Стимуляция посттравматической регенерации седалищного нерва крысы с помощью плазмиды,

Оригинальные исследования
67
Стимуляция посттравматической регенерации
седалищного нерва крысы с помощью плазмиды,
экспрессирующей сосудистый эндотелиальный фактор
роста и основной фактор роста фибробластов
Р.Ф. Масгутов 1, 2, 3, И.И. Салафутдинов 1, 2, А.А. Богов 3, А.А. Трофимова 1, 2,
И.Г. Ханнанова 1, Р.И. Муллин 1, Р.Р. Исламов 2, 3, Ю.А. Челышев 2, 3, А.А. Богов 1, А.А. Ризванов 1, 2, 3
1
ГАУЗ «Республиканская клиническая больница» МЗ Республики Татарстан, Казань
2
ФГАО УВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», Казань
3
ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», Казань
Stimulation of rat’s sciatic nerve post-traumatic regeneration using plasmids expressing vascular endothelial
growth factor and basic fibroblast growth factor
R.F. Masgutov 1, 2, 3, I.I. Salafutdinov 1, 2, A.A. Bogov 3, A.A. Trofimova 1, 2, I.G. Khannanova 1, R.I. Mullin 1,
R.R. Islamov 2, 3, Yu.A. Chelyshev 2, 3, A.A. Bogov 1, A.A. Rizvanov 1, 2, 3
1
Republic Clinical Hospital, Kazan
2
Kazan (Volga Region) Federal University, Kazan
3
Kazan State Medical University, Kazan
Разработка эффективных методов лечения больных
с повреждением периферических нервов является актуальной задачей биомедицины. «Золотым стандартом» в восстановлении целостности нервных проводников является
аутонервная пластика, при которой дефект периферического нерва замещают с помощью аутогенной нервной вставки. Предложен способ стимулирования реваскуляризации
и регенерации аутонервной вставки с помощью локальной
инъекции плазмиды pBud-VEGF-FGF2, экспрессирующей
сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и основной фактор роста фибробластов (FGF2). Показано, что прямое введение плазмиды pBud-VEGF-FGF2 в проксимальный
и дистальный отрезки нерва, а также в саму аутонервную
вставку, стимулирует регенерацию седалищного нерва крысы и восстанавливает двигательную активность.
Ключевые слова: сосудистый эндотелиальный фактор
роста (VEGF), основной фактор роста фибробластов (FGF2),
генная терапия, плазмида, аутологичная трансплантация,
периферический нерв, аутонервная вставка.
Повреждения периферических нервов с наличием посттравматического дефекта являются актуальной проблемой медицины. Ежегодно в мире проводят
более 2 млн реконструктивных операций с целью
восстановления нервных стволов [1]. Несмотря на
широкое применение различных подходов и методов
лечения, остается проблема высокой степени инвалидизации больных [2–3].
Перспективным направлением для стимуляции
посттравматической регенерации поврежденных
нервных проводников представляется использование нейротрофических и ангиогенных факторов.
В качестве таких стимуляторов особый интерес
представляют сосудистый эндотелиальный фактор
роста (VEGF) и основной фактор роста фибробластов
(FGF2).
VEGF проявляет свойства типичного нейротрофического фактора. Он поддерживает выживание
чувствительных [4] и двигательных [5] нейронов.
Вместе с тем, VEGF стимулирует пролиферацию
астроцитов [6], нейральных стволовых [7] и ключевых для регенерации периферического нерва шван-
The development of effective treatments for patients
with peripheral nerve injury is an urgent task of biomedicine.
«Gold» standard in restoring the integrity of nerve conduits is
auto-nerve transplantation in which a peripheral nerve defect
is corrected with autologous nerve graft. Here we propose
a method for stimulating revascularization and regeneration
of auto-nerve graft by a local injection of plasmid pBud-VEGFFGF2, expressing vascular endothelial growth factor (VEGF)
and basic fibroblast growth factor (FGF2). It is shown that
direct injection of plasmid pBud-VEGF-FGF2 in the proximal
and distal segments of nerve, as well as in the auto-nerve
graft, stimulates the regeneration of the rat’s sciatic nerve
and restores motor activity.
Key words: vascular endothelial growth factor (VEGF),
basic fibroblast growth factor (FGF2), gene therapy, plasmid,
autologous transplantation, peripheral nerve, auto-nerve
graft.
новских клеток [4]. VEGF обладает выраженным
стимулирующим влиянием на процесс неоваскуляризации, что важно для устранения эффекта посттравматической ишемии тканей.
Другой, не менее важный для нейрорегенерации
ангиогенный и нейротрофический фактор – FGF2. На
модели преодоления 10 мм диастаза седалищного
нерва крысы при помощи кондуита из хитозана с
гидрогелевым матриксом на основе гепаринафибрина-фибронектина, содержащего FGF2, показано существенное превышение показателей регенерации по сравнению с контролем (PBS вместо
гидрогеля c FGF2) и их приближение к модели аутонервной вставки [8].
Однако при непосредственной доставке нейротрофических факторов в область повреждения терапевтический эффект ограничен по времени из-за
короткого периода жизни рекомбинантных белков в
тканях in vivo. Для достижения устойчивого и пролонгированного действия терапевтических молекул
представляется более целесообразным доставлять
не рекомбинантные нейротрофические факторы, а
e-mail: rizvanov@gmail.com
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VI, № 3, 2011
68
Оригинальные исследования
гены, кодирующие их биосинтез. Доставка в область
повреждения терапевтических генов считается одним из перспективных направлений для стимуляции
нейрорегенерации. Остается неясным, какие гены
или их комбинаций наиболее эффективно стимулируют посттравматическую регенерацию нерва. Для
решения этой задачи в данной работе выбрана комбинация генов vegf и fgf2, кодируемых ранее разработанной нами плазмидой pBud-VEGF-FGF2 [9].
Цель работы: выявить влияние прямой генной
терапии плазмидой pBud-VEGF-FGF2 на посттравматическую регенерацию седалищного нерва крысы
при замещении его дефекта с помощью аутонервной
вставки.
Материал и методы
Двухкассетный
экспрессионный
плазмидный
вектор pBud-VEGF165-FGF2 создан на основе плазмиды рBudCE4.1 (Invitrogen) субклонированием
кДНК генов vegf (изоформа 165) и fgf2 под контролем промоторов EF-1α и CMV соответственно [9].
Ранее нами было показано, что при трансфекции
клеток человека различных типов плазмидой pBudVEGF165-FGF2 происходит конститутивная и независимая экспрессия двух терапевтических генов vegf
и fgf2 [9–10]. Плазмидную ДНК для введения подопытным животным выделяли из рекомбинантного
штамма Escherichia coli с помощью набора EndoFree
Plasmid Maxi Kit в соответствии с инструкциями производителя (QIAGEN).
В работе использовали белых беспородных крыс.
У животных в левом седалищном нерве на уровне
середины бедра формировали диастаз длиной 5 мм,
иссеченный фрагмент нерва тотчас подшивали в
сформированный дефект. Через 7 сут. производили
повторный доступ к нерву. Животным опытной группы
вводили с помощью инъекции плазмиду pBud-VEGFFGF2 в проксимальный и дистальный отрезки нерва,
отступая 1 мм от линии шва, а также в саму вставку, отступая 2,5 мм от линии шва; по 5 мкл в каждую
точку (всего 45 мкг плазмидной ДНК в 15 мкл PBS).
Животным контрольной группы в те же точки и в
том же объеме вводили раствор фосфатного буфера
(PBS). Начиная со вторых суток после второй операции, для оценки двигательной функции использовали метод стимуляционной электронейромиографии.
С помощью игольчатых электродов регистрировали
суммарный потенциал икроножной мышцы, а именно порог возникновения моторного ответа, латентный период, длительность, амплитуду максимального моторного ответа, количество двигательных
единиц крысы на стимуляцию седалищного нерва до
операции, через 7 сут. после операции, через 28 и
56 сут. после введения плазмиды pBud-VEGF-FGF2,
а также у интактных животных. На 60 сут. после операции забирали 5 мм фрагмента периферического
отрезка седалищного нерва дистальнее линии шва
вставки, фиксировали в 2,5% растворе глутарового
альдегида, дофиксировали в 2% растворе четырехокиси осмия и заливали в эпон-аралдит. На полутонких срезах, окрашенных толуидиновым синим, под
световым микроскопом подсчитывали количество
миелиновых волокон. Статистический анализ проводили методом t-критерия Стьюдента в программе
Microsoft Excel 2007.
Все процедуры с животными проводили в соответствии с правилами, рекомендованными Физиологической секцией Российского национального
комитета по биологической этике [11].
Результаты и обсуждение
Начиная со 2-х сут. после операции, произведена
оценка динамики восстановления двигательной функции икроножной мышцы, иннервируемой седалищным
нервом. В таблице представлены данные амплитуды
моторных ответов подопытной и контрольной групп
животных в сравнении с группой интактных животных.
Исходя из полученных данных, лучшие результаты
наблюдали в группе животных с введением плазмиды
pBud-VEGF-FGF2 – средние значения амплитуды максимального моторного ответа икроножной мышцы на
56 сут. составили 63% относительно интактной конечности, а в контрольной группе результат – 22%.
В работе C. Fu et al. (2007) при перерезке седалищного нерва крысы без формирования диастаза к 8 неделе после операции и одновременного
однократного введения 50 мкг плазмидного вектора
phVEGF165 суммарный потенциал икроножной мышцы возрастал по сравнению с контролем (введение
физраствора вместо плазмиды) в среднем в 1,5
раза [12]. В нашем случае на том же сроке наблюдения и приблизительно при той же дозе вводимой
Амплитуда суммарного потенциала икроножной мышцы на электростимуляцию
седалищного нерва
Интактная группа
Контрольная группа
(PBS)
Группа с введением плазмиды
pBud-VEGF-FGF2
До операции
45,23±3,2
46,15±3,9
46,15±3,9
7 сут. после операции
45,23±3,2
7,18±3,21
8,04±1,76
7 сут. после введения
плазмиды
45,23±3,2
8,49±1,01
9,47±1,16
28 сут. после введения
плазмиды
45,23±3,2
9,55±2,01
11,16±2,74
56 сут. после введения
плазмиды
45,23±3,2
10,27±1,45
29,38±1,45*
Сроки
Примечание: * – отмечены параметры статистически значимо отличающиеся от значений зарегистрированных
у контрольной группы (значение р<0,05).
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VI, № 3, 2011
69
Оригинальные исследования
6000,0
PBS
Миелиновые волокна
однократно плазмиды pBud-VEGF-FGF2 амплитуда
моторных ответов икроножной мышцы увеличивалась почти в 3 раза. Учитывая наличие диастаза
в наших экспериментах, т.е. существенно более
сложные условия для регенерации нервных волокон, зарегистрированный нами результат по данному
электрофизиологическому показателю превосходит
результаты работы C. Fu et al., что может быть связано с доставкой в область повреждения нерва одновременно двух терапевтических генов, экспрессирующих in vivo комбинацию нейротрофических и
ангиогенных факторов. На модели диабетической
нейропатии у крыс и кроликов через 4 нед. после
прямого введения в мышцу плазмиды с рекомбинантными генами человека VEGF-1 (VEGF165) или VEGF-2
(VEGFC) по критериям неоваскуляризации и электрофизиологическим параметрам для нервных волокон
большого и малого диаметра также был зарегистрирован устойчивый позитивный результат [13].
Через 60 сут. после операции во всех группах забирали проксимальный фрагмент периферического
отрезка седалищного нерва для оценки количества
регенерирующих миелиновых волокон. При эксплантации седалищного нерва крыс подопытной группы
с введением плазмиды pBud-VEGF-FGF2 была выявлена выраженная реваскуляризация аутонервной
вставки (рис. 1). При гистологическом исследовании показано, что количество миелиновых волокон
в дистальном отрезке седалищного нерва было на
98,4% (р<0,05) больше по сравнению с контрольной группой (введение PBS) (рис. 2).
5000,0
4000,0
pBud-VEGF-FGF2
Интактный нерв
3000,0
2000,0
1000,0
0,0
Группы
Рис. 2. Количество регенерирующих миелиновых
волокон в аутонервной вставке седалищного нерва
крысы
В условиях генной терапии увеличение количества миелиновых волокон может быть результатом
прямого поддерживающего влияния нейротрофических факторов на выживание и дифференцировку
шванновских клеток, а также на процесс ремиелинизации аксонов.
Таким образом, полученные данные указывают
на то, что прямое введение плазмиды pBud-VEGFFGF2 стимулирует регенерацию седалищного нерва
крысы и восстанавливает двигательную активность
конечности. При этом усиливается реваскуляризация аутонервной вставки и, вероятно, активируется пролиферация шванновских клеток и экспрессия в них ряда стимуляторов нейрорегенерации,
таких как нейротрофичекие факторы, молекулы
адгезии, молекулы внеклеточного матрикса и др.
Наблюдаемые нами эффекты улучшения показателей регенерации нерва могут быть результатом
локальной сверхэкспрессии терапевтических генов
и прямого влияния кодируемых ими нейротрофических и одновременно ангиогенных факторов на
клетки-мишени в поврежденной ткани.
Благодарности
Работа частично финансировалась грантами Российского Фонда Фундаментальных Исследований,
государственным контрактом ФЦП Федерального
Агентства по Науке и Инновациям 16.512.11.2101,
Министерством Здравоохранения Республики Татарстан. Работа частично выполнена на оборудовании
Регионального центра коллективного пользования
физико-химических исследований веществ и материалов (РЦКП ФХИ) и научно образовательного
центра фармацевтики Казанского (Приволжского)
федерального университета.
Рис. 1. Аутонервная вставка седалищного нерва
крысы через 60 сут. после операции (опытная
группа животных) с признаками интенсивной
неоваскуляризации. Черными стрелками показано
место шва центрального отрезка со вставкой
ЛИТЕРАТУРА:
1. Sharon I., Fishfeld C. Acute nerve injury. Med. J. 2002; 3(6):
69–75.
2. Шевелев И.Н., Вашин Н.Н., Лошаков В.А. Результаты интерфасцикулярной аутотрансплантации в лечении травматических повреждений срединного и локтевого нервов. Вопросы нейрохирургии
им. Бурденко. 1983; 5: 45–51.
3. Lee S.K., Wolfe S.W. Peripheral nerve injury and repair. J. Am.
Acad. Orthop. Surg. 2000; 8(4): 243–52.
4. Sondell M., Lundborg G., Kanje M. Vascular endothelial
growth factor has neurotrophic activity and stimulates axonal
outgrowth, enhancing cell survival and Schwann cell proliferation
in the peripheral nervous system. J. Neurosci. 1999; 19(14):
5731–40.
5. Islamov R.R., Chintalgattu V., Pak E.S. et al. Induction of VEGF
and its Flt-1 receptor after sciatic nerve crush injury. Neuroreport.
2004; 15(13): 2117–21.
6. Rosenstein J.M., Mani N., Silverman W.F. et al. Patterns of brain
angiogenesis after vascular endothelial growth factor administration in
vitro and in vivo. PNAS USA 1998; 95(12): 7086–91.
7. Sun J., Sha B., Zhou W. et al. VEGF-mediated angiogenesis
stimulates neural stem cell proliferation and differentiation in the
premature brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2010; 394(1):
146–52.
8. Han H., Ao Q., Chen G. et al. A novel basic fibroblast growth
factor delivery system fabricated with heparin-incorporated fibrinfibronectin matrices for repairing rat sciatic nerve disruptions.
Biotechnol. Lett. 2010; 32(4): 585–91.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VI, № 3, 2011
70
Оригинальные исследования
9. Салафутдинов И.И., Шафигуллина А.К., Ялвач M.Э. и др.
Эффект одновременной экспрессии различных изоформ фактора
роста эндотелия сосудов VEGF и основного фактора роста фибробластов FGF2 на пролиферацию эндотелиальных клеток пупочной
вены человека HUVEC. Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия 2010; 5(2): 62–7.
10. Rizvanov A.A., Guseva D.S., Salafutdinov I.I. et al. Genetically
modified human umbilical cord blood cells expressing vascular
endothelial growth factor and fibroblast growth factor 2 differentiate
into glial cells after transplantation into amyotrophic lateral sclerosis
transgenic mice. Exp. Biol. Med. 2011; 236(1): 91–8.
11. Генин А.М., Ильин А.Е., Капланский А.С. и др. Биоэтические правила проведения исследований на человеке и животных
в авиационной, космической и морской медицине. Авиакосмическая и экологическая медицина 2001; 4: 14–20.
12. Fu C., Hong G., Wang F. Favorable effect of local VEGF gene
injection on axonal regeneration in the rat sciatic nerve. J. Huazhong.
Univ. Sci. Technolog. Med. Sci. 2007; 27(2): 186–9.
13. Schratzberger P., Walter D.H., Rittig K. et al. Reversal of
experimental diabetic neuropathy by VEGF gene transfer. J. Clin.
Invest. 2001; 107(9): 1083–92.
Поступила 03.07.2011
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VI, № 3, 2011