Разработка и стандартизация способа количественного

Оригинальные статьи
Разработка и стандартизация способа
количественного определения содержания
вакцинного вирусного антигена в вакцине
клещевого энцефалита
Воробьева М.С.1, Красильников И.В.2, Волкова Р.А.1, Ладыженская И.П.1,
Шкуратова О.В.2, Пришедько П.В.2, Фадейкина О.В.1, Климова М.С.1
1
ФГБУ «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Минздравсоцразвития России, info@gisk.ru
2
ФГУП «НПО «Микроген», Минздравсоцразвития России, secretariat@microgen.ru
Development and standardization of test
method for assay of vaccinal viral antigen
content in tick-borne encephalitis vaccine
Vorobieva M.S.1, Krasilnikov I.V.2, Volkova R.A.1, Ladyzhenskaya I.P.1, Shkuratova O.V.2,
Prishedko P.V.2, Fadeikina O.V.1, Klimova M.S.1
1
Federal State Budgetary Institution «Tarasevich State Research Institute of Standardization
and Control of Biological Medicines», Minzdravsocrazvitia RF, info@gisk.ru
2
Federal State Unitary Enterprise «Scientific-Production Association «Microgen» Russian Federation,
secretariat@microgen.ru
Для количественного определения содержания вакцинного антигена в вакцине клещевого энцефалита (КЭ), на предприятии НПО «Вирион» (филиал «НПО «Микроген») разработан стандартный образец предприятия (СОП) вакцинного антигена вируса КЭ. СОП аттестован в соответствии
с требованиями стандартизации, и калиброван по содержанию протективного белка Е. Показана
принципиальная возможность определения содержания вакцинного антигена в вакцине КЭ на
примере нескольких серий вакцины «Энцевир».
Ключевые слова: клещевой энцефалит, вакцина, профилактика клещевого энцефалита, качество
вакцин, определения содержания вакцинного антигена, стандартный образец предприятия,
стандартизация
Библиографическое описание: Воробьева М.С., Красильников И.В., Волкова Р.А. с соавт. Разработка
и стандартизация способа количественного определения содержания вакцинного вирусного антигена в
вакцине клещевого энцефалита // Биопрепараты. — 2011. — № 1. — С. 21-26.
RMA «Virion» (Branch of RMA «Microgen») has developed reference standard for vaccinal antigen in
tick-borne encephalitis virus for performing assay analysis of vaccinal antigen in tick-borne encephalitis
vaccine. The reference standard has been certified according to standardization requirements and
calibrated against protective protein Е content. The possibility of determination of vaccinal antigen
content in tick-borne encephalitis vaccine has been demonstrated by the case study of several batches
of «Encevir» vaccine.
Key words: tick-borne encephalitis, vaccine, prevention of tick-borne encephalitis, quality of vaccines,
determining the content of the vaccine antigen, reference standard, standardization
Bibliographical entry: Vorobieva M.S., Krasilnikov I.V., Volkova R.A. et al. Development and standardization of
test method for assay of vaccinal viral antigen content in tick-borne encephalitis vaccine // Biopreparats
(Biopharmaceuticals). — 2011. — № 1 — P. 21-26.
Для корреспонденции:
Воробьева М.С. – заведующая лаборатории арбовирусных инфекций, риккетсий
и СПИДа ФГУН «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Минздравсоцразвития РФ
Адрес: ФГУН «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Минздравсоцразвития РФ,
119002, Москва, пер. Сивцев Вражек, 41, info@gisk.ru
Статья поступила 13.12.2010 г., принята к печати 21.01.2011 г.
21
Январь–март 2011 г.
Клещевой энцефалит (КЭ) представляет одну из
наиболее серьезных проблем инфекционной патологии в РФ. Несмотря на принимаемые меры, заболеваемость КЭ в РФ высока — от 2000 до 3000 больных в год.
Одним из эффективных средств борьбы с КЭ остается
профилактическая вакцинация населения, проживающего в регионах его природных очагов [1, 2].
В настоящее время в РФ зарегистрированы шесть вариантов вакцины КЭ: две отечественные (для взрослых и
детей с 3-летнего возраста) — вакцина КЭ производства
ФГУП «ПИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН», вакцина
«Энцевир» производства ФГУП «НПО «Микроген»; и четыре зарубежные – «ФСМЕ-Иммун» (для взрослых и подростков с 16 лет), «ФСМЕ-Иммун–Джуниор» (для детей с
1 года и до 16 лет) — обе производства компании
«Бакстер–вакцины», Австрия; «Энцепур взрослый» (для
взрослых и подростков с 12 лет), «Энцепур детский» (для
детей с 1 года и до 12 лет) — обе производства компании
«Новартис–вакцины», Германия.
Основным показателем качества вакцин КЭ является
специфическая активность, определенная в тесте иммуногенности на линейных мышах Балб/С.
Сравнительный анализ специфической (иммуногенной) активности при контроле вышеуказанных вакцин в
стандартном тесте показывает, что вакцины отечественного производства и вакцины производства компании «Бакстер-вакцины», имеют сходные показатели
иммуногенности по МИД50 (минимальная 50% иммунизирующая доза). МИД50 для вакцин компании «Новартис
вакцины» выше лимита в 3–5 раз (табл. 1).
Содержание в вакцине вирусного антигена (протективного белка Е) должно быть стандартным.
Избыточное содержание вакцинного вирусного антигена может повысить реактогенность вакцины, выражающуюся в появлении температурных реакций от
38oС и выше, головной боли, общем недомогании.
Эти явления наблюдаются, как правило, после первой прививки, реже после второй прививки, через
7-8 ч после введения вакцины и проходят на следующий день [3, 4].
Вакцины зарубежного производства: «ФСМЕИммун» (взрослая и детская), «Энцепур» (взрослая и
детская) — калиброваны по этому показателю: «ФСМЕИммун» — взрослая — 2,38 мкг/0,5 мл, детская — 1,6
мкг/0,25 мл, «Энцепур взрослый» — 1,5 мкг/0,5 мл,
детский — 0,75 мкг/0,25 мл. Данные показатели указаны в инструкциях по применению на эти вакцины.
Подбор оптимальной дозы вакцинного антигена проводился при достаточно больших доклинических и клинических исследованиях [2].
Отечественные вакцины КЭ по показателю содержания вакцинного вирусного антигена в прививочной
дозе не стандартизованы. В связи с этим, целью нашего исследования стала разработка и стандартизация
способа количественного определения содержания
вакцинного вирусного антигена в вакцине КЭ.
В качестве модели была использована вакцина КЭ
«Энцевир», производства ФГУП «НПО «Микроген».
Исследования проводились параллельно в ФГБУ «ГИСК
им. Л.А. Тарасевича» Минздравсоцразвития России и в
НПО «Вирион» – филиале ФГУП «НПО «Микроген» в
Томске.
I. Материалы и методы
Материалы:
1. Серии вакцины КЭ «Энцевир» производства ФГУП
«НПО Микроген».
2. СОП (стандартный образец предприятия) — приготовлен на предприятии НПО «Вирион» согласно
рекомендациям ФГБУ «ГИСК им. Л.А. Тарасевича»
для определения вакцинного антигена.
3. Наборы реагентов для иммуноферментного выявления антигена вируса КЭ «ВектоВКЭ-антиген»,
производства ЗАО «Вектор–Бест», Новосибирск.
4. Наборы реагентов для иммуноферментного выявления антигена вируса КЭ «ИФА ТС АГ ВКЭ» производства ФГУП «НПО «Микроген».
5. Препарат протективного белка Е вируса КЭ — очищенный жидкий белок Е, партия № 41, с концентрацией белка Е — 160 мкг/мл. Получен из ЗАО
«Вектор–Бест». Хранение при температуре минус
70 С.
Таблица 1. Специфическая активность вакцин КЭ по результатам изучения иммуногенной активности на
мышах Бальб/С с 2006 по 2010 г.
Название вакцины
Количество серий
отконтролированных
в «ГИСК им. Л.А. Тарасевича»
МИД50 (среднее
значение), мл
Диапазон МИД50, мл
«Энцевир»
25
0,0043
от 0,0011
до 0,0125
Вакцина ФГУП «ПИПВЭ
им. М.П. Чумакова РАМН»
22
0,0052
от 0,001
до 0,0122
«ФСМЕ-Иммун»
8
0,0028
от 0,001
до 0,006
«Энцепур»
6
0,036
от 0,019
до 0,05
Примечание: МИД50 — минимальная иммунизирующая доза вакцины; лимит МИД50 по НД:  0,0125 мл.
22
Методы:
1. Иммуноферментный анализ.
2. Стандартный тест определения специфической
активности (иммуногенности) вакцин КЭ при иммунизации линейных мышей Балб/С.
3. Компьютерная программа статистической обработки результатов иммуноферментного анализа
методом параллельных линий «Паралайн», разработана докт. биол. наук. В.Г. Петуховым в ФГБУ
«ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Минздравсоцразвития
России [5].
II. Результаты и обсуждение
Сравнительный анализ чувствительности двух наборов реагентов для ИФА при титровании серий вакцин
«Энцевир» проводился следующим образом.
В предварительных опытах нами была установлена
возможность титрования сорбированных вакцин КЭ
методом ИФА в наборах реагентов для выявления вак-
цинного антигена вируса клещевого энцефалита:
«ВектоВКЭ-антиген», производства ЗАО «ВекторБест»
и «ИФА ТС АГ ВКЭ» производства ФГУП «НПО
«Микроген». Наборы реагентов различаются по составу
основных реагентов: в первом наборе для выявления
антигена вируса КЭ используются только моноклональные антитела к белку Е, штамм № 205 вируса КЭ (как в
иммуносорбенте, так и в конъюгате). Во втором наборе
реагентов для этой цели используются поликлональные антитела, полученные на основе асцитической
жидкости крыс, иммунизированных вирусом КЭ.
Нами проведено титрование 10 серий вакцины КЭ
«Энцевир» в обоих наборах реагентов. Каждая серия
вакцины исследовалась в ИФА не менее трех раз.
Полученные данные показывают более чем 10-кратное
превышение титров антигена при использовании набора реагентов «ВектоВКЭ-антиген» (табл. 2).
В табл. 3 представлены результаты параллельного
титрования методом ИФА в обоих наборах реагентов
(10 опытов) препарата протективного белка Е вируса
Таблица 2. Сравнительное определение титра вакцинного антигена вируса КЭ методом ИФА
№ серий вакцины
«Энцевир»
360409
400609
480809
611209
620110
700110
740210
750210
760310
770310
Набор реагентов «ИФА ТС АГ ВКЭ»,
титр в ИФА вакцинного антигена ВКЭ
1:256
1:256
1:256
1:256
1:256
1:512
1:512
1:512
1:512
1:512
Набор реагентов «ВектоВКЭ-Антиген»,
титр в ИФА вакцинного антигена ВКЭ
1:2560
1:1280
1:1280
1:5120
1:2560
1:5120
1:5120
1:1280
1:2560
1:1280
Примечания: «ВектоВКЭ-антиген» — производства ЗАО «ВекторБест»; «ИФА ТС АГ ВКЭ» — производства ФГУП
«НПО «Микроген».
Таблица 3. Сравнительное титрование методом ИФА препарата белка Е вируса КЭ и СОП вакцинного
антигена
Дата постановки
опыта в ИФА
8.11.2010
10.11.2010
26.11.2010
1.12.2010
3.12.2010
4.12.2010
7.12.2010
8.12.2010
9.12.2010
10.12.2010
Набор реагентов «ИФА ТС АГ ВКЭ»
Белок Е № 41
СОП
1:10240
1:1024
1:20480
1:1024
1:10240
1:1024
1:10240
1:1024
1:10240
1:512
1:20480
1:512
1:20480
1:512
1:10240
1:1024
1:10240
1:1024
1:10240
1:1024
1:10240
1:1024
1:10240
1:1024
—
—
Набор реагентов «ВектоВКЭ-антиген»
Белок Е № 41
СОП
1:128000
1:8000
1:128000
1:8000
1:128000
1:8000
—
1:8000
1:128000
1:8000
1:128000
1:8000
1:128000
1:8000
1:128000
1:8000
1:128000
1:8000
1:128000
1:8000
1:64000
1:8000
1:64000
1:8000
1:64000
1:8000
23
Январь–март 2011 г.
КЭ и СОП вакцинного антигена, выполненные в НПО
«Вирион». Они подтвердили более высокую чувствительность набора реагентов «ВектоВКЭ-антиген» по
сравнению с набором реагентов «ИФА ТС АГ ВКЭ».
Для получения кандидата в СОП нами использована
технология производства серийной продукции очищенной и концентрированной вакцины КЭ «Энцевир».
СОП готовили на основе полуфабриката вакцины без
добавления стабилизатора (альбумин крови человека)
и проведения сорбции антигена на геле алюминия гидроксида. Кандидат в СОП вакцинного антигена вируса
КЭ серия № 010810 был приготовлен на основе производственной партии очищенного концентрата № 252
культурального антигена вируса КЭ (производственная
партия № 252 вошла в серию вакцины «Энцевир»
№ 103).
К концентрату культурального вакцинного антигена
вируса КЭ № 252 был добавлен в качестве стабилизатора раствор сахарозы 50% (из расчета 50 мг сахарозы
на 1 мл концентрата). Материал разлит в ампулы по 0,5
мл и лиофилизирован. Всего было получено 736 ампул,
дата изготовления — август 2010 г.
В НПО «Вирион» были проведены испытания кандидата СОП по следующим показателям: внешний вид,
точность розлива, потеря в массе при высушивании,
герметичность, растворимость, прозрачность и цветность растворенного препарата, рН, содержание общего белка, содержание сахарозы, специфическая
активность в ИФА, иммуногенность при иммунизации
мышей Бальб/С. Для изучения стабильности и определения срока годности СОП, ампулы были заложены на
хранение в течение 1 года при различных температурных режимах. После поступления образцов СОП в
«ГИСК им. Л.А. Тарасевича» проведена аттестация образцов по тем же показателям. Сравнительные данные
по контролю в НПО «Вирион» и аттестации в «ГИСК им.
Л.А. Тарасевича» СОП вакцинного антигена вируса КЭ
представлены в табл. 4.
СОП, серия №010810, дополнительно изучен в тесте
термодеградации, заключающемся в прогревании образцов СОП при температуре 37oС в течение 7 и 14 сут.
Специфическую активность в ИФА образцов СОП после теста термодеградации изучали в сравнении с образцом СОП, хранившимся при температуре от 2 до
8oС. Полученные данные представлены в табл. 5. В результате проведенных исследований СОП вакцинного
антигена в ИФА снижения активности не наблюдали. По
результатам контроля и аттестации серия СОП №
010810 соответствовала требованиям по всем показателям, на СОП было оформлено Свидетельство и
Инструкция по применению.
Таблица 4. Сравнительные данные по контролю в НПО «Вирион» и аттестации в «ГИСК им. Л.А.
Тарасевича» СОП вакцинного антигена вируса КЭ
№
препарата
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Наименование показателя
НПО «Вирион»
Внешний вид
Точность, % розлива
Потеря в массе при высушивании,
%
Герметичность
рН
Содержание общего белка
(мкг/ампула)
Содержание сахарозы (мкг/ампула)
Средняя масса содержимого
(мкг/ампула)
Иммуногенность (МИД50 в мл)
Специфическая активность
(титр в ИФА)
«ГИСК им. Л.А.Тарасевича»
2,0
Пористая масса белого цвета
1,35
2,2
2,3
герметичен
7,42
герметичен
7,4
13,0-14,0
13,3
26,4
25,0
35,18
34,8
0,002
0,001
1:4096*
1:8192*
1:1024**
Примечания: НПО «Вирион», г. Томск — тест система «ИФА ТС АГ ВКЭ», сер. № 020310. «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» —
набор реагентов «ВектоВКЭ–аниген» ЗАО «Вектор – Бест», г. Новосибирск.
Таблица 5. Изучение стабильности СОП в тесте термодеградации (температура 37oС в течение 7 и 14 сут)
Разведения
СОП
(исх.1:32)
1:256
1:512
1:1024
1:2048
1:4096
Титрование СОП,
ампула № 1
Титрование СОП,
ампула № 2
3,398
2,586
1,367
0,738
0,385
3,237
2,154
1,129
0,612
0,288
Титрование СОП после
теста термодеградации
(7 суток)
2,612
1,398
0,673
0,396
Примечания: даны значения оптической плотности (ОП) каждого разведения СОП.
24
Титрование СОП после
теста термодеградации
(14 суток)
3,455
2,364
1,230
0,684
0,339
Таблица 6. Определение концентрации вирусного белка Е в СОП вакцинного антигена (статистическая
обработка в программе «Паралайн» результатов титрования в ИФА — данные «ГИСК им. Л.А. Тарасевича»)
Исследование
СОП/белок Е
Min стандартное
отклонение
Концентрация белка Е,
мкг/0,5мл
Max стандартное
отклонение
Ампула № 1
8,46
9,19
9,9
Ампула № 2
7,53
9,66
12,4
Ампула № 3
8,22
8,92
9,67
Среднее значение
8,1
9,26
10,33
Таблица 7. Определение концентрации вирусного белка Е в СОП вакцины КЭ (данные «НПО «Вирион»)
Количество измерений*
Содержание вирусного белка Е в СОП (мкг/0,5 мл)
№1
8,36
№2
8,17
№3
8,83
№4
7,80
№5
9,15
Среднее значение
8,46
* В каждом измерении исследовали по 1 ампуле.
Таблица 8. Определение концентрации вакцинного антигена (белок Е) в сериях вакцины КЭ «Энцевир»
по отношению к СОП антигена (с помощью программы «Паралайн»)
Номера
серии
вакцин
«Энцевир»
Min
отклонение
Концентрация,
мкг/амп
Max
отклонение
Номера
серии
вакцин
«Энцевир
Min
отклонение
Концентрация,
мкг/амп
Max
отклонение
Сер. 91
2,78
3,29
3,84
Сер. 71
4,00
4,77
5,66
Сер. 93
2,22
2,85
3,52
Сер. 72
3,18
3,83
4,53
Сер. 90
1,92
2,49
3,21
Сер. 75
4,48
5,35
6,39
Сер. 95
2,67
3,34
4,05
Сер. 77
4,74
5,70
6,92
Среднее
значение
2,39
2,99
3,66
Среднее
значение
4,1
4,91
5,88
Определение содержания вирусного белка Е в СОП
осуществлялось следующим образом. Основную часть
вакцинного антигена вируса КЭ составляет вирусный
оболочечный белок Е, обеспечивающий протективные
(защитные) свойства вакцины [3].
Очищенный белок Е, партия № 41, был получен из ЗАО
«ВекторБест» в сентябре 2010 г. Согласно паспорту на
этот препарат, получено 240 мкл с концентрацией белка
Е — 160 мкг/мл. Хранение препарата при температуре
минус 70oС. Для проведения параллельных титрований
СОП и вирусного белка Е готовили предварительное разведение белка Е, основываясь на его исходной концентрации. Разведение 1:1000 готовили на растворе для
разведения образцов — РРО из набора реагентов
«ВектоВКЭ-антиген». Таким же образом готовили предварительное разведение СОП — 1:128.
Дальнейшие разведения СОП и белка Е готовили
также на растворе РРО. В каждом конкретном случае
последовательные двукратные разведения готовились
из предварительных разведений. Расчет концентрации
белка Е в СОП проведен на основе параллельного ти-
трования трех ампул СОП на разных планшетах набора
реагентов «ВектоВКЭ-антиген» в разное время.
Для статистической обработки данных, полученных
при параллельном титровании вирусного белка Е и
СОП, подбирали для этих материалов разведения,
имеющие сравнимые показатели оптической плотности (ОП) с линейным падением их значений. По полученным цифровым показателям ОП проводили
статистическую обработку методом параллельных линий программы «Паралайн». Устанавливали линейность и параллельность графиков зависимости
логарифма дозы от логарифма ОП для вирусного белка
Е в СОП, и рассчитывали концентрацию вакцинного
антигена (белка Е) в мкг/мл по формуле:
C = M x Cs x k,
где С — концентрация вирусного белка Е в СОП в мкг/
мл; М — активность вирусного белка Е, установленная по
программе «Паралайн»; Сs — концентрация вирусного
белка Е в соответствующем разведении; k — коэффициент (разведение СОП 1:2048).
Границы 95% доверительного интервала для рассчи-
25
Январь–март 2011 г.
танной концентрации С вычисляли по формулам:
Cmin (минимальное отклонение) = MminxCsxk
и Cmax (максимальное отклонение) = Mmax x Cs x k.
В программу «Паралайн» для вычисления значения М
вносили следующие данные: Сs — концентрация белка Е
(разведение 1:16000) = 0,01 мкг/мл; К — разведение испытуемого препарата СОП 1:2048; М — вычисляется автоматически по компьютерной программе Паралайн.
В соответствии с данными программы «Паралайн»
значение М (активность вирусного белка Е) — 0,943 при
значениях: min (минимальное стандартное отклонение) — 0,735 и max — (максимальное стандартное отклонение) — 1,213.
С = 0,943 x 0,01 x 2048 = 19,31 мкг/мл;
Сmin = 0,740 x 0,01 x 2048 = 15,15 мкг/мл;
Сmax = 1,21 x 0,01 x 2048 = 24,78 мкг/мл.
В результате проведенных статистических исследований установлено, что среднее значение содержания вирусного белка Е в СОП составило 9,26 мкг/0,5 мл (табл. 6).
Подобные результаты были получены в НПО
«Вирион» — содержание белка Е в СОП составило 8,46
мкг/0,5 мл (табл. 7).
Установленная концентрация белка Е в СОП вакцинного антигена вируса КЭ позволила подойти к определению
содержания протективного антигена (вирусного белка Е)
в сериях вакцины КЭ «Энцевир». Для изучения были подо-
браны 8 серий вакцины:
 серии № 71, № 72, № 75, № 77: содержание общего белка — от 9,0 мкг/0,5 мл до 9,5 мкг/0,5 мл;
 серии № 90, № 91, № 93, № 95: содержание общего белка — от 5,0 мкг/0,5 мл до 6,0 мкг/0,5 мл.
Проведено параллельное титрование серий вакцины
«Энцевир» по отношению к СОП вакцинного антигена вируса КЭ. Титрование каждой серии вакцины «Энцевир»
методом ИФА проводилось не менее 3 раз. Показано, что
в сериях вакцины, содержавших при контроле меньшее
количество общего белка (№ 90, 91, 93, 95), определялась более низкая концентрация белка Е — 2,99 мкг/амп
(среднее значение) по сравнению с сериями № 71, 72, 75,
77 — среднее значение вирусного вакцинного антигена
по белку Е — 4,91 мкг/амп (табл. 8).
Выводы:
1.
2.
3.
Разработан и стандартизован способ количественного определения содержания вакцинного
вирусного антигена (белок Е) в вакцине клещевого
энцефалита.
Разработан и аттестован СОП вакцинного антигена вируса КЭ соответствующий требованиям
стандартизации к СОП; оформлены свидетельство и инструкция по применению СОП.
СОП вакцинного антигена вируса КЭ калиброван
по содержанию вирусного протективного белка Е.
Литература:
1.
2.
3.
26
Злобин В.И. Современные проблемы эпидемиологии и профилактики клещевого энцефалита в
Российской Федерации // Биопрепараты. —
2004. — № 2 (14). — С. 4–7.
Кунц К. Австрийский опыт вакцина — вакцинации
против клещевого энцефалита // Эпидемиология
и вакцинопрофилактика. — 2004. — № 1. — С.
37–41.
Локтев В.Б., Терновой В.А., Нетесов С.В.
Молекулярно-генетическая характеристика вируса клещевого энцефалита // Вопросы вирусологии. — 2007. — № 5. — C. 10–16.
4.
5.
Воробьева М.С., Ладыженская И.П., Расщепкина
М.П. и др. Оценка качества отечественных иммуноферментных тест-систем для ранней диагностики КЭ // Материалы расширенного пленума
проблемной комиссии «Клещевой и другие вирусные энцефалиты» РАМН, 9-10 декабря 2003 г.
— М., 2003. — С. 53–54.
Петухов В.Г.,Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ «Паралайн»,
2006.