Министерство образования и науки Российской Федерации

Министерство образования и науки Российской Федерации
Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского
Национальный исследовательский университет
Учебно-научный и инновационный комплекс
«Физические основы информационно-телекоммуникационных систем»
Калинцева Я.И., Мухина И.В., Семьянов А.В.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПЕРЕЖИВАЮЩИХ СРЕЗОВ МОЗГА КРЫС
Электронное методическое пособие
Блок мероприятий 2. Повышение эффективности научно-инновационной
деятельности
Учебная дисциплина: " Нейрональные сети мозга "
Специальность "020207 Биофизика"
Направление: "020207 Биофизика"
Нижний Новгород
2011
УДК 57.085.21(077)
ББК 28с я73-4
К-17
К-17 Калинцева Я.И., Мухина И.В., Семьянов А.В. ПРИГОТОВЛЕНИЕ
ПЕРЕЖИВАЮЩИХ СРЕЗОВ МОЗГА КРЫС: электронное методическое
пособие /Нижний Новгород, 2011. - 36 с.
В настоящем пособии изложены основные правила работы с
лабораторным
оборудованием,
описание
методики
приготовления
переживающих срезов мозга крыс, краткие сведения об основных правилах
приготовления растворов, а также представлены лабораторные работы. В
приложении имеются дополнительные материалы, необходимые для
выполнения лабораторных работ по приготовлению рабочих растворов.
Руководство предназначено для студентов 5 курса дневного отделения,
обучающихся по специальности «Биофизика», в рамках проведения одного из
разделов большого практикума, а также для студентов 4-5 курсов в целях
изучения курсов «Нейрональные сети мозга», «Математические модели
нейродинамики».
Подготовлено при поддержке гранта РФФИ офи-м 11-04-12144;
программы Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология" (20082011); 2.1.1/13659 по аналитической ведомственной целевой программе
"Развитие научного потенциала высшей школы" (2009-2011).
УДК 57.085.21(077)
ББК 28с я73-4
© Нижегородский государственный
университет им. Н.И.Лобачевского, 2011
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
Глава 1. Теоретические основы работы в экспериментальной
лаборатории................................................................................................................4
1.1 Основные правила работы в химической лаборатории.....................................4
1.2.Правила работы с аналитическими весами.........................................................5
1.3. Правила работы с пипеточными дозаторами.....................................................5
1.4. Правила работы с магнитной мешалкой............................................................7
1.5. Правила работы с осмометром............................................................................8
1.6. Правила работы с вибротомом.........................................................................12
1.7. Расчеты параметров растворов.........................................................................14
1.8. Основные правила обработки лабораторной посуды.....................................16
1.9.Медицинская доврачебная помощь в лаборатории..........................................17
Глава 2. Методика приготовления переживающих срезов мозга..................18
2.1. Приготовление растворов, необходимых для работы с переживающими
срезами мозга крыс....................................................................................................18
2.1.1. Приготовление базовых растворов................................................................18
2.1.2. Приготовление рабочих растворов................................................................20
2.2. Приготовление переживающих срезов мозга крыс.........................................25
2.3. Методика прижизненного маркирования глиальных клеток в срезах мозга с
помощью флуоресцентных зондов…......................................................................26
Глава 3. Лабораторные работы............................................................................28
Лабораторная работа №1..........................................................................................28
Лабораторная работа №2..........................................................................................29
Лабораторная работа №3..........................................................................................30
Лабораторная работа №4..........................................................................................31
Библиографический список..................................................................................33
Приложение..............................................................................................................34
3
Глава 1. Теоретические основы работы в экспериментальной лаборатории
1. 1. Основные правила работы в химической лаборатории
– на лабораторном столе во время работы не должно находиться посторонних
предметов;
– в лаборатории следует работать в хлопчатобумажном халате, волосы должны
быть убраны;
– принимать пищу в лаборатории строго запрещается;
– перед и после выполнения работы необходимо вымыть руки;
– работать нужно аккуратно, результат опыта зависит от чистоты проведения
эксперимента;
– все опыты с ядовитыми и пахучими веществами выполнять в вытяжном
шкафу;
– химические реактивы брать только шпателем, пинцетом или ложечкой (не
руками!);
– неизрасходованные реактивы не высыпать и не выливать обратно в те
сосуды, откуда они были взяты;
– при нагревании растворов и веществ в пробирке необходимо использовать
держатель. Отверстие пробирки должно быть направлено в сторону от себя и
других работающих;
– нельзя наклоняться над сосудом, в котором происходит нагревание или
кипячение жидкости;
– при необходимости определения запаха, выделяющегося при реакции газов,
нужно легким движением ладони направить струю газа от отверстия
реакционного сосуда к себе и осторожно вдохнуть;
– при разбавлении концентрированных кислот и щелочей небольшими
порциями приливать кислоту (или концентрированный раствор щелочи) в воду,
а не наоборот;
– при попадании концентрированного раствора кислоты на кожу промыть
место ожога струей воды в течение нескольких минут. После этого обработать
обожженное место 3%-м раствором питьевой соды;
– при ожоге концентрированными растворами щелочей промыть обожженное
место струей воды в течение нескольких минут. После этого обработать
обожженное место 1%-м раствором уксусной или борной кислоты и снова
водой;
– при термическом ожоге охладить пораженное место, для чего поместить его
под струю холодной воды. После охлаждения смазать мазью от ожогов;
– при попадании раствора любого реактива в глаз немедленно промыть его
большим количеством воды, после чего сразу же обратиться к врачу;
– со всеми возникающими вопросами сразу же обращаться к сотрудникам
лаборатории [5].
4
1.2. Правила работы с аналитическими весами
На итоговый результат при взвешивании веществ влияет довольно много
факторов. Перед использованием необходимо внимательно ознакомиться с
руководством по эксплуатации аналитических весов.
Аналитические весы используются для взвешивания сухих химических
реактивов с точностью от 0,0001 до 0,01 г и пределом измерения от 210 г до 1,5
кг.
В качестве примера работы с аналитическими весами использованы два
типа аналитических весов - Scientech sp1500 и Scientech sa 210 (оба типа весов
позволяют произвольно устанавливать метку отсчёта «0»):
– с точностью 0,0001 г и пределом измерения до 210 г. Такие весы
используются для взвешивания небольших количеств веществ (обычно до 100
мг, но иногда, когда требуется необычно высокая точность, и больше);
– с точностью 0,01 г и пределом измерения до 1,5 кг. Весы используются для
всех остальных взвешиваний.
Расположенная в верхней части дисплея весов полоса «%» показывает,
какую часть от максимально допустимого составляет вес реактива на чаше
весов [4].
Порядок работы с аналитическими весами
1. Установить на чашу аналитических весов "пустую" емкость для
взвешивания;
2. Установить на дисплее аналитических весов значение «0»;
3. Насыпать необходимое количество реактива в емкость, находящуюся на
чаше весов до появления на дисплее нужного значения.
Если при взвешивании реактив попал на поверхность аналитических
весов, нужно аккуратно снять чашу и, если надо, верхний кожух весов; все
части весов протереть влажной тряпкой и насухо вытереть, затем собрать
аналитические весы.
1.3. Правила работы с пипеточным дозатором
Дозаторы пипеточные предназначены для объемного дозирования проб
биологических жидкостей и реактивов, применяемых в практике медицинских
и химических исследований с использованием одноразовых наконечников.
Дозаторы пипеточные могут применяться в лабораторной практике
медицинских учреждений, а также учреждения химической, фармацевтической,
микробиологической промышленности и других областях наружного
хозяйства. Дозаторы пипеточные работают на принципе воздушного
смещения/вытеснения с использованием съемных разовых наконечников.
Управление дозатором пипеточным осуществляется с помощью плунжера. Все
дозаторы пипеточные оборудованы встроенным сбрасывателем наконечников.
5
Дозаторы пипеточные работают в следующих диапазонах объемов от 0,5 мкл
до 5000 мкл.
Техника дозирования
дозирования (полное вытеснение
1. Техника прямого
жидкости из
наконечника):
- нажимая большим пальцем на головку переместите плунжер в первую стоппозицию;
- погрузите наконечник дозатора пипеточного в раствор на глубину около 1см
и плавно опустите плунжер до возвращения его в стартовую стоп-позицию;
подождите немного для полного забора жидкости. Выньте дозатор пипеточный
из раствора, коснувшись кончиком наконечника края сосуда с раствором для
удаления избытка жидкости снаружи наконечника;
- дозируйте набранную жидкость в приемный сосуд, плавно нажимая на
головку плунжера до первой стоп-позиции, и, через секунду возобновив
нажатие, переместите плунжер до второй стоп-позиции, полностью вытесняя,
таким образом, остатки жидкости из наконечника;
- выньте дозатор пипеточный из приемного сосуда и плавно головку плунжера
для возвращения его в стартовую позицию.
2. Техника обратного дозирования (частичное вытеснение жидкости из
наконечника):
- нажимая большим пальцем на головку переместите плунжер во вторую стоппозицию;
- погрузите наконечник дозатора пипеточного в раствор на глубину около 1см
и плавно опустите плунжер до возвращения в стартовую стоп-позицию. Это
приведет к набору в наконечник большего объема жидкости, чем заданный;
- выньте дозатор пипеточный из раствора, коснувшись кончиком наконечника
края сосуда с раствором для удаления избытка жидкости снаружи наконечника;
- дозируйте набранную жидкость в приемный сосуд, плавно нажимая на
головку плунжера до первой стоп-позиции. Отдозированный, таким образом,
объем жидкости будет в точности соответствовать заданному на дозаторе
пипеточном объему;
- удерживая головку плунжера в первой стоп-позиции, выньте дозатор
пипеточный из приемного сосуда, перенесите дозатор пипеточный в емкость
для отходов, и, нажав головку плунжера до второй стоп-позиции, слейте
оставшуюся в наконечнике жидкость.
Примечание: техника обратного дозирования используется для работы с
вязкими и пенящимися растворами, а также для дозирования малых объемов.
Рекомендации: набирайте жидкость в дозатор пипеточный только при
закрепленном на дозаторе наконечнике. В работе дозатор пипеточный должен
находится в вертикальном положении и наконечник его должен быть погружен
в раствор на несколько миллиметров. Рекомендуется предварительное 5-ти
кратное ополаскивание наконечника намеченным для работы раствором. Это
особенно важно для растворов, чья вязкость и плотность отлична от воды.
Всегда нажимайте на головку плунжера большим пальцем. Дозируемая
6
жидкость, наконечник и сам дозатор пипеточный должны иметь одинаковую
температуру. Протирание наконечника допустимо только в тех редких случаях,
когда на внешней поверхности наконечника остались капельки набираемой
жидкости. Избегайте при этом касания отверстия наконечника. Для избегания
переноса тепла внутрь дозатора пипеточного, не держите ее в ладони, когда не
работаете с ней. Используйте только соответствующий диапазону наконечник.
Выбирайте нужную технику дозирования (прямую или обратную) которая
соответствует характеру дозируемой жидкости. Не используйте избыточную
силу и резкие движения при нажатии на плунжер, и дозатор пипеточный
прослужит вам долго.
Уход за пипеточным дозатором
Для увеличения срока службы дозатора пипеточного рекомендуется в
конце рабочего дня проверять его на чистоту, особое внимание стоит уделять
держателю наконечников. Для чистки дозатора пипеточного используйте 70%
этиловый спирт и мягкую ткань. Рекомендуется регулярно чистить держатель
наконечников. Дозатор пипеточный создан таким образом, чтобы его было
легко обслуживать на месте. Однако если требуется ремонт или
профессиональная калибровка, обратитесь к ближайшему дистрибьютору за
этим сервисом. Перед передачей дистрибьютору, убедитесь, что дозатор
пипеточный чистый и не содержит никакой жидкости.
1.4. Правила работы с магнитной мешалкой
Магнитная мешалка предназначена для перемешивания жидкостей при
проведении лабораторных работ. Эксплуатируют магнитную мешалку при
температуре окружающей среды от +5оС до +35оС и относительной влажности
воздуха не более 80 % при температуре +25оС.
Корпус магнитной мешалки (magnetic stirrer HI 302N) выполнен из
пластмассы. На передней панели расположены светодиодный индикатор
питания и регулятор скорости вращения. На задней панели расположены
разъём источника питания "~12В" и кнопка «вкл/выкл»
Принцип действия: перемешивание жидкости в сосуде осуществляется
за счет движения магнитного стержня в магнитном поле. Вращающееся
магнитное поле формируется постоянными магнитами, закреплёнными на валу
шагового двигателя. Скорость вращения двигателя определяется частотой и
последовательностью
импульсов,
выдаваемых
микроконтроллером.
Управление микроконтроллером производится посредством изменения
сопротивления регулятора, которое зависит от угла поворота ручки
переменного резистора [1].
Порядок работы с магнитной мешалкой
1. Установите мешалку на горизонтальную поверхность и подключите к
источнику питания при помощи разъёма "~12В" на задней панели;
2. Источник питания присоедините к сети переменного тока;
7
3. В центр верхней части корпуса магнитной мешалки поставьте сосуд с
перемешиваемой жидкостью и погрузите в него магнитный стержень;
4.Нажмите кнопку «вкл», при этом должен загореться светодиодный
индикатор;
5.Установите уровень скорости вращения магнитного стержня в сосуде
регулятором скорости вращения. При установке скорости необходимо следить
за уровнем жидкости в сосуде, чтобы не происходило ее выплескивание. В
процессе перемешивания возможно опускание в сосуд с жидкостью различных
датчиков, при этом они не должны задевать вращающийся магнитный
стержень.
Замена сосуда с жидкостью возможна без выключения или
изменения скорости вращения магнитной мешалки;
6.После окончания работы с магнитной мешалкой снимите сосуд с
перемешиваемой жидкостью, извлеките из него магнитный стержень;
7.Повторным нажатием кнопки «вкл» выключите питание магнитной мешалки,
светодиодный индикатор при этом гаснет. Отсоедините источник питания от
сети переменного тока.
Во время эксплуатации следует выполнять следующие операции:
внешний осмотр - ежедневно; очистка корпуса и разъемов - один раз в месяц.
Внешний осмотр проводится перед включением магнитной мешалки и
заключается в определении целостности корпуса, кабелей, разъемов.
Для очистки корпуса магнитной мешалки протрите корпус тканью,
смоченной спиртом этиловым техническим по ГОСТ 17299-78 марки А или
водой. При этом необходимо исключить попадание спирта или воды внутрь
корпуса прибора. Использование других растворителей не допускается.
Очистка разъемов проводится при загрязнении. Для очистки разъемы
протрите тканью, смоченной спиртом этиловым техническим по ГОСТ 1729978 марки А.
1.5. Правила работы с осмометром
Осмометр – (осмо - + греч. metreo измерять) прибор для измерения
осмотического давления или концентрации осмотически активных веществ;
применяется при биофизических и биохимических исследованиях.
Осмолярность (осмотическая концентрация) - суммарная концентрация
всех растворенных частиц. Может выражаться, как осмолярность (осмоль на
литр раствора) и как осмоляльность (осмоль на кг растворителя).
Осмоль – это единица осмотической концентрации, равная
осмоляльности, получаемой при растворении в 1 кг растворителя 1 моль
неэлектролита.
От осмолярности зависят так называемые свойства растворов: депрессия
точки замерзания, повышение точки кипения и осмотическое давление.
Осмотическая концентрация - это одно из общих свойств растворов,
однако, очень непохожее на остальные свойства. Это специфическое свойство
растворителя. Оно может быть измерено с помощью полупроницаемого
8
мембранного аппарата, но только в случае непроницаемых частиц раствора, так
как именно эти частицы не участвуют в поддержании осмотического давления.
Такие измерения часто обозначают как «коллоидное давление» или
«осмотическое давление», т. е. давление, связанное с присутствием коллоидов.
Общая осмотическая концентрация – это лишь теоретическое представление.
Измерение общей осмотической концентрации раствора может
произведено путем сравнения 1 общего свойства раствора с аналоговым
основным свойством чистого, беспримесного растворителя. Именно на этом
принципе основана работа осмометра [2].
Рисунок 1. Внешний вид прибора осмометр - Vapro Pressure Osmometer 5520 . а. - передняя
панель; б.- задняя панель. 1-дисплей; 2-углубление в держателе; 3-направляющее устройство
для пипеточного дозатора; 4-крышка; 5-нажмите на крышку, чтобы открыть ее; 6-индикатор
включения прибора; 7- кнопка «select»; 8-кнопка «enter»; 9-порт передачи данных; 10звуковой выход; 11-ручка переключения; 12- тумблер включения прибора; 13- серийный
номер и модель прибора.
Для работы с осмометром используют пипеточные дозаторы объемом 10
мкл для биологических растворов и лабораторных реагентов. Пластмассовые
наконечники для дозаторов можно использовать только один раз.
Не рекомендуется использовать 3-х шаговые пипеточные дозаторы, так
как последний шаг вызывает появление пузырьков, которые в свою очередь
могут загрязнить термопару.
Допустимая ошибка при измерениях лежит в пределах 10% от конечного
результата.
Таблица 1. Порядок работы с осмометром (Vapro Pressure Osmometer 5520).
1. Поверните
«открыто».
ручку
в
положение
9
2. С помощью пинцета положите в
углубление на держателе одиночный диск
из фильтровальной бумаги. Следует
убедиться, что вы положили 1 диск, если 2
диска склеены между собой, следует их
разделить, так как измерение будет
ошибочным.
3. Подведите пипеточный дозатор в
выемку
направляющего
устройства.
Наконечник дозатора должен находиться
на расстоянии около 5 мм от центра
бумажного диска.
Плавно нажмите плунжер дозатора до
конца, чтобы образец (жидкость) попали
на бумажный диск. Диск должен
полностью намокнуть.
Никогда не позволяйте наконечнику
дозатора, прикасаться к бумажному диску.
Если это произошло, то завершите
измерение и промойте держатель перед
тем как продолжить процедуру.
4. Задвиньте держатель. Держатель не
должен находиться в открытом состоянии
более 2-х минут, иначе последует звуковой
сигнал.
10
5. Поверните ручку в положение
«закрыто».
Затем на дисплее появиться время, в
течение которого будет проходить цикл
измерений. Цикл начинается сразу после
перемещения
ручки
в
положение
«закрыто». Осмолярность указывается в
интернациональных единицах - ммоль/кг.
6.
После
получения
результатов
необходимо
промыть
держатель
деионизированной водой. Если образец в
течение 4 минут не будет убран с
поверхности
держателя,
последует
звуковой сигнал.
Поверните ручку в положение «открыто» и
выдвиньте держатель. С помощью пинцета
уберите бумажный диск. Нанесите с
помощью
микропипетки
каплю
деионизированной воды непосредственно
в углубление держателя (также как и в
случае нанесения образца). Уберите воду
с помощью кусочков фильтровальной
бумаги, не дотрагиваясь до углубления
держателя. Следует обратить внимание на
то, что все манипуляции с держателем
проводятся с особой аккуратностью, так
как
чувствительность
к
малейшим
изменениям (даже пузырькам воздуха) на
этой поверхности очень высокая.
7. После уборки капель с углубления
держателя,
задвиньте
держатель
и
поверните ручку в положение «закрыто». На
дисплее появиться время, в течение
которого будет проходить цикл измерений.
После этого на экране должна появиться
надпись «READY» (готов), что означает
правильность очистки прибора
и
дальнейшую возможность работы с ним.
11
Если на экране вместо надписи «READY» появились значения
осмолярности, то прибор промыт не верно. Следует повторить этап промывки
еще раз в той же последовательности до появления на экране прибора надписи
«READY». Если при работе с прибором возникли какие-то трудности, следует
немедленно обратиться к сотрудникам лаборатории.
1.6. Правила работы с вибротомом
Вибротом – прибор для производства срезов из фиксированных и
нефиксированных препаратов биологической ткани, а также для
небиологических образцов.
Основная область применения виброротома – нейробиология.
Рисунок 2. Внешний вид прибора Microm НМ 650V.
Прибор имеет уникальный запатентованный вибрирующий механизм,
позволяющий избежать артефактов при производстве срезов живой ткани,
благодаря минимальному колебанию вибрирующего лезвия по оси z.
Амплитуду вибрации, так же как и частоту можно независимо настраивать в
процессе работы, для оптимизации работы прибора с определенным типом
ткани. Все значимые параметры для удобства работы оператора могут быть
сохранены в установках вибротома. Вибротом с вибрирующим лезвием НМ
650V позволяет получить срезы тканей превосходного качества [3].
12
Техника работы с вибротомом
1. Включить вибротом при помощи кнопки «вкл/выкл», которая располагается
на задней стенке прибора;
2. Включить охлаждение чаши вибротома;
3. Закрепить лезвие вибротома с помощью винтов;
4. Выставить угол наклона лезвия;
5. Налить в чашу вибротома необходимый раствор;
6. Установить магнит с препаратом в чаше вибротома;
7. Установить границы резки препарата;
а) нажатием кнопки вниз «↓» довести лезвие до «верхней» границы препарата;
б) нажать кнопку «окно»;
в) довести лезвие до «ближнего» края препарата, нажатием и удерживанием
кнопки «старт»;
г) нажать кнопку «окно»;
д) довести лезвие до «дальней» границы препарата, нажатием и удерживанием
кнопки «назад»;
е) проверить правильность установки границ резки препарата нажатием кнопки
«старт»;
8. Опустить лезвие вниз на несколько ступеней, непосредственно до самого
препарата;
9. Запустить резку кнопкой «старт»;
10. После окончания резки препарата, необходимо при помощи
продолжительного нажатия на кнопку «вверх» вернуть лезвие в
первоначальное положение;
11. Выключить охлаждение чаши вибротома;
12. Выключить вибротом;
13. Убрать лезвие;
14. Снять чашу вибротома;
15. Вымыть лезвие, чашу вибротома, магнит с помощью дистиллированной
воды и спирта;
16. Протереть тканью чашу вибротома.
13
кнопка "окно"границы резки
Рисунок 3. Внешний вид передней панели вибротома Microm НМ 650V.
1.7. Расчеты параметров растворов
Для расчета концентрации веществ в растворах используют такие
единицы измерения, как моль и процентное содержание.
Моль - единица измерения количества вещества. 1 моль - такое
количество вещества, в котором содержится 6,022х1023 (число Авогадро)
молекул этого вещества. Моль - единица безразмерная.
Процентное содержание - отношение количества данного вещества к
количеству всего раствора, выраженное в процентах. В зависимости от того,
что понимается под количеством, процентное содержание будет "массовым"
(w/w - weight/weight), "объёмным" (v/v - volume/volume) или "смешанным"
(например w/v - weight/volume).
Молярная весовая концентрация (моляльность) (m) - число молей
растворённого вещества, приходящееся на 1000 г растворителя.
Молярная объёмная концентрация (молярность) (CM)- число молей
растворённого вещества, содержащееся в 1 литре раствора.
Нормальность (CN) - число грамм-эквивалентов растворённого вещества,
содержащееся в 1 литре раствора.
Мольная (или молярная) доля (N) - число молей растворённого вещества,
приходящееся на 1 моль раствора.
Титр (T)- число граммов растворённого вещества, содержащееся в 1 мл
раствора.
14
Весовой процент (P)- число граммов растворённого вещества,
содержащееся в 100 г раствора.
(А) - число граммов растворённого вещества, приходящееся на 100 г
растворителя.
Формулы для расчетов концентрационных показателей растворов
E - эквивалентный вес растворённого вещества;
M - молекулярный вес растворённого вещества;
MP - молекулярный вес растворителя;
n - число грамм-эквивалентов в 1 моль растворённого вещества;
p - плотность раствора.
5) T
1) m
T = p/(1 + 1000/Mm); (5.1)
m = CM/(p - CMM/1000); (1.1)
T = CMM/1000; (5.2)
m = CN/(pn - CNM/1000); (1.2)
T = CNE/1000; (5.3)
m = 1000N/(MP(1 - N)); (1.3)
T = N/(N + (1 - N)MP/M); (5.4)
m = 1000T/(M(p- T)); (1.4)
T = pP/100; (5.5)
m = 1000P/(M(100 - P)); (1.5)
T = Ap/(100 + A); (5.6)
m = 10A/M; (1.6)
6) P
2) CM
P = 100Mm/(1000 + Mm); (6.1)
CM = 1000pm/(mM + 1000); (2.1)
P = CMM/10p; (6.2)
CM = CN/n; (2.2)
P = CNE/10p; (6.3)
CM = 1000pN/(MN + MP(1 - N)); (2.3)
P = 100N/(N + (1 - N)MP/M); (6.4)
CM = 1000T/M; (2.4)
P = 100T/p; (6.5)
CM = 10pP/M; (2.5)
P = 100A/(100 + A); (6.6)
CM = 1000Ap/(M(A +100)); (2.6)
7) A
3) CN
A = Mm/10; (7.1)
CN = 1000pmn/(mM + 1000); (3.1)
A = CMM/10(p - CMM/1000); (7.2)
CN = CMn; (3.2)
A = CNE/10(p - CNE/1000); (7.3)
CN = 1000pNn/(MN + MP(1 - N)); (3.3)
A = 100MN/((1 - N)MP); (7.4)
CN = 1000T/E; (3.4)
A = 100T/(p - T); (7.5)
CN = 10pP/E; (3.5)
A = 100P/(100 - P); (7.6)
CN = 1000Ap/(E(A +100)); (3.6)
4) N
N = m/(m + 1000/MP); (4.1)
N = CM/(CM + (1000p - CMM)/MP); (4.2)
N = CN/(CN + (1000p - CNE)/MP); (4.3)
N = T/(T + (p - T)M/MP); (4.4)
N = P/(P + (100 - P)M/MP); (4.5)
N = A/(A + 100M/MP); (4.6)
15
1.8. Основные правила обработки лабораторной посуды
В тех случаях, когда химическая посуда не загрязнена жировыми и
другими не растворяющимися в воде веществами, посуда может мыться теплой
водой с чистящим средством. Хорошо вымытая в теплой воде посуда
обязательно 2-3 раза ополаскивается дистиллированной водой и спиртом.
Посуда считается чистой тогда, когда, ополоснув последний раз водой и
перевернув ее, не увидим на стенках приставших капель.
Если посуда чиста, вода стекает с нее, не оставляя капель. Если на
стенках пробирки, например, имелся налет каких-либо солей, какой-нибудь
осадок, то для удаления его пробирку нужно очистить специальной щеткой
(ершом) и уже затем домывать [5].
При мытье и сушке посуды необходимо помнить следующее:
– посуда всегда должна быть чисто вымыта и ополоснута дистиллированной
водой;
– при работе с ершом нужно следить, чтобы нижним концом его не проткнуть
дно или не пробить стенку сосуда;
– при сушке посуды надо следить, чтобы она не загрязнилась;
– при мытье посуды различными органическими растворителями необходимо
экономить последние;
– осадки и растворы ценных веществ (серебро, платина, ртуть и др.) при
подготовке посуды к мытью нельзя выбрасывать; их следует собирать в
отдельные склянки;
– концентрированные растворы кислот и щелочей, дурно пахнущие и ядовитые
вещества, хромовую смесь, металлический Na+ и т. п. нельзя выливать или
выбрасывать в раковину;
– выбирая способ мытья, прежде всего, нужно учитывать, каким веществом
загрязнена данная посуда;
– при мытье посуды следует придерживаться правил техники безопасности и
санитарии;
– все опасные и ядовитые вещества могут отмывать только люди, обученные
обращению с такими веществами. Для мытья посуды с такими загрязнениями
следует отводить отдельную раковину, помещенную под тягой;
– дурно пахнущие загрязнения отмывают только под тягой;
– следует соблюдать большую осторожность при использовании для мытья
посуды концентрированных щелочей, концентрированных кислот, хромовой
смеси и других окислителей;
– при работе с органическими растворителями следует избегать вдыхания их
паров, попадания растворителей на руки и одежду и помнить об огнеопасности
многих органических растворителей;
– по возможности следует механизировать процесс мытья химической посуды;
– для отмывания загрязнений применяют наиболее дешевые материалы;
16
1.9. Медицинская доврачебная помощь в лаборатории
При несоблюдении правил техники безопасности работы в
лаборатории возможны случаи, требующие неотложной медицинской
помощи: порезы рук стеклом, ожоги горячими предметами, кислотами,
щелочами и т.д. [5].
При ранении стеклом. При ранениях стеклом нужно убедиться в том,
что в ранке не осталось стекла, затем быстро обмыть, смазать йодом и
перевязать пораненное место. Вместо повязки небольшую рану можно замазать
жидкостью Новикова, клеем БФ-6 или просто заклеить бактерицидным
лейкопластырем.
Угар (отравление продуктами горения). Угоревшего выносят на
свежий воздух, расстегивают сдавливающие тело части одежды, обливают
грудь, голову и лицо холодной водой. К носу пострадавшего подносят платок,
смоченный 2-3 каплями нашатырного спирта. Как только сознание возвратится,
пострадавшему дают выпить крепкого чая. Не следует вносить больного сразу в
помещение, даже если угар прошел. Ни в коем случае не делают угоревшему
искусственного дыхания.
При ожогах. При ожогах кислотами обожженное место прежде всего
обмывают раствором двууглекислой соды, а при ожогах щелочами - раствором
уксусной кислоты. При термических ожогах обожженное место можно
смазывать мазью от ожогов, натереть мылом или смазать вазелином и посыпать
двууглекислой содой. Если от ожога появится только краснота или
припухлость, то обожженные места нужно смазать вазелином или чистым
подсолнечным маслом, затем прикрыть чистым платком, потом ватой и
завязать платком или бинтом.
17
Глава 2. Методика приготовления переживающих срезов мозга крыс
2.1. Приготовление растворов, необходимых для работы с
переживающими срезами мозга крыс
Для работы с переживающими срезами мозга крыс необходимы 3
рабочих раствора: раствор для препарирования срезов, раствор для инкубации
срезов, раствор Рингера [8]. Данные растворы имеют многокомпонентный
состав и готовятся в несколько этапов.
2.1.1. Приготовление базовых растворов
На первом этапе готовят базовые растворы: «Часть 1»; «Часть 2»; «Часть
3»; 40 мл 1М раствора СаCl2; 40 мл 1М раствора MgCl2 (таблицы 2, 3, 4).
Таблица 2. Состав базового раствора «Часть 1» (вес компонентов выражен в граммах)
Компоненты
Объем базового раствора, мл
MW
2000
1000
500
NaCl
58,44
139,087
69,544
34,772
KCl
74,56
3,728
1,864
0,932
MgSO4
203,3
6,4084
3,2042
1,602
NaH2PO4
119,98
2,3996
1,1998
0,5999
Таблица 3. Состав базового раствора «Часть 2» (вес компонентов выражен в граммах)
Компоненты
NaHCO3
Объем базового раствора, мл
MW
84,01
2000
1000
500
44,021
22,0105
11,005
Таблица 4. Состав базового раствора «Часть 3» (вес компонентов выражен в граммах)
18
Компоненты
Объем базового раствора, мл
MW
2000
1000
500
NaCl
58,44
50,84
25,42
12,71
KCl
74,56
1,864
0,932
0,466
MgSO4
203,3
17,254
8,627
4,3135
NaH2PO4
119,98
1,5
0,750
0,3749
Сахароза
342,3
171,14
85,57
42,78
При приготовлении данных растворов необходимо выполнять следующую
последовательность:
1. Взять чистую колбу необходимого объема;
2. Налить небольшое количество деионизированной воды (например: при
приготовлении растворов объемом 500 мл первоначальный объем воды должен
составить 200-300 мл, в зависимости от количества добавляемых далее
реактивов);
3. Поместить в колбу магнитный стержень и поставить колбу на магнитную
мешалку;
4. Включить магнитную мешалку, выставить необходимую скорость;
5. Взвесить при помощи аналитических весов необходимые навески реактивов;
6. Добавлять реактивы в колбу следует постепенно, постоянно перемешивая
раствор на магнитной мешалке;
7. После добавления всех реактивов в колбу, необходимо снять колбу с
магнитной мешалки и вытащить из нее магнитный стержень, используя
наружный магнит;
8. Довести раствор до нужного объема деионизированной водой;
9. Поместить в колбу чистый магнитный стержень и поставить колбу на
магнитную мешалку;
10. Тщательно перемешать раствор;
11. Выключить магнитную мешалку, вынуть из колбы магнитный стержень;
12. Колбу с полученным раствором закрыть крышкой;
13. Готовые растворы необходимо подписать, указав: название и дату
приготовления, фамилию сделавшего раствор;
14. Растворы хранить в холодильнике, не более 7 дней;
19
15. По истечению срока хранения раствора, его необходимо вылить. Колбу
тщательно вымыть моющим средством, ополоснуть дистиллированной водой и
спиртом. После чего колбу помещают в сухожаровой шкаф.
Для приготовления 40 мл 1М раствора CaCl2 к 40 мл
деионизированной воды добавляют 5,88 г CaCl2;
Для приготовления 40 мл 1М раствора MgCl2 к 40 мл
деионизированной воды добавляют 8,132 г MgCl2.
Полученные растворы перемешать (не взбалтывать!) и поместить в
холодильник. Хранить не более 7 дней.
2.1.2. Приготовление рабочих растворов
Приготовление рабочего раствора для препарирования мозга
Состав раствора (мМ): NaCl 87; KCl 2,5; MgSO4 8,48; NaH2PO4 1,24;
NaHCO3 26,2; CaCl2 0,5; D-глюкоза 11 (табл. 5).
Таблица 5. Состав рабочего раствора для препарирования мозга в зависимости от конечного
объема
Компоненты
Объем рабочего раствора, мл
500
1000
«Часть 3»
100 мл
200 мл
«Часть 2»
50 мл
100 мл
CaCl2 (1M)
250 мкл
500 мкл
D-глюкоза
1,35 г
2,7 г
При приготовлении рабочего раствора для препарирования мозга
необходимо выполнять следующую последовательность:
1. Взять чистую колбу необходимого объема;
2. Налить в колбу 100 мл (200 мл) раствора «Часть 3»;
3. Поместить в колбу чистый магнитный стержень и поставить колбу на
магнитную мешалку;
4. Включить магнитную мешалку, выставить необходимую скорость;
5. Добавить в колбу 50 мл (100 мл) «Часть 2» ;
6. Добавить 300 мл (600 мл) деионизированной воды;
20
7. Добавить 0,99 г D-глюкозы;
8. Тщательно перемешать при помощи магнитной мешалки;
9. Выключить магнитную мешалку;
10. Полученный раствор карбогенизировать (карбоген - газовая смесь
состоящая из 5% СО2 и 95%О2) в течение 5 минут;
11. Взять чистый мерный стаканчик на 100-200 мл;
12. Налить в мерный стаканчик 50 мл (100 мл) деионизированной воды;
13. Поместить в мерный стаканчик чистый магнитный стержень и поставить
стаканчик на магнитную мешалку;
14. Включить магнитную мешалку, выставить необходимую скорость;
15. С помощью пипеточного дозатора добавить 250 мкл (500 мкл) раствора
(1M) CaCl2;
16. Тщательно перемешать при помощи магнитной мешалки;
17. Выключить магнитную мешалку и достать из мерного стаканчика
магнитный стержень при помощи наружного магнита;
18. Поставить на магнитную мешалку колбу с карбогенизированным
раствором;
19. Включить магнитную мешалку, выставить необходимую скорость;
20. К постоянно перемешиваемому раствору медленно прилить раствор CaCl2.;
21. Тщательно перемешать полученный раствор;
22. Выключить магнитную мешалку, вынуть из колбы магнитный стержень;
23. После приготовления раствора для препарирования мозга необходимо
измерить его осмолярность, при помощи прибора осмометра (см. п. 1.5);
24. Осмолярность раствора для препарирования мозга должна быть в пределах
от 289-296 ммоль/кг;
25. В случае если осмолярность раствора отличается от требуемой: проводим
титрование деионизированной водой до достижения необходимого значения
осмолярности;
26. Тщательно перемешать полученный раствор при помощи магнитной
мешалки;
27. Измерить осмолярность раствора;
28. Колбу с полученным раствором закрыть крышкой;
29. Готовый раствор необходимо подписать, указав: название и дату
приготовления раствора, фамилию сделавшего раствор;
30. Раствор хранить в холодильнике, не более 4 дней;
31. По истечению срока хранения раствора, его необходимо вылить. Колбу
тщательно вымыть моющим средством, ополоснуть дистиллированной водой и
спиртом. После чего колбу помещают в сухожаровой шкаф;
Приготовление рабочего раствора для инкубации срезов мозга крыс
Состав раствора (мМ): NaCl 119; KCl 2,5; MgSO4 1,3; NaH2PO4 1; NaHCO3
26,2; CaCl2 1; MgCl2 1,6; D-глюкоза 11 (табл. 6).
21
Таблица 6. Состав рабочего раствора для инкубации срезов мозга крыс в зависимости от
конечного объема
Компоненты
Объем рабочего раствора, мл
500
1000
«Часть 1»
50 мл
100 мл
«Часть 2»
50 мл
100 мл
CaCl2 (1M)
500 мкл
1000 мкл
MgCl2 (1M)
800 мкл
1600 мкл
D-глюкоза
2,5 г
5г
При приготовлении рабочего раствора для инкубации срезов мозга крыс
необходимо выполнять следующую последовательность:
1. Взять чистую колбу необходимого объема;
2. Налить в колбу 50 мл (100 мл) «Часть 1»;
3. Поместить в колбу чистый магнитный стержень и поставить колбу на
магнитную мешалку;
4. Включить магнитную мешалку, выставить необходимую скорость;
5. Добавить в колбу 50 мл (100 мл) раствора «Часть 2»;
6. Добавить 300 мл (600 мл) деионизированной воды;
7. Добавить 0,99 г D-глюкозы;
8. Тщательно перемешать при помощи магнитной мешалки;
9. Выключить магнитную мешалку;
10. Полученный раствор карбогенизировать в течение 5 минут;
11. Взять чистый мерный стаканчик на 100-200 мл;
12. Налить в мерный стаканчик 50 мл (100 мл) деионизированной воды;
13. Поместить в мерный стаканчик чистый магнитный стержень и поставить
стаканчик на магнитную мешалку;
14. Включить магнитную мешалку, выставить необходимую скорость;
15. С помощью пипеточного дозатора добавить 500 мкл (1000 мкл) раствора
(1M) CaCl2;
16. Тщательно перемешать при помощи магнитной мешалки;
17. Выключить магнитную мешалку и достать из мерного стаканчика
магнитный стержень при помощи наружного магнита;
18. Взять чистый мерный стаканчик на 100-200 мл;
22
19. Налить в мерный стаканчик 50 мл (100 мл) деионизированной воды;
20. Поместить в мерный стаканчик чистый магнитный стержень и поставить
стаканчик на магнитную мешалку;
21. Включить магнитную мешалку, выставить необходимую скорость;
22. С помощью пипеточного дозатора добавить 800 мкл (1600 мкл) раствора
(1M) MgCl2;
23. Тщательно перемешать при помощи магнитной мешалки;
24. Выключить магнитную мешалку и достать из мерного стаканчика
магнитный стержень при помощи наружного магнита;
25. Поставить на магнитную мешалку колбу с карбогенизированным
раствором;
26. Включить магнитную мешалку, выставить необходимую скорость;
27. К постоянно перемешиваемому раствору медленно прилить растворы CaCl2.
и MgCl2;
28. Тщательно перемешать полученный раствор;
29. Выключить магнитную мешалку, вынуть из колбы магнитный стержень;
30. После приготовления раствора для инкубации необходимо измерить его
осмолярность, при помощи прибора осмометра (см. п. 1.5);
31. Осмолярность раствора для инкубации должна быть в пределах от 289-296
ммоль/кг;
32. В случае если осмолярность раствора отличается от требуемой: проводим
титрование деионизированной водой до достижения необходимого значения
осмолярности;
33. Тщательно перемешать полученный раствор при помощи магнитной
мешалки;
34. Измерить осмолярность раствора;
35. Колбу с полученным раствором закрыть крышкой;
36. Готовый раствор необходимо подписать, указав: название и дату
приготовления раствора, фамилию сделавшего раствор;
37. Раствор хранить в холодильнике, не более 4 дней;
38. По истечению срока хранения раствора, его необходимо вылить. Колбу
тщательно вымыть моющим средством, ополоснуть дистиллированной водой и
спиртом. После чего колбу помещают в сухожаровой шкаф;
Приготовление рабочего раствора Рингера
Состав рабочего раствора Рингера (мМ): NaCl 119; KCl 2,5; MgSO4 1,3;
NaH2PO4 1; NaHCO3 26,2; CaCl2 2; D-глюкоза 11 (pH 7,4; осмолярность 295
мОсм) (табл. 7).
Таблица 7. Состав рабочего раствора Рингера в зависимости от конечного объема
Компоненты
Объем рабочего раствора, мл
500
23
1000
«Часть 1»
50 мл
100 мл
«Часть 2»
50 мл
100 мл
CaCl2 (1M)
1250 мкл
2500 мкл
D-глюкоза
0,99 г
1,98 г
При приготовлении рабочего раствора Рингера необходимо выполнять
следующую последовательность:
1. Взять чистую колбу необходимого объема;
2. Налить в колбу 50 мл (100 мл) раствора «Часть 1»;
3. Поместить в колбу чистый магнитный стержень и поставить колбу на
магнитную мешалку;
4. Включить магнитную мешалку, выставить необходимую скорость;
5. Добавить в колбу 50 мл (100 мл) раствора «Часть 2»;
6. Добавить 300 мл (600 мл) деионизированной воды;
7. Добавить 0,99 г (1,98 г) D-глюкозы;
8. Тщательно перемешать при помощи магнитной мешалки;
9. Выключить магнитную мешалку;
10. Полученный раствор карбогенизировать в течение 5 минут;
11. Взять чистый мерный стаканчик на 100-200 мл;
12. Налить в мерный стаканчик 50 мл (100 мл) деионизированной воды;
13. Поместить в мерный стаканчик чистый магнитный стержень и поставить
стаканчик на магнитную мешалку;
14. Включить магнитную мешалку, выставить необходимую скорость;
15. С помощью пипеточного дозатора добавить 1250 мкл (2500 мкл) раствора
(1M) CaCl2;
16. Тщательно перемешать при помощи магнитной мешалки;
17. Выключить магнитную мешалку и достать из мерного стаканчика
магнитный стержень при помощи наружного магнита;
18. Поставить на магнитную мешалку колбу с курбогенизированным
раствором;
19. Включить магнитную мешалку, выставить необходимую скорость;
20. К постоянно перемешиваемому раствору медленно прилить раствор CaCl2.;
21. Тщательно перемешать полученный раствор;
22. Выключить магнитную мешалку, вынуть из колбы магнитный стержень;
23. После приготовления раствора Рингера необходимо измерить его
осмолярность, при помощи прибора осмометра (см. п. 1.5);
24. Осмолярность раствора Рингера должна быть в пределах от 289-296
ммоль/кг;
24
25. В случае если осмолярность раствора отличается от требуемой: проводим
титрование деионизированной водой до достижения необходимого значения
осмолярности;
26. Тщательно перемешать полученный раствор при помощи магнитной
мешалки;
27. Измерить осмолярность раствора;
28. Колбу с полученным раствором закрыть крышкой;
29. Готовый раствор необходимо подписать, указав: название и дату
приготовления раствора, фамилию сделавшего раствор;
30. Раствор хранить в холодильнике, не более 4 дней;
31. По истечению срока хранения раствора, его необходимо вылить. Колбу
тщательно вымыть моющим средством, ополоснуть дистиллированной водой и
спиртом. После чего колбу помещают в сухожаровой шкаф;
2.2. Приготовление переживающих срезов мозга
Прежде чем приступать к приготовлению срезов, необходимо включить
систему охлаждения препаровальной чаши вибротома. Во время резки
температура раствора для препарирования в чаше вибротома должна быть от +4
до +6ºС, кроме того раствор должен постоянно карбогенизироваться.
Охлаждение включают примерно за 30-40 минут до начала использования
прибора.
После достижения необходимой для резки температуры в чаше
вибротома включают сам вибротом.
Для приготовления переживающих срезов мозга используют
неполовозрелых крыс различных линий в возрасте 5-21 дня постнатального
развития.
Перед препарированием мозга животные умерщвляются путем
цервикальной дислокации с последующей декапитацией. Затем приступают к
препарированию мозга.
Этапы препарирования мозга крысы
1. Снять скальп-кожу и мышцы черепа с помощью остроконечных прямых
ножниц с поверхности черепа крысы;
2. Сделать поперечный разрез костей черепа, а затем продольный разрез
черепной коробки до уровня глазниц с помощью остроконечных прямых
ножниц. Следует отметить, что бранши ножниц не следует заводить очень
глубоко, так как можно повредить мозг;
3. Сделать 2 поперечных разреза до уровня глазниц с помощью остроконечных
прямых ножниц;
4. Раздвинуть отпрепарированные кости черепа с помощью пинцета, подрезать
черепно-мозговые нервы с помощью ложечки и выделить мозг;
5. Выделенный мозг extempore! помещают в раствор для препарирования
температурой +4°С;
25
6. На заранее приготовленную подложку из агар-агара наносят каплю
ацилакрилатного клея и аккуратно помещают на него выделенный мозг (рис.4);
7. Подложку с мозгом приклеивают на магнит, который затем помещают в
чашу вибротома;
8. Выставляют нужные параметры резки срезов мозга крысы на вибротоме;
9. Приступают к непосредственному приготовлению срезов мозга (рис.4).
Рисунок 4. Схема приготовления переживающих срезов мозга крыс.
Порядок выставления границ резки среза мозга крысы
1. Опускаем лезвие до уровня раствора в чаше вибротома и смачиваем его
раствором;
2. Нажимаем кнопку вибротома «окно»;
3. Выставляем первую (ближнюю) границу резки, нажатием и удержанием
кнопки «старт». При этом лезвие прибора начнет двигаться по направлению к
нам. Удерживаем эту кнопку до тех пор, пока лезвие не передвинется до
необходимого уровня дальней границы (дистальный конец мозга);
4. Нажимаем кнопку «окно»;
5. Выставляем дальнюю границу резки, нажатием и удержанием кнопки
«назад». При этом лезвие прибора начнет двигаться по направлению от нас.
Удерживаем эту кнопку до тех пор, пока лезвие не передвинется до
необходимого уровня ближней границы резки (фронтальный конец мозга);
6. Нажимаем кнопку «окно».
После того как обе границы резки выставлены лезвие опускают до
необходимого уровня мозга и нажимают кнопку вибротома «старт». Угол
резки, частота вибрации и скорость режущей подачи лезвия подбираются
таким образом, чтобы максимально сохранить клеточную структуру области, с
клеток которой будут вестись регистрации.
Приготовленные срезы забирают из чаши вибротома с помощью пипетки
и помещают в карбогенизированный раствор для инкубации, температурой
+36ºC. Инкубация в данном растворе необходима для минимизации
последствий резки живой ткани. Срезы находятся в данном растворе один час.
Через час можно приступать к непосредственной работе со срезами мозга в
крысы в экспериментальной установке с перфузионной камерой [8, 9].
26
2.3. Методика прижизненного маркирования глиальных клеток в
срезе мозга крысы с помощью флуоресцентных зондов
Для прижизненного маркирования глиальных клеток мозга, в частности,
астроцитов, в срезах мозга можно использовать маркер Sulforhodamine 101 (SR)
[6,7]. При инкубации среза с данным красителем маркируются также
поврежденные нейроны.
Методика прижизненного маркирования
1. Наливаем 5 мл раствора Рингера в чашку Петри диаметром 40мм;
2. С помощью пипеточного дозатора добавляем к этому раствору 5мкл 100 нМ
раствора Sulforhodamine 101;
3. Закрепляем канюлю для карбогенизации раствора в используемой для
окрашивания чашке Петри;
4. В чашку Петри помещаем специальную чашечку с пористым дном для
непосредственно инкубации среза в растворе Sulforhodamine 101;
5. В специальную чашечку с пористым дном с помощью пипетки переносим
приготовленный на вибротоме срез мозга крысы;
6. Накрываем фольгой чашку Петри (окраска производиться в темноте при
температуре +35-37ºC). В зависимости от возраста животного время инкубации
в растворе Sulforhodamine 101 разное. Для крысят 5-10 дней (Р5-10) – 30 минут,
для крыс старше 10 дней постнатального развития (>Р10) время инкубации в
растворе Sulforhodamine 101 составляет 45-60 минут.
После прокрашивания срезы мозга могут быть использованы в дальнейшем
имиджинговых экспериментах с другими красителями.
Рисунок 5. Схема маркирования клеток переживающих срезов мозга раствором Sulforhodamine
101
27
Глава 3. Лабораторные работы
Лабораторная работа № 1
"Приготовление растворов для проведения нейробиологического
эксперимента"
Цель работы:
приготовить растворы для проведения нейробиологического эксперимента.
Оборудование:
аналитические весы, магнитная мешалка, мерные колбы, пипеточные дозаторы.
Материалы:
NaCl, KCl, MgSO4, NaH2PO4, NaHCO3, CaCl2, MgCl2, D-глюкоза, сахароза,
деионизированная вода.
Ход работы:
Для работы с переживающими срезами мозга крыс необходимы 3
рабочих раствора: раствор для препарирования срезов, раствор для инкубации
срезов, раствор Рингера. Данные растворы имеют многокомпонентный состав и
готовятся в несколько этапов. На первом этапе готовят базовые растворы:
«Часть 1»; «Часть 2»; «Часть 3»; 40 мл 1М раствора СаCl2; 40 мл 1М раствора
MgCl2 (см. п. 2.1).
Этапы работы
1. Подготовить лабораторную посуду для приготовления растворов (см. п. 1.8);
2. Сделать навески необходимых реактивов для приготовления растворов (см.
п. 1.2);
3. Используя магнитную мешалку (см. п.1.4) произвести смешивание реактивов
в порядке указанном в п.2.1;
4. Приготовленные растворы подписать, указав: название и дату приготовления
раствора, фамилию сделавшего раствор;
5. Убрать приготовленные растворы в холодильник;
6. Вымыть использованную в ходе работы лабораторную посуду (см. п. 1.8);
7. Убрать за собой рабочее место, реактивы, протереть магнитную мешалку и
аналитические весы влажной тряпкой (см. п.1.2, 1.4).
Результат:
приготовленные рабочие растворы: раствор для препарирования срезов,
раствор для инкубации срезов, раствор Рингера.
Вопросы для самоконтроля:
1. Каких правил следует придерживаться, работая в химической лаборатории?
2. Перечислите последовательность действий при работе с аналитическими
весами.
28
3. Перечислите последовательность действий при работе с магнитной
мешалкой.
4. Перечислите последовательность действий при работе с пипеточными
дозаторами.
5. Какими единицами измерения пользуются для выражения концентрации
растворов?
6. Перечислите основные правила обработки лабораторной посуды.
7. Какую доврачебную медицинскую помощь следует оказать пострадавшему в
результате ранения стеклом, отравлением продуктами горения, при ожогах?
Лабораторная работа № 2
"Определение осмолярности растворов"
Цель работы:
измерить осмолярность 3 рабочих растворов: раствор для препарирования
срезов, раствор для инкубации срезов, раствор Рингера.
Оборудование:
осмометр, пипеточный дозатор, диски фильтровальной бумаги, пинцет.
Материалы:
рабочие растворы: раствор для препарирования срезов, раствор для инкубации
срезов, раствор Рингера. Деионизированная вода.
Ход работы:
Осмометр – (осмо - + греч. metreo измерять) прибор для измерения
осмотического давления или концентрации осмотически активных веществ;
применяется при биофизических и биохимических исследованиях.
Осмолярность (осмотическая концентрация) - суммарная концентрация
всех растворенных частиц. Может выражаться, как осмолярность (осмоль на
литр раствора) и как осмоляльность (осмоль на кг растворителя) (см. п.1.5).
Этапы работы
1. Подготовить 3 рабочих раствора: раствор для препарирования срезов,
раствор для инкубации срезов, раствор Рингера для проведения измерений
осмолярности;
2.Подготовить необходимое оборудование для измерения осмолярности:
пипеточный дозатор на 10 мкл, пинцет, диски из фильтровальной бумаги;
3. Произвести измерение осмолярности 3 рабочих растворов: раствор для
препарирования срезов, раствор для инкубации срезов, раствор Рингера,
согласно правилам работы с осмометром изложенными в п.1.5;
4. Промыть углубление в держателе деионизированной водой (см. п.1.5);
5. Убедиться, что на дисплее прибора появилась надпись «READY»;
6. Записать полученные результаты измерений в таблицу.
29
Результат:
заполненная таблица значений осмолярности 3 рабочих растворов:
раствора для препарирования срезов, раствора для инкубации срезов, раствора
Рингера
Наименование
раствора
Значение осмолярности раствора, осмоль /л
Необходимое
значение
Раствор для
препарирования
срезов
289-296
Раствор для
инкубации срезов
289-296
Раствор Рингера
289-296
Полученное
значение
После титрования
раствора
Вопросы для самоконтроля:
1. Что такое осмолярность и в чем она измеряется?
2. Какие свойства растворов зависят от осмолярности?
3. Перечислите последовательность действий при работе с осмометром.
Лабораторная работа № 3
"Приготовление переживающих срезов мозга крыс"
Цель работы:
приготовление переживающих срезов мозга крысы.
Оборудование:
остроконечные прямые ножницы, ножницы горизонтально изогнутые,
скальпель (лезвие №23), ложечка хирургическая, пинцет, вибротом пипетки.
Материалы:
рабочие растворы: раствор для препарирования срезов, раствор для инкубации
срезов, раствор Рингера. Деионизированная вода, ацилакрилатный клей,
лабораторные животные (самцы крыс линии Вистар).
30
Ход работы:
1. Взять из вивария лабораторное животное (самца крыс линии Вистар);
2. Подготовить необходимые для работы инструменты, оборудование и
лабораторную посуду;
3. Включить охлаждение чаши вибротома;
4. Налить раствор для препарирования в чашу вибротома;
5. Закрепить канюлю для карбогенизации раствора к чаше вибротома;
6. Закрепить лезвие в держателе вибротома при помощи винтов;
6. Включить вибротом (см. п. 1.6)
7. Приготовить подложку из агар-агара;
8. Отпрепарировать мозг крысы (см. п. 2.2);
9. На заранее приготовленную подложку из агар-агара нанести каплю
ацилакрилатного клея и аккуратно поместить на него выделенный мозг;
10. Подложку с мозгом приклеить на магнит, который затем поместить в чашу
вибротома;
11. Выставить нужные параметры резки срезов мозга крысы на вибротоме;
12. Приготовить срезы мозга (см. п. 2.2 );
13. Переложить приготовленные срезы мозга с помощью пипетки в
карбогенизированный раствор для инкубации, температурой +36ºC;
14. Срезы находятся в данном растворе один час. Через час можно приступать к
непосредственной работе со срезами.
Результат:
приготовленные переживающие срезы мозга крыс.
Вопросы для самоконтроля:
1. Какие растворы необходимы для приготовления переживающих срезов
мозга?
2. Какой температуры должен быть раствор для препарирования мозга?
3. Какой температуры должен быть раствор для инкубации срезов мозга?
4. Какой осмолярности должны быть рабочие растворы?
5. Перечислите последовательность действий при работе с вибротомом.
Лабораторная работа № 4
"Маркирование переживающих срезов мозга крыс"
Цель работы:
маркирование переживающих срезов мозга крыс.
Оборудование:
чашка Петри диаметром 40 мм, чашечка с пористым дном, пипетки,
пипеточные дозаторы.
31
Материалы:
переживающие срезы мозга крыс, рабочий раствор Рингера, 100 нМ раствор
Sulforhodamine 101.
Ход работы:
1. Подготовить необходимые для работы инструменты и лабораторную посуду;
2. Налить 5 мл раствора Рингера в чашку Петри диаметром 40 мм;
3. С помощью пипеточного дозатора добавить к этому раствору 5мкл 100нМ
раствора Sulforhodamine 101;
4. Закрепить канюлю для карбогенизации раствора;
5. Поместить в чашку Петри чашечку с пористым дном;
6. Перенести с помощью пипетки срез мозга в чашечку с пористым дном;
7. Накрыть фольгой чашку Петри (маркирование производиться в темноте при
температуре +35-37ºC).
8. В зависимости от возраста животного время маркирования разное. Для
животных 5-10 дней – 30 минут, для остальных животных примерное время
маркирования -45 минут (см. п. 2.3).
После маркирования срезы мозга могут быть использованы в дальнейшем
анализе.
Результат:
маркированные переживающие срезы мозга крысы.
Вопросы для самоконтроля:
1. Какие растворы необходимы для маркирования переживающих срезов мозга
крыс?
2. Какой температуры должен быть раствор для маркирования срезов мозга?
3. При какой температуре производится маркирование срезов мозга?
4. Какие клетки мозга маркируются Sulforhodamine 101?
32
Библиографический список
1. Instruction manual for magnetic stirrers.- USA, 2007.- 27 p.
2. Instruction manual for vapor pressure osmometer model 5520.- USA, 2007.- 101 p.
3. Instruction manual for microm HM 650 V.- USA, 2007.- 123 p.
4. Instruction manual for electronic balance.- USA, 2007.- 28 p.
5. Степин Б.Д. Техника лабораторного эксперимента в химии: учеб. пособие
для ВУЗов — М.: Химия, 1999 — 600 с.
6. I. R. Winship, N. Plaa, T. H. Murphy, "Rapid astrocyte calcium signals correlate
with neuronal activity and onset of the hemodynamic response In Vivo". The Journal
of Neuroscience, 2007, 27(23).-6268–6272 р.
7. J. Kang, N. Kang, Y. Yu, et.al. "Sulforhodamine 101 induces long-tem potentiation
of intrinsic excitability and synaptic efficacy in hippocampal CA1 pyramidal
neurons". Neuroscience, 2010, 169(4).-1601-1609 р.
8. P. J. Lein, C. D. Barnhart, I. N. Pessah, "Acute hippocampal slice preparation and
hippocampal slice cultures". In Vitro Neurotoxicology: Methods and Protocols,
Methods in Molecular Biology,2011, 758.
9. D. M. Mathis, J. L. Furman, C. M. Norris,"Preparation of acute hippocampal slices
from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and
amyloid pathology". Journal of Visualized Experiments and Leica Microsystems,
2011,49. -1-8 р.
33
Приложение 1
Таблица растворимости
Что есть что в таблице растворимости:
р — Растворимое
н — Нерастворимое
м — Малорастворимое
- — Не существует или разлагается водой
34
Приложение 2
Ярослава Игоревна Калинцева
Ирина Васильевна Мухина
Алексей Васильевич Семьянов
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПЕРЕЖИВАЮЩИХ СРЕЗОВ МОЗГА КРЫС
Электронное методическое пособие
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ
УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»
603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23.