Q2 (не фильтрующий массанализатор), где сталкиваются с молекулами газа (аргон) и фрагментируются (активизированная столкновениями диссоциация). Образовавшиеся дочерние ионы вводятся в масс-анализатор, Q3, где они, также как в Q1, выделяются по значениям отношений (m/z) и направляются в детектор для регистрации сигналов. Уровень концентрации каждого заданного метаболита (мкмоль/л) рассчитывался по площади соответствующего ему пика при сравнении с пиками стандартов. Аналитические характеристики теста разработаны конкретно для каждого определяемого метаболита. Средняя воспроизводимость составляет 25%, чувствительность, или минимальное количество вещества, которое будет детектировано, составляет 1 пикограмм на микролитр (1пг/мкл). 75 Таблица 2.2 Карнитин и ацилкарнитины, исследованные методом масс-спектрометрического анализа 1 2 3 4 5 6 7 8 Принятое обозначение карнитина и ацилкарнитинов C0 C2 C3 C4 C5 C5:1 С6 C8 9 C8:1 Октеноилкарнитин 10 C10 Деканоилкарнитин 11 С10:1 Деценоилкарнитин 12 C12 13 С12:1 14 C14 15 C14ОH 16 C14:1 17 C16 18 C16ОH 19 С16:1 20 C16:1-ОH 3-гидроксипальмитолеил-карнитин 21 С18 Октадеканоилкарнитин (Стеароил) 22 С18ОН 23 C18:1 24 C18:1ОH № п/п Полное название карнитина и ацилкарнитинов Свободный карнитин Ацетилкарнитин Пропионилкарнитин Бутирилкарнитин Изовалерилкарнитин Тигликарнитин Гексаноилкарнитин Октаноилкарнитин Додеканоилкарнитин (Лауроил) Додеценоилкарнитин Миристоилкарнитин (Тетрадеканоил) 3-гидрокси-миристоилкарнитин Миристолеилкарнитин (Тетрадеценоил) Пальмитоилкарнитин 3-гидроксипальмитоил-карнитин Гексадеценоилкарнитин 3-гидрокси-октадеценоилкарнитин(3-ОН-стеароил) Октадеценоилкарнитин (Олеил) 3-гидрокси-октадеценоил-карнитин (3-ОНолеил) 76 2.2.3. Молекулярно-генетические исследования Молекулярно-генетические исследования проводили методом мультипраймерной полимеразной цепной реакции, ПЦР (Трофимов Д.Ю., 1996) [63]. Для ПЦР-анализа использовали образцы цельной венозной крови, полученные с добавлением ЭДТА (этилендиаминтетраацетат) в качестве антикоагулянта (вакутейнеры, ВD Vacutainer, EDTA Tubes, США). Геномную ДНК получали методом быстрого выделения из ядерных клеток крови с использованием наборов ДНК-Тех (фирма «НПФ ДНК-Технология», Россия). Процесс выделения ДНК начинался с лизиса ядерных клеток и дальнейшим удалением фрагментов центрифугирования. клеточных Последующее органелл, мембран ферментативное с разрушение помощью белков протеиназой К, экстрагирование и осаждение ДНК буферным раствором, содержащим фенол и хлороформ, завершалось удалением надосадочной жидкости и растворением ДНК в буферном растворе (Marmur J.A., 1970). ДНК хранили в течение недели при температуре +4 ºС или при -20 ºС при более длительном хранении (две недели). Для типирования генов HLA класса II (DQA1, DQB1) использовали наборы HLA-ДНК-Тех (фирма «НПФ ДНК-Технология», Россия). Амплификацию проводили на программируемом многоканальном термоциклере «ТП4-ПЦР-01» («НПФ ДНК-Технология», Москва). Продукты амплификации визуализировали с помощью метода горизонтального электрофореза с детекцией молекул ДНК по их размеру в пластине агарозного геля (1,5-2,5%), предварительно окрашенного красителем ДНК (бромистый этидий, 0,5 мкг/мл). После окончания электрофореза пластину из агарозного геля помещали на фильтр трансиллюминатора (Vilber Lourmat, Франция), который излучает свет в ультрафиолетовом диапазоне (254– 310 нм). Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передавалась на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра, 590 нм (Noolandi et al., 1993). 77 Прилагаемые к набору реагентов смеси для амплификации позволяли детектировать специфичности (аллельные варианты, или полиморфизмы гена), представленные в таблице 2.3. Таблица 2.3 Исследованные полиморфизмы генов HLA - DQA1 и HLA - DQВ1 Ген Локализация на хромосоме/OMIM HLA - DQA1 6p21.3 /146880 HLA - DQВ1 6p21.3 / 604305 Полиморфизм DQA1*0101 DQA1*0102 DQA1*0103 DQA1*0201 DQA1*0301 DQA1*0401 DQA1*0501 DQA1*0601 DQB1*0201 DQB1*0301 DQB1*0302 DQB1*0303 DQB1*0304 DQB1*0305 DQB1*0401/2 DQB1*0501 DQB1*0502/4 DQB1*0503 DQB1*0601 DQB1*0602-8 Примечание. OMIM – Оnline Mendelian Inheritance in Man – менделеевское наследование у человека (каталог МАК-КЬЮСИКА), компьютерный вариант 78 2.2.4. Определение состава авенина сортов овсов, используемых в питании больных целиакией Состав фракций и компонентов проламинов авенина определяли методом вертикального электрофореза в пластинах 6,5% полиакриламидного геля с использованием ацетатного буфера (рН 3,1) (Конарев В.Г.,1975). Интенсивность реакции белков, исследуемых авенинов с IgG сывороток больных целиакией оценивалась методом иммуноферментного анализа и выражалась в оптических единицах (о.е.). В качестве контроля использовали сыворотку человека без антиглиадиновых антител. Белки из овсов выделяли 2М мочевиной путем однократного экстрагирования (Конарев В.Г.1970). Для нанесения антигена на внутреннюю поверхность лунок полистероловых планшетов, которые в дальнейшем использовали для проведения иммуноферментного анализа, в лунки вносили по 0,2 мл экстрагированного белка и инкубировали 18 часов при 4С, после чего проводили промывку 3 раза в течение 5 мин. буфером (0,1М NaCl в 0,01М натрий фосфатном буфере, рН 7,4 с добавлением Твин-20). В лунки добавляли по 0,25 мл 1% раствора бычьего сывороточного альбумина и инкубировали ночь при комнатной температуре (около 20С). Промывали 3 раза в течение 5 мин. фосфатно-солевым буфером. Далее исследования продолжали, используя набор реактивов (тест-система для определения IgG антител к глиадину, фирма “Хема - Медика”, Москва). Исследования проводились в отделе биохимии и молекулярной биологии Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н.И. Вавилова». (руководитель доктор биологических наук, профессор Гаврилюк И.П.) 79 2.2.5. Исследование биоптатов слизистой оболочки тонкой кишки Оценку биоптатов слизистой оболочки тонкой кишки (СОТК) проводили двумя методами: определяли количество тканевых трансглутаминазных депозитов и проводили гистологическое исследование. Уровень тканевых трансглутаминазных субэпителиальных депозитов (ТТ-д) в СОТК определяли иммуноферментным методом тест-системами для определения ТТА в сыворотке крови (фирма ООО «Хема-Медика», Москва) после их предварительной элюции из биоптатов СОТК (Radek JT et al., 1993г.) по методу, предложенному Korponay-Szabo IR, 2004. Биоптаты предварительно промывали в поверхностных фосфатно-солевом антител, затем буфере при (PBS) комнатной для удаления температуре крови и (18ºС-23ºС) инкубировали 20 минут в растворе 2.5 г/л монохлоруксусной кислоты с добавлением 0,2 М/л NaCl для получения значения рН=2,7-3,0. После проведенной инкубации рН элюата доводили 0,05 моль/л трис-HCl или 1М/л имидазола до рН 7,0-7,4. Изменение рН до 7,0-7,4 являлось необходимым для дальнейшего использования элюата (вместо сыворотки, в том же количестве) в иммуноферментном анализе. Результаты выражали в произвольных единицах (AU-arbitrary units). Для элюирования использовали нефиксированные биоптаты, которые могли храниться в течение недели при температуре +4 - +8 ºС или до года при -20 ºС. Забор биоптатов производился из тех же отделов кишечника, что и для гистологического исследования. Перед проведением исследования биптаты доводили до комнатной температуры (18 - 23 ºС), повторное замораживание не допускалось. Для гистологического исследования биоптатов применяли световую микроскопию с предварительным окрашиванием препаратов гематоксилином и эозином. Стадии изменений морфологической картины СОТК оценивали по классификации Marsh-Oberhuber, 1999г. Гистологические исследования проводились патоморфологами ГБОУ ВПО СПбГПМУ (к.м.н. Красногорский И.Н.) и ГБОУ ВПО ГМУ им. И.И. Мечникова (к.м.н. Калинина Е.Ю.) 80 2.3. Методы статистического анализа данных Статистический анализ баз данных проводился с помощью пакетов программ: DAG_Stat.xls, MedCalc, Ver. 11.5.1.0, STATISTICA Ver.6, AtteStat10.10.2 (http: //attestatsoft.narod.ru/ download.htm), а также системы статистического анализа и визуализации данных R, состоящей из языка программирования высокого уровня R, version 3.1.1., реализовывающего различные операции с объектами, векторами, матрицами, списками и т.д., и большого набора функций обработки данных, собранных в отдельные пакеты (package). Указанные пакеты программ позволили провести оценку сравнения выборок с применением параметрических и непараметрических критериев (Uкритерий Манна-Уитни, Колмогорова-Смирнова), анализа таблиц сопряжённости с применением критерия хи-квадрата и поправкой Йетса, точного двустороннего критерия Фишера, анализа ранговой корреляции с помощью коэффициента Спирмена и линейной корреляции параметрическим методом с помощью коэффициента Пирсона. С целью последующей нахождения визуализацией оптимальной был комбинации применен биомаркеров метод с построения классификационных деревьев решений (decision trees). Поиск cut-off, или точки разделения здоровых и больных (нуждающихся в дальнейшем обследовании и не нуждающихся в обследовании), а также оценку операционных характеристик теста проводили с помощью ROC-анализа. Построение ROC-кривой - зависимости чувствительности от вероятности ложноположительных результатов, т.е. величины (1-специфичность), позволяло определить точку наилучшего разделения здоровых и больных (уровень показателя, которому соответствовала максимальная сумма чувствительности и специфичности метода). Показатель площади под кривыми операционных характеристик AUC (Area Under the receiver operating characteristic [ROC] Curve) использовался как один из основных для качества диагностики, меры ее различающей (разрешающей) способности, верно оценивающий истинно положительные и истинно отрицательные результаты. 81 Универсальность AUC определялась ее безразмерной величиной, которая выражается в долях единицы, т. е. принимает значения от 0 до 1. Использовалась ее интерпретация, которая при значениях AUC = 0,5 определяла отсутствие диагностической (дискриминационной) способности, а значениях AUC = 1 соответствовала идеалу диагностики, который практически недостижим. Тест с AUC <0,6 относился к неудовлетворительным, с AUC в интервале 0,6 – 0,7 – посредственным, в интервале 0,7 – 0,8 – удовлетворительным, в пределах 0,8 – 0,9 - хорошим и с AUC >0,9 – отличным [137]. Оценку отношения правдоподобия положительного результата (ОП+, Чувствительность/(1-Специфичность) и отношения правдоподобия отрицательного результата (ОП-, Специфичность/(1-Чувствительность) проводили по следующим характеристикам [137]: - ОП+>10 или ОП- <0,1 - полная уверенность в присутствии болезни или соответственно в ее отсутствии; - ОП+ от 5 до 10 и ОП- от 0,1 до 0,2 - умеренные основания для диагностического решения; - ОП+ от 2 до 5 и ОП- от 0,2 до 0,5 незначительная вероятность или незначительная уверенность в отсутствии болезни у пациента; - ОП+ от 0,5 до 2 практически не влияет на диагностическое решение относительно вероятности/наличия болезни у пациента. Оценку прогностического значения диагностических тестов проводили по предсказательной ценности положительного результата теста (ПЦПР, PPV Positive Prediction Value), а также по прогностической ценности отрицательного результата (ПЦОР, NPV - Negative Prediction Value). При проведении HLA-генотипирования прогностическую значимость теста оценивали по отсутствию или наличию рисковых аллелей или гаплотипов. Так, ПЦПР (PPV) рассматривали как вероятность P(D+|G+) того, что у носителя «рискового» генотипа G+ возникнет и разовьется болезнь D+. Она вычисляется по известной формуле, основанной на теореме Бейза (Crawford, 2009; Zaykin, 2004) 82 Аналогичным образом вычислялась ПЦОР (NPV) – как вероятность P(D-|G-) того, что у индивидуума без «рискового» генотипа болезнь не должна получить своего развития. Вероятность P(D+) есть не что иное, как распространенность (prevalence) данного заболевания в данной популяции. Для статистического анализа данных, полученных при выполнении HLAгенотипирования, использовались показатели Бейзов (Байесовский) фактора (BF01) – как характеристики однородности распределения гаплотипов. Значения BF01>1, свидетельствовали в пользу нулевой гипотезы H0 как однородности распределений гаплотипов (отсутствие различий между ними). Значения BF01<1 указывали на неоднородность распределений гаплотипов в сравниваемых группах (гипотеза H1 о неоднородности распределений). В качестве мер эффекта использовались: ОШ, OR (Odds Ratio) - отношение шансов; и отношение рисков ОР, RR (Risk Ratio), т.е. доли носителей рисковых аллелей или гаплотипов в группе больных к доле таких носителей в контрольной группе, а также РР, RD (risk difference) - разность рисков (долей). Для показателя эффективности и продуктивности генотипирования использовалась величина NNG (Number Needed to be Genotyped) – количество подлежащих генотипировнию. NNG вычисляется как величина, обратная к разности рисков РР, RD, деленная на распространенность болезни (Rembold, 1998) Она рассматривалась как количество индивидуумов, которых надо генотипировать, чтобы выявить хотя бы на одного больного целиакией больше, чем обычным методом диагностики. 83 Для статистической обработки данных, полученных при проведении HLAгенотипирования, были использованы следующие статистические программы: - программа StatXact-8 и Cytel Corp., USA (http://www.cytel.com/) для получения точных p-значений и точных границ доверительных интервалов (ДИ); - электронная таблица Clopper-Pearson.xls http://www.med.uio.no/imb/stat/two-by-two/installation.html) для построения точных ДИ и долей (частот); - программа Post_Test_Probabilities.exe, Crawford, 2009 (http://www.abdn.ac.uk/psy086/dept/psychom.htm) и усовершенствованный скрипт (Zaykin, 2004) для расчета предсказательных (прогностических) ценностей и вычисления бейзовских ДИ; - программа ROC analysis.xls, Watkins, 2000 (http: //www.public.asu.edu/ ~mwwatkin/Watkins3.html) для вычисления AUC; - программы Arlequin, Ver. 3.5.1.2, GenAlEx-6.3; GENEPOP, v. 4.0.10; PowerMarker-3.25 для получения исчерпывающих генетико-популяционных показателей, таких как оценка частот аллелей, генотипов и гаплотипов, проведения проверки согласия с равновесием Харди-Вайнберга и проверки неравновесности по сцеплению и т.д.; - программы LearnBayes, Version 2.0 (http://cran.r-project.org/bin/windows/contrib/r-release/LearnBayes_2.0.zip) и bayesCategories.htm (http://www.toad.net/jkaplan2/bayesCategories.htm) для бейзовского анализа таблиц сопряженности и вычисления бейзова фактора BF; - программа SANCT 8 - для подробного анализа структуры таблиц сопряженности. 84 ГЛАВА 3. АНТИТЕЛА К ТКАНЕВОЙ ТРАНСГЛУТАМИНАЗЕ И ЭНДОМИЗИЮ КАК ЗНАЧИМЫЕ МАРКЕРЫ ЦЕЛИАКИИ 3.1. Диагностическая информативность антител к тканевой трансглутаминазе (ТТА) и эндомизию (ЭМА) для дифференциальной диагностики воспалительных заболеваний кишечника Дифференциальная диагностика целиакии и воспалительных заболеваний кишечника (неспецифический язвенный колит, НЯК и болезнь Крона, БК) имеет особое значение из-за ассоциации с целиакией, схожести клинических проявлений и иммунных реакций при развитии болезни. Уменьшение количества ложноположительных результатов и, как следствие, повышение специфичности исследования при проведении дифференциальной диагностики, способствует своевременному принятию правильного клинического решения. Участие тканевой трансглутаминазы (TG2) в процессах, связанных с апоптозом при развитии воспалительных заболеваний кишечника может сопровождаться выработкой ТТА и ЭМА [274,152]. Однако до настоящего времени результаты ложноположительных исследований результатов при и возможность проведении получения дифференциальной диагностики целиакии и воспалительных заболеваниях кишечника остаются неоднозначными [19,32]. В связи с этим из группы сравнения были выделены пациенты с данными патологиями и рассмотрены в отдельном сравнительном исследовании с больными с установленным диагнозом «целиакия». В таблице 3.1. представлены результаты проведенного исследования с включением в группу сравнения пациентов с неспецифическим язвенным колитом и болезнью Крона. При наличии болезни Крона у 92,3% больных было выявлено повышение уровня IgG-ТТА, выходящее за референтный интервал, а в группе с неспецифическим язвенным колитом – у 60% пациентов. При этом уровень IgG-ТТА в группе с болезнью Крона и НЯК намного превышал уровень IgА-ТТА (в десять раз) в тех же группах. В то же время количество результатов 85 IgА-ТТА, выходящих за референтные значения, по сравнению IgG-ТТА, было незначительным и составило в группе больных с болезнью Крона 10,3% и в группе НЯК 4,4%. Таблица 3.1 Распределение результатов измерения IgA-ТТА, IgG-ТТА и IgA-ЭМА относительно референтного интервала и средняя концентрация в обследованных группах пациентов IgG-ТТА (N до 25 Ед/мл) IgA-ЭMA (N титр1:5) Положитель- Содержание ные в результаты, сыворотке, % Ед/мл Положительные результаты, % IgA-ТТА (N до 20 Ед/мл) Группы больных Целиакия (n=38) Болезнь Крона (n=39) НЯК (n=45) Положительные результаты, % Содержание в сыворотке, Ед/мл 92,1 90,0±42,2* 92,1 177,1±87,2* 94,7 10,3 4,2±2,1* 92,3 31,9±17,8* 0 4,4 2,8±1,3* 60,0 28,4±14,9* 0 Группа сравнения 6,7 1,9±1,6 6,7 23,211,9 (n=62) *достоверность различий относительно группы сравнения, р<0,01 2,0 Уровни IgА-ТТА и IgG-ТТА, превышающие референтные значения, были также зарегистрированы в группе сравнения у пациентов, имеющих в анамнезе аутоиммунный тиреоидит (3), псориаз (2), хронический вирусный гепатит (1), язвенную болезнь двенадцатиперстной кишки в стадии обострения (2), что составило в общей сложности, 12,9% от общего количества результатов в этой группе пациентов. Отрицательный результат был получен у трех больных с целиакией (7,9%); ТТА были в пределах допустимого предела. 86 Титры ЭМА у всех пациентов в группах с БК, НЯК не выходили за допустимые референтные пределы. В группе пациентов с целиакией, у всех, за исключением двух пациентов (5,3%), ЭМА были положительными. В проведенных ранее исследованиях было установлено, что для целиакии характерно присутствие специфичных антител VH5-семейства генов, которые предпочтительны для тканевой трансглутаминазы, TG2, так как содержат в своей структуре один или более остатков лизина, который определяет им роль субстрата, позволяя проявлять изопептидазную активность у TG2 [241]. Механизм взаимодействия включает образование изопептидных связей между TG2 и остатками лизина в антигенспецифичном В-клеточном Ig-поверхностном рецепторе, приводя к понижению порога их активации. Связавшись с Igрецептором В-клетки, TG2 катализирует перекрестное сшивание белков между глиадиновыми пептидами и Ig-рецептором В-клеток, после чего глиадиновые пептиды получают доступ в В-клетки. Процесс интернализации глиадиновых пептидов формирует антигенпредставляющую способность у В-клеток, которая обуславливает распознавание CD4+T-лимфоцитами пептидов глиадина в комплексе с HLA-молекулами, с последующей пролиферацией В-клеток и выработкой специфических антител. Предполагают, что при определенных заболеваниях может происходить перераспределение сегментов вариабельных генов антител (V-генов). Важно, что мутации происходят в областях, ответственных за узнавание антигенов, обеспечивая более полное соответствие антигену активного центра антитела. Такие гипермутации в V-генах приводят к повышению аффинности связывания определенных клонов антител к нетипичному для них антигену [235]. Однако, если при целиакии происходит взаимодействие антител только с одной определенной антигенной детерминантой (каталитический активный центр TG2), с формированием специфичных антител, то другие семейства V-генов антител связываются с несколькими антигенными эпитопами (внешние домены TG2) [28]. Другой механизм связывания объясняет неспецифичность выявляемых антител, что подтвердили результаты нашего исследования, показав повышение ТTА не 87 только у больных болезнью Крона и НЯК, но и в группе сравнения (аутоиммунный тиреоидит, псориаз, хронический вирусный гепатит, язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки в стадии обострения) (таблица 3.1). Установлено, что при воспалительных заболеваниях кишечника экспрессия J-цепи секреторного иммуноглобулина А (SIgA), которая необходима для генерации SIgA, резко снижена и приводит к местному дефициту SIgA, что сказывается в целом на уровне сывороточного IgA при воспалительных заболеваниях кишечника [32]. В группах пациентов с болезнью Крона и НЯК было показано снижение уровня сывороточных IgA-ТТА. Поскольку IgA является высоко специфическим маркером, отражающим состояние слизистой оболочки, то отсутствие IgA-ответа позволяет сделать вывод о неспецифичности IgA-ТТА антител для воспалительных заболеваний кишечника в отличие от целиакии, где была отмечена их активная выработка (рисунок 3.1). Концентрация IgA-ТТА, Ед\мл 600 500 400 300 200 100 0 0 20 40 60 80 100 Пациенты ВЗК Целиакия Группа сравнения Рисунок 3.1. Содержание IgA-ТТА в группах обследованных пациентов 88 Активация макрофагов и драматическое увеличение плазматических клеток при воспалительных заболеваниях кишечника обуславливают избыточную продукцию IgG. Установлено, что изменение гликозилированности углеводного компонента Fc-фрагмента за счет снижения процессов сиализации, наблюдаемое при воспалительных заболеваниях кишечника, переключает IgG с противовоспалительной активности с последующим снижением эффекторных функций, на провоспалительную/токсическую активность. В настоящее время также предположительно установлено, что при воспалительных заболеваниях кишечника подавляющее большинство IgG экспрессирует матричные металлопротеиназы (ММР-3), участвующие в повреждении слизистой оболочки кишечника, что определяет новую роль IgG в развитии воспалительных заболеваниях кишечника [67]. Результаты наших исследований подтвердили активное участие IgG-ТТА как в воспалительных процессах, так и в механизмах повреждения слизистой оболочки кишечника, что было подтверждено высоким уровнем IgG-ТТА, который выходил за допустимые референтные значения почти у всех пациентов с болезнью Крона (36 пациентов из 39) и у 23 пациентов из 45 в группе с НЯК (рисунок 3.2). Анализ полученных результатов показал, что высокие концентрации IgGТТА были связаны с характерным для болезни Крона глубоким, трансмуральным поражением кишечной стенки. Длительность и степень воспалительного процесса при НЯК, а также распространение воспаления только в слизистой оболочке с переходом на подслизистый слой кишечной стенки оправдывает непостоянное, особенно при коротком сроке развития болезни, повышение IgG-ТТА (50% пациентов). Диагностическая эффективность определения ТТА для выявления или исключения целиакии у больных с воспалительными заболеваниями кишечника, была изучена на основании значений специфичности, отношения правдоподобия и предсказательной ценности положительного и отрицательного результатов. Эти показатели, а также площади под ROC-кривой показали несостоятельность ТТА 89 600 Концентрация IgG-ТТА, Ед\мл 500 400 300 200 100 0 0 20 40 60 80 100 Пациенты ВЗК Целиакия Группа сравнения Рисунок 3.2. Содержание IgG-ТТА в группах обследованных пациентов для проведения дифференциальной диагностики целиакии (таблица 3.2), что нашло объяснение в использовании различных субстратов, таких как эндомизий пищевода приматов и рекомбинантная человеческая тканевая трансглутаминаза при определении ЭМА и ТТА. Отличие в конфигурации антигенных эпитопов TG2 в этих субстратах объясняет разную аффинность связывания с антителами. Чем выше взаимная антигенсвязывающего интенсивнее комплементарность участка прочность антитела соединения, и что антигенной ближе их является детерминанты соответствие, причиной и тем разной специфичности и чувствительности тестов [166]. Это подтвердили результаты нашего исследования, продемонстрировав отсутствие положительных результатов определения ЭМА в группах пациентов с болезнью Крона и НЯК и максимально 90 Таблица 3.2 Диагностические характеристики тестов по определению ЭМА и ТТА у пациентов с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом по сравнению с группой сравнения Чувствительность (%) Специфич ность (%) 95% ДИ ОП ОП ПЦПР ПЦОР Площадь под ROC-кривой 90,9 100 0,914-0,980 83,3 0,03 97,0 98,0 0,955 IgA-ТТА 91,9 44,1 0,544-0,702 1,64 0,18 67,5 81,16 0,626 IgG-ТТА 94,2 61,8 0,717-0,851 2,26 0,094 75,7 89,4 0,790 Название теста IgA-ЭМА ОП + ПЦ - Примечание. ДИ-доверительный интервал; ОП-отношение правдоподобия; ОП+, ОП- – отношение правдоподобия положительного и отрицательного результатов теста; ПЦ- предсказательная ценность; ПЦПР-предсказательная ценность положительного результата; ПЦОРпредсказательная ценность отрицательного результата. 91 высокую специфичность ЭМА у больных с целиакией, определив эндомизий пищевода приматов как оптимально работающую антигенную детерминанту. Превышение допустимых референтных пределов уровня ЭМА только в группе пациентов с целиакией позволило дифференцировать целиакию от воспалительных заболеваний кишечника. На основании проведенного анализа полученных данных, были установлены максимальная специфичность, а также высокие значения отношения правдоподобия и прогностической значимости положительного и отрицательного результатов, которые позволяют предположить высокий риск присутствия целиакии у пациентов с болезнью Крона и НЯК при положительных результатах ЭМА и исключить целиакию при низких титрах ЭМА (таблица 3.2). Оптимальное соотношение чувствительности и специфичности тестов демонстрируется построением ROC-кривых, которые показывают диагностическую эффективность каждого исследования в сопоставлении больных с целиакией и группой сравнения (рисунок 3.3). Таким образом, проведенное исследование подтвердило возможность успешного проведения дифференциальной диагностики целиакии и болезни Крона/НЯК для исключения или подтверждения глютеновой энтеропатии с включением в диагностический протокол определение ЭМА. В группе больных целиакией по сравнению с группой сравнения установленная диагностическая информативность определения ЭМА и IgА–ТТА, представленная в таблице 3.3, продемонстрировала их значимость для выявления целиакии, за исключением IgG–ТТА, у которых диагностическая информативность оказалась значительно ниже. Расчетные характеристики диагностической точности определения IgG–ТТА, представленные отношением правдоподобия положительного и отрицательного результатов, предсказательной ценностью положительного результата, представляют IgG–ТТА как малозначащий диагностический маркер целиакии и позволяют не рекомендовать IgG–ТТА для диагностики глютеновой энтеропатии (таблица 3.3, рисунок 3.4). 92 ЭМА Рисунок 3.3. Графическое изображение результатов ROC-анализа определения ЭМА и ТТА в группах пациентов с НЯК и болезнью Крона относительно группы сравнения Примечание: sensitivity-чувствительность; specificity-специфичность; AUC – площадь под кривой 93 Таблица 3.3 Диагностические характеристики определения ЭМА и ТТА у больных с установленным диагнозом целиакии по сравнению с группой сравнения Антитела Чувствитель ность (%) Специфичность (%) 95% ДИ IgA-ЭМА 93,1 97,8 IgA-ТТА 94,8 IgG-ТТА 84,5 ОП ПЦ ОП ОП ПЦПР ПЦОР Площадь под ROC-кривой 0,919-0,987 43,62 0,05 96,5 95,7 0,965 96,7 0,933-0,992 28,52 0,07 94,7 96,8 0,950 89,1 0,890-0,972 7,77 0,17 83,1 90,1 0,912 + - Примечание. ДИ-доверительный интервал; ОП-отношение правдоподобия; ОП+, ОП- – отношение правдоподобия положительного и отрицательного результатов теста; ПЦ- предсказательная ценность; ПЦПР-предсказательная ценность положительного результата; ПЦОР- предсказательная ценность отрицательного результата. 94 ЭМА Рисунок 3.4. Графическое изображение результатов ROC-анализа определения ЭМА и ТТА в группе пациентов с целиакией относительно больных группы сравнения Примечание: sensitivity - чувствительность; specificity - специфичность; AUC - площадь под кривой 95 Проведенные исследования показали вероятность получения ложноположительных результатов IgА–ТТА не только в группе больных НЯК и болезнью Крона, но и в группе сравнения (аутоиммунные заболевания, хронические заболевания желудочно-кишечного тракта, синдром нарушенного кишечного всасывания) в отличие от ЭМА, которые не имели ложноположительных результатов у этих пациентов. Связанные с этим установленные прогностическая значимость и отношения правдоподобия положительных результатов для IgА–ТТА оказались ниже, чем у ЭМА, что предполагает меньшую диагностическую значимость IgА–ТТА. Установленное значительное превосходство значений отношения правдоподобия положительного результата и предсказательной ценности положительного результата у ЭМА определяет их первостепенное значение в лабораторной панели при установлении диагноза целиакии и в дифференциальной диагностике при наличии клинических подозрений на глютеновую энтеропатию. Имевшие место отрицательные результаты ЭМА у двух больных целиакией (ложноотрицательные результаты), позволяют сделать вывод о недостаточной чувствительности ЭМА, что также подтвердили показатели предсказательной ценности, отношения правдоподобия отрицательных результатов теста и чувствительности, которые оказались лучше у IgА–ТТА. Диагностические характеристики определения антител и их соотношения продемонстрированы построением ROC-кривых (рисунок 3.4). Кроме этого, ложноположительных в группе результата. сравнения Выяснение были зарегистрированы причины получения два таких результатов было связано с субъективностью интерпретации, что снижает достоверность полученных результатов и требует достаточного опыта работы для анализа флуоресцентной визуализации. Максимальная интегральная диагностическая эффективность (площадь под кривой), превышающая таковую для IgA-ТТА, получена при определении ЭМА (рисунок 3.4). 96 Таким образом, по результатам проведенного исследования установлено, что ЭМА является лучшим диагностическим маркером как для группы больных с болезнью Крона и НЯК, так и для больных с целиакией. Отсутствие ложноположительных результатов в группах с НЯК и БК, позволяет рекомендовать включение ЭМА в алгоритм дифференциальной диагностики воспалительных заболеваний кишечника. По сравнению с ЭМА, полученные диагностические характеристики для IgА–ТТА и IgG–ТТА в группах пациентов с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом характеризуют их как неспецифические лабораторного маркеры, которые обследования с не целью могут включаться проведения в алгоритм дифференциальной диагностики. Для группы больных с установленным диагнозом «целиакия» (таблица 3.3) IgА–ТТА являются специфичными и высоко чувствительными маркерами, однако выявленная возможность получения ложноположительных результатов вызывает необходимость их подтверждения положительными результатами антител к эндомизию, как более специфического теста. Однако субъективность интерпретации результатов и недостаточная чувствительность определяет принятие другого методического решения. Установленная неудовлетворительная диагностическая точность теста для определения IgG–ТТА не позволяет включать IgG–ТТА для выявления целиакии. 3.2. Целесообразность модификации верхнего предела референтного интервала ТТА, соответствующего 100% предсказательной ценности положительного результата, для сокращения сроков обследования на первом этапе диагностики целиакии Известно, что снижение ложноположительных результатов исследования, которые, как установлено выше, характерны для ТТА, возможно при изменении точки отсечения (cut-off), которая отражает оптимальные соотношения чувствительности и вероятности ложноположительных результатов исследования (1-специфичность) и определяется в ходе построения ROC-кривой. Смещение 97 (подбор) значения cut-off позволяет достичь 100% предсказательную ценность положительного результата и, тем самым, значительно повысить клиническую информативность исследований [22]. Достижение 100% предсказательной ценности положительного результата позволяет формировать группу обследуемых с несомненным диагнозом и исключает необходимость проведения дополнительного обследования, обеспечивая скрининговый режим отбора пациентов с целиакией. Использование такого подхода было предложено в 2012 году Европейским обществом педиатрической гастроэнтерологии, гепатологии и нутрициологии (ESPGHAN) и применено для антител к тканевой трансглутаминазе, которые широко используются в диагностике целиакии, имеют простоту определения, коммерческую доступность, отсутствие субъективизма при анализе получаемых результатов. Для апробации такого подхода был проведен ретроспективный анализ результатов обследования 392 пациентов, полученных на отечественных тест-системах фирмы «Хема-Медика», Москва, с установленным для них фирмой-производителем cut off = 20 Eд/мл (IgA-ТТА) и 25 Eд/мл (IgG-ТТА). Именно эти наборы лежат в основе диагностической панели и широко распространены в Российской Федерации. Из общего количества пациентов, включенных в данный анализ (n=392), у 78 пациентов поставлен и подтвержден в ходе наблюдения диагноз целиакии, а у 9 больных, несмотря на положительные результаты сывороточных ТТА, диагноз не подтвердился. В таблице 3.4 представлено распределение больных по результатам исследования ТТА. Среди пациентов с неподтвержденным диагнозом целиакии преобладали больные, имеющие незначительное повышение ТТА. Уровень ТТА выше 150 Ед/мл регистрировался только у пациентов с глютеновой энтеропатией. Морфометрические показатели у больных, имеющих концентрации ТТА равной 100 Ед/мл и выше, соответствовали деструктивной стадии по Marsh M.N., за исключением ТТА=133 Ед/мл одного и пациента, страдающего имеющего сахарным морфометрические маркеры не подтвердили целиакию. диабетом, концентрацию у которого 98 Таблица 3.4 Количество пациентов с целиакией и без целиакии при уровнях ТТА, превышающих верхнее референсное значение IgA-ТТА (референтное значение – до 20 Ед/мл) Количество пациентов с целиакией (n=78) Количество пациентов без целиакии (n=9) До 35 14 9 35-99 18 2 100-149 13 1 ≥150 33 0 Нужно отметить, что из 78 пациентов с целиакией, у семи - результаты ТТА не выходили за пределы референтных значений (ложноотрицательные результаты). Из них у одного пациента был выявлен селективный IgA-дефицит, у другого в анамнезе присутствовал ревматоидный артрит и пациент находился на иммуносупрессивной терапии, что способствовало подавлению выработки аутоантител, объясняя нормальный уровень IgA-ТТА. Остальные пациенты с результатами ТТА, не выходившими за пределы референтных значений (5), во время обследования имели ограничения в употреблении глютен-содержащих продуктов (хлеб, каши, сладости). Полученные ранее результаты зарубежных исследований (Hill ID et al, 2005) объяснили возможность получения таких значений ТТА при ограничении поступления глютена с пищей. Было показано, что потребление глютена менее 15 г/сутки приводит к нормализации антител в крови, с продолжающимся патологическим его воздействием на СОТК. Наши результаты подтвердили этот вывод, продемонстрировав сочетание ложноотрицательных результатов IgA-ТТА с деструктивными изменениями в СОТК (Marsh II, Marsh III) у таких пациентов. В связи с этим, ориентирование пациентов на обычный режим питания без ограничения продуктов, содержащих 99 глютен, исключение селективного IgA-дефицита и влияние иммуносупрессорных препаратов на продукцию антител, является важным и необходимым условием для получения достоверных результатов и постановки правильного диагноза. Проведенный ROC-анализ подтвердил оптимальный cut-off – 20 Ед/мл для данных тест-систем и установил предсказательную ценность положительного результата для данного cut-off - 89,5%. Подбор уровня IgA- ТТА, соответствующего 100% предсказательной ценности положительного результата, определил концентрацию IgA-ТТА равную 160 Ед/мл. Таким образом, для того, чтобы иметь достоверный диагноз, позволяющий не проводить дальнейшее обследование, необходимо, чтобы результат обследования соответствовал 160 Ед/мл (таблица 3.5). Проведенный анализ результатов также подтвердил полученный ранее вывод, что присутствие в анамнезе пациента других аутоиммунных заболеваний определяет возможность получения ложноположительных результатов (в нашем исследовании – это больной сахарным диабетом, с IgA -ТТА=133 Ед/мл). Таблица 3.5 Соответствие разных уровней тканевых трансглутаминазных антител определенной предсказательной ценности положительного результата IgA-ТТА Ед/мл ПЦПР(%) 20 89,5 40 95 100 98 160 100 >240 100 ПЦПР - предсказательная ценность положительного результата теста Подбор такого уровня концентрации IgA-ТТА, который соответствует 100% предсказательной ценности положительного результата исследования, позволяет 100 отбирать пациентов, которым не требуется дальнейшее обследование и тех, у которых не достигается уровень IgA-ТТА, соответствующий 100% ПЦПР, для дальнейшего обследования и наблюдения. Проведенное возможность не нами исследование проводить дальнейшее подтвердило, обследование что при появившаяся достижении результатов теста 100% ПЦПР значительно ускоряет постановку диагноза в результате сокращения цикла обследования, в том числе и за счет не проведения ЭФГДС. Количество пациентов, которые могли обойтись без ЭФГДС, составили в нашем исследовании 40,8%. Необходимо также отметить, что высокие уровни маркерных антител (в нашем исследовании средняя концентрация соответствовала 249,8±106,7 Ед/мл), как правило, характеризуют классическую (типичную) целиакию. Поэтому достижение у больного концентрации IgA-ТТА 160 Ед/мл и более, позволяет не только достоверно выявлять типичную целиакию, но и более четко определить «серую зону» от 160 ЕД/мл до 20 Ед/мл, в которую попадают пациенты с подозрением на субклиническую форму целиакии, требующие подробного обследования. Таким образом, проведенное исследование выявило существенные преимущества при использовании нового подхода. Это прежде всего сокращение цикла обследования за счет не проведения ЭФГДС, что значительное ускоряет постановку диагноза со своевременным назначением диетотерапии и уменьшает затраты на дорогостоящие диагностические процедуры и лабораторные тесты. Модификация точки отсечения позволяет также сфокусировать внимание врача на атипичных формах целиакии, при которых результаты измерения IgA-ТТА могут давать ложные результаты (положительные или отрицательные, соответственно «серой зоне») и которые требуют более детального обследования. Однако, несмотря на преимущества, модификация верхнего значения референтного интервала для ТТА-теста не исключают диагностических проблем при получении не превышающих референтные пределы значения сывороточных маркеров. Так, ESPGHAN рекомендует использовать для атипичных (асимптоматических) форм HLA-генотипирование. Отсутствие носительства HLA-молекул отрицает 101 целиакию, присутствие предполагает дальнейшее обследование на IgA ТТА с превышением референтного значения в три раза, с подтверждением полученного результата гистоморфометрическими показателями. При отсутствии превышения в три раза референтного предела для IgA-ТТА проводится подтверждающий ЭМА-тест, который опровергает наличие целиакии в случае отрицательного результата (при дальнейшем наблюдении за пациентом). Однако, выше были показаны недостатки ЭМА-теста (недостаточная чувствительность теста и субъективность при интерпретации результатов). Кроме этого, к причинам получения ложноотрицательных результатов, связанных с недостатками ЭМАтеста, можно ограничения добавить подтвержденные глютен-содержащих иммуносупрессорные предсказательной препараты. ценности проведенным исследованием, продуктов, селективный IgA-дефицит и Поэтому использование положительного результата только не 100% исключает уверенности в правильности получения отрицательных результатов обследования, что определяет расширение диагностического поиска и новые методические решения. Помимо изучения возможностей теста по определению ТТА с целью сокращения сроков обследования на первом этапе диагностики целиакии, был проведен анализ гистоморфометрических характеристик СОТК и установлен профиль сывороточных маркеров, используемых для диагностики целиакии, Ретроспективный анализ обследования выявил, что сроки постановки диагноза варьировали от 10 месяцев до 13лет 6 месяцев, большинству больных диагноз был установлен до 4 лет (68,8 %). Основными причинами обследования были поносы и/или изменения характера стула в виде полифекалии, запоров (30,5%), боли в животе (23,5%), задержка темпов физического развития (29%), а также потеря в весе, отягощенная наследственность к целиакии, задержка психо-моторного развития, атопический дерматит и т.д. Для подтверждения диагноза большинству больных (77%) выполнялась ФГДЭС. Анализ данных гистоморфометрии показал, что при выставлении диагноза доминирует 2 стадия по Марш (58,3%), реже 3 стадия (24,3%) и минимальным количеством представлена 4 стадия (всего два 102 случая, 1,7%), что подтверждает превалирование манифестных форм целиакии, протекающих без выраженных изменений в СОТК (рисунок 3.5). Обратило внимание, что диагноз выставлялся как с учетом неспецифических для целиакии гистоморфологических изменений (1 стадия по Марш, 15,7%), так и по сочетанию клинических проявлений, отдельных серологических маркеров, в том числе и по повышению сывороточных антител класса IgG (8,9%), а также только от эффекта назначения безглютеновой диеты (8,9%). При этом комплексное обследование, включающее сывороточные антитела и проведение биопсии, имели 66,5 % пациентов. Рисунок 3.5. Распределение гистоморфометрических повреждений СОТК по классификации Марш на момент выявления целиакии. Анализ лабораторных данных показал, что ведущая диагностическая роль принадлежит антителам к глиадину и тканевой трансглютаминазе. Их назначают чаще других сывороточных маркеров (82%). Кроме сывороточных маркеров для 103 диагностики целиакии, активно используется HLA-генотипирование (рисунок 3.6). Обратило внимание, что HLA-генотипирование чаще проводится не для отрицания целиакии, а для постановки диагноза в случае присутствия HLAмолекул. В связи с внедрением в практическую медицину антител к дезаминированным пептидам глиадина (2011г.) наблюдается тенденция к снижению использования для диагностики целиакии АГА и применение ДПГА. Кроме этого, заметна возрастающая тенденция к использованию ЭМА без четкого представления о роли этих маркеров в диагностике целиакии (рисунок 3.6). Таким образом, ретроспективный анализ обследования пациентов для постановки диагноза показал имеющиеся серьезные методические недостатки в лабораторной диагностике целиакии, которые определяют создание диагностической системы целиакии с включением принципов, клиникодиагностических критерив и алгоритмов обследоваиия. 104 Рисунок 3.6. Тенденция использования лабораторных маркеров для диагностики целиакии 105 ГЛАВА 4. ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ВОЗМОЖНОСТИ СЫВОРОТОЧНЫХ АНТИТЕЛ К ДЕЗАМИНИРОВАННЫМ ПЕПТИДАМ ГЛИАДИНА И АНТИТЕЛ К ТКАНЕВОЙ ТРАНСГЛУТАМИНАЗЕ В КАПИЛЛЯРНОЙ КРОВИ 4.1. Диагностическая информативность антител к дезаминированным пептидам глиадина До недавнего времени морфологическое исследование биоптатов слизистой тонкого кишечника считалось «золотым» диагностическим стандартом. Однако, за последнее десятилетие были накоплены доказательства, свидетельствующие о недостаточной специфичности гистологических маркеров. В связи с этим, акцент в диагностике целиакии переместился на малоинвазивные лабораторные исследования и совершенствование применения сывороточных маркеров. Использование дезаминированных пептидов глиадина как нового эпитопа, который повышал аффинность связывания с антителами (Aleanzi M, Demonte AM, et al, 2001), привело к признанию антител к дезамидированным пептидам глиадина (ДПГА) как эффективным маркерам целиакии. С 2007 года в Европе ДПГА широко используются для диагностики целиакии. В России недостаточная методическая информативность врачей, а также отсутствие стандартизованного протокола по диагностике целиакии приводит к неправильному применению ДПГА для выявления глютеновой энтеропатии. Для оценки клинико-диагностической информативности ДПГА были проведены сравнительные одномоментные измерения комплекса антител (АГА, ТТА, ДПГА), генетический анализ (HLA-DQA1, HLA-DQB1) и оценены гтстологические и морфометрические изменения по Marsh в биопсийном материале СОТК. Представленные в таблице 4.1 результаты проведенных исследований показали большое количество положительных результатов теста при определении антител к глиадину (АГА) в группах больных, соблюдающих диету (39,5%) и в 106 группе сравнения (42%), что наглядно продемонстрировало недостаточную специфичность этого показателя по сравнению с ДПГА (рисунок 4.1). Таблица 4.1 Результаты комплексного обследования (генетический, иммунологический и морфологический анализ) в разных группах обследованных пациентов Генетичес ТТА, % ДПГА, % АГA, % кие полож.резул полож.резуль полож.резуль маркеры ьтатов татов татов (DQ2, DQ8), IgA IgG IgA IgG IgA IgG % выявления Группы больных Стадия целиакии по. Marsh Больные с впервые 15/Marsh выявленной III 19/20 90 90 95 95 85 85 целиакией до 5/Marsh 1 начала лечения (n=20) Больные 6/Marsh III целиакией, 39/45 0 22 16 13 38 84 14/Marsh I соблюдающие 25/Marsh 0 БГД (n=45) Группа 6/Marsh III сравнения 15/50 4 12 6 4 42 40 9/Marsh I (n=50) 35/Marsh 0 Примечание: ТТА – антитела к тканевой трансглутаминазе; АГА- антитела к глиадину; ДПГА- антитела к дезаминированным пептидам глиадина; БГД – безглютеновая диета Сравнительный анализ результатов, полученных при определении сывороточных антител к тканевой трансглутаминазе и к дезаминированным пептидам, показал меньшее количество пропущенных больных (ложноотрицательных результатов) в группе с впервые выявленной целиакией при определении ДПГА. В группе больных, соблюдающих БГД, лучший результат по эффективности проводимого лечения при сравнении с морфометрическими показателями был у IgА-ДПГА (таблица 4.1). В группе пациентов, соблюдающих БГД, были зарегистрированы результаты IgG-ТТА, которые выходили за референтные пределы и были связаны с деструктивными и воспалительными изменения в СОТК. 107 Рисунок 4.1. Влияние безглютеновой диеты и манифестации болезни на результаты исследования ДПГА и АГА Примечание: АГА- антитела к глиадину; ДПГА- антитела к дезаминированным пептидам глиадина; БГД – безглютеновая диета В то же время результаты IgG-ДПГА, превышающие референтные значения, отражали только факт нарушения диеты. Такие же результаты, связанные с деструктивными изменениями в СОТК, были получены в группе сравнения, что еще раз подтвердило недостаточную специфичность IgG-ТТА (таблица 4.1, рисунок 4.2). До сих пор остается до конца не понятным, почему самые специфичные антитела вырабатываются не на главный внешний триггер целиакии глютен, а на фермент тканевую трансглутаминазу, TG2. В связи с этим выдвинуты две основные версии, одна из которых предполагает роль TG2 как гаптен-носителя глютеновых пептидов, и молекулярная мимикрия, представляющая особый интерес как основной триггер аутоиммунной патологии, к которой относят целиакию. Молекулярную мимикрию при целиакии объясняют формированием дезаминированных пептидов глиадина, которые образуются благодаря воздействию на них TG2. Проведенные научные исследования показали, что процесс дезаминирования глютеновых пептидов, обеспечивает, помимо 108 связывания с молекулами HLA-DQ2, HLA-DQ8, ещё и появление модифицированных эпитопов (антигенные детерминанты), которые по своей структуре очень похожи на эпитопы TG2. Этим объясняют молекулярную мимикрию, способствующей выработке ТТА-зависимых антител к дезаминированным пептидам глютена [207]. Рисунок 4.2. Результаты обследования пациентов в группе сравнения на IgG-ДПГА и IgG- ТТА В отличие от дезаминированных пептидов глютена, которые принимают активное участие в патогенезе целиакии, глиадиновые пептиды распознаются и связываются антителами как ответная иммунная реакция на антиген, не отражающая характерные изменения в слизистой тонкого кишечника. Поэтому они не являются достаточно специфичными, в то время как ТТА-зависимые антитела, или ДПГА, проявляют высокую специфичность. Это подтвердили результаты наших исследований, которые при сравнительном анализе, показали 109 наибольшую специфичность у ДПГА и наименьшую – у АГА, особенно у IgGАГА (таблица 4.2). Таблица 4.2 Диагностическая информативность сывороточных маркеров целиакии Чувствит Антитела ельность (%) ОП Специфич ность (%) Площадь ПЦ под ROC- ОП+ ОП- ПЦПР ПЦОР кривой IgA-АГА 86,7 89,2 8,02 0,15 83,7 90,3 0,914 IgG-АГА 93,3 61,4 1,92 0,13 80,2 88,9 0,759 IgA-ТТА 94,8 96,7 28,52 0,07 94,7 96,8 0,950 IgG-ТТА 84,2 89,8 8,25 0,18 83,1 90,1 0,920 IgA-ДПГА 94,7 91,8 11,61 0,06 90,3 94,7 0, 926 IgG-ДПГА 94,4 93,7 15,11 0,059 91,9 95,7 0,959 Примечание. ОП-отношение правдоподобия; ОП+, ОП- – отношение правдоподобия положительного и отрицательного результатов теста; ПЦ- предсказательная ценность; ПЦПРпредсказательная ценность положительного результата; ПЦОР- предсказательная ценность отрицательного результата. Показатели площади под ROC-кривой, а также отношение правдоподобия и предсказательная ценность положительного и отрицательного результатов тестов, оказались лучшими у IgA-ТТА, IgG-ДПГА, IgA-ДПГА и худшими у IgG-ТТА и IgG-АГА, IgА-АГА (рисунок 4.3, таблица 4.2). Таким образом, полученные лабораторные характеристики ДПГА, определяют превосходство теста для определения антител к дезаминированным пептидам глиадина по сравнению с АГА и диктуют необходимость замены АГА на ДПГА, что повысило бы диагностическую эффективность и способствовало снижению пропусков при выявлении заболевания. Кроме этого, установленные для IgG-ДПГА лабораторные показатели, в отличие от IgG-ТТА, способствуют решению имеющихся проблем по диагностике селективного IgА-дефицита, 110 ассоциированного с целиакией. Селективный IgА-дефицит регистрируется у 12% больных целиакией и поэтому совершенствованию и эффективности его диагностики уделяется большое внимание (MА.Chow, 2012). Рисунок 4.3. Сравнительная характеристика значений площади под ROC-кривой, полученных при определении АГА, ТТА и ДПГА Примечание: Sensitivity-чувствительность; specificity-специфичность Для исключения диагностических пропусков селективного IgА-дефицита в настоящее время проводится дополнительное определение сывороточного общего IgА, а также совместное с IgА определение IgG-ТТА, IgG-АГА. Недостаточная их специфичность часто приводит к дополнительному и необоснованному повторному обследованию пациента, а использование общего IgА, как отдельных тестов, не совсем удобно в алгоритме обследования пациента. Поэтому включение специфичного маркера IgG-ДПГА для диагностики селективного IgАдефицита у больных целиакией, позволяет в этом случае значительно улучшить и ускорить диагностику целиакии. 111 Обратила на себя внимание недостаточная чувствительность ДПГА (таблица 4.2), которая не отличается от чувствительности IgA-ТТА и поэтому не может, так же, как и другие тесты, cамостоятельно решить проблему по выявлению субклинических форм, которые могут протекать без выраженных изменений комбинации в СОТК. тестов, Однако, рассмотрение способствующей возможности повышению оптимальной диагностической эффективности, определило проведение анализа различных комбинаций тестов, представленных в таблице 4.3. Было установлено, что комбинации IgA-ТТА+IgAДПГА+IgG-ДПГА и IgA-ТТА+IgG-ДПГА являются диагностически эффективными и отличаются от других комбинаций значениями отношения правдоподобия положительного (ОП+) и отрицательного (ОП-) результатов теста, предсказательной ценностью положительного результата теста (ПЦПР), специфичностью, чувствительностью и площадью под ROC-кривой (таблица 4.3). Значение отношения правдоподобия положительного результата теста отражает вероятность получения положительных результатов теста у больных, по сравнению со здоровыми пациентами и характеризует диагностическую точность исследования. Поэтому, установленные диагностические характеристики для комбинации тестов (IgA-ТТА+IgG-ДПГА+IgG-ДПГА и IgA-ТТА+IgG-ДПГА) со значением отношения правдоподобия положительного результата теста равным 46,67 являются лучшими и значительно повышают диагностическую эффективность целиакии. Однако, комбинация IgA-ТТА+IgG-ДПГА имеет преимущества по сравнению IgA-ТТА+IgA-ДПГА+IgG-ДПГА за счет меньшего количества тестов и более быстрого исполнения, а также экономической целесообразности данной комбинации тестов. Как комбинации показало тестов проведенное исследование, принцип оптимальной улучшает диагностическую ситуацию, особенно для манифестных форм целиакии, протекающих с разной степенью поражения СОТК (таблица 4.3). Такая оптимальная комбинация может быть объяснена совместным использованием аутоантител (ТТА) с антителами к внешнему антигену (ДПГА). Известно, что большая концентрация низкоаффинных аутоантител может дать 112 сигнал более сильный, чем малая концентрация высокоаффинных специфических аутоантител. Поэтому поликлональная активация В-клеток приводит к синтезу большого количества полиспецифичных антител, что объясняет ложноположительные реакции в серологических тестах. И, если взаимодействие специфичных антител при целиакии происходит только с одной определенной антигенной детерминантой (каталитический активный центр TG2), то неспецифичные антитела связываются с несколькими антигенными эпитопами (внешние домены TG2), что приводит к ложноположительным результатам [28]. В то же время неспецифическое и перекрестное связывание аутоантител может давать невысокие титры аутоантител. Тем не менее, как ложноположительные, так и ложноотрицательные реакции в серологических тестах могут быть компенсированы присутствием специфических серологических маркеров, не относящихся к аутоантителам (в нашем случае ДПГА). Таблица 4.3 Комбинация тестов по определению антител к дезаминированным пептидам глиадина (ДПГА) и к тканевой трансглутаминазе (ТТА) для повышения диагностической эффективности IgA-ДПГА + IgA-ТТА + IgA-ТТА + IgA- IgA-ТТА IgG-ДПГА ДПГА+IgG-ДПГА Cпецифичность% 95.8 97.9 97.9 Чувствительность% 94.4 97.2 97.2 0.99 0.992 0.992 22,67 46.67 46.67 0.058 0.028 0.028 ПЦПР 94.4 97.2 97.2 ПЦОР 95.8 97.9 97.9 Площадь под ROCкривой ОП+ ОП - Примечания: ОП+ – отношение правдоподобие положительного результата теста; ОП- – отношение правдоподобие отрицательного результата теста; ПЦПР – предсказательная ценность положительного результата теста; ПЦОР – предсказательная ценность отрицательного результата теста. 113 Однако улучшение диагностической информативности окончательно не решает проблем по выявлению глютеновой энтеропатии, оставляя все-таки возможность получения как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов (таблица 4.3). Таким образом, изучение клинико-диагностической информативности антител к дезаминированным пептидам глиадина показало, что использование ДПГА для диагностики селективного целиакии за IgA-дефицита способствует счет улучшению использования выявления высокоспецифичного IgG–ДПГА, повышает диагностическую эффективность обследования как за счет замены АГА на ДПГА, так и установленной оптимальной комбинации тестов. 4.2. Оценка аналитических возможностей иммунохроматографического экспресс-метода для определения ТТА в капиллярной крови Использование нового субстрата – эндогенной тканевой трансглутаминазы, полученной при лизисе собственных конкурентное преимущество эритроцитов пациента, определяло иммунохроматографического экспресс-метода, связанное с отсутствием необходимости очистки и нанесения субстрата, использования предполагало определенного улучшение качества полистироловых диагностических показателей планшетов, и что возможность применения данного метода для выявления субклинических форм целиакии. Кроме этого, пожизненная диетотерапия, которая сопровождает больных целиакией, требует ее постоянного домашнего мониторирования. Поэтому использование доступного, удобного и специфичного субстрата, который реализовался в иммунохроматографическом экспресс-тесте, впервые решило проблему доступности мониторинга диетотерапии в домашних условиях, а также быстрой постановки диагноза. В связи с этим были проведены клинические испытания иммунохроматографического экспресс-метода по определению тканевых трансглутаминазных антител в капиллярной крови у 87 пациентов и 114 выполнен анализ полученных данных с сывороточными ТТА и морфометрическими маркерами, который представлен в таблице 4.4. Таблица 4.4 Сравнительная характеристика результатов обследования Группы пациентов Результаты ТТАс (-) Больные целиакией Пациенты без целиакии (+) Результаты биопсии Результаты экспресс-теста (-) (+) (-) (+) Общее количество 0 12 2 10 3 9 12 75 0 75 0 75 0 75 При работе с иммунохроматографическим экспресс-тестом объективная оценка получаемых результатов обеспечивалась двумя независимыми операторами, которые не были знакомы с диагнозом и результатами обследования пациентов. Идентификация двух индикаторных красных полос, свидетельствующих о присутствии тканевых трансглутаминазных антител у пациента и правильной работе теста, проводилась через 5 минут, но не позже, чем через 10 минут с момента завершения теста. Необходимое количество цельной капиллярной крови для исследования - 10 мкл. В группе пациентов с подозрением на целиакию (87 пациентов), после проведенного обследования, были выделены пациенты (10) с положительными результатами, полученными при исследовании венозной и капиллярной крови. Сравнительная характеристика данных по сывороточным маркерам и результатам, полученным экспресс-тестом, показала (таблица 4.4): 1. Три пациента имели расхождения в результатах обследования: значения сывороточных маркеров, выходящие за референтные пределы, сочетались с отрицательными значениями экспресс-теста. 2. Три положительных результата быстрого теста вызвали сомнение из-за слабой окраски тест-зоны и привели к необходимости анализа полученных 115 результатов для исключения субъективности в оценке и их правильной интерпретации. Анализ полученных результатов показал, что плохо видимая красная линия положительного результата быстрого теста была связана с незначительным повышением (от 22 до 28Е/мл, при норме 20Е/мл) тканевых трансглутаминазных антител в сыворотке венозной крови (рисунок 4.4). Рисунок 4.4. Визуализация возможных результатов экспресс-теста Справа - контрольная тест-зона (яркая красная полоса внутреннего контроля) Слева – вверху три слабоположительных и положительный результаты 3. В группе пациентов с диагнозом целиакия, находящихся на БГД больше года, быстрым тестом был получен один положительный результат, который коррелировал с положительными результатами сывороточных маркеров и подтвердил нарушения в диете. 4. В группе контроля были зарегистрированы только отрицательные результаты, полученные быстрым тестом, что подтвердило его высокую специфичность. 5. Анализ морфометрических характеристик биоптатов, показал, что из десяти пациентов, имеющих положительные результаты сывороточных маркеров и быстрого теста, только у восьмерых были зарегистрированы характерные для 116 целиакии гистологические маркеры (таблица 4.4). У этих же пациентов были обнаружены и генетические маркеры глютеновой энтеропатии. Результаты, представленные в таблице 4.4, показали, что при сравнительной характеристики ТТА-теста и экспресс-теста относительно морфометрических показателей, худшим оказался экспресс-тест. Отсутствие количественных характеристик и вынужденная качественная характеристика получаемых результатов усиливали субъективность оценки, особенно при невыраженной окраске тест-зоны. Таким образом, качественная оценка вместе с отсутствием опыта и предварительного обучения для правильной трактовки результатов, сказались на разнице в оценке диагностических показателей (таблица 4.5). Таблица 4.5 Диагностические показатели экспресс-теста Экспресс- тест Специфич ность Чувствительность ОП+ ОП+ ПЦПР ПЦОР Без предварительного 94.4 83.3 15.0 0.18 71.4 97.1 обучения Предварительное 97.2 92.3 32.77 0.08 85.7 98.6 обучение Примечания: ОП+ – отношение правдоподобие положительного результата теста; ОП- – отношение правдоподобие отрицательного результата теста; ПЦПР – предсказательная ценность положительного результата теста; ПЦОР – предсказательная ценность отрицательного результата теста. Представленные в таблице 4.5 результаты, полученные с предварительным обучением и без него, показали необходимость предварительного его проведения у медицинского персонала, в связи с обеспечением более высокой достоверности получаемых результатов. Только при соблюдении этих условий предсказательная ценность положительного и отрицательного результатов (ПЦПР, ПЦОР), а также показатели отношения правдоподобия (ОП+, ОП-) определяют высокую информативность теста. Диагностические характеристики экспресс-теста при предварительном обучении оказались сопоставимыми с диагностическими характеристиками сывороточных маркеров, что позволяет значительно сокращать 117 время обследования пациента. Высокие значения ПЦОР и низкие ОПобуславливают также высокую вероятность отсутствия заболевания при отрицательном результате теста с достоверностью 98,6%. Обратила на себя внимание высокая (92,3%), но все же недостаточная для выявления субклинических форм, чувствительность теста. Полученные результаты по работе экспресс-теста позволили определить его преимущества и недостатки. Преимущества: 1. Простота – возможность проведения исследования без использования лабораторного оборудования и предварительного обучения медперсонала. 2. Оперативность – позволяет быстро (~ 10-15 минут) получить результат обследования прямо в кабинете врача и в короткие сроки поставить диагноз, предупреждая дальнейшее прогрессирование заболевания. 3. Существенное сокращение времени обследования за счет уменьшения этапов обследования пациентов (без определения сывороточных маркеров). 4. Экономичность, которая объясняется как минимальными затратами на приобретение теста без необходимости закупки лабораторного оборудования и создания специальной инфраструктуры с привлечением дополнительных штатных единиц (тест может быть выполнен медсестрой в кабинете врача), так и минимальным временем на выполнение самого теста. 5. Экспресс-тест не требует специальных условий хранения (хранение в температурном режиме от +10 ºС до +27 ºС). 6. Минимальное количество капиллярной крови (10 мкл) для исследования позволяет отказаться от инвазивной процедуры забора венозной крови, а также дает возможность проведения повторных исследований при неясной клинической картине и необходимости наблюдения за пациентом, что особенно важно для детской возрастной группы. 7. Доступность мониторирования эффективности диетотерапии в домашних условиях. Комплектация быстрого теста включает стерильный скарификатор и дезинфицирующую жидкость. 118 Недостатки экспресс- теста: 1. Присутствующая субъективность в оценке результатов, особенно при пограничных или незначительных превышениях ТТА-к может привести к пропуску положительных результатов. 2. Для проведения исследования, несмотря на простоту процедуры, необходимо предварительное обучение для правильного выполнения теста и должной интерпретации полученных результатов 3. Тест не исключил дополнительного обследования при неопределенном результате. 4. Недостаточная чувствительность иммунохроматографического экспрессметода не решает диагностических проблем целиакии. 5. ТТА в капиллярной крови, также, как и ТТА в венозной крови, не исключают возможность получения ложноположительных результатов, что создает необходимость расширения диагностической панели с целью их исключения. Таким образом, апробированный иммунохроматографический экспрессметод для определения тканевых трансглутаминазных антител в капиллярной крови пациента зарекомендовал себя как быстрый, удобный и высокоспецифичный лабораторный тест. Он позволяет существенно облегчить и ускорить постановку диагноза, но только при определенных результатах теста. Достоверность результатов определяется необходимостью предварительного обучения, что не предусматривает его широкое использование. Кроме этого, иммунохроматографический тест не может использоваться как самостоятельный тест из-за необходимости подтверждения результатов более специфичными тестами. В связи с этим, предназначенная для этого теста роль скринирующего теста для быстрой постановки диагноза не оправдана. Полученные для этого теста лабораторные характеристики с учетом выявленных недостатков, хуже, чем у других сывороточных маркеров (ЭМА, ТТА), поэтому, несмотря на экономическую доступность и быстроту получения результатов, использование этого теста в настоящее время диагностически не оправдано. 119 ГЛАВА 5. ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ СУБЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ДЕПОЗИТОВ К ТКАНЕВОЙ ТРАНСГЛУТАМИНАЗЕ В СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКЕ ТОНКОГО КИШЕЧНИКА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СУБКЛИНИЧЕСКИХ ФОРМ И РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ ЦЕЛИАКИИ. ВЗАИМОСВЯЗЬ СООТВЕТСТВИЯ ДЕФИЦИТА КАРНИТИНА СО СТЕПЕНЬЮ ПОРАЖЕНИЯ СОТК У БОЛЬНЫХ ЦЕЛИАКИЕЙ ДЛЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ 5.1. Прогностическая значимость субэпителиальных депозитов к тканевой трансглутаминазе в слизистой оболочке тонкого кишечника для выявления субклинических форм и ранней диагностики целиакии Ответная реакция на глютен у больных целиакией начинается в собственной пластинке слизистой оболочки тонкого кишечника (lamina propria), куда проникают пептиды (протективный глютена, не ретротрансцитоз). подвергаясь Этот факт кишечному объясняет протеолизу возможность субэпителиального депонирования IgA антител к тканевой трансглутаминазе (IgA-ТТ-д) в слизистой оболочке тонкого кишечника (СОТК) еще до развития в ней морфологических изменений, характерных для целиакии (Korponay-Szabo, I.R., 2004). Раннее субэпителиальное депонирование IgA-ТТ-д определяет им более высокую диагностическую значимость для выявления ранней целиакии и манифестных форм, протекающих с разной степенью выраженности гистоморфологических изменений СОТК. В России IgA-ТТ-д не изучались и до сих пор не применяются для диагностики глютеновой энтеропатии. Для оценки диагностической эффективности IgA-ТТ-д всем пациентам, включенным в это исследование, выполнялось также определение ТТА в сыворотке крови, HLAгенотипирование (HLA-DQ2, HLA-DQ8) и исследование морфометрических маркеров в образцах СОТК. 120 Для анализа полученных данных были рассмотрены как больные с типичным течением целиакии, так и пациенты с атипичными формами (подгруппы I и II основной группы). Часть больных с впервые выявленной целиакией (n=21) была обследована до начала терапии и перехода на безглютеновое питание; некоторые больные, имеющие установленный диагноз, не придерживались регулярно предписанной безглютеновой диеты (n=23), что влияло на результаты исследований. Эти пациенты были проанализированы в сопоставлении с больными, строго соблюдавшими диету (n=21). Результаты лабораторных и морфологических исследований представлены в таблице 5.1 и рисунке 5.1. Таблица 5.1 Частота выявления IgA-ТТ-д в группах обследованных пациентов Группы больных Больные целиакией до начала лечения (n=21) Больные целиактией, соблюдающие БГД (n=21) Больные целиакией, нарушающие БГД (n=23) Группа сравнения (n=45) ТТА, доля полож. результатов (%) Стадия целиакии по M. Marsh IgA-ТТ-д, доля полож. результатов (%) Носительство DQ2,DQ8, доля полож. результатов (%) 85,7 18/Marsh III 3/Marsh 0 95,2 90,5 14,3 8/Marsh I 13/Marsh 0 95,2 85,7 30,4 7/Marsh III 10/Marsh I 6/ Marsh 0 100 87,0 10,8 5/Marsh III 20/Marsh I 40/Marsh 0 7,7 23,1 БГД – безглютеновая диета При обследовании группы сравнения было выявлено, что сывороточные IgA-ТТА и IgG-ТТА превышали референтные значения только у 7 из 45 121 пациентов (10,8%) с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки, аллергической энтеропатией, неспецифическим язвенным колитом, эрозивным гастритом, аутоиммунным тиреоидитом, сахарным диабетом, себорейным дерматитом в анамнезе. Эти данные еще раз подтвердили полученные ранее результаты о недостаточной специфичности ТТА и возможном активном участии их как в воспалительных процессах и в механизмах повреждения СОТК (IgGТТА), так и при аутоиммунной патологии (IgА-ТТА). Рисунок 5.1. Частота выявления субэпителиальных ТТ-д в СОТК и ТТА в сыворотке крови для обследованных групп: 1 – больные целиакией; 2 – группа больных, строго соблюдающих БГД; 3 – группа больных, эпизодически нарушающих БГД; 4 – группа сравнения. БГД – безглютеновая диета Морфометрические показатели биопсийного материала СОТК в группе сравнения у 5 из 45 пациентов соответствовали изменениям при деструктивной стадии целиакии по Marsh. Как показали наши наблюдения, эти результаты были зарегистрированы у пациентов с деструктивными (эрозивными) поражениями 122 СОТК, такими, как: язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки, эрозивный гастрит, язвенная болезнь желудка. В то же время значения сывороточных IgAТТА у этих пациентов не превышали установленные референтные пределы, отсутствовала так же наследственная предрасположенность к целиакии, а количественные значения IgA-ТТ-д депозитов не отличались от значений, установленных для группы сравнения. Кроме этого, наблюдалась положительная динамика на фоне лечения, назначенного согласно подтвердили мнение выставленному о возможной диагнозу. схожей с Полученные целиакией результаты выраженности морфологических изменений СОТК при других заболеваниях тонкой кишки, обусловленных иммунными нарушениями [32,20]. Присутствие генетических маркеров было зарегистрировано у 15 из 45 пациентов, что составило 33,3% и подтвердило мультифакторность целиакии с возможностью носительства HLA-гаплотипов у лиц, не болеющих этим заболеванием. Результаты измерения IgА-ТТ-д выражались в единицах оптической плотности (оп) с дальнейшим переводом их в произвольные единицы AU (arbitrary units). Значения AU рассчитывались как отношения оптической плотности, полученное для каждого пациента к некоторому эталонному значению оптической плотности. В качестве эталонного принималось значение точки отсечения (cut-off), которое определялось при проведении ROC-анализа. На рисунке 5.2 в качестве примера показана ROC-кривая для субэпителиальных депозитов IgА-ТТ-д в биопсийном материале в группе больных целиакией до начала лечения. На ROC-диаграмме приведено значение точки отсечения (0,25) и значения чувствительности и специфичности для критерия 0,25. Аналогичные расчеты эталонных значений оптической плотности и AU проводились и для других групп пациентов, с расчетом. средних значений AU и 95% доверительного интервата для каждой группы пациентов. Результаты, полученные в группе сравнения по IgA-ТТ-д, показали, что среднее значение AU у них было минимальным - 0,665 AU (таблица 5.2). Однако, 123 у пяти пациентов из этой группы, имеющих в анамнезе аутоиммунные заболевания, были зарегистрированы значения IgA-ТТ-д (в среднем 2,06 AU), превышающие установленное для этой группы среднее значение, что предполагает недостаточную специфичность IgA-ТТ-д. Рисунок 5.2. Результаты ROC-анализа субэпителиальных депозитов IgА-ТТ-д в биопсийном материале группы больных целиакией до начала лечения Результаты, полученные в группе сравнения по IgA-ТТ-д, показали, что среднее значение AU у них было минимальным - 0,665 AU (таблица 5.2). Однако, у пяти пациентов из этой группы, имеющих в анамнезе аутоиммунные заболевания, были зарегистрированы значения IgA-ТТ-д (в среднем 2,06 AU), превышающие установленное для этой группы предполагает недостаточную специфичность IgA-ТТ-д. среднее значение, что 124 Таблица 5.2 Средние значения для IgА-ТТ-д по каждой группе обследованных пациентов Средние значения и 95% ДИ, AU Группы больных Больные целиакией до начала лечения (n=21) типичная целиакия 22,615 (16,501-27,499) атипичная целиакия 5,477 (3,448-6,559) Больные целиакией, соблюдающие БГД (n=21) 0,920 (0,779-0,983) Больные целиакией, нарушающие БГД (n=23) 2,261 (1,611-2,820) Группа сравнения (n=45) 0,665 (0,601-0,777) Примечание: ДИ – доверительный интервал; AU – произвольные единицы. Достоверность различий относительно группы сравнения p 0,001 Зарегистрированные ложноположительные результаты обследования (IgAТТ-д и ТТА) у пациентов с аутоиммунной патологий получили объяснение описанной выше возможностью формирования клона незрелых В-клеток с гипермутациями в V-генах, приводящие к повышению аффинности связывания антител к нетипичному для них антигену. В группе больных с впервые выявленной целиакией до начала терапии определение IgA-ТТ-д характеризовалось высокой частотой положительных результатов при сопоставлении с группой сравнения. В группе c впервые выявленной целиакией количественная характеристика (средние значения, выраженные в произвольных единицах, AU) соответствовала как очень высокому уровню у больных с типичным течением целиакии до лечения (22,615 AU, с разбросом от 16,501 до 27,499 AU), так и умеренно повышенному при атипичных формах (5,477 AU с разбросом от 3,448 до 6,559 AU). При этом результаты гистологических маркеров были сравнимы выраженности у этих же пациентов (таблица 5.2). и не отличались по своей 125 Исключение составили 3 больных с высокими значениями IgA-ТТ-д из этой группы пациентов, у которых была установлена бессимптомная форма целиакии. Все они не предъявляли жалоб и обследовались в связи с выявлением целиакии у ближайших родственников. У двух больных умеренно повышенные IgA-ТТА депозиты (6,92 AU) сочетались с не превышающими референтные пределы значениями сывороточных и морфометрических показателей. В ходе динамического наблюдения в течение 6 месяцев было отмечено нарастание тяжести клинической симптоматики, а при повторном взятии биоптата была установлена деструктивная стадия по М.Marsh и назначена безглютеновая диета. Исследование ТТА только в 85,7% случаев при впервые выявленной целиакии дало положительные результаты. В то же время у 3 из 21 больного ТТА не превышали установленные референтные пределы, что подтвердило недостаточную чувствительность этого маркера. Результаты молекулярно-генетических исследований в этой группе пациентов, так же как в группе больных, находящихся постоянно или нарушающих безглютеновую диету, подтвердили ассоциацию целиакии с HLAгаплотипами (установленный процент носительства HLA-гаплотипов составил 90,5%, 85,7% и 87,0%, соответственно). Морфометрические измерения слизистой оболочки тонкого кишечника, характерные для целиакии, отсутствовали у 3-х больных среди пациентов с впервые выявленным заболеванием. У одного из них была установлена латентная форма целиакии на основании высоких титров ЭМА, значительно превышающих референтные пределы результатов для ТТА и клинических проявлений – эпизодическое нарушение стула (до 3-4 раз в день) и повышенная утомляемость. Отсутствие характерных для целиакии гистоморфометрических изменений СОТК у двух других пациентов из этой группы может свидетельствовать о мозаичности (фрагментарности) поражения СОТК при целиакии и необходимости взятия большего количества биоптатов для получения достоверных результатов. 126 Большой интерес представляло изучение соотношений находок IgA-ТТ-д и степени морфометрических изменений. Проведенный корреляционный анализ зависимости между IgA-ТТ-д и стадией повреждения СОТК по Marsh показал отсутствие линейной корреляционной зависимости (rs=0,13, p0,05), представленное на рисунке 5.3. Отсутствие корреляции позволяет использовать определение IgA-ТТ-д в сложных диагностических ситуациях и представляет это исследование важным для диагностики манифестных форм целиакии, протекающих с минимальными отклонениями морфометрических показателей. Стадия повреждения СОТК (по МАРШ) 4 3.5 R2 = 0.1334 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 5 10 15 20 25 30 AU Рисунок 5.3. Сопоставление степени повреждения СОТК и уровня IgA-ТТ-д у больных с целиакией Таким образом, отсутствие корреляции при сопоставлении степени повреждения СОТК и уровнем IgA-ТТ-д у больных с целиакией объясняет 127 высокие и умеренно повышенные значения IgA-ТТ-д при отрицательных результатах как сывороточных, так и морфометрических маркеров и является важным диагностическим дополнением для установления целиакии с помощью исследования субэпителиальных депозитов СОТК Группа пациентов с установленным диагнозом целиакии находилась на безглютеновой диете, строго соблюдая рекомендации по питанию или периодически их нарушая. При строгом соблюдении диеты в течение года концентрация сывороточных маркеров (ТТА) приходила в норму значительно быстрее, чем значения IgA-ТТ-д. Так, сывороточные маркеры нормализовались в течение двух-трех месяцев диетотерапии (в зависимости от начальной концентрации ТТА), в то время как IgA-ТТ-д за год соблюдения строгой безглютеновой диеты не достигали значений, характерных для группы сравнения (0,92 AU против 0,66 AU, соответственно). При эпизодическом нарушении диеты, только у 7 из 23 пациентов (30,4%) ТТА были повышенными и, следовательно, могли подтвердить факт нарушения безглютенового режима питания. Среди больных, строго соблюдающих диету, у всех пациентов, за исключением трех, ТТА находились в установленных референтных пределах. Субэпителиальные депозиты к тканевой трансглутаминазе, в отличие от ТТА, максимально точно (100%) выявляли нарушения диеты. Их количественная характеристика более чем в 2 раза превышала таковую у лиц, строго соблюдающих безглютеновую диету. Полученные результаты были объяснены тем фактом, что доставку необработанных пептидов глютена через базальную мембрану кишечного эпителия в собственную пластинку обеспечивает у больных целиакией увеличенная экспрессия CD71 (рецептор трансферрина) на апикальной поверхности эпителиоцитов и его высокая аффинность связывания с секреторным и димерным IgA (д IgA /с IgA). С помощью этого факта стало возможным лучшее понимание формирования патологического иммунного ответа и объяснение феномена субэпителиального депонирования IgA-ТТ-д в СОТК, со строгой специфичностью к TG2. Ковалентное связывание TG2 пептидов глютена определяет и присутствие IgA-ТТА в образовавшихся комплексах. Кроме этого 128 было подтверждено, что у больных целиакией, не получающих глютен, сохраняется остаточная экспрессия CD71, которая способствует проникновению небольшого количества пептидов глютена в собственную пластинку слизистой тонкого кишечника и поддерживает воспалительные процессы в СОТК. Эти данные подтверждают и результаты нашего исследования: эпизодическое нарушение безглютеновой диеты может не выявляться сывороточными и морфометрическими показателями, но умеренное повышение IgA-ТТ-д указывает на сохраняющийся воспалительный процесс в СОТК. Этот факт также объяснил отличие IgA-ТТ-д от сывороточных IgA-ТТА, быстро снижавшихся до нормы и не отражавших истинную картину восстановительных процессов в СОТК у больных целиакией, получающих адекватную диетотерапию. Сравнительный анализ морфометрических показателей в группах пациентов, находящихся на строгой безглютеновой диете и эпизодически её нарушающих, показал, что морфометрические данные у пациентов на строгой диете соответствовали преимущественно Marsh 0 (у 13пациентов) и Marsh I (у 8 пациентов). В то же время, несоблюдение диеты поддерживало морфометрические изменения на уровне Marsh III (у семи пациентов), Marsh I (у десяти пациентов), а Marsh 0 – только у шести больных. Представленные данные морфометрических показателей еще раз наглядно продемонстрировали необходимость соблюдения строгой безглютеновой диеты. Отсутствие характерных для целиакии гистоморфометрических изменений СОТК у шести пациентов из группы, эпизодически нарушающих рекомендации по питанию, так же, как и у лиц с впервые установленным диагнозом до начала лечения, может свидетельствовать о мозаичности (фрагментарности) поражения СОТК при целиакии и необходимости многоточечного взятия биоптатов. В то же время, проведенный ROC-анализ не выявил преимуществ у исследования субэпителиальных депозитов, определив у них только более высокую чувствительность по сравнению с остальными антителами (таблица 5.3). Диагностическая информативность, которую поддерживают значения отношения правдоподобия и предсказательной ценности положительного результата теста, а 129 также площадь под ROC-кривой, оказалась лучшей у IgA-ТТА (таблица 5.3, рисунок 5.3). По данным проведенного исследования установлена высокая прогностическая значимость отрицательного результата у IgA-ТТ-д (таблица 5.3), которая позволяет судить о высокой степени вероятности отсутствия заболевания при отрицательном результате. Поэтому даже незначительные превышения точки отсечения (cut-off) имеют диагностическое значение, что подтверждает отношение правдоподобия положительного результата. Таким образом, проведенное исследование продемонстрировало возможность более точной диагностики целиакии с помощью IgA-ТТ-д и отличные диагностические качества IgA-ТТ-д для мониторинга диетотерапии, выявления эпизодических нарушений в режиме питания. Однако, нельзя не отметить недостатки этих маркеров, один из которых связан с инвазивностью проводимой процедуры, не позволяющей широкое применение этого теста. Кроме этого, возможность получения ложноположительных результатов IgA-ТТ-д у пациентов с аутоиммунной патологией, требует дифференцированного подхода при оценке ее результатов. 130 Таблица 5.3 Сравнительная характеристика диагностической информативности показателей сывороточных ТТА и субэпителиальных депозитов IgA-ТТ-д у больных целиакией Антитела Чувствительность (%) Специ фично сть (%) IgA - ТТА 90,7 96,8 IgG - ТТА 81,0 88,7 IgA-ТТ-д 95 93,5 Морфомет рические маркеры 85,7 92,4 ОП 95% ДИ 0,8960,992 0,8290,963 0,8600,979 0,8060,947 ПЦ (%) ОП+ ОП- ПЦПР ПЦОР Площадь под ROCкривой 27,9 0,1 90,0 96,8 0,963 7,17 0,21 70,8 93,2 0, 912 14,72 0,063 82,6 98,3 0,937 11,31 0,15 78,3 95,4 0,891 Примечания: ОП+ – отношение правдоподобие положительного результата теста; ОП- – отношение правдоподобие отрицательного результата теста; ПЦПР – предсказательная ценность положительного результата теста; ПЦОР – предсказательная ценность отрицательного результата теста; ДИ – доверительный интервал. Рисунок 5.3. Графическое изображение площади под ROC-кривой IgA-ТТ-д, морфометрических маркеров и ТТА 131 5.2. Взаимосвязь соответствия дефицита карнитина со степенью поражения СОТК у больных целиакией В настоящее время, помимо диагностических, активно изучаются неспецифические маркеры целиакии, которые позволяют оптимизировать лечение глютеновой энтеропатии и повысить его эффективность. Среди большого количества исследований выделяются работы, направленные на связь пониженного уровня свободного карнитина и ацилкарнитинов с клиническим состоянием больных целиакией [216,289]. По своей химической структуре Lкарнитин (3-гидрокси-4-N,N,N-триметиламинобутират, L-3-гидрокси-4-N- триметиламино- бутановая кислота, или γ-триметиламино-β-гидроксибутановая кислота) представляет собой холиноподобный четвертичный амин. В многочисленных исследованиях были определены функции L-карнитина, среди которых особое место занимает его участие в метаболизме жирных кислот. В настоящее время установлено, что карнитин может присутствовать как в свободном виде, так и в форме О-ацильных эфиров (ацилкарнитины), которые образовываются за счет эстерификации его гидроксильной группы. Карнитин, связывая жирные кислоты, обеспечивает транспорт жирных кислот в митохондриальный матрикс в виде О-ацильных эфиров, или ацилкарнитинов, которые проходят внешнюю мембрану митохондрии. После чего ацилкарнитины преобразуются в соответствующие ацилкоэнзимы (ацил-КоА), имеющие доступ в матрикс митохондрии, где и подвергаются β–окислению. Помимо его интегрального воздействия на энергетические процессы в организме человека, установлено влияние карнитина на химический состав миелиновой оболочки для проведения нервных импульсов, ингибирование клеточного апоптоза, достижение оптимального липидного состава мембран клетки, стимуляцию иммунного ответа и снижение активности регулирование массы воспалительных тела и др., что цитокинов, процессы объясняет его старения, значимость как дополнительного маркера целиакии [87,126,182,273,292]. В организме человека основное количество карнитина содержится в мышцах и сердце, что обусловлено 132 высокой активностью липидного обмена в данных тканях. В связи с этим главными органами-«мишенями» при недостаточности карнитина служат скелетные мышцы и миокард, а также клетки головного мозга, печень и почки. Исходя из основных функций карнитина, вторичный дефицит карнитина клинически может проявляться от умеренного повышения утомляемости до тяжелых энцефалопатий, полиневропатиями, снижением работоспособности, мышечной слабостью, гипотонией и гипотрофией, отставанием в физическом и психомоторном развитии, неврологическими нарушениями, сонливостью или раздражительностью, нарушением функции сердца и печени, анорексией, частыми инфекционными заболеваниями [216, 263]. В связи с масштабностью воздействия карнитина на организм человека, нормализация уровня при его недостатке имеет большое клиническое значение. Установлено, что уровень карнитина в крови больных целиакией снижен и его понижение объясняется совокупностью нарушений в процессах ассимиляции, всасывания, состоянии ферментативных и транспортных систем тонкого кишечника, характерных для глютеновой энтеропатии [254]. Результаты проведенных исследований вместе с появившейся возможностью использования карнитина в комплексном лечении для улучшения качества жизни больных, определили его как важный неспецифический маркер в динамике наблюдения за больными с глютеновой энтеропатией. Вместе с тем, отечественные исследования по данной проблеме отсутствуют. В ходе проведенного исследования были определены уровни свободного карнитина и ацилкарнитинов в группах пациентов с впервые выявленной целиакией (длительно не диагностируемой) и у пациентов с установленным диагнозом, находящихся на безглютеновой диете в течение года, Характер изменений уровня свободного карнитина, ацилкарнитинов в обеих группах больных целиакией по сравнению с контрольной группой представлен в таблице 5.4. Полученные результаты убедительно показали снижение концентраций свободного карнитина и его эфиров у больных с целиакией до начала терапии 133 (p<0,001) и у пациентов с установленным диагнозом, находящихся на строгой безглютеновой диете в течение года (p<0,001), по сравнению с контрольной группой (рисунок 5.4). Наиболее выраженное понижение уровня карнитина и его эфиров выявлено (в среднем на 25-38% при p<0,001) при впервые установленном диагнозе и до начала специфической диетотерапии. Полученные результаты подтвердили мнение о его вторичном дефиците у больных целиакией. На фоне проводимого лечение (безглютеновая диета), содержание карнитина и его эфиров повышалось, но, тем не менее, их уровень отличался от данных, полученных в контрольной группе, и оставался в среднем на уровне 90% от уровня карнитина в контрольной группе (рисунок 5.4). Рисунок 5.4. Средняя концентрация карнитина в обследованных группах. 1 –группа сравнения; 2 - больные, находящиеся на лечении; 3 - больные с целиакией до начала терапии. С0 – карнитин 134 Таблица 5.4 Концентрации свободного карнитина и карнитиновых эфиров в крови у больных с впервые выявленной целиакией* и находящихся на лечении** (мкмоль/л) 1 Принятое обозначение карнитина и ацилкарнитинов C0 Свободный карнитин Больные с впервые выявленной целиакией (n=15) 21,3440,945* Больные, находящиеся на лечении (n=30) 28,4321,254** 33,1262,084 2 C2 Ацетилкарнитин 4,1150,185* 5,821±0,253** 12,2380,442 3 C3 Пропионилкарнитин 0,7430,042* 1,2420,072** 0,8260,043 4 C4 Бутирилкарнитин 0,1320,009* 0,1710,012** 0,2150,012 5 C5 Изовалерилкарнитин 0,1020,009* 0,1240,011** 0,1480,011 6 C5:1 Тигликарнитин 0,0240,001* 0,0350,002** 0,0440,004 7 С6 Гексаноилкарнитин 0,0420,002* 0,0720,005** 0,0960,007 8 C8 Октаноилкарнитин 0,0520,004* 0,1020,007** 0,1360,012 9 C8:1 Октеноилкарнитин 0,0390,003* 0,0610,005** 0,0850,009 10 C10 Деканоилкарнитин 0,0510,004* 0,1010,008** 0,1350,009 11 С10:1 Деценоилкарнитин 0,0840,007* 0,0950,007** 0,1120,009 12 C12 0,0440,003* 0,0520,003** 0,0640,005 13 С12:1 0,0340,002* 0,0610,004** 0,0740,006 № п/п Полное название карнитина и ацилкарнитинов Додеканоилкарнитин (Лауроил) Додеценоилкарнитин Группа сравнения (n=35) 135 Продолжение таблицы 5.4 № п/п Принятое обозначение карнитина и ацилкарнитинов 14 C14 15 C14ОH 16 C14:1 17 C16 18 C16ОH 19 С16:1 20 C16:1-ОH 21 С18 22 С18ОН Полное название карнитина и ацилкарнитинов Миристоилкарнитин (Тетрадеканоил) 3-гидроксимиристоилкарнитин Миристолеилкарнитин (Тетрадеценоил) Пальмитоилкарнитин 3-гидроксипальмитоилкарнитин Гексадеценоилкарнитин 3-гидроксипальмитолеилкарнитин Октадеканоилкарнитин (Стеароил) 3-гидрокси-октадеценоилкарнитин(3-ОН-стеароил) Больные с впервые выявленной целиакией (n=15) Больные, находящиеся на лечении (n=30) Группа сравнения (n=35) 0,0780,005* 0,0870,005** 0,0920,004 0,0080,001* 0,0010,0001** 0,0050,001 0,0350,003* 0,0430,003** 0,0520,005 0,7620,047* 0,8110,05** 0,8830,047 0,0140,001* 0,0130,0006** 0,0110,001 0,0570,005* 0,0920,007** 0,0450,003 0,0420,003* 0,0510,004** 0,0590,004 0,5110,027* 0,5500,029** 0,5630,003 0,0060,001* 0,0070,0009** 0,0090,001 136 Окончание таблицы 5.4 № п/п Принятое обозначение карнитина и ацилкарнитинов 23 C18:1 24 C18:1ОH Полное название карнитина и ацилкарнитинов Октадеценоилкарнитин (Олеил) 3-гидрокси-октадеценоилкарнитин (3-ОН-олеил) Больные с впервые выявленной целиакией (n=15) Больные, находящиеся на лечении (n=30) Группа сравнения (n=35) 0,7600,031* 0,8720,044** 0,9620,045 0,0130,002* *достоверность различий относительно группы сравнения, р< 0,001 ** достоверность различий относительно группы сравнения, р< 0,001 0,01630,002** 0,0160,020 137 Профиль ацилкарнитинов у больных с длительно не выявляемой целиакией также отличался, хотя и в меньшей степени, от группы сравнения. Это связано, по всей вероятности, с имеющимся синдромом мальабсорбции и нарушением у больных целиакией метаболизма липопротеидов, триглицеридов, что вносит свой вклад в снижение синтеза жирных кислот. Что касается группы пациентов, находящихся на лечении, то неполное восстановление уровня карнитина и ацилкарнитинов у этих больных позволяет сделать вывод о недостаточности безглютеновой диеты для нормализации имеющихся нарушений в гомеостазе карнитина. Неоднородность полученных показателей по эфирам карнитина в этой группе отражает разную степень нарушений в метаболизме жирных кислот с широкой вариабельностью уровня энергодефицита. Значительный вторичный дефицит карнитина у больных с целиакией, можно объяснить поражением СОТК и формированием синдрома мальабсорбции. К синдрому мальабсорбции ведут характерные для целиакии деструктивные изменения и воспалительные процессы в слизистой тонкой кишки, нарушающие ее реабсорбционную способность, которая становится причиной одного из наиболее распространенного для глютеновой энтеропатии дефицита витаминов В6 и В12, фолиевой кислоты и железа, которые необходимы для эндогенного синтеза карнитина. Помимо синдрома мальабсорбции, у больных целиакией наблюдается, как правило, снижение ферментативных функций эпителиальных клеток тонкого кишечника с вовлечением ферментов, участвующих в карнитиновом цитозольном биосинтезе, таких, как: триметиллизин гидрокситриметиллизин гидроксилаза альдолаза TML HTML (КФ 1.14.11.8), (КФ 4.1.2.), триметиламинобутиральдегид дегидрогеназа TMABA (КФ 1.2.1.47). К снижению ферментативной активности присоединяется уменьшение активности высоко аффинного для карнитина транспортера OCTN2, локализованного в щеточной кайме тонкой кишки, что также вносит свой вклад в уменьшение уровня карнитина. Необходимо отметить, что изменения в качественном и количественном составе жирных кислот, липопротеидов, обусловленные их 138 низкой реабсорбцией в тонком кишечнике при целиакии, также влияют на синтез карнитина и его производных [254,273,292]. Проведенные исследования подтвердили предполагаемую зависимость уровня карнитина от степени поражения СОТК и выявили связь значительного дефицита карнитина у больных с целиакией со степенью поражения СОТК. Рассчитанный коэффициент ранговой корреляции Спирмена (rs=0,754, р0,01) подтвердил строгую корреляционную зависимость между тяжестью поражения СОТК и уровнем карнитина (рисунок 5.5), что позволяет по снижению уровня карнитина опосредованно судить о тяжести поражения СОТК и, как следствие, о тяжести течения болезни, с определением адекватности назначенного лечения. Помимо этого, зависимость между тяжестью поражения СОТК и уровнем карнитина позволяет проводить динамику восстановления СОТК и оценить благоприятный вариант развития болезни Стадии повреждения СОТК (по МАРШ) 3,5 3 2,5 R2 = 0,754 2 1,5 20 20,5 21 21,5 22 22,5 С0, мкмоль/л Рисунок 5.5. Корреляционная зависимость между тяжестью повреждения СОТК от уровня карнитина Примечание: СО-свободный карнитин 139 Таким образом, своевременное выявление дефицита карнитина и назначение комплексного лечения с возможностью его дополнительного включения, помимо безглютеновой диеты, будет способствовать восстановлению СОТК, определит возможности профилактики осложнений, что отразится на повышении качества жизни больных целиакией. 140 ГЛАВА 6. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ HLA-ГАПЛОТИПОВ (HLA-DQ2, HLA-DQ8), АССОЦИИРОВАННЫХ С ЦЕЛИАКИЕЙ, В РОССИЙСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ. ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ИНФОРМАТИВНОСТЬ ИХ ТЕСТИРОВАНИЯ 6.1. Распределение HLA-гаплотипов (HLA-DQ2, HLA-DQ8), ассоциированных с целиакией, в Российской популяции Согласно данным полногеномного анализа связей «генотип-болезнь» (GWAS), с целиакией могут быть ассоциированы, кроме уже известных генов (локусов) системы HLA, и некоторые другие не HLA-гены. Установлено, что известные не HLA-гены объясняют не более 14% генетического риска, по сравнению с HLA-генами, которые вносят до 40% генетического риска. Поэтому в настоящее время целиакию относят к заболеваниям, связанные прежде всего с системой локусов HLA. Известно, что большинство таких заболеваний проявляют сложные типы наследования и характеризуются неполной пенетрантностью и генетической гетерогенностью [328]. Доказано, что в развитии целиакии самое непосредственное участие принимают молекулы HLA-DQ2 и HLA-DQ8, которые являются продуктами гистосовместимости (т.е. генов второго системы класса HLA). главного Формирование комплекса гетеродимера, обозначенного как DQ2, определяется гаплотипами DQA1*0201-DQB1*0201 и DQA1*0501-DQB1*0201, которые выявляются у более чем 90% больных целиакией. Формирование гетеродимера DQ8 определяется гаплотипом DQA1*0301-DQB1*0302, выявляемого всего лишь у 5-12% больных целиакией [253,258]. Необходимость участия HLA-генов в развитии целиакии подтверждает тот факт, что только 0,4-0,7% больных целиакией не имеют указанных выше молекул HLA. Вместе с тем, согласно проведенным геномным исследованиям молекулы DQ2 и DQ8 экспрессируются у 30-40% здоровых индивидуумов, что подтверждает генетическую гетерогенность целиакии [196]. Таким образом, локусы системы HLA продолжают оставаться основными генетическими 141 факторами целиакии, однако несмотря на несомненную связь генов системы HLA с целиакией, вопрос о диагностической и прогностической значимости HLA генотипирования остается открытым, спорным и неоднозначным. Для оценки диагностической значимости HLA генотипирования было проведено изучение численности, частот и диагностической значимости рисковых аллельных вариантов и частот гаплотипов с использованием популяционного контроля, сформированного по литературным данным («эталонные» частоты аллелей и гаплотипов, полученные в популяции Санкт-Петербурга, Москвы, СевероЗападного округа России, Западной Сибири) [9,10,198,29,16]. Для этого была использована процедура вычисления так называемых совместных (simultaneous) 99% ДИ, при которой наблюдаемые численности рассматриваются как выборка из полиномиального распределения (программа StatXact-8). Полученные результаты «классической» (частотной) проверки однородности данных, взятых для формирования популяционного контроля с использованием критерия хи-квадрат (χ2), показали их неоднородность (гетерогенность) с высокой степенью достоверности: р2·10-4 – для данных по локусу HLA-DQA1 и р 6·10-12 – для данных по локусу DQB1. Однако представления популяционной генетики о фактически неизбежной гетерогенности (дифференцированности, расслоенности) популяций человека, позволяют применить более консервативный подход, согласно которому показателем (мерой) однородности (независимости) анализируемых выборок является отношение правдоподобий, ОП, называемое также бейзовым (байесовым) фактором, БФ. Высокие значения байесова фактора (БФ≥100) свидетельствуют об однородности выборки, а значения БФ1 свидетельствуют об её неоднородности. Полученные значения БФ-2·1012 для данных по локусу HLADQA1 и БФ-4338 по локусу HLA-DQВ1 свидетельствуют о высокой однородности всех представленных выборок, что позволило объединить их в одну группу и предложить ее в качестве эталона сравнения (таблица 6.1). 142 Таблица 6.1 Совокупное распределение численностей и частот аллелей по двум локусам HLA-DQA1 и HLA-DQB1 (данные российских исследователей) Аллель 0101 0102 0103 02 0301 0401 05 0601 Всего БФ 02 0301 0302 0303 0304 0305 0401 0501 0502 0503 0601 0602-8 Всего БФ [9]* 39 41 14 26 19 5 55 1 200 33 45 12 10 2 1 4 32 13 6 8 34 200 [198] 31 37 18 21 33 9 53 0 202 35 40 23 10 0 0 8 26 14 5 3 38 202 Численности аллелей в выборках Локус HLA-DQA1* [29] [10] [16] [2] 68 76 35 37 90 114 44 52 42 64 23 16 72 87 35 38 84 58 19 37 24 9 13 4 102 172 46 93 2 2 1 2 484 582 216 279 2·1012 Локус HLA-DQB1* 88 112 46 52 76 140 41 72 56 43 9 21 24 20 5 11 0 1 2 0 4 0 0 0 34 10 5 4 62 64 32 27 8 41 12 18 6 13 1 6 2 19 2 7 124 119 54 51 484 582 209 269 4338 Всего [146] 19 30 9 19 33 5 29 1 145 305 408 186 298 283 69 550 9 2108 «Эталонная» частота аллели 0,120,140,17 0,170,190,22 0,070,090,11 0,120,140,17 0,110,130,16 0,020,030,05 0,230,260,29 0,0010,0040,011 1,00 р2·10-4 24 18 25 16 0 0 5 15 4 2 1 35 145 390 432 189 96 5 5 70 258 110 39 42 455 2091 0,160,190,22 0,180,210,24 0,070,090,11 0,030,050,06 0,00030,0020,008 0,00030,0020,008 0,020,030,05 0,100,120,15 0,040,050,07 0,010,020,03 0,010,020,03 0.190.220.25 1,00 р 6·10-12 Примечание: * - ссылки на литературные источники. В подстрочниках указаны границы точных 99%-х доверительных интервалов (ДИ) для частот аллелей как для полиномиальных вероятностей. 143 6.2. Диагностическая информативность тестирования HLA-гаплотипов Для оценки диагностической информативности определения HLA-DQA1 были выбраны аллели *0201, *0301 и *0501, ассоциированные с риском развития целиакии [196]. Графическое изображение диагностической информативности выявления носительства аллели HLA - ВQA1*0201 представлено на рисунке 6.1. Рисунок 6.1. Диагностическая информативность, основанная на носительстве аллели HLA-ВQA1*0201 Примечание: PPV – предсказательная ценность положительного результата; NPV – предсказательная ценность отрицательного результата; Prevalence – распространенность заболевания. Чувствительность и специфичность были представлены следующими значениями: чувствительность – 0,210,270,33, специфичность относительный риск (ОР) носительства данной аллели составил 0,910,9160,92, 2,43,24,1 а (р<106). Эффект с таким значением ОР принято интерпретировать как сильный (Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, USA, 2011). 144 С практической (клинической) точки зрения наиболее важным является ответ на вопрос, какова вероятность развития болезни у конкретного носителя данной аллели. Расчеты основаны как известных ранее соответствующих формулах Бейза (Bayes), так и на алгоритме для их интервальных, разработанных относительно недавно (Zaykin D.V. et al., 2004). В данном случае, если у данного индивидуума присутствует аллель HLA-DQA1*0201, то вероятность того, что у него разовьется целиакия, составляет 0,0110,0230,051, т.е. от 1% до 5% (с доверительной вероятностью 99%). Формально эта вероятность (2,3%) примерно в три раза превышает известную распространенность целиакии, равную 0,75% и варьирующую в диапазоне от 0,2% до 1,2%. Таким образом, риск развития целиакии у носителя HLA-DQA1*0201 выше, чем у любого другого индивидуума без данной аллели. Графическое изображение диагностической информативности выявления носительства аллели HLA-ВQA1*0301 представлено на рисунке 6.2. Рисунок 6.2. Диагностическая информативность, основанная на носительстве аллели HLA-ВQA1*0301 Примечание: PPV – предсказательная ценность положительного результата; NPV – предсказательная ценность отрицательного результата диагностики; Prevalence – распространенность заболевания. 145 Проведена оценка чувствительности и специфичности определения носительства аллели HLA-ВQA1*0301 (рисунок 6.2) для диагностики целиакии, показала чувствительность = 0,160,210,27 и специфичность = 0,840,850,86. При такой низкой чувствительности и специфичности выявление носительства аллели HLA-ВQA1*0301 не может быть рекомендован для диагностики целиакии. Расчетный относительный риск составил 1,021,381,81 (р 0,0064). Однако, показателем его статистически значимого отличия является не только малое рзначение, но и сравнение 99%-го ДИ с относительным риском ОР0=1, постулируемым нулевой гипотезой об отсутствии связи («ассоциации») этой аллели с целиакией. В данном случае нижняя (левая) граница 99%-го ДИ для ОР=1,02 и практически «касается» значения 1. Эффект с таким значеним ОР принято интерпретировать как пренебрежимо малый (Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, USA, 2011). Расчет вероятности развития целиакии у носителя аллели HLA-DQA1*0301 показывает её значение 0,0050,0100,023, т.е. от 0,5% до 2,3% (с доверительной вероятностью 99%), в среднем 1,0%, что всего лишь в 1,3 раза превышает общую (среднюю) распространенность целиакии, равную 0,75% и варьирующую в диапазоне от 0,2% до 1,2%. Очевидно, что столь незначительное повышение вероятности не может иметь ни диагностического, ни прогностического значения. Графическое изображение диагностической информативности выявления носительства аллели HLA-ВQA1*0501 представлено на рисунке 6.3. В соответствии с ним аллель HLA-ВQA1*0501 неинформативна и непригодна ни для диагностики, ни для прогноза развития целиакии у ее носителя. Ее чувствительность и специфичность как диагностических показателей очень низки: чувствительность = 0,240,300,37, специфичность = 0,720,730,75. Связь этой аллели с целиакией статистически незначима (р=0,15). Относительный риск составляет 0,91,11,4, а его 99%-й ДИ «накрывает» значение ОР = 1, постулируемое нулевой гипотезой об отсутствии связи. Вероятность развития целиакии при носительстве данной аллели составляет 0,00380,00850,019, т.е. от 0,38% до 1,9% (с доверительной вероятностью 99%). 146 Статистически эта вероятность не отличается от известной оценки общей (средней) распространенности целиакии в популяции. Рисунок 6.3. Диагностическая информативность, основанная на носительстве аллели HLA-ВQA1*0501 Примечание: PPV - предсказательная ценность положительных результатов диагностики; NPV – предсказательная ценность отрицательных результатов диагностики; Prevalence – распространенность заболевания. Графическое изображение диагностической информативности выявления носительства аллели Чувствительность и HLA-ВQB1*0201 специфичность представлено определения HLA-ВQB1*0201 для диагностики целиакии составила на рисунке носительства 0,350,410,48 и 6.4. аллели 0,900,910,92 соответственно. Установленная чувствительность диагностики целиакии по признаку наличия аллели HLA-ВQB1*0201 низка и данный признак не информативен для диагностических целей. С другой стороны, специфичность 147 такой диагностики оказалась высокой, и это означает, что при отсутствии у пациента этой аллели высока вероятность отсутствия у него целиакии. Рисунок 6.4. Диагностическая информативность, основанная на носительстве аллели HLA-ВQB1*0201 Примечание: PPV - предсказательная ценность положительных результатов диагностики; NPV – предсказательная ценность отрицательных результатов диагностики; Prevalence – распространенность заболевания Относительный риск развития целиакии при носительстве ВQB1*0201 составляет 3,84,65,6 и с высокой достоверностью (р < 10-6) отличается от значения ОР=1, постулируемого нулевой гипотезой об отсутствии связи («ассоциации») этой аллели с целиакией. Эффект с таким значением ОР принято интерпретировать как сильный (Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, USA, 2011). Вероятность P(D|a) развития болезни (D) у конкретного носителя данной аллели (a) HLA-DQB1*0201составляет: P(Cel|HLA-DQB1*0201) = 0,0160,0340,072, т.е. от 1,6% до 7,2% (с доверительной вероятностью 99%). Формально эта 148 вероятность (3,4%) примерно в 4,5 раза превышает известную оценку общей (средней) распространенности целиакии, равную 0,75% и варьирующую в диапазоне от 0,2% до 1,2%. Т.е., действительно риск развития целиакии у носителя этой аллели выше, чем у любого другого индивидуума без данной аллели. Тем не менее, эта повышенная вероятность явно слишком мала, чтобы считать наличие этой аллели прогностическим показателем. Графическое изображение диагностической информативности выявления носительства аллели HLA- ВQB1*0302 представлено на рисунке 6.5. Рисунок 6.5. Диагностическая информативность, основанная на носительстве аллели HLA-ВQB1*0302 Примечание: PPV - предсказательная ценность положительных результатов диагностики; NPV – предсказательная ценность отрицательных результатов диагностики; Prevalence – распространенность заболевания. 149 Чувствительность и специфичность определения носительства аллели HLA-ВQA1*0302 в диагностике целиакии составляет 0,110,140,33 и 0,9360,9440,951, соответственно. Аналогично наличию аллеля HLA-ВQB1*0201 чувствительность диагностики целиакии по признаку наличия аллели HLA-ВQA1*0302 очень низка, что не позволяет этот признак использовать для подтверждения целиакии. Относительный риск для данной аллели составляет 1,72,53,6. Показателем его достоверности является не только малое р-значение (р<10-6), но и тот факт, что указанный 99%-й ДИ не «накрывает» значение ОР0 = 1, постулируемое нулевой гипотезой об отсутствии связи («ассоциации») этой аллели с целиакией. Эффект с таким значеним ОР принято интерпретировать как слабый ((Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, USA, 2011). Вероятность развития болезни при носительстве аллели HLA-DQB1*0302, составляет 0,0080,0190,043, т.е. от 0,8% до 4,3% (с доверительной вероятностью 99%). Формально эта вероятность (1,9%) примерно в 2,5 раза превышает известную оценку общей (средней) распространенностью целиакии, равную 0,75% и варьирующую в диапазоне от 0,2% до 1,2%, то есть, действительно риск развития целиакии у носителя этой аллели выше, чем у любого другого индивидуума без данной аллели. Тем не менее, эта повышенная вероятность явно слишком мала, чтобы считать наличие этой аллели прогностическим показателем. Изучение данных по численности, частотам и диагностической значимости рисковых аллельных вариантов HLA-молекул DQ2 и DQ8, показали, что в локусе HLA-DQA1 в сравниваемых группах пациентов частоты предрасполагающих аллелей *201, *301 и *501 статистически высоко значимо отличаются от частот всех остальных аллелей (р=10-9 и БФ01= 10-16). Однако при этом различия, полученные между самими рисковыми аллельными вариантами, статистически незначимы, что подтверждают значения р=0,15 и БФ01=5,7 (таблица. 6.2). Аналогичные данные были получены по локусам HLA-DQВ1 (таблица 6.3). Так, в сравниваемых группах пациентов частоты предрасполагающих аллелей *201 и *302 статистически высоко значимо отличаются от частот всех остальных аллелей (P = 10-9 и BF01 = 10-21), в то же время между этими аллелями 150 Таблица 6.2 Численности и частоты аллелей локуса HLA-DQA1 у пациентов со II-III стадиями целиакии по M.N.Marsh Численности аллелей в группах Аллель Популяцион ный контроль Целиакия II-III Всего 201 298 109 407 301 283 86 501 550 101 Частоты аллелей в группах Популяционный контроль Целиакия II-III Всего 0,120,140,14 0,190,250,33 0,140,160,19 369 0,110,130,16 0,150,200,27 0,120,150,17 133 683 0,230,260,29 0,250,320,39 0,240,270,30 305 24 329 0,120,140,17 0,030,060,10 0,110,130,15 102 408 35 443 0,170,190,22 0,050,080,14 0,150,180,20 103 186 26 212 0,070,0090,11 0,030,060,11 0,070,080,10 401 69 7 76 0,020,030,05 0,0040,020,05 0,020,030,04 601 9 0 9 0,0010.0040,011 0,000,000,02 0,0010,0030,009 Всего 2108 420 2528 1,00 1,00 1,00 -9 P 10 БФ01 10-16 Р и БФ01 0,15 5,7 0,23 53,6 151 Таблица 6.3 Численности и частоты аллелей локуса HLA-DQВ1 у пациентов со II-III стадиями целиакии по M.N.Marsh Численности аллелей в группах Частоты аллелей в группах Популяци онный контроль Целиакия II-III Всего Популяционный контроль Целиакия II-III Всего 201 366 179 545 0,160,190,22 0,350,430,51 0,200,230,26 302 164 59 223 0,060,080,11 0,090,140,20 0,070,090,12 301 414 60 474 0,180,210,24 0,090,140,21 0,170,200,23 303 80 16 96 0,030,040,06 0,020,040,08 0,030,040,06 304 5 0 5 0,0000,0030,009 0,000,000,02 0,0000,0020,007 305 5 1 6 0,0000,0030,009 0,0000,0020,02 0,00050,0030,008 401 65 8 73 0,020,030,05 0,0050,020,05 0,020,030,04 501 243 25 268 0,100,120,15 0,030,060,11 0,090,110,14 502 106 9 115 0,040,050,07 0,0060,020,06 0,040,050,07 503 37 2 39 0,010,020,03 0,0000,0050,03 0,0090,020,03 601 41 6 47 0,010,020,03 0,0030,0140,04 0,010,020,03 602 420 55 475 0,190,220,25 0,080,130,19 0,170,200,23 Всего 1946 420 2366 1,00 1,00 1,00 Аллель р 10-9 БФ01 10-21 P и БФ01 0,086 3,1 0,33 104 152 достоверности отличий нет (таблица 6.3). Такие же результаты были получены по остальным (неинформативным) аллельным вариантам в обоих локусах, частоты которых между группами пациентов статистически неразличимы. В результате обобщения всех полученных данных по локусу HLA-DQА1 и локусу HLA-DQВ1 была составлена таблица (таблица 6.4), в которой рисковые аллели, так же, как и неинформативные аллели, представлены едиными блоками. Выявленные такие значения показателей размера эффекта, как отношение шансов OШ (2,23,14,3 и 2,63,44,6) и, отношение рисков ОР (1,31,51,6 и 1,82,02,4), представленные в таблице 6.4 принято интерпретировать как малозначащие. Положительное и отрицательное значение отношения правдоподобия (ОП) в данном случае, хоть и статистически значимы, но с низкими верхними границами 99%-х ДИ, которые достигают значения 2,7. Допустимыми для практического применения считаются тесты, для которых ОП+ > 10 и/или ОП- > 10 (Магнус Я. Р. и др., 2004). Показатели чувствительноcти и специфичности HLA- генотипирования также довольно низкие, с верхней границей 99%-го ДИ 0,82. Таким образом, статистический анализ частот рисковых аллелей показал их диагностическую и прогностическую несостоятельность как самостоятельных маркеров. Учитывая полученные данные, был выполнен анализ суммарной оценки гаплотипов молекул DQ2 и DQ8 по их численности и частоте, с последующим определением их диагностической значимости (таблица 6.5). Было определено, что доля носителей, обсуждаемых гаплотипов в контрольной группе, составила 0,44 или 44%, что удовлетворительно согласуется с их частотами, предложенными в качестве эталонных для европеоидов (Klitz et al., 2003), а именно 34% (0,320,340,36). В группе больных целиакией она составила 92,4% (таблица 6.5). Этот показатель оказался несколько ниже, чем у больных целиакией в Европейской популяции (96-98%), что связано с недостаточной методической информативностью российских врачей о значении ассоциированных с целиакией HLA-гаплотипов при выставлении диагноза. 153 Таблица 6.4 Диагностическая значимость рисковых аллелей локусов HLA-DQА1 и HLA-DQВ1 Аллели HLADQA1* Популяцио нный контроль n = 1054 Стадия целиакии II-III n = 210 Аллели HLADQB1* Популяционный контроль n = 1045 Стадия целиакии II-III n=210 02, 0301, 05 1131 0,500,540,56 328 0,720,780,83 02, 0302 579 0,250,280,30 238 0,500,570,63 0301, 0303, 0304, 0305, 0401, 0501, 0502/4, 0503, 0601, 0602-8 1512 0,700,720,75 182 0,370,430,50 2091 1,00 420 1,00 0101, 0102, 0103, 0401, 0601 977 0,440,460,49 92 0,170,220,28 Всего 2108 1,00 420 1,00 Однородность групп P 6·10-6 4·10-43 БФ01 3·10-23 9·10-38 Размеры эффектов OШ 2,23,14,3 2,63,44,6 ОР 1,31,51,6 1,82,02,4 Диагностическая информативность Чувст. 0,740,780,82 0,520,570,61 Специф. 0,440,460,49 0,700,720,74 ОП+ 1,31,51,6 1,82,02,4 - ОП 1,72,12,7 1,41,71,9 ПЦПР 0,0020,0070,015 0,0030,0100,021 ПЦОР 0,9850,9930,998 0,9790,9900,997 Примечание: БФ – байесов фактор, Р – уровень значимости. ОШ – отношение шансов, ОР – отношение рисков, ОП+ и ОП- – отношения правдоподобия, ПЦПР и ПЦОР – предсказательная ценность положительного и отрицательного результатов 154 Таблица 6.5 Численности и частоты носителей гаплотипов по локусам HLA-DQA1 и HLA-DQB1 в четырех группах пациентов и их диагностическая и прогностическая способности Пациенты Стадия целиакии II, IIIa,b Стадия целиакии IIIc Популяци онный контроль n=285 n=190 n=20 n=392 02-02, 05-02, 301-302 73 0,190,260,33 173 0,830,900,95 20 0,881,001,00 173 0,380,440,51 439 0,260,280,30 Все остальные 212 0,670,740,81 17 0,050,100,17 0 0,000,000,12 219 0,490,560,62 448 0,700,720,74 Всего 285 1,00 190 1,00 20 1,00 392 1,00 495 1,00 Гаплотипы Стадия целиакии I Всего Однородность групп P 10-33 БФ01 10-31 Размеры эффекта ОШ ОР 0,81,11,5 0,8 1,11,4 6,89,714,2 17,630,353,4 3,43,84,2 3,64,24,6 Диагностическая информативность Чувст 0,210,260,31 0,850,900,94 0,951,01,0 Спец. 0,490,560,62 0,490,560,62 0,490,560,62 + 0,81,11,4 3,43,84,2 3,74,14,5 - 0,91,01,1 4,27,613,8 2,531400 ПЦПР 0,0020,0050,011 0,0060,020,04 0,0070,020,04 ПЦОР 0,9890,9950,998 0,960,980,998 0,960,980,998 ОП ОП Примечание: БФ – байесов фактор, Р – уровень значимости. В подстрочниках указаны границы точных 99%-х доверительных интервалов (ДИ). ОШ – отношение шансов, ОР – отношение рисков, ОП+ и ОП- – отношения правдоподобия, ПЦПР и ПЦОР – предсказательная ценность положительного и отрицательного результатов 155 Высокий процент рисковых гаплотипов у больных целиакией в Российской популяции также подтвердил их участие в патогенезе целиакии, независимо от популяционных отличий. Диагностическая чувствительность HLA-генотипирования, согласно полученным результатам (таблица 6.5), возрастает в зависимости от стадии целиакии, не представляя диагностической информативности для первой стадии заболевания. Выявлена низкая специфичность (0,490,560,62), которая подтверждается площадью под ROC-кривой, равной 0,73, при минимальном отклонении 0,67 и максимальном – 0,80 (рисунок 6.6), демонстрирует недостаточную диагностическую эффективность HLA-гаплотипирования, Рисунок 6.6. Графическое изображение ROC-кривой как интегральной меры диагностической эффективности, построенной на основе HLA-гаплотипирования Примечание: False positive rate – ложноположительные результаты; True positive rate – истинно положительные результаты 156 Высокая прогностическая значимость отрицательных результатов теста (ПЦОР) показывает, что отсутствие рисковых гаплотипов оказывается весьма эффективным для предсказания отсутствия болезни с вероятностью, практически не ниже 99,8% (рисунок 6.7). Рисунок 6.7. Диагностическая информативность, основанная на носительстве рисковых гаплотипов Примечание: PPV - предсказательная ценность положительных результатов диагностики; NPV – предсказательная ценность отрицательных результатов диагностики; Prevalence – распространенность заболевания. Проведенный статистический анализ показал, что отношения правдоподобий для положительных и отрицательных результатов теста зависят от стадии целиакии. Значения ОП+ варьирует от 0,8 до 4,5. Качество диагностического теста с такими значениями принято интерпретировать как посредственное (отличным считается тест, для которого ОП+>10 и/или ОП-<10). Что касается показателей по ОП-, то они так же как ОП+ возрастают в зависимости от стадии целиакии. Диагностически значимыми ОП-представлены в группе 157 пациентов со II-III стадиями целиакии. Выявлена зависимость резкого возрастания доли носителей рисковых гаплотипов от стадии целиакии. Наглядно это представлено как возрастание значений отношений шансов ОШ и отношений рисков ОР (таблица 6.5). Таким образом, наличие рисковых гаплотипов явно недостаточно для предсказания болезни у носителей, но их отсутствие оказывается весьма эффективным для предсказания отрицания болезни с вероятностью, практически не ниже 99,8%. Также очевидно, что диагностическая (прогностическая) ценность выявления рисковых гаплотипов гораздо выше, чем при выявлении отдельных рисковых аллелей. Установленная зависимость резкого возрастания доли носительства рисковых гаплотипов от степени поражения слизистой тонкого кишечника, обуславливает прогнозирование развитие клинического течения целиакии. 158 ГЛАВА 7. ЛАБОРАТОРНАЯ ОЦЕНКА ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ТОЛЕРАНТНОСТИ У БОЛЬНЫХ ЦЕЛИАКИЕЙ К НАИБОЛЕЕ РАСПРОСТРАНЕННЫМ ПИЩЕВЫМ СОРТАМ ОВСОВ ДЛЯ ВКЛЮЧЕНИЯ ИХ В ДИЕТОТЕРАПИЮ Известно, что основным внешним фактором для развития целиакии является глютен. Для всех клейковинных белков, к которым относится глютен, характерно большое число повторяющихся аминокислотных последовательностей, с преимущественным содержанием пролина и глутамина. Установленная гомология аминокислотных последовательностей соответствует степени систематической близости злаков, которая была выявлена у проламинов пшеницы, ржи, ячменя, при наибольшей разнице в отношении проламинов риса, кукурузы и проса и наименьшей в отношении овса. Это объясняет, помимо пшеницы, токсичность для больных целиакией ячменя, ржи и безопасность риса, кукурузы и проса. Возможность употребления в пищу овса обсуждается до сих пор, так как реакция на овес у больных целиакией неоднозначна, что предположительно связано в первую очередь с загрязнением овса (глютеновая контаминация), а также с возможностью определенных сортовых различий в аминокислотной последовательности авенинов [323]. Такое различие приводит к формированию патологического пептидного эпитопа, похожего на глютеновый, что способствует развитию иммунной реакции у больных целиакией [332]. В последнее время активно обсуждается иммуногенность овса и возможность безопасного включения его в безглютеновую диету. Некоторые исследователи предполагают возможность диетического употребления больными целиакией умеренного количества овса без выделения сортовых различий (50-70 мг) [181,167]. Для изучения индивидуализации токсичности безглютеновой отдельных диеты и сортов овсов дальнейшего с целью перспективного производства продуктов из нетоксичных для больных целиакией сортов было проведено исследование совместно с Федеральным государственным бюджетным 159 научным учреждением «Федеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н.И. Вавилова». Исследовались наиболее распространенные пищевые сорта овсов (таблица 7.1.). Как показал электрофоретический анализ авенинов исследованных сортов овсов, все сорта представлены двумя электрофоретическими фракциями (- и ß-фракциями) и различаются по составу компонентов авенина, однако связи между компонентным составом и интенсивностью реакции с антителами к авенинам не было обнаружено (рисунок 7.1, таблица 7.1). Рисунок 7.1. Электрофореграммы глиадина пшеницы и авенинов различных сортов овсов. α и β – фракции проламинов, Б.п. – фракция быстрых проламинов 160 Возможно, отсутствие связи между компонентным составом и интенсивностью реакции с антителами к авенинам связано с тем, что компоненты авенина с одинаковой электрофоретической подвижностью, имеют различные антигенные детерминанты. Результаты изучения фракций авенинов у различных сортов овсов выявили такие сорта, как Пушкинский (отечественная селекция) и Астор (зарубежная селекция), у которых антигенные эпитопы не вызывали сильного иммунного ответа по сравнению с другими сортами овсов. Именно поэтому эти сорта были выделены для дальнейшего изучения (таблица 7.1). Таблица 7.1 Интенсивность иммунной реакции в группах сравнения и больных целиакией на разные авенины Сорт овсов Пушкинский Hja7603N Nuprine Бег-3 Местный (Монголия) Таежник Астор Пшеница Интенсивность (IgG) реакции на авенины в единицах о.п. Больные целиакией Группа сравнения n=24 n=30 0,86* 0,244 1,4* 0,43 1,4* 0,43 1,17* 0,33 >2,0* 0,5 1,5* 0,61* >2,0* 0,17 0,138 0,1 Примечание: о.п.-оптическая плотность; *Достоверность различий относительно группы сравнения, p 0,05 Пушкинский сорт относится к голозерным формам, которые имеют технологические преимущества для приготовления диетических продуктов. Для определения интенсивности реакции авенинов изучаемых сортов овсов с антителами использовали антитела класса IgG, как основного сывороточного иммуноглобулина, с учетом его количественного преобладания по сравнению с 161 другими классами антител и возможностью участия (помимо других биологических свойств) во вторичном иммунном ответе. Кроме этого, измерение антител класса IgG связано с селективным IgА-дефицитом, ассоциированным с целиакией, который является одной из причин ложноотрицательных результатов. Интенсивность реакции антигена, полученного путем однократного экстрагирования белков из овсов 2М мочевиной, с антителами к авенинам изучаемых сортов овсов оценивали иммуноферментным методом в единицах оптической плотности. Для разграничения интенсивности реакции у больных с целиакией и пациентов без целиакии (группа сравнения) были рассчитаны средняя арифметическая числа (x̅) из полученных значений единиц оптической плотности в группе сравнения, стандартное отклонение от среднеарифметического числа () и пороговое значение, равное сумме среднеарифметического числа и двух стандартных отклонений (2). Значения средней арифметической и стандартного отклонения в группе сравнения были получены для каждого изучаемого сорта овса (рисунок 7.2, 7.3). 162 Рисунок 7.2. Графический расчет среднего арифметического и стандартного отклонения в единицах оптической плотности для реакции взаимодействия авенинов Пушкинского сорта с антителами класса IgG в группе сравнения. Примечание. Х - среднее арифметическое; - стандартное отклонение. 163 Рисунок 7.3. Графический расчет среднего арифметического и стандартного отклонения в единицах оптической плотности для реакции взаимодействия авенинов сорта Астор с антителами класса IgG в группе сравнения. Примечание. Х - среднее арифметическое; - стандартное отклонение. Таким образом, по результатам проведенного расчета были получены статистические характеристики, представленные в таблице 7.2. Проведенный анализ распределения значений единиц оптической плотности реакции исследуемых авенинов с антителами класса IgG в группе больных целиакией относительно порогового значения позволил выделить пациентов, у которых значения единиц оптической плотности были ниже порогового значения, то есть пациентов, не реагирующих на авенины исследуемых сортов овсов (рисунок 7,4, 7.5). Такие больные суммарно по исследуемым сортам овсов составили 43,7%. 164 Таблица 7.2 Статистические характеристики для разных сортов овсов в группах обследованных Сорта овсов Средняя Средняя Пороговое арифметическая в арифметическая в значение в единицах ОП для единицах ОП для единицах ОП группы сравнения группы больных Пушкинский 0,244 0,86 0,464 Астор 0,138 0,61 0,262 Примечание. ОП- оптическая плотность Рисунок 7.4. Распределение значений оптической плотности, полученных по реакции взаимодействия авенинов сорта Астор с антителами класса IgG в группе больных целиакией 165 Рисунок 7.5. Распределение значений оптической плотности, полученных по реакции взаимодействия авенинов Пушкинского сорта с антителами класса IgG в группе больных целиакией Кроме этого, сравнительный анализ значений единиц оптической плотности в группе больных целиакией позволил выделить три подгруппы (рисунок 7.6): - низко реагирующих (37,5%), - высоко реагирующих (33,3%) - по-разному реагирующих на разные сорта овсов (29,2%) Полученный результат подтвердил разную иммунную реакцию у больных целиакией на авениниы овсов. 166 Рисунок 7.6. Разные иммунные реакции на авенины в группе больных целиакией Примечание. Овес №1- Астор; овес№2- Пушкинский Такое же распределение было получено при обследовании пациентов из группы сравнения, что позволило сделать вывод, что разная иммунная реакция на овес наблюдается во всех группах обследованных, включая группу сравнения (рисунок 7.6, 7.7). Однако, при отсутствии целиакии иммунная реакция на авенины не получает дальнейшего развития, не приводит к запуску патогенетических механизмов и не сопровождается клиническими симптомами, в отличие от больных, страдающих глютеновой энтеропатией. Поскольку в основе иммунного ответа группы сравнения лежит типичная иммунная реакция на антиген (авенины), то и характер её проявлений при лабораторном исследовании был однотипен у всех обследованных. 167 Рисунок 7.7. Разные иммунные реакции на авенины у пациентов группы сравнения Примечание. Овес №1- Астор; овес№2- Пушкинский Таким образом, по результатам лабораторных данных об иммуногенности сортов овсов у обследованных больных глютеновой энтеропатией выявлены разные реакции на авенины овсов. Однотипность в реакции проламинов разных сортов овсов с одной и той же сывороткой нельзя объяснить разной антигенной детерминантой или неодинаковым уровнем их содержания, которое не меняется в зависимости от сорта [36]. Более вероятны другие причины различной иммуногенности у больных целиакией к авенинам овсов. Известно, что наследственная предрасположенность к целиакии в настоящее время определяется генами D-региона (DQA1, DQB1, DRB1) HLA-системы II класса, нарушение работы которых приводит к развитию патогенеза целиакии. Именно HLA-молекулы (DQ2, DQ8) определяют возможность представления и распознавания пептидов глютена Т-клетками, после чего происходит активация Т-клеток и формирование патологического иммунного ответа. Однако наглядно 168 показанная разная реакция на авенины у больных целиакией не позволяет сделать такой же вывод, который справедлив для токсичности глютена. Разный механизм ответной реакции на авенины может быть в настоящее время объяснен результатами, полученными полногеномным анализом ассоциаций (Genome Wide Association Studies — GWAS), выявившим ассоциированные с целиакией генетические изменения на уровне однонуклеотидных полиморфизмов (single nucleotide polymorphism, SNP). Такие маркерные (ассоциированные с целиакией) изменения в нуклеотидной последовательности SNP, как показали проведенные геномные исследования, могут влиять на экспрессию локусов количественных признаков (eQTLs, expression quantitative traits loci), определяющих значительную долю изменяемости экспрессии одного, близлежащего гена (Cis-eQTL) или большего количества удаленных генов (Trans-eQTL). Такое изменение экспрессии генов может, помимо других нарушений, менять цитокиновый и хемокиновый профили, что влечет за собой изменения в работе STAT/JAK-систем и транскрипцио́нного фактора NF-κB, контролирующего экспрессию генов иммунного ответа, апоптоза, клеточного цикла [328]. Формирование множества новых путей передачи сигналов, участники которых начинают взаимодействовать друг с другом, приводит к образованию уже не пути, а сети передачи сигналов. В этой сложной сети передачи сигналов могут формироваться разные нарушения, в том числе в представлении и распознавании таких антигенов, как авенины, антигенные эпитопы которых могут ошибочно восприниматься как глютеновые [209]. Этот вывод подтвердили недавно проведенные исследования, показавшие наличие у пациентов, реагирующих на овес, другого клона кишечных Т-клеток, которые могут представлять авенины для связывания HLA-молекулами, с дальнейшим развитием иммунологического каскада [82]. Таким образом, зарегистрированный у больных целиакией разный иммунный ответ на авенины овсов, является ключевым в деструкции слизистой оболочки тонкого кишечника, которую можно избежать проведением тестирования на авенины овса. Этому способствовали отобранные определенные сорта овсов (Пушкинский, Астор), которые не вызывали сильного иммунного 169 ответа у больных целиакией по сравнению с другими сортами овсов. Разработка диагностических тест-систем для определения антител к авенинам поможет провести индивидуализацию диеты больного целиакией и определить возможность употребления в пищу для данного пациента определенных сортов овсов, включение которых, как дополнительных источников витаминов группы В, микроэлементов, особенно калия и фосфора, белков, клетчатки (растворимой и нерастворимой), антиоксидантов (фитиновая кислота, фенольные соединения, витамин Е и др.), полиненасыщенных жирных кислот, будет способствовать сбалансированности питания больного целиакией. Такой подход имеет важное клиническое значение для расширения безглютеновой диеты. Кроме этого, возможность индивидуализации диеты больного с помощью тест-систем будет способствовать дальнейшему изучению сортовой коллекции овсов, что позволит определить группу нетоксичных для больных целиакией сортов с включением их в новые продукты. Так, мука овса по ряду пищевых и технологических свойств не уступает пшеничной и может заменить ее в производстве, например, кондитерских изделий, что скажется на снижении себестоимости существенное продуктов. снижение Увеличение его стоимости продуктового отразится на ассортимента и психологической адаптивности больных. Реализация производства таких продуктов будет способствовать развитию новой отрасли пищевой промышленности, обеспечивающей выращивание и переработку зерна нетоксичных сортов овса в специализированных хозяйствах, предназначенных для производства безопасных для здоровья больных целиакией продуктов. Важность и значение проведенного исследование было отмечено дипломом первой степени на конкурсе «Лучший инновационный проект и лучшая научнотехническая разработка 2011 года» (биотехнология и медицина) и золотой медалью в рамках международного форума «Биоиндустрия» на конкурсе инновационных решений для воспроизводства, функционирования и целесообразного развития живых организмов и среды их обитания в номинации «Биотехнологические решения для здравоохранения». 170 ГЛАВА 8. ПРИНЦИПЫ, КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ И АЛГОРИТМЫ ЛАБОРАТОРНОГО ВЫЯВЛЕНИЯ ЦЕЛИАКИИ На основании полученных операционных характеристик была проведена оценка диагностической информативности изученных лабораторных тестов и выполнена процедура их приоритетного выбора с исключением из перечня таких неинформативных лабораторных исследований, как IgА-АГА, IgG-АГА и IgG – ТТА (таблица 8.1). Таблица 8.1 Диагностическая информативность лабораторных тестов ОП ПЦ (%) Антитела Чувст. (%) Спец. (%) ОП+ ОП- ПЦПР ПЦОР IgA-EMA 93,1 97,8 43,62 0,07 96,5 96,8 IgA – ТТА 94,8 96,7 28,52 0,05 94,7 95,7 IgG – ТТА 84,2 89,8 7,77 0,17 83,1 90,1 IgA–ТТ-д 95 93,5 14,72 0,063 82,6 98,3 IgA-ДПГА 94.7 91.8 11.61 0.06 80.3 94.7 IgG-ДПГА 94.7 93.8 15.47 0.06 84.2 96.5 Экспресстест 83.3 94.4 15.00 0.18 71.4 97.1 IgA-АГА 86.7 89.2 8.02 0.27 83.7 90.3 IgG-АГА 93.3 61.4 4.02 0.73 80.2 88.9 HLADQ2,DQ8 100 56 4.1 0.63 40 99.8 Примечания: ОП+– отношение правдоподобие положительного результата теста; ОП – отношение правдоподобие отрицательного результата теста; ПЦПР – предсказательная ценность положительного результата теста; ПЦОР – предсказательная ценность отрицательного результата теста - Дальнейшее ранжирование лабораторных тестов было проведено с помощью статистического анализа деревьев решений (decision tree). 171 Сравнительный анализ результатов двух деревьев решений (рисунки 8.1 и 8.2) подтвердил большее количество ложноположительных результатов у ТТА по сравнению с IgG -ДПГА, которые не относятся к аутоантителам и не связаны с поликлональной количества активацией В-клеток, полиспецифичных приводящей антител и к синтезу возможности большого получения ложноположительных результатов. Кроме этого, проведенный анализ деревьев решений показал необходимость проведения совместного использования тестов (IgA-ТТА, ТТ-д), которое повышает диагностическую информативность. Так, при обследовании на IgGДПГА добавление второго теста (IgA-ТТА) сокращает количество пропущенных больных с недиагностированной целиакией (рисунок 8.1). Что касается обследования на IgA-ТТА (рисунок 8.2), то дополнительное использование оценки биоптатов (выявление субэпителиальных депозитов к тканевой трансглутаминазе, ТТ-д), приводит к отсутствию ошибочно классифицированных больных (рисунок 8.2). Анализ деревьев решений графически представил диагностическую эффективность биопсии, которая даже при наличии второй (two) и третьей (three) стадии повреждения СОТК по Marsh не дает достоверного результата (рисунок 8.3), правильности что указывает выполнения на необходимость методики гистоморфометрических показателей. совершенствования количественного и определения 172 Рисунок 8.1. Дерево классификации для ТТА и ДПГА, определяющее их оптимальную последовательность для диагностики целиакии Примечание: WT- группа обследованных (в числителе больные целиакией, в знаменателепациенты без целиакии), ILL – больные (числитель – пациенты правильно классифицированы как больные, знаменатель – пациенты ошибочно классифицированы как больные); ВПРИверхний предел референтного интервала. 173 Рисунок 8.2. Дерево классификации для ТТА и биоптатов, определяющее их оптимальную последовательность в применении Примечание: WT- группа обследованных (в числителе больные целиакией, в знаменателепациенты без целиакии), ILL – больные (числитель – правильно классифицированы как больные, знаменатель – ошибочно классифицированы как больные); ВПРИ-верхний предел референтного интервала. 174 Рисунок 8.3. Диагностическая эффективность комбинации IgA-ТТА+биопсия, графически представленная ветвями классификационного дерева Примечание: ILL – больные; WT- группа обследованных Node –вершина; ВПРИ - верхний предел референтного интервала; черный цвет – лица с отсутствием целиакии; серый – больные целиакией; (one) –первая, zero – нулевая, two – вторая, three- третья стадии повреждения слизистой оболочки тонкого кишечника по Marsh Как показал проведенный анализ, отсутствие неправильных результатов возможно только при первой (one) и нулевой (zero) стадиях повреждения СОТК по Marsh вместе с не превышающими верхний предел референтного интервала значениями ТТА (рисунок 8.3). Использование IgA-ТТА для повышения 175 диагностической информативности ложноположительные результаты. Что снижает, но касается новых не исключает маркеров (ТТ-д, субэпителиальные депозиты к тканевой трансглутаминазе), то в целом их диагностическая информативиость выше, чем у гистоморфометрических показателей, но все-таки не исключает и оставляет возможность получения как ложноотрицательных, так и ложноположительных результатов (рисунок 8.4). Рисунок 8.4. Диагностическая эффективность комбинации IgA-ТТА+биоптаты, графически представленная ветвями классификационного дерева Примечание: ILL – больные; WT- группа обследованных Node –вершина; ВПН – верхний предел нормы; черный цвет – лица с отсутствием целиакии; серый – больные целиакией; (one) – первая, zero – нулевая, two – вторая, three- третья стадии повреждения слизистой оболочки тонкого кишечника по Marsh Таким образом, проведенное ранжирование лабораторных тестов, показало, что самостоятельное использование отдельных тестов является неэффективным и 176 предусматривает необходимость расширения диагностических возможностей лабораторных тестов за счет подбора их оптимальных комбинаций. Для расширения диагностических возможностей, которое позволит снизить вероятность ошибочного исключения диагноза, был использован принцип системной интеграции. С помощью ROC-анализа была определена оптимальная комбинация методов (таблица 8.2). Представленная максимальными в таблице характеристиками 8.2 комбинация чувствительности ЭМА+IgА-ТТА и с предсказательной ценности отрицательного результата, предполагает отсутствие заболевания при отрицательном результате. Такая комбинация (ЕМА+IgA-ТТА) является наиболее информативной для исключения целиакии. Лабораторные характеристики других комбинаций имеют высокие, но не максимальные показатели диагностической информативности, которые приводят к возможности диагностических пропусков, обсуждаемых выше (рисунок 8.1). Из представленных комбинаций с включением инвазивных методов диагностики (IgA-ТТА+биопсия - гистоморфометрические показатели биопсийного материала; IgA-ТТА+ТТ-д биопсия+ТТ-д и т.д..) заслуживает внимания комбинация тестов IgA-ТТА+биопсия+биоптаты, определяющая максимальную специфичность и более высокую чувствительность (96,3%), чем у других комбинаций, например чувствительность IgA-ТТА +ЭМА+ТТ-д равна 94,7% (таблица 8.2). Такая комбинация тестов дает возможность процедуры подтверждать взятия наличие биопсийных заболевания. образцов СОТК Однако не инвазивность позволяет широко использовать такую комбинацию тестов. Целесообразно применять ее, например, как подтверждающий тест на заключительных этапах диагностики. 177 Таблица 8.2 Результаты комбинации тестов Площадь под ROC-кривой Чувствительность Специфичность ОП+ ОП- ПЦПР ПЦОР ЭМА+IgA-ТТА 0,998 100 97.3 46.0 0.00 96.7 100 IgA-ТТА+IgG-ДПГА 0,992 97,2 97,9 46,67 0,028 97,2 97,9 IgA-ТТА+IgА-ДПГА 0,99 94,4 95,8 22,67 0,058 94,4 95,8 IgA-ТТА+IgА-ДПГА+ЭМА 0,997 100,0 95,9 24,5 0,00 90,5 100,0 IgG-ДПГА+ ЭМА 0,999 100,0 98,0 49,0 0,00 95,0 100,0 IgA-ТТА+ТТ-д +биопсия 0,997 96,3 100,0 0,037 100,0 97,5 IgA-ТТА+биопсия 0,91 78,95 95,9 19,31 0,22 88,2 92,2 Биопсия+ТТ-д 0,976 94,7 91,8 11,61 0,057 81,8 97,8 Биопсия+ТТ-д 0,976 94,7 91,8 11,61 0,057 81,8 97,8 ЭМА+ТТ-д 0,995 94,7 98,0 46,42 0,054 94,7 98,0 Комбинация тестов 178 Продолжение таблицы 8.2 Комбинация тестов Площадь под ROC-кривой Чувствительность Специфичность IgA-ТТА +ЭМА+ТТ-д 0,996 94,7 IgА-ДПГА+IgG-ДПГА+ ТТ-д 0,996 IgG-ДПГА+ ТТ-д ОП- ПЦПР ПЦОР 100,0 0,053 100,0 98,0 94,7 100,0 0,053 100,0 98,0 0,988 89,5 100,0 0,11 100,0 96,1 ЭМА+ТТ-д+биопсия 0,997 100,0 95,9 24,5 0,00 90,5 100,0 IgG-ДПГА+ТТ-д+ биопсия 0,994 100,0 93,9 16,33 0,00 86,4 100,0 IgА-ДПГА+ТТ-д +биопсия 0,981 94,7 95,9 23,21 0,055 90,0 97,9 IgА-ДПГА+ТТ-д 0,96 94,7 100,0 0,053 100,0 98,0 0,984 94,7 98,0 0,054 94,7 98,0 IgG-ДПГА+биопсия + ОП+ 46,42 - Примечания: ОП – отношение правдоподобие положительного результата теста; ОП – отношение правдоподобие отрицательного результата теста; ПЦПР – предсказательная ценность положительного результата теста; ПЦОР – предсказательная ценность отрицательного результата теста 179 Таким образом, на основании принципа системной интеграции с использованием ROC-анализа были определены оптимальные комбинации тестов и сформированы диагностические критерии: - диагностический критерий исключения целиакии – комбинация тестов ЕМА+IgA-ТТА (прогностическая ценность отрицательного результата - 100%); - диагностический критерий подтверждения целиакии – комбинация тестов IgA-ТТА+биопсия+ТТ-д (прогностическая ценность положительного результата 100%); Помимо этого, комплексное изучение лабораторных тестов с учетом полученных результатов, дополнило диагностические критерии целиакии: - диагностический критерий исключения целиакии для пациентов, имеющих генетический риск - HLA-тест (прогностическая ценность отрицательного результата - 99,8%); - критерий дифференциальной диагностики для воспалительных заболеваний кишечника – тест для определения антител к эндомизию (ЭМА); Оптимально подобранные комбинации лабораторных тестов вместе с критериями определяют последовательное их выполнение с формированием диагностических этапов (принцип этапности). Принцип этапности учитывает клиническую информативность лабораторных тестов и формирует диагностическую целесообразность каждого этапа. Последовательное соблюдение этапности подчиняется принципу взаимозависимости, который выстраивает зависимость выполнения каждого этапа от выполнения предыдущего и последующего этапов, без смещения или отсутствия одного из этапов. Такой подход снижает диагностические пропуски и не приводит к усложнению процесса дифференциальной диагностики. Принцип системной интеграции, предусматривающий использование максимальных операционных характеристик тестов за счет модификации точки отсечения, сокращает «серую зону» (вероятность сомнительного результата), тем самым уменьшая диагностические ошибки. 180 Принципы системной интеграции, этапности и взаимозависимости позволяют построить алгоритм лабораторного обследования для группы лиц с подозрением на целиакию (рисунок 8.5). Выстраивание алгоритма предполагает формирование целостной диагностической системы, подчиняющейся принципу синергизма, по которому эффективность работы системы выше, чем эффективность отдельных ее составляющих. Сформулированные принципы лабораторной диагностики и клиникодиагностические критерии определили алгоритмы обследования не только для больных с подозрением на целиакию, но и для лиц, входящих в группы риска, который представлен на рисунке 8.6. 181 Рисунок 8.5. Алгоритм обследования пациентов с клиническим подозрением на целиакию Примечание. ДПГА- антитела к дезаминированным пептидам глиадина; ТТА- антитела к тканевой трансглутаминазе, ЭМА- антитела к эндомизию; ТТ-д субэпителиальные депозиты к тканевой трансглутаминазе; ВПРИ-верхний предел референтного интервала; DQ2/DQ8-HLAмолекулы 182 Рисунок 8.6. Алгоритм обследования лиц, входящих в группы риска Примечание. ДПГА- антитела к дезаминированным пептидам глиадина; ТТА- антитела к тканевой трансглутаминазе, ЭМА- антитела к эндомизию; ТТ-д субэпителиальные депозиты к тканевой трансглутаминазе; ВПРИ-верхний предел референтного интервала; DQ2/DQ8-HLAмолекулы Описание алгоритмов Обследование пациента, имеющего клиническое подозрение на целиакию, начинается с определеиня антител к дезаминированным пептидам глиадина. Эти антитела (IgG-ДПГА) были выбраны вследствие меньшего количества ложноположительных результатов и возможности сразу исключать селективный IgA-дефицит, имеющий высокую распространенность у больных целиакией (12%) 183 [221]. Полученные при обследовании значения IgG-ДПГА ниже верхнего предела референтного интервала (ВПРИ) должны подтверждаться комбинацией тестов ЕМА+ТТА для исключения целиакии, что позволяет не проводить инвазивную процедуру взятия биоптатов и сокращать сроки обследования. При значениях IgG-ДПГА, превышающих ВПРИ, используется комбинация тестов ТТА+ биопсия+ТТ-д, которая предусматривает подтверждение целиакии у пациента. При получении других результатов обследования необходимо проведение HLAгенотипирования; отсутствие HLA-молекул DQ2 и DQ8 исключает целиакию, а наличие HLA-молекул DQ2 и DQ8 вместе с клиническим подозрением определяет необходимость динамического наблюдения за пациентом с последующим проведением повторного обследования. Если обследование пациента не выявило выходящих за референтные пределы результатов, но клиническое подозрение на целиакию продолжает оставаться, необходимо исключить ограничения в питании глютенсодержащих продуктов и иммунносупресорную терапию, которые могут являться причиной получения не выходящих за референтные пределы результатов (высокая вероятность ложноположительных результатов). В случае выбранного самим пациентом ограничения в питании глютенсодержащих продуктов, необходимо перевести пациента на обычное питание и повторить обследование не раньше, чем через 3 месяца. Обследование пациента из группы риска (наличие в анамнезе заболеваний, ассоциированных с целиакией, первая степень родства с больными с установленным диагнозом «целиакия») начинается с HLA-генотипирования (рисункок 8.6). При отсутствии носительства HLA-молекул обследование заканчивается, поскольку целиакия в таком случае маловероятна. Положительный результат HLA-генотипирования предполагает дальнейшее обследование по алгоритму обследования пациентов с клиническим подозрением (рисунок 8.5) Представленные алгоритмы обследования были апробированы в СПб ГКУЗ «Диагностический (медико-генетический) преимущества диагностических алгоритмов: центр». Выявлены следующие 184 - использование 100% предсказательной ценности положительного и отрицательного результатов при применении оптимальных комбинаций лабораторных тестов предполагает четкую связь обнаруженных отклонений с наличием или отсутствием целиакии; - сокращение сроков обследования – исключение целиакии уже на начальном этапе по результатам комбинации ЭМА+ТТА и по HLA- генотипированию (без проведения биопсии, запись на проведение и ожидание результатов биопсии занимает в среднем 3-4 недели); - уменьшение результатов «серой зоны» благодаря использованию максимальных операционных характеристик тестов за счет оптимальной комбинации лабораторных тестов; - обеспечение выявления селективного IgA-дефицита у больных целиакией без введения в алгоритм обследования дополнительного теста; - экономичность диагностического алгоритма за счет использования дорогостоящих лабораторных исследований (HLA-генотипирование) только в отдельных случаях: на начальных этапах диагностики – в группах риска, на заключительных этапах – при неоднозначных результатах обследования лиц с подозрением на заболевание; а также за счет уменьшения количества лабораторных тестов при использовании их в оптимально подобранной комбинации. Использование разработанных алгоритмов для диагностики целиакии позволило снизить диагностические пропуски и обеспечить своевременное назначение лечения, что подтвердила установленная диагностическая эффективность алгоритма, которая составила 97,4 %. Таким образом, на основании результатов диссертационного исследования с использованием комплексного подхода сформулированы основные принципы лабораторной диагностики целиакии: - использование максимальных операционных характеристик тестов за счет оптимальной комбинации лабораторных тестов и сокращения «серой зоны» (принцип системной интеграции); 185 - этапность с учетом клинической информативности и аналитических характеристик тестов (принцип этапности); - принцип взаимозависимости, предусматривающий зависимость выполнения каждого этапа от выполнения предыдущего и последующего этапов, снижающий диагностические пропуски и препятствующего усложнению процесса дифференциальной диагностики. - единство диагностической системы, эффективность работы которой выше, чем эффективность отдельных ее составляющих (принцип синергизма). Организационно-методические решения для оптимальной интерпретации результатов обследования Трудности при интерпретации результатов обследования связаны с возможностью получения неоднозначных результатов и, как следствие, их неправильной трактовкой. Для уменьшения ошибок при интерпретации таких результатов, которые могут сказаться на правильности ведения больного целиакией, были сформулированы следующие организационно-методические решения. 1. При подтверждении диагноза (ТТА, ТТ-д, биопсия) с условием положительного результата HLA-генотипирования (3 этап, рисунок 8.5) возможны следующие варианты результатов: – значения IgА-ТТА выше референтного значения, гистоморфометрические показатели и IgА-ТТ-д в пределах допустимых отклонений – диагноз не выставляется (нет целиакии) при наличии в анамнезе аутоиммунной патологии, воспалительных заболеваний кишечника (ложноположительные результаты). При отсутствии этих заболеваний – наблюдение за пациентом и повторное обследование. – значения IgА-ТТА и гистоморфометрические показатели выше референтных значений, IgА-ТТ-д в пределах допустимых отклонений – диагноз целиакия не выставляется. Возможность получения ложноположительных 186 результатов при оценке гистоморфометрических показателей может быть связана с проксимально-дистальным градиентом, взятием биоптата не из рекомендованных участков тонкой кишки, при несоблюдении правил взятия биопсийного материала. Кроме этого, не следует учитывать гистоморфометрические показатели, характерные для первой стадии по Марш. Причины ложноположительных ТТА результатов изложены выше. Пациент, получивший такие результаты обследования, продолжает находиться на обычном питании под наблюдением гастроэнтеролога. – значения IgА-ТТА не превышают референтный предел, гистоморфометрические показатели и значения IgА-ТТ-д выше допустимых отклонений – диагноз целиакия. Пациенту необходимо исключить ограничения глютенсодержащих продуктов, иммуносупрессорную терапию. – значения IgА-ТТА и гистоморфометрические показатели не превышают референтный предел, IgА-ТТ-д - выше допустимых отклонений. Пациент должен находиться под наблюдением гастроэнтеролога и на обычном питании. При ухудшении клинического состояния, провести повторное обследование на сывороточные маркеры. Кроме этого, необходимо исключить ограничения глютенсодержащих продуктов и иммуносупрессорную терапию. 2. При выявленном у пациента селективном IgА-дефиците требуется заменить во всех сывороточных тестах класс IgА на IgG. 3. Использовать субэпителиальные депозиты к тканевой трансглутаминазе (ТТ-д) вместе с определением концентрации свободного карнитина и его эфиров для эффективности проводимого лечения и выявления эпизодического нарушения (1 раз в 6 месяцев, с последующим обследованием один раз в год). 4. Обследование пациента проводить без необоснованного перевода на БГД, ие использовать в диагностике АГА и ТТА-IgG 5. HLA-генотипирование проводить только для исключения целиакии. 187 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Результатом исследования явилась разработка диагностических алгоритмов обследования, основанных на четко обозначенных принципах диагностики. Благодаря комплексному изучению всех известных и новых маркеров целиакии, принципам диагностики целиакии и разработанным на их основе клинико– диагностических критериев была решена приоритетная задача диагностической оптимизации целиакии, объединяющей расширение диагностических возможностей, своевременное выявление целиакии, проведение эффективного лечения и мониторинга диетотерапии. Изучение иммунологической толерантности к определенным сортам овсов (Астор, Пушкинский) способствовало реализации диагностического решения по определению антител к авенинам соответствующих сортов овсов. Выявление отсутствия иммунологической реакции у пациента на авенины соответствующих сортов овсов позволяет включать и индивидуализировать диетотерапию, увеличивать продуктовый перечень, предусматривать сбалансированность питания, а также понизить экономическую стоимость специализированных продуктов питания. Такое успешное комплексное выполнение адекватных лечебно-оздоровительных мероприятий, предупреждающих формирование многочисленных осложнений, способствует значительному повышению уровня социальной адаптации и психологической реабилитации больных целиакией. 188 ВЫВОДЫ 1. Тканевые трансглутаминазные антитела IgA-класса и эндомизийные антитела являются основными диагностическими маркерами целиакии, использование которых в комбинации и при условии верхней границы референтного интервала тканевых транглутаминазных антител, определенной как 160 ед/мл, имеет высокую положительную прогностическую значимость и может служить для подтверждения целиакии. Отсутствие ложноположительных результатов исследования эндомизийных антител при диагностике целиакии определяет целесообразность их включения в алгоритм дифференциальной диагностики воспалительных заболеваний кишечника. Тканевые трансглутаминазные антитела IgG-класса имеют недостаточную диагностическую информативность (специфичность 89,1%, чувствительность 84,5%) и не должны использоваться в диагностике целиакии. 2. Высокие показатели чувствительности (94,7%) и специфичности (93,9%) антител к дезаминированным неспецифичные пептидам антиглиадиновые антитела глиадина позволяют (чувствительность заменить 86,7% и специфичность 89,2%) в программах диагностики целиакии. Антитела к дезаминированным пептидам глиадина IgG-класса являются дополнительным методом выявления селективного IgA-дефицита у больных глютеновой энтеропатией. 3. Использование иммунохроматографического экспресс-теста по определению тканевых трансглутаминазных антител в капиллярной крови для диагностики целиакии возможно после предварительной профессиональной подготовки медицинского персонала. 4. Субэпителиальные тканевые трансглутаминазные депозиты слизистой оболочки тонкого кишечника являются дополнительным лабораторным маркером при диагностике субклинических форм и ранней диагностике целиакии, выявления эпизодического нарушения диетотерапии и правильной трактовки результатов гистологического исследования биоптатов. Высокая прогностическая значимость отрицательного результата (ПЦОР-98,3%) и отношение 189 правдоподобия отрицательного результата (ОП- - 0,063) позволяют судить о высокой степени вероятности исключения заболевания. Уровень карнитина и его эфиров коррелирует со степенью поражения СОТК (rs и может рассматриваться как критерий риска неблагоприятного течения целиакии с поражением слизистой тонкого кишечника. 5. Носительство HLA-DQ2 и HLA-DQ8 гаплотипов ассоциировано в Российской популяции с целиакией и является основным генетическим фактором риска развития глютеновой энтеропатии. Высокая прогностическая значимость отрицательного результата теста по HLA-генотипированию (99,8%) позволяет исключать целиакию при отсутствии HLA-DQ2 и HLA-DQ8 гаплотипов в группах риска на начальном этапе диагностики и в диагностически неясных ситуациях в качестве окончательного критерия. 6. Установлена иммунологическая толерантность у больных целиакией (43,7%) к наиболее распространенным пищевым сортам овсов (Пушкинский, Астор). Определение антител к авенинам указанных сортов овсов позволяет сбалансировать питание больных целиакией и расширить диетотерапию. 7. Основными принципами лабораторной диагностики целиакии являются этапность с учетом диагностической информативности лабораторных тестов; принцип системной интеграции с модификацией точки отсечения для достижения максимальных операционных характеристик тестов и сокращения «серой зоны», принципы взаимозависимости и синергизма, обеспечивающие более высокую диагностическую эффективность системы лабораторных исследований, чем суммарная эффективность отдельных ее элементов. 8. Разработанные на основе этих принципов алгоритмы обследования обеспечивают диагностическую эффективность 97,4%, что позволяет своевременно выявлять больных целиакией с разными манифестными формами, сокращать циклы и сроки обследования, способствуя снижению развития осложнений, приводящих к инвалидизации и летальному исходу 190 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Обследование пациента при подозрении на целиакию должно начинаться с определения IgG-ДПГА, а в группах риска – с HLA-генотипирования (первая степень родства и пациенты, имеющие в анамнезе ассоциированные с целиакией заболевания). Отсутствие HLA-молекул DQ2 и/или HLA-DQ8 у пациента из группы риска позволяет не проводить дальнейшее обследование. 2. Для исключения целиакии необходимо определение ЭМА и ТТА. Определение IgG-ДПГА направлено на снижение ложноположительных результатов и исключение селективного IgA – дефицита, ассоциированного с целиакией. 3. Использование отрицательных результатов комбинации тестов ЭМА и IgA-ТТА позволяет отрицать наличие целиакии у пациента, что рекомендует использовать эту комбинацию как окончательный критерий отсутствия целиакии при условии отрицательных результатов IgG-ДПГА. 4. В случае, если пациент с подозрением на целиакию имеет результаты IgG-ДПГА выше референтных значений, необходимо подтвердить наличие целиакии комбинацией тестов IgА-ТТА+IgА-ТТ-д+биопсия. При обследовании пациентов, имеющих не выходящие за референтные пределы результаты обследования, необходимо исключить ограничения в питании глютенсодержащих продуктов и иммуносупрессорную терапию. 5. Сорта овсов Астор и Пушкинский могут включаться в продуктовый перечень больных целиакией после предварительного определения антител к авенинам. 6. Эффективность диетотерапии при целиакии может быть дополнительно оценена с помощью исследования субэпителиальных трансглутаминазные депозитов слизистой оболочки тонкого кишечника. тканевых 191 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АГА антитела к глиадину AГA IgA антитела к глиадину класса IgA АГА IgG антитела к глиадину класса IgG БГД безглютеновая диета ДПГА антитела к дезаминированным пептидам глиадина ДПГА IgA антитела к дезаминированным пептидам глиадина класса IgA ДПГА IgG антитела к г дезаминированным пептидам глиадина класса IgG ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота ДПК двенадцатиперстная кишка ИФА иммуноферментный анализ МЭЛ межэпителиальные лимфоциты ОПП отношение правдоподобия положительного результата ОПО отношение правдоподобия отрицательного результата ПЦПР предсказательная ценность положительного результата ПЦОР предсказательная ценность отрицательного результата ПЦР полимеразная цепная реакция AU (ПЕ) arbitrary units, произвольные единицы AUС, ROC аrea Under the receiver operating characteristic [ROC] Curve) – площадь под кривой оперативной (рабочей) характеристики диагностического метода. СОТК слизистая оболочка тонкой кишки ТТА антитела к тканевой трансглютаминазе ТТА IgA антитела к тканевой трансглютаминазе класса IgA ТТА IgG антитела к тканевой трансглютаминазе класса IgG ТТ-д субэпителиальные депозиты слизистой оболочки тонкой кишки к тканевой трансглутаминазе IgA-ТТ-д субэпителиальные ТТ-депозиты класса IgA 192 ТМБ тетраметилбензидин TG2 фермент тканевая трансглутаминаза HLA-система человеческие лейкоцитарные антигены (англ. HLA, Human Leucocyte Antigens) — группа антигенов гистосовместимости, главный комплекс гистосовместимости (MHC) HLA-DQ2 и HLA-DQ8 антигены генов II-класса HLA-системы (DQA1, DQB1) PBS фосфатно-солевой буфер FITC флуоресцеинизотиоцианат, флуоресцентная метка для коньюгирования с неспецифичными антителами ЭДТА этилендиаминтетраацетат или этилендиаминтетрауксусная кислота ЭМА антитела к эндомизию ЭФГДС эзофиброгастродуоденоскопия 193 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Агафонова, Л.Е. Пьезокварцевый иммуносенсор для анализа плазмы крови больных инфарктом миокарда и ранней клинической диагностики / Л. Е. Агафонова, А. В. Лисица, В. В. Шумянцева, А. И. Арчаков // Медицинский академический журнал. – 2012. – Т. 12, № 4. – С. 22-24. 2. Алексеев, ассоциированной Л.П. с Межпопуляционный HLA генетической подход в установлении предрасположенности к инсулинзависимому сахарному диабету / Л.П. Алексеев, И.И. Дедов, А.В. Зилов, М.Н. Болдырева [и др.] // Сахарный диабет. – 1998. – № 1. – С. 19-21. 3. Анциферова, О. В. Клинико-диагностическая характеристика целиакии у детей Иркутска и Иркутской области: дис. … канд. мед. наук: 14.01.08 / Анциферова, Оксана Викторовна. – Красноярск., 2014. – 159 с. 4. Аруин, Л.И. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника /Л.И. Аруин, Л.Л. Капуллер, В.А. Исаков. – М.: Триада-Х, 1998. – 496 с. 5. Бельмер, С.В. Некоторые аспекты гуморальной регуляции функций желудочно-кишечного тракта при синдроме нарушенного кишечного всасывания (энтероэндокринные клетки и гормоны щитовидной железы): автореф. дис. … канд. мед. наук / Бельмер Сергей Викторович. – М., 1990. – 24 с. 6. Бельмер С.В. Рабочий протокол диагностики и лечения целиакии у детей / С.В. Бельмер, Ю.Г. Мухина, Т.В. Гасилина [и др.] // XVII Конгресс детских гастроэнтерологов России. – М., 2010. 7. Бельмер, С.В. Целиакия: исходы и новые подходы к диагностике / С.В.Бельмер, Т.В.Гасилина // Лечащий врач. – 2012. – № 8. – С. 56-60. 8. Бельмер С.В. Целиакия у детей / С.В. Бельмер, Ю.Г. Мухина, Т.В. Гасилина [и др.] // Стандарты диагностики и лечения: XI Конгресс детских гастроэнтерологов России Санкт-Петербург, май 2010. – М., 2004. 9. Беспалова, О.Н. Особенности аллельного полиморфизма генов HLA II класса (DRB1, DQA1, DQB1) у супругов в парах с невынашиванием беременности 194 / О.Н. Беспалова, Т.С. Бескоровайная, Т.Э. Иващенко, С.М. Тверская [и др.] // Ж. Акуш. и Жен. Болезн. – 2006. – т. 55. – № 3. – С. 5-11. 10. Болдырева, «Функциональный» М.Н. генотип, HLA (класс гипотеза II) и естественный преимущества отбор. «функциональной» гетерозиготности: дисс. … д-ра мед. наук: 14.00.36 / Болдырева Маргарита Николаевна – М., 2007. – 224 с. 11. Вохмянина, Н.В. Дезаминированные пептиды глиадина. Оптимальный подход к диагностике целиакии / Н.В.Вохмянина // Уральский медицинский журнал. – 2012. – №5(97). – С.129–133. 12. Вохмянина, Н.В. Новые подходы к диагностике целиакии на основе системной интеграции лабораторных исследований / Н.В. Вохмянина, Т.В. Вавилова // Трансляционная медицина. Сборник статей под ред. Е.В. Шляхто. – 2-е изд. – СПб.: Северо-Западный федеральный медицинский исследовательский центр им. В.А.Алмазова, 2015. – С. 240-259. 13. Вохмянина, Н. В. Особенности диагностики глютеновой энтеропатии с использованием определения тканевых трансглутаминазных антител в капиллярной крови / Н. В. Вохмянина, Ю. С. Лебедин, В. Л. Эмануэль. // Российский педиатрический журнал. – 2010. – № 1. – С. 21-24. 14. Вохмянина, Н.В. Субэпителиальные депозиты IgA–tTG в слизистой тонкого кишечника – перспективные лабораторные маркеры глютеновой энтеропатии / Н.В. Вохмянина, А.В Козлов, Л.С. Орешко // Уральский медицинский журнал. – 2011. – №3. – С. 86–90. 15. Говорун, Ю.В. Диагностика и лечение целиакии: учебно-методическое пособие / Ю.В. Говорун, А.С. Портянко, Ю.Х. Мараховский. – Минск, 2006. – 31 с. 16. Голованова, О.В. Частоты аллелей генов DRB1, DQA1, DQB1 и TNFA у пришлого населения Западной Сибири / О.В. Голованова, В.И. Коненков, А.В. Шевченко, М.В. Смодьникова // Генетика. – 2009. – Т. 45, № 8. – С. 1118–1124. 195 17. Данилов, Д.А. Атипичная целиакия у детей. Клинико-лабораторные аспекты: дис. … канд. мед. наук: 14.01.08 / Данилов, Денис Александрович. – Барнаул. – 2015. – 144 с. 18. Жлоба, А.А. Лабораторная диагностика нарушений свободно- радикального метаболизма: методическое пособие / А.А. Жлоба. – СПб.: СПбМГУ им. акад. И.П. Павлова, 2001. – 38 с. 19. Иммуногистохимические методы: Руководство / Ed. by George L. Kumar, Lars Rudbeck.: DAKO / Пер. с англ. под ред. Г.А.Франка и П.Г.Малькова. – М., 2011. – 224 с 20. Калинина, Е.Ю. Морфологические и морфометрические изменения двенадцатиперстной кишки при целиакии взрослых: дис. … канд. мед. наук: 14.00.15 / Калинина Елена Юрьевна – СПб., 2005. – 145 с. 21. Камилова, А.Т. Иммуногенетические маркеры целиакии в узбекской популяции [Текст] / А.Т. Камилова // Материалы юбилейного XV Международного Конгресса детских гастроэнтерологов России и стран СНГ. Актуальные проблемы абдоминальной патологии у детей. – М., 2008. – С. 279280. 22. Клиническая лабораторная диагностика: национальное руководство по клинической лабораторной диагностике. В 2-х томах / Под ред. Долгов В.В. и др. [Электронный ресурс]. [2012 г., DjVu, RUS]. – С. 62-66. 23. Клинические аспекты целиакии у детей. Пособие для практических врачей-педиатров / H.A. Коровина, И.Н. Захарова, Ю.А. Лысиков [и др.]. – М.: МедЭкспертПресс, 2007. – 79 с. 24. Конарев, В. Г. Белковые маркеры геномов пшениц и их диких сородичей / В.Г. Конарев, И.П. Гаврилюк, Н.К. Губарева // Вестник с.-х. наук. – 1970. – Т. 8. – С. 100-114. 25. Конарев, В. Г. Молекулярно-биологические исследования генофонда культурных растений в ВИРе (1967–2007 гг.) / В.Г. Конарев, В.В. Сидорова, А.В. Конарев. – 2-е изд. доп. – СПб.: ВИР, 2007. – 134 с. 196 26. Кондратьева, Е.И. К вопросу о классификации целиакии у детей / Е.И. Кондратьева, Г.Н. Янкина // Вопросы детской диетологии. – 2008. – Т. 6, № 2. – С. 81–82. 27. Кондратьева, Е. И. Целиакия у детей. Спорные вопросы диагностики и лечения / Е. И. Кондратьева, Г.Н.Янкина // Вопросы детской диетологии. – 2010. – Т. 8, № 2. – С. 37–41. 28. Корниенко, Е.А. Роль кишечной микробиоты в развитии целиакии / Е.А. Корниенко // Медицинский совет. – 2013. – № 1. – Часть 3. – С. 44-52. 29. Кураева, Т.Л. Ассоциация сахарного диабета 1 типа с полиморфными аллелями HLA-DR и DQ- генов в двух русских популяциях – московской и вологодской / Т.Л. Кураева, М.Н. Кашенин, М.Н. Болдырева [и др.] // Сахарный диабет. – 2009. – № 2. – С. 28-32. 30. Лазарева, Т.С. Целиакия у детей и подростков / Т.С. Лазарева // Вопросы современной педиатрии. – 2008. – № 4. – С.80-84. 31. Лапин, С.В. Клинические рекомендации по лабораторной диагностике аутоиммунных заболеваний / С.В. Лапин, А.В. Мазинг, Т.В. Булгакова, Е.А. Суркова, Т.В. Блинова, И.С. Холопова, О.С. Напалкова, М.Ю. Лернер, А.А. Тотолян, В.Л. Эмануэль. – М.: СПбМГУ им. акад. И.П. Павлова, Научнометодический Центр по молекулярной медицине МЗ РФ, 2014. – 22 с. 32. Лысиков, Ю.А. Непереносимость глютена с позиций физиологии пищеварения / Ю.А. Лысиков // Эффективная фармакотерапия. – 2013. – № 7. – С. 50-57. 33. Лысиков, Ю.А. Нерешенные и нерешаемые вопросы целиакии / Ю.А. Лысиков // Клиническое питание. – 2006. – № 1–2. – С. 49–52. 34. Магнус, Я.Р. Эконометрика / Я.Р. Магнус, П.К. Катышев, А.А. Пересецкий – М.: Дело, 2004. – 576 с. 35. Мухина, Ю.Г. Критерии остроты патологического процесса при целиакии у детей / Ю.Г. Мухина [и др.] // Педиатрия. – 1990. – № 7. – С 45–49. 36. Овес. Культуральная флора. / Под ред. В.Д. Кобылянского и В.Н. Солдатова. – М.: Колос, 1994. – 368 с. 197 37. Орешко, Л.С. Исторические и клинические аспекты целиакии: монография / Л.С. Орешко. – СПб.: Санкт-Петербургская гос. мед. акад. им. И.И. Мечникова, 2011. –108 с. 38. Орешко, Л.С. Роль главного комплекса гистосовместимости при целиакии / Л.С. Орешко // Вестн. Санкт–Петербергского Университета. – 2007. – Вып. 4. – Сер. 11. 39. Орешко, Л.С. Целиакия взрослых: особенности патогенеза, клинических проявлений, диагностики, лечения и профилактики осложнений : дис. … докт. мед. наук: 14.00.47 / Орешко, Людмила Саварбековна. – СПб., 2009. – 240 с. 40. Ошева Т.М. Современный взгляд на диагностику и лечение глютеновой энтеропатии у детей раннего возраста / Т.М. Ошева, Н.С. Журавлева, О.В. Осипенко // Вопросы современной педиатрии. – 2012. – № 4. – С.95-98. 41. Парфенов, А.И. Глютенчувствительная целиакия и профилактика аутоиммунных и онкологических заболеваний / А.И. Парфенов, Е.А. Сабельникова, Л.М.Крумс и др. // Терапевтический архив. – 2007. – № 2. – С. 5– 11. 42. Парфенов, А.И. Диагностика глютеновой энтеропатии и оценка эффективности ее лечения / А.И. Парфенов, Л.М. Крумс // Терапевтический архив. – 2002.– № 2. – С. 27–31. 43. Парфенов, А.И. Новые горизонты изучения чувствительности к глютену. А.И. Парфенов // Терапевтический архив. – 2013. – № 2. – С. 4–7 44. Парфенов, А.И. Целиакия. Эволюция представлений о распространенности, клинических проявлениях и значимости этиотропной терапии / А.И. Парфенов. – М.: Анахарсис, 2007. – 376 с. 45. Парфенов, А.И. Энтерология / А.И. Парфенов. – М.: Триада-Х, 2002. – С. 380–420. 198 46. Плетнева, Н.Г. Диагностические возможности копрограммы / Н.Г. Плетнева, В.И. Лещенко // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. – 1998. – Т. VIII, № 6. – С. 26–30. 47. Плеханова Ю.В. Разработка иммуносенсоров для анализа гербицидов триазинового ряда и производных мочевины: автореф. дис. ... канд. биол. наук: 03.00.23 / Плеханова Юлия Викторовна. – Саратов, 2009. – 25 с. 48. Преснова, Г.В. Электрохимические биосенсоры на основе пероксидазы хрена / Г.В.Преснова, М.Ю. Руцова, А.М. Егоров // Рос.хим.ж. (Ж. Рос.хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). – 2008. – Т. LII, № 2. – С. 62-65. 49. Рабсон, А. Основы медицинской иммунологии / А. Рабсон, А. Ройт, П. Делвз. – М.: Мир, 2006. – 319 с. 50. Распространенность HLA -аллелей у больных целиакией г. Томска / Е.И. Кондратьева, Г.Н. Янкина, В.П. Пузырев, Л.П. Назаренко, A.A. Рудко, Е.В. Лошкова // Сибирский вестник гепатологии и гастроэнтерологии. – 2006. – № 20. – С. 72–73. 51. Ревнова, М.О. Целиакия у детей: клинические проявления, диагностика, эффективность безглютеновой диеты: автореф. дис. … д-ра мед. наук: 14.00.09 / Ревнова Мария Олеговна. – СПб., 2005. – 39 с. 52. Результаты анализа пищевых продуктов на содержание глютена в рамках 4-го международного дня целиакии. Отчет от 28 мая 2010 г. [Электронный ресурс]. Режим доступа: www.stylab.ru. 53. Рекомендации по диагностике и лечению целиакии взрослых. – М.-СПб. – 2014. – 24 с. 54. Сабельникова, Е.А. Глютенчувствительная целиакия: рапространенность в группах риска, клинические формы, лечение и диспансерное наблюдение: дис. … д-ра мед. наук: 14.00.05 / Сабельникова Елена Анатольевна. – М., 2008. – 287 с. 55. Саванович, П.П. Клинико-диагностические особенности целиакии у детей / П.П. Саванович, Х. Белес // Медицинский журнал. – 2009. – № 2. – С. 108– 111. 199 56. Сайфутдинов, Р.Г. Роль оксида азота при заболеваниях внутренних органов (обзор литературы) / Р.Г. Сайфутдинов // Вестник современной клинической медицины – 2009. – Вып. 3. – Т. 2. – С. 48-53. 57. Сафронова, В.А. Определение прогестерона методом латерального проточного иммуноанализа / В.А. Сафронова, Ж.В. Самсонова, В.Г. Григоренко, А.П. Осипов // Вестн. Моск. Ун-та. Сер.2 Химия. – 2012. – Т.53, №5. – С. 326-334. 58. Смурова, К.М. Участие микротрубочек в регуляции актинового цитоскелета в клетках эндотелия: автореф. дис. … канд. биол. наук: 03.00.25 / Смурова Ксения Михайловна – М., 2004. – 20 с. 59. Совершенствование диагностики целиакии у детей в Ставропольском крае. Ретроспективный анализ за 17 лет / Л.Я.Климов, М.В.Стоян, В.А.Курьянинова, О.И.Еремеева, В.С.Кашников [и др.] // Медицинский вестник Северного Кавказа. – 2014. – Т. 9, № 3. – С. 237-241. 60. Стандарты (протоколы) диагностики и лечения болезней органов пищеварения. Министерство Здравоохранения Российской Федерации Приказ № 125 от 17 апреля 1998 года. 61. Стефани, Д.В. Иммунология и иммунопатология детского возраста / Д.В. Стефани, Ю.Е. Вельтищев. – М.: Медицина, 1996. – 384 с. 62. Ткаченко, Е.И. Оптимизация лечения пробиотиками больных с целиакией [Электронный ресурс] / Е..Ткаченко // Мединфа, гастроентерология, статьи. Режим доступа: /http://medinfa.ru/article/7/116156/; http://www.medafarm.ru; http://www.normoflorin.ru. 07.11.2005. 63. Трофимов, Д.Ю. Разработка метода мультипраймерной ПЦР для типирования генов HLA класса II: автореф. дис. ... канд. биолог. наук: 14.00.36 / Трофимов Дмитрий Юрьевич. – М., 1996. – 24 с. 64. Федеральные клинические рекомендации по оказанию медицинской помощи детям с целиакией. Министерство Здравоохранения Российской Федерации. Союз педиатров России. – 2015. – 22 с. 65. Целиакия у детей /Рабочая группа//Стандарты диагностики и лечения, СПб. – 2010. – 13 с. 200 66. Целиакия у детей: современный взгляд на проблему / И.Н. Захарова, Т.Э. Боровик, Н.А. Коровина [и др.]. – М., 2011. – 66 с. 67. Целиакия у детей / под ред. С. В. Бельмера, М.О.Ревновой – М. : ИД МЕДПРАКТИКА-М», 2013. – 416 с. 68. Шарипова, М.Н. Клинико-эпидемиологические и генетические особенности целиакии у детей Казахстана / М.Н. Шарипова // Педиатрия. – 2009. – Т. 87, № 1. – С. 106-108. 69. Янкина, Г.Н. Клинико-генетические и иммуно-морфологические аспекты целиакии у детей. Стратегия реабилитации: дис. … д-ра мед. наук: 14.01.08 / Янкина, Галина Николаевна. – Томск., 2014. – 372 с. 70. A van Heel, D. A genome-wide association study for celiac disease identifies risk variants in the region harboring IL2 and IL21 / D. A van Heel, L. Franke, K. Hunt [et al.] // Nature Genetics. – 2007. – Vol. 39(7). – P. 827-9. 71. Abadie, V. Integration of Genetic and Immunological Insights into a Model of Celiac Disease Pathogenesis Annu / V. Abadie, L.M. Sollid, L.B. Barreiro, B. Jabri // Rev. Immunol. – 2011. – Vol. 29. – P. 493–525. 72. Admou, B. Atypical Celiac Disease: From Recognizing to Managing / B. Admou, L. Essaadouni, K. Krati, K. Zaher [et al.] // Gastroenterology Research and Practice. – 2012. – Article ID 637187. – 9 p. 73. Ahmed, M.B. IL-15 Renders conventional lymphocytes resistant to suppressive functions of regulatory T cells through activation of the phosphatidylinositol 3-kinase pathway / M.B. Ahmed, N.B. Hmida, N. Moes, S. Buyse [et al.] // J. Immunol. – 2009. – Vol. 182. – P. 6763–6770. 74. Akin, A. Capsule Endoscopy in Celiac Disease / E. Akin, O. Ersoy // Hindawi Publishing Corporation Gastroenterology Research and Practice. – 2012. – Article ID 676073. – 5 p. 75. Aleanzi, M. Celiac disease: antibody recognition against native and selectively deamidated gliadin peptides / M. Aleanzi, AM. Demonte, C. Esper [et al.] // Clin Chem. – 2001. – Vol. 47. – P. 2023–2028. 201 76. Alzahrani, A.S. Severe primary hyperparathyroidism masked by asymptomatic celiac disease / A.S. Alzahrani, M.A. Sheef // Endocr. Pract. – 2008. – Vol. 14, № 3. – P. 347–350. 77. Amaya-González, S. Aptamer binding to celiac disease-triggering hydrophobic proteins: a sensitive gluten detection approach / S. Amaya-González, N. de-Los-Santos-Álvarez, AJ. Miranda-Ordieres, MJ. Lobo-Castañón // Anal Chem. – 2014. – Vol. 86(5). 78. Anti-reticulin antibodies in childhood coeliac disease / P.P. Seah [et al.] // Lancet. – 1971. – Vol. 2, № 7726. – P. 681–682. 79. Antibody reactivity against human and guinea pig tissue transglutaminase in children with celiac disease / T. Hansson [et al.] // J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. – 2000. – Vol. 30. – P. 379–384. 80. Arateus and the coeliac affection / B. Dowd, J. Walker-Smith, S. Gee // Brit. Med. J. – 1974. – Vol. 2. – P. 445–447. 81. Arato, A. Historical aspects of celiac disease / A. Arato // International celiac disease meeting, 13–16 September, Maribor, 2007. – P. 31–36. 82. Arentz-Hansen, H. The Molecular Basis for Oat Intolerance in Patients with Celiac Disease / H. Arentz-Hansen, B. Fleckenstein, Ø. Molberg [et al.] // PLoS Medic. – 2004. – Vol. 1. – Issue 1. 83. Armstrong, D. Testing for gluten-related disorders in clinical practice: The role of serology in managing the spectrum of gluten sensitivity / D Armstrong, AC DonWauchope, EF Verdu. // Can J Gastroenterol. – 2011. – Vol. 25(4). – P. 193-197. 84. Аssociation between anti-endomysial antibody and total intestinal villous atrophy in children with coeliac disease / F. Ozgenc [et al.] // JPGM. – 2003. – Vol. 49, № 1. – P. 21–24. 85. Auricchio, R. Diagnosis of celiac disease / R. Auricchio, R. Troncone // Pediatr.Adolesc. Med. Basel. – 2008. – Vol. 12. – P. 107–113. 86. Bai, JC. World Gastroenterology Organisation global guidelines on celiac disease / JC. Bai, M. Fried, GR. Corazza [et al.] // J Clin Gastroenterol. – 2005. – Vol. 40(1). – P. 1-19. 202 87. Bai, JC. World Gastroenterology Organisation global guidelines on celiac disease / JC. Bai, M. Fried, GR. Corazza [et al.] // J Clin Gastroenterol. – 2013. – Vol. 47. – P. 121. 88. Ballewa, J.T. Daughertya Antibody biomarker discovery through in vitro directed evolution of consensus recognition epitopes PNAS / J.T. Ballewa, J.A. Murrayc, P. Collind, M. Mäkie [et al.] // November 26, 2013. – Vol. 110, № 48. – P. 19335. 89. Balli, F. Celiac disease and lymphoma / F. Balli, AR. Di Biase, P. Bertolani, V. Morinello, V. Clo, M. Federico // Pediatr Med Chir. – 1999. – Vol. 21(3). – P. 111-3. 90. Bamford, R.N. Interleukin 15 mediates epithelial changes in celiac disease / R.N. Bamford, A.P. Battiata, T.A. Waldmann // Gastroenterology. – 2000. – Vol. 119. – P. 996–1006. 91. Barbato, M. Value of antigliadin antibodies (AGA) in latent coeliac disease (CD) / M. Barbato, MR. Miglietta, F. Viola, S. Uccini [et al.] // Minerva Pediatr. – 2000. – Vol. 52(11). – P. 617-21. 92. Barone, M.V. Gliadin Peptides as Triggers of the Proliferative and Stress/Innate Immune Response of the Celiac Small Intestinal Mucosa / M.V. Barone, R. Troncone, S. Auricchio // Int. J. Mol. Sci. – 2014. – Vol. 15. – P. 20518-20537. 93. Barton, S.H. Celiac Disease and Autoimmunity in the Gut and Elsewhere / S.H. Barton, J.A. Murray // Gastroenterol Clin North Am. – 2008. – Vol. 37(2). – P. 411-28. 94. Benahmed, M. Inhibition of TGF-β signaling by IL-15: A new role for IL-15 in the loss of immune homeostasis in celiac disease / M. Benahmed, B. Meresse, B. Arnulf, U. Barbe [et al.] // Gastroenterology. – 2007. – Vol. 132. – P. 994–1008. 95. Berger, E. Allergic pathogenesis of celiac disease with studies of the splitting up of pathogenic antigens by enzymes. (In German) / E. Berger // Bibl Paediatr. –1958. – Vol. 6. – P. 1-55. 96. Bienvenu, F. Early diagnosis of celiac disease in IgA deficient children: contribution of a point-of-care test / F. Bienvenu, S.I. Anghel, C.B. Duvanel, J. Guillemaud [et al.] // BMC Gastroenterology. – 2014. – Vol. 14. – P. 186. 203 97. Bienvenu, F. Evaluation of a point-of-care test based on deamidated gliadin peptides for celiac disease screening in a large pediatric population / F. Bienvenu, C.B. Duvanel, C. Seignovert [et al.] // European Journal of Gastroenterology Hepatology. – 2012. – Vol. 24 (12). – P. 1418-23. 98. Boguszewski, M.C.S. Celiac disease, short stature and growth hormone deficiency / M.C.S. Boguszewski, A. Cardoso-Demartini, M.C. Geiger Frey, A. Celli // Transl Gastrointest Cancer. – 2015. – Vol. 4(1). – P. 69-75. 99. Brito, M.D. Enteropathy-Associated T Cell Lymphoma as a Complication of Silent Celiac Disease / M.D. Brito, Â. Martins, R. Henrique, J. Mariz // Hematol Rep. – 2014. – Vol. 6(4). – P. 78-80. 100. Brottveit, M. Mucosal Cytokine Response After Short-Term Gluten Challenge in Celiac Disease and Non-Celiac Gluten Sensitivity / M. Brottveit, A.C. Beitnes, S. Tollefsen [et al.] // Am J Gastroenterol. – 2013. – Vol. 108. – P. 842–850. 101. Burgin-Wolff, A. Antibodies against human tissue transglutaminase and endomysium in diagnosing and monitoring coeliac disease / A. Burgin-Wolff, I. Dahlbom, F. Hadziselimovic, C.J. Petersson // Scand. J. Gastroenterol. – 2002. – Vol. 37. – P. 685–691. 102. Bürgin-Wolff, A. Antigliadin and antiendomysium antibody determination for coeliac disease / A. Bürgin-Wolff, H. Gaze, F. Hadziselimovic, H. Huber [et al.] // Arch Dis Child. – 1991. – Vol. 66. – P. 941-947. 103. Caicedo, R.A. Current guidelines for the diagnosis and treatment of celiac disease / R.A. Caicedo, I.D. Hill // Pediatr. Adolesc. Med. Basel. Karger. – 2008. – Vol. 12. – P. 107–113. 104. Calabrò, A. A Metabolomic Perspective on Coeliac Disease / A. Calabrò, E. Gralka, C. Luchinat [et al.] // Hindawi Publishing Corporation Autoimmune Diseases. – 2014. – Article ID 756138. – 13 p. 105. Calero, P. IgA antigliadin antibodies as a screening method for nonovert celiac disease in children with insulin-dependent diabetes mellitus / P. Calero, C. RibesKoninckx, V. Albiach, C. Carles, J. Ferrer // J Pediatr Gastroenterol Nutr. – 1996. – Vol. 23. – P. 29-33. 204 106. Capone, P. Fecal calprotectin in coeliac disease / P. Capone, A. Rispo, N. Imperatore [et al.] // World J Gastroenterol. – 2014. – Vol. 20(2). – P. 611-612. 107. Caputo, I. Enzymatic Strategies to Detoxify Gluten: Implications for Celiac Disease / I. Caputo, M. Lepretti, S. Martucciello, C. Esposito // Enzyme Research. – 2010. – Article ID 174354. – 9 p. 108. Cara, Lsr. Celiac Disease GeneReviews / Lsr. Cara, D.O. Young, P.H. Green, A.K. Taylor // [Internet].Initial Posting: July 3. – 2008. 109. Castillo, N.E. The present and the future in the diagnosis and management of celiac disease / N.E. Castillo, G.T. Thimmaiah, A. Daniel // Gastroenterology Report. – 2014. – P. 1–9. 110. Catassi, C. Natural history of celiac disease autoimmunity in a USA cohort followed since 1974 / C. Catassi, D. Kryszak, B. Bhatti, C. Sturgeon [et al.] // Ann Med. – 2010. – Vol. 42(7). – P. 530-8. 111. Catassi, C. Risk of Non-Hodgkin Lymphoma in Celiac Disease / C. Catassi, E. Fabiani, G. Corrao [et al.] // JAMA. – 2002. – Vol. 287(11). – P. 1413-1419. 112. Catassi, C. The coeliac iceberg in Italy. A multicentre antigliadin antibodies screening for coeliac disease in school-age subjects / C. Catassi // Acta Paediatr Suppl. – 1996. – Vol. 412 (May). - P. 29-35. 113. Catassi, C. The New Epidemiology of Celiac Disease / C. Catassi, S. Gatti, A. Fasano // J. of Pediatric Gastroenterology & Nutrition. – 2014. – Vol. 59. – P. 7–9. 114. Catassi, C. World Perspective on Celiac Disease / C. Catassi, R.P. Anderson, I.D. Hill, S. Koletzko [et al.] // JPGN. – 2012. – Vol. 55, № 5. 115. Celiac disease / C. D’Angelo [et al.] // N. Engl. J. Med. – 2008. – Vol. 358. – P. 747–749. 116. Celiac disease – from inflammatory to atrophy: a long term follow up study / M.L. Lahdeaho [et al.] // J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. – 2005. – Vol. 41. – P. 44–48. 117. Celiac disease: variations of presentations in adults / G.K. Makharia [et al.] // Indian J. Gastroenterol. – 2007. – Vol. 26. – P. 162–166. 205 118. Changes in body composition, substrate oxidation, andresting metabolic rate in adult celiac disease patients after a 1-y gluten-free diet treatment / E. Capristo [et al.] // Am. J. Clin. Nut. – 2000. – Vol. 72, № 1. – P. 76–81. 119. Change in lipid profile in celiac disease: beneficial effect of gluten-free diet / G.Y. Kwon [et al.] // Am. J. Med. – 2006. – Vol. 119, № 9. – P. 786–790. 120. Chen, C.S. Coagulopathy due to celiac disease presenting as intramuscular hemorrhage / C.S. Chen, E.U. Cumbler, A.T. Triebling // J. Gen. Intern. Med. – 2007. – Vol. 22, № 11. – P. 1608–1612. 121. Chorzelski, TP. IgA anti-endomysium antibody. A new immunological marker of dermatitis herpetiformis and coeliac disease / TP. Chorzelski, EH. Beutner, J. Sulej, H. Tchorzewska [et al.] // Br. J. Dermatol. – 1984. – Vol. 111. – P. 395– 402. 122. Chow, MA. Immunoglobulin A deficiency in celiac disease / MA. Chow, B. Lebwohl, NR. Reilly, P. Green // J Clin Gastroenterol. – 2012. – Vol. 46(10). – P. 850-4. 123. Cianferoni, A. Oral food challenge to wheat: a near-fatal anaphylaxis and review of 93 food challenges in children / A.Cianferoni [et al.] // World Allergy Organization Journal. – 2013. – Vol. 6. – P. 14. 124. CODEX STAN 118-1979, ALINORM 08/31/26 para 64, appendix III. – URL: www.linguee.fr/anglais-francais/traduction/for+dietary+use.html. 125. Coeliac disease case finding and diet monitoring by point-of-care testing / I.R. Korponay-Szabo [et al.] // Aliment. Pharmacol. Ther. – 2005. –Vol. 22. – P. 729– 737. 126. Collin, P. Antiendomysial and antihuman recombinant tissue transglutaminase antibodies in the diagnosis of coeliac disease: a biopsy-proven European multicentre study / P. Collin, K. Kaukinen, H. Vogelsang [et al.] // Eur J Gastroenterol Hepatol. – 2005. – Vol. 17. – P. 85–91. 127. Collin, P. Should adults be screened for celiac disease? What are the benefits and harms of screening? / P. Collin // Gastroenterology. – 2005. – Vol. 128, № 4 (Suppl 1). – P. 104–108. 206 128. Corazza, G.R. Coeliac disease / G.R. Corazza, V. Villanacci // J Clin Pathol. – 2005. – Vol. 58. – P. 573-574. 129. Damasiewicz-Bodzek, A. Serologic markers of celiac disease in psoriatic patients /A. Damasiewicz-Bodzek, T.Wielkoszynski // J. Eur Acad Dermatol Venereol. – 2008. – Vol. 22. – P. 1055–1061. 130. De Angelis, M. Mechanism of Degradation of Immunogenic Gluten Epitopes from Triticum turgidum L. var.durum by Sourdough Lactobacilli and Fungal Proteases / M. De Angelis, A. Cassone, C.G. Rizzello [et al.] // Applied and Environmental Microbiology. – 2010. – Vol. 76, № 2. – P. 508–518. 131. De Bellis, A. Prolactin and Autoimmunity Pituitary. / A. De Bellis, A. Bizzarro, R. Pivonello [et al.] // – 2005. – Vol. 8. – P. 25–30. 132. De Re, V. Do gliadin and tissue transglutaminase mediate PPAR downregulation in intestinal cells of patients with coeliac disease? / V. De Re, M.P. Simula, A. Notarpietro [et al.] // Gut. – 2010. – Vol. 59. – P. 1730–1731. 133. DeGaetani, M. Villous Atrophy and Negative Celiac Serology: A Diagnostic and Therapeutic Dilemma / M. DeGaetani, C.A. Tennyson, B. Lebwohl [et al.] // Am J Gastroenterol. – 2013. – Vol. 108. – P. 647–653. 134. Delvecchio, M. Prolactin may be increased in newly diagnosed celiac children and adolescents and decreases after 6 months of gluten-free diet / M. Delvecchio, MF. Faienza, A. Lonero, V. Rutigliano [et al.] // Horm Res Paediatr. – 2014. – Vol. 81(5). – P. 309-13. 135. Detel, D. Serum and intestinal dipeptidyl peptidase IV(DPP IV/CD26) activity in children with celiac disease / D. Detel, M. Persi, J. Varljen // J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. – 2007. – Vol 45, № 1. – P. 65–70. 136. Determining IgA and IgG antigliadin, IgA antitransglutaminase, and antiendomysial antibodies in monkey esophagus and in umbilical cord for diagnosis of celiac disease in developing countries / M. Bahia [et al.] // J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. – 2007. – Vol. 45, № 5. – P. 551–558. 137. Di Sabatino, A. Coeliac disease / A. Di Sabatino, G.R. Corazza // Lancet. – 2009. – Vol. 373. – P. 1480–93. 207 138. Di Sabatino, A. Intraepithelial and lamina propria lymphocytes show distinct patterns of apoptosis whereas both populations are active in Fas based cytotoxicity in coeliac disease / A. Di Sabatino, R. Ciccocioppo, S. D’Alò [et al.] // Gut. – 2001. – Vol. 49. – P. 380–386. 139. Diagnostic accuracy of coeliac serological tests: a prospective study / G.E. Reeves [et al.] // Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. – 2006. – Vol. 18, № 5. – P. 493–501. 140. Dicke, WK. Coeliakie. Een onderzoek naar de nadelige invloed van sommige graansoorten op de lijder aan coeliakie / W.K. Dicke // MD. Thesis. Utrecht – 1950. 141. Dickson, B.C. Coeliac disease: an update for pathologists / B.C. Dickson, C.J. Streutker, R. Chetty // J. Clin. Pathology. – 2006. – Vol. 59. –P. 1008–1016. 142. Dieterich, W. Identification of tissue transglutaminase as the autoantigen of celiac disease / W. Dieterich, T. Ehnis, M. Bauer [et al.] // Nat Med. – 1997. – Vol. 3. – P. 797-801. 143. Effective detection of human leukocyte antigen risk alleles in celiac disease using tag single nucleotide polymorphisms / A.J. Monsuur [et al.] // Plos.ONE. – 2008. – Vol. 3, Issue 5. – P. 2270. 144. El-Salhy, M. The nature and implication of intestinal endocrine cell changes in celiac disease / M. El-Salhy // Histol. Histopathol. – 1998. – Vol. 13, № 4. – P. 1069–1075. 145. Evaluation with Doppler Sonography of mesenteric blood flow in celiac disease / F. Giovagnorio [et al.] // AJR. Am. J. Roentgenol. – 1998. – Vol. 171, № 3. – P. 629–632. 146. Evseeva, I. HLA-A, -B, -Cw, -DQA1, -DQB1 and -DRB1 allele frequencies in a Pomor population from Russia / I. Evseeva, A. Spurkland, L. Alexeev, W.F. Bodmer // Hum. Immunol. – 2004. – Vol. 65. – P. 1063–1065. 147. Facchiano, F. The role of transglutaminase-2 and its substrates in human diseases / F. Facchiano, A. Facchiano, A. M. Facchiano // Frontiers in Bioscience. – 2006. – Vol. 11. – P. 1758–1773. 148. Farrace, MG. Presence of anti-«tissue» transglutaminase antibodies in inflammatory intestinal diseases: an apoptosis-associated event? / MG. Farrace, A. 208 Picarelli, M. Di Tola, L. Sabbatella [et al.] // Cell death and differentiation. – 2001. – Vol. 8(7). – P. 767–70. 149. Fasano, A. Celiac Disease / A. Fasano, C. Catassi // N Engl J Med. – 2012. – Vol. 367. – P. 2419-26. 150. Fasano, A. Clinical presentation of celiac disease in the pediatric population / A. Fasano // Gastroenterology. – 2005. – Vol. 128 (4 Suppl 1). – P. 68-73. 151. Fasano, A. Coeliac disease in children / A. Fasano, A. Catassi // Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. – 2005. – Vol. 19, № 3. – P. 467–478. 152. Fasano, A. Current approaches to diagnosis and treatment of celiac disease: an evolving spectrum / A. Fasano, A. Catassi // Gastroenterology. – 2001. – Vol. 120. – P. 636–651. 153. Fasano, A. Prevalence of celiac disease in at-risk and not-at-risk groups in the United States: a large multicenter study / A. Fasano, I. Berti, T. Gerarduzzi [et al.] // Arch Intern Med. – 2003. – Vol. 163. – P. 286 – 92. 154. Fasano, A. Sonulin, a newly discovered modulator of intestinal permeability, and its expression in celiac disease / A. Fasano [et al.] // Lancet. – 2000. – Vol. 355. – P. 1518–1519. 155. Feldman, M. Sleisenger and Fordtran's Gastrointestinal and Liver Disease: Pathophysiology, Diagnosis and Management / M. Feldman, L. Friedman, L. Brandt // Philadelphia, PA: Saunders. – 2010. – P. 1797–1820. 156. Ferguson, A. Precipitins to dietary proteins in serum and upper intestinal secretions of coeliac children / A. Ferguson, F. Carswell // Br Med J. – 1972. – Vol. 1. – P. 75-77. 157. Ferrara, F. Anti-transglutaminase antibodies in non-coeliac children suffering from infectious diseases / F. Ferrara, S. Quaglia, I. Caputo, C. Esposito [et al.] // Clin Exp Immunol. – 2010. – Vol. 159(2). – P. 217–223. 158. Ferrara, F. Protective role of anti-idiotypic network in celiac disease-prone subjects / F. Ferrara, S. Dal Bo, S. Quaglia // 40th Annual Meeting of ESPGHAN. – 2007. 209 159. Ferretti, G. Celiac Disease, Inflammation and Oxidative Damage A Nutrigenetic Approach / G. Ferretti, T. Bacchetti, S. Masciangelo, L. Saturni // Nutrients. – 2012. – Vol. 4. – P. 243-257. 160. Finn, R. Serum IgG antibodies to gliadin and other dietary antigens in adults with atopic eczema / R. Finn, MM. Harvey, PM. Johnson, JL. Verbov, RM. Barnes // Clin Exp Dermatol. – 1985. – Vol. 10. – P. 222-8. 161. Ford, AC.Yield of diagnostic tests for celiac disease in individuals with symptoms suggestive of irritable bowel syndrome: Systematic review and meta-analysis / AC. Ford, WD. Chey, NJ. Talley [et al.] // Arch Intern Med. – 2009. – Vol. 169. – P. 651-8. 162. Franchis R. Video capsule enteroscopy in the diagnosis of celiac disease / R. Franchis // Am. J. Gastroenterol. – 2007. – Vol. 102, № 8. – P. 1624–1631. 163. Freeman, H.J. Collagenous sprue / H.J. Freeman // Can J Gastroenterol. – 2011. – Vol. 25(4). – P. 189–192. 164. Freeman, H.J. Update on collagenous sprue / H.J. Freeman // World J Gastroenterol. – 2010. – Vol. 16(3). – P. 296–298. 165. Frost, AR. Serological screening for coeliac disease in adults with Turner’s syndrome: prevalence and clinical significance of endomysium antibody positivity / AR. Frost, MM. Band, CG. Conway. // Eur J Endocrinol. – 2009. – Vol. 160. – P. 6759. 166. Galipeau, H.J. Novel Role of the Serine Protease Inhibitor Elafin in GlutenRelated Disordershe / H.J. Galipeau, W.M. Wiepjes, JP. Motta [et al.] // American Journal of Gastroenterology. – 2014. – Vol. 109. – P. 748-756. 167. Garsed, K. Can oats be taken in a gluten-free diet? A systematic review / K. Garsed, BB. Scott // Scand J Gastroenterol. – 2007. – Vol. 42. – P. 171–178. 168. Gatti, S. Beyond the intestinal celiac mucosa: diagnostic role of anti-TG2 deposits, a systematic review Frontiersin Medicine / S. Gatti, M. Rossi, S. Alfonsi, A. Mandolesi [et al.] // Gastroenterology. – 2014. – Vol. 1. – P. 1-9. 169. Gee, S. On the celiac affection / S. Gee // Saint Bartholomew’s Hospital Reports. – 1888. – Vol. 24. – P. 17–20. 210 170. Gil-Humanes, J. Reduced-Gliadin Wheat Bread: An Alternative to the Gluten-Free Diet for Consumers Suffering Gluten-Related Pathologies / J. GilHumanes, F. Pisto´n, R. Altamirano-Fortoul [et al.] // PLoS ONE 2014 9(3): e90898. 171. Granito, A.Volta Anti-actin IgA antibodies in severe coeliac disease / A. Granito, P. Muratori, F. Cassani [et al.] // Clin Exp Immunol. – 2004. – Vol. 137. – P. 386–392. 172. Gregorini, A. Immunogenicity Characterization of Two Ancient Wheat αGliadin Peptides Related to Coeliac Disease / A. Gregorini, M. Colomba, H.J. Ellis, P.J. Ciclitira // Nutrients. – 2009. – Vol. 1. – P. 276-290. 173. Gujral, N. Celiac disease: Prevalence, diagnosis, pathogenesis and treatment / N. Gujral, H.J. Freeman, A.BR. Thomson // World J Gastroenterol. – 2012. – Vol. 18(42). – P. 6036-6059. 174. Guttormsen, V. No induction of anti-avenin IgA by oats in adult, diet-treated coeliac disease / V. Guttormsen, A. Løvik, A. Bye, J. Bratlie, L. Mørkrid, KE. Lundin // Scand J Gastroenterol. – 2008. – Vol. 43(2). – P. 161-5. 175. Hardy, MY. Ingestion of oats and barley in patients with celiac disease mobilizes cross-reactive T cells activated by avenin peptides and immuno-dominant hordein peptides / MY. Hardy [et al.] // Journal of Autoimmunity. – 2014. doi:10.1016 /j.jaut.2014.10.003. 176. Hecker, M. Inhibition by antioxidants of nitric oxide synthase expression in murine macrophages: Role of nuclear factor kappa B and interferon regulatory factor 1 / M. Hecker, C. Preiss, V. Klemm, R. Busse // Br. J. Pharmacol. – 1996. – Vol. 118. – P. 2178–2184. 177. Herter, C.A. On infantilism from chronic intestinal infection / C.A. Herter. – New York: Mc-Millan, 1908. 178. Hijaz, NM. Celiac crisis presenting with status epilepticus and encephalopathy / NM. Hijaz, JM. Bracken, SR. Chandratre // Eur J Pediatr. – 2014. – Vol. 173(12). – P. 1561-4. 211 179. Hill, ID. What are the sensitivity and specificity of serologic tests for celiac disease? Do sensitivity and specificity vary in different populations? / ID. Hill // Gastroenterology. – 2005. – Vol. 128. – P. 25-32. 180. Hodrea, J. Transglutaminase 2 is expressed and active on the surface of human monocyte-derived dendritic cells and macrophages / J. Hodrea, MA. Demeny, G. Majai [et al.] // Immunol Lett. – 2010. – Vol. 130 (1-2). – P. 74-81. 181. Holm, K. Oats in the treatment of childhood coeliac disease: a 2-year controlled trial and a long-term clinical follow-up study / K. Holm, M. Maki, N. Vuolteenaho [et al.] // Aliment Pharmacol Ther. – 2006. – Vol. 23. – P. 1463–1472. 182. Hopper, AD. Pre-endoscopy serological testing for coeliac disease: evaluation of a clinical decision tool / AD. Hopper, SS. Cross, DP. Hurlstone [et al.] // BMJ. – 2007. – Vol. 334. – P. 729. 183. Howdle, P.D. Primary small-bowel malignancy in the UK and its association with coeliac disease / P.D. Howdle, P.K. Jalal, G.K.T. Holmes, R.S. Houlston // Q J Med. – 2003. – Vol. 96. – P. 345–353. 184. Hue, S. A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease / S. Hue, J.J. Mention, R.C. Monteiro [et al.] // Immunity. – 2004. – Vol. 21. – P. 367–377. 185. Husby, S. European Society for Pediatric Gastroenterology,Hepatology, and Nutrition Guidelines for the Diagnosis of Coeliac Disease / S. Husby, S. Koletzko, I.R. Korponay-Szabo, M.L. Mearin [et.al.] // J Pediatr Gastroenterol Nutr. – 2012. – Vol. 54. – P. 136–160. 186. IGA anti-gliadin best in finding the youngest celiacs / C. Lagerqvist [et al.] // International Celiac Disease Meeting, Maribor, 13–16 September 2007. – P. 177. 187. Ilus, T. Incidence of Malignancies in Diagnosed Celiac Patients: A Population-based Estimate / T. Ilus, K. Kaukinen, L.J. Virta, E. Pukkala, P. Collin // The American Journal of Gastroenterology. – 2014. – Vol. 109. – P. 1471-1477. 188. In vivo targeting of intestinal and extraintestinal transglutaminase 2 by coeliac autoantibodies / I.R. Korponay-Szabo [et al.] // Gut. – 2004. – Vol. 53. – P. 641–648. 212 189. Increased protein expression of matrix metalloproteinases-1, -3 and -9 and TIMP-1 in patients with gluten-sensitive enteropathy / B.M. Mohamed [et al.] // Dig. Dis. Sci. – 2006. – Vol. 51, № 10. – P. 1862–1868. 190. Inhibition of TGF-beta signaling by IL-15: a new role for IL-15 in the loss of immune homeostasis in celiac disease / M. Benahmed [et al.] // Gastroenterology. – 2007. – Vol. 132, № 3. – P. 994–1008. 191. Intestinal epithelial exosomes carry MHC class II/peptides able to inform the immune system in mice / G. Van Niel [et al.] // Gut. – 2003. – Vol. 52. – P. 1690–1697. 192. Iversen, R. Sollid Activity-regulating structural changes and autoantibody epitopes in transglutaminase 2 assessed by hydrogen/deuterium exchange / R. Iversen, S. Mysling, K. Hnida [et al.] // PNAS. – 2014. – Vol. 111(48). – P. 17146–17151. 193. Janine, L. Coombes & Fiona Powrie Dendritic cells in intestinal immune regulation / L. Janine // Nat. Rev. Immunology. – 2008. – Vol. 8. – P. 435. 194. Jin, X. Activation of extracellular transglutaminase 2 by thioredoxin / X. Jin, J. Stamnaes, C. Klöck, TR. DiRaimondo [et al.] // J Biol Chem. – 2011. – Vol. 286 (43). – P. 37866-73. 195. Jones, R.A. Reduced expression of TG2 in a human endothelial cell line leads to changes in cell spreading, cell adhesion and reduced polymerisation of fibronectin / R.A. Jones, B. Nicholas, S. Mian, P.J.A. Davies [et al.] // J. Cell Sci. – 1997. – Vol. 110. – P. 2461-2472. 196. Kagnoff, M.F. Celiac disease: pathogenesis of a model immunogenetic disease/ M.F. Kagnoff // J. Clin. Invest. – 2007. – Vol. 117, № 1. – P. 41–49. 197. Kang, J.Y. Systematic Review: Worldwide Variation in the Frequency of Coeliac Disease and Changes Over Time Aliment / J.Y. Kang, A.H.Y. Kang, A.Green, K.A. Gwee, K.Y. Ho // Pharmacol Ther. – 2013. – Vol. 38(3). – P. 226-245. 198. Kapustin, S. HLA-DPB1, -DQA1, -DQB1 and -DRB1in a Slavic population from Northwest Russia / S. Kapustin, A. Lyshchov, J. Alexandrova [et al.] // Hum. Immunol. – 2004. – Vol. 65. – P. 1067–1068. 213 199. Kaukinen, K. Intolerance to cereals is not specific for coeliac disease / K. Kaukinen, K. Turjanmaa, M. Mäki [et al.] // Scand J Gastroenterol. – 2000. – Vol. 35. – P. 942-946. 200. Kergaravat, S.V. Electrochemical Magneto Immunosensor for the Detection of Anti-TG2 Antibody in Celiac Disease / S.V. Kergaravat, L. Beltramino, N. Garnero, L. Trotta [et al.] // Biosensors and Bioelectronics. – 2013. – Vol. 48. – P. 203-209. 201. Kilmartin, C. Avenin fails to induce a Th1 response in celiac tissue following in vitro culture / C. Kilmartin, S. Lynch, M. Abuzakouk [et al.] // Gut. – 2003.–V. 52. – P.47-52. 202. Klöck, C. Role of Transglutaminase 2 in Celiac Disease Pathogenesis / C. Klöck, T.R. DiRaimondo, C. Khosla // Semin Immunopathol. – 2012. – Vol. 34(4). – P. 513–522. 203. Kocna, P. Tissue Transglutaminase-Serology Markers for Coeliac Disease / P. Kocna, Z. Vaníčková, J. Perušičová, M. Dvořák // Clin Chem Lab Med. – 2002. – Vol. 40(5). – P. 485-492. 204. Koning, F. Celiac Disease: Across the Threshold of Tolerance Pediatric and Adolescent Medicine / F. Koning // Frontiers in Celiac Disease. – 2008. – Vol. 12. – P. 82-88. 205. Koning, F. Toxicit of prolamins in celiac disease / F. Koning // International Celiac Disease Meeting, Maribor, 13–16 September 2007. – P. 49–54. 206. Koot, VC. Elevated level of IgA gliadin antibodies in patients with rheumatoid arthritis / VC. Koot, M. Van Straaten, WT. Hekkens, G. Collee, BA. Dijkmans // Clin Exp Rheumatol. – 1989. – Vol. 7. – P. 623-6. 207. Korponay-Szabo, I.R. Deamidated Gliadin Peptides Form Epitopes That Transglutaminase Antibodies Recognize / I.R. Korponay-Szabo, Z. Vecsei, R. Kiraly, I. Dahlbom [et al.] // J Pediatr Gastroenterol Nutr. – 2008. –Vol. 46, № 3. – Р. 253–261. 208. Kumar, V. Are antigliadin antibodies specific for celiac disease? / V. Kumar, A. Lerner, N. Jain, EH. Beutner // J Pediatr Gastroenterol Nutr. – 1984. – Vol. 3. – P. 815. 214 209. Kumar, V. From genome-wide association studies to disease mechanisms: celiac disease as a model for autoimmune diseases / V. Kumar, C. Wijmenga, S. Withoff // Semin Immunopathol. – 2012. – Vol. 34. – P. 567–580. 210. Kupfer, SS. Pathophysiology of celiac disease / SS. Kupfer, B. Jabri // Gastrointest Endosc Clin N Am. – 2012. – Vol. 22. – P. 639-660. 211. L-Carnitine in the treatment of fatigue in adult celiac disease patients. A pilot study / C. Ciacci [et al.] // Dig. Liver. Dis. – 2007. – Vol. 9. – P. 17. 212. Ladinser, B. Endomysium antibodies in coeliac disease: an improved method / E. Rossipal, K. Pittschieler // Gut. – 1994. – Vol. 35. – P. 776–778. 213. Lagerqvist, C. Antigliadin Immunoglobulin A Best in Finding Celiac Disease in Children Younger Than 18 Months of Age / C. Lagerqvist, I. Dahlbom, T. Hansson, E. Jidell [et al.] // JPGN. – 2008. – Vol. 47. – P. 428–435. 214. Laranjeira, C Glial cells in the mouse enteric nervous system can undergo neurogenesis in response to injury / C. Laranjeira [et al.] // J Clin Invest. – 2011. –Vol. 121(9). – P. 3412-24. 215. Lauret, E. Celiac Disease and Autoimmune-Associated Conditions / E. Lauret, R. Luis // BioMed Research International. – 2013. – Article ID 127589. – 17 p. 216. Lavy, A. Increased susceptibility to undergo lipid peroxidation of chylomicrons and low-density lipoprotein in celiac disease / A. Lavy, A. Ben, A. Amotz, M. Aviram // Ann. Nutr. Metab. – 1993. – Vol. 37. – P. 68–74. 217. Lebwohl, B. The unfolding story of celiac disease risk factors / B. Lebwohl, JF. Ludvigsson, PH. Green // Clin Gastroenterol Hepatol. – 2014. – Vol. 12. – P. 632-5. 218. Leeds, J.S. Coeliac disease / J.S. Leeds, A.D. Hopper, D.S. Sanders // British Medical Bulletin. – 2008. – Vol. 88, № 1. – P. 157–170. 219. Leeds, J.S. Is exocrine pancreatic insufficiency in adult coeliac disease a cause of persisting symptoms? / J.S. Leeds, A.D. Hopper, D.P. Hurlstone, S.J. Edwards [et al.] // Aliment Pharmacol Ther. – 2007. – Vol. 25. – P. 265–271. 220. Leeds, JS. Is there an association between coeliac disease and inflammatory bowel diseases? A study of relative prevalence in comparison with population controls / 215 JS. Leeds, BS. Höroldt, R. Sidhu [et al.] // Scand J Gastroenterol. – 2007. – Vol. 42. – P. 1214-20. 221. Lenhardt, A. Role of human-tissue transglutaminase IgG and anti-gliadin IgG antibodies in the diagnosis of coeliac disease in patients with selective immunoglobulin A deficiency / A. Lenhardt, A. Plebani, F. Marchetti [et al.] // Dig Liver Dis. – 2004. – Vol. 36. – P. 730-4. 222. Leonard, JN. Gliadin in bullous pemphigoid / JN. Leonard, L. Fry, P. Wright [et al.] // Lancet. – 1981. – Vol. 2. – P. 1111-2. 223. LePane, CA. Ulcerative jejunoileitis: a complication of celiac sprue simulating Crohn's disease diagnosed with capsule endoscopy (PillCam) / CA. LePane, JS. Barkin, J. Parra, T. Simon // Dig Dis Sci. – 2007. – Vol. 52(3). – P. 698-701. 224. Lerner, A. Serological Diagnosis of Celiac Disease –Moving Beyond the Tip of the Iceberg / A. Lerner // International Journal of Celiac Disease. – 2014. – Vol. 2, № 2. – P. 64-66. 225. Lionetti, E. New Clues in Celiac Disease Epidemiology, Pathogenesis, Clinical Manifestations and Treatment / E. Lionetti, C. Catassi // Int Rev Immunol. – 2011. – Vol. 30(4). – P. 219–231. 226. Locke, GR.Celiac disease serology in irritable bowel syndrome and dyspepsia: A population-based case-control study / GR. Locke, JA. Murray, AR. Zinsmeister, LJ. Melton, NJ. Talley // Mayo Clin Proc. – 2004. – Vol. 79. – P. 476-82. 227. Loftus, C.G. Celiac disease diagnosis and management / C.G. Loftus, J.A. Murray, M.D. Murray // JCOM. – 2002. – Vol. 9, № 6. – P. 341–349. 228. Logan, RFA. Problems and pitfalls in epidemiological studies of celiac disease / RFA. Logan // Dyn Nutr Res. – 1992. – Vol.2. – P. 14 –24. 229. Lohi, S. Increasing prevalence of coeliac disease over time / S. Lohi, K. Mustalahti, K. Kaukinen [et al.] // Aliment Pharmacol Ther. – 2007. – Vol. 26. – P. 1217–1225. 230. Looking for celiac disease: diagnostic accuracy of two rapid commercial assays / G. Nemec [et al.] // Am. J. Gastroenterol. – 2006. – Vol. 101. – P. 1597–1600. 216 231. Lorenz, R.G. Celiac disease / R.G. Lorenz // Clin. Laboratory News. – 2007. – Vol. 33, № 8. – P. 10–15. 232. Low specificity of anti-tissue transglutaminase antibodies in patients with primary biliary cirrhosis / N. Bizzaro [et al.] // J. Clin. Lab. Anal. – 2006. – Vol. 20, № 5. – P. 184–189. 233. Lowell, L.B. Cross-linking vasomotor tone and vascular remodeling / L.B. Lowell, D. Dajnowiec // Circulation Research. – 2005. – Vol. 96. – P. 9. 234. Luciani, A. Lysosomal accumulation of gliadin p31–43 peptide induces oxidative stress and tissue transglutaminase-mediated PPARgamma downregulation in intestinal epithelial cells and coeliac mucosa / A. Luciani, V.R. Villella, A. Vasaturo, I. Giardino [et al.] // Gut. – 2010. – Vol. 59. – P. 311–319. 235. Ludvigsson, J.F. Diagnosis and management of adult coeliac disease / J.F. Ludvigsson, J.C. Bai, F. Biagi [et al.] // Guidelines from the British Society of Gastroenterology Gut Published Online First: doi:10.1136/gutjnl-2013-306578. 236. Ludvigsson, J. The Oslo definitions for coeliac disease and related terms / J. Ludvigsson, D. Leffler, J. Bai [et al.] // Gut. – 2013. – Vol. 62(1). – P. 43-52. 237. Ludvigsson, J.F. Timing of Introduction of Gluten and Celiac Disease Risk / J.F. Ludvigsson, A. Fasano // Ann Nutr Metab. – 2012. – Vol. 60(suppl 2). – P. 22–29. 238. Maglio, M. Serum and Intestinal Celiac Disease-associated Antibodies in Children With Celiac Disease Younger Than 2 Years of Age / M. Maglio, A. Tosco, F. Paparo, R. Auricchio [et al.] // J Pediatr Gastroenterol Nutr. – 2009. – Vol. 50. – P. 43-48. 239. Main chain hydrogen bond interactions in the binding of proline–rich gluten peptides to the celiac disease associated HLA-DQ2 molecule / E. Berqsenq [et al.] // J. Biol. Chem. – 2005. – Vol. 280, № 23. – P. 21791–21796. 240. Maiuri, M.C. Gliadin increases iNOS gene expression in interferon— Stimulated RAW 264.7 cells through a mechanism involving NF-κB. Naunyn Schmiedebergs / M.C. Maiuri, D. de Stefano, G. Mele, B. Iovine [et al.] // Arch. Pharmacol. – 2003. – Vol. 368. – P. 63–71. 217 241. Maki, M. Evaluation of a serum IgA class reticulin antibody test for the detection of childhood celiac disease / M. Maki, O. Hallstrom, T. Vesikari, J.K. Visakorpi // J. Pediatr. – 1984. – Vol. 105. – P. 901–905. 242. Maki, M. Prevalence of Celiac Disease among Children in Finland / M. Maki et al. // Engl J Med. – 2003. – Vol. 348. – P. 2517-24. 243. Mamone, G. Identification of a peptide from α-gliadin resistant to digestive enzymes: Implications for celiac disease / G. Mamone, P. Ferranti, M. Rossi, P. Roepstorff, et al. // In Proceedings of the 44th Scientific Meeting of The International Association of Forensic Toxicologists, Ljubljana, Slovenia, 27 August–1 September 2006. 244. Mаrild, K. Antibiotic exposure and the development of coeliac disease: a nationwide case-control study / K. Mаrild, Ye W, B. Lebwohl, PH. Green, MJ. Blaser, T. Card, JF. Ludvigsson // BMC Gastroenterol. – 2013. – Vol. 8. – P. 13:109. 245. Mariné, M. The prevalence of coeliac disease is significantly higher in children compared with adults Aliment / M. Mariné, C. Farre, M. Alsina [et al.] // Pharmacol Ther. – 2011. – Vol. 33(4). – P. 477-86. 246. Marsh, MN. Mucosal pathology in gluten sensitivity. Coeliac Disease / MN. Marsh // Oxford: Blackwell Scientific Publications. – 1992. – P. 136-191. 247. Martín-Yerga, D. Electrochemical Immunosensors for Celiac Disease Detection / D. Martín-Yerga, A. Costa-García // International Journal of Celiac Disease. – 2014. – Vol. 2, № 4. – P. 139-141. 248. McCormick, PA. Altered gastrointestinal immune response in sarcoidosis / PA. McCormick, C. Feighery, C. Dolan [et al.] // Gut. – 1988. – Vol. 29. – P. 1628-31. 249. Mearin, ML. Celiac disease in children and adolescents / ML. Mearin // Curr Probl Pediatr Adolesc Health Care. – 2007. – Vol. 37. – P. 86 –105. 250. Meeuwisse, G.W. Diagnostic criteria in coeliac disease / G.W. Meeuwisse // Acta. Paediatr. Scand. – 1970. – Vol. 59. – P. 461–463. 251. Mehta, K. Tissue transglutaminase: from biological glue to cell survival cues / K. Mehta, JY. Fok, LS. Mangala // Front Biosci. – 2006. – Vol. 11. – P. 173-185. 218 252. Mention, J.J. Interleukin 15: A key to disrupted intraepithelial lymphocyte homeostasis and lymphomagenesis in celiac disease / J.J. Mention, A.M. Ben, B. Bègue [et al.] // Gastroenterology. – 2003. – Vol. 125. – P. 730–745. 253. Meresse, B. Celiac disease: an immunological jigsaw. / B. Meresse, G. Malamut, N. Cerf-Bensussan // Immunity. – 2012. – Vol. 36. – P. 907-919. 254. Meresse, B. Coordinated induction by IL-15 of a TCR-independent NKG2D signaling pathway converts CTL into lymphokine-activated killer cells in celiac disease / B. Meresse, Z. Chen, C. Ciszewski [et al.] // Immunity. – 2004. – Vol. 21. – P. 357– 366. 255. Missing endomysial and reticulin binding of coeliac antibodies in transglutaminase 2 knockout tissues / I.R. Korponay-Szabo [et al.] // Gut. –2003. – Vol. 52. – P. 199–204. 256. Molberg, O. Tissue transglutaminase selectively modifies gliadin peptides that are recognized by gut-derived T cells in celiac disease / O. Molberg, SN. Mcadam, R. Korner, H. Quarsten [et al.] // Nat Med. – 1998. – Vol. 4. – P. 713-717. 257. Molecular characterization of covalent complexes between tissue transglutaminase and gliadin peptides / B. Fleckenstein [et al.] // J. Biol. Chem. – 2004. – Vol. 279, № 17. – P. 17607–17616. 258. Mubarak, A. Human leukocyte antigen DQ2.2 and celiac disease / A. Mubarak, E. Spierings, V. Wolters [et al.] // J Pediatr Gastroenterol Nutr. – 2013. – Vol. 56. – P. 428-430. 259. Murray, J.A. Effect of a gluten-free diet on gastrointestinal symptoms in celiac disease / J.A. Murray, T. Watson, B. Clearman, F. Mitros // Am J Clin Nutr. – 2004. – Vol. 79. – P. 669 –73. 260. Mustalahti, K. The prevalence of celiac disease in Europe Results of a centralized international mass screening project / K. Mustalahti, C. Cattassi, A. Reunanen [et al.] // J.Annals of Medicine. – 2010. – Vol. 42. – P. 587-595. 261. Nadalutti, C. Extracellular transglutaminase 2 has a role in cell adhesion, whereas intracellular transglutaminase 2 is involved in regulation of endothelial cell 219 proliferation and apoptosis / C. Nadalutti, KM. Viiri, K. Kaukinen, M. Mäki, K. Lindfors // Cell Prolif. – 2011. – Vol. 44. – P. 49-58. 262. Nanayakkara, M. An undigested gliadin peptide activates innate immunity and proliferative signaling in enterocytes: the role in celiac disease / M. Nanayakkara, G. Lania, M. Maglio [et al.] // Am. J. Clin. Nutr. – 2013. – Vol. 98. – P. 1123–1135. 263. National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement on Celiac Disease, June 28–30, 2004 / [No authors listed] // Gastroenterology. – 2005. – Vol. 128 (Suppl. 1), – P. 1–9. 264. Nijeboer, P. Update on the Diagnosis and Management of Refractory Coeliac Disease / P. Nijeboer, R.L.J. van Wanrooij, G.J. Tack, C.J.J. Mulder [et al.] // Gastroenterology Research and Practice. – Volume 2013. – Article ID 518483 – 9 p. 265. Oberhuber, G. The histopathology of coeliac disease: time for a standardized report scheme for pathologists / G. Oberhuber, G. Granditsch, H. Vogelsang // Eur JGastroenterol Hepatol. – 1999. – Vol. 11(10). – P. 1185–94. 266. O'Farrelly, C. α-gliadin antibody levels: a serological test for coeliac disease / C. O'Farrelly, J. Kelly, W. Hekkens, B. Bradley, [et al.] // British Medical Journal. – 1983. – Vol 286. – P. 2007-2010. 267. Olen, O. Antibodies against deamidated gliadin peptides and tissue transglutaminase for diagnosis of pediatric celiac disease / O. Olen, AH. Gudjónsdóttir, L. Browaldh, M. Hessami [et al.] // J Pediatr Gastroenterol Nutr. – 2012. – Vol. 55. – P. 695-700. 268. Osales-Rivera, L.C. Electrochemical immunosensor detection of antigliadin antibodies from real human serum / L.C. Osales-Rivera, J.L. Acero-Sanchez, P. LozanoSanchez, I. Katakis, C.K. O’Sullivan // Biosens Bioelectron. – 2011. – Vol. 26(11). – P. 4471–4476. 269. Osman, AA. B cell epitopes of gliadin / AA. Osman, T. Gunnel, A. Dietl [et al.] // Clin Exp Immunol. – 2000. – Vol. 121. – P. 248–54. 270. Osman, A.A. Production of recombinant human tissue transglutaminase using the baculovirus expression system, and its application for serological diagnosis of 220 coeliac disease / A.A. Osman, T. Richter, M. Stern [et al.] // European Journal of Gastroenterology & Hepatology. – 2002. – Vol. 14. – P. 1217-1223. 271. Ozgenc, F. Association between anti-endomysial antibody and total intestinal villous atrophy in children with coeliac disease / F. Ozgenc, G. Aksu, S. Aydogdu [et al.] // JPGM. – 2003. – Vol. 49. – Issue 1. – P. 21-4. 272. Patchy villous atrophy of duodenumin childhood celiac disease / M. Bonamico [et al.] // J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. – 2004. – Vol. 38. – P. 204–207. 273. Paulley, J.W. Observations on the aetiology of idiopathic steatorrhoea. Jejunal and lymph-node biopsies / J.W. Paulley // Br. Med. J. – 1954. – Vol. 4. – P. 1318–1321. 274. Peter, H.R. The Many Faces of Celiac Disease: Clinical Presentation of Celiac Disease in the Adult Population / H.R. Peter // Gastroenterology. – Vol. 128, № 4. – P. 74–78. 275. Phenotyping of peripheral blood lymphocytes in adult celiac disease / A. Di Sabatino [et al.] // Immunol. – 1998. – Vol. 95, № 4. – P. 572–576. 276. Piacentini, M. Characterization of distinct sub-cellular location of transglutaminase type II: changes in intracellular distribution in physiological and pathological states / M. Piacentini, M. D’Eletto, M.G. Farrace [et al.] // Cell Tissue Res. – 2014. – Vol. 358(3). – P. 793–805. 277. Ponziani, F.R. Folate in gastrointestinal health and disease / F.R. Ponziani, I.A.Cozzato, S.Danese, S.Fagiuou [et al.] // European Review for Medical and Pharmacological Sciences. – 2012. – Vol. 16. – P. 376-385. 278. Population screening for coeliac disease in primary care by district nurses using a rapid antibody test: diagnostic accuracy and feasibility study / I.R. KorponaySzabo [et al.] // Research Accepted 8 October. – 2007. 279. Prause, C. Antibodies against deamidated gliadin as new and accurate biomarkers of childhood coeliac disease / C. Prause, M. Ritter, C. Probst, C. Daehnrich [et al.] // J Pediatr Gastroenterol Nutr. – 2009. – Vol. 49. – P. 52-58. 280. Qiao, S.W. The adaptive immune response in celiac disease / S.W. Qiao, R. Iversen, M. Ráki, L.M.Sollid // Semin Immunopathol. – 2012. – Vol. 34(4). – P. 523-40. 221 281. Radek, JT. Affinity of human erythrocyte transglutaminase for a 42-kDa gelatin-binding fragment of human plasma fibronectin / JT. Radek, JM. Jeong, SN. Murthy [et al.] // Proc Natl Acad Sci USA. – 1993. – Vol. 90. – P. 3152–6. 282. Radlović, N. Celiac Disease / N. Radlović // Srp Arh Celok Lek. – 2013. – Vol. 141(1-2). – P. 122-126. 283. Ramakrishna, B.S. Wanted: diagnostic criteria for adult celiac disease / B.S. Ramakrishna // Indian J. Gastroenterol. – 2007. – Vol. 26. – P. 157–158. 284. Rashtak, S. Comparative usefulness of deamidated gliadin antibodies in the diagnosis of celiac disease / S. Rashtak, MW. Ettore, HA. Homburger [et al.] // Clin Gastroenterol Hepatol. – 2008. – Vol. 6. – P. 426–32. 285. Real, A. Identification and In Vitro Reactivity of Celiac Immunoactive Peptides in an Apparent Gluten-Free Beer / A. Real, I. Comino, Ma de Lourdes Moreno, et al. // PLoS ONE 2014 9(6): e100917. 286. Real, A. Molecular and immunological characterization of gluten proteins isolated from oat cultivars that differ in toxicity for celiac disease / A. Real, I. Comino, L. de Lorenzo [et al.] // PLoS One 2012 7: e48365. 287. Rensch, MJ. The prevalence of celiac disease autoantibodies in patients with systemic lupus erythematosus / MJ. Rensch, R. Szyjkowski, RT. Shaffer [et al.] // Am J Gastroenterol. – 2001. – Vol. 96. – P. 1113-5. 288. Revised criteria for diagnosis of coeliac disease. Report of working Group of European Society of Paediatric Gastroenterology and Nutrition // Arch. Dis. Child. – 1990. – Vol. 65. – P. 909–911. 289. Rivabene, R. Redox-dependent modulation of lipid synthesis induced by oleic acid in the human intestinal epithelial cell Line Caco-2 / R. Rivabene, Napolitano, A. Cantafora, E. Bravo // Exp. Biol. Med. – 2001. –Vol. 226. – P. 191–198. 290. Romanos, J. Predicting susceptibility to celiac disease by genetic risk profiling / J. Romanos, C. Wijmenga // Annals of Gastroenterology & Hepatology. – 2010. – Vol. 1. – P.11-18. 222 291. Rostami Nejad, M. Subclinical celiac disease and gluten sensitivity / M. Rostami Nejad, S. Hogg-Kollars, S. Ishaq, K. Ros // Gastroenterol Hepatol Bed Bench. – 2011. – Vol. 4(3). – P. 102-108. 292. Rubio-Tapia, A. Clinical Guidelines: Diagnosis and Management of Celiac Disease / A. Rubio-Tapia, I. D.Hill, P. Ciarán, K.H. Calderwood [et al.] // Am J Gastroenterol. – 2013. – Vol. 108. – P. 656–676. 293. Ruuskanen, A. Positive serum antigliadin antibodies without celiac disease in the elderly population: does it matter? / A. Ruuskanen, K. Kaukinen, P. Collin, H. Huhtala [et al.] // Scand J Gastroenterol. – 2010. – Vol. 45(10). – P. 1197-202. 294. Salentijn, E.MJ. Quantitative and qualitative differences in celiac disease epitopes among durum wheat varieties identified through deep RNA-amplicon sequencing / E.MJ. Salentijn, D.G. Esselink, S.V. Goryunova [et al.] // BMC Genomics. – 2013. – Vol. 14. – P. 905. 295. Sapone, A. Divergence of gut permeability and mucosal immune gene expression in two gluten-associated conditions celiac disease and gluten sensitivity / A. Sapone , K.M. Lammers, V. Casolaro, M. Cammarota [et al.] // BMC Medicine. – 2011. – P. 9-23. 296. Sarada, L. Tebo Testing for Antireticulin Antibodies in Patients with Celiac Disease Is Obsolete: a Review of Recommendations for Serologic Screening and the Literature Clinical and Vaccine Immunology / L. Sarada, A.E. Nandiwada // – 2013. – Vol. 20, № 4. – P. 447–451. 297. Sattar, N. Celiac disease in children, adolescents and young adults with autoimmune thyroid disease / N. Sattar, F. Lazare, M. Kacer [et al.] // J Pediatr. – 2011. – Vol. 158. – P. 272-5. 298. Scherf, KA. Electrochemical Immunosensors for the Diagnosis of Celiac Disease / KA. Scherf, P. Koehler, H. Wieser // Advances in Chemical Engineering and Science. – 2015. – Vol. 5. – P. 83-95. 299. Schirru, E. Anti-Actin IgA Antibodies Identify Celiac Disease Patients with a Marsh 3 Intestinal Damage among Subjects with Moderate Anti-TG2 Levels / E. 223 Schirru, F. Danjou, L. Cicotto [et al.] // Hindawi Publishing Corporation BioMed Research International. – 2013. – Article ID 630463. – 6 p. 300. Sequeira, I.R. Standardising the Lactulose Mannitol Test of Gut Permeability to Minimise Error and Promote Comparability / I.R. Sequeira, R.G. Lentle, M.C. Kruger, R.D. Hurst // PLoS One. – 2014. – Vol. 9(6): e99256. 301. Shelby, D. Burns Can Elafin help with gluten intolerance and celiac disease? / D. Shelby // Source: MedicalNewsToday, American Journal of Gastroenterology April 25, 2014. 302. Sido, B. Impairment of intestinal glutathione synthesis in patients with inflammatory bowel disease / B. Sido, V. Hack, A. Hochlehnert [et al.] // Gut. – 1998. – Vol. 42. – P. 485–492. 303. Sigman, T. Ulcerative jejunitis in a child with celiac disease / T. Sigman, V.H. Nguyen, F. Costea, A. Sant [et al.] // BMC Gastroenterology. – 2014. – Vol. 14. – P. 29. 304. Significance of intraepithelial lymphocytosis in small bowel biopsy samples with normal mucosal architecture / S. Kakar [et al.] // Am. J. Gastroenterol. – 2003. – Vol. 98. – P. 2027–2033. 305. Silano, M. Delayed diagnosis of celiac disease increases cancer risk / M. Silano, U. Volta, A.M. Mecchia [et al.] // BMC Gastroenterology. – 2007. – Vol. 7. – P. 8. 306. Silano, M. Diversity of oat varieties in eliciting the early inflammatory events in celiac disease / M. Silano, E. Penas Pozo, F. Uberti, S. Manferdelli [et al.] // Eur J Nutr. – 2013. doi 10.1007/s00394-013-0617-4. 307. Simon-Vecsei, Z. A single conformational transglutaminase 2 epitope contributed by three domains is critical for celiac antibody binding and effects / Z. Simon-Vecsei, R. Kiraly, P. Bagossi [et al.] // Proc Natl Acad Sci USA. – 2012. – Vol. 109. – P. 431-436. 224 308. Singh, P. Non-classical Celiac Disease / P. Singh, G.K. Makharia // International Journal of Celiac Disease. – 2014. – Vol. 2, № 3. – P. 76-85/ 309. Sjölund, K. Plasma motilin in untreated celiac disease / K. Sjölund, R. Ekman // Peptides. – 2003. – Vol. 24(3). – P. 483-6. 310. Small bowel bacterial overgrowth is a common cause of chronic diarrhea / M. Teo [et al.] // J. Gastroenterol. Hepatol. – 2004. – Vol. 19, № 8. – P. 904–909. 311. Small-bowel mucosal transglutaminase 2-specific IgA deposits in coeliac disease without villous atrophy: a prospective and randomized clinical study / K. Kaukinen [et al.] // Scand. J. Gastroenterol. – 2005. – Vol. 40, № 5. – P. 564–572. 312. Smedby, K.E. Malignant lymphomas in coeliac disease: evidence of increased risks for lymphoma types other than enteropathy-type T cell lymphoma / K.E. Smedby, M. Åkerman, H. Hildebrand [et al.] // Gut. – 2005. – Vol. 54. – P. 54-59. 313. Sollid, LM. Molecular basis of celiac disease / LM. Sollid // Annual Review of Immunology. – 2000. – Vol.18. – P. 53-81. 314. Steel, D.M. Abnormal fatty acid pattern in intestinal mucosa of children with celiac disease is not reflected in serum phospholipids / D.M. Steel, W. Ryd, H. Ascher, B. Strandvik // J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. – 2006. – Vol. 43, № 3. – P. 318–323. 315. Stepniak, D. Celiac disease: sandwiched between innate and adaptive immunity / D. Stepniak, F. Koning // Human Immunology. – 2006. – Vol. 67. – P. 460–468 316. Stoven, S. Celiac Disease: Advances in Treatment via Gluten Modification / S. Stoven, J.A. Murray, E. Marietta // Clinical Gastroenterology and Hepatology. – 2012. – Vol. 10. – P. 859–862. 317. Structural basis for the guanine nucleotide-binding activity of tissue transglutaminase and its regulation of transamidation activity / S. Liu [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2002. – Vol. 99. – P. 2743–2747. 318. Svanqvist, A. Fibronectin-tissue transglutaminase interaction and the development of a modified ELISA assay for the detection of coeliac disease / А. Svanqvist // urn: nbn\se\uu\diva-155482 (URN). – 2011. 225 319. Szaflarska-Poplawska, A. Oxidatively damaged DNA/oxidative stress in children with celiac disease / A. Szaflarska-Poplawska, A. Siomek, M. CzerwionkaSzaflarska, D. Gackowski [et al.] // Cancer Epidemiol. Biomark. Prev. – 2010. – Vol. 19. – P. 1960–1965. 320. Telega, G. Emerging new clinical patterns in the presentation of celiac disease / G. Telega, T.R. Bennet, S. Werlin // Arch. Pediatr. Adolesc. Med. –2008. – Vol. 162, № 2. – P. 164–168. 321. The immune recognition of gluten in celiac disease / R. Ciccocioppo [et al.] //Clin. Exp. Immunol. – 2005. – Vol. 140. – P. 408–416. 322. The toxicity of high molecular weight glutenin subunits of wheat to patients with celiac disease / Dh. Dewar [et al.] // Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. –2006. – Vol. 18. – P. 483–491. 323. Thompson, T. Gluten contamination of commercial oat products in the United States / T. Thompson // N Engl J Med. – 2004. – Vol. 351. – P. 2021-2. 324. Tissue transglutaminase is the target in both rodent and primate tissues for celiac disease-specific autoantibodies / I.R. Korponay-Szabo [et al.] // J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. – 2000. – Vol. 31. – P. 520–527. 325. Tosco, A. MaglioIntestinal anti-tissue transglutaminase antibodies in potential coeliac disease / A. Tosco, R. Aitoro, R. Auricchio, D. Ponticelli [et al.] // Clinical & Experimental Immunology. – 2013. – Vol. 171(1). – P. 69-75. 326. Transthyrin: a marker for celiac disease activity / R. Reifen [et al.] // J. Med. – 1998. – Vol. 29, № 1–2. – P. 30–36. 327. Trigoni, E. Celiac Disease in Adult Patients: Specific Autoantibodies in the Diagnosis, Monitoring, and Screening Hindawi / E. Trigoni, A. Tsirogianni, E. Pipi, G. Mantzaris, C. Papasteriades // Publishing Corporation Autoimmune Diseases. – 2014. – Article ID 623514. – 7 p. 328. Trynka, G. A genetic perspective on coeliac disease / G. Trynka, C. Wijmenga, D.A. van Heel // Trends Mol. Med. – 2010. – Vol. 16. – P. 537–550. 226 329. Trynka, G. Coeliac disease-associated risk variants in TNFAIP3 and REL implicate altered NF-kappaB signalling / G. Trynka [et al.] // Gut. –2009. – Vol. 58. – P. 1078–83. 330. Trynka, G. From genome-wide association studies to disease mechanisms: celiac disease as a model for autoimmune diseases / G. Trynka [et.al.] //Semin Immunopathol. – 2012. – Vol. 34. – P.567–580. 331. Tursi, A. Low prevalence of antigliadin and anti-endomysium antibodies in subclinical/silent celiac disease / A. Tursi, G. Brandimarte, G. Giorgetti [et al.] // Am J Gastroenterol. – 2001. – Vol. 96(5). – P. 1507-10. 332. Tye Din, JA. Peripheral blood T cells induced by oat challenge target a series of avenin peptides in coeliac disease / JA. Tye Din, T. Beissbarth, RP. Anderson // J Gastroenterol Hepatol. – 2004. – Supplement: A212. 333. Usefulness of antibodies to deamidated gliadin peptides in celiac disease / U. Volta [et al.] // Dig. Dis. Sci. – 2008. – Vol. 53, № 6. – P. 1582–1588. 334. Usefulness of faecal elastase-1 assay in monitoring pancreatic function in chiedhood celiac disease / E. Capristo [et al.] // Ital. J. Gastroenterol. Hepatol. – 1998. – Vol. 30, № 5. – P. 500–504. 335. Uspenskaya, ID.The significance of increased levels of end nitric oxide metabolites in blood serum of children with celiac disease / ID. Uspenskaya, MV. Erzutova, LV. Korkotashvili [et al.] // Bratisl Lek Listy. – 2014. – Vol. 115(11). – P. 712-7. 336. Utility in clinical practice of immunoglobulin a anti-tissue transglutaminase antibody for the diagnosis of celiac disease / J.A. Abrams [et al.] // Clin. Gastroenterol. Hepatol. – 2006. – Vol. 4, № 6. – P. 726–730. 337. Van de Wal, Y. Selective deamidation by tissue transglutaminase strongly enhances gliadin-specific T cell reactivity / Y. Van de Wal, Y. Kooy, P. Van Veelen [et al.] // J Immunolo. – 1998. – Vol. 161. – P. 1585–8. 338. Van den Broeck, HC. Presence of celiac disease epitopes in modern and old hexaploid wheat varieties: wheat breeding may have contributed to increased prevalence 227 of celiac disease / HC. van den Broeck, HC. de Jong, EM. Salentijn [et al.] // Theor Appl Genet. – 2010. – Vol. 121(8). – P. 1527-39. 339. Ventura, A. SIGEP study group for autoimmune disorders in celiac disease / A. Ventura, G. Magazzu, L. Greco // Gastroenterol. – 1999. – Vol. 117, № 2. – P. 297–303. 340. Visakorpi, J. Memoir on the history of ESPGAN / J. Visakorpi B. Strandvik // ESPGAN 25 Years memories 1968–1992. Goteborg: Tryckt and Bunden Vasastadens Bokbinderi AB. – 1993. – P. 18–25. 341. Vivas Alegre, S. Refractory celiac disease / S. Vivas Alegre, J.M. Ruiz de Morales // Gastroenterol. Hepatol. – 2008. – Vol. 31, № 5. – P. 310–316. 342. Vogelsang, H. In vivo and in vitro permeability in coeliac disease / H. Vogelsang, M. Schwarzenhofer, B. Steiner [et al.] // Alimentary Pharmacology & Therapeutics. – 2001. – Vol. 15. – Issue 9. – P. 1417–1425. 343. Voigt, W. Severe thrombocytosis and anemia associated with celiac disease in a young female patient / W. Voigt, K. Jordan, C. Sippel [et al.] // Journal of Medical Case Reports. – 2008. – Vol. 2. – P. 96. 344. Vojdani, A. Differentiation between Celiac Disease, Nonceliac Gluten Sensitivity, and Their Overlapping with Crohn’s Disease / A. Vojdani, D. Perlmutter // A Case Series. Case Reports in Immunology. – 2013. – Article ID 248482. – 9 p. 345. Volta, U. Antibodies to gliadin detected by immunofluorescence and a micro-ELISA method: markers of active childhood and adult coeliac disease / U. Volta, M. Lenzi, R. Lazzari, F. Cassani [et al.] // Gut. – 1985/ – Vol. 26. – P. 667-671. 346. Volta, U. Celiac disease: diagnostic criteria in progress / U. Volta, V. Villanacci // Cellular & Molecular Immunology. – 2011. – Vol. 8. – P. 96–102. 347. Volta, U. Clinical and immunological features of celiac disease in patients with type 1 diabetes / U. Volta, F. Tovoli, G. Caio // Expert Rev Gastroenterol Hepatol. – 2011. – Vol. 5. – P. 479-87. 348. Volta, U. The changing clinical profile of celiac disease: a 15-year experience (1998-2012) in an Italian referral center / U. Volta, G. Caio, V. Stanghellini, R. De Giorgio // BMC Gastroenterology. – 2014. – Vol. 14. – P. 194. 228 349. Vriezinga, SL. Randomized feeding intervention in infants at high risk for celiac disease / SL. Vriezinga, R. Auricchio, E. Bravi, G. Castillejo, A. Chmielewska // N Engl J Med. – 2014. – Vol. 371(14). – P. 1304-15. 350. Wolters, V. Human tissue transglutaminase enzyme linked immunosorbent assay outperforms both the guinea pig based tissue transglutaminase assay and antiendomysium antibodies when screening for coeliac disease / V. Wolters, AF. VooijsMoulaert, H. Burger, R. Brooimans [et al.] // Eur J Pediatr. – 2002. – Vol. 161. – P. 284-287. 351. Wouters, J. Prospective human leukocyte antigen, endomysium immunoglobulin A antibodies, and transglutaminase antibodies testing for celiac disease in children with Down syndrome / J. Wouters, ME. Weijerman, AM. van Furth [et al.] // J Pediatr. – 2009. – Vol. 154. – P. 239-42. 352. Wu, J. Coeliac disease: emerging in China? / J Wu, B Xia [et al.] // Gut. – 2010. – Vol. 59. – P. 418-419. 353. Yiannakou, J.Y.·Detection and Characterisation of Anti-Endomysial Antibody in Coeliac Disease Using Human Umbilical Cord Int / J.Y. Yiannakou, D. Dell’Olio, M. Saaka, et al. // Arch Allergy Immunol. – 1997. – Vol. 112. – P. 140–144. 354. Zanzi, D. IL-15 interferes with suppressive activity of intestinal regulatory T cells expanded in celiac disease / D. Zanzi, R. Stefanile, S. Santagata, L. Iaffaldano [et al.] // Am. J. Gastroenterol. – 2011. – Vol. 106. – P. 1308–1317. 355. Zaykin, D.V. Interval estimation of genetic susceptibility for retrospective case-control studies / D.V. Zaykin, Z. Meng, S.K. Ghosh // BMC Genet. – 2004. – Vol. 5. – Paper 9. 356. Zemskov, EA. The role of tissue transglutaminase in cell-matrix interactions / EA. Zemskov, A. Janiak, J. Hang, A. Waghray, AM. Belkin // Front Biosci. – 2006. – Vol. 11. – P. 1057-1076.
