КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ И ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ ФАКТОРА На правах рукописи
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БЕЛКА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК На правах рукописи АРХИПОВА Валентина Ивановна КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ И ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ ФАКТОРА ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ 2 ИЗ ЭУКАРИОТ И АРХЕЙ 03.01.03 – Молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор М.Б. Гарбер Москва – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ........................................................................................................... 4 ВВЕДЕНИЕ .................................................................................................................................... 5 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ИНИЦИАЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ У АРХЕЙ ................................................................................. 7 1. Сравнительная характеристика системы инициации трансляции у бактерий, эукариот и архей ............................................................................................................................................ 7 2. Архейные факторы инициации трансляции ......................................................................... 15 2.1. aIF1 ................................................................................................................................. 15 2.2. aIF1A............................................................................................................................... 18 2.3. aIF2 ................................................................................................................................. 22 2.4. aIF5B............................................................................................................................... 38 2.5. aIF6 ................................................................................................................................. 46 Заключение................................................................................................................................... 51 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ....................................................................................................... 52 1. Материалы и приборы ............................................................................................................. 52 1.1. Химические реактивы и ферменты ......................................................................... 52 1.2. Буферы и среды ......................................................................................................... 53 1.3. Бактериальные штаммы и плазмиды....................................................................... 53 1.4. Принадлежности........................................................................................................ 54 1.5. Приборы ..................................................................................................................... 54 2. Методы генной инженерии и микробиологии ...................................................................... 55 2.1. Клонирование генов субъединиц e/aIF2 ................................................................. 55 2.2. Метод сайт-направленного мутагенеза последовательности ДНК ...................... 57 2.3. Электрофорез ДНК в геле агарозы .......................................................................... 58 2.4. Обработка ДНК сайт-специфическими эндонуклеазами рестрикции ................. 58 2.5. Получение компетентных клеток E. coli с применением хлорида кальция ........ 58 2.6. Трансформация клеток E. coli плазмидной ДНК методом теплового шока ....... 59 2.7. Экспрессия генов субъединиц e/aIF2 в клетках E. coli.......................................... 59 3. Биохимические методы при работе с белками ..................................................................... 60 3.1. Препаративное выделение и очистка γ-субъединицы aIF2 S. solfataricus и ее мутантных форм из клеток штаммов-суперпродуцентов E. coli ..................................... 60 3.2. Препаративное выделение и очистка aIF2α, aIF2αD3, aIF2αD23, aIF2β S. solfataricus из клеток штаммов-суперпродуцентов E. coli ........................................... 62 3.3. Препаративное выделение и очистка гетеротримера aIF2 S. solfataricus из клеток штаммов-суперпродуцентов E. coli........................................................................ 62 3.4. Препаративное выделение и очистка eIF2α и eIF2β S. cerevisiae из клеток штаммов-суперпродуцентов E. coli .................................................................................... 63 3.5. Получение препаратов комплексов e/aIF2 .............................................................. 64 2 3.6. Спектрофотометрическое определение концентраций белков ............................ 65 3.7. Электрофорез белков в ПААГ в присутствии ДСН ............................................... 65 3.8. Электрофорез белков в ПААГ в неденатурирующих условиях в кислой среде . 66 3.9. Кристаллизация aIF2γ и ее мутантных форм в свободной и нуклеотид-связанных формах ............................................................................................. 66 4. Биохимические методы при работе с РНК и нуклеотидами................................................ 67 4.1. Получение и очистка фрагментов мРНК ................................................................ 67 4.2. Препаративное выделение и очистка инициаторной тРНК E. coli из клеток штамма-суперпродуцента.................................................................................................... 69 4.3. Аминоацилирование тРНК ....................................................................................... 70 4.4. Электрофорез РНК в ПААГ в денатурирующих условиях ................................... 71 4.5. Препаративная очистка нуклеотидов ...................................................................... 71 4.6. Анализ чистоты препаратов нуклеотидов .............................................................. 71 4.7. Спектрофотометрическое определение концентраций нуклеиновых кислот и нуклеотидов .......................................................................................................................... 72 5. Биохимические методы при работе с РНК-белковыми комплексами ................................ 72 5.1. Получение мРНК-белковых комплексов ................................................................ 72 5.2. Электрофорез РНК-белковых комплексов в ПААГ............................................... 72 5.3. Электрофорез РНК-белковых комплексов в геле агарозы .................................... 73 5.4. Анализ РНК-белковых комплексов методом поверхностного плазмонного резонанса ............................................................................................................................... 73 5.5. Получение и препаративная очистка тройственных комплексов aIF2•GDPNP•Met-тРНКf и e/aIF2•GDPNP•Met-тРНКf ...................................................... 75 5.6. Кристаллизация тройственных комплексов aIF2•GDPNP•Met-тРНКf и e/aIF2•GDPNP•Met-тРНКf.................................................................................................... 76 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ............................................................................................. 77 1. Получение и кристаллизация архейного тройственного комплекса aIF2•GDPNP•MetтРНКf ......................................................................................................................................... 77 2. Выделение субъединиц eIF2 S. cerevisiae ............................................................................. 87 3. Получение и кристаллизация химерных форм фактора e/aIF2 и их тройственных комплексов e/aIF2•GDPNP•Met-тРНКf .................................................................................. 90 4. Исследование мРНК-связывающих свойств aIF2γ S. solfataricus ....................................... 92 5. «Рабочий» цикл aIF2γ S. solfataricus.................................................................................... 108 ВЫВОДЫ ................................................................................................................................... 117 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ......................................................................................................... 118 БЛАГОДАРНОСТИ .................................................................................................................. 135 3 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ а. о. – аминокислотный остаток БСА – бычий сывороточный альбумин ДСН – додецилсульфат натрия ДТТ – 1,4-дитиотреитол ИПТГ – изопропил-β-D-тиогалактопиранозид ММЭПЭГ – монометиловый эфир полиэтиленгликоля МПД – 2-метил-2,4-пентандиол н. о. – нуклеотидный остаток НТО – нетранслируемая область о. е. – оптическая единица ПААГ – полиакриламидный гель ПАК – полиакриловая кислота ПЦР – полимеразная цепная реакция ТЕМЕД – N, N, N’, N’ – тетраметил этилендимамин Трис – трис-(гидроксиметил)-аминометан Фн – неорганический фосфат ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота CTD – С-концевой домен D1 – домен 1, D2 – домен 2, D3 – домен 3 FMT – формиат-ион GDPCP – гуанозин-5’-(β,γ-метилен)-трифосфат GDPNP – гуанозин-5’-(β,γ-имидо)-трифосфат Hepes – N-2-гидроксиэтилпиперазин-N’-2-этансульфоновая кислота IRES – внутренний участок посадки рибосом MANT-GDP – (2’/3’)-O-(N-метилантранилоил)гуанозин-5’-дифосфат MES – 2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота NDSB – неденатурирующий сульфобетаин NTD – N-концевой домен PMSF – фенилметилсульфонилфторид SPR – поверхностный плазмонный резонанс SRL – сарцин-рициновая петля β-МЭ – β-меркаптоэтанол 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы. Одной из важнейших задач молекулярной биологии является изучение механизма биосинтеза белка. Инициация синтеза полипептидной цепи на рибосоме – сложный процесс, в котором немаловажную роль играют белковые факторы. Ключевую роль в процессе инициации биосинтеза белка выполняет гомологичный между эукариотами и археями гетеротримерный фактор инициации трансляции 2 (e/aIF2αβγ), который доставляет инициаторную метионил-тРНК (Met-тРНКi) в Р-участок малой субчастицы рибосомы. Интенсивные структурные исследования e/aIF2 ведутся в лабораториях ряда стран. Настоящая диссертационная работа является продолжением исследований структурной организации архейного фактора aIF2, ведущихся в Институте белка РАН. В данной работе описано получение кристаллов и определение структуры тройственного комплекса сердцевинной части aIF2 с метионилированной инициаторной тРНК и аналогом ГТФ. Эта работа делалась коллективом сотрудников лаборатории структурных исследований аппарата трансляции ИБ РАН при непосредственном участии автора диссертации. Автором работы проводились также эксперименты по получению новых, более совершенных кристаллических форм комплекса полноразмерного aIF2 с Met-тРНКi и ГТФ, а также были начаты эксперименты по выделению и кристаллизации субъединиц эукариотического фактора eIF2, пространственная структура которого до сих пор неизвестна (определена структура только его α-субъединицы). Несмотря на гомологию, архейный фактор aIF2 не является идеальной моделью для интерпретации данных по функционированию eIF2, и определение пространственной структуры eIF2 необходимо для корректного описания механизма инициации трансляции у эукариот на молекулярном уровне. Параллельно с кристаллизацией и исследованиями структуры e/aIF2 в данной работе проводилось изучение дополнительной функции γ-субъединицы архейного фактора aIF2. Помимо основной роли в связывании инициаторной метионил-тРНК в составе гетеротримерного фактора, γ-субъединица aIF2 как в составе фактора, так и в изолированном состоянии способна связывать и защищать мРНК от 5’-3’ направленной деградации, однако на сегодняшний день данная функция aIF2γ мало изучена. Цель работы: исследование структуры фактора инициации трансляции 2 из археи Sulfolobus solfataricus и дрожжей Saccharomyces cerevisiae; исследование механизма взаимодействия aIF2γ с мРНК. 5 Основные задачи работы: Получение кристаллов и исследование структуры архейного тройственного комплекса aIF2•GDPNP•Met-тРНКf. Получение штаммовпродуцентов Escherichia coli для субъединиц eIF2 S. cerevisiae и разработка методов выделения этих белков. Получение и кристаллизация гетеротримера eIF2 и/или его химерных форм с субъединицами архейного фактора aIF2, а также получение химерных тройственных комплексов e/aIF2•GDPNP•Met-тРНКf и их кристаллизация. Сайтнаправленный мутагенез предполагаемых участков узнавания 5’-концевого нуклеозидтрифосфата мРНК на γ-субъединице aIF2 S. solfataricus. Кристаллизация aIF2γ дикого типа и его мутантных форм в различных функциональных состояниях (в свободной форме, в комплексе с ГДФ и негидролизуемыми аналогами ГТФ). Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые получены кристаллы сердцевинной части архейного тройственного комплекса aIF2αD3γ•GDPNP•Met-тРНКf, на основе которых была определена его пространственная структура. Показано, что, несмотря на структурную гомологию γ-субъединицы aIF2 с бактериальным фактором элонгации EF-Tu, способы взаимодействия этих белков с тРНК принципиально отличаются. Разработаны методики выделения α- и β-субъединиц eIF2 дрожжей. Впервые получены кристаллы химерных тройственных комплексов e/aIF2•GDPNP•Met-тРНКf, что открывает перспективы для определения структур субъединиц эукариотического фактора eIF2. Впервые показано, что канонический нуклеотид-связывающий сайт aIF2γ является специфическим местом связывания 5’-концевого гуанозин-трифосфата мРНК. Определение кристаллических структур aIF2γ в различных функциональных состояниях позволило построить схему конформационных переходов, происходящих в этом белке при связывании ГТФ, его гидролизе и освобождении ГДФ. Результаты по структуре архейного тройственного комплекса aIF2 с ГТФ и инициаторной метионил-тРНК и структурам комплексов γ-субъединицы aIF2 с нуклеотидами имеют фундаментальный характер. Полученные в ходе работы генетические конструкции и штаммы-продуценты E. coli для субъединиц eIF2 S. cerevisiae используются в ИБ РАН. В методическом аспекте данная работа будет полезна для специалистов, работающих в области препаративной биохимии и кристаллизации макромолекул, как в нашей стране, так и за рубежом. Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи. Результаты данной работы докладывались на Российских и международных конференциях. 6 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ИНИЦИАЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ У АРХЕЙ 1. Сравнительная характеристика системы инициации трансляции у бактерий, эукариот и архей Серия молекулярных событий, происходящих с рибосомой и предшествующих образованию пептидной связи между двумя первыми аминокислотными остатками белка обозначается как стадия инициации или начала трансляции. В процессе инициации трансляции рибосома помещается на инициаторный кодон и устанавливается правильная рамка считывания мРНК. Этот этап является мишенью для различных регуляторных механизмов и поэтому в большей степени определяет скорость и эффективность трансляции. Среди доменов жизни (архей, бактерий и эукариот) аппарат инициации трансляции подвергся существенной эволюционной дивергенции. Между прокариотами (археи и бактерии) и эукариотами существуют различия в организации ее участников: РНК (рРНК, мРНК и тРНК) и белков (рибосомных и факторов инициации трансляции). При этом археи занимают промежуточное положение, поскольку структура архейных мРНК и характер взаимодействия мРНК-рибосома напоминает таковые у бактерий, однако факторы инициации трансляции архей имеют большую гомологию с эукариотическими. Несмотря на существующие различия, в аппарате инициации трансляции сохранилось ядро эволюционно консервативных компонентов, общих среди трех доменов жизни. Рибосома – сложная макромолекулярная машина, ответственная за синтез белка во всех живущих организмах. Все рибосомы состоят из двух субчастиц. У бактерий малая рибосомная субчастица 30S (образована 16S рРНК и примерно 20 белками) вместе с большой субчастицей 50S (23S и 5S рРНК и 30-35 белков) формируют 70S рибосому. У эукариот 40S субчастица (18S рРНК и около 30 белков) и 60S субчастица (25-28S, 5S и 5.8S рРНК и примерно 50 белков) формируют 80S рибосому. Архейные 70S рибосомы образованы 30S и 50S субчастицами и содержат 16S, 23S и 5S рРНК бактериального типа. Однако сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей 16S (18S) рРНК позволил впервые выделить археи в отельную группу прокариот (Woese and Fox, 1977). По содержанию белков рибосомы архей занимают промежуточное положение между бактериальными и эукариотическими. В архейных рибосомах обнаружено 68 белков (28 в малой и 40 в большой субчастице), из которых 34 белка (15 и 19, соответственно) имеются у бактерий и эукариот, 33 белка (13 и 20, соответственно) представлены только у 7 эукариот, и 1 белок (LX, белок большой субчастицы) специфичен для архей (Lecompte et al., 2002). Морфологическими элементами большой субчастицы рибосомы являются «тело», L1-выступ, центральный протуберанец и L12-выступ (P-выступ у архей и эукариот), или «палец». Малая субчастица имеет «головку», «тело» и боковую лопасть, или «платформу». У эукариот 40S субчастица дополнительно имеет «клюв» и так называемые «ноги». Архейная 30S субчастица обладает промежуточной формой по сравнению с малыми субчастицами бактерий и эукариот, поскольку имеет выраженный «клюв» на головке, но не имеет столь выраженных «ног» на конце тела (Рис. 1) (Lake, 1983). (а) (б) (г) (в) Рис. 1. Схематическое изображение малых рибосомных субчастиц (а) бактерий, (б) архей и (в) эукариот со стороны, контактирующей с большой субчастицей, а также (г) целой архейной рибосомы в перекрывающейся проекции. Рисунок с небольшими изменениями взят из Lake, 1983. Малая рибосомная субчастица участвует в инициации трансляции, и именно на ней расположен участок связывания мРНК. В нуклеотидной последовательности мРНК содержится информация об аминокислотной последовательности белка, который необходимо синтезировать рибосоме. Помимо кодирующей последовательности, или цистрона, мРНК обычно содержит нетранслируемые области (НТО) на 5’- и 3’-концах. Эукариотические мРНК в большинстве случаев моноцистронны, тогда как мРНК прокариот в связи с оперонной организацией генов обычно полицистронны, т.е. содержат несколько кодирующих последовательностей. Предшествующая кодирующей последовательности 5’-НТО включает специфические последовательности или структуры, которые участвуют в связывании рибосомы. В случае полицистронных мРНК каждому индивидуальному цистрону обычно предшествует его элементы участка инициации трансляции, которые часто перекрываются с кодирующими последовательностями предыдущих цистронов (см. обзор Kozak, 1999). Каждая кодирующая последовательность начинается с инициаторного, или стартового кодона, в качестве которого у эукариот практически всегда используется AUG, у бактерий и архей этот кодон используется в 90 и 79% случаев, соответственно, а также возможен старт с кодонов GUG (8 и 11%, 8 соответственно) или UUG (1 и 10%, соответственно) (Gualerzi and Pon, 1990; Tolstrup et al., 2000). В процессе инициации трансляции происходит связывание мРНК малой рибосомной субчастицей, и за счет узнавания инициаторного кодона мРНК и его спаривания с инициаторной тРНК в P-участке (участке связывания пептидил-тРНК) рибосомы установливается правильная рамка считывания всей последующей кодирующей последовательности мРНК. В бактериальной мРНК на расстоянии 7-10 нуклеотидных остатков (н. о.) перед стартовым кодоном располагается полипуриновая нуклеотидная последовательность, так называемая последовательность Шайна-Дальгарно, которая в большей или меньшей степени комплементарна последовательности «анти-ШайнаДальгарно», расположенной на 3’-конце 16S рРНК малой рибосомной субчастицы (Shine and Dalgarno, 1974). Спаривание этих последовательностей способствует непосредственному связыванию мРНК с рибосомой таким образом, что стартовый кодон размещается вблизи P-участка. Кроме того, у бактерий дополнительное связывание мРНК и рибосомы может осуществляться благодаря взаимодействию рибосомного белка S1 (bS1 согласно номенклатуре рибосомных белков Ban et al., 2014) с A/U-богатыми участками мРНК, расположенными перед последовательностью Шайна-Дальгарно (Komarova et al., 2002). Эукариотические мРНК не содержат последовательности Шайна-Дальгарно и, как правило, имеют специфические постранскрипционные модификации: 7-метилгуанозин (кэп-структура) на 5’-конце и поли(А)-хвост на 3’-конце, которые при участии факторов инициации трансляции и поли(А)-связывающего белка PABP способствуют узнаванию и связыванию мРНК с малой рибосомной субчастицей (см. обзор Gallie, 1998; Wells et al., 1998). У эукариот выбор инициаторного кодона главным образом осуществляется по механизму сканирования, при этом 40S рибосомная субчастица связывается с кэппированым 5’-концом мРНК и движется в 5’-3’ направлении пока не достигнет инициаторного кодона, которым обычно является первый попавшийся AUG кодон (Kozak, 1989). Кроме того, возможны альтернативные механизмы инициации, связанные с наличием таких элементов мРНК, как короткие открытые рамки считывания (uORF), кэпнезависимые трансляционные элементы (CITEs) или внутренние участки посадки рибосом (IRES структуры) (см. обзоры Shatsky et al., 2010, 2014; Martínez-Salas et al., 2012). Архейные мРНК, подобно бактериальным, не кэппированы и не полиаденилированы, часто полицистронны (см. обзор Dennis, 1997; Kyrpides and Woese, 1998a), и имеют последовательность Шайна-Дальгарно, главным образом, перед внутренними цистронами (Tolstrup et al., 2000). У первых цистронов полицистронных 9 мРНК и моноцистронных мРНК архей часто отсутствует последовательность ШайнаДальгарно, либо они начинаются непосредственно с инициаторного AUG кодона, такие мРНК называют безлидерными (Slupska et al., 2001; Brenneis et al., 2007). На основании типов мРНК различают следующие способы реализации связывания мРНК с рибосомой у архей. Один из механизмов основан на каноническом взаимодействии последовательности Шайна-Дальгарно мРНК с 16S рРНК, который реализуется на внутренних цистронах полицистронных мРНК (Condò et al., 1999; Tolstrup et al., 2000). Эксперименты по мутагенезу in vitro и in vivo в археях показали, что нарушение последовательности ШайнаДальгарно имеет неблагоприятное воздействие, приводящее к ослаблению или полной остановке синтеза белка (Condò et al., 1999; Sartorius-Neef and Pfeifer, 2004). Однако в случае археи Haloferax volcanii нарушение последовательности Шайна-Дальгарно, расположенной в 5’-НТО мРНК, не влияло на эффективность трансляции (Kramer et al., 2014). Следующий способ взаимодействия характерен для безлидерных мРНК. Для ассоциации 30S субчастицы с безлидерными мРНК строго необходимо присутствие инициаторной тРНК (Benelli et al., 2003). Полагают, что за счет кодон-антикодонового взаимодействия между мРНК и тРНК происходит посадка малой рибосомной субчастицы на иницииаторный AUG кодон, в результате чего стартовый кодон, расположенный на 5’-конце матрицы оказывается прямо в Р-участке рибосомной субчастицы. На сегодняшний день механизм трансляции безлидерных мРНК остается малоизученным. Безлидерные мРНК также имеются у бактерий и эукариот (Janssen, 1993) и могут транслироваться всеми типами рибосом, независимо от их происхождения (Grill et al., 2000). Это позволило предположить, что безлидерные мРНК предшествовали всем другим типам мРНК и широко использовались организмами, существовавшими до эволюционного расхождения трех доменов жизни. Стоит отметить, что в бактериях и эукариотах инициация трансляции на безлидерных мРНК может осуществляться недиссоциированными 70S или 80S рибосомами и в отсутствии факторов инициации трансляции (Balakin et al., 1992; O’Donnell and Janssen, 2002; Udagawa et al., 2004; Moll et al., 2004; Andreev et al., 2006). В 2009 году был экспериментально охарактеризован новый тип инициации трансляции у архей, который осуществляется на лидерсодержащих мРНК, не имеющих последовательность Шайна-Дальгарно (Hering et al., 2009). Эффективность трансляции таких мРНК сильно зависела от длины 5’-НТО (минимальный размер – 15 н. о.) и ее вторичной структуры (отсутствие стабильных шпилек непосредственно перед стартовым 10 кодоном). Авторы предполагают, что при данном механизме инициации трансляции происходит внутренняя посадка малой рибосомной субчастицы на мРНК. Однако элементы, способствующие такому взаимодействию, остаются невыявленными. Например, у бактерий в связывании мРНК, не содержащих последовательность ШайноДальгарно, участвует рибосомный белок S1 (Boni et al., 2001). Тогда как у архей и ряда бактерий белок S1 отсутствует (см. обзор Benelli and Londei, 2011). В инициации трансляции важную роль играют белковые факторы, которые существенно усиливают связывание мРНК с малой рибосомной субчастицей и делают это взаимодействие более избирательным. У бактерий в этом процессе участвуют три мономерных фактора: IF1, IF2 и IF3 (Табл. 1). Таблица 1. Функциональные свойства бактериальных факторов инициации трансляции. IF1 1) взаимодействует с А-участком 30S субчастицы, препятствует связыванию инициаторной тРНК в А-участке, стимулируя ее посадку строго в Р-участок; 2) стабилизирует связывание IF2 и IF3 с 30S субчастицей IF2 ГТФ-связывающий белок 1) способствует связыванию инициаторной тРНК с Р-участком 30S субчастицы; 2) способствует присоединению 50S субчастицы к инициаторному 30S комплексу IF3 1) диссоциирует 70S рибосомы и препятствует ассоциации рибосомных субчастиц; 1) необходим для правильного узнавания AUG-кодона; 2) опосредованно участвует в отборе инициаторной тРНК Согласно кинетическим исследованиям образования преинициаторного комплекса факторы IF3 и IF2 первыми связываются с малой рибосомной субчастицей и образуют нестабильный комплекс, который стабилизируется при связывании IF1 (Milón et al., 2012). IF1 занимает A-участок (участок связывания аминоацил-тРНК) малой рибосомной субчастицы (Moazed et al., 1995; Dahlquist and Puglisi, 2000) и препятствует преждевременной посадке элонгаторной тРНК. Бактериальная инициаторная метионилтРНК, в отличие от (формилметионил-тРНК, элонгаторной, fMet-тРНКfMet), формилируется по остатку метионина и с помощью фактора IF2 связывается в P-участке 30S субчастицы. Связывание мРНК с малой рибосомной субчастицей может происходить на любой стадии образования преинициаторного комплекса, не зависит от факторов инициации трансляции и определяется концентрацией мРНК, а также наличием вторичной структуры участка связывания с рибосомой (Milón et al., 2012). Точность узнавания инициаторного кодона контролируется фактором IF3, который дестабилизирует неканонические кодон-антикодоновые взаимодействия (Sussman et al., 1996). После узнавания инициаторного кодона (на этом этапе бактериальный преинициаторный комплекс становится инициаторным) IF2 способствует присоединению 50S субчастицы, 11 что вызывает гидролиз ГТФ на IF2, и факторы покидают рибосому, которая переходит к стадии элонгации. В отличие от прокариот, в эукариотических клетках, как правило, не происходит непосредственного узнавания инициаторного участка мРНК малой рибосомной субчастицей и в процессе инициации трансляции задействовано большее число белковых факторов, как мономерных, так и состоящих из нескольких субъединиц (Табл. 2). Одни эукариотические факторы (eIF4A, eIF4B, eIF4E, eIF4G и eIF4H) вовлечены в узнавание кэп-структуры и разворачивание вторичной структуры мРНК, другие (еIF1, eIF1A, еIF2, eIF2B, еIF3, eIF5, eIF5B) взаимодействуют с рибосомой и/или мРНК и способствуют правильному узнаванию инициаторного кодона. В процессе инициации трансляции эукариотический 43S преинициаторный комплекс, состоящий из 40S рибосомной субчастицы, связанной с факторами eIF1, eIF1A, eIF3, eIF5 и тройственным комплексом eIF2•ГТФ•Met-тРНКi, взаимодействует с 5’-концом мРНК. Узнавание кэп-структуры мРНК осуществляется фактором eIF4F, состоящим из кэп-связывающей субъединицы (eIF4E), субъединицы-«платформы» (eIF4G) и РНК-хеликазы (eIF4A). Специфическое взаимодействие eIF4G с eIF3 обеспечивает связывание 40S субчастицы с 5’-концом мРНК, при этом 3’-конец мРНК посредством белка PABP также связан с eIF4G, в результате чего мРНК оказывается замкнутой в кольцо. Далее образовавшийся так называемый 48S преинициаторный комплекс начинает «сканировать» мРНК в поисках AUG кодона в оптимальном нуклеотидном контексте. Узнавание AUG кодона и его окружения контролируется факторами eIF1 и eIF1A. После установления правильного взаимодействия AUG кодона с антикодоном тРНКi фактор eIF1 покидает рибосому, что вызывает высвобождение неорганического фосфата из тройственного комплекса eIF2•ГТФ•Met-тРНКi и тем самым обуславливает необратимость всего процесса (Algire et al., 2005; Maag et al., 2005). При этом гидролиз ГТФ на eIF2 активируется фактором eIF5, и eIF2 диссоциирует в комплексе с ГДФ. Для последующего присоединения 60S рибосомной субчастицы необходим eIF5B (Pestova et al., 2000), который ориентирует акцепторный черешок тРНКi в P-участке большой субчастицы (Lomakin and Steitz, 2013), гидролизует ГТФ и покидает образовавшийся на этом этапе 80S инициаторный комплекс, готовый к стадии элонгации. Отдельную роль в инициации трансляции играет фактор eIF6, который связывает большую рибосомную субчастицу и препятствует ее преждевременному объединению с малой субчастицей. Роль эукариотических факторов eIF1, еIF2 (и eIF5B), еIF1A аналогична роли бактериальных факторов IF3, IF2 и IF1, соответственно (Battiste et al., 2000; Pestova et al., 2000; Pestova and Kolupaeva, 2002). 12 У архей в инициации биосинтеза белка принимают участие факторы aIF1, aIF1A, aIF2, aIF2Bαβδ (гомологов γ- и ε-субъединиц eIF2B у архей не обнаружено), aIF4A, aIF5A, aIF5B и aIF6, которые гомологичны соответствующим факторам инициации трансляции эукариот (Kyrpides and Woese, 1998a, 1998b; Lee et al., 1999; см. обзор Marintchev and Wagner, 2004) (Табл. 2). Факторы e/aIF1A и e/aIF5B имеют гомологию с бактериальными IF1 и IF2, соответственно, и поскольку они представлены во всех трех доменах жизни, их относят к универсально консервативным факторам (Kyrpides and Woese, 1998a; Lee et al., 1999). Таблица 2. Факторы инициации трансляции эукариот и архей и их функциональные свойства. Эукариотические eIF1, мономер 1) необходим для правильного узнавания AUGкодона и его окружения; взаимодействует с P-участком 40S субчастицы; 2) в паре с eIF1A способствует связыванию eIF2•ГТФ•Met-тРНКi с 40S рибосомной субчастицей eIF1A (гомолог IF1), мономер 1) в паре с eIF1 контролирует узнавание AUGкодона; взаимодействует с А-участком 40S субчастицы; 2) стимулирует связывание eIF2•ГТФ•MetтРНКi с 40S субчастицей; 3) способствует связыванию eIF5B с 40S субчастицей eIF2, гетеротример (α,β,γ) ГТФ-связывающий белок 1) доставляет инициаторную тРНК в Р-участок 40S субчастицы; 2) влияет на точность узнавания AUG-кодона; 3) регулирует синтез белка eIF2A, мономер функция не установлена eIF2B, гетеропентамер (α,β,γ,δ,ε) связывается с eIF2•ГДФ и обеспечивает обмен ГДФ на ГТФ eIF2D, мономер способен доставлять как инициаторную, так и элонгаторную тРНК в P-участок 40S субчастицы eIF3, гетеромультимер (6-13 субъединиц) 1) служит площадкой для сборки других факторов: eIF1, eIF1A, eIF2, eIF4B, eIF4G, eIF5; 2) стимулирует присоединение мРНК и тройственного комплекса eIF2•ГТФ•Met-тРНКi к 40S субчастице; 3) диссоциирует рибосомы на субчастицы и препятствует их реассоциации Архейные aIF1, мономер 1) необходим для правильного узнавания AUGкодона; взаимодействует с P-участком 30S субчастицы; 2) способствует связыванию aIF2•ГТФ•MetтРНКi с 30S рибосомной субчастицей аIF1A (гомолог IF1), мономер в паре с aIF1 способствует связыванию aIF2 с 30S субчастицей aIF2, гетеротример (α,β,γ) ГТФ-связывающий белок 1) доставляет инициаторную тРНК в Р-участок 30S субчастицы; 2) γ-субъединица связывает мРНК, содержащие трифосфат на 5’-конце, и защищает их от 5’→3’ направленной деградации гомолог не найден aIF2B, найдены гомологи субъединиц α,β,δ функция не установлена гомолог не найден гомологи не найдены ни для одной из субъединиц 13 Таблица 2. Продолжение. факторы группы eIF4 (eIF4F) eIF4F служит адаптором для первичного связывания мРНК с 43S комплексом eIF4A, мономер АТФ-зависимая РНК-хеликаза «раскручивает» элементы вторичной структуры 5’-НТО мРНК аIF4А, мономер АТФ-связывающий белок функция не установлена eIF4B и eIF4H, мономеры стимулируют работу eIF4A гомологи не найдены eIF4Е, мономер 1) специфически связывается с кэп-структурой; 2) является мишенью для регуляции инициации трансляции гомолог не найден eIF4G, мономер 1) является «платформой» для связывания eIF4A, eIF4E, eIF3, PABP и мРНК; 2) стимулирует хеликазную активность eIF4A; 3) является мишенью для регуляции инициации трансляции eIF5, мономер 1) активирует ГТФазную активность eIF2; 2) ингибирует диссоциацию ГДФ с eIF2 eIF5A (гомолог EF-P), мономер фактор элонгации трансляции способствует образованию первой пептидной связи eIF5B (гомолог IF2), мономер ГТФ-связывающий белок 1) стимулирует связывание инициаторной тРНК в P-участке рибосомы; 2) способствует присоединению 60S субчастицы к преинициаторному комплексу eIF6, мономер взаимодействует с 60S субчастицей и предотвращает ее ассоциацию с 40S субчастицей гомолог не найден Основная масса исследований гомолог не найден аIF5A (гомолог EF-P), мономер функция не установлена аIF5B (гомолог IF2), мономер ГТФ-связывающий белок 1) стимулирует связывание инициаторной тРНК в P-участке рибосомы; 2) способствует присоединению 50S субчастицы к преинициаторному комплексу аIF6, мономер взаимодействует с 50S субчастицей и предотвращает ее ассоциацию с 30S субчастицей архейных факторов инициации трансляции проводится из организма S. solfataricus царства кренархеот (лат. Crenarchaeota), которые стоят ближе к эукариотам, чем остальные царства архей (см. обзоры Benelli and Londei, 2009, 2011; La Teana et al., 2013). Однако результаты экспериментов с факторами инициации трансляции из археи H. volcanii, принадлежащего к царству эвриархеот (лат. Euryarchaeota), хорошо согласуются и дополняют данные о функционировании инициаторных факторов трансляции S. solfataricus (Gäbel et al., 2013). 14 Было показано, что факторы aIF1, aIF1A, β- и γ-субъединицы aIF2, aIF5A, aIF5B и aIF6 являются жизненно необходимыми белками для клеток архей (Gäbel et al., 2013). Делеция гена, кодирующего α-субъединицу aIF2, приводила к существенному замедлению роста клеток. Удаление генов, кодирующих α- и δ-субъединицы aIF2B и aIF4A не изменяло ростовых характеристик. Функции факторов aIF4A и aIF5A не определены. 2. Архейные факторы инициации трансляции 2.1. aIF1 Архейный фактор инициации трансляции 1, aIF1 – однодоменный белок с молекулярной массой около 10 кДа. Гомология aIF1 с эукариотическим фактором eIF1 составляет 52-56%. На сегодняшний день в научной литературе экспериментальные данные о факторе aIF1 достаточно скудны, как и для многих других архейных факторов трансляции. Всего три работы посвящены функциональным исследованиям aIF1. Было установлено, что aIF1 является жизненно-необходимым белком (Gäbel et al., 2013). Делеция гена фактора aIF1 H. volcanii приводила к тому, что клетки архей становились нежизнеспособными. В экспериментах в бесклеточной системе трансляции было показано, что повышение содержания количества фактора aIF1 в реакционной смеси увеличивало синтез тотального белка, что указывает на участие aIF1 в стимуляции трансляции (Hasenöhrl et al., 2006). С помощью ряда биохимических методов и метода резонансного переноса флуоресцентной энергии было установлено, что aIF1 (его С-концевая часть) стимулирует присоединение мРНК и тройственного комплекса aIF2•ГТФ•Met-тРНКi к малой рибосомной субчастице (Hasenöhrl et al., 2006) и ингибирует связывание мРНК, содержащей неканонический AUU инициаторный кодон, с 30S субчастицей, ассоциированной с aIF2•ГТФ•Met-тРНКi (Hasenöhrl et al., 2009). Эти результаты хорошо согласуются с данными о функционировании его эукариотического гомолога eIF1. Мутации в белке eIF1 ослабляли взаимодействие eIF2•ГТФ•Met-тРНКi с 43S преинициаторным комплексом (Cheung et al., 2007), либо вызывали Sui– фенотип (suppressor of initiation codon mutation), при котором инициация трансляции происходила на неканонических триплетах (Castilho-Valavicius et al., 1990; Yoon and Donahue, 1992). Таким образом, можно заключить, что аналогично eIF1 архейный фактор aIF1 способствует повышенной избирательности связывания тройственного комплекса e/aIF2•ГТФ•Met-тРНКi с правильным инициаторным кодоном мРНК. 15 На основании анализа профиля седиментации рибосом и результатов вестернблоттинга с использованием антител к aIF1 было установлено его связывание с малой рибосомной субчастицей (Hasenöhrl et al., 2006). Методом химического пробинга был исследован участок связывания aIF1 на 30S рибосомной субчастице S. solfataricus и показано, что aIF1 защищает от химической модификации нуклеотидные остатки 658/659 и 749/750 в петлях h23 и h24 16S рРНК, соответственно (Hasenöhrl et al., 2009). Такое расположение aIF1 аналогично положению eIF1 на 40S субчастице. Эукариотический фактор eIF1 связывается вблизи P-участка малой рибосомной субчастицы, взаимодействует со спиралями h24, h44, h45 18S рРНК (Рис. 2а) (Lomakin et al., 2003; Rabl et al., 2011; Weisser et al., 2013; Lomakin and Steitz, 2013; Hussain et al., 2014). Пространственные структуры eIF1 в свободном состоянии и в комплексе с 40S рибосомной субчастицей определены (Табл. 3). Структура архейного фактора aIF1 на данный момент остается неизвестной. (а) (б) головка E P A тРНКi тРНКi мРНК eIF1 eIF1 антикодон eIF1A тело β1-β2 петля спираль h44 18S рРНК мРНК Рис. 2. (а) Расположение эукариотических факторов eIF1 и eIF1A S. cerevisiae и инициаторной тРНК на 40S рибосомной субчастице (PDB код 3J81). Буквами A, P и E обозначены соответствующие участки малой рибосомной субчастицы. (б) Связывание eIF1 и тРНКi в P-участке 40S субчастицы. Фактор eIF1 состоит из неструктурированного N-конца и сформированного в домен консервативной C-концевой части (Рис. 3а). В этот домен входят пять β-тяжей, формирующих β-лист, по одну сторону от которого находятся две α-спирали с чередованием ββαββαβ. Консервативная петля β1-β2 белка eIF1 располагается на 40S 16 субчастице между антикодоновой петлей инициаторной тРНК и нуклеотидными остатками спирали h44 18S рРНК (Рис. 2б) (Lomakin and Steitz, 2013; Hussain et al., 2014; Llácer et al., 2015). Такое месторасположение eIF1 необходимо, чтобы отслеживать структурные изменения, взаимодействия. Фактор происходящие eIF1 при установлении поддерживает неблагоприятное кодон-антикодового состояние малой рибосомной субчастицы для связывания тРНК с Р-участком. Однако инициаторная тРНК обладает более высоким сродством к Р-участку рибосомы, чем другие тРНК, и только она может успешно правильного “сопротивляться” кодон-антикодового дестабилизирующему спаривания 48S действию комплекс eIF1. После претерпевает конформационные изменения, и фактор eIF1 покидает свой участок связывания. Аналогичной функцией и месторасположением на рибосоме обладает двухдоменный фактор IF3 у бактерий (Рис. 3б). Несмотря на то, что С-концевой домен IF3 “напоминает” структуру eIF1, гомология между IF3 и e/aIF1 отсутствует. Таблица 3. Результаты структурных исследований eIF1. Предел разрешения, Å Номер в PDB банке Homo sapiens eIF1 ЯМР 2IF1 Fletcher et al., 1999 S. cerevisiae eIF1 ЯМР 2OGH Reibarkh et al., 2008 Tetrahymena thermophila 40S•eIF1 40S•eIF1•eIF1A 3.9 3.7 4V5O 4BTS Rabl et al., 2011 Weisser et al., 2013 H. sapiens 40S•eIF1 40S•eIF1•eIF1A 7.8 7.0 4KZX 4KZY Lomakin and Steitz, 2013 3.75 4.0 3J80 3J81 3.46 3JAM Llácer et al., 2015 6.47 4UER Aylett et al., 2015 Название объекта и источника S. cerevisiae 40S•eIF1•eIF1A 40S•eIF1•eIF1A•eIF2-GTPMet-тРНКi•мРНК 40S•eIF1•eIF1A Lachancea kluyveri 40S•eIF1•eIF1A•eIF3 17 Ссылка Hussain et al., 2014 (а) (б) N IF3-NTD N eIF1 C C IF3-CTD C N Рис. 3. (а) Схематическое изображение пространственной структуры eIF1 H. sapiens, полученной методом ЯМР (PDB код 2IF1). Желтым цветом выделена петля β1-β2. (б) Схематическое изображение кристаллических структур N-концевого (NTD) и C-концевого (CTD) доменов IF3 из Geobacillus stearothermophilus (PDB коды 1TIF и 1TIG, соответственно). Рисунки с изменениями взяты из Marintchev and Wagner, 2004. 2.2. aIF1A Фактор aIF1A – однодоменный белок (11.5 кДа) с OB-укладкой (oligonucleotide/oligosaccharide-binding fold), которая представляет собой пяти тяжевой β-лист свернутый в β-цилиндр с α-спиралью между тяжами β3 и β4 (Рис. 4, Табл. 4). Его структурный и функциональный гомолог обнаружен у эукариот – eIF1A и у бактерий – IF1. Таким образом, e(a)IF1A/IF1 является универсальным фактором инициации трансляции. На рисунке 4 представлены пространственные структуры универсального фактора e(a)IF1A/IF1. В отличие от бактериального IF1 у эукариот и архей e/aIF1A имеет на концах неструктурированные «хвосты», которые более длинные у eIF1A. Было показано, что C-концевой «хвост» эукариотического фактора eIF1A усиливает связывание тройственного комплекса eIF2•ГТФ•Met-тРНКi с 40S субчастицей (Fekete et al., 2005, 2007; Saini et al., 2010). Кроме этого, C-концевым участком eIF1A взаимодействует с IV доменом eIF5B (Olsen et al., 2003; Marintchev et al., 2003; Zheng et al., 2014). У архей aIF1A также образует стабильный комплекс с aIF5B (Londei, 2005). Однако у архейного фактора aIF1A на C-конце неструктурированный участок отсутствует. N-концевой неструктурированный «хвост» eIF1A способствует узнаванию инициаторного кодона 18 (Fekete et al., 2007); роль N-концевого «дополнения» архейного фактора aIF1A неопределенна. (а) (б) (в) N N N C C C IF1 aIF1A eIF1A (г) OB-домен IF1 (E. coli) 1 72 aIF1A (M. jannaschii) 1 17 86 12 29 97 102 eIF1A (H. sapiens) 1 114 144 Рис. 4. Схематические изображения пространственных структур, полученных методом ЯМР-спектроскопии: (a) IF1 из E. coli (PDB код 1AH9), (б) aIF1A из Methanocaldococcus jannaschii (PDB код 1JT8) и (в) eIF1A из H. sapiens (PDB код 1D7Q). (г) Схематическое выравнивание аминокислотных последовательностей IF1, aIF1A и eIF1A. Фиолетовым цветом окрашен OB-домен. Участки aIF1A, отсутствующие в IF1, окрашены голубым. Желтым цветом окрашены участки eIF1A специфичные для эукариот. Рисунки а-в с изменениями взяты из Marintchev and Wagner, 2004. Фактор aIF1A является жизненно важным белком и функционирует в паре с aIF1. У археи H. volcanii aIF1A кодируется двумя генами, одновременная делеция которых приводила к нежизнеспособности клеток. Однако удаление только одного из генов aIF1A повышало уровень транскрипции другого и клетки выживали (Gäbel et al., 2013). Методом резонансного переноса флуоресцентной энергии было показано, что aIF1 и aIF1A совместно стимулируют связывание aIF2 с 30S субчастицей (Hasenöhrl et al., 2009). Однако факторы aIF1 и aIF1А не взаимодействуют с aIF2. Методом химического пробинга было показано, что фактор aIF1A не защищает нуклеотидные остатки 16S рРНК от модификации гидроксильными радикалами, тогда как в присутствии обоих факторов от химической модификации в 16S рРНК защищены те же нуклеотидные остатки в спиралях h23 и h24, что и в присутствии только фактора aIF1, и дополнительно 1011-1012 н. о. в спирали h34 (Hasenöhrl et al., 2009). Защита нуклеотидных остатков дополнительно в спирали h34 16S рРНК, по-видимому, есть эффект конформационных изменений в 19 рибосомной субчастице в результате связывания aIF1A или обоих факторов, что в свою очередь благоприятствует посадке aIF2•ГТФ•Met-тРНКi на рибосому. Структурные изменения в спирали h34 18S рРНК также наблюдались при связывании эукариотических гомологов eIF1 и eIF1A с 40S субчастицей (Passmore et al., 2007). Таблица 4. Результаты структурных исследований e(a)IF1A/IF1. Звездочкой отмечены структуры, находящиеся в базе EM Data Bank (http://www.ebi.ac.uk/pdbe/). Предел разрешения, Å Номер в PDB банке H. sapiens eIF1A ЯМР 1D7Q Battiste et al., 2000 M. jannaschii aIF1A ЯМР 1JT8 Li and Hoffman, 2001 Pyrococcus abyssi aIF1A 1.35 4MNO нет публикации E. coli IF1 ЯМР 1AH9 Sette et al., 1997 IF1 1.47 3I4O Hatzopoulos and MuellerDieckmann, 2010 T. thermophila 40S•eIF1•eIF1A 3.7 4BTS Weisser et al., 2013 H. sapiens 40S•eIF1A 40S•eIF1•eIF1A 40S•мРНК•тРНКi•eIF1A 7.81 7.01 7.03 4KZX 4KZY 4KZZ Lomakin and Steitz, 2013 3.75 4.0 3J80 3J81 3.46 3JAM Llácer et al., 2015 6.47 4UER Aylett et al., 2015 3.2 13.8 18.3 1HR0 1ZO1 EMD-1771* Carter et al., 2001 Allen et al., 2005 Julián et al., 2011 8.7 11.5 EMD-1523* EMD-2448* Simonetti et al., 2008 Simonetti et al., 2013a Название объекта и источника Ссылка Mycobacterium tuberculosis S. cerevisiae 40S•eIF1•eIF1A 40S•eIF1•eIF1A•eIF2-GTPMet-тРНКi•мРНК 40S•eIF1•eIF1A L. kluyveri 40S•eIF1•eIF1A•eIF3 E. coli 30S•IF1 IF1•IF2•fMet-тРНКf в составе 70S 30S•мРНК•IF1•IF2•ГТФ•IF3•fMetтРНКf T. thermophilus 30S•мРНК•IF1•IF2•ГТФ•fMet-тРНКf 30S•IF1•IF2•fMet-тРНКf Hussain et al., 2014 Слаженная работа факторов aIF1 и aIF1A согласуется с выраженным синергизмом в действии eIF1 и eIF1A на сборку 43S преинициаторного комплекса. Если eIF1 несколько 20 дестабилизирует взаимодействие тройственного комплекса eIF2•ГТФ•Met-тРНКi с мРНК на 40S субчастице, способствуя повышенной избирательности связывания с правильным инициаторным кодоном мРНК, то eIF1А стабилизирует правильное кодон-антикодоновое спаривание. Функция eIF1A аналогична таковой прокариотического IF1 – это, во-первых, блокировка А-участка и обеспечение установки инициаторной тРНК в Р-участке на правильном AUG кодоне и, во-вторых, совместно с eIF1, поддержание «открытого» состояния малой рибосомной субчастицы для эффективного взаимодействия с мРНК и Met-тРНКi (цит. по Спирин, 2011). У эукариот eIF1A связывается с N-концевым доменом β-субъединицы eIF2, который отсутствует у β-субъединицы архейного фактора aIF2 (Singh et al., 2004). Факторы eIF1 и eIF1A друг с другом не взаимодействуют, но связываются с малой рибосомной субчастицей кооперативно (Maag and Lorsch, 2003). Анализ структур комплексов 40S субчастиц с факторами инициации трансляции показал, что eIF1 и eIF1A связывают спираль h44 18S рРНК (Рис. 2а) (Weisser et al., 2013; Lomakin and Steitz, 2013; Hussain et al., 2014; Llácer et al., 2015). Кроме этого, eIF1A взаимодействует со спиралью h18 18S рРНК и располагается в A-участке 40S субчастицы, а именно N-концевой участок eIF1A устанавливается вблизи кодон-антикодоновой пары. Высококонсервативные среди эукариот аминокислотные остатки Gly8 и Gly9 eIF1A S. cerevisiae контактируют с антикодоновой петлей Met-тРНКi, а высококонсервативный среди эукариот и архей остаток Trp70 eIF1A S. cerevisiae образует стэкинг-взаимодействие с нуклеотидным остатком мРНК в +4 положении (Hussain et al., 2014). Вероятно, взаимодействие мРНК с eIF1A и нуклеотидными остатками рРНК задерживает продвижение мРНК по малой субчастице рибосомы при достижении правильного инициаторного кодона, и тем самым стабилизирует eIF2•ГТФ•Met-тРНКi на 40S субчастице. 21 2.3. aIF2 Инициация трансляции требует связывания инициаторной тРНК в P-участке малой рибосомной субчастицы. В эукариотах и археях инициаторную метионил-тРНК на малую субчастицу рибосомы доставляет гетеротримерный фактор инициации трансляции 2 (e/aIF2αβγ) (Levin et al., 1973; Schreier and Staehelin, 1973; Yatime et al., 2004; Pedullà et al., 2005). Самая большая субъединица e/aIF2, γ (с молекулярной массой от 45 до 58 кДа) образует ядро гетеротримера и взаимодействует с субъединицами α (28-35 кДа) и β (15-17 кДа у архей и 35-38 кДа у эукариот), которые не контактируют друг с другом (Kimball et al., 1987; Erickson and Hannig, 1996; Thompson et al., 2000; Schmitt et al., 2002; Pedullà et al., 2005; Yatime et al., 2007; Stolboushkina et al., 2008). Эукариотический eIF2 и архейный aIF2 гомологичны между собой (40-42% гомологии для α-субъединицы, 27-30% - для β-субъединицы и 50-57% - для γ-субъединицы) (см. обзор Stolboushkina and Garber, 2011), но ни одна из субъединиц этих факторов не имеет гомологии с бактериальным IF2. Субъединицы архейного фактора инициации трансляции 2 по размеру меньше соответствующих субъединиц эукариотического фактора (Рис. 5). Так, α-субъединица eIF2 в отличие от aIF2α имеет отрицательно заряженный С-концевой участок длиной 30-40 а. о. Архейная β-субъединица по размеру в два раза меньше β-субъединицы эукариотического фактора и гомологична ее С-концевой части (Thompson et al., 2000; Cho and Hoffman, 2002). N-концевая часть eIF2β, отсутствующая у архейной aIF2β, содержит три полилизиновых блока (длина каждого 6-8 остатков лизина), которые необходимы для взаимодействия eIF2 с активатором ГТФазной активности eIF2 – фактором eIF5 (Das et al., 1997) и с ГДФ/ГТФ-обменивающим фактором eIF2B (Asano et al., 1999), а также с мРНК (Laurino et al., 1999). Кроме того, β-субъединица eIF2 имеет дополнительные аминокислотные остатки на C-конце (примерно 15 а. о.). В отличие от архейного фактора aIF2 γ-субъединица эукариотического фактора содержит дополнительный N-концевой участок, длина которого варьирует в зависимости от организма (до 90 а. о.). Было показано, что у дрожжей удаление этого участка eIF2γ не влияет на функционирование фактора, однако введенные в эту область точечные мутации вызывают замедление скорости роста клеток (Erickson et al., 1997). 22 S. solfataricus aIF2α S. cerevisiae eIF2α S. solfataricus aIF2β полилизиновые блоки S. cerevisiae eIF2β S. solfataricus aIF2γ S. cerevisiae eIF2γ Рис. 5. Схема первичных структур субъединиц e/aIF2. Здесь и далее домены α-субъединицы e/aIF2 обозначены арабскими цифрами: 1, 2 и 3, чтобы отличать их от доменов γ-субъединицы: I, II и III. N – N-концевая α-спираль aIF2β, C – С-концевой домен aIF2β. γ-Субъединица e/aIF2 является ГТФ-связывающим белком. Наличие ГТФ обязательно для того, чтобы фактор мог связать Met-тРНКi и образовать стабильный тройственный комплекс e/aIF2•ГТФ•Met-тРНКi (Levin et al., 1973; Schreier and Staehelin, 1973; Kapp and Lorsch, 2004; Yatime et al., 2004; Pedullà et al., 2005). В этом заключается существенное отличие фактора инициации трансляции 2 эукариотического типа от бактериального фактора IF2, который может связывать инициаторную тРНК и без участия ГТФ (Petersen et al., 1979), но не образует стабильного комплекса с инициаторной тРНК в отсутствии рибосомы (Miller and Wahba, 1973). В архейных и эукариотических клетках инициаторная метионил-тРНК в отличие от бактериальной не формилируется (Housman et al., 1970; White and Bayley, 1972) и защищена от спонтанного деаминоацилирования, когда находится в комплексе с e/aIF2 (Yatime et al., 2004). В экспериментах с использованием инициаторной тРНК, аминоацилированной чужой аминокислотой, было установлено, что фактор e/aIF2 специфически узнает остаток метионина на 3’-конце тРНКi (Wagner et al., 1984; Drabkin and Rajbhandary, 1998; Yatime et al., 2004). Кроме того, инициаторная тРНК имеет ряд особенностей, позволяющих фактору e/aIF2 дискриминировать элонгаторные тРНК (Рис. 6). Известно, что все инициаторные тРНК на конце антикодоновой шпильки содержат три последовательно расположенные G-C пары. В отличие от инициаторных тРНК бактерий 5’-концевой нуклеотидный остаток архейных и эукариотических тРНК i, как и во всех элонгаторных тРНК, обязательно спарен с нуклеотидным остатком 23 3’-концевого участка. Но в инициаторных тРНК это всегда «слабая» пара A-U, тогда как в элонгаторных тРНК имеет место спаривание G-С. Помимо этого в инициаторных тРНК большинства эукариот и архей в позиции 53-56 находится последовательность GAUC или GUUC вместо универсальной последовательности GTΨC, характерной для элонгаторных тРНК и бактериальных инициаторных тРНК (RajBhandary and Chow, 1995; Marck and Grosjean, 2002). Несмотря на ряд структурных различий в инициаторных тРНК бактерий и архей, архейный фактор aIF2 способен взаимодействовать с бактериальной метионилированной инициаторной тРНК (Met-тРНКf) с тем же сродством, что и с собственной Met-тРНКi (Yatime et al., 2004). (б) (а) E. coli (в) S. cerevisiae S. solfataricus Рис. 6. Схемы вторичных структур инициаторных тРНК из (а) бактерий E. coli, (б) эукариот S. cerevisiae и (в) архей S. solfataricus. Рамками выделены характерные особенности инициаторных тРНК. Функциональные исследования изолированных субъединиц e/аIF2 показали, что изолированная γ-субъединица в комплексе с ГТФ связывает Met-тРНКi значительно слабее, чем в составе полноразмерного фактора (Yatime et al., 2004, 2006; Pedullà et al., 2005). С тем же сродством, что и полный архейный фактор инициации трансляции 2, инициаторную тРНК связывает αγ-димер, а именно γ-субъединица вместе с 3 доменом α-субъединицы (Yatime et al., 2004). В случае эукариотического фактора eIF2 получены противоречивые данные об участии β-субъединицы в связывании Met-тРНКi (Nygard et al., 1980; Das et al., 1982; Flynn et al., 1993), удаление α-субъединицы eIF2 не влияло существенно на образование тройственного комплекса (Nika et al., 2001), а для eIF2 из одноклеточного эукариотического организма Encephalitozoon cuniculi было показано, что α- и β24 субъединицы вносят равный вклад в повышение сродства инициаторной тРНК к eIF2γ (Naveau et al., 2010). Последующие эксперименты с химерным фактором e/aIF2, состоящим из γ-субъединицы aIF2 археи S. solfataricus и α- и β-субъединиц eIF2 эукариот S. cerevisiae, показали, что β-субъединица дрожжевого фактора eIF2 играет важную роль в связывании Met-тРНКf, причем специфические для эукариот N- и C-концевые участки eIF2β необходимы для достижения полноценной способности eIF2 связывать инициаторную тРНК (Naveau et al., 2013). В этих экспериментах α-субъединица эукариотического фактора eIF2 вносила незначительный вклад в повышение сродства aIF2γ к Met-тРНКf, однако при удалении отрицательно заряженного C-концевого участка eIF2α, сродство химерного e/aIF2αγ димера к Met-тРНКf существенно увеличивалось. Повидимому, между архейным и эукариотическим фактором e/aIF2 существуют некоторые различия в организации тройственного комплекса, где главную роль в связывании инициаторной тРНК играет центральная γ-субъединица e/aIF2, тогда как участие периферических субъединиц видоспецифично (Naveau et al., 2010). Сравнительно недавно было установлено, что, несмотря на существующие отличия между aIF2 и eIF2, архейный фактор aIF2 способен связываться с малой субчастицей эукариотической рибосомы и формировать инициаторный комплекс с факторами инициации трансляции эукариот (Dmitriev et al., 2011). С помощью метода тоепринтинга было показано, что в реконструированной из очищенных компонентов системе инициации трансляции млекопитающих aIF2 S. solfataricus способствует правильному размещению инициаторной тРНК в P-участке 40S рибосомной субчастицы и сопровождает полный набор эукариотических факторов в кэп-зависимом сканировании и выборе AUG кодона. Поскольку aIF2 был способен поддерживать сканирование мРНК малой рибосомной субчастицей, авторы предположили, что у архей также возможно существование похожего механизма инициации трансляции. Однако в полученной системе aIF2 ингибировал инициацию 1) ингибирование трансляции происходило на по стадии следующим гидролиза возможным ГТФ, причинам: по-видимому, из-за конформационной несовместимости aIF2 с эукариотической рибосомой и/или отсутствия активатора ГТФазной функции; 2) aIF2 не мог покинуть инициаторный комплекс и тем самым препятствовал присоединению 60S рибосомной субчастицы. У эукариот гидролиз ГТФ связанного с eIF2 осуществляется на малой субчастице рибосомы под действием фактора eIF5 (Chakrabarti and Maitra, 1991), гомолог которого у архей отсутствует (Londei, 2005). О том, как происходит гидролиз ГТФ на aIF2 у архей, известно очень мало. В экспериментах in vitro попытки стимулировать ГТФазную активность aIF2 на 30S субчастице архейной рибосомы не привели к успеху (Pedullà et al., 2005). Было 25 предположено, что в архейных клетках белок, активирующий гидролиз ГТФ на aIF2, еще не обнаружен (Dmitriev et al., 2011). Однако недавние эксперименты in vitro показали, что aIF2 обладает высокой внутренней ГТФазной активностью и способен гидролизовать ГТФ в отсутствии рибосомы (Dubiez et al., 2015). Наблюдаемая константа скорости (kнабл) гидролиза ГТФ на изолированной γ-субъединице aIF2 S. solfataricus составляла 0.38±0.02 мин-1, и присутствие α- и β- субъединиц, а также Met-тРНКi не влияло существенно на скорость гидролиза. Эти значения скорости гидролиза ГТФ на aIF2 были сопоставимы с данными, полученными для эукариотического тройственного комплекса eIF2•ГТФ•Met-тРНКi в присутствии eIF5 (0.42±0.03 мин−1), тогда как в отсутствии eIF5 скорость гидролиза составляла 5×10−4 мин−1 (Algire et al., 2005). Одиночные замены D19A и H97A в aIF2γ понижали скорость гидролиза ГТФ в 8.5 и 17.5 раз, соответственно; в случае двойной замены D19A/H97A скорость гидролиза понизилась более чем в 50 раз (Dubiez et al., 2015). Полученные в этой работе структурные данные позволили объяснить, как гидролиз ГТФ на aIF2 может происходить в отсутствии активатора ГТФазной активности. В структуре aIF2γ помимо иона магния, стабилизирующего фосфатную группу ГТФ, был обнаружен дополнительный ион магния, связанный с Asp19, который, по-видимому, может играть роль, аналогичную роли каталитического остатка аргинина eIF5 (Arg15 в eIF5 S. cerevisiae), участвующего в активации ГТФазной активности eIF2 (Das et al., 2001; Paulin et al., 2001; Algire et al., 2005). Тем не менее, авторы не исключают возможность воздействия других участников инициации трансляции на ГТФазную активность aIF2. Кроме того, неясным остается вопрос, как процесс гидролиза ГТФ и последующее освобождение неорганического фосфата регулируются на рибосоме и сопряжены с установлением кодон-антикодонового взаимодействия у архей. После гидролиза ГТФ фактор e/aIF2 в ГДФ-связанной форме покидает инициаторный комплекс и для повторного связывания Met-тРНКi должен быть регенерирован до e/aIF2•ГТФ. Эукариотический фактор eIF2 имеет большее сродство к ГДФ (Kd ≈ 3.0×10–8 М), чем к ГТФ (Kd ≈ 2.5×10–6 М) (Walton and Gill, 1975), и для функционирования ему необходим ГДФ/ГТФ-обменивающий фактор eIF2B (Panniers and Henshaw, 1983; Konieczny and Safer, 1983), состоящий из пяти субъединиц. Субъединицы α, β и δ eIF2B образуют регуляторный субкомплекс, ответственный за связывание eIF2; γ- и ε-субъединицы eIF2B образуют каталитический субкомплекс, где γ-субъединица стимулирует активность ε-субъединицы, которая осуществляет катализ ГДФ/ГТФ обмена на eIF2 (Pavitt et al., 1998). У архей на сегодняшний день не обнаружено гомологов eIF2Bγε и только у некоторых видов архей найдены гомологи регуляторных субъединиц 26 eIF2B (aIF2Bαβδ) (Bult et al., 1996; Kyrpides and Woese, 1998b; Dev et al., 2009). Кроме того, у β-субъединицы архейного фактора aIF2 отсутствует N-концевая часть, которая у eIF2β участвует во взаимодействии с eIF2Bε (Asano et al., 1999). На основании этих данных, а также с учетом того, что γ-субъединица aIF2 в отличие от eIF2γ имеет одинаковое сродство к ГТФ (Kd ≈ 4.8×10–7 М) и ГДФ (Kd ≈ 4.0×10–7 М) (Pedullà et al., 2005), было предположено, что у архей обмен ГДФ на ГТФ в комплексе aIF2•ГДФ происходит самопроизвольно (за счет более высокой концентрации ГТФ в клетке). Высокая скорость обмена нуклеотидов ГДФ и ГТФ на aIF2γ также свидетельствует в пользу этого предположения (Pedullà et al., 2005). Известно, что в клетках эукариот eIF2B является важным звеном механизма тотального контроля скорости трансляции, поскольку регулирует доступность ГТФ-связаной формы eIF2 на стадии инициации. В условиях стресса (аминокислотное голодание, проникновение вируса, присутствие несвернутых белков, дефицит гема) в клетке активируется ряд сериновых киназ (GCN2, PKR, PERK, HCR, соответственно), которые фосфорилируют α-субъединицу eIF2 по остатку Ser51, и фосфорилированный eIF2 прочно связывает ГДФ/ГТФ-обменивающий фактор eIF2B. В результате освобождающийся после инициации eIF2•ГДФ не может быть регенерирован до eIF2•ГТФ, что существенно ингибирует биосинтез белка на стадии инициации (см. обзор Merrick, 1992). Остаток Ser51 консервативен среди α-субъединиц эукариотического, но не архейного фактора e/aIF2. Тем не менее, в архее P. horikoshii был обнаружен гомолог эукариотической киназы PKR – киназа Ph0512p, которая специфически фосфорилировала Ser48 α-субъединицы aIF2 (Tahara et al., 2004). Пространственно Ser48 в молекуле aIF2α занимает то же место, в котором расположен Ser51 в α-субъединице эукариотического фактора eIF2. Потенциальная возможность фосфорилирования aIF2α может указывать на существование регуляторного механизма биосинтеза белка и у архей. При исследовании возможного участия существующих у архей α- β- и δ- субъединиц фактора aIF2B в регуляторном механизме было показано, что aIF2Bαβδ из P. horikoshii, P. furiosus и Thermococcus acidophilum способен in vitro образовывать комплекс с aIF2α из того же организма (Dev et al., 2009). С другой стороны, в отличие от эукариотического eIF2B, который связывает только фосфорилированную α-субъединицу eIF2, архейный фактор aIF2Bαβδ специфически связывал α-субъединицу эукариотического фактора eIF2 независимо от того, фосфорилирована она или нет. По-видимому, у архей, в отличие от эукариот, регуляция биосинтеза белка не происходит за счет связывания aIF2B фосфорилированной α-субъединицей aIF2. 27 В 2008 году была обнаружена дополнительная функция γ-субъединицы архейного фактора aIF2 S. solfataricus (Hasenöhrl et al., 2008). Оказалось, что aIF2γ может связывать мРНК, на 5’-конце которых находится 5’-трифосфат, и защищать эти мРНК от 5’-3’ направленной деградации. При этом присутствие ГТФ или ГДФ не влияло на связывание мРНК. Измерение констант связывания aIF2 с мРНК показало существование стабильного комплекса (Kd ≈ 1.0×10–8 М), формирование которого может препятствовать связыванию aIF2•ГТФ с Met-тРНКi. Что определяет выбор aIF2 связывать Met-тРНКi или мРНК, пока неизвестно. Авторы предположили, что в клетке aIF2 взаимодействует с инициаторной тРНК и доставляет ее к малой рибосомной субчастице, выполняя, таким образом, свою основную функцию. В условиях стресса, когда синтез рибосом заметно снижен, свободный aIF2 начинает предпочтительно связывать мРНК и переходит к выполнению своей дополнительной функции – защите мРНК от деградации (Hasenöhrl et al., 2008). Позднее в этой же лаборатории был идентифицирован белок Sso2509, который в экспериментах in vitro непосредственно взаимодействовал с γ-субъединицей aIF2 и способствовал диссоциации комплекса aIF2•мРНК (Märtens et al., 2014). Sso2509 мог быть обнаружен только в клетках, восстановленных после аминокислотного голодания. В этих условиях в клетках, лишенных гена белка Sso2509, наблюдалось общее снижение уровня синтеза белка, по сравнению с клетками дикого типа. На основании полученных данных было предположено, что Sso2509 необходим для ускорения возобновления синтеза белка после стресса, в связи с чем его назвали фактором восстановления трансляции Trf (translation recovery factor) (Märtens et al., 2014). Известно, что в посадке тройственного комплекса e/aIF2•ГТФ•Met-тРНКi на малую рибосомную субчастицу участвуют факторы e/aIF1 и e/aIF1A (Algire et al., 2002; Hasenöhrl et al., 2009). При изучении механизма инициации трансляции у архей было показано, что сродство Met-тРНКf к комплексу 30S•aIF2•ГТФ•aIF1•aIF1A S. solfataricus (Kd ≈ 4.0×10–9М) выше, чем к aIF2•ГТФ (Kd ≈ 1.5×10–7 М) (Hasenöhrl et al., 2009). Это позволило предположить, что у архей, подобно бактериям, инициаторная тРНК непосредственно взаимодействует с малой рибосомной субчастицей в присутствии факторов инициации трансляции, а не поступает в комплексе с aIF2•ГТФ. Однако в других работах сообщалось о более высоком сродстве Met-тРНКf к aIF2•ГТФ из S. solfataricus (Kd ≈ 1.5×10–9 М) (Yatime et al., 2006; Schmitt et al., 2012) и о существовании в растворе стабильного тройственного комплекса aIF2•ГТФ•Met-тРНКi (Yatime et al., 2004; Pedullà et al., 2005). Таким образом, последовательность событий образования архейного преинициаторного комплекса до сих пор остается малоизученной, но не исключает возможность существования альтернативных путей. 28 В настоящее время механизм функционирования e/aIF2 лучше изучен для эукариотического фактора, но структурные исследования проводились главным образом на архейном факторе aIF2 (Табл. 5). Так если для эукариотического фактора eIF2 определены структуры только α-субъединицы (Nonato et al., 2002; Dhaliwal and Hoffman, 2003; Ito et al., 2004; Dar et al., 2005; Hussain et al., 2014), то для архейного фактора aIF2 известны структуры каждой изолированной субъединицы (Schmitt et al., 2002; Cho and Hoffman, 2002; Gutiérrez et al., 2004; Roll-Mecak et al., 2004; Yatime et al., 2005; Vasile et al., 2007; Nikonov et al., 2007; Dubiez et al., 2015), его αγ- и βγ-димеров (Yatime et al., 2006; Sokabe et al., 2006), неполного гетеротримера (Yatime et al., 2007), а также полноразмерного aIF2 (Stolboushkina et al., 2008). Таблица 5. Результаты структурных исследований e/aIF2. Название белка и источника Предел разрешения, Å Номер в PDB банке H. sapiens eIF2αдомены 1-2 eIF2α (A27Q,L46H,V71K, Δ302-314) 1.9 ЯМР 1KL9 1Q8K Nonato et al., 2002 Ito et al., 2004 S. cerevisiae eIF2αдомены 1-2 eIF2αдомены 1-2•PKR киназа1-284 eIF2αдомены 1-2•PKR киназа1-284 •ADPNP-Mg2+ 2.86 2.8 2.5 1Q46 2A1A 2A19 Dhaliwal and Hoffman, 2003 Dar et al., 2005 P. abyssi aIF2αдомены 2-3 aIF2α 2.26 3.37 1YZ7 1YZ6 Yatime et al., 2005 P. horikoshii OT3 aIF2α•aDim2p•16SрРНК 2.8 3AEV Jia et al., 2010 M. jannaschii aIF2βцентральный домен aIF2βС-концевой домен ЯМР ЯМР 1K8B 1K81 Cho and Hoffman, 2002 Methanobacterium thermoautotrophicum aIF2β ЯМР 1NEE Gutiérrez et al., 2004 S. solfataricus aIF2β ЯМР 2NXU Vasile et al., 2007 P. abyssi aIF2γ aIF2γ(G235D) aIF2γ•ГДФ-Mg2+ aIF2γ(G235D)•ГДФ-Mg2+ aIF2γ(G235D)•GDPNP-Mg2+ 1.95 1.85 1.9 2.1 1.8 1KK0 1KJZ 1KK3 1KK2 1KK1 Schmitt et al., 2002 29 Ссылка Таблица 5. Продолжение. M. jannaschii aIF2γ 2.4 1S0U Roll-Mecak et al., 2004 S. solfataricus aIF2γ aIF2γ•GDPNP•ГДФ aIF2γ•GDPCP aIF2γ•GDPNP aIF2γ•ГДФ aIF2γ(D19A)•ГТФ aIF2γ(D19A)•GDPNP aIF2γ(D19A)•ГДФ aIF2γ(H97A)•ГТФ-2Mg2+ aIF2γ(H97A)•GDPNP aIF2γ(H97A)•ГДФ-Фн 2.9 2.65 2.5 1.3 1.94 1.65 1.43 1.71 1.5 1.58 1.69 2PLF 2PMD 3I1F 4RD4 4RD6 4RCY 4RCZ 4RD0 4RD1 4RD2 4RD3 Nikonov et al., 2007 S. solfataricus aIF2αγ•GDPNP-Mg2+ 3.0 2AHO Yatime et al., 2006 P. furiosus aIF2βγ (G236D) aIF2βγ (G236D)•ГДФ-Mg2+ 2.8 3.4 2D74 2DCU Sokabe et al., 2006 S. solfataricus aIF2αдомен3βα1-спиральγ•ГДФ-Mg2+ aIF2αдомен3βγ•ГДФ-Фн 2.15 3.2 2QN6 2QMU Yatime et al., 2007 S. solfataricus aIF2αβγ 2.8 3CW2 Stolboushkina et al., 2008 5.0 3V11 Schmitt et al., 2012 4.0 3J81 Hussain et al., 2014 15.0 3JAQ, 3JAP S. solfataricus aIF2αβα1-спиральγ•GDPNP•MetтРНКf S. cerevisiae eIF2α•Met-тРНКi в составе 40S•eIF1•eIF1A•eIF2•GDPCP• Met-тРНКi•мРНК eIF2•GDPCP•Met-тРНКi в составе 40S•eIF1•eIF1A•eIF2• GDPCP•Met-тРНКi•eIF3•мРНК Столбоушкина, 2009 Dubiez et al., 2015 Llácer et al., 2015 Общими очертаниями молекула aIF2 S. solfataricus напоминает латинскую букву «L», длинное плечо которой образовано α-субъединицей, короткое – β-субъединицей, а угол – γ-субъединицей (Рис. 7). 30 D1 aIF2α N D2 D3 C II Switch 1 aIF2γ III N C С-концевой домен C Switch 2 I(G) N N-концевая спираль центральный домен aIF2β Рис. 7. Схематическое изображение кристаллической структуры aIF2 S. solfataricus (PDB код 3CW2). Оранжевым, зеленым и серым цветом обозначены α-, β- и γ-субъединицы aIF2, соответственно. В синий и красный цвета окрашены петли-переключатели switch 1 и switch 2, соответственно. Домены α-субъединицы e/aIF2 обозначены D1, D2 и D3, домены γ-субъединицы – римскими цифрами. α-Субъединица aIF2 состоит из трех доменов. Домены 1 (ОВ-укладка) и 2 (пучок из пяти α-спиралей) представляют собой компактную «жесткую» структуру, подвижно связанную с доменом 3 (топология βαββαβ), который образует контакты с γ-субъединицей aIF2. β-Субъединица aIF2 содержит неупорядоченную N-концевую часть, которая приобретает конформацию α-спирали при взаимодействии с γ-субъединицей и служит «якорем» при формировании aIF2βγ димера (Sokabe et al., 2006; Yatime et al., 2007; Stolboushkina et al., 2008). N-концевая α-спираль aIF2β гибкой перемычкой связана с центральным доменом (четырехтяжевой антипараллельный β-лист, по одну сторону от которого располагаются три α-спирали, топология ββααββα), который в свою очередь соединен с С-концевым доменом (трехтяжевой антипараллельный β-лист) длинной α-спиралью. Было показано, что С-концевой домен aIF2β может контактировать с γ-субъединицей aIF2 (Yatime et al., 2007; Stolboushkina et al., 2008). С-концевой, или цинксвязывающий домен aIF2β содержит высококонсервативный и функционально важный мотив, состоящий из двух СХXС единиц, разделенных 17 или 19 а. о, где X – остаток 31 любой аминокислоты. Две пары остатков цистеина этого мотива координируют атом цинка, который необходим для поддержания пространственной структуры С-концевого домена (Cho and Hoffman, 2002; Gutiérrez et al., 2002). Мутации в этом мотиве приводят к существенным нарушениям в работе эукариотического фактора eIF2 (Donahue et al., 1988; Castilho-Valavicius et al., 1992; Huang et al., 1997). Предполагается участие цинксвязывающего домена β-субъединицы eIF2 во взаимодействии с мРНК (Castilho-Valavicius et al., 1992; Laurino et al., 1999). Центральная γ-субъединица состоит из трех доменов. Домен I, или G домен (шеститяжевой β-лист, окруженный пятью α-спиралями, топология βαββαβαβαβα), содержит нуклеотид-связывающий сайт, характерный для белков семейства рибосомозависимых ГТФаз (Leipe et al., 2002), куда также относятся факторы трансляции IF2 (e/aIF5B), EF-Tu (e/aEF1A), SELB, EF-G (e/aEF2) и RF3 (eRF3). Для белков этого семейства (G-белков) характерно наличие ГТФ-связывающего домена (G-домена), содержащего консервативные мотивы DXXG, NKXD, GSA(L/K), GXXXXGK(T/S), необходимые для связывания нуклеотида и иона магния, и функционально важные петлипереключатели, называемые switch 1 и switch 2. Особенностью I(G) домена γ-субъединицы e/aIF2 является наличие «цинкового пальца», образующего выступ, в котором четыре остатка цистеина координируют ион цинка (Schmitt et al., 2002). Было показано, что структура этого выступа при отсутствии иона цинка остается неизменной (Yatime et al., 2007). Домены II и III aIF2γ представляют собой β-цилиндры (состоящие из девяти и пяти антипараллельных β-тяжей, соответственно) и образуют единый структурный блок, который связан с I(G) доменом гибкой перемычкой. В ходе структурных исследований γ-субъединицы aIF2 между доменами I(G) и II был обнаружен дополнительный ГТФ-связывающий сайт, образованный консервативными аминокислотными остатками, часть из которых способна формировать сеть водородных связей с нуклеотидом (Nikonov et al., 2007). Наложение всех известных структур субъединиц aIF2 на структуру гетеротримера позволило заключить, что молекула aIF2 состоит из «жесткой» части, содержащей γ-субъединицу, 3 домен α-субъединицы и N-концевую α-спираль β-субъединицы и двух подвижных «крыльев», образованных 1 и 2 доменами α-субъединицы и центральным и С-концевым доменами β-субъединицы. Вероятно, высокая конформационная подвижность в α- и β-субъединицах aIF2 позволяет фактору менять свое сродство к лигандам и переходить из одного состояния в другое, что необходимо для его функционирования (Stolboushkina et al., 2008). 32 Из структурных исследований aIF2 также стоит отметить кристаллическую структуру комплекса α-субъединицы aIF2 (1 и 2 домены) с архейным белком aDim2p и 11-нуклеотидным фрагментом 16S рРНК (Jia et al., 2010). Гомолог aDim2p у эукариот (Dim2p) является фактором процессинга, который участвует в созревании 18S рРНК. В работе Джиа и др. (2010) было показано, что aDim2p с одной стороны образует прочный комплекс с 3’-концевым участком 16S рРНК в области последовательности анти-ШайнаДальгарно, а с другой стороны способен взаимодействовать с α-субъединицей или с полноразмерным фактором aIF2 независимо от присутствия рРНК. При этом ни β-, ни γсубъединицы aIF2 не взаимодействуют с aDim2p. Несмотря на образование стабильного комплекса aDim2p с aIF2, его биологическое значение пока остается неизвестным. Была выдвинута гипотеза, что в клетках эукариот и архей Dim2p обладает многочисленными функциями, в ходе выполнения которых может взаимодействовать с разными белками. Структура aIF2γ очень похожа на структуру бактериального фактора элонгации трансляции EF-Tu (EF1A) (Berchtold et al., 1993; Nissen et al., 1995; Polekhina et al., 1996) и его архейного (aEF1A) (Vitagliano et al., 2001) и эукариотического (eEF1A) (Andersen et al., 2000, 2001) гомологов, которые в комплексе с ГТФ доставляют элонгаторную аминоацилтРНК в A-участок рибосомы. Известно, что в структуре EF-Tu наблюдаются значительные конформационные перестройки при связывании ГТФ или ГДФ, которые соответствуют активной – «закрытой» конформации и неактивной – «открытой» (Kjeldgaard and Nyborg, 1992; Kjeldgaard et al., 1993; Berchtold et al., 1993). В γ-субъединице aIF2 такие значительные перестройки отсутствуют, и во всех состояниях конформация белка близка к активной – «закрытой» конформации, когда все три домена пространственно сближены друг с другом (Рис. 8) (Schmitt et al., 2002; Roll-Mecak et al., 2004; Sokabe et al., 2006; Nikonov et al., 2007; Yatime et al., 2006, 2007; Stolboushkina et al., 2008). 33 aIF2γ•ГТФ EF-Tu•ГТФ I(G) Switch 2 Switch 1 III aIF2γ II EF-Tu•ГДФ aIF2γ•ГДФ Рис. 8. Сравнение пространственных структур aIF2γ S. solfataricus без нуклеотида, в комплексе с ГТФ и ГДФ (PDB коды 2PLF, 2AHO, 2PMD, соответственно) со структурами EF-Tu Thermus thermophilus в комплексе с ГТФ (PDB код 1EXM) и EF-Tu T. aquaticus в комплексе с ГДФ (PDB код 1TUI). В зеленый и сиреневый цвета окрашены ГТФ и ГДФ, соответственно; синим и красным цветом изображены петли switch 1 и switch 2, соответственно. Римскими цифрами обозначены домены aIF2γ. Долгое время считалось, что характерной особенностью активного «ON» и неактивного «OFF» состояний рибосомозависимых ГТФаз является существование специфических конформаций петель-переключателей switch 1 и switch 2. Так в EF-Tu гидролиз ГТФ индуцирует переключение петель switch 1 и switch 2 из конформации ON в конформацию OFF, что является причиной существенных структурных изменений в белке, приводящих к разрушению участка связывания аминоацил-тРНК (Polekhina et al., 1996). Сравнительный анализ всех известных структур γ-субъединицы aIF2 изолированной и в комплексе с другими субъединицами, а также в свободном и связанном с нуклеотидом состояниях показал, что switch участки белка во всех структурах занимают приблизительно одинаковые положения, и их конформации равномерно распределены между двумя крайними состояниями ON и OFF switch участков EF-Tu (Nikonov et al., 2007; Stolboushkina et al., 2008). Стоит отметить, что в структуре неполного гетеротримерного фактора aIF2 (Yatime et al., 2007) в γ-субъединице, связанной с ГДФ, 34 наблюдалось ON положение switch 2, а петля switch 1 принимала конформацию не характерную для ON и OFF состояний. Было предположено, что в полученной структуре switch участки принимают конформации, соответствующие состоянию aIF2γ непосредственно после гидролиза ГТФ, когда неорганический фосфат (Фн) еще остается связанным с белком. Позднее с помощью молекулярной динамики были рассчитаны изменения свободной энергии возможных переходов из ON:ГТФ в OFF:ГДФ состояние aIF2γ и показано, что белок с промежуточной ON/OFF конформацией switch участков действительно может являться функциональным интермедиатом (Satpati and Simonson, 2012). На основании кристаллических структур фактора EF-Tu в комплексе с Phe-тРНКPhe и нерасщепляемым аналогом ГТФ (GDPNP) (Nissen et al., 1995, 1999), а также структур -димера (Yatime et al., 2006) и -субъединицы aIF2 (Schmitt et al., 2002; Nikonov et al., 2007) были предложены две модели тройственных комплексов aIF2 с ГТФ и инициаторной тРНК, которые в дальнейшем не подтвердились. Кристаллические структуры двух тройственных комплексов (полноразмерного – aIF2αβγ•GDPNP•MetтРНКf и неполноразмерного – aIF2αD3γ•GDPNP•Met-тРНКf) были определены французской (Schmitt et al., 2012) и нашей группами (Stolboushkina et al., 2013), соответственно. Эти данные будут подробно описаны в результатах данной диссертационной работы. Другим важным направлением в изучении свойств e/aIF2 является исследование расположения тройственного комплекса e/aIF2•ГТФ•Met-тРНКi на малой рибосомной субчастице. Методом фотоактивируемого ковалентного связывания было зафиксировано ковалентное присоединение α- и γ-субъединиц eIF2 к 18S рРНК (Westermann et al., 1980). С помощью электронной микроскопии с использованием антител к субъединицам eIF2, было показано расположение eIF2 в районе «шеи» малой рибосомной субчастицы со стороны, контактирующей с большой субчастицей (Bommer et al., 1988). Согласно данным химического пробинга в 48S преинициаторном комплексе S. cerevisiae домен III eIF2γ располагается вблизи A1655-A1671 и U1735-A1750 н. о. спирали h44 18S рРНК (Shin et al., 2011a). Кроме того, в составе 48S комплекса в результате фотоактивируемого ковалентного связывания были получены сшивки eIF2α с нуклеотидным остатком в положении -3 относительно стартового кодона мРНК (Pisarev et al., 2006). С использованием метода белок-белковых сшивок и последующей идентификации сшитых продуктов с помощью иммуноблотинга и масс-спектрометрии было показано взаимодействие 1 домена eIF2α с белком S5 (uS7 согласно номенклатуре Ban et al., 2014) (Sharifulin et al., 2013). 35 В последние годы с помощью крио-электронной микроскопии были получены модели 43S преинициаторного комплекса млекопитающих (с разрешением 11.6 Å и содержащего 40S, eIF1, eIF1A, eIF2•GTP•Met-тРНКi и eIF3) (Hashem et al., 2013), и 48S преинициаторного комплекса дрожжей (с разрешением 4.0 Å и содержащего 40S, eIF1, eIF1A, eIF2•GTP•Met-тРНКi и мРНК) (Hussain et al., 2014), в которые авторы вписали структуру полноразмерного архейного тройственного комплекса aIF2•GDPNP•Met-тРНКf (Schmitt et al., 2012) (Рис. 9а). Анализ полученных моделей показал, что фактор инициации трансляции 2 связан с малой рибосомной субчастицей посредством α-субъединицы, причем расположение 1 и 2 доменов этой субъединицы отличается от их расположения в структуре изолированного архейного тройственного комплекса (Schmitt et al., 2012). В составе преинициаторных комплексов эти домены повернуты на 45 градусов к «платформе» и смещены на 15 Å в направлении «шеи» 40S рибосомной субчастицы так, что 1 домен eIF2α располагается вблизи рибосомного белка S5. Было показано, что в такой ориентации eIF2α находится вблизи E-участка малой рибосомной субчастицы, а в присутствии мРНК – непосредственно в E-участке, где структурно имитирует молекулу тРНК. При этом 1 домен eIF2α контактирует с нуклеотидными остатками мРНК в положении -2 и -3, 2 домен взаимодействует с D- и T-петлями инициаторной тРНК, а 3 домен – с акцепторным черешком тРНКi и γ-субъединицей eIF2. Согласно модели 43S преинициаторного комплекса, eIF2γ находится на расстоянии 34 Å от спирали h44 18S рРНК; однако авторам не удалось вписать β-субъединицу eIF2 ввиду отсутствия соответствующей электронной плотности (Hashem et al., 2013). Структура 48S преинициаторного комплекса (Hussain et al., 2014) была определена с разрешением 4.0 Å, но разрешение ухудшалось с увеличением расстояния от малой рибосомной субчастицы, по-видимому, из-за увеличения подвижности элементов на периферии комплекса, в связи с чем построить модель для γ-субъединицы eIF2 в составе преинициаторного комплекса не удалось. Кроме того, в структуре отсутствовала интерпретируемая электронная плотность для eIF2β (Hussain et al., 2014). Совсем недавно были опубликованы модели дрожжевого 48S преинициаторного комплекса, находящегося в «открытом» и «закрытом» состояниях (до и после узнавания инициаторного кодона антикодоном тРНКi, соответственно) и содержащего 40S, eIF1, eIF1A, eIF2•GTP•Met-тРНКi, eIF3 и мРНК (Llácer et al., 2015). В этой работе авторам удалось построить модель только части eIF2β, за исключением неструктурированных N-концевых 1-125 а. о. и последних двадцати C-концевых остатков белка, т.е. только той части eIF2β, которая соответствует β-субъединице архейного фактора aIF2. Анализ полученных моделей показал, что eIF2β напрямую не контактирует с 40S субчастицей. 36 N-концевая α-спираль eIF2β прочно связана с eIF2γ, а центральный домен β-субъединицы взаимодействует с eIF1, eIF1A и тРНКi (Рис. 9б). Необходимо отметить, что в полученных моделях структура тройственного комплекса была определена только с низким разрешением, 15 Å, и для интерпретации электронной плотности были использованы структуры субъединиц архейного фактора aIF2. Таким образом, несмотря на значительные успехи в построении моделей эукариотического преинициаторного комплекса, их анализ не вносит ясность в структурную организацию e/aIF2•ГТФ•Met-тРНКi. (а) головка тРНКi eIF2α мРНК eIF2γ eIF1A (N-концевая спираль) eIF1 тело h44 (б) eIF2γ мРНК 180° тРНКi Рис. 9. (а) Модель эукариотического 48S преинициаторного комплекса, полученная с помощью криоэлектронной микроскопии. Рисунок с небольшими изменениями взят из Hussain et al., 2014. (б) Взаимное расположение eIF1, eIF1A, eIF2, тРНКi и мРНК в 48S комплексе. Рисунок с небольшими изменениями взят из Llácer et al., 2015. 37 2.4. aIF5B Универсальный фактор инициации трансляции e(a)IF5B/IF2 обнаружен во всех доменах жизни: у бактерий это IF2, а у эукариот и архей он обозначается как e/aIF5B. Бактериальный фактор IF2 в процессе инициации трансляции выполняет две функции. Аналогично e/aIF2, фактор IF2 способствует связыванию инициаторной тРНК с малой рибосомной субчастицей, не влияя на связывание других тРНК. Согласно кинетическим исследованиям IF2 в комплексе с ГТФ сначала взаимодействует с малой рибосомной субчастицей, а затем связывает fMet-тРНКf, где ГТФ служит эффектором, придающим IF2 повышенное сродство к 30S субчастице (Dubnoff et al., 1972; Mazumder, 1972; Antoun et al., 2006; Milon et al., 2010). В отсутствии рибосомы комплекс IF2 с fMetтРНКf является нестабильным (Miller and Wahba, 1973). Второй функцией IF2 является катализ присоединения 50S субчастицы к инициаторному 30S комплексу с образованием 70S комплекса. Связанный с ГТФ, fMet-тРНКf и с 30S рибосомной субчастицей фактор IF2 взаимодействует с 50S субчастицей, что приводит к активации гидролиза ГТФ, и комплекс IF2•ГДФ покидает рибосому (Dubnoff et al., 1972; Godefroy-Colburn et al., 1975). Фактор e/aIF5B был впервые обнаружен в дрожжах S. cerevisiae (Choi et al., 1998) и впоследствии найден у других эукариот (Lee et al., 1999; Wilson et al., 1999; Carrera et al., 2000) и архей (Lee et al., 1999). Первоначально считалось, что подобно IF2 в клетках эукариот и архей e/aIF5B стимулирует связывание инициаторной тРНК с малой рибосомной субчастицей и более того, катализирует образование первой пептидной связи (Choi et al., 1998). Было сделано предположение, что e/aIF5B связывается с А-участком рибосомы, имитируя тРНК частью своей молекулы, и таким образом, направляет инициаторную тРНК в вакантный Р-участок (Lee et al., 1999). Однако позднее было показано, что аналогично IF2 фактор e/aIF5B необходим только для быстрой ассоциации субчастиц в активную транслирующую рибосому (Pestova et al., 2000). Как и в случае IF2, взаимодействие e/aIF5B с рибосомными субчастицами происходит в ГТФ-связанной форме. Объединение субчастиц стимулирует ГТФазную активность фактора, в результате чего e/aIF5B теряет сродство к рибосоме. Считается, что дальнейший обмен ГДФ на ГТФ в комплексе e/aIF5В•ГДФ происходит самопроизвольно (Pestova et al., 2000). Результаты исследований in vitro архейного фактора aIF5B S. solfataricus подтвердили, что aIF5B является рибосомо-зависимой ГТФазой, которая взаимодействует с 30S и 50S субчастицами, так и с целой рибосомой даже в отсутствии других факторов инициации трансляции и инициаторной тРНК. Кроме того было показано, что aIF5B усиливает 38 трансляцию как лидерсодержащих, так и безлидерных мРНК в бесклеточной системе трансляции (Maone et al., 2007). Универсальный фактор e(a)IF5B/IF2 – многодоменный мономерный белок. Бактериальный фактор IF2 имеет молекулярную массу 60-100 кДа. В его аминокислотной последовательности выделяют низкоконсервативную N-концевую область, которая у IF2 E. coli состоит из доменов I-III, и высококонсервативную C-концевую область, включающую IV-VI домены (Рис. 10) (Steffensen et al., 1997). IV(G) домен содержит ГТФ/ГДФ связывающий сайт. VI домен делят дополнительно на домены VI-1 (C1) и VI-2 (C2). Установлено, что изолированный VI-2 домен связывает инициаторную тРНК с тем же сродством (Kd ≈ 9×10–7 М), что и полноразмерный фактор IF2 (Spurio et al., 2000). В экспериментах с использованием модифицированных препаратов fMet-тРНКf, а также с помощью сайт-направленного мутагенеза IF2 и ЯМР спектроскопии было показано, что субстратом VI-2 домена IF2 является формилированная α-NH2-группа fMet-тРНКf, благодаря узнаванию которой IF2 отличает fMet-тРНКf от неформилированной Met-тРНКf и деацилированной тРНКf (Sundari et al., 1976; Guenneugues et al., 2000). Среди различных видов бактерий N-концевая часть IF2 может содержать повторы (Simonetti et al., 2013a) и сильно варьировать по содержанию аминокислотной последовательности и длине. Кроме того, наблюдается внутривидовое разнообразие форм фактора. Так в клетках E. coli IF2 существует в виде трех функционально активных изоформ: полноразмерного белка и двух укороченных с N-конца форм (Nyengaard et al., 1991). Разнообразие в N-концевой части IF2, по-видимому, и привело к использованию в литературе различных вариантов обозначений доменов белка (Рис. 10). Эукариотический фактор eIF5B имеет приблизительную молекулярную массу 140175 кДа. Архейный фактор aIF5B (около 70 кДа) укорочен с N-конца на 400-600 а. о. по сравнению с его гомологами IF2 и eIF5B (Рис. 10). Несмотря на это различие, aIF5B может заменять eIF5B in vitro и in vivo (Choi et al., 1998; Lee et al., 1999), а удаление N-концевой части IF2 (Laalami et al., 1991) и eIF5B (Choi et al., 1998) не влияет на жизнеспособность клеток. Характерной особенностью архейного и эукариотического факторов e/aIF5B является наличие на C-конце дополнительного спирального субдомена, состоящего из двух α-спиралей, который отсутствует у бактериального IF2 (Roll-Mecak et al., 2000). На сегодняшний день известны пространственные структуры e(a)IF5B/IF2 из всех трех доменов жизни (Рис. 11, Табл. 6). 39 (1) (2) (3) IF2 (E. coli, 890 а. о.) IF2 (T. thermophilus, 571 а. о.) eIF5B (S. cerevisiae, 1002 а. о.) aIF5B (M. thermoautotrophicum, 594 а. о.) (4) Рис. 10. Схема первичных структур e(a)IF5B/IF2. Приведены встречающиеся в литературе обозначения доменов IF2 (1, 2, 3) и e/aIF5B (4). Фиолетовым цветом на C-конце e/aIF5B отмечен α-спиральный субдомен, отсутствующий в бактериальном IF2. NTD – N-концевой домен; α8, α12 – α-спирали, расположенные между соответствующими доменами. (б) (а) aIF5B (в) eIF5B IF2 Рис. 11. Схематическое изображение пространственных структур e(a)IF5B/IF2 в свободном от нуклеотидов состоянии. (а) Кристаллическая структура aIF5B M. thermoautotrophicum (PDB код 1G7R). (б) Кристаллическая структура eIF5B Chaetomium thermophilum (PDB код 4N3N); в структуре не удалось определить N-концевой участок длиной 516 а. о. (в) Модель структуры полноразмерного IF2 T. thermophilus (PDB код 3J4J); использована нумерация доменов IF2 E. coli. Цветовое обозначение соответствует Рис. 10. 40 Таблица 6. Результаты структурных исследований e(a)IF5B/IF2. Во всех структурах eIF5B отсутствует N-концевой домен, остальные домены обозначены аналогично архейному aIF5B, в случае бактериального фактора IF2 использована нумерация доменов IF2 E. coli. Звездочкой отмечены структуры, находящиеся в базе EM Data Bank. Предел разрешения, Å Номер в PDB банке M. thermoautotrophicum aIF5B aIF5B•ГДФ aIF5B•GDPNP 2.2 2.0 2.0 1G7R 1G7S 1G7T Roll-Mecak et al., 2000 C. thermophilum eIF5Bдомены III – IV eIF5B домены I(G) – IV eIF5Bдомены I(G) – III •ГДФ eIF5Bдомены I(G) – II •ГТФ 3.2 2.75 2.12 1.87 4N3G 4N3N 4NCL 4NCN Kuhle and Ficner, 2014 S. cerevisiae eIF5Bдомены I(G) – III eIF5Bдомены I(G) – III •ГДФ eIF5Bдомены I(G) – III eIF5Bдомены I(G) – IV 1.83 3.02 2.49 2.35 4N3S 4NCF 3WBJ 3WBI Kuhle and Ficner, 2014 E. coli IF2домен N1 ЯМР 1ND9 Laursen et al., 2003 G. stearothermophilus IF2домен VI-1 IF2домен VI-2 IF2домен IV(G) IF2домен IV(G)•ГДФ ЯМР ЯМР ЯМР ЯМР 1Z9B 1D1N 2LKC 2LKD Wienk et al., 2005 Meunier et al., 2000 Wienk et al., 2012 T. thermophilus IF2домены III – V IF2домены III – V•ГДФ IF2домены III – V•ГТФ IF2домены III – VI-1 IF2домены III – VI-1•ГДФ IF2 (модель полноразмерного фактора) 1.95 2.3 2.8 2.8 2.8 11.5 4B3X 4B47 4B48 4KJZ 4KJZ 3J4J Simonetti et al., 2013b S. cerevisiae eIF5Bдомены I(G)-IV• eIF1A143-153а.о 80S•мРНК•eIF5B•GDPCP•Met-тРНКi 3.3 4.3 3WBK 4V8Y Zheng et al., 2014 Fernández et al., 2013 Oryctolagus cuniculus 80S•HCV-IRES•eIF5B•GDPNP• Met-тРНКi 8.6 4UJD Yamamoto et al., 2014 E. coli IF1•IF2•fMet-тРНКf в составе 70S 30S•мРНК•IF1•IF2•ГТФ•IF3•fMetтРНКf 13.8 18.3 1ZO1 EMD-1771* Allen et al., 2005 Julián et al., 2011 8.7 11.5 11.5 11.0 EMD-1523* EMD-2448* EMD-1172* EMD-1173* Simonetti et al., 2008 Simonetti et al., 2013a Myasnikov et al., 2005 Название объекта и источника T. thermophilus 30S•мРНК•IF1•IF2•ГТФ•fMet-тРНКf 30S•IF1•IF2•fMet-тРНКf 70S•мРНК•IF2•GDPCP•fMet-тРНКf 70S•мРНК•IF2•ГДФ•fMet-тРНКf 41 Ссылка Zheng et al., 2014 Eiler et al., 2013 Simonetti et al., 2013a Архейный фактор aIF5B состоит из четырех доменов I(G), II, III и IV, соответствующих IV(G), V, VI-1 и VI-2 доменам IF2. По форме молекула белка aIF5B напоминает бокал, где домены I – III образуют «чашу» и соединены при помощи «ножки» (α12-спирали) с IV доменом, образующим «основание бокала». Домен I (восьмитяжевой β-лист, окруженный семью α-спиралями, топология βαββααββαβααββα) является G доменом и содержит нуклеотид-связывающий сайт, характерный для белков семейства рибосомозависимых ГТФаз. Домен II (β-цилиндр, состоящий из 11 антипараллельных β-тяжей) соединен спиралью α8 с III доменом (четырехтяжевой параллельный β-лист, по обе стороны которого расположены по две α-спирали, топология βαβαβαβα). Спираль α12 длиной 40 Å соединяет III домен с доменом IV (β-цилиндр из восьми антипараллельных β-тяжей, за которым следуют две α-спирали). Пространственная структура aIF5B M. thermoautotrophicum с разрешением 2.0-2.2 Å была определена в трех функциональных состояниях: без нуклеотида и в комплексах с ГДФ и ГТФ (Roll-Mecak et al., 2000). Было обнаружено, что при взаимодействии с ГТФ в области I(G) домена aIF5B «эффекторная» петля – switch 2 существенно меняет свою конформацию. В результате этого происходит поворот II и III доменов на 7-8 градусов, сопряженный со смещением IV домена на расстояние порядка 5 Å (Рис. 12). Рис. 12. Сравнение кристаллических структур aIF5B M. thermoautotrophicum, соответствующих трем функциональным состояниям: без нуклеотида (молекула белка окрашена в серый цвет, PDB код 1G7R), в комплексе с ГДФ (II-IV домены окрашены в голубой цвет, PDB код 1G7S) и в комплексе с нерасщепляемым аналогом ГТФ, GDPNP (II-IV домены окрашены в желтый цвет, PDB код 1G7T). Наложение структур производилось по I(G) домену. Стрелками обозначено направление движения доменов. Овалом выделен участок взаимодействия switch 2 с доменами II и III. Рисунок взят из Kuhle and Ficner, 2014. 42 Конформационные изменения, происходящие при переходе aIF5B из ГТФ-связанной в ГДФ-связанную форму и обратно, были представлены моделью маятника, где спираль α12 является «стрежнем», а IV домен - «грузиком» (Roll-Mecak et al., 2000). Однако данная модель, предполагающая междоменную передачу сигнала о связанном нуклеотиде по механизму «шарнирного рычага» (“articulated lever”), в дальнейших теоретических работах по термодинамике и молекулярной динамике была поставлена под сомнение. С одной стороны опровергалась возможность того, что конформационные изменения, возникающие в I(G) домене aIF5B при связывании нуклеотида, могут вызывать такие удаленные перестройки, как смещение IV домена (Simonson and Satpati, 2012). С другой стороны, было предположено, что все три кристаллические структуры aIF5B, несмотря на присутствие ГТФ в одной из них, представляют неактивную форму белка, а активная форма возможна только при взаимодействии e(a)IF5B/IF2 с рибосомой (механизм «условного переключения», “conditional switching”) (Hauryliuk et al., 2008). Прояснению этого вопроса способствовало определение кристаллических структур эукариотического фактора eIF5B из S. cerevisiae и C. thermophilum в свободном состоянии (Рис. 11б) и в комплексе с ГТФ и ГДФ (Kuhle and Ficner, 2014; Zheng et al., 2014). Взаимная ориентация и топология доменов eIF5B в свободном состоянии соответствуют таковым в структуре архейного фактора aIF5B, несвязанного с нуклеотидом. Было показано, что у эукариот связывание ГТФ c eIF5B индуцирует существенные конформационные изменения двух консервативных switch участков I(G) домена, что сопровождается поворотом II домена относительно I(G) примерно на 30 градусов и разрывом стабильного контакта между доменом III и участком switch 2. В результате конформационные изменения в нуклеотид-связывающем сайте I(G) домена eIF5B приводят к высокой структурной подвижности III и IV доменов. Эти данные совместно с результатами мутагенеза α12 спирали eIF5B (Shin et al., 2011b) свидетельствуют в пользу того, что жесткая организация молекулы e/aIF5B необходима для правильного позиционирования I(G) и IV доменов белка на рибосоме, и приводит к смещению IV домена e/aIF5B в ответ на связывание ГТФ и его гидролиз. По сравнению с архейным и эукариотическим факторами e/aIF5B, поведение бактериального IF2 при связывании нуклеотида существенно отличается. Определение кристаллических структур IF2 T. thermophilus в свободной форме и в комплексе с ГДФ и ГТФ (Рис. 11в, Табл. 6) (Simonetti et al., 2013b; Eiler et al., 2013) позволило заключить, что в IF2 участок switch 2 нуклеотид-связывающего сайта не взаимодействует напрямую с VI-1 доменом (соответствует III домену aIF5B). Из этого следует, что у бактерий информация о 43 нуклеотиде, связанном в IV(G) домене IF2, не может быть передана взаимодействующему с тРНК VI-2 домену белка по механизму «шарнирного рычага» (Eiler et al., 2013). Структурных исследований взаимодействия архейного фактора aIF5B с рибосомой не проводилось. Структурное сходство I(G) и II доменов aIF5B с I(G) и II доменами факторов элонгации EF-Tu и EF-G позволило предположить, что e/aIF5B взаимодействует с рибосомой аналогичным образом (Roll-Mecak et al., 2000). Сравнение аминокислотных последовательностей из e(a)IF5B/IF2 различных эукариотических, архейных и бактериальных организмов показало, что активный сайт G домена и гидрофобные ядра всех четырех доменов архейного фактора aIF5B образованы консервативными аминокислотными остатками, в то время как неконсервативные остатки формируют петли на поверхности белка (Roll-Mecak et al., 2000). Поскольку структуры бактериального и эукариотического гомологов долгое время не удавалось определить, было предположено, что универсальный фактор e(a)IF5B/IF2 имеет общее пространственное строение, и, структура архейного фактора aIF5B была использована для моделирования взаимодействия IF2 и eIF5B с рибосомой. Эксперименты по связыванию укороченных форм и изолированных доменов IF2 с рибосомными субчастицами, метод химического пробинга и криоэлектронная микроскопия позволили построить модель взаимодействия IF2 с рибосомой (Moreno et al., 1999; Marzi et al., 2003; Allen et al., 2005; Myasnikov et al., 2005; Simonetti et al., 2008, 2013a; Julián et al., 2011). Было показано, что IF2 занимает межсубъединичное пространство, при этом IV(G) домен IF2 связывается с 50S субчастицей в районе сарцинрициновой петли и L7/L12-выступа (т.е. с ГТФаза-связывающим центром); домен V (соответствующий домену II aIF5B) взаимодействует с 30S субчастицей и фактором IF1, домен VI-1 контактирует с 50S субчастицей, а VI-2 – с 50S субчастицей и акцепторным черешком инициаторной тРНК. N-концевая часть IF2, отсутствующая у архейного aIF5B, по-видимому, взаимодействует с обеими рибосомными субчастицами. Было установлено, что взаимное расположение доменов IF2 отличается от ориентации доменов в структуре aIF5B (Allen et al., 2005; Simonetti et al., 2008). Данные по малоугловому рассеянию рентгеновских лучей подтвердили существование различий в организации доменов aIF5B M. thermoautotrophicum и соответствующих доменов фактора IF2 E. coli (Rasmussen et al., 2008). На основании кристаллических структур IF2, данных ЯМР-спектроскопии и криоэлектронной микроскопии (Allen et al., 2005; Myasnikov et al., 2005; Simonetti et al., 2008, 2013a, 2013b; Julián et al., 2011; Wienk et al., 2012; Eiler et al., 2013) было установлено, что IF2 имеет подвижную структуру в свободном состоянии и принимает вытянутую конформацию в комплексе с рибосомой. В отличие от IF2 архейный фактор 44 aIF5B, согласно данным по малоугловому рассеянию рентгеновских лучей (Rasmussen et al., 2011), в растворе имеет ту же вытянутую конформацию, что была обнаружена в его кристаллической структуре (Roll-Mecak et al., 2000). Для эукариотического фактора eIF5B методом химического пробинга (Unbehaun et al., 2007) и с помощью криоэлектронной микроскопии (Fernández et al., 2013; Yamamoto et al., 2014) было показано, что общая ориентация eIF5B на рибосоме соответствует ориентации IF2: I(G) домен eIF5B располагается рядом с ГТФаза-связывающим центром 60S субчастицы, домен II взаимодействует с 40S субчастицей, III домен – с обеими субчастицами, а домен IV располагается вблизи пептидил-трансферазного центра 60S субчастицы. Кроме того, было установлено, что при связывании с рибосомой III и IV домены eIF5B изменяют свои конформации, так что IV домен образует контакты с инициаторной тРНК (Рис. 13) (Fernández et al., 2013; Yamamoto et al., 2014). Анализ модели комплекса eIF5B с 80S рибосомой, полученной в двух состояниях, отличающихся поворотом рибосомных субчастиц и конфигурацией инициаторной тРНК, позволил предположить, что eIF5B вызывает переориентацию Met-тРНКi в P-участке рибосомы (Yamamoto et al., 2014). (а) головка (б) (в) тело Рис. 13. (а) Модель структуры комплекса 80S рибосомы S. cerevisiae с eIF5B, инициаторной тРНК и стартовым кодоном мРНК, полученная с помощью криоэлектронной микроскопии. Рибосома представлена со стороны P-выступа. (б) Модель взаимодействия eIF5B с Met-тРНКi на рибосоме. (в) Конформационные изменения в факторе eIF5B, происходящие при его связывании с рибосомой. Рисунки с небольшими изменениями взяты из Fernández et al., 2013. Возможность влияния e/aIF5B на связывание (стабилизацию и/или ориентацию) MetтРНКi с рибосомой не исключалась еще в ранних исследованиях (Choi et al., 1998; Marintchev et al., 2003). Но, несмотря на существенное сходство аминокислотных последовательностей VI-2 домена IF2 и IV домена e/aIF5B (идентичность около 25%), попытки обнаружить комплекс как эукариотического, так и архейного фактора с 45 инициаторной тРНК не привели к успеху (Roll-Mecak et al., 2000; Maone et al., 2007). Исследования химерных белков, полученных путем замены доменов между aIF5B S. solfataricus и IF2 термофильной бактерии G. stearothermophilus показали, что IV домен aIF5B в растворе не образует стабильный комплекс ни с Met-тРНКi, ни с fMet-тРНКi (Maone et al., 2007). Однако в этих экспериментах удаление специфичного для aIF5B спирального C-концевого участка приводило к понижению связывания Met-тРНКi и fMetтРНКi с рибосомой. Это позволило предположить, что спиральный C-концевой участок aIF5B необходим для взаимодействия этого фактора с инициаторной тРНК на рибосоме и ее правильного позиционирования в P-участке в процессе формирования 70S рибосомы. Способность e/aIF5B взаимодействовать с Met-тРНКi на рибосоме согласуется с результатами биохимических исследований, согласно которым eIF5B участвует в формировании инициаторного комплекса на IRES-содержащих мРНК как вирусного, так и клеточного происхождения и, по-видимому, может заменять eIF2, инактивированный фосфорилированием α-субъединицы (Pestova et al., 2008; Terenin et al., 2008; Thakor and Holcik, 2012). Предполагается, что в этих условиях eIF5B служит как для помещения инициаторной тРНК в P-участок рибосомы, так и для объединения рибосомных субчастиц. В случае архей также отмечалась способность aIF5B стимулировать взаимодействие Met-тРНКi с 30S субчастицей даже в отсутствии фактора aIF2 (Maone et al., 2007). Тем не менее, согласно кинетическим исследованиям взаимодействие e/aIF5B с Met-тРНКi в растворе гораздо слабее (Kd ≈ 2×10–6 М для архейного и 4×10–5 М для эукариотического фактора) (Guillon et al., 2005), чем у фактора e/aIF2 (Kd порядка 10-9÷10-8 М) (Kapp and Lorsch, 2004; Yatime et al., 2006), ответственного за доставку Met-тРНКi на малую рибосомную субчастицу у архей и эукариот. 2.5. aIF6 Фактор инициации трансляции 6 – высококонсервативный белок, который имеется у эукариот (eIF6) и архей (aIF6), но отсутствует в бактериальных клетках. На сегодняшний день существуют немногочисленные данные о функционировании архейного фактора aIF6. Удаление гена, кодирующего aIF6 в H. volcanii, показало, что этот фактор необходим для выживания клеток архей (Gäbel et al., 2013). В работе Benelli et al., 2009 были проведены экспериментальные исследования функциональных свойств фактора aIF6 из S. solfataricus. По результатам фракционирования лизатов клеток S. solfataricus в 46 градиенте плотности сахарозы и результатам вестерн-блоттинга с использованием поликлональных антител к рекомбинантному aIF6 было сделано заключение, что фактор aIF6 специфично связывается с большой рибосомной субчастицей. Поскольку добавление мРНК к клеточным лизатам приводило к увеличению количества свободного фактора aIF6 в системе, было предположено, что активация трансляции вызывает диссоциацию aIF6 с 50S рибосомных субчастиц. Добавление очищенного препарата aIF6 в бесклеточную систему трансляции вызывало ингибирование трансляции пропорционально количеству добавленного белка, при этом наблюдалось уменьшение числа 70S рибосом. Таким образом, было показано, что связывание фактора aIF6 с большой рибосомной субчастицей препятствует формированию целых рибосом. Результаты исследований архейного фактора aIF6 хорошо согласуются с данными о функционировании гомологичного эукариотического фактора eIF6. Было установлено, что у эукариот eIF6 связывается с 60S рибосомными субчастицами и затрудняет их ассоциацию с 40S субчастицами, ингибируя тем самым преждевременное формирование 80S рибосом (Russell and Spremulli, 1979; Valenzuela et al., 1982). На основании этих данных eIF6 был определен как фактор инициации трансляции, регулирующий доступ 60S субчастиц к стадии элонгации. Архейный и эукариотический факторы инициации трансляции 6 обладают высокой гомологией (50-58%). Кристаллические структуры aIF6 из M. jannaschii и eIF6 из S. cerevisiae были получены с разрешением 1.3 и 2.5 Å, соответственно (Рис. 14, Табл. 7) (Groft et al., 2000). Анализ этих структур показал, что данные белки (молекулярная масса около 25 кДа) состоят из пяти повторяющихся почти идентичных субдоменов (каждый образован двумя α-спиралями и тремя β-тяжами, топология αββαβ), упорядоченных вокруг пяти осей псевдосимметрии. Субдомены e/aIF6 обозначают латинскими буквами A-E. Эукариотический фактор eIF6 на C-конце дополнительно имеет около 20 а. о. В экспериментах in vitro было показано, что удаление этих аминокислотных остатков eIF6 не влияет на функционирование фактора (Groft et al., 2000). Предполагается, что дополнительный C-концевой участок eIF6 может служить мишенью для регуляции фактора in vivo. Для кристаллизации eIF6 был использован белок, лишенный специфических для эукариот C-концевых аминокислотных остатков. 47 (а) (б) Рис. 14. (a) Схематическое изображение кристаллической структуры фактора aIF6 M. jannaschii. (б) Наложение структур молекул aIF6 M. jannaschii (черный цвет) и eIF6 S. cerevisiae (коричневый цвет). Буквами A-E обозначены субдомены e/aIF6. Рисунок с небольшими изменениями взят из Groft et al., 2000. Таблица 7. Результаты структурных исследований e/aIF6. Предел разрешения, Å Номер в PDB банке S. cerevisiae eIF6 2.5 1G62 M. jannaschii aIF6 1.3 1G61 11.8 2X7N Gartmann et al., 2010 T. thermophila 60S•eIF6 3.52 4V8P Klinge et al., 2011 Methanothermobacter thermautotrophicus 50S•aIF6 6.6 4ADX Greber et al., 2012 Название объекта и источника S. cerevisiae eIF6•uL14•eL24•25S рРНК(SRL) в составе 60S•eIF6 Ссылка Groft et al., 2000 На сегодняшний день известны структуры архейного и эукариотического фактора e/aIF6 в комплексе с большой рибосомной субчастицей (Табл. 7). Структуры эукариотического фактора eIF6 из S. cerevisiae и T. thermophila в комплексе с 60S субчастицей из того же организма были получены с помощью криоэлектронной микроскопии (Gartmann et al., 2010) и рентгеноструктурного анализа (Klinge et al., 2011), соответственно. Было установлено, что eIF6 связывается с белком L23e (uL14 согласно номенклатуре Ban et al., 2014) большой рибосомной субчастицы в области сарцинрициновой петли (SRL) на краю поверхности, контактирующей с малой рибосомной субчастицей. Такое расположение eIF6 на 60S субчастице стерически затрудняет связывание 40S субчастицы и препятствует формированию 80S рибосом. 48 В 2012 году с помощью криоэлектронной микроскопии была определена структура 50S рибосомной субчастицы из археи M. thermautotrophicus в комплексе с aIF6 с разрешением 6.6 Å (Рис. 15) (Greber et al., 2012). Было показано, что aIF6 занимает положение на 50S субчастице, которое в высокой степени соответствует положению, занимаемому его эукариотическим гомологом eIF6 на 60S субчастице. Фактор aIF6 образует обширные контакты с белком L14p (uL14 согласно номенклатуре Ban et al., 2014), что хорошо согласуется с результатами ранее проведенных экспериментов, где было показано, что L14p и aIF6 формируют комплекс и вне рибосомы, а при иммунопреципитации aIF6 отделяется от рибосомы, увлекая за собой L14p (Benelli et al., 2009). В результате анализа расположения фактора aIF6 на 50S субчастице было установлено, что aIF6 мешает объединению рибосомных субчастиц, поскольку напрямую блокирует формирование межсубъединичных контактов между белком L14p большой рибосомной субчастицы и петлей h14 16S рРНК малой субчастицы (Greber et al., 2012). Высокая консервативность механизма, препятствующего объединению рибосомных субчастиц у эукариот и архей, говорит о том, что точное расположение e/aIF6 на большой рибосомной субчастице является необходимым условием его функционирования. (а) L1-выступ Центральный протуберанец (б) P-выступ Рис. 15. (а) Схематическое изображение пространственной структуры 50S рибосомной субчастицы M. thermautotrophicus в комплексе с aIF6, полученной с помощью криоэлектронной микроскопии. (б) Участок связывания aIF6 на большой рибосомной субчастице вблизи сарцин-рициновой петли (sarcin-ricin loop, SRL), где rpL14p (uL14) и rpL24e (eL24) – соответствующие белки 50S субчастицы. Рисунки с небольшими изменениями взяты из Greber et al., 2012. Диссоциация фактора e/aIF6 из комплекса с большой рибосомной субчастицей может служить лимитирующим этапом инициации трансляции. В экспериментах с архейным фактором aIF6 было замечено, что диссоциация комплекса 50S•aIF6 49 сопровождается появлением на электрофореграмме более тяжелой формы белка (Benelli et al., 2009). Авторы предположили, что уход aIF6 с 50S субчастицы вызван некоторой модификацией фактора, которая, по-видимому, не является фосфорилированием, поскольку электрофоретическая подвижность новой формы белка не изменялась после обработки препарата фосфатазами. Лучше изучен механизм диссоциации эукариотического комплекса 60S•eIF6. Известно, что у млекопитающих уход eIF6 с 60S субчастиц осуществляется за счет сайт-специфического фосфорилирования фактора eIF6 протеинкиназой C (PKC), активируемой рецептором RACK1. Белок RACK1 является мажорным компонентом транслирующих рибосом, который непосредственно взаимодействует с eIF6 (Ceci et al., 2003). У дрожжей освобождение eIF6, по-видимому, происходит под действием рибосомозависимой ГТФазы Efl1 (Senger et al., 2001) и белка Sdo1 (Menne et al., 2007). Стоит отметить, что обширные исследования функционирования эукариотического фактора eIF6 выявили его многочисленные функции в клетке, однако не смогли прояснить роль этого белка в процессе инициации трансляции. Как у дрожжей, так и у высших эукариот eIF6 участвует в биогенезе рибосом (Sanvito et al., 1999; Si and Maitra, 1999), а именно в созревании предшественников рРНК (Basu et al., 2001) и экспорте рибосом из ядра в цитоплазму (Senger et al., 2001). Однако у дрожжей отсутствие фактора eIF6 не ослабляет инициацию трансляции in vitro, а профили седиментации рибосом клеток, лишенных eIF6, свидетельствуют о том, что eIF6 не является фактором инициации трансляции у дрожжей (Sanvito et al., 1999; Si and Maitra, 1999). У млекопитающих eIF6, наоборот, способствует эффективной инициации трансляции in vivo. Было показано, что eIF6 стимулирует инициацию трансляции в ответ на сигналы факторов роста или введение инсулина и тем самым влияет на тотальную регуляцию трансляции. Предполагается, что в данном случае роль eIF6 заключается в связывании 60S рибосомных субчастиц и предотвращении формирования неактивных 80S рибосом (Gandin et al., 2008). В экспериментах in vitro было показано, что eIF6 H. sapiens способствует реинициации трансляции за счет того, что связывается с 60S рибосомными субчастицами и обеспечивает необратимость диссоциации пост-терминационных рибосомных комплексов, которую осуществляет белок ABCE1 (Pisarev et al., 2010). Существуют данные, что архейный фактор aIF6 подобно eIF6 может принимать участие в реинициации трансляции, поскольку предотвращает вхождение 50S рибосомных субчастиц в трансляционный цикл после терминации (Barthelme et al., 2011). Кроме того для архейных клеток было показано, что экспрессия гена белка aIF6 остается неизменной на разных стадиях клеточного цикла, однако увеличивается в три раза при тепловом или 50 холодовом шоке, что указывает на возможную роль aIF6 in vivo в качестве репрессора трансляции в условиях стресса (Benelli et al., 2009). Таким образом, фактор инициации трансляции 6 у архей и эукариот является регуляторным белком и, по-видимому, выполняет несколько важных функций в клетке. Заключение В настоящее время сценарий событий, происходящих в ходе инициации трансляции в клетках архей, остается малоизученным. Несмотря на то, что археи являются прокариотами, механизм и аппарат инициации биосинтеза белка у архей сложнее, чем у бактерий. Система инициации трансляции архей имеет мозаичный характер и объединяет черты бактериальной и эукариотической систем. Так, если организация архейных мРНК и способ их взаимодействия с рибосомой напоминает таковые у бактерий, то факторы инициации трансляции архей имеют большую гомологию с эукариотическими. Результаты исследований особенностей функционирования бактериальных и эукариотических факторов инициации трансляции позволяют предугадывать роль соответствующих архейных белков. С другой стороны успех в определении структур архейных факторов aIF5B и aIF2 способствует интерпретации экспериментальных данных по функционированию их гомологов eIF5B/IF2 и eIF2. В целом изучение структур и функций отдельных компонентов процесса инициации трансляции способствует пониманию деталей механизма инициации на молекулярном уровне. 51 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 1. Материалы и приборы 1.1. Химические реактивы и ферменты В работе использовали следующие химические реактивы зарубежных фирм: хлорид натрия, хлорид магния, гидроксид натрия, ЭДТА, глицин, хлорид кальция, дрожжевой экстракт (GERBU, Германия); ацетат натрия, ацетат магния, гидроксид калия, хлорид калия (Merck, Германия); БСА, ацетат калия, какодилат натрия, малонат натрия, формиат натрия, метиленовый синий, метионин, дезоксирибонуклеаза I, сахароза, толуидиновый синий, Трис, Hepes, MES, диметилсульфоксид, МПД, GDPNP, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, рибонуклеозид-трифосфаты, ГДФ (Sigma, США); GDPСP (Jena Bioscience, Германия); MANT-GDP (BioLog, Германия); сульфат аммония, агар, триптон, мочевина, «ледяная» уксусная кислота (Panreac, Испания); бромид этидия, ТЕМЕД, ММЭПЭГ 5000, гексамин хлорид кобальта, натриевая соль ПАК 5100 (Fluka, Швейцария); β-аланин, ДТТ (Reanal, Венгрия); ксиленцианол (Amersham, Швеция); tween 20 (Bio-Rad, США); ДСН, кумасси G-250, персульфат аммония, PMSF, акриламид, N’, N’-метиленбисакриламид, бромфеноловый синий, хлорамфеникол, β-меркаптоэтанол, спермидин (Serva, Германия); этиленгликоль, NDSB (Hampton Research, США); белковые маркеры, T4 ДНК-лигаза, T4 РНК-лигаза (Fermentas, Литва); KOD Hot Start ДНКполимераза (Novagen, США). Реактивы, произведенные российскими фирмами: ДНК-маркеры, сайт-специфические эндонуклеазы рестрикции DpnI, BamHI, NdeI, SmaI, TaqSE ДНК-полимераза (СибЭнзим); синтетические олигонуклеотиды-праймеры (Синтол, Евроген); этанол (Реахим); ИПТГ, агароза, фенол, глицерин, хлорид аммония (Хеликон); изопропанол, изоамиловый спирт, соляная кислота, хлорид лития, хлороформ (Химмед); ампициллин (Синтез). Также в работе использовали хроматографические носители: Butyl-Toyopearl 650S (Toyo-Soda, Япония), гепарин-сефароза, ДЕАЕ-сефароза, Q-сефароза, S-сефароза, сефадекс G25; фирменные колонки, заполненные супердексом-75 и 200 (10/300, 16/60) и MonoQ (5/5) (Pharmacia, Швеция). 52 1.2. Буферы и среды Буфер «А» 50 мМ Трис-НСl, рН 8.0, 300 мМ MgCl2, 1 M NaCl, 5 мМ ЭДТА, рН 8.0, 10 мМ β-МЭ Буфер «Б» 50 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 1.5 М (NH4)2SO4, 1 М NaCl, 10 мМ β-МЭ Буфер «В» 50 мM Трис-HCl, pH 7.5, 50 мM NaCl, 10 мМ β-МЭ Буфер «Г» 10 мМ Hepes-KOH, pH 7.5, 100 мМ NaCl, 0.1 мМ ЭДТА, рН 8.0, 10 мМ β-МЭ Буфер «Д» 10 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 100 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 1 мМ ЭДТА, рН 8.0, 10 мМ β-МЭ Буфер «Е» 100 мМ Трис-HCl, pH 6.8, 200 мМ NaCl, 10 мМ β-МЭ Буфер «Ж» 100 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 50 мМ NaCl, 10 мМ β-МЭ Буфер «З» 25 мМ NaH2PO4--Na2HPO4, pH 6.0, 50 мМ NaCl, 10 мМ β-МЭ Буфер «И» 50 мМ Трис-НСl, pH 7.5, 200 мM NaCl, 10 мМ β-МЭ Буфер «К» 50 мМ Трис-НСl, рН 6.8, 100 мM NaCl, 0.1 мМ ЭДТА, рН 8.0, 10 мМ β-МЭ Буфер «Л» 10 мМ Трис-НСl, рН 8.0, 100 мM KCl, 10 мМ MgCl2, 1 мМ ЭДТА, рН 8.0, 10 мМ β-МЭ Буфер «М» 50 мМ Трис-НСl, pH 7.5, 50 мM NaCl, 10 мМ MgCl2 Буфер «Н» 50 мM Трис-HCl, pH 7.5, 100 мM NaCl, 100 мM KCl, 10 мM MgCl2, 2 мМ ДТТ Буфер «О» 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 200 мМ NaCl, 8 мМ MgCl2, 0.1 мМ ЭДТА Буфер «П» 50 мМ Трис-HCl, pH 7.5, 200 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 0.005% tween 20 Буфер «Р» 30 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 5 мМ MES, 7 мМ MgCl2, 0.5 мМ ДТТ, 0.5 мкМ GDPNP Буфер ТАЕ (50-ти кратный) 2 М Трис-ацетат, рН 8.0, 50 мМ ЭДТА, рН 8.0 LB среда 1% триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl LB-агар 1.5% агар, 1% триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl 1.3. Бактериальные штаммы и плазмиды Для генно-инженерных процедур использовали бактериальный штамм E. coli XL1-Blue (Stratagene, США) с генотипом recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac[F’ proAB lacIqZ∆M15Tn10(Tetr)]; плазмиды pET11c и pET11d (Novagen, США) с характеристикой Apr lacI pBR322ori T7 промотор; pUC18 (USBiological, США) Apr lacZ pBR322ori. Для экспрессии генов белков использовали штаммы E. coli BL21(DE3) (Stratagene, США) и С41(DE3) (Imaxio, Франция) с генотипом F- dcm ompT hsdS(rB- mB-) gal λ(DE3); плазмиду pLacIRARE (Novagen) с характеристикой Camr lacI p15a ori, несущую гены 53 аргининовой, изолейциновой, лейциновой, пролиновой и глициновой тРНК, узнающих редкие для E. coli кодоны аргинина AGA и CGG, изолейцина AUA, лейцина CUA, пролина ССС и глицина GGA. Для суперпродукции инициаторных тРНК использовали штамм E. coli MRE 600 (NCIMB Ltd., Великобритания) с генотипом F- rna. 1.4. Принадлежности Для фильтрования растворов использовали нитроцеллюлозные Millipore (США) и стекловолокнистые GF/A Whatman (Великобритания) фильтры. Для концентрирования препаратов применяли концентраторы VivaSpin-10 (VivaScience, Великобритания). Для диализа белковых препаратов использовали самодельные мешки из мембран с отсечкой 12 – 16 кДа (Serva, Германия). Для выделения и очистки ДНК использовали фирменные наборы – QIAquick® Gel-Extraction Kit, QIAquick® Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Германия). В опытах по кристаллизации использовали наборы растворов Natrix, Grid Screen Salt, Additive Screen, Silver Bullets (Hampton Research, США), Nucleix, AmSO4 (QIAGEN, Германия), NucPro (Jena Bioscience, Германия), Clear Strategy, Stura (Molecular Dimensions, Великобритания), вакуумную смазку (Bayer, США), плашки и силиконизированные покровные стеклышки (Hampton Research, США). В методе SPR использовали сенсорный чип NLS с иммобилизованным авидином (Bio-Rad, США). Для тонкослойной ионообменной хроматографии использовали пластины PEI-целлюлозы (Merck, Германия). Также в работе использовали микроцентрифужные пробирки eppendorf (Германия), центрифужные пробирки Falcon (Greiner, Австрия). 1.5. Приборы В работе использовали хроматографические системы ÄKTA Basic (Amersham Biosciences, Швеция) и Econo System (Bio-Rad, США); спектрофотометры Ultrospec 2100 Pro (Amersham Biosciences, Швеция), Сole-Parmer® 1100 (США), NanoPhotometerTM P-Class (IMPLEN, Германия), Hitachi 150-20 (Япония); ультрафиолетовый трансиллюминатор (Сole-Parmer, США); амплификатор Gene Amp PCR System 2400 (Perkin Elmer, Сингапур); MasterCycler® personal (Eppendorf, Германия); комплекты оборудования для электрофореза Mini Protean II и Mini-Sub® Cell GT (Bio-Rad, США), HoeferTM Dua Gel Caster (Amersham Biosciences, Англия); источник питания Biometra P-25 (Biotron, Германия), Эльф-4 (ДНКТехнология, Россия); автоклавы (SANYO, Япония); термостат MLW UH (MLW, ГДР); термостатированный шейкер для выращивания бактериальной культуры InnovaTM 4000 (Pegasus Scientific Inc., США); ультразвуковой дезинтегратор Sonic Dismembrator 550 54 (Fisher Scientific, США); гомогенизатор высокого давления EmulsiFlex®-C3 (Avestin, Германия); центрифуги 5415C, 5810R и Mini spin (Еppendorf, Германия), К-23 (Janetzky, ГДР), BR4i (Jouan, Франция), J2-21 и TL-100 (Beckman, США); весы Scout Pro SPU601 и Adventurer Pro AV364C (Ohaus, США); ВЛКТ-500-М (СССР); магнитные мешалки ММ2А (ЧССР); шейкеры IKA® VIBRAX VXR basic (IKA, Германия); рН-метр PB-11 (Sartorius, Германия); микроскопы SZX12 и SZ51 (Olympus, Япония). 2. Методы генной инженерии и микробиологии 2.1. Клонирование генов субъединиц e/aIF2 Гены α-, β-, γ-субъединиц eIF2 S. cerevisiae (sui2, sui3 и gcd11, соответственно), фрагмент гена sui2, кодирующий укороченную на 30 а. о. с С-конца α-субъединицу eIF2 S. cerevisiae (sui2ΔС; 1-274 а. о.), и фрагменты гена aIF2α S. solfataricus, соответствующие 2 и 3 доменам (sso_αD23; 89-266 а. о.) или только 3 домену белка (sso_αD3; 175-266 а. о.), амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Матрицами служили плазмидная ДНК YEp13/GCD11(His8)/SUI2/SUI3 (Erickson and Hannig, 1996) на основе вектора YEp13, содержащая гены субъединиц eIF2 S. cerevisiae, и плазмидная ДНК pET11с-sso_α (Stolboushkina et al., 2008) на основе вектора pET11c, содержащая ген aIF2α S. solfataricus. Были сконструированы комплементарные к матрицам олигонуклеотидыпраймеры, которые заключали в себе на 5’-концах требуемые сайты рестрикции (подчеркнуты) и кодоны инициации и терминации трансляции (обозначены контуром). Прямые праймеры: F_sui2: 5’-GGAATTCCAT TCCACTTCTCATTGCAGATTT-3’ F_ sui2T274: 5’-GGAATTCCAT TCCACTTCTCATTGCAGATTT-3’ F_ sui3: 5’-GGAATTCCAT TCCTCCGATTTAGCTGCTG-3’ F_gcd11: 5’-GGAATTCCAT AGTGACTTACAAGACCAAGAACC-3’ F_sso_αD3: 5’-GGAATTCCAT AGAAAAGTGAAAATGTCT-3’ F_sso_αD23: 5’-GGAATTCCAT GAGAGAAGAAAGAAGAAT-3’ Обратные праймеры: R_ sui2: 5’-CGCGGATCC CTCGTCGTCTGACTCATC-3’ R_ sui2T274: 5’-GCTTGTAACTCGGATCC AGTAGCAGTGACAGCC-3’ R_ sui3: 5’-CGCGGATCC CATTCTCCTTCTCTTACC-3’ R_gcd11: 5’-CGGGATCC AGCGATGGGTTCCAATGTAG-3’ R_sso_αD3: 5’-CGGGATCC TTTCTTAACCACACTTATA-3’ R_sso_αD23: 5’-CGGGATCC TTTCTTAACCACACTTATA-3’ 55 Реакционная смесь (50 мкл) содержала 40 нг ДНК-матрицы, два праймера с концентрацией каждого 1 мкМ, 5 мкл соответствующего буфера 10-ти кратной концентрации, четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата (dATФ, dЦTФ, dГТФ, dTTФ) с концентрацией каждого 0.2 мМ, 1 мМ сульфата магния и 1 ед. активности KOD Hot Start ДНК-полимеразы. После начальной активации (2 мин при 95°С) следовали 25 циклов реакции амплификации. Цикл состоял из трех этапов: денатурации ДНК 30 с при 95°С, отжига праймеров 1 мин при 55°С, и синтеза ДНК 1 мин при 70°С. Для завершения полного образования двухцепочечных структур продуктов реакции ПЦР, реакционную смесь дополнительно прогревали 4 мин при 70°С. По окончании ПЦР содержимое реакционной смеси анализировали с помощью электрофореза в 1.5%-ном агарозном геле с использованием ДНК-маркеров. Продукт ПЦР выделяли из геля в чистом виде с помощью фирменного набора QIAquick® Gel-Extraction Kit. Далее продукты ПЦР и плазмидный вектор расщепляли pET11c сайт-специфическими эндонуклеазами рестрикции (NdeI и BamHI) и очищали с помощью электрофореза в агарозном геле с последующим использованием фирменного набора QIAquick® Gel-Extraction Kit. Реакцию лигирования проводили в течение ночи при 22°С в объеме 20 мкл: 100 нг вектора, молярное соотношение вектор : вставка составляло 1 : 5, 2 мкл соответствующего буфера 10-ти кратной концентрации и 2 ед. активности Т4 ДНКлигазы. Реакцию останавливали прогревом при 65°С в течение 20 мин, и половину объема лигазной смеси использовали для трансформации штамма E. coli XL1-Blue. Для проведения анализа бактериальных колоний на наличие рекомбинантной плазмиды использовали ПЦР. Выросшие колонии ресуспендировали в 50 мкл стерильной дистиллированной воды, и 5 мкл высевали на плотную селективную среду. Остальной раствор прогревали 5 мин при 99С, центрифугировали 5 мин при 6 000 g и супернатант использовали для ПЦР. Реакционная смесь (20 мкл) содержала 5 мкл супернатанта, два специфических к соответствующего вставке праймера буфера с 10-ти концентрацией кратной каждого 1 мкМ, концентрации, 2 мкл четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата с концентрацией каждого 0.2 мМ и 1 ед. активности TaqSE ДНК-полимеразы. Реакцию амплификации проводили по вышеописанной программе. Результаты реакции анализировали методом электрофореза в агарозном геле. Далее из колоний клеток, содержащих плазмиды со вставками, выделяли плазмидные ДНК с помощью фирменного набора QIAquick® Spin Miniprep Kit. Отсутствие мутаций оценивали по результатам секвенирования (Синтол или ЦКП Геном, Москва). 56 2.2. Метод сайт-направленного мутагенеза последовательности ДНК Для получения сайт-специфической мутации методом QuikChange® (Stratagene, США) конструировали олигонуклеотиды-праймеры, комплементарные матрице и содержащие необходимую мутацию. Матрицей служила плазмидная ДНК pET11d-sso_γ, содержащая ген aIF2γ S. solfataricus (Stolboushkina et al., 2008). Для введения мутаций (подчеркнуты) в последовательность гена использовали следующие прямые праймеры: F(K225A): 5’-GTTTTGACGTTAATGCGCCCGGTACCC-3’ F(R280A): 5’-GATTTCGTCCATAGCGTTTGGAGATGAGG-3’ F(F221A): 5’-GCTTGTGATAAGAAGTGCGGACGTTAATGCG-3’ F(∆41-45): 5’-CATCAAAACATTCCGAAGAAACAATAAAACTGGG-3’ F(Δ37-47): 5’-GGACATCAAAAAAACTGGGTTACGCAGAGAC-3’ F(H20F): 5’-GGTGTAGTTGGTCATGTAGATTTCGGTAAGACTACACTAG-3’ F(D152A): 5’-GTTCAAAATAAGGTAGCCGTAGTCTCCAAAGAGGA-3’ F(N149Y): 5’-CCTAATTATAGTTCAATACAAGGTAGACGTAGTCTCCAAAGAG-3’ F(N149F): 5’-CCTAATTATAGTTCAATTCAAGGTAGACGTAGTCTCCAAAGAG-3’ F(G21V): 5’-GGTGTAGTTGGTCATGTAGATCATGTGAAGACTACACTAG-3’ Обратные праймеры были полностью комплементарны прямым праймерам. Амплификацию целой матрицы ДНК проводили с помощью ПЦР. Реакционная смесь (25 мкл) содержала 10-25 нг ДНК-матрицы, прямой и обратный праймеры с концентрацией каждого 0.3 мкМ, 2.5 мкл соответствующего буфера 10-ти кратной концентрации, четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата с концентрацией каждого 0.2 мМ, 1 мМ сульфата магния и 0.5 ед. активности KOD Hot Start ДНК-полимеразы. После начальной активации (3 мин при 95°С) следовали 18 циклов реакции амплификации: 30 с при 95°С; 30 с при 57°С; 6 мин при 72°С. После этого реакционную смесь дополнительно прогревали 8 мин при 72°С. В результате образовывалась смесь двухцепочечных ДНК, которая содержала исходную плазмиду и плазмиду с мутацией. По окончании ПЦР содержимое реакционной смеси анализировали с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле. Далее к ПЦР-смеси добавляли сайт-специфическую эндонуклеазу рестрикции DpnI (5 ед. активности) и оставляли в течение 2 часов при 37°С, чтобы расщепить исходную матрицу по метилированным сайтам (5’-Gm6ATC-3’). Для последующей трансформации компетентных клеток E. coli штамма XL1-Blue использовали 5 мкл рестрикционной смеси. Из выросших колоний выделяли плазмидные ДНК с помощью фирменного набора QIAquick® Spin Miniprep Kit. Наличие мутаций оценивали по результатам секвенирования (Синтол или ЦКП Геном, Москва). 57 2.3. Электрофорез ДНК в геле агарозы Электрофорез ДНК проводили при напряжении 90 В в однократном TAE-буфере в горизонтальных пластинах размером 7×7×0.7 см в аппарате Mini-Sub® Cell GT. Концентрацию агарозы в геле варьировали от 1% до 2% в зависимости от размера ДНК фрагмента. Перед полимеризацией в агарозу вносили бромистый этидий до 1 мкг/мл. Препарат ДНК смешивали в соотношении 5 : 1 с шестикратным TAE-буфером, содержавшим 40% глицерина или сахарозы и по 0.25% бромфенолового синего и ксиленцианола. По окончании электрофореза ДНК в геле анализировали в ультрафиолетовом свете. 2.4. Обработка ДНК сайт-специфическими эндонуклеазами рестрикции Рестрикцию двуспиральной ДНК проводили с использованием сайт-специфических эндонуклеаз рестрикции в буферах, поставляемых вместе с ферментами, при рекомендуемых фирмой-производителем температурах в течение 1-2 часов. Реакционная смесь (20 мкл) обычно содержала 0.2-1 мкг ДНК, 2 мкл соответствующего буфера 10-ти кратной концентрации, БСА до концентрации 0.1 мг/мл, если это было необходимо для работы фермента, и 1 ед. активности рестриктазы. Реакцию останавливали прогревом смеси 20 мин при 65°С. Когда ДНК необходимо было обработать двумя рестриктазами, реакцию проводили одновременно при условии, что оба фермента функционируют в одном и том же буфере. Если в дальнейшем обработанную рестриктазами ДНК использовали для реакции транскрипции, то ее подвергали очистке – однократной экстракции вначале фенолом, затем смесью фенола и хлороформа (1 : 1) и наконец хлороформом. 2.5. Получение компетентных клеток E. coli с применением хлорида кальция Компетентные клетки бактерий получали по методике, описанной ранее (Mandel and Higa, 1970), со значительными изменениями. В 100-мл колбу вносили 20 мл LB среды с необходимым антибиотиком и культуру бактерий. Клетки выращивали при 37°С с интенсивным перемешиванием (200 об/мин) до поглощения (А590) 0.5-0.6 о.е./мл. Культуру переносили в центрифужные пробирки Falcon, охлаждали во льду 10 мин и центрифугировали при 6 000 g и 4°С в течение 5 мин. Надосадочную жидкость удаляли, а клетки ресуспендировали в половине начального объема охлажденного во льду стерильного раствора 10 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 50 мМ CaCl2. Суспензию клеток снова помещали в ледяную баню на 15 мин и снова центрифугировали при 6 000 g и 4°С в течение 5 мин. Надосадочную жидкость удаляли, а клетки ресуспендировали в 1/10 58 начального объема охлажденного раствора 10 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 50 мМ CaCl2. Суспензию клеток разливали порциями по 200 мкл в охлажденные микроцентрифужные пробирки. Приготовленные таким способом компетентные клетки хранению не подлежат, поэтому по мере необходимости готовили свежую порцию компетентных клеток и осуществляли трансформацию. 2.6. Трансформация клеток E. coli плазмидной ДНК методом теплового шока Для одной трансформации использовали 200 мкл суспензии приготовленных компетентных клеток. В суспензию клеток вносили 40 нг плазмидной ДНК или 10 мкл лигазной смеси и инкубировали смесь 30 мин во льду. Тепловой шок проводили на водяной бане при 42°С в течение 1 мин. Затем в пробирку добавляли 800 мкл LB среды, инкубировали 1 час при 37°С без качания, после чего 100 мкл клеточной суспензии (клетки осаждали коротким центрифугированием) наносили на плотную селективную среду (LB-агар с антибиотиком), чашки переворачивали и инкубировали при 37°С в течение ночи (12-16 часов). 2.7. Экспрессия генов субъединиц e/aIF2 в клетках E. coli Для экспрессии в клетках E. coli генов субъединиц eIF2 S. cerevisiae и aIF2 S. solfataricus использовали систему Штудиера (Studier et al., 1990). Рекомбинантными плазмидами pET11c-sui2, pET11c-sui2ΔС, pET11c-sui3, pET11c-gcd11 трансформировали штамм E. coli BL21(DE3)/pLacIRARE, плазмидами pET11с-sso_αD3 и pET11c-sso_αD23 – штамм E. coli BL21(DE3). Для получения субъединиц aIF2 S. solfataricus использовали глицериновые культуры BL21(DE3)/pET11с-sso_α, BL21(DE3)/pET11d-sso_β и C41(DE3)/pET11d-sso_γ (Stolboushkina et al., 2008). Эти штаммы E. coli обладают геном Т7-РНК-полимеразы под контролем lac-промотора. В случае субъединиц архейного фактора aIF2 полученные на чашках колонии смывали в колбы с LB средой и ампициллином (100 мкг/мл) и растили при 37°С с интенсивным перемешиванием (200 об/мин) до поглощения (А590) 0.8 о.е./мл. Затем в культуру клеток добавляли искусственный индуктор lac-оперона, ИПТГ, до конечной концентрации 0.8-1 мМ и продолжали инкубировать в тех же условиях в течение 3 часов. За время инкубации в присутствии ИПТГ в клетках нарабатывается Т7-РНК-полимераза, которая с высокой эффективностью начинает транскрибировать клонированный ген, находящийся под контролем Т7-промотора. Для экспрессии генов субъединиц eIF2 полученные на чашках колонии смывали в колбы с LB средой, ампициллином (100 мкг/мл) и хлорамфениколом (10 мкг/мл) и 59 растили при 37°С с интенсивным перемешиванием (200 об/мин) до поглощения (А590) 0.6-0.8 о.е./мл. Затем в случае eIF2β в культуру клеток добавляли ИПТГ до конечной концентрации 0.3 мМ и продолжали инкубировать в течение 3 часов в тех же условиях. В случае eIF2α и eIF2αΔC колбы охлаждали 10 мин при 4°С, добавляли ИПТГ до конечной концентрации 0.3 мМ и продолжали инкубировать в течение 12 часов при 30°С. Далее клетки собирали центрифугированием при 6 000 g и 4°С в течение 20 мин. Уровень продукции субъединиц e/aIF2 оценивали электрофорезом в 15%-ном ПААГ в присутствии ДСН. Полученную биомассу замораживали и хранили при -70°С. 3. Биохимические методы при работе с белками 3.1. Препаративное выделение и очистка γ-субъединицы aIF2 S. solfataricus и ее мутантных форм из клеток штаммов-суперпродуцентов E. coli Выделение aIF2γ S. solfataricus дикого типа, так же как и мутантных форм белка, осуществляли по методике описанной ранее (Nikonov et al., 2007) с некоторыми изменениями. Клетки штаммов-суперпродуцентов для aIF2γ дикого типа (BL21(DE3)/pET11d-sso_γ) и мутантных форм суспендировали в буфере «А» и разрушали ультразвуком (режим: общее время 20 мин; время пульса 1 с; время паузы 1 с) в центрифужных пробирках Falcon во льду. Дебрис осаждали центрифугированием при 12 500 g в течение 30 мин при 4°С. Супернатанты прогревали при 65°С в течение 20 мин и затем снова центрифугировали в тех же условиях, чтобы удалить термолабильные белки E. coli. Затем из клеточного лизата удаляли рибосомы высокоскоростным центрифугированием при 150 000 g в течение 1 часа при 4С. Полученный супернатант снова прогревали 20 мин при 65°C и центрифугировали (12 500 g, 30 мин, при 4°С). В случае мутантных форм aIF2γ с заменами в каноническом нуклеотид-связывающем сайте образцы прогревали при 55-60°C. Далее к супернатанту при медленном перемешивании добавляли сухой сульфат аммония до конечной концентрации 1.7 М и наносили на колонку с носителем Butyl-Toyopearl 650S для дальнейшей хроматографической очистки (Табл. 8). Фракции, содержавшие очищенный белок aIF2γ, объединяли и концентрировали на концентраторе VivaSpin-10. Раствор белка расфасовывали по микроцентрифужным пробиркам, замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С. Чистоту белковых препаратов оценивали электрофорезом в 15%-ном ПААГ в присутствии ДСН. Содержание примеси нуклеиновых кислот в белковых спектрофотометрически при длине волны 260 нм. 60 препаратах контролировали Таблица 8. Условия хроматографической очистки субъединиц aIF2 S. solfataricus и eIF2 S. сerevisiae, выделенных из биомассы штаммов-суперпродуцентов E. coli. Для каждого белка приведены расчетное значение изоэлектрической точки (pI), длина аминокислотной последовательности (а. о.) и молекулярная масса (кДа). Белки aIF2γ pI 8.4 415 а. о. 46 кДа aIF2α pI 9.2 266 а. о. 30 кДа aIF2αD3 pI 8.9 93 а. о. 10 кДа aIF2αD23 pI 8.8 179 а. о. 20 кДа aIF2β pI 8.8 139 а. о. 16 кДа eIF2β pI 9.5 285 а. о. 32 кДа eIF2α pI 4.9 304 а. о. 35 кДа Условия первой хроматографии Условия второй хроматографии Носитель Butyl-Toyopearl 650S (9 мл); стартовый буфер «Б»; скорость 60 мл/ч; обратный линейный градиент: V = 180 мл, 1.5 – 0.1 М (NH4)2SO4 и 1 – 0.1 M NaCl в 50 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 10 мМ β-МЭ; Vфракции = 4 мл; фракции объединяли, концентрировали, и разводили в 20 раз буфером «В». Носитель гепарин-сефароза (25 мл); стартовый буфер «В»; скорость – 60 мл/ч; линейный градиент: V = 200 мл, 0.05 – 1 M NaCl в 50 мМ Трис-HCl, pH 7.5, 10 мМ β-МЭ; Vфракции = 5 мл. Носитель S-сефароза (25 мл); стартовый буфер «Г»; скорость 60 мл/ч; линейный градиент: V = 400 мл, 0.1 – 0.4 M NaCl в 10 мМ Hepes-KOH, pH 7.5, 0.1 мМ ЭДТА, pH 8.0, 10 мМ βМЭ; Vфракции = 5 мл; фракции объединяли, к полученному препарату белка при перемешивании добавляли в сухом виде (NH4)2SO4 и NaCl до концентрации 1.5 М и 1 М, соответственно. Носитель Butyl-Toyopearl 650S (9 мл); стартовый буфер «Б»; скорость 60 мл/ч; обратный линейный градиент: V = 180 мл, 1.5 – 0.1 М (NH4)2SO4 и 1 – 0.1 M NaCl в 50 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 10 мМ β-МЭ; Vфракции = 4 мл. Перед нанесением на колонку к супернатанту добавляли при перемешивании в сухом виде (NH4)2SO4 до конечной концентрации 1.7 М. Носитель Butyl-Toyopearl 650S (9 мл); стартовый буфер «Б»; скорость 60 мл/ч; обратный линейный градиент: V = 180 мл, 1.5 – 0.1 М (NH4)2SO4 и 1 – 0.1 M NaCl в 50 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 10 мМ β-МЭ; Vфракции = 4 мл; фракции объединяли, к полученному препарату белка снова добавляли при перемешивании в сухом виде (NH4)2SO4 и NaCl до концентрации 1.5 М и 1 М, соответственно. Дальнейшую очистку проводили с помощью повторной хроматографии на Butyl-Toyopearl 650S в тех же условиях. Перед нанесением на колонку супернатант разводили в 4 раза буфером 270 мМ ТрисHCl, pH 8.0, 10 мМ β-МЭ. Носитель Q-сефароза (10 мл); стартовый буфер «Ж»; скорость 60 мл/ч; линейный градиент: V = 60 мл, 0.05 – 1 M NaCl в 100 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 10 мМ β-МЭ; Vфракции = 4 мл; фракции объединяли, концентрировали и переводили в буфер «З» диализом. Носитель Q-сефароза (10 мл); стартовый буфер «З»; скорость 60 мл/ч; линейный градиент: V = 60 мл, 0.05 – 1 M NaCl в 25 мМ NaH2PO4-Na2HPO4, pH 6.0, 10 мМ β-МЭ Vфракции = 5 мл фракции объединяли и концентрированием переводили в буфер «И». 61 3.2. Препаративное выделение и очистка aIF2α, aIF2αD3, aIF2αD23, aIF2β S. solfataricus из клеток штаммов-суперпродуцентов E. coli Клетки штаммов-суперпродуцентов суспендировали в следующих буферах: «Г» – для BL21(DE3)/pET11с-sso_α и BL21(DE3)/pET11с-sso_αD3; «А» – для BL21(DE3)/pET11сsso_αD23 и BL21(DE3)/pET11d-sso_β, и разрушали ультразвуком (режим: общее время 20 мин; время пульса 10 с; время паузы 10 с) в центрифужных пробирках Falcon во льду. Дебрис осаждали центрифугированием при 12 500 g в течение 30 мин при 4°С. Супернатанты прогревали при 65°С в течение 20 мин и затем снова центрифугировали в тех же условиях, чтобы удалить термолабильные белки E. coli. Полученные супернатанты наносили на колонку с необходимым носителем для дальнейшей хроматографической очистки субъединиц aIF2 (Табл. 8). Фракции, содержавшие очищенные субъединицы aIF2, объединяли, концентрировали и переводили в необходимый буфер на концентраторе VivaSpin-10. Препарат белка расфасовывали по микроцентрифужным пробиркам, замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С. Чистоту белковых препаратов оценивали электрофорезом в 15%-ном ПААГ в присутствии ДСН. Содержание примеси нуклеиновых кислот в белковых препаратах контролировали спектрофотометрически при длине волны 260 нм. 3.3. Препаративное выделение и очистка гетеротримера aIF2 S. solfataricus из клеток штаммов-суперпродуцентов E. coli Выделение и очистку гетеротримера aIF2 S. solfataricus осуществляли по методике, описанной ранее (Stolboushkina et al., 2008). Клетки штаммов-суперпродуцентов каждой субъединицы aIF2 (с 3 л культуры для γ-субъединицы и по 1 л культуры для α- и βсубъединиц) суспендировали индивидуально в буфере «Г» и разрушали ультразвуком (режим: общее время 15 мин; время пульса 10 с; время паузы 10 с) в центрифужных пробирках Falcon во льду. Разрушенные клеточные стенки и мембраны убирали центрифугированием в течение 30 мин при 12 500 g и 4°С. Полученные супернатанты прогревали при 65°С в течение 20 мин и затем снова центрифугировали в тех же условиях. Супернатанты, каждый из которых содержал одну из трех субъединиц aIF2, смешивали и наносили на колонку с носителем S-сефароза (25 мл), уравновешенной буфером «Г», со скоростью 30 мл/ч при 4°C. Колонку промывали тем же буфером в течение ночи со скоростью 12 мл/ч. Связавшийся с носителем реконструированный полный гетеротример aIF2 элюировали 400 мл линейного градиента концентрации NaCl (0.1 – 0.4 М) в 10 мМ Hepes-KOH, pH 7.5, 0.1 мМ ЭДТА и 10 мМ β-МЭ. Скорость элюции – 60 мл/ч, объем 62 фракции – 10 мл. Фракции из центральной части пика, содержавшие все три субъединицы (α, β, γ) aIF2, объединяли и концентрировали на концентраторе VivaSpin-10. Далее белковый препарат разводили в 20 раз буфером «Д» и наносили на колонку с носителем гепарин-сефароза (25 мл), уравновешенной тем же буфером, со скоростью 60 мл/ч. Колонку промывали 250 мл буфера «Д», а связавшийся с носителем aIF2 элюировали 500 мл линейного градиента концентрации KCl (0.1 – 0.5 М) в 10 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 10 мМ MgCl2, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ β-МЭ. Объем фракции составлял 4.5 мл. Фракции белка aIF2 из центральной части пика и со склонов отдельно объединяли и концентрировали на концентраторе VivaSpin-10. Раствор белка расфасовывали по микроцентрифужным пробиркам, замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С. Чистоту препаратов белка оценивали электрофорезом в 15%-ном ПААГ в присутствии ДСН. Содержание примеси нуклеиновых кислот в белковых препаратах контролировали спектрофотометрически при длине волны 260 нм. Гомогенность препаратов белка также анализировали электрофорезом в 15%-ном ПААГ в неденатурирующих условиях в кислой среде. 3.4. Препаративное выделение и очистка eIF2α и eIF2β S. cerevisiae из клеток штаммов-суперпродуцентов E. coli Клетки штаммов-суперпродуцентов суспендировали в следующих буферах: «Е» – для BL21(DE3)/pLacIRARE/pET11c-sui2 и «А» – для BL21(DE3)/pLacIRARE/pET11c-sui3. К суспензии клеток BL21(DE3)/pLacIRARE/pET11c-sui3 дополнительно добавляли дезоксирибонуклеазу I (50 мкг на 1 г биомассы клеток) и PMSF до концентрации 0.3 мМ, после чего клетки разрушали гомогенизатором высокого давления во льду. Клетки BL21(DE3)/pLacIRARE/pET11c-sui2 разрушали ультразвуком (режим: общее время 2 мин; время пульса 10 с; время паузы 10 с) в центрифужных пробирках Falcon во льду. Клеточные обломки осаждали центрифугированием при 12 500 g в течение 30 мин при 4°C. В случае eIF2α из клеточного лизата дополнительно удаляли рибосомы высокоскоростным центрифугированием при 300 000 g в течение 30 мин при 4С. Полученные супернатанты наносили на колонку с необходимым носителем для дальнейшей хроматографической очистки субъединиц eIF2 (Табл. 8). Чтобы добиться желаемой чистоты препарата eIF2α, дополнительно проводили гельфильтрацию на смоле супердекс-75, уравновешенной буфером «И». Общий объем смолы составлял 120 мл, скорость – 24 мл/ч, объем фракции – 1 мл. Фракции, содержавшие очищенные субъединицы eIF2, объединяли и концентрировали на концентраторе VivaSpin-10. Чистоту белковых препаратов оценивали 63 электрофорезом в 15%-ном ПААГ в присутствии ДСН. Содержание примеси нуклеиновых кислот контролировали спектрофотометрически при длине волны 260 нм. Препараты белков расфасовывали по микроцентрифужным пробиркам, замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С. 3.5. Получение препаратов комплексов e/aIF2 Гетеродимер aIF2αD3γ, гетеротример aIF2αD23βγ, а также химерные гетеротримеры eIF2αβ/aIF2γ, eIF2β/aIF2αγ, eIF2β/aIF2αD23γ и eIF2β/aIF2αD3γ получали смешиванием препаратов соответствующих субъединиц aIF2 S. solfataricus и eIF2 S. cerevisiae с последующей очисткой с помощью гель-фильтрации на смоле супердекс-75 или супердекс-200, уравновешенной буфером 50 мМ Трис-НСl, pH 7.5, 200 мM KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ β-МЭ. Количество образца составляло 5-10 мг в объеме 0.5 мл. Общий объем смолы составлял 120 мл, скорость – 24 мл/ч, объем фракции – 1 мл. Таким образом, сначала смешивали aIF2γ с одной из субъединиц в молярном соотношении 1 : 1.2 и получали препарат гетеродимера, который после гель-фильтрации концентрировали на концентраторе VivaSpin-10 до концентрации 20-30 мг/мл. Для реконструкции гетеротримера полученный гетеродимер смешивали с необходимым количеством соответствующей третьей субъединицы и снова проводили гель-фильтрацию в тех же условиях. Фракции, содержавшие гетеротример e/aIF2, объединяли, концентрировали на концентраторе VivaSpin-10 до концентрации 20-30 мг/мл. Для получения химерного комплекса eIF2αΔCβ/aIF2γ клетки штаммов- суперпродуцентов aIF2γ и eIF2αΔC (с 2 и 1 л культуры, соответственно) суспендировали индивидуально в буфере «К», а клетки штамма-суперпродуцента eIF2β (с 0.5 л культуры) суспендировали в буфере «А». Клетки разрушали ультразвуком (режим: общее время 2 мин для eIF2αΔC и eIF2β, 5 мин для aIF2γ; время пульса 10 с; время паузы 10 с) в центрифужных пробирках Falcon во льду. Разрушенные клеточные стенки и мембраны убирали центрифугированием в течение 20 мин при 12 500 g и 4°С. Супернатант, содержащий aIF2γ, дополнительно прогревали 20 мин при 65°С и затем снова центрифугировали в тех же условиях для осаждения денатурированных белков. Супернатанты, каждый из которых содержал одну из трех субъединиц e/aIF2 смешивали, инкубировали 30 мин при 4°С, разводили буфером 50 мМ Трис-НСl, рН 6.8, 0.1 мМ ЭДТА, рН 8.0, 10 мМ β-МЭ до конечной концентрации NaCl 100 мМ и наносили на колонку с носителем S-сефароза (25 мл), уравновешенной буфером «К», со скоростью 30 мл/ч при 4°C. Колонку промывали тем же буфером в течение ночи со скоростью 12 мл/ч. Связавшийся с носителем реконструированный гетеротример e/aIF2 элюировали 64 400 мл линейного градиента концентрации NaCl (0.1 – 1 М) в 50 мМ Трис-НСl, рН 6.8, 0.1 мМ ЭДТА, рН 8.0, 10 мМ β-МЭ. Скорость элюции – 60 мл/ч, объем фракции – 5 мл. Фракции из центральной части пика, содержавшие все три субъединицы (eIF2αΔC, eIF2β и aIF2γ), объединяли и концентрировали на концентраторе VivaSpin-10. Далее белковый препарат разводили в 20 раз буфером «Л» и наносили на колонку с носителем гепаринсефароза (25 мл), уравновешенной тем же буфером, со скоростью 60 мл/ч при 4°C. Колонку промывали 250 мл буфера «Л», а связавшийся с носителем e/aIF2 элюировали 360 мл линейного градиента концентрации KCl (0.1 – 0.65 М) в 10 мМ Трис-НСl, рН 8.0, 10 мМ MgCl2, 1 мМ ЭДТА, рН 8.0, 10 мМ β-МЭ. Объем фракции составлял 4.5 мл. Фракции белка e/aIF2 из центральной части пика объединяли и концентрировали на концентраторе VivaSpin-10 до концентрации 20-25 мг/мл. Чистоту белковых препаратов оценивали электрофорезом в 15%-ном ПААГ в присутствии ДСН. Содержание примеси нуклеиновых кислот контролировали спектрофотометрически при длине волны 260 нм. Растворы белков расфасовывали по микроцентрифужным пробиркам, замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С. 3.6. Спектрофотометрическое определение концентраций белков Определение концентраций белков проводили по поглощению в ультрафиолетовой области спектра (240 – 340 нм). В кювете с длиной оптического пути l = 1 см измеряли поглощение А разбавленного раствора анализируемого вещества. С помощью основного закона светопоглощения A = ελCl вычисляли концентрацию С (моль/л) вещества. Для этого в расчет брали молярный коэффициент поглощения ελ (M-1·см-1) в зависимости от природы поглощающего вещества. Для белков значение коэффициента экстинкции рассчитывали по следующей формуле: A280(1 мг/мл) = (5690nw + 1280ny + 120nc)/M = ε; где nw, ny и nc – количество остатков Trp, Tyr и Cys, соответственно, в полипептиде массой M; 5690, 1280 и 120 – коэффициенты экстинкции для этих остатков, соответственно. 3.7. Электрофорез белков в ПААГ в присутствии ДСН Электрофорез проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970) (с некоторыми изменениями) в вертикально расположенных пластинах геля размером 7×8 см и толщиной 0.75 мм в аппарате Mini Proteаn II. Особенностью этой системы является полимеризация в одной пластине двух гелей: разделяющего (15%-ный ПААГ), и непосредственно над ним концентрирующего (6%-ный ПААГ); для обоих гелей С = 5% (процентное отношение массы метиленбисакриламида к общей массе метиленбисакриламида и акриламида). Буфером для разделяющего геля служил 0.375 М Трис-HCl, pH 8.7 с добавлением ДСН до 65 0.1%. Разделяющий гель полимеризовали на высоту 5 см, концентрирующий на 2 см. Для концентрирующего геля использовали буфер 0.125 М Трис-HCl, рН 6.8, 0.1% ДСН. Для полимеризации геля на 1 мл раствора добавляли 10 мкл 10%-ного персульфата аммония и 1 мкл ТЕМЕД. К белковому препарату добавляли пятикратный буфер для образцов: 0.375 М ТрисHCl, pH 6.8, 60% глицерина или сахарозы, 10% ДСН, 1.4 М β-МЭ и 0.05% бромфенолового синего, и прогревали в течение 5 мин при 99°C. Электродный буфер содержал 0.025 М Триc, 0.192 М глицин, рН 8.3, 0.1% ДСН. Электрофорез проводили при напряжении 30-40 В до вхождения образцов в разделяющий гель, а затем при 90-120 В. Электрофорез останавливали после полного выхода бромфенолового синего из геля. Белки в геле окрашивали кипячением в растворе, содержавшем 0.1% кумасси G-250, 10% уксусной кислоты и 30% этанола, в течение 5 мин. Избыток красителя из геля вымывали теплой 7%-ной уксусной кислотой в течение 25-30 мин. 3.8. Электрофорез белков в ПААГ в неденатурирующих условиях в кислой среде Электрофорез в неденатурирующих условиях в кислой среде успешно используют для фракционирования щелочных белков. В этом случае белки разделяются по размерам и заряду, и они мигрируют в направлении катода. В качестве буфера разделяющего геля (15%-ный ПААГ) использовали 0.12 М ацетат калия, титрованный ледяной уксусной кислотой до pH 4.5. Буфер концентрирующего геля (4%-ный ПААГ) готовили аналогичным титрованием 0.12 М ацетата калия до pH 6.8. Для обоих гелей С = 2.6%. Электродный буфер получали титрованием 0.35 М водного раствора β-аланина ледяной уксусной кислотой до pH 4.5. Белковый препарат смешивали с равным объемом 0.24 М ацетата калия, pH 4.5, содержавшего 20% глицерина или сахарозы. В качестве лидирующего красителя для электрофореза в кислой среде использовали метиленовый синий до 0.001%. Окрашивание геля производили кипячением в 0.1%-ном растворе кумасси G-250 с 10%-ной уксусной кислотой и 30%-ным этанолом. 3.9. Кристаллизация aIF2γ и ее мутантных форм в свободной и нуклеотид-связанных формах В экспериментах по кристаллизации мы использовали метод диффузии паров в висящей капле (Davies and Segal, 1971). На силиконизированное покровное стекло (16х16 мм) наносили раствор белка (20-50 мг/мл в 50 мМ Трис-HCl, pH 7.5, 200 мМ NaCl, 10 мМ β-меркаптоэтанол) и осадителя. Раствор нуклеотида добавляли в каплю в молярном соотношении белок : нуклеотид равном 1 : 10. Стеклом с обращенной вниз каплей 66 накрывали стаканчик (объемом 2 мл), наполненный 400 мкл противораствора-осадителя, края которого предварительно обрабатывали вакуумной смазкой для герметичности системы. При подборе условий кристаллизации γ-субъединицы aIF2 и ее мутантных форм использовали коммерческие наборы Clear Strategy Screen, Grid Screen Salt, Stura. Кристаллизацию вели при 22 или 28°C. Непосредственно перед сбором дифракционных данных кристаллы кратковременно вымачивали в криорастворе, после чего мгновенно замораживали при температуре 100 K в струе жидкого азота. 4. Биохимические методы при работе с РНК и нуклеотидами 4.1. Получение и очистка фрагментов мРНК Все фрагменты мРНК были получены транскрипцией in vitro. Для получения фрагментов мРНК рибосомного белка L1 архей Methanococcus vannielii и M. jannashii длиной 36 и 49 н. о., соответственно (MvaL1мРНК-36 и MjaL1мРНК-49) использовали линеаризованные с помощью рестриктазы SmaI плазмиды на основе вектора pUC18 (Nevskaya et al., 2005; Tishchenko et al., 2006), содержавшие под контролем Т7-промотора фрагменты генов белка L1. Фрагмент мРНК ацетил-КоА-ацетилтрансферазы S. solfataricus (SsoACAT) был транскрибирован с синтетического ДНК-олигонуклеотида, заключавшего в себе 30-ти нуклеотидный фрагмент гена SsoACAT (выделен жирным шрифтом) и прилегающую последовательность Т7-промотора (а именно T7 φ6.5 промотора): 5’-ATATAGTTTTCCGGCAAATCCTACAATCATCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’. С помощью второго ДНК-олигонуклеотида 5’-TAATACGACTCACTATAG-3’, называемого Т7-адаптером, или Т7-топом, формировали двуспиральный участок Т7-промотора. Для этого Т7-адаптер и олигонуклеотид-матрицу смешивали в эквимолярных количествах, денатурировали 2 мин при 90°С с последующим отжигом в течение медленного охлаждения до 25°С. Реакционная смесь (1 мл) содержала 50 мкг ДНК-матрицы, 80 мМ Hepes-KOH, pH 7.5, 40 мМ ДТТ, 1 мМ спермидин, MgCl2, четыре рибонуклеозидтрифосфата (ATФ, ГТФ, ЦTФ, УТФ) и 2000 ед. активности Т7-РНК-полимеразы (собственного производства). Концентрации MgCl2 и рибонуклеотидов зависели от нуклеотидного состава мРНК и были подобраны в каждом случае экспериментально (Табл. 9). Инкубацию проводили в течение 3 ч при 37°С. С помощью центрифугирования в течение 15 мин при 14 000 g и 4°С удаляли побочный продукт транскрипции – пирофосфат. 67 Таблица 9. Условия транскрипции фрагментов мРНК. Фрагмент мРНК Концентрация MgCl2 Концентрации ATФ, ГТФ, ЦТФ Концентрация УТФ SsoACATмРНК-30 22 мМ 4 мМ каждого 1 мМ MvaL1мРНК-36 31 мМ 6 мМ каждого 6 мМ MjaL1мРНК-49 15 мМ 4 мМ каждого 1 мМ Анализ и очистку транскриптов РНК проводили с помощью электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях. Для этого транскрибированную РНК осаждали тремя объемами этанола и 1/10-той объема 3 М ацетата калия, рН 5.5 в пробирке Falcon и оставляли при -20°С на ночь. Далее осажденную РНК центрифугировали 30 мин при 12 500 g и 4°С и растворяли в 600 мкл буфера 90 мМ Трис-ацетат, pH 7.8, 5 мМ ЭДТА, 8 М мочевина. Чтобы избежать перегрузки, на одну пластину геля нагружали 1/4-ую часть полученного раствора РНК. Режим электрофореза описан в пункте 4.4. Полосу геля, содержавшую РНК, вырезали и измельчали до мелкой крошки между двумя листами парафильма поступательными движениями стеклянной палочки. Измельченный гель переносили шпателем в центрифужную пробирку Falcon и заливали тремя объемами буфера «М». Элюцию РНК из геля вели ночь при 4°С с качанием. Затем суспензию геля центрифугировали в течение 10 мин при 12 500 g и 4°С; полученный супернатант наносили на колонку с насителем ДЕАЕ-сефароза (7 мл), уравновешенной буфером «М». Скорость протока составляла 60 мл/ч. Далее колонку промывали 50 мл того же буфера. РНК элюировали 1 М NaCl в 50 мМ Трис-HCl, pH 7.5 и 10 мМ MgCl2. Объем фракции составлял 1 мл. Фракции, содержавшие РНК, объединяли, к ним добавляли три объема этанола и 1/10 объема 3 М ацетата калия, рН 5.5 и оставляли при -20°С на ночь. Далее осажденную РНК центрифугировали в течение 30 мин при 12 500 g и 4°С, надосадочную жидкость удаляли, а осадок подсушивали и растворяли в буфере «Н». Препарат РНК хранили при -20°С. Препараты фрагментов мРНК длиной 40 и 41 н. о. (ompAмРНК-40, A-ompAмРНК41) были любезно предоставлены доктором Удо Блэзи (Венский биоцентр, Австрия). Фрагмент мРНК ompAмРНК-40, соответствующий −21 по +19 н. о. мРНК белка ompA E. coli (Moll et al., 2003), и аналогичный фрагмент мРНК, но содержащий дополнительный аденозинтрифосфат на 5’-конце, были получены транскрипцией in vitro с помощью T7-РНК полимеразы. При этом в случае ompAмРНК-40 ДНК матрица содержала T7 φ6.5 промотор (5’-TAATACGACTCACTATAG-3’), а в случае A-ompAмРНК-41 – T7 φ2.5 промотор (5’-TAATACGACTCACTATTA-3’) (Coleman et al., 2004), в результате чего 68 синтезируемые фрагменты мРНК на 5’-конце несли ГТФ или АТФ, соответственно (выделены жирным шрифтом в последовательности промоторов). 4.2. Препаративное выделение и очистка инициаторной тРНК E. coli из клеток штамма-суперпродуцента Компетентные клетки E. coli штамм MRE 600 трансформировали плазмидой pUC18-metY (Столбоушкина, 2009) и высевали на чашку с агаризованной LB средой (LB-агар), содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Затем одну колонию переносили в пробирку с 3 мл среды LB с ампициллином (100 мкг/мл) и инкубировали при 37°С с качанием в течение 6 часов. Далее культуру переносили в 1 литр LB среды, содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и выращивали клетки в течение 20-21 часа при 37°С с качанием. Культуру клеток центрифугировали при 6 000 g, 4°С в течение 15 мин. Клеточную биомассу переносили в центрифужную пробирку Falcon, ресуспендировали в 5 мл охлажденного 0.9% KCl и центрифугировали при 6 000 g, 4°С в течение 5 мин. Надосадочную жидкость удаляли, а клетки взвешивали. Получение препарата суммарной тРНК осуществляли по классической методике Zubay (1962) с небольшими изменениями. Все операции кроме тех, что указаны, проводили при 4°С. Клетки (6 г), полученные с 1 л культуры, суспендировали в 12 мл буфера 1 мМ Трис-HCl, рН 7.4, 10 мМ ацетат магния и смешивали с 10.5 мл фенола, насыщенного водой. Смесь подвергали энергичному перемешиванию в течение 1 часа в пробирке Falcon, а затем центрифугировали в течение 30 мин при 12 500 g. Водную фазу аккуратно отбирали, переносили в чистую пробирку Falcon, добавляли 1/20-тую объема 20% ацетата калия, рН 5.0 и два объема этанола и оставляли при -20°С на 3 часа. Далее проводили центрифугирование в течение 30 мин при 12 500 g, супернатант удаляли, а осадок подсушивали и растворяли в 6 мл охлажденного 1 М NaCl. Пробирку с раствором выдерживали во льду в течение 1 часа, раствор периодически ресуспендировали. Агрегировавшие высокомолекулярные нуклеиновые кислоты удаляли центрифугированием при 12 500 g в течение 30 мин. Осадок повторно экстрагировали в 3 мл 1 М NaCl с последующим центрифугированием. Супернатанты, полученные после двух экстракций, объединяли и суммарную тРНК осаждали двумя объемами этанола в течение ночи при -20°С с последующим центрифугированием (30 мин, 12 500 g). Затем полностью повторяли стадию экстракции тРНК 1М NaCl. Далее полученный после осаждения спиртом осадок растворяли в 600 мкл 2 М Трис-HCl, рН 8.8 и инкубировали 3 часа при 37°С с целью деаминоацилирования тРНК. Содержимое пробирки охлаждали во льду, к раствору добавляли 200 мкл 5 М NaCl и два объема этанола и оставляли при 69 -20°С на ночь. После центрифугирования (30 мин, 12 500 g) осадок подсушивали, растворяли в 3.9 мл 300 мМ ацетата натрия, pH 7.5 и порциями добавляли 2.1 мл охлажденного изопропанола. Смесь интенсивно перемешивали и центрифугировали при комнатной температуре в течение 15 мин при 12 500 g. Супернтатант переносили в пробирку Falcon при комнатной температуре, а осадок растворяли в 2.5 мл 300 мМ ацетата натрия, pH 7.0, порциями добавляли 1.3 мл охлажденного изопропанола (с интенсивным перемешиванием) и центрифугировали при комнатной температуре в течение 15 мин при 12 500 g. К объединенным после двух экстракций супернатантам добавляли 0.45 объема (примерно 4.5 мл) изопропанола комнатной температуры. Смесь интенсивно перемешивали и помещали на 10 мин в ледяную баню. Полученный после центрифугирования (25 мин, 12 500 g, 4°С) осадок подсушивали, растворяли в 600 мкл воды и суммарную тРНК осаждали тремя объемами этанола и 1/10-той объема 3 М ацетата калия, рН 5.5 в течение ночи при -20°С. При необходимости полностью повторяли стадию экстракции тРНК ацетатом натрия и изопропанолом. Осадок после центрифугирования растворяли в 2 мл буфера «О» и четверть объема раствора тРНК наносили на колонку с носителем MonoQ (1 мл), уравновешенной тем же буфером. Скорость протока составляла 24 мл/ч. Далее колонку промывали 10 мл буфера «О». РНК элюировали 24 мл линейного градиента концентрации NaCl (0.2 – 0.75 М) в 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 8 мМ MgCl2, 0.1 мМ ЭДТА. Объем фракции составлял 0.5 мл. Состав каждой фракции анализировали электрофорезом в 15%-ном ПААГ в денатурирующих условиях. Фракции, содержавшие чистый препарат тРНК, замораживали и хранили при -20°С. 4.3. Аминоацилирование тРНК Реакцию аминоацилирования инициаторной тРНК E. coli проводили по ранее описанной методике (Столбоушкина, 2009) в течение 5 мин при 25°С. Реакционная смесь (1 мл) содержала 30 мМ Трис-HCl, рН 8.0, 30 мМ KCl, 8 мМ MgCl2, 3 мМ ATФ, 1 мМ ДТТ, 0.1 мМ ЭДТА, 40 мкМ метионин, 1 мг инициаторной тРНК и 70 мкг рекомбинантной метионил-тРНК-синтетазы MetRS (собственного производства). После реакции аминоацилирования пробирку помещали в лед, и все дальнейшие операции проводили быстро при 4°С. К смеси добавляли равный объем охлажденного фенола, насыщенного водой, интенсивно перемешивали на шейкере и центрифугировали в течение 2 мин при 12 500 g. Водную фазу (1 мл) отбирали в центрифужную пробирку с 0.5 мл фенола, насыщенного водой, и 0.5 мл смеси хлороформа и изоамилового спирта, смешанных в соотношении 24 : 1. После интенсивного перемешивания смесь центрифугировали (2 мин, 70 12 500 g), водную фазу отбирали и Met-тРНКf осаждали из нее при -70°С тремя объемами этанола и 1/10-той объема 3 М ацетата калия, рН 5.5. Замороженный препарат Met-тРНКf можно хранить в течение месяца. 4.4. Электрофорез РНК в ПААГ в денатурирующих условиях Для этой цели использовали 15%-ный ПААГ (С=5%), полимеризованный в 90 мМ Трис-ацетатном буфере, pH 7.8 с 5 мМ ЭДТА и 8 М мочевины. РНК предварительно денатурировали в таком же буфере. В качестве лидирующего красителя использовали бромфеноловый синий с конечной концентрацией 0.01%. Использовали электродный буфер: 90 мМ Трис-ацет, pH 7.8, 5 мМ ЭДТА. Электрофорез вели при напряжении 90-120 В в вертикально расположенных пластинах геля размером 7×8×0.075 см (аппарат Mini Proteаn II) и 10.5×10.5×0.15 см для очистки РНК (аппарат HoeferTM Dua Gel Caster). После окончания электрофореза РНК в геле окрашивали в растворе, содержавшем 0.25% толуидинового синего, 5% уксусной кислоты и 10% этанола, в течение 15-20 мин при комнатной температуре. Избыток красителя из геля вымывали диффузией в воде. В случае препаративной очистки РНК, для ее визуализации использовали ультрафиолетовую лампу, что позволяло исключить окрашивание геля. 4.5. Препаративная очистка нуклеотидов 5 мг нуклеотида (GDPNP, ГТФ, ГДФ) растворяли в 500 мкл 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5 и наносили со скоростью 24 мл/ч на колонку со смолой MonoQ (1 мл), уравновешенной 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5. Колонку промывали 10 мл 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5 и нуклеотид элюировали 30 мл линейного градиента концентрации NaCl (0 – 1 М) в 20 мМ Трис-HCl, pH 7.5. Объем фракции составлял 0.5 мл. Концентрацию нуклеотида в каждой фракции определяли спектрофотометрически, далее фракции замораживали и хранили при -20°С. 4.6. Анализ чистоты препаратов нуклеотидов Использованные в работе нуклеотиды проверяли методом тонкослойной ионообменной хроматографии на пластинах PEI-целлюлозы (Merck, Германия) длиной 20 см. Раствор препарата наносили на поверхность слоя сорбента на расстоянии 1.5 см от нижнего края пластины. Количество нуклеотида, вносимого в пятно, составляло 12 мкг. Восходящую хроматографию проводили в буфере 0.1 М Трис-HCl, рН 8.0, 0.5 М LiCl в течение 2 часов при комнатной температуре в стеклянной камере с плоским дном и притертой крышкой. Для детектирования нуклеотидов использовали ультрафиолетовую лампу. 71 4.7. Спектрофотометрическое определение концентраций нуклеиновых кислот и нуклеотидов Определение концентраций нуклеиновых кислот и нуклеотидов проводили аналогично определению концентрации белков (см. пункт 3.6). Молярный коэффициент поглощения ελ (M-1·см-1) при pH 7.0 для ГДФ, ГТФ и его аналогов ε253 = 13700. В случае количественного определения нуклеиновых кислот руководствовались тем, что раствор, содержащий 1 мг/мл РНК, характеризуется А260 = 24, а для ДНК А260 = 20. 5. Биохимические методы при работе с РНК-белковыми комплексами 5.1. Получение мРНК-белковых комплексов Препарат мРНК прогревали при 65°С в буфере «Н» в течение 5 мин, а затем охлаждали 1 мин во льду. γ-Субъединицу aIF2 смешивали с мРНК в эквимолярном соотношении и выдерживали при комнатной температуре (25°C) 10-15 мин. Нуклеотид (ГТФ или ГДФ) добавляли либо к мРНК-белковому комплексу, либо к белку до того, как смешать его с мРНК. Объем препарата составлял 20 мкл. Концентрация РНК, белка и нуклеотида в смеси – 10 мкМ каждого, в экспериментах с ompAмРНК – 2 мкМ каждого. Образцы инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре. При необходимости готовили двойной объем смеси и после 10 мин инкубации при 25°C делили смесь на две части: одну оставляли при 25°C, а другую прогревали 5 мин при 65°С. Анализ РНКбелковых комплексов проводили с помощью электрофореза в ПААГ в неденатурирующих условиях. 5.2. Электрофорез РНК-белковых комплексов в ПААГ Для проведения гель-шифта РНК-белковые комплексы подвергали электрофорезу в вертикально расположенных пластинах геля размером 7×8 см и толщиной 0.75 мм в аппарате Mini Proteаn II. Состав геля: 8% ПААГ (С = 5%), 90 мМ Трис-ацетат, рН 7.8, 10 мМ MgCl2. Препарат комплекса смешивали с равным объемом буфера для образцов: 180 мМ Трис-ацетата, рН 7.8, 20 мМ MgCl2, 20% глицерина или сахарозы и 0.02% бромфенолового синего. Условия электрофореза: электродный буфер – 90 мМ Трис-ацетат, рН 7.8, 10 мМ MgCl2; напряжение – 90 В. Электрофорез прерывали после полного выхода бромфенолового синего из геля. Для визуализации РНК гель красили бромистым этидием (0.5 мкг/мл) и анализировали по ультрафиолетовому поглощению в 72 трансиллюминаторе; либо гель окрашивали в растворе, содержавшем 0.25% толуидинового синего, 5% уксусной кислоты и 10% этанола в течение 15-20 мин при комнатной температуре и затем отмывали краску из геля в теплой воде. Электрофорез в описанных условиях также проводили для определения связывания aIF2γ с флуоресцентно-меченым нуклеотидом (MANT-GDP), при этом меняли полярность электродов. MANT-GDP в геле визуализировали в ультрафиолетовом свете, затем для визуализации белков гель окрашивали кипячением в растворе, содержавшем 0.1% кумасси G-250, 10% уксусной кислоты и 30% этанола, в течение 5 мин. Избыток красителя из геля вымывали теплой 7%-ной уксусной кислотой в течение 25-30 мин. 5.3. Электрофорез РНК-белковых комплексов в геле агарозы РНК-белковые комплексы подвергали электрофорезу в горизонтально расположенных пластинах 3%-ного геля агарозы размером 7×10×0.7 см в аппарате Mini-Sub® Cell GT. Буфер геля – 90 мМ Трис-ацетат, рН 7.8, 5 мМ MgCl2. Бромистый этидий вводили непосредственно в гель до концентрации 1 мкг/мл. Препарат комплекса смешивали с равным объемом буфера 180 мМ Трис-ацета, рН 7.8, 20 мМ MgCl2, 20% глицерина или сахарозы, 0.02% бромфенолового синего. Образцы вносили в слоты, расположенные на середине геля и начинали электрофорез. Условия электрофореза: электродный буфер – 90 мМ Трис-ацетат, рН 7.8, 5 мМ MgCl2; напряжение – 90 В. Электрофорез прерывали в тот момент, когда до выхода бромфенолового синего из геля оставался 1 см. РНК в комплексе анализировали по ультрафиолетовому поглощению в трансиллюминаторе. Для оценки присутствия белка в комплексе гель окрашивали в растворе, содержавшем 0.1% кумасси G-250, 10% уксусной кислоты и 30% этанола, в течение ночи при комнатной температуре. Избыток красителя из геля вымывали диффузией в 7%-ной уксусной кислоте. 5.4. Анализ РНК-белковых комплексов методом поверхностного плазмонного резонанса 5.4.1. Биотинилирование фрагмента РНК Фрагменты мРНК, полученные транскрипцией in vitro с использованием Т7 РНКполимеразы, были очищены согласно методике, описанной в пункте 4.1. Олигонуклеотид с фосфатной группой на 5’-конце и с молекулой биотина на 3’-конце 5’-GCGCAGCGAG-биотин-3’ (Синтол) присоединялся к фрагменту РНК с помощью фермента T4 РНК-лигазы. Реакционная смесь (50 мкл) содержала по 60 мкМ фрагмента мРНК и биотинилированного олигонуклеотида, 1 мМ гексамин хлорид кобальта (III), 73 4% диметилсульфоксида, 0.1 мг/мл БСА, 5 мкл соответствующего буфера 10-ти кратной концентрации, 25 ед. активности РНК-лигазы. Перед добавлением фермента смесь прогревали в течение 5 мин при 60°С. Реакцию лигирования проводили в течение 3 часов при 37ºС, после чего РНК высаживали тремя объемами этанола и 1/10-той объема 3 М ацетата натрия, рН 5.5 в течение ночи при -20°С. Затем РНК собирали центрифугированием (30 мин, 12 500 g, 4°С) и очищали с помощью электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях (пункт 4.4). Нужную полосу вырезали, гель измельчали растиранием между двумя листами парафильма. Элюцию РНК проводили в 500 мкл буфера 100 мМ Трис-HCl, pH 7.5, 500 мМ NaCl, 0.5% ДСН, 10 мМ ЭДТА, pH 8.0 в течение 2 часов при 22°C на шейкере. Затем суспензию геля центрифугировали 10 мин при 12 500 g и 4°С, раствор РНК смешивали с равным объемом смеси фенола и хлороформа (1:1) и тщательно встряхивали до образования однородной эмульсии. Для разделения фаз эмульсию центрифугировали (14 000 g, 3-5 мин, 4°C). Депротеинизацию проводили 1-2 раза до полного исчезновения интерфазы. Затем водную фазу отбирали и осаждали из нее РНК тремя объемами этанола и 1/10-той объема 3 М ацетата натрия, pH 5.5, в течение ночи при -20С. Далее РНК собирали центрифугированием (14 000 g, 30 мин, 4С) и растворяли в 50 мкл (до концентрации 0.3 мг/мл) буфера «П», используемого в экспериментах по связыванию на приборе ProteOn XPR36 (Bio-Rad, США). Препарат биотинилированной РНК расфасовывали по 3 мкл и замораживали при -20°C. Для проверки эффективности присоединения биотинилированного олигонуклеотида к фрагменту мРНК полученный препарат смешивали со стрептавидином в эквимолярных количествах и анализировали методом электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях (пункт 4.4). 5.4.2. Модификация поверхности чипа Чип NLS промывали в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя трехкратными инъекциями раствора 1 M NaCl, 50 мМ NaOH со скоростью протока 30 мкл/мин. Биотинилированную РНК прогревали 5 мин при 60ºC, охлаждали до комнатной температуры. Все дальнейшие эксперименты проводились при 25°C. Препарат РНК разводили в 500 раз буфером «П» и впрыскивали по одному из каналов чипа со скоростью протока 30 мкл/мин до достижения единиц ответа 400-500 RU. Несвязанную с поверхностью чипа РНК отмывали 0.05% раствором ДСН. 74 5.4.3. Определение констант ассоциации и диссоциации методом поверхностного плазмонного резонанса Препарат белка (γ-субъединица aIF2 и ее мутантные формы) диализовали против буфера «П». Для каждого эксперимента последовательным разведением готовили растворы белка с пятью разными концентрациями. Раствор белка объемом 350 мкл впрыскивали по двум каналам чипа со скоростью протока 30 мкл/мин. Сенсограммы были скорректированы с учетом эффекта неспецифического связывания белка с авидином в свободном от РНК канале. Время прохождения белка по каналам (время ассоциации) составляло 300 с, время диссоциации (промыв поверхности чипа буфером «П») – 3600 с. После окончания эксперимента белки, связанные с чипом, удаляли пропусканием раствора 0.5% ДСН в течение 2-5 мин со скорость протока 30 мкл/мин. Результирующие кривые связывания были проанализированы с использованием пакета программ BIAеvaluation. 5.5. Получение и препаративная очистка тройственных комплексов aIF2•GDPNP•Met-тРНКf и e/aIF2•GDPNP•Met-тРНКf Тройственные комплексы фактора инициации трансляции 2 с негидролизуемым аналогом ГТФ, GDPNP, и инициаторной Met-тРНК получали по схеме, описанной ранее (Столбоушкина, 2009). Для этого использовали архейный гетеродимер aIF2αD3γ или полноразмерный гетеротример aIF2αβγ, а также различные варианты химерных гетеротримеров e/aIF2 (eIF2αβ/aIF2γ, eIF2αΔCβ/aIF2γ, eIF2β/aIF2αγ, eIF2β/aIF2αD23γ и eIF2β/aIF2αD3γ). Препарат белка смешивали с GDPNP в молярном соотношении 1 : 4 и инкубировали 10-20 мин при 4°С. Высаженную этанолом Met-тРНКf E. coli (см. пункт 4.3) собирали центрифугированием (30 мин, 12 500 g, 4°С) и растворяли в 180 мкл охлажденной воды. Все последующие операции проводили быстро при 4°С. Микроцентрифужные вытянутые пластиковые пробирки с крышкой и усеченным на конце конусом набивали смолой сефадекс G25 (300-400 мкл), уравновешенной водой, делали небольшой надрез у основания и вставляли в пробирку eppendorf через проделанное в крышке отверстие. Такую конструкцию помещали в центрифужные пробирки Falcon и центрифугировали 5 мин при 4 000 об/мин в бакетном роторе S40 (Jouan, США). В каждую пробирку со смолой вносили по 30-40 мкл раствора Met-тРНКf, переносили в чистые пробирки eppendorf с отверстиями и снова центрифугировали в тех же условиях. Полученные аликвоты очищенного препарата Met-тРНКf объединяли, затем смешивали с нуклеотид-связанным белком aIF2•GDPNP (или e/aIF2•GDPNP) и инкубировали 10-20 мин при 4°С. Молярное соотношение белок : РНК составляло 1 : 1.5. 75 Полученный тройственный комплекс aIF2•GDPNP•Met-тРНКf (или e/aIF2•GDPNP•Met-тРНКf) в объеме 500 мкл наносили со скоростью 30 мл/ч на колонку с носителем супердекс-75 или супердекс-200 (120 мл), уравновешенным буфером 50 мМ Трис-HCl, рН 6.8, 40 мМ NH4Cl, 100 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 0.5 мМ ДТТ, 10 мкМ GDPNP. Объем фракции составлял 1 мл. Состав каждой фракции анализировали с помощью электрофореза в геле агарозы (см. пункт 5.3). Фракции, содержавшие тройственный комплекс, объединяли, добавляли сульфат аммония в сухом виде до 30% насыщения, перемешивали до полного растворения соли и концентрировали на концентраторе VivaSpin-10 до 300-500 мкл. Тройственный комплекс высаживали добавлением сульфата аммония до 65% насыщения и хранили при 4°С. Непосредственно перед экспериментами по кристаллизации осадок собирали центрифугированием (1 час, 14 000 g, 4ºС) и растворяли в буфере «Р». 5.6. Кристаллизация тройственных комплексов aIF2•GDPNP•Met-тРНКf и e/aIF2•GDPNP•Met-тРНКf Кристаллизацию тройственных комплексов вели при 4 или 12°С методом диффузии паров в висящей или сидячей капле (Davies and Segal, 1971) как вручную, так и с использованием роботов для кристаллизации. Для этого 0.2-2 мкл раствора e/aIF2•GDPNP•Met-тРНКf с концентрацией комплекса 3-6 мг/мл, находившемся в буфере «Р», смешивали с равным объемом противораствора-осадителя. Каплю уравновешивали против 50-400 мкл противораствора. Поиск условий кристаллизации проводили с использованием коммерческих наборов растворов для кристаллизации РНК-белковых комплексов: Natrix (Hampton Research, США), Nucleix, AmSO4 (QIAGEN, Германия) и NucPro (Jena Bioscience, Германия). 76 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Получение и кристаллизация архейного тройственного комплекса aIF2•GDPNP•Met-тРНКf У эукариот и архей фактор инициации трансляции 2 состоит из трех субъединиц: α, β и γ. В ГТФ-связанной форме этот фактор позиционирует инициаторную метионил-тРНК в P-участок малой рибосомной субчастицы. Важная роль архейного и эукариотического факторов инициации трансляции 2 в процессе инициации биосинтеза белка определяет большой интерес к их пространственным структурам. В отличие от эукариотических белков белки гипертермофильных архей обладают повышенной термостабильностью, что существенно облегчает работу по их выделению и кристаллизации. Это обстоятельство позволило добиться успехов в исследовании структуры архейного фактора aIF2, для которого были определены структуры изолированных субъединиц, гетеродимеров и неполного гетеротримера. В 2008 году нашей группой была впервые определена кристаллическая структура полноразмерного гетеротримера aIF2 (см. Рис. 7 в разделе «Обзор литературы»), анализ которой выявил высокую междоменную подвижность в α- и β-субъединицах (Stolboushkina et al., 2008). Было показано, что молекула aIF2 состоит из конформационно-стабильной центральной части, содержащей γ-субъединицу, 3 домен α-субъединицы и N-концевую α-спираль β-субъединицы, и двух подвижных «крыльев» – 1 и 2 домены α-субъединицы, с одной стороны, и центральный и С-концевой домены β-субъединицы, с другой стороны (домены α-субъединицы e/aIF2 обозначены арабскими цифрами: 1, 2 и 3, чтобы отличать их от доменов γ-субъединицы: I, II и III). Следующим этапом было определение пространственной структуры тройственного комплекса фактора инициации трансляции 2 с ГТФ и инициаторной метионил-тРНК. Это наиболее важное функциональное состояние данного фактора, в котором он взаимодействует и с тРНК и с рибосомой. Для кристаллизации тройственного комплекса был выбран конформационно-стабильный гетеродимер γ-субъединицы aIF2 с изолированным 3 доменом α-субъединицы (aIF2αD3γ), который согласно литературным данным необходим и достаточен для того, чтобы фактор aIF2 связал инициаторную тРНК (Yatime et al., 2004). Выделение aIF2γ осуществляли по ранее разработанной методике (Nikonov et al., 2007), включающей прогрев белкового экстракта при 65°C и две стадии колоночной хроматографии. Делецию двух подвижных доменов aIF2α S. solfataricus проводили с 77 помощью генно-инженерных методов путем замены кодона Glu174 на инициаторный ATG кодон. При выделении aIF2αD3, аналогично выделению aIF2γ, использовали прогрев клеточного лизата при 65°С, после чего белок очищали с использованием ионообменной (S-сефароза) и гидрофобной хроматографий. Гомогенный препарат αD3γ-гетеродимера получали смешиванием γ-субъединицы aIF2 с небольшим избытком 3 домена α-субъединицы aIF2 (в молярном соотношении 1 : 1.2) с последующей гель-фильтрацией на смоле супердекс-75. Для получения тройственного комплекса мы использовали бактериальную Met-тРНКf, поскольку согласно биохимическим данным архейный фактор инициации трансляции 2, практически, с одинаковым сродством взаимодействует как с архейной инициаторной Met-тРНКi, так и с бактериальной Met-тРНКf (Yatime et al., 2004, 2006). Суперпродукцию тРНКf проводили в штамме E. coli MRE600, не содержащем РНКазы I. Такие клетки трансформировали плазмидой pUC18-metY (Столбоушкина, 2009), содержащей ген предшественника бактериальной инициаторной тРНК, ограниченный собственными природными промотором и терминатором. В результате процессинга в клетках образуется зрелая тРНКf с уникальными 5’- и 3’-концами и необходимыми модификациями. Препарат суммарной тРНК, полученный по ранее описанной методике (Zubay, 1962) (см. раздел «Материалы и методы», пункт 4.2), фракционировали на колонке с анионообменной смолой MonoQ и анализировали с помощью электрофореза в геле с мочевиной. Таким образом, с 1 л культуры штамма-продуцента мы получали до 3 мг гомогенной тРНКf E. coli. Аминоацилирование тРНКf метионином проводили с помощью каталитического домена метионил-тРНК-синтетазы E. coli. Чтобы понизить эффективность спонтанного деаминоацилирования, все операции с Met-тРНКf в свободном состоянии проводили быстро на холоду. Реакционную смесь после аминоацилирования депротеинизовали фенолом, Met-тРНКf осаждали этанолом и переводили в водный раствор с помощью гель-фильтрации на сефадексе G25. При сборке тройственного комплекса препарат aIF2αD3γ инкубировали с негидролизуемым аналогом ГТФ (GDPNP) в молярном соотношении белок : нуклеотид равном 1 : 4. Использование вместо ГТФ его негидролизуемых аналогов приводило к образованию более стабильного тройственного комплекса, что увеличивало шансы на успех в получении кристаллов. Препарат GDPNP фирмы Sigma, который, как было показано ранее (Nikonov et al., 2007), содержит примесь ГДФ, предварительно очищали с помощью ионообменной хроматографии на MonoQ. К смеси белка и нуклеотида добавляли полученный препарат Met-тРНКf в молярном соотношении белок : РНК равном 1 : 1.5 из расчета, что не вся инициаторная тРНК 78 находится в аминоацилированном состоянии. Препарат реконструированного тройственного комплекса инкубировали в течение 20 мин и очищали от избытка тРНКf и нуклеотида с помощью гель-фильтрации на колонке со смолой супердекс-75. На рисунке 16 представлен хроматографический профиль, три пика которого по данным электрофоретического анализа соответствуют тройственному комплексу, свободной тРНКf и свободному нуклеотиду. Фракции, содержавшие комплекс aIF2αD3γ•GDPNP•MetтРНКf, объединяли и концентрировали, затем тройственный комплекс осаждали добавлением сульфата аммония. Оптическая плотность, mAU 4 500 2 220 нм 260 нм 280 нм 4 000 3 500 1 3 000 2 500 2 000 1 500 1 000 3 500 0 -500 0 5 10 Объем, мл 15 20 25 Рис. 16. Профиль гель-фильтрации смеси aIF2αD3γ + GDPNP + Met-тРНКf на супердекс-75 (общий объем смолы 24 мл). Три пика соответствуют 1. aIF2αD3γ•GDPNP•Met-тРНКf, 2. тРНКf, 3. GDPNP. Поиск условий кристаллизации проводили методом диффузии паров в висящей капле с использованием коммерческого набора растворов Natrix (Hampton Research, США) для кристаллизации РНК-белковых комплексов. Эта работа проводилась совместно с Е.А. Столбоушкиной. В результате нам удалось получить кристаллы комплекса aIF2αD3γ•GDPNP•Met-тРНКf в условиях, где в качестве осаждающего реагента использовался сульфат аммония. Кристаллы появлялись при температуре 12°C через 6-8 дней и достигали максимальных размеров 7050180 мкм (Табл. 10). На синхротроне в Гамбурге (линия X12 станции DESY, Германия) был собран набор дифракционных данных. Анализ этих данных показал, что кристалл содержит элементарные ячейки в двух различных ориентациях, причем процентное содержание таких ячеек одинаково (совершенный твиннинг). Работа по решению и анализу структуры тройственного комплекса проводилась совместно с группой С.В. Никонова (Институт белка РАН, Пущино). В результате структуру комплекса удалось определить с разрешением 3.2 Å (Stolboushkina et al., 2013). 79 Таблица 10. Результаты экспериментов по кристаллизации комплекса гетеродимера aIF2αD3γ с GDPNP и Met-тРНКf. Объект и фото кристалла aIF2αD3γ•GDPNP• Met-тРНКf Условия кристаллизации В капле: 45% насыщения (NH4)2SO4, 30 мМ Трис-HCl, pH 7.5, 300 мМ NDSB 195 В противорастворе: 60-70% насыщения (NH4)2SO4 Температура 12°C Крио: 20% (v/v) этиленгликоль, 50% насыщения (NH4)2SO4, 0.5 М NDSB 195, 2 мМ ДТТ, 1 мМ GDPNP Статистика набора Предел разрешения 3.2 Å Пространственная группа P3121 Параметры ячейки: 93.68, 93.68, 220.03 (Å) 90.00, 90.00, 120.00 (°) Доля твиннинга 0.5 PDB код 3QSY Общими очертаниями молекула тройственного комплекса aIF2αD3γ•GDPNP•MetтРНКf напоминает правильный треугольник со стороной около 90 Å, в вершинах которого расположены «цинковый палец» γ-субъединицы, 3 домен α-субъединицы и антикодоновая петля тРНКf (Рис. 17). γ Met-тРНКf Рис. 17. Схематическое изображение пространственной aIF2αD3γ•GDPNP•Met-тРНКf (PDB код 3QSY). структуры комплекса В полученной структуре домены γ-субъединицы и 3 домен α-субъединицы имеют топологию, наблюдаемую в ранее определенных структурах aIF2, однако II и III домены γ-субъединицы повернуты на 10° и смещены примерно на 15 Å относительно I(G)-домена 80 по сравнению с их ориентацией в структуре αγ-димера aIF2 (Yatime et al., 2006) (Рис. 18). В результате такого смещения образуется глубокая щель между I(G) и III доменами aIF2γ. Рис. 18. Наложение структуры aIF2αγ гетеродимера (показана оранжевым цветом, PDB код 2AHO) на структуру aIF2αD3γ из полученного тройственного комплекса (показана синим цветом). Наложение проводилось по I(G)-домену γ-субъединицы aIF2. Основная часть молекулы тРНКf в представленном тройственном комплексе сохраняет свою общую топологию, но значительным изменениям подвергается ее акцепторный черешок. CCA-конец Met-тРНКf располагается в сформировавшейся щели между I(G) и III доменами aIF2γ, при этом остаток метионина находится в гидрофобной впадине, образованной остатками Phe124, Pro125, Phe133, Phe169, Leu336, Val340 и Met345, а его SD атом формирует водородную связь с Arg130. 5’-Конец тРНКf расположен между I(G) и II доменами γ-субъединицы aIF2. Анализ структуры тройственного комплекса показал полное соответствие структурных данных с полученными ранее биохимическими данными и данными химического пробинга по взаимодействию Met-тРНКi с доменами γ-субъединицы и с доменом 3 α-субъединицы aIF2 (Рис. 19) (Yatime et al., 2004; Pedullà et al., 2005; Shin et al., 2011a). 81 γ Met-тРНКf Рис. 19. Схематическое изображение пространственной структуры комплекса aIF2αD3γ•GDPNP•Met-тРНКf. Синим цветом показаны участки инициаторной тРНК, которые по данным химического пробинга (Shin et al., 2011a) находятся вблизи Lys507 eIF2 S. cerevisiae, соответствующего Gly403 aIF2γ S. solfataricus (отмечен оранжевым шариком). Несмотря на структурную гомологию γ-субъединицы aIF2 с бактериальным фактором элонгации EF-Tu, связывание Met-тРНКi с aIF2γ происходит иначе, чем связывание элонгаторных аминоацил-тРНК с фактором EF-Tu: взаимодействие элонгаторной тРНК с фактором элонгации EF-Tu идет через Т-шпильку (Nissen et al., 1995, 1999), тогда как инициаторная тРНК взаимодействует с фактором инициации aIF2 D-шпилькой (Рис. 20а, б). Таким образом, различия в нуклеотидной последовательности T-шпильки инициаторной и элонгаторных тРНК могут предотвращать связывание инициаторной тРНК с EF-Tu, а различия в D-шпильке могут предотвращать связывание элонгаторных тРНК с aIF2. Одновременно с нами французской группой была определена структура тройственного комплекса, содержащего полноразмерный гетеротример aIF2αβγ, в котором однако отсутствовала электронная плотность для большей части β-субъединицы (Schmitt et al., 2012). Данная структура была определена с более низким разрешением (5 Å), и принципиально отличается от полученной нами структуры. Несмотря на то, что в обеих структурах архейного тройственного комплекса тРНК обращена к белку со стороны D-петли, в этих двух моделях она взаимодействует с разными участками γ- и α-субъединиц aIF2 (Рис. 20б, в). В нашей структуре наиболее существенный контакт образуется между доменом III aIF2γ и D-шпилькой тРНК, что соответствует биохимическим данным и данным химического пробинга (Yatime et al., 2004; Shin et al., 82 2011a), тогда как в предложенной французской группой модели домен III γ-субъединицы не участвует в связывании тРНК, а самые обширные контакты образуются между тРНК и 1 и 2 доменами α-субъединицы, которые по биохимическим данным и по данным пробинга с гидроксильными радикалами не должны взаимодействовать с тРНК. aIF2αβγ•GDPNP•Met-тРНКf aIF2αD3γ•GDPNP•Met-тРНКf EF-Tu•GDPNP•aa-тРНК βNtH CCA-конец CCA-конец CCA-конец (а) (б) (в) Рис. 20. Схематическое изображение пространственных структур комплексов (а) EFTu•GDPNP•Phe-тРНКPhe T. aquaticus (PDB код 1TTT), (б) aIF2αD3γ•GDPNP•Met-тРНКf S. solfataricus (PDB код 3QSY) и (в) aIF2αβγ•GDPNP•Met-тРНКf S. solfataricus (PDB код 3V11). Римскими цифрами I(G), II, III обозначены домены EF-Tu и aIF2γ; домены α-субъединицы aIF2 обозначены αD1, αD2 и αD3. В молекуле тРНК синим цветом обозначен акцепторный черешок, красным – D-шпилька, голубым – антикодоновая шпилька, оранжевым – вариабельная петля, зеленым – T-шпилька; черным отмечен CCA-конец тРНК. βNtH – N-концевая α-спираль aIF2β. Анализ взаимодействий между соседними молекулами в кристалле комплекса aIF2αβγ•GDPNP•Met-тРНКf показывает, что N-концевые домены α-субъединиц соседних молекул комплекса занимают положение между тРНК и III доменом γ-субъединицы, мешая их сближению (Рис. 21). В кристалле эти два домена α-субъединицы контактируют с тРНК разными участками, что коррелирует с их способностью неспецифически взаимодействовать с РНК, которая была ранее показана в биохимических экспериментах (Yatime et al., 2004). Можно предположить, что короткоживущие варианты комплекса, которые могут образовываться в растворе, могли в условиях кристаллизации оказаться более подходящими для упаковки в кристалле. Для кристаллизации тройственного 83 комплекса французской группой был использован ПЭГ в качестве осаждающего агента: 5% (w/v) ПЭГ 20 000, 200 мМ KCl, 50 мМ MES, pH 5.7, 10 мМ MgCl2. Возможно, невысокая ионная сила в условиях кристаллизации способствовала сохранению неспецифических контактов между aIF2α и тРНК. тРНКf Рис. 21. Кристаллическая упаковка комплекса aIF2αβγ•GDPNP•Met-тРНКf. Домены γ- и α-субъединиц aIF2 обозначены римскими и арабскими цифрами, соответственно. Положение между акцепторным черешком тРНКf и III доменом γ-субъединицы занимают 1 и 2 домены α-субъединицы (α sym) соседней молекулы комплекса. βNtH – N-концевая α-спираль aIF2β. Несмотря на существующие противоречия структурных и биохимических данных, структура aIF2αβγ•GDPNP•Met-тРНКf, определенная французской группой, была использована для интерпретации электронной плотности тройственного комплекса в составе структур эукариотического преинициаторного комплекса, полученных с помощью криоэлектронной микроскопии. Так с разрешением 11.6 Å была построена модель 43S комплекса млекопитающих, который содержал 40S рибосомную субчастицу, eIF3, тройственный комплекс eIF2•ГТФ•Met-тРНКi и РНК хеликазу Dhx29 (Hashem et al., 2013). Кроме этого в группе В. Рамакришнана с помощью криоэлектронной микроскопии были получены структуры дрожжевого 48S комплекса, включающего 40S субчастицу, eIF1, eIF1A, eIF2•ГТФ•Met-тРНКi и мРНК (Hussain et al., 2014) и дополнительно eIF3 (Llácer et al., 2015) (см. Рис. 9 в разделе «Обзор литературы»). В определенной с разрешением 4.0 Å структуре 48S комплекса (Hussain et al., 2014) обнаружены обширные контакты между тРНКi и α-субъединицей eIF2, однако авторам не удалось построить модель для β-субъединицы (видна только ее N-концевая α-спираль) и γ-субъединицы eIF2. В полученных совсем недавно моделях 48S комплекса (Llácer et al., 2015) была 84 дополнительно построена модель eIF2β, но только той ее части, которая соответствует β-субъединице архейного фактора aIF2. Однако в этой работе структура тройственного комплекса была определена с более низким разрешением, 15 Å. Таким образом анализ полученных на сегодняшний день моделей эукариотических 43S и 48S преинициаторных комплексов не вносит ясность в структурную организацию e/aIF2•ГТФ•Met-тРНКi. Хотя наша биохимическими структура тройственного данными и с комплекса результатами хорошо прямого согласуется пробинга и с комплекса гидроксильными радикалами, нельзя исключать, что отсутствие 1 и 2 доменов α-субъединицы aIF2 привело к изменению взаимной ориентации тРНК и белка, что, в свою очередь, обусловило более выгодные условия для связывания ССА конца тРНК в щели между I и III доменами γ-субъединицы. Чтобы устранить существующие противоречия и установить истинную структуру комплекса, мы приступили к кристаллизации различных вариантов тройственного комплекса в новых условиях. Для образования тройственных комплексов мы получили два варианта архейного гетеротримера aIF2αβγ, отличающиеся размером α-субъединицы: была использована как полноразмерная aIF2α, так и укороченная с N-конца на один домен форма белка (aIF2αD23). Для удаления подвижного 1 домена aIF2α с помощью генно-инженерных методов была проведена замена кодона Asp88 на ATG кодон. Выделение aIF2αD23, а также β-субъединицы aIF2 осуществляли с использованием двух последовательных гидрофобных хроматографий. Гомогенный препарат комплекса aIF2βγ получали путем смешивания γ-субъединицы aIF2 с небольшим избытком aIF2β в молярном соотношении 1 : 1.2 и проводили гель-фильтрацию на смоле супердекс-75, после чего центральные фракции пика комплекса анализировали с помощью электрофореза в денатурирующих условиях. Аналогично путем добавления небольшого избытка aIF2αD23 к препарату гетеродимера получали гетеротример aIF2αD23βγ. Полноразмерный гетеротример aIF2 был выделен и очищен по ранее разработанной схеме (Stolboushkina et al., 2008). Согласно этой методике образование комплекса происходит при смешивании прогретых клеточных лизатов для каждой из субъединиц aIF2 с последующей очисткой гетеротримера с помощью ионообменной и аффинной хроматографий на S- и гепарин-сефарозе, соответственно. В дальнейшем препараты гетеротримеров aIF2αD23βγ и aIF2αβγ использовали для образования тройственных aIF2αD3γ•GDPNP•Met-тРНКf. комплексов Поиск условий аналогично получению кристаллизации был комплекса проведен с использованием наборов растворов Natrix (Hampton Research, США), Nucleix, AmSO4 (QIAGEN, Германия) и NucPro (Jena Bioscience, Германия) для кристаллизации РНК85 белковых комплексов. Кристаллы комплексов были получены в условиях №29 Natrix, в которых осаждающим реагентом был хлорид лития (Табл. 11). Тонкие гексагональные пластинки появлялись при 4°C через 3-5 дней и легко таяли при повышении температуры. Для оптимизации условий были использованы наборы растворов Additive Screen и Silver Bullets (Hampton Research, США). Такие добавки, как NDSB, 1,8-диаминооктан и 1,6-диаминогексан растворяли образующийся в капле осадок и способствовали росту кристаллов в толщину (до 70 мкм). Использование натриевой соли полиакриловой кислоты (ПАК) способствовало появлению округлых, но мелких (20-30 мкм) кристаллов. С наиболее крупных кристаллов комплекса aIF2αβγ•GDPNP•Met-тРНКf на синхротроне в Берлине (линия BL14.1 станции BESSY II, Германия) нам удалось собрать набор дифракционных данных, но только с низким разрешением (4.8 Å). В настоящее время мы продолжаем оптимизировать условия кристаллизации. Таблица 11. Результаты экспериментов по кристаллизации aIF2•GDPNP•Met-тРНКf. Объект и фото кристаллов aIF2αD23βγ•GDPNP•Met-тРНКf Условия кристаллизации Статистика наборов В капле: 2M LiCl, 25 мМ Hepes-NaOH, pH 7.0, 5 мМ MgCl2, 3% (w/v) 1,8-диаминооктан В противорастворе: 4 M LiCl, 50 мМ Hepes-NaOH, pH 7.0, 10 мМ MgCl2 Температура 4°C; Крио: 5 М LiCl Отражали до 5.5 Å В капле: 2M LiCl, 25 мМ Hepes-NaOH, pH 7.0, 5 мМ MgCl2, 3% (w/v) D-сорбитол В противорастворе: 4 M LiCl, 50 мМ Hepes-NaOH, pH 7.0, 10 мМ MgCl2 Температура 4°C Крио: 5 М LiCl Предел разрешения 4.8 Å Пространственная группа P3121 Параметры ячейки: 86.97, 86.97, 330.25 (Å) 90.0, 90.0, 120.0 (°) Доля твиннинга 0.5 В капле: 2M LiCl, 25 мМ Hepes-NaOH, pH 7.0, 5 мМ MgCl2, 300 мМ NDSB 195, 0.4% (w/v) натриевая соль ПАК 5100, 10 мМ АТФ В противорастворе: 4 M LiCl, 50 мМ Hepes-NaOH, pH 7.0, 10 мМ MgCl2, 0.8% (w/v) натриевая соль ПАК 5100 Температура 4°C Не тестировали В капле: 1.25 M KCl, 25 мМ какодилат натрия, pH 6.0, 100 мМ MgCl2, 300 мМ NDSB 221, 0.2% (w/v) натриевая соль ПАК 5100, 4% (v/v) 2,5-гександиол В противорастворе: 2.5 M KCl, 50 мМ какодилат натрия, pH 6.0, 200 мМ MgCl2; Температура 4°C Не тестировали aIF2αβγ•GDPNP•Met-тРНКf 86 2. Выделение субъединиц eIF2 S. cerevisiae В отличие от быстро развивающихся структурных исследований архейного фактора aIF2 и его комплексов, структурные исследования его эукариотического гомолога eIF2 продвигаются значительно медленнее, и к настоящему времени известна только структура α-субъединицы eIF2 (Ito et al., 2004; Hussain et al., 2014) Несмотря на гомологию, субъединицы эукариотического фактора по размеру больше соответствующих субъединиц фактора из архей (см. Рис. 5 в разделе «Обзор литературы»). При этом β-субъединица архейного фактора aIF2 почти в два раза меньше по размеру, чем eIF2β, и гомологична ее С-концевой части. Более того, архейный фактор aIF2 не способен полностью заменять функции эукариотического фактора eIF2 в системе инициации трансляции у эукариот (Dmitriev et al., 2011). Таким образом, структура архейного aIF2 не может являться совершенной моделью для интерпретации экспериментальных данных по функционированию эукариотического фактора eIF2. В настоящее время актуальной задачей является определение структур изолированных β- и γ-субъединиц, αγ- и βγ-димеров, полного гетеротримерного фактора eIF2 и его функциональных комплексов с ГТФ и инициаторной тРНК. Поэтому мы приступили к работе с эукариотическим фактором инициации трансляции 2. Плазмида YEp13/GCD11(His8)/SUI2/SUI3 (Erickson and Hannig, 1996) с генами субъединиц eIF2 S. cerevisiae была нам любезно предоставлена доктором Эрнестом Хеннингом (Техасский Университет, США). Однако в лаборатории Э. Хеннинга для аналитического выделения рекомбинантных субъединиц фактора eIF2 S. cerevisiae использовалась дрожжевая экспрессионная система, которая у нас отсутствует. Поэтому для препаративного выделения этих белков мы клонировали гены каждой субъединицы eIF2 S. cerevisiae по отдельности в экспрессионный вектор pET11c. Гены всех субъединиц были клонированы без олигогистидинового «хвоста», который может мешать при кристаллизации белков. Полученными рекомбинантными плазмидами трансформировали клетки E. coli штамма BL21(DE3), несущего плазмиду pLacIRARE (Novagen) с генами аргининовой, изолейциновой, лейциновой, пролиновой и глициновой тРНК, узнающих редкие для E. coli кодоны соответствующих аминокислот. Использование этой плазмиды позволяет избежать ошибок, которые могут возникнуть при синтезе эукариотических белков в бактериальных клетках. Таким образом, нами были получены штаммыпродуценты для каждой из субъединиц дрожжевого фактора eIF2. Из представленной электрофореграммы (Рис. 22) видно, что после трех часов индукции ИПТГ при 37ºС наблюдается значительная продукция α- и β-субъединиц eIF2 (дорожки 2 и 5), при этом 87 уровень синтеза γ-субъединицы был очень низким, и идентифицировать белок удалось только с помощью масс-спектрометрии (дорожка 8). Стоит отметить, что в используемых нами условиях электрофореза в присутствии ДСН была замечена аномальная подвижность eIF2β, которая может быть связана с высокой изоэлектрической точкой белка (pI 9.5). eIF2α (35 кДа) 1 2 3 М eIF2β (32 кДа) 4 5 6 eIF2γ (58 кДа) 7 8 9 70 55 40 35 25 15 10 Рис. 22. Электрофоретический анализ (в 15%-ном ПААГ в присутствии ДСН) продукции рекомбинантных α-, β-, γ-субъединиц eIF2 S. cerevisiae в клетках E. coli BL21(DE3)/ pLacIRARE. Лизаты клеток-продуцентов до индукции ИПТГ (1, 4, 7), через 3 ч после индукции (2, 5, 8) или через 3 ч без индукции (3, 6, 9). Стрелкой отмечена полоса, соответствующая γ-субъединице eIF2. М – белковые маркеры с указанием их молекулярных масс, кДа. Однако при разрушении клеток-продуцентов оказалось, что большая часть синтезируемых белков осаждается вместе с клеточными обломками. По-видимому, при выбранных нами условиях индукции эукариотические белки в клетках переходят в нерастворимую форму, образуя так называемые тельца включения. Мы пытались перевести белки в растворимую форму, меняя условия индукции и используя при разрушении клеток буфер с высокой (1M NaCl или 3 М LiCl) или низкой ионной силой или с добавлением детергентов (Tween 20, NDSB 201). Мы также учитывали описанные в литературе немногочисленные данные по выделению субъединиц eIF2 из штаммовпродуцентов E. coli (Naveau et al., 2010, 2013; Schmitt et al., 2012). Для сохранения eIF2α в растворимой форме наиболее эффективным оказалось понижение температуры инкубации клеток после добавления индуктора с 37 до 30°C и, соответственно, увеличение времени инкубации с 3 до 12 ч. После удаления рибосом из клеточного экстракта первой стадией очистки белка была выбрана анионообменная хроматография на Q-сефарозе, что обусловлено кислой природой eIF2α (pI 4.9). Известно, 88 что α-субъединица eIF2 обладает неспецифическим сродством к РНК, а разрушить неспецифическое взаимодействие белка с нуклеиновыми кислотами возможно в растворах с высокой ионной силой. В связи с этим для дальнейшей очистки белка сначала была выбрана гидрофобная хроматография, которая позволяет связать белок с носителем при высоких концентрациях солей. Однако в результате белок прочно связался со смолой, и его не удалось элюировать с колонки. Поэтому было решено после первой хроматографии на Q-сефарозе (pH 8.0) провести рехроматографию с понижением значения pH буфера до 6.0. Оставшиеся в препарате белка примеси затем удалось удалить с помощью гельфильтрации на смоле супердекс-75. При поиске оптимальных условий выделения eIF2β клетки штамма-продуцента суспендировали в буфере с 1 М хлоридом натрия. Чтобы белок не подвергался протеолитическому расщеплению, как было замечено для препарата eIF2β из лизата ретикулоцитов кролика (Price et al., 1989), к суспензии клеток добавляли ингибиторы протеаз. После осаждения клеточного дебриса к супернатанту добавляли сухой сульфат аммония и для очистки белка использовали гидрофобную хроматографию. Поскольку после первой хроматографии в препарате белка оставались примеси нуклеиновых кислот, далее повторно использовали гидрофобную хроматографию, что позволило добиться желаемой чистоты препарата. Разработанные схемы выделения α- и β-субъединиц eIF2 S. cerevisiae позволяют получать с 1 л культуры клеток порядка 20 и 8 мг белка, соответственно, с чистотой не менее 95% (Рис. 23, дорожки 1 и 2). При получении растворимой формы eIF2γ S. cerevisiae мы столкнулись со значительными трудностями. Помимо описанных способов оптимизации условий индукции экспрессии и разрушения клеток мы использовали и другие подходы. В нашей лаборатории γ-субъединицу архейного фактора aIF2 S. solfataricus в отличие от α- и βсубъединиц aIF2 удалось синтезировать только в клетках штамма С41(DE3), предназначенного для продукции токсичных белков. Поэтому этот штамм был также использован для продукции eIF2γ S. cerevisiae. Другой подход заключался в получении αγили βγ-димеров eIF2 путем смешивания соответствующих клеток штаммов-продуцентов до разрушения. Мы надеялись, что связывание с α- или β-субъединицей eIF2 позволит избежать агрегации eIF2γ. Кроме того была клонирована генетическая конструкция для получения белка eIF2γ сшитого с убиквитином. Объединение с убиквитином в одну полипептидную цепь тоже не помогло избежать образования телец включения при наработке eIF2γ в бактериальной системе экспрессии. Мы также пытались получить γ-субъединицу эукариотического фактора eIF2 из другого организма и клонировали ген 89 γ-субъединицы eIF2 H. sapiens, которая по размеру меньше eIF2γ S. cerevisiae и имеет большую гомологию с aIF2γ S. solfataricus (плазмиды, несущие гены субъединиц eIF2 H. sapiens, были любезно предоставлены Е.З. Алкалаевой, Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва). Однако во всех этих случаях наблюдалась низкая продукция белка eIF2γ, который при аналитическом выделении осаждался с клеточными обломками. Таким образом к настоящему времени нам пока не удалось получить γ-субъединицу эукариотического фактора eIF2 в растворимой форме. На данный момент совместно с Ю.Н. Лежниным (Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва) ведется работа по получению eIF2γ S. cerevisiae в дрожжевой секреторной системе экспрессии. 3. Получение и кристаллизация химерных форм фактора e/aIF2 и их тройственных комплексов e/aIF2•GDPNP•Met-тРНКf Поскольку мы не смогли получить препарат eIF2γ, мы использовали γ-субъединицу архейного фактора aIF2 S. solfataricus для связывания с α- и β-субъединицами eIF2 S. cerevisiae и получения химерных гетеродимеров и гетеротримера. Возможность формирования химерного фактора e/aIF2 является одним из подходов к определению пространственной структуры субъединиц эукариотического eIF2. Параллельно нашим исследованиям биохимические и функциональные исследования тройственных комплексов химерного фактора e/aIF2 с ГТФ и Met-тРНКf ведутся в лаборатории Э. Шмитт во Франции (Schmitt et al., 2012; Naveau et al., 2013). Однако пока нет ни одной публикации о получении кристаллов таких комплексов. Кристаллизация химерных комплексов может способствовать определению структур субъединиц эукариотического фактора, которые сами по себе пока не были закристаллизованы. Гомогенный препарат химерного комплекса eIF2β/aIF2γ мы получали путем смешивания γ-субъединицы aIF2 с небольшим избытком eIF2β в молярном соотношении 1 : 1.2 и проводили гель-фильтрацию на смоле супердекс-75, после чего центральные фракции пика комплекса анализировали с помощью электрофореза в денатурирующих условиях (Рис. 23, дорожка 4). Аналогично путем добавления небольшого избытка eIF2α или aIF2α к препарату гетеродимера получали гетеротримеры eIF2αβ/aIF2γ и eIF2β/aIF2αγ, соответственно. При этом мы использовали как полноразмерную α-субъединицу aIF2 S. solfataricus, так и ее укороченные формы aIF2αD23 и aIF2αD3. Поскольку α- и β-субъединицы eIF2 обладали похожей электрофоретической подвижностью, соответствующие этим белкам полосы на электрофореграмме удалось разделить при увеличении времени проведения электрофореза (Рис. 23, дорожка 5). 90 Известно, что α-субъединица эукариотического фактора eIF2 имеет неупорядоченный C-концевой «хвост», функциональная роль которого не определена. Поскольку подвижные участки молекулы белка могут мешать при кристаллизации, у α-субъединицы eIF2 S. cerevisiae был делетирован с С-конца участок длиной 30 а. о. (eIF2αΔC). Более половины аминокислотных остатков этого «хвоста» eIF2α отрицательнозаряжены, и согласно литературным данным его удаление существенно усиливает связывание Met-тРНКf с исследуемым химерным комплексом eIF2αβ/aIF2γ (Naveau et al., 2013). Мы клонировали ген, кодирующий укороченную на 30 а. о. с С-конца α-субъединицу eIF2 S. cerevisiae (eIF2αΔC), путем замены кодона Glu275 на стоп-кодон. Поскольку при выделении eIF2αΔC возникли трудности, химерный комплекс eIF2αΔCβ/aIF2γ получали аналогично выделению архейного гетеротримера aIF2αβγ. Клетки штаммов-суперпродуцентов субъединиц aIF2γ, eIF2αΔC и eIF2β (с 2, 1 и 0.5 л культуры, соответственно, с учетом разного уровня синтеза субъединиц в клетках) разрушали ультразвуком, дебрис удаляли, клеточный лизат aIF2γ прогревали и центрифугировали, после чего супернатанты для каждой субъединицы смешивали и фракционировали на смолах S-сефароза и гепарин-сефароза. Описанная методика позволила получить до 50 мг комплекса eIF2αΔCβ/aIF2γ с 3.5 л общей культуры клеток (Рис. 23, дорожка 6). M 1 2 3 4 5 6 170 130 95 72 7 8 9 aIF2γ eIF2β eIF2αΔC 55 aIF2γ 43 34 eIF2β eIF2α 26 aIF2γ eIF2β aIF2α aIF2αD23 aIF2αD3 17 Рис. 23. Электрофоретический анализ (в 15%-ном ПААГ в присутствии ДСН) препаратов изолированных субъединиц и химерных комплексов e/aIF2: 1. eIF2α; 2. eIF2β; 3. aIF2γ; 4. eIF2β/aIF2γ; 5. eIF2αβ/aIF2γ; 6. eIF2αΔCβ/aIF2γ (eIF2αΔC – укороченная на 30 а. о. eIF2α); 7. eIF2β/aIF2αγ; 8. eIF2β/aIF2αD23γ; 9. eIF2β/aIF2αD3γ. М – белковые маркеры с указанием их молекулярных масс, кДа. С полученными химерными гетеротримерами e/aIF2 мы образовывали тройственные комплексы с ГТФ и инициаторной Met-тРНК. Был проведен поиск условий кристаллизации изолированной β-субъединицы eIF2, химерных межсубъединичных 91 комплексов и химерных комплексов с Met-тРНКf. Однако из всех объектов на сегодняшний день удалось закристаллизовать только препараты химерных тройственных комплексов (Табл. 12). По-видимому, подвижные домены α- и β-субъединиц e/aIF2, которые препятствуют кристаллизации белковых препаратов, стабилизируются в присутствии тРНК. Кристаллы химерных комплексов были получены при 4°C в условиях №28 и 29 набора растворов Nucleix, где осаждающими реагентами являются сульфат и хлорид лития, соответственно. Таблица 12. Результаты экспериментов по кристаллизации химерных тройственных комплексов e/aIF2•GDPNP•Met-тРНКf. Объект и фото кристаллов Условия кристаллизации eIF2β/aIF2αD3γ•GDPNP•Met-тРНКf В капле: 2M LiCl, 25 мМ Hepes-NaOH, pH 7.0, 5 мМ MgCl2, 3% (w/v) 1,8диаминооктан В противорастворе: 4 M LiCl, 50 мМ Hepes-NaOH, pH 7.0, 10 мМ MgCl2 Температура 4°C Крио: 5 М LiCl В капле: 0.8 M Li2SO4, 25 мМ HepesNaOH, pH 7.0, 25 мМ MgSO4, 83 мМ NDSB 195, 0.5% (w/v) натриевая соль ПАК 5100 В противорастворе: 1.6 M Li2SO4, 50 мМ Hepes-NaOH, pH 7.0, 50 мМ MgSO4; Температура 4°C eIF2β/aIF2αD23γ•GDPNP•Met-тРНКf В капле: 2M LiCl, 25 мМ Hepes-NaOH, pH 7.0, 5 мМ MgCl2, 220 мМ NDSB 211 В противорастворе: 4 M LiCl, 50 мМ Hepes-NaOH, pH 7.0, 10 мМ MgCl2 Температура 4°C Крио: 5 М LiCl Статистика наборов Предел разрешения 4.9 Å Пространственная группа P3121 Параметры ячейки: 87.59, 87.59, 333.8 (Å) 90.0, 90.0, 120.0 (°) Доля твиннинга 0.5 Не тестировали Предел разрешения 5.5 Å Пространственная группа P3221 Параметры ячейки: 86.93, 86.93, 332.62 (Å) 90.00, 90.00, 120.00 (°) Доля твиннинга 0.5 eIF2β/aIF2αγ•GDPNP•Met-тРНКf В капле: 1.25 M KCl, 25 мМ какодилат натрия, pH 6.0, 100 мМ MgCl2, 3% (w/v) 1,6-диаминогексан В противорастворе: 2.5 M KCl, 50 мМ какодилат натрия, pH 6.0, 200 мМ Отражали до 8.5 Å MgCl2 Температура 4°C Крио: 20% (v/v) этиленгликоль, 2.5 M KCl, 50 мМ какодилат натрия, pH 6.0, 200 мМ MgCl2 С полученных кристаллов комплексов eIF2β/aIF2αD3γ•GDPNP•Met-тРНКf, и eIF2β/aIF2αD23γ•GDPNP•Met-тРНКf на синхротроне в Берлине (линия BL14.1 станции BESSY II, Германия) были собраны наборы дифракционных данных с разрешением 4.9 и 5.5 Å, соответственно. К сожалению, низкое разрешение и свойственное этим кристаллам 92 двойникование существенно осложняют определение структур этих комплексов. Поэтому продолжается работа по оптимизации условий кристаллизации. 4. Исследование мРНК-связывающих свойств aIF2γ S. solfataricus У эукариот и архей фактор инициации трансляции 2 в ГТФ-связанной форме позиционирует инициаторную метионил-тРНК в P-участок малой рибосомной субчастицы. Удо Блэзи с соавторами (Венский биоцентр, Австрия) показали, что γ-субъединица архейного фактора aIF2 S. solfataricus помимо центральной роли в связывании Met-тРНКi имеет дополнительную функцию: aIF2γ способна связывать мРНК, на 5’-конце которых находится трифосфат, и защищать их от 5’-3’-направленной деградации (Hasenöhrl et al., 2008). Известно, что эукариотический фактор eIF2 также способен связывать мРНК (Barrieux and Rosenfeld, 1977; Kaempfer et al., 1978a, 1978b). Однако в отличие от архей у эукариот за связывание мРНК отвечает β-субъединица eIF2 (Gonsky et al., 1992). Центральная субъединица e/aIF2, γ-субъединица, является рибосомной ГТФазой и по своей структуре относится к семейству белков eIF1A (наиболее изученный представитель семейства – бактериальный фактор элонгации EF-Tu). γ-Cубъединица e/aIF2 состоит из трех доменов: I(G), II и III. Известны кристаллические структуры γ-субъединицы архейного фактора aIF2 в свободном состоянии и в комплексе с ГТФ и ГДФ, в изолированном виде и в составе αγ- и βγ-гетеродимеров и гетеротримера (Schmitt et al., 2002; Roll-Mecak et al., 2004; Yatime et al., 2006, 2007; Sokabe et al., 2006; Nikonov et al., 2007; Stolboushkina et al., 2008; Dubiez et al., 2015). Во всех известных структурах γ-субъединицы aIF2 домены I(G), II и III пространственно сближены, что соответствует «закрытой» ГТФ-связанной активной форме EF-Tu (Berchtold et al., 1993) (см. Рис. 8 в разделе «Обзор литературы»). Как и у других ГТФаз консервативный (канонический) сайт связывания нуклеотидов расположен в G-домене aIF2γ. В нашей лаборатории в результате кристаллизации γ-субъединицы aIF2 из S. solfataricus со смесью ГДФ и нерасщепляемого аналога ГТФ, GDPNP, был обнаружен дополнительный (неканонический) сайт связывания ГТФ, расположенный на поверхности домена II (Nikonov et al., 2007) (Рис. 24). Кроме того было показано, что мРНК и ГТФ конкурируют друг с другом за связывание с γ-субъединицей aIF2 (Столбоушкина, 2009). Это позволило предположить, что один из нуклеотидсвязывающих сайтов aIF2γ (неканонический или канонический) может служить местом связывания 5’-конца мРНК. 93 (а) (б) Switch 1 P-петля Switch 2 Петля L1 Рис. 24. (а) Схематическое изображение пространственной структуры aIF2γ S. solfataricus в комплексе с ГДФ в каноническом и негидролизуемым аналогом ГТФ (GDPNP) в неканоническом нуклеотид-связывающих сайтах (PDB код 2PMD). Пронумерованными шариками отмечены Cα атомы соответствующих аминокислотных остатков, измененных с помощью сайт-направленного мутагенеза. (б) Аминокислотная последовательность aIF2γ S. solfataricus. Элементы вторичной структуры показаны цилиндрами (α-спирали) и стрелками (β-тяжи). Аминокислотные остатки, участвующие в образовании канонического и неканонического нуклеотид-связывающих сайтов, отмечены розовым и зеленым, соответственно. Участки последовательности, соответствующие I(G), II и III доменам, разделены сплошной линией. 94 Чтобы локализовать участок связывания мРНК на aIF2γ, мы попытались получить пригодные к структурным исследованиям кристаллы комплекса γ-субъединицы aIF2 с разными фрагментами мРНК. Однако наши попытки не увенчались успехом, поэтому было решено провести направленный мутагенез обоих нуклеотид-связывающих сайтов белка, чтобы выявить, какие мутации приводят к изменению сродства aIF2γ к ГТФ и мРНК, и таким образом, выяснить какой их двух нуклеотид-связывающих сайтов является местом связывания 5’-конца мРНК. Сайт-направленный мутагенез нуклеотид-связывающих сайтов aIF2γ Сначала был проведен мутагенез в области неканонического нуклеотид- связывающего сайта aIF2γ. Анализ кристаллической структуры aIF2γ в комплексе с нуклеотидами показал, что положение молекулы нерасщепляемого аналога ГТФ в неканоническом нуклеотид-связывающем сайте стабилизировано за счет стэкинг взаимодействия рибозы гуанозина с высококонсервативным Phe221 и за счет водородных связей между основанием и Arg280 и кислородом главной цепи Ala296, а также между γ-фосфатом нуклеотида и Lys225. Кроме того одну из сторон неканонического нуклеотидсвязывающего сайта белка формируют аминокислотные остатки петли-переключателя switch 1 (Рис. 25а). (а) (б) Рис. 25. Анализ положения нуклеотида в (а) неканоническом и (б) каноническом нуклеотид-связывающих сайтах aIF2γ (PDB коды 3I1F и 4M53, соответственно). Пунктирными линиями обозначены водородные связи. W – молекула воды. Mg – ион магния (Mg2+). 95 На основании этих данных в аминокислотной последовательности aIF2γ с помощью сайт-направленного мутагенеза методом QuikChange® (Stratagene) были проведены одиночные замены K225A, R280A, двойная замена К225А/R280A и тройная замена F221A/K225A/R280A, а также делеции пяти (Δ41-45) и одиннадцати (Δ37-47) аминокислотных остатков петли switch Выделение 1. мутантных форм aIF2γ осуществляли по разработанной ранее методике выделения белка дикого типа (Nikonov et al., 2007). Для исследования взаимодействия с aIF2γ были использованы фрагменты мРНК, полученные транскрипцией in vitro: SsoACATмРНК-30, ompAмРНК-40, A-ompAмРНК-41, MvaL1мРНК-36 и MjaL1мРНК-49 (Рис. 26а). Структуры двух последних фрагментов мРНК, закристаллизованных в комплексе с архейным рибосомным белком L1, были ранее определены в нашей лаборатории (Nevskaya et al., 2005; Tishchenko et al., 2006). С помощью метода гель-шифта мы наблюдали изменение электрофоретической подвижности фрагмента мРНК, если он образовывал комплекс с белком (комплекс РНК с белком двигается медленнее, чем сама РНК). Все мутантные белки также как и aIF2γ дикого типа образовывали комплекс с мРНК в эквимолярных соотношениях, а ГТФ и мРНК конкурировали за связывание с белком. Таким образом, мы выяснили, что ни одна из введенных мутаций в области неканонического нуклеотидсвязывающего сайта aIF2γ не повлияла на способность белка связывать мРНК. Далее мы исследовали влияние мутаций в каноническом нуклеотид-связывающем сайте γ-субъединицы aIF2 на связывание мРНК. Этот сайт образован двумя консервативными участками 149NKVD152 и 184SALH187, окружающими основание нуклеотида, P-петлей (18-23 а. о.), которая взаимодействует с фосфатными группами, и переключателем switch 2 (93-113 а. о.) (Рис. 25б). Чтобы нарушить связывание нуклеотида в каноническом нуклеотид-связывающем сайте aIF2γ, в аминокислотной последовательности белка осуществляли замены, которые могли привести к разрыву водородных связей с нуклеотидом либо создать стерические препятствия для его связывания. Примером мутации, в результате которой могут возникнуть пространственные ограничения для связывания нуклеотида в каноническом нуклеотидсвязывающем сайте aIF2γ, может являться замена, приводящая к дестабилизации «открытой» конформации P-петли. Такая конформация P-петли характерна для ГТФ- и ГДФ-связанного состояний aIF2γ и сильно отличается от «закрытой» конформации, препятствующей связыванию белка с нуклеотидом (Nikonov et al., 2007). С помощью сайт-направленого мутагенеза в аминокислотной последовательности aIF2γ были проведены одиночные замены H20F, G21V, N149Y, N149F, D152A и двойная замена H20F/D152A. Мутантные формы aIF2γ получали по методике выделения белка дикого 96 типа. Оказалось, что замены в каноническом нуклеотид-связывающем сайте существенно повлияли на формирование комплекса aIF2γ с мРНК. С помощью метода гель-шифта (Рис. 26б) мы показали, что замена D152A ослабила способность γ-субъединицы aIF2 связывать мРНК (4 дорожка), в результате замены H20F большая часть белка не связывала мРНК (3 дорожка), а двойная замена этих остатков (5 дорожка) и одиночные замены N149Y, N149F и G21V (6-8 дорожки) привели к тому, что на электрофореграмме не удается детектировать образование соответствующих РНК-белковых комплексов. SsoACATмРНК-30 ompAмРНК-40 A-ompAмРНК-41 MvaL1мРНК-36 MjaL1мРНК-49 (а) 1 (б) 2 3 4 5 6 7 8 РНК-белковый комплекс фрагмент РНК Рис. 26. (а) Схемы вторичных структур фрагментов мРНК, использованных в экспериментах по связыванию с aIF2γ. Вторичные структуры SsoACATмРНК-30, ompAмРНК-40, A-ompAмРНК-41 были предсказаны с помощью программы mfold (версия 3.5). (б) Электрофоретический анализ образования комплексов aIF2γ дикого типа и ее мутантных форм с заменами в каноническом нуклеотид-связывающем сайте с MvaL1мРНК-36 (в 8%-ном ПААГ, неденатурирующие условия). 1. мРНК; 2. aIF2γ + мРНК; 3. aIF2γH20F + мРНК; 4. aIF2γD152A + мРНК; 5. aIF2γH20F/D152A + мРНК; 6. aIF2γN149Y + мРНК; 7. aIF2γN149F + мРНК; 8. aIF2γG21V + мРНК. В реакционной смеси использовали эквимолярные количества мРНК и белка. 97 Чтобы количественно оценить влияние введенных мутаций на формирование и стабильность комплекса γ-субъединицы aIF2 с мРНК, мы использовали метод поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Этот метод позволяет наблюдать кинетику взаимодействия молекул в реальном времени. В работе были использованы сенсорные чипы с иммобилизованным авидином (чипы NLS фирмы Bio-Rad). Биотинилированный олигонуклеотид присоединяли к 3’-концевому гидроксилу фрагмента мРНК с помощью РНК-лигазы. Модифицированный биотином фрагмент мРНК впрыскивали в один из каналов чипа. Второй канал чипа оставляли для сравнения неспецифической сорбции белков с авидином. Для каждого эксперимента последовательным разбавлением были приготовлены препараты белка с пятью разными концентрациями. Растворы белка пропускали по каналам чипа в режиме вычета SPR сигнала свободного канала из сигнала модифицированного канала. SPR сигнал выражается в единицах ответа (RU) и прямо пропорционален количеству молекул белка, связанных с РНК. Результаты событий, происходящих в реальном времени, представлены в виде сенсограмм (Рис. 27). Работа проводилась совместно с лабораториями С.А. Мошковского (Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича, Москва) и Е.А. Пермякова (Институт биологического приборостроения с опытным производством РАН, Пущино). Рис. 27. Сенсограммы, показывающие взаимодействие γ-субъединицы aIF2 и ее мутантных форм с заменами в каноническом нуклеотид-связывающем сайте с SsoACATмРНК-30. 98 Полученные данные были обработаны с помощью программы BIAevaluation, в качестве теоретической модели использовали модель взаимодействия Лангмюра (1:1). Полученные кинетические константы представлены в таблице 13. Таблица 13. Кинетический анализ взаимодействия γ-субъединицы aIF2 S. solfataricus и ее мутантных форм с SsoАСАТмРНК-30. aIF2γ Константа скорости ассоциации, ka (M-1s-1) Константа скорости диссоциации, kd (s-1) Кажущаяся константа диссоциации, Kd (M) wt (1.08±0.01)105 (2.54±0.01)10-5 2.3610-10 Замены в каноническом нуклеотид-связывающем сайте D152A (7.21±0.59)103 (6.21±0.04)10-5 8.6210-9 H20F (1.07±0.04)104 (6.41±0.01)10-4 5.9710-8 H20F/D152A (1.98±0.13)103 (1.15±0.01)10-3 5.8210-7 N149Y нет связывания N149F нет связывания G21V нет связывания Замены и делеции в неканоническом нуклеотид-связывающем сайте K225A (9.21±0.07)104 (3.21±0.01)10-5 3.4810-10 R280A (7.48±0.06)104 (3.33±0.01)10-5 4.4610-10 K225A/R280A (6.37±0.06)104 (3.57±0.01)10-5 5.6110-10 F221A/K225A/R280A (1.08±0.01)105 (2.79±0.01)10-5 2.6010-10 Δ41-45 (9.22±0.06)104 (2.56±0.01)10-5 2.7810-10 Δ37-47 (9.77±0.01)104 (2.61±0.01)10-5 2.6710-10 Кинетический анализ показал, что aIF2γ дикого типа связывает фрагмент мРНК (SsoACATмРНК-30) с константой Kd равной 2.3610-10 M, тогда как замены в каноническом нуклеотид-связывающем сайте D152A, H20F и H20F/D152A ухудшают связывание мРНК на 1, 2 или 3 порядка, соответственно. При этом отмечается как понижение скорости образования РНК-белковых комплексов, так и увеличение скорости их диссоциации, т.е. уменьшение стабильности. В случае мутантных форм aIF2γ с одиночными заменами N149Y, N149F и G21V связывания белка с мРНК зафиксировано не было. С помощью метода SPR мы также показали, что формы γ-субъединицы aIF2 с мутациями в неканоническом нуклеотид-связывающем сайте связывают мРНК с тем же сродством, что и белок дикого типа. В целом полученные данные указывают на то, что 99 связывание мРНК происходит в районе канонического нуклеотид-связывающего сайта aIF2γ S. solfataricus. Далее чтобы выяснить, связывают ли мутантные формы aIF2γ с заменами в каноническом нуклеотид-связывающем сайте нуклеотид, мы использовали флуоресцентно меченый аналог ГДФ (MANT-GDP). Компактная флуоресцентная группа MANT связана с кольцом рибозы в 2’/3’ положении (Рис. 28б) и имеет минимальное влияние на взаимодействие белка с нуклеотидом, в связи с чем MANT производные ГДФ и ГТФ широко используются в экспериментах по связыванию с G-белками (Mohr et al., 2002; Pisareva et al., 2007). Наличие комплекса aIF2γ и MANT-GDP анализировали электрофорезом в неденатурирующих условиях. Связавшийся с белком флуоресцентно меченый нуклеотид визуализировали в отраженном ультрафиолете, после чего белки в геле окрашивали кумасси G-250 (Рис. 28а). Оказалось, что мутантные белки aIF2γ с одиночными заменами H20F и D152A, а также с двойной заменой H20F/D152A связывают меченый ГДФ, в отличие от белков с заменами N149Y, N149F и G21V. Таким образом, замены N149Y, N149F и G21V приводят к тому, что мутантные белки aIF2γ не связывают ни мРНК, ни ГДФ. (а) (б) 1 2 3 4 5 6 7 MANT-GDP Рис. 28. (а) Электрофоретический анализ связывания флуоресцентно меченого аналога ГДФ (MANT-GDP) мутантными формами aIF2γ с заменами в каноническом нуклеотидсвязывающем сайте (в 8%-ном ПААГ, неденатурирующие условия). Эквимолярная смесь MANT-GDP с 1. aIF2γ; 2. aIF2γH20F; 3. aIF2γD152A; 4. aIF2γH20F/D152A; 5. aIF2γN149Y; 6. aIF2γN149F; 7. aIF2γG21V. Представлено изображение геля, сфотографированного под ультрафиолетом λ=254 нм (сверху) и после окраски кумасси G-250 (снизу). (б) Структурная формула MANT-GDP (λexc = 355 нм, λem = 448 нм). 100 Кристаллизация мутантных форм aIF2γ с заменами в каноническом нуклеотидсвязывающем сайте Чтобы посмотреть, какие изменения произошли в структуре γ-субъединицы aIF2 в результате введенных нами мутаций, мы провели эксперименты по кристаллизации этих мутантных форм белка для определения их структуры. Белки с заменами H20F, D152A и H20F/D152A, которые связывали флуоресцентно меченый ГДФ, нам не удалось закристаллизовать в свободном состоянии, а только в комплексе с нуклеотидами. Кристаллы были получены сокристаллизацией белка с десятикратным избытком нуклеотида (ГТФ или его нерасщепляемых аналогов, GDPNP и GDPCP). В работе использовали GDPNP фирмы Sigma, который, как было показано ранее (Nikonov et al., 2007), содержит примесь ГДФ; и GDPCP фирмы Jena Bioscience, который согласно результатам тонкослойной ионообменной хроматографии не содержит примесей. Препарат ГТФ очищали с помощью хроматографии на ионообменной смоле MonoQ. К смеси белка и нуклеотида добавляли равный объем противораствора: 3.6 М формиат натрия, 0.1 М какодилат натрия, pH 6.5. Кристаллизацию вели при 28°C. Кристаллы белка появлялись через 2-3 дня и достигали своего максимального размера (от 100 до 400 мкм) в течение 1-1.5 недель (Рис. 29). Непосредственно перед сбором дифракционных данных кристаллы подвергались кратковременному вымачиванию в криорастворе (3 М формиат натрия, 85 мM какодилат натрия, pH 6.5, 15% (v/v) этиленгликоль), после чего были мгновенно заморожены при температуре 100 K в струе жидкого азота. Часть кристаллов тестировали на лабораторной рентгеновской установке Proteum X8 (Bruker, Германия), данные с остальных кристаллов были собраны на синхротроне в Берлине (линия BL14.1 станции BESSY II, Германия). Все полученные кристаллы принадлежат к кубической пространственной группе I23 с параметрами элементарной ячейки: a = b = c = 188 Å, α = β = γ = 90°. aIF2γH20F• GDP aIF2γH20F• GDPNP/GDP aIF2γH20F• GDPCP aIF2γD152A• GDPCP aIF2γH20F/D152A• GDPCP 3.1 Å 2.7 Å 2.3 Å 2.2 Å 3.27 Å Рис. 29. Фотографии кристаллов мутантных форм aIF2γ с заменами в каноническом нуклеотид-связывающем сайте. 101 Совместно с группой С.В. Никонова (Институт белка РАН, Пущино) были определены структуры мутантных форм aIF2γ методом молекулярного замещения. При кристаллизации aIF2γH20F с очищенным препаратом ГТФ молекула ГДФ была обнаружена в каноническом нуклеотид-связывающем сайте белка. Мы предположили, что в растворе происходит быстрый гидролиз ГТФ, после чего белок кристаллизуется в комплексе с ГДФ. Данное предположение подтвердилось в опубликованной недавно работе, результаты которой свидетельствуют о том, что гидролиз ГТФ на aIF2γ эффективно происходит in vitro (Dubiez et al., 2015). Несмотря на то, что мутантные белки имели пониженное сродство к мРНК, их структуры не выявили существенных изменений, и нуклеотид по-прежнему связывался в каноническом нуклеотид-связывающем сайте. В результате замены H20F все контакты нуклеотида с aIF2γ сохранились. В случае замены D152A связь атома N2 GDPCP с атомом OD2 Asp152 перестала существовать, а атом N1 GDPCP вместо водородной связи с OD1 атомом Asp152 образовал водородную связь с молекулой воды (Рис. 30). Таким образом, хотя замены H20F и D152A сохраняют способность белка связывать нуклеотид, крупная молекула мРНК, взаимодействующая с измененным сайтом, диссоциирует с большей вероятностью. aIF2γ•GDPCP aIF2γH20F•GDPCP aIF2γD152A•GDPCP Рис. 30. Анализ изменений в каноническом нуклеотид-связывающем участке aIF2γ в результате замен H20F и D152A. Структуры aIF2γH20F•GDPCP, aIF2γD152A•GDPCP и aIF2γH20F/D152A•GDPCP были депонированы в банк белковых структур (PDB коды 4NBS, 4QFM, и 4QHY, соответственно). К сожалению, не связывающие нуклеотид мутантные формы γ-субъединицы aIF2 с заменами N149Y, N149F и G21V пока закристаллизовать не удается. 102 Влияние природы 5’-концевого нуклеотидного остатка мРНК на связывание aIF2γ По данным группы У. Блэзи (Венский биоцентр, Австрия) в качестве субстрата aIF2γ может выступать любая мРНК, на 5’-конце которой находится трифосфат (моно- и дефосфорилированные по 5’-концу мРНК не связываются с γ-субъединицей aIF2) (Hasenöhrl et al., 2008). В экспериментах, проведенных в нашей лаборатории, было показано, что из четырех нуклеозид-трифосфатов только ГТФ конкурирует с мРНК за связывание с aIF2γ (Столбоушкина, 2009). Это позволило предположить, что для связывания мРНК необходимо присутствие на ее 5’-конце не просто трифосфата, а именно гуанозинтрифосфата. Известно, что характерной чертой подавляющего большинства промоторов фаговых РНК-полимераз является использование ГТФ в качестве первого нуклеозидтрифосфата при синтезе РНК. Более того, 5’-концевыми нуклеозидами в природных мРНК S. solfataricus чаще всего являются пуриновые нуклеозиды (A или G) (Wurtzel et al., 2010). Мы решили проверить, как aIF2γ связывает мРНК с аденозинтрифосфатом и с гуанозинтрифосфатом на 5’-конце. Для этого транскрипцией in vitro с помощью T7-РНК полимеразы с двух разных промоторов (Coleman et al., 2004) были получены фрагменты мРНК, начинающиеся с G или А. Оказалось, что мРНК с 5’-концевым гуанозинтрифосфатом (ompAмРНК-40) связывалась с белком (Рис. 31, дорожка 2), в то время как связывания мРНК, несущей аденозинтрифосфат на 5’-конце (A-ompAмРНК-41), не наблюдалось (Рис. 31, дорожка 7). Таким образом, мы подтвердили, что для связывания с aIF2γ важен именно 5’-концевой гуанозинтрифосфат мРНК. ompAмРНК-40 1 2 3 4* A-ompAмРНК-41 5* 6 7 8* РНК-белковый комплекс фрагмент РНК Рис. 31. Электрофоретический анализ влияния 5’-концевого нуклеотидного остатка мРНК на связывание aIF2γ (8%-ный ПААГ, неденатурирующие условия). Использованы фрагменты мРНК с 5’-концевым гуанозинтрифосфатом (ompAмРНК-40) или аденозинтрифосфатом (A-ompAмРНК-41). 1. ompAмРНК-40; 2. aIF2γ + ompAмРНК-40; 3. [aIF2γ + ГТФ] + ompAмРНК-40; 4*. aIF2γ + ompAмРНК-40; 5*. [aIF2γ + ГТФ] + ompAмРНК-40; 6. A-ompAмРНК-41; 7. aIF2γ + A-ompAмРНК-41; 8*. aIF2γ + A-ompAмРНК-41. Звездочкой отмечены дорожки, где препарат был прогрет при 65°C. В реакционной смеси использовали эквимолярные количества нуклеотида, мРНК и белка. 103 Влияние температуры на конкуренцию между ГТФ/ГДФ и мРНК за связывание с aIF2γ Согласно нашим данным ГТФ конкурирует с мРНК за связывание с aIF2γ (Рис. 31, 3 дорожка), однако из литературных данных было известно, что ни ГТФ, ни ГДФ не препятствуют формированию РНК-белкового комплекса (Hasenöhrl et al., 2008). Оказалось, что существенным фактором является температура, при которой формировали комплекс. Мы ставили эксперименты при комнатной температуре (25°C), а наши коллеги из лаборатории У. Блэзи (Венский биоцентр, Австрия) использовали температуру 65-70°C, т.к. aIF2γ был взят из термофильного организма. Чтобы проверить влияние температуры, мы поставили параллельно эксперимент при комнатной температуре и с прогревом при 65°C и выяснили, что после прогрева комплекс с мРНК остается стабильным (Рис. 31, 4 дорожка), а ГТФ, предварительно добавленный к aIF2γ в эквимолярных количествах, не мешает связыванию мРНК (Рис. 31, 5 дорожка). По-видимому, при прогреве ГТФ уходит из сайта связывания, уступая место мРНК. Это говорит о том, что при 65°C сродство мРНК к γ-субъединице aIF2 выше, чем сродство нуклеотида. Использованный в данном эксперименте 40-нуклеотидный фрагмент мРНК (ompAмРНК-40) имеет неструктурированный 5’-конец (Рис. 26а). Если в эксперименте использовали фрагмент мРНК, 5’-конец которого участвует в формировании стабильной шпильки (MvaL1мРНК36), то после прогрева в присутствии ГТФ только часть РНК уходила в комплекс с белком (Рис. 32, дорожка 5 справа). Возможно, сродство aIF2γ к мРНК со стабильной структурой на 5’-конце ниже, чем к мРНК с более подвижным 5’-концом. ompAмРНК-40 1 2 3 4* 5* MvaL1мРНК-36 1 2 3 4* 5* РНК-белковый комплекс фрагмент РНК Рис. 32. Электрофоретический анализ влияния подвижности 5’-конца мРНК на связывание с aIF2γ (8%-ный ПААГ, неденатурирующие условия). Использованы фрагменты мРНК, у которых 5’-концевой нуклеотидный остаток свободен (ompAмРНК40) или участвует в формировании шпильки (MvaL1мРНК-36). 1. мРНК; 2. aIF2γ + мРНК; 3. [aIF2γ + ГТФ] + мРНК; 4*. aIF2γ + мРНК; 5*. [aIF2γ + ГТФ] + мРНК. Звездочкой отмечены дорожки, где препарат был прогрет при 65°C. В реакционной смеси использовали эквимолярные количества нуклеотида, мРНК и белка. 104 Кроме того мы показали, что если при комнатной температуре ГДФ или ГТФ, добавленные к aIF2γ в эквимолярном соотношении, препятствуют связыванию мРНК и не вытесняют уже связанную с белком мРНК (Рис. 33, дорожки 3-6), то при 65°C конкуренция снижается (дорожки 9-12) и, чтобы предотвратить образование комплекса с мРНК, необходимо увеличение количества нуклеотида, по крайней мере, в 10 раз. 1 2 ГДФ ГТФ 3 5 4 ГДФ 6 7* 8* ГТФ 9* 10* 11* 12* РНК-белковый комплекс фрагмент РНК Рис. 33. Электрофоретический анализ влияния ГДФ и ГТФ на связывание aIF2γ с MvaL1мРНК-36 при 25°С и 65°С (8%-ный ПААГ, неденатурирующие условия). 1. мРНК; 2. aIF2γ + мРНК; 3. [aIF2γ + ГДФ] + мРНК; 4. [aIF2γ + мРНК] + ГДФ; 5. [aIF2γ + ГТФ] + мРНК; 6. [aIF2γ + мРНК] + ГТФ; 7*. мРНК; 8*. aIF2γ + мРНК; 9*. [aIF2γ + ГДФ] + мРНК; 10*. [aIF2γ + ГДФ(1:10)] + мРНК; 11*. [aIF2γ + ГТФ] + мРНК; 12*. [aIF2γ + ГТФ(1:10)] + мРНК. Звездочкой отмечены дорожки, где препарат был прогрет при 65°C. За исключением десятикратного избытка нуклеотида в дорожках 10 и 12, во всех остальных случаях в реакционной смеси использовали эквимолярные количества нуклеотида, мРНК и белка. Конкуренция между ГТФ/ГДФ и мРНК за связывание с aIF2γ и результаты сайтнаправленного мутагенеза позволяют впервые утверждать, что связывание 5’-концевого гуанозинтрифосфата мРНК в каноническом нуклеотид-связывающем сайте aIF2γ определяет специфическое предположить, что взаимодействие свободный ГТФ и мРНК с данным гуанозинтрифосфат белком. на Логично 5’-конце мРНК взаимодействуют с каноническим нуклеотид-связывающим сайтом aIF2 схожим образом. Ранее проведенные эксперименты (Pedullà et al., 2005; Hasenöhrl et al., 2008) и наши кинетические исследования показывают, что сродство aIF2 к мРНК с гуанозинтрифосфатом на 5’-конце (Kd ≈ 1.010-8 ÷ 2.410-10 M) выше, чем к ГТФ (4.810-7 M) или ГДФ (4.010-7 M). Это предполагает существование дополнительных контактов между белком и мРНК. С помощью метода тоу-принтинг ранее было показано, что в присутствии aIF2γ обратная транскриптаза останавливается в положении +4 по отношению к 5’-концу мРНК (Hasenöhrl et al., 2008). Это указывает на расположение специфического сайта связывания aIF2 вблизи 5’-конца мРНК и на отсутствие 105 дополнительных прочных контактов белка с остальной частью мРНК. Следовательно, основные контакты мРНК сосредоточены на небольшом участке aIF2 в районе канонического нуклеотид-связывающего сайта. Поскольку замена H20F ослабила сродство aIF2 к мРНК, хотя и не вызвала структурных изменений в каноническом нуклеотид-связывающем сайте, мы предполагаем, что His20 может образовывать дополнительные контакты с 5’-концевым участком мРНК. На основании этих данных совместно с группой С.В. Никонова (Институт белка РАН, Пущино) были смоделированы возможные структуры комплекса aIF2γ•мРНК и выполнены расчеты молекулярной динамики (МД) (Рис. 34). Для моделирования были использованы структуры aIF2γ, MjaL1мРНК-49 и MvaL1мРНК-36 (PDB коды 4M4S, 1U63 и 2HW8, соответственно). В мРНК водородные связи в паре G-C между 5’- и 3’-концевыми нуклеотидными остатками были разрушены, и 5’-концевой гуанозинтрифосфат был наложен на молекулу нуклеотида в каноническом ГТФ/ГДФсвязывающем сайте aIF2. Все исследуемые модели имели одинаковое исходное положение для 5’-концевого гуанозинтрифосфата и различные положения остальной части молекулы мРНК. 106 aIF2γ•MjaL1мРНК-49 aIF2γ•MvaL1мРНК-36 I(G) I(G) 5’ ГТФ 5’ ГТФ III III II II I(G) I(G) 5’ ГТФ III III II II Рис. 34. Гипотетические модели комплексов aIF2γ•MjaL1мРНК-49 и aIF2γ•MvaL1мРНК-36 (сверху) и модели этих комплексов после молекулярнодинамических расчетов с длиной траектории 100 нс (снизу), полученные В.Г. Кляшторным и О.С. Никоновым. Красным цветом обозначен 5’-концевой гуанозинтрифосфат мРНК (5’ ГТФ). Расчеты МД показывают, что несмотря на существенные изменения в положении основной части молекулы мРНК относительно aIF2, положение 5’-концевого гуанозинтрифосфата в каноническом нуклеотид-связывающем сайте белка остается неизменным на всем протяжении 100 нс МД траектории для всех используемых моделей. Эти данные могут свидетельствовать о том, что исследуемый контакт является необходимым и достаточным для специфического узнавания мРНК γ-субъединицей aIF2. Предполагаемая высокая подвижность фрагмента мРНК, связанного с aIF2 специфическим, но непротяженным контактом, может объяснять трудности, возникающие при кристаллизации такого комплекса, даже если фрагмент мРНК имеет стабильную структуру. 107 5. «Рабочий» цикл aIF2γ S. solfataricus Мутантные формы aIF2γ с заменами и делециями в области неканонического нуклеотид-связывающего сайта связывали мРНК с тем же сродством, что и белок дикого типа. Мы закристаллизовали эти белки, чтобы выяснить, какие изменения произошли в структуре aIF2γ в результате введенных мутаций. Кристаллы были получены главным образом в растворах, содержащих формиат или малонат натрия в качестве осадителя, и использованы для сбора дифракционных данных (Табл. 14). Дифракционные данные были собраны на синхротроне в Берлине (линия BL14.1 станции BESSY II, Германия). Определение структур мутантных форм aIF2γ и их анализ были проведены совместно с группой С.В. Никонова (Институт белка РАН, Пущино). Наложение полученных структур на структуру aIF2γ дикого типа не выявило существенных отклонений в ходе полипептидной цепи. Однако сравнение большого числа кристаллических структур aIF2γ, полученных с высоким разрешением, позволило выявить структурные особенности не тронутых мутациями подвижных участков G-домена белка. Полученные нами структурные данные позволили построить схему конформационных переходов в γ-субъединице aIF2, которая циркулирует между активным (ON) ГТФ-связанным и неактивным (OFF) ГДФ-связанным состояниями, проходя через промежуточные формы, когда белок может быть связан одновременно с ГДФ и неорганическим фосфатом или не содержать нуклеотид. Нами были получены структуры aIF2γ в четырех этих состояниях (Рис. 35). 108 Таблица 14. Результаты экспериментов по кристаллизации мутантных форм aIF2γ с заменами в неканоническом нуклеотид-связывающем сайте. Объект и фото кристаллов aIF2γK225A•GDPNP/GDP aIF2γR280A•GDPNP/GDP aIF2γR280A•GDPCP aIF2γF221A/K225A/R280A• GDPNP/GDP aIF2γF221A/K225A/R280A• GDPCP aIF2γF221A/K225A/R280A• ГДФ Условия кристаллизации В капле: 16% (w/v) ММЭПЭГ 5000, 45 мМ ацетат натрия pH 5.5, 5 мМ GDPNP В противорастворе: 36% (w/v) ММЭПЭГ 5000, 100 мМ ацетат натрия, pH 5.5 Температура 22°C Крио: 30% (w/v) ММЭПЭГ 5000, 85 мМ ацетат натрия, pH 5.5, 15% (v/v) этиленгликоль В капле: 1.6 M формиат натрия, 43 мМ какодилат натрия, pH 6.5, 5 мМ GDPNP В противорастворе: 3.1 M формиат натрия, 87 мМ какодилат натрия, pH 6.5. Температура 28°C Крио: 3.0 M формиат натрия, 85 мМ какодилат натрия, pH 6.5, 15% (v/v) этиленгликоль В капле: 1.6 M формиат натрия, 43 мМ какодилат натрия, pH 6.5, 5 мМ GDPCP В противорастворе: 3.6 M формиат натрия, 100 мМ какодилат натрия, pH 6.5. Температура 28°C Крио: 3.0 M формиат натрия, 85 мМ какодилат натрия, pH 6.5, 15% (v/v) этиленгликоль Статистика наборов Предел разрешения 3.4 Å Пространственная группа P212121 Параметры ячейки: 71.94 166.53, 247.06 (Å) 90.0, 90.0, 90.0 (°) Предел разрешения 2.2 Å Пространственная группа R32 Параметры ячейки: 142.53,142.53, 218.52 (Å) 90.0, 90.0, 90.0 (°) Предел разрешения 2.4 Å Пространственная группа I23 Параметры ячейки: 186.92, 186.92, 186.92 (Å) 90.0, 90.0, 90.0 (°) В капле: 4.5% (w/v) малонат натрия, pH 6.0, 5.5 мМ GDPNP В противорастворе: 18% (w/v) малонат натрия, pH 4.5, 5% (v/v) МПД Температура 28°C Крио: 30% (w/v) малонат натрия, рН 6.0, 15% (v/v) этиленгликоль Предел разрешения 2.6 Å Пространственная группа I23 Параметры ячейки: 188.67, 188.67, 188.67 (Å) 90.0, 90.0, 90.0 (°) В капле: 4.5% (w/v) малонат натрия, pH 5.5, 4.9 мМ GDPCP В противорастворе: 18% (w/v) малонат натрия, pH 4.5, 5% (v/v) МПД Температура 28°C Крио: 30% (w/v) малонат натрия, рН 5.5, 15% (v/v) этиленгликоль Предел разрешения 2.0 Å Пространственная группа P1 Параметры ячейки: 76.71, 76.75, 146.79 (Å) 101.5, 92.1, 96.0 (°) В капле: 1.6 M формиат натрия, 43 мМ какодилат натрия, pH 6.5, 1 мМ ГТФ В противорастворе: 3.6 M формиат натрия, 100 мМ какодилат натрия, pH 6.5 Температура 28°C Крио: 3.0 M формиат натрия, 85 мМ какодилат натрия, pH 6.5, 15% (v/v) этиленгликоль Предел разрешения 2.25 Å Пространственная группа R32 Параметры ячейки: 142.86, 142.86, 218.41 (Å) 90.0, 90.0,120.0 (°) PDB код 4M4S (Рис.35. aIF2γ•ГДФ•FMT) 109 Таблица 14. Продолжение. Объект и фото кристаллов aIF2γΔ41-45 Условия кристаллизации В капле: 0.7 M Li2SO4, 23 мМ HepesNaOH, pH 7.0, 23 мМ MgSO4, 270 мМ NDSB 195. В противорастворе: 1.6 M Li2SO4, 50 мМ Hepes-NaOH, pH 7.0, 50 мМ MgSO4. Температура 12°C Крио: 2.0 M Li2SO4, 50 мМ Hepes-NaOH, pH 7.0, 50 мМ MgSO4, 270 мМ NDSB 195, 15% (v/v) этиленгликоль Статистика наборов Предел разрешения 2.15 Å Пространственная группа P3121 Параметры ячейки: 95.82, 95.82, 165.24 (Å) 90.0 , 90.0, 120.0 (°) PDB код 4M2L (Рис. 35. aIF2γ) aIF2γΔ41-45•GDPNP/GDP В капле: 4.5% (w/v) малонат натрия, pH 4.7, 5.5 мМ GDPNP В противорастворе: 15% (w/v) малонат натрия, pH 4.7. Температура 28°C Крио: 25.5% (w/v) малонат натрия, pH 4.7, 15% (v/v) этиленгликоль aIF2γΔ41-45•ГДФ В капле: 1.2 M формиат натрия, 33 мМ какодилат натрия, pH 6.5, 3 мМ ГДФ В противорастворе: 3.6 M формиат натрия, 100 мМ какодилат натрия, pH 6.5. Температура 28°C Крио: 3.0 M формиат натрия, 85 мМ какодилат натрия, pH 6.5, 15% (v/v) этиленгликоль Предел разрешения 2.5 Å Пространственная группа I23 Параметры ячейки: 187.25, 187.25, 187.25 (Å) 90.0, 90.0, 90.0 (°) В капле: 1.8 M формиат натрия, 44 мМ какодилат натрия, pH 6.5, 5 мМ GDPNP В противорастворе: 3 M формиат натрия, 83 мМ какодилат натрия, pH 6.5. Температура 28°C Крио: 3.0 M формиат натрия, 85 мМ какодилат натрия, pH 6.5, 15% (v/v) этиленгликоль Предел разрешения 2.3 Å Пространственная группа I23 Параметры ячейки: 187.12, 187.12, 187.12 (Å) 90.0, 90.0, 90.0 (°) PDB код 3PEN В капле: 1.8 M формиат натрия, 44 мМ какодилат натрия, pH 6.5, 4.9 мМ GDPCP В противорастворе: 3.2 M формиат натрия, 90 мМ какодилат натрия, pH 6.5. Температура 28°C Крио: 3.0 M формиат натрия, 85 мМ какодилат натрия, pH 6.5, 15% (v/v) этиленгликоль Предел разрешения 2.0 Å Пространственная группа I23 Параметры ячейки: 186.89, 186.89, 186.89 (Å) 90.0, 90.0, 90.0 (°) PDB код 4M53 aIF2γΔ37-47•GDPNP/GDP aIF2γΔ37-47•GDPCP 110 Предел разрешения 2.8 Å Пространственная группа P3121 Параметры ячейки: 94.75, 94.75, 165.37 (Å) 90.0 , 90.0, 120.0 (°) PDB код 3SJZ 111 II ON (ГТФ) C N I(G) III II II C aIF2γ ON (ГДФ•Фн) C III III FMT N I(G) II OFF (ГДФ) C aIF2γ•ГДФ III Петля L1 Петля switch 2 Петля switch 1 Петля P Нуклеотид Рис. 35. «Рабочий» цикл aIF2γ S. solfataricus. Кристаллические структуры aIF2γ в свободном состоянии, в ГТФ(GDPCP)- и ГДФ-связанном состояниях и в промежуточной форме в комплексе с ГДФ и формиат ионом (FMT); PDB коды 4M2L, 4RJL, 4M0L и 4M4S, соответственно. В скобках указаны состояния γ-субъединицы aIF2 в ее «рабочем» цикле. Предполагается, что структура aIF2γ•ГДФ•FMT соответствует промежуточному состоянию белка в комплексе с ГДФ и Фн. N I(G) aIF2γ•GDPCP N I(G) aIF2γ•ГДФ•FMT При кристаллизации aIF2γ или ее мутантных форм с очищенным препаратом ГТФ, как и в случае кристаллизации aIF2γH20F с ГТФ, мы обнаруживали молекулу ГДФ в каноническом нуклеотид-связывающем сайте. В условиях с высокой концентрацией формиата натрия, который был использован в качестве осадителя, в сформировавшемся комплексе aIF2γ•ГДФ формиат-ион (FMT) стабилизировал switch участки белка в конформации, характерной для активного (ON) ГТФ-связанного состояния aIF2γ и EF-Tu. В полученной структуре aIF2γ•ГДФ•FMT атом кислорода формиат иона образует водородные связи с атомами азота главной цепи Gly96 и His97 петли switch 2 и Thr46 петли switch 1 (Рис. 36). Дополнительно формиат ион взаимодействует через молекулу воды с ионом магния, β-фосфатом нуклеотида и Lys22 P-петли. В целом формиат ион занимает положение, близкое к положению неорганического фосфата (Фн) в структуре aIF2αD3βγ•ГДФ•Фн (Yatime et al., 2007), которая, как предполагают авторы, отражает состояние белка непосредственно после гидролиза ГТФ – в комплексе с ГДФ и Фн. В этой структуре гетеротримера, определенной с низким разрешением (3.2 Å), промежуточное состояние белка поддерживается неким лигандом, возможно, фосфат-ионом, который взаимодействует с обоими switch участками aIF2γ. ГДФ Рис. 36. Наложение канонического нуклеотид-связывающего участка aIF2γ структур aIF2γ•ГДФ•FMT (показана серым цветом) и aIF2αD3βγ•ГДФ•Фн (показана зеленым цветом, PDB код 2QMU). Черными и зелеными пунктирными линиями показаны водородные связи, образуемые формиат-ионом (FMT) и неорганическим фосфатом (Фн), соответственно. Конформации переключателя switch 1 существенно отличаются. W – молекула воды. Mg – ион магния (Mg2+). 112 На основании этих данных мы предположили, что в полученной нами с разрешением 2.25 Å структуре aIF2γ•ГДФ•FMT формиат-ион имитирует отщепленный от ГТФ неорганический фосфат. В таком случае данная структура может представлять промежуточное состояние aIF2γ•ГДФ•Фн, в котором Фн сохраняет связь с белком и положение switch участков соответствует активному состоянию γ-субъединицы. В ранее определенных структурах aIF2γ координаты атомов для большинства аминокислотных остатков петли switch 1 не были определены из-за большой подвижности полипептидной цепи этого участка. В определенной нами структуре aIF2γ•ГДФ•FMT в области переключателя switch 1 мы впервые наблюдали хорошо интерпретируемую электронную плотность. Центральная часть switch 1 (36-44 а. о.) формирует α-спираль, а остатки 31-35 образуют β-тяж, входящий в состав семи-тяжевого β-листа. Аналогичные элементы вторичной структуры также наблюдались в петле switch 1 фактора EF-Tu•GDPNP. Однако сравнение полученной структуры со структурой EF-Tu•GDPNP выявило некоторые различия в положении спиральной части переключателя, которые могут быть следствием гидролиза ГТФ. Кроме того, в структуре aIF2γ•ГДФ•FMT по сравнению со всеми известными структурами aIF2γ впервые были замечены существенные конформационные изменения петли L1 (220-234 а. о.) (Рис. 35) и петли α6-β16 (308-313 а. о.), которые в обычной своей конформации участвуют в формировании поверхности контактов между γ- и α-субъединицами aIF2 (Yatime et al., 2006). Важно отметить, что вблизи этих петель расположены участки aIF2γ, с которыми контактирует переключатель switch 1. Поскольку обнаруженные конформации петель L1 и α6-β16 нарушают область взаимодействия γ-субъединицы с 3 доменом α-субъединицы aIF2 и, следовательно, препятствуют формированию αγ-димера, мы предположили, что эти участки aIF2γ также могут функционировать как петли-переключатели. Чтобы выяснить роль формиат-иона в конформационных перестройках aIF2γ, мы закристаллизовали белок дикого типа с ГДФ в присутствии формиата натрия. Полученная структура была полностью идентична структуре aIF2γ•ГДФ•FMT. Это свидетельствует о том, что не ГТФ, присутствующий в растворе при кристаллизации, а именно формиат-ион в высокой концентрации стабилизирует связанную с нуклеотидом γ-субъединицу aIF2 в ON конформации. Полученные в этих условиях кристаллы aIF2γ с негидролизуемым аналогом ГТФ, GDPCP, позволили определить структуру этого белка с самым высоким на тот момент разрешением – 1.64 Å (Табл. 15, Рис. 35). В этой модели впервые стала видна полная структура переключателя switch 1 в составе ГТФ-связанной aIF2γ. Сравнительный анализ структур switch 1 в составе aIF2γ•GDPCP и EF-Tu•GDPNP выявил схожее 113 положение и конформацию переключателя, а также идентичность системы водородных связей как стабилизирующих структуру этого участка, так и определяющих его положение в обоих белках. Структура aIF2γ•GDPCP депонирована в банк белковых структур (PDB код 4RJL). Позднее аналогичные результаты были получены в группе Э. Шмитт, которые определили структуру aIF2γ S. solfataricus в комплексе с GDPNP с разрешением 1.3 Å (Dubiez et al., 2015) (см. Табл. 5 в разделе «Обзор литературы»). Таблица 15. Результаты экспериментов по кристаллизации aIF2γ дикого типа с нуклеотидами. Объект и фото кристаллов aIF2γ•GDPCP aIF2γ•ГДФ Условия кристаллизации В капле: 1.2 M формиат натрия, 33 мМ какодилат натрия, pH 6.5, 1.2% (w/v) ММЭПЭГ 5000, 1 мМ GDPCP В противорастворе: 3.2 M формиат натрия, 90 мМ какодилат натрия, pH 6.5 Температура 28°C Крио: 3.0 M формиат натрия, 85 мМ какодилат натрия, pH 6.5, 15% (v/v) этиленгликоль В капле: 7.5% (w/v) ПЭГ 4000, 100 мМ Трис-HCl, pH 7.5, 90 мМ KBr, 0.5 мМ ГТФ В противорастворе: 13% (w/v) ПЭГ 4000, 100 мМ Трис-HCl, pH 7.5, 180 мМ KBr Температура 22°C Крио: 13% (w/v) ПЭГ 4000, 100 мМ Трис-HCl, pH 7.5, 180 мМ KBr, 15% (v/v) этиленгликоль Статистика наборов Предел разрешения 1.64 Å Пространственная группа I23 Параметры ячейки: 186.25, 186.25, 186.25(Å) 90.0, 90.0, 90.0 (°) PDB код 4RJL (Рис. 35. aIF2γ•GDPCP) Предел разрешения 2.6 Å Пространственная группа P1211 Параметры ячейки: 86.05, 106.55, 156.30 (Å) 90.00, 90.63, 90.00 (°) PDB код 4M0L (Рис. 35. aIF2γ•ГДФ) При кристаллизации aIF2γ с ГТФ в условиях, не содержащих формиат натрия, был снова закристаллизован комплекс aIF2γ•ГДФ (Табл. 15), но в отсутствие формиат иона петли-переключатели принимали характерные OFF конформации. Сравнение структур OFF и ON состояний aIF2γ впервые продемонстрировало смещение доменов II и III относительно домена I(G) (Рис. 37а), хотя и не столь значительное как в EF-Tu факторе. Вращение II и III доменов aIF2γ происходит на 10-15° вокруг оси, соединяющей Cα атомы 292-293 а. о. Стоит отметить, что взаимное расположение доменов γ-субъединицы, не связанной с нуклеотидом, соответствует промежуточному положению между ГТФ- и ГДФ-связанным состояниями белка. Это может объяснять одинаковое сродство aIF2γ S. solfataricus к ГТФ и ГДФ (Pedullà et al., 2005). 114 (а) (б) I(G) I(G) Петля β17-β18 N SW2 II C III II III 10-15° aIF2γ•GDPCP (ON) aIF2γ•ГДФ•FMT (ON) aIF2γ•ГДФ•FMT (ON) aIF2γ•ГДФ (OFF) Рис. 37. (а) Смещение доменов aIF2γ S. solfataricus при переходе из активного состояния в неактивное. Наложение структур aIF2γ•ГДФ•FMT и aIF2γ•ГДФ проводилось по I(G) домену. Cα атомы 292-293 а. о. показаны шариками. (б) Наложение участков аминокислотной цепи белка, входящих в состав нуклеотид-связывающего кармана в активной форме aIF2γ•GDPCP, на соответствующие участки активной, но ГДФ-связанной формы aIF2γ•ГДФ•FMT. FMT – формиат ион, Wf – молекула активной воды, участвующая в гидролизе ГТФ. Участки switch 1 и 2 обозначены как SW1 и SW2, соответственно. Основные изменения в структуре aIF2γ, происходящие при связывании ГТФ, его гидролизе и переходе белка в свободное состояние, обусловлены структурными перестройками подвижных участков G-домена белка (Рис. 35). Сравнительный анализ полученных структур позволил описать структурные перестройки в aIF2γ, происходящие при гидролизе ГТФ. При переходе aIF2γ из ГТФ- в ГДФ-связанное состояние центральная часть переключателя switch 1 поворачивается на 60 по часовой стрелке, что приводит к значительным конформационным перестройкам на его N- и C-концах (Рис. 37б). Конформацию сохраняет только -спираль (A) и прилегающий к ней Met45. Участки switch 1, включающие 34-38 и 44-48 а. о., теряют α-спиральную конформацию, и С-конец A-спирали смещается в сторону switch 2. Практически все водородные связи, стабилизирующие структуру центрального участка switch 1 и его положение в молекуле, разрушаются, и стабильность его конформации значительно снижается. Гидролиз ГТФ смещает -фосфат в положение, которое ранее занимала молекула активной воды, и дестабилизирует switch 1, стимулируя его дальнейшие перестройки, которые ведут к удалению -фосфата и переходу aIF2γ в неактивную ГДФ-связанную форму. 115 Функционально важная петля switch 1 играет роль «застежки» для «кармана», образованного каноническим нуклеотид-связывающим сайтом aIF2γ. Было обнаружено, что конформация этого переключателя, не позволяет полностью закрыть карман в aIF2γ, в отличие от EF-Tu (Рис. 38). Это может объяснять меньшее сродство aIF2γ к ГТФ и ГДФ (Kd ≈ 4.810-7 M и 4.010-7 M, соответственно), по сравнению с EF-Tu T. thermophilus к ГТФ и ГДФ (Kd ≈ 5.810-8 и 1.110-9 M, соответственно) и соизмеримые скорости обмена связанного с aIF2 меченого ГДФ на немеченый ГТФ и ГДФ (Arai et al., 1978; Pedullà et al., 2005). Поскольку карман остается открытым и доступным растворителю на протяжении всего цикла работы aIF2γ, γ-фосфату ничто не препятствует покинуть белок после гидролиза ГТФ. Это в свою очередь указывает на возможность спонтанного гидролиза ГТФ у фактора aIF2 на рибосоме и объясняет отсутствие у архей фактора aIF5, стимулирующего ГТФазную активность aIF2. aIF2γ ON (ГТФ) EF-Tu ON (ГТФ) Рис. 38. Сравнение степени закрытия нуклеотид-связывающего кармана в aIF2γ S. solfataricus и EF-Tu T. thermophilus (PDB коды 4RJL и 1EXM, соответственно), находящихся в активном, ГТФ-связанном состоянии. Стрелкой отмечена область нуклеотид-связывающего кармана, которая при связывании ГТФ остается открытой в aIF2γ и закрыта в EF-Tu. 116 ВЫВОДЫ В настоящей диссертационной работе получены следующие основные результаты: 1. Получены кристаллы тройственного комплекса aIF2αD3γ•GDPNP•Met-тРНКf, что позволило впервые определить и проанализировать пространственную структуру этого комплекса с разрешением 3.2 Å. Показано, что, несмотря на структурную гомологию aIF2γ и EF-Tu, взаимодействие инициаторной тРНК с фактором инициации aIF2 происходит по D-шпильке, тогда как элонгаторные тРНК взаимодействуют с фактором элонгации EF-Tu по Т-шпильке. 2. В условиях с высокой ионной силой получены кристаллы полноразмерного тройственного комплекса aIF2αβγ•GDPNP•Met-тРНКf, с которых собраны дифракционные данные с разрешением до 4.8 Å. 3. Получены штаммы-суперпродуценты E. coli для α- и β-субъединиц eIF2 S. cerevisiae и разработаны методики выделения этих белков. 4. Получены препараты различных вариантов химерного фактора e/aIF2 и их тройственных комплексов с GDPNP и Met-тРНКf. Найдены условия кристаллизации химерных тройственных комплексов. С кристаллов комплекса eIF2β/aIF2αD3γ•GDPNP•Met-тРНКf собран набор дифракционных данных с разрешением 4.9 Å. 5. Показано, что замены в каноническом нуклеотид-связывающем сайте aIF2γ S. solfataricus снижают или полностью подавляют способность белка связывать мРНК. Для связывания с aIF2γ необходимо наличие у мРНК 5’-концевого гуанозинтрифосфата; белок не связывает мРНК с аденозинтрифосфатом на 5’-конце. Эти данные позволяют впервые утверждать, что связывание 5’-концевого гуанозинтрифосфата мРНК в каноническом нуклеотид-связывающем сайте aIF2γ определяет специфическое взаимодействие мРНК с данным белком. 6. Получены кристаллы мутантных форм γ-субъединицы aIF2 S. solfataricus в свободной форме, в комплексе с ГДФ и негидролизуемыми аналогами ГТФ. Получены кристаллы aIF2γ дикого типа в комплексе с негидролизуемым аналогом ГТФ, что позволило определить пространственную структуру этого белка с разрешением 1.64 Å. На основе полученных кристаллических структур была построена схема рабочего цикла aIF2γ, отображающая структурные перестройки подвижных участков G-домена белка. 117 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Спирин, А.С. (2011). Молекулярная биология: рибосомы и биосинтез белка. Москва: Издательский центр «Академия». – 496 с. 2. Столбоушкина, Е.А. Исследования структуры архейного фактора инициации трансляции 2. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. 2009, Москва. 3. Algire, M.A., Maag, D., Savio, P., Acker, M.G., Tarun, S.Z.J., Sachs, A.B., Asano, K., Nielsen, K.H., Olsen, D.S., Phan, L., et al. (2002). Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA 8, 382–397. 4. Algire, M.A., Maag, D., and Lorsch, J.R. (2005). Pi release from eIF2, not GTP hydrolysis, is the step controlled by start-site selection during eukaryotic translation initiation. Mol. Cell 20, 251–262. 5. Allen, G.S., Zavialov, A., Gursky, R., Ehrenberg, M., and Frank, J. (2005). The cryo-EM structure of a translation initiation complex from Escherichia coli. Cell 121, 703–712. 6. Andersen, G.R., Pedersen, L., Valente, L., Chatterjee, I., Kinzy, T.G., Kjeldgaard, M., and Nyborg, J. (2000). Structural basis for nucleotide exchange and competition with tRNA in the yeast elongation factor complex eEF1A:eEF1Bα. Mol. Cell 6, 1261–1266. 7. Andersen, G.R., Valente, L., Pedersen, L., Kinzy, T.G., and Nyborg, J. (2001). Crystal structures of nucleotide exchange intermediates in the eEF1A – eEF1Bα complex. Nat. Struct. Biol. 8, 531–534. 8. Andreev, D.E., Terenin, I.M., Dunaevsky, Y.E., Dmitriev, S.E., and Shatsky, I.N. (2006). A leaderless mRNA can bind to mammalian 80S ribosomes and direct polypeptide synthesis in the absence of translation initiation factors. Mol. Cell. Biol. 26, 3164–3169. 9. Antoun, A., Pavlov, M.Y., Lovmar, M., and Ehrenberg, M. (2006). How initiation factors tune the rate of initiation of protein synthesis in bacteria. EMBO J. 25, 2539–2550. 10. Arai, K., Arai, N., Nakamura, S., Oshima, T., and Kaziro, Y. (1978). Studies on polypeptide-chain-elongation factors from an extreme thermophile, Thermus thermophilus HB8. 2. Catalytic properties. Eur J Biochem. 92, 521–531. 11. Asano, K., Krishnamoorthy, T., Phan, L., Pavitt, G.D., and Hinnebusch, G. (1999). Conserved bipartite motifs in yeast eIF5 and eIF2Bε, GTPase-activating and GDP-GTP exchange factors in translation initiation, mediate binding to their common substrate eIF2. EMBO J. 18, 1673–1688. 12. Aylett, C.H.S., Boehringer, D., Erzberger, J.P., Schaefer, T., and Ban, N. (2015). Structure of a yeast 40S-eIF1-eIF1A-eIF3-eIF3j initiation complex. Nat. Struct. Mol. Biol. 22, 269–271. 13. Balakin, A.G., Skripkin, E.A., Shatsky, I.N., and Bogdanov, A.A. (1992). Unusual ribosome binding properties of mRNA encoding bacteriophage λ repressor. Nucleic Acids Res. 20, 563–571. 118 14. Ban, N., Beckmann, R., Cate, J.H.D., Dinman, J.D., Dragon, F., Ellis, S.R., Lafontaine, D.L.J., Lindahl, L., Liljas, A., Lipton, J.M., et al. (2014). A new system for naming ribosomal proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 24, 165–169. 15. Barrieux, A., and Rosenfeld, M.G. (1977). Comparison of mRNA binding by Met-tRNAf binding protein and mRNA-associated proteins. J. Biol. Chem. 252, 392–398. 16. Barthelme, D., Dinkelaker, S., Albers, S., Londei, P., Ermler, U., and Tampé, R. (2011). Ribosome recycling depends on a mechanistic link between the FeS cluster domain and a conformational switch of the twin-ATPase ABCE1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 3228– 3233. 17. Basu, U., Si, K., Warner, J.R., and Maitra, U. (2001). The Saccharomyces cerevisiae TIF6 gene encoding translation initiation factor 6 is required for 60S ribosomal subunit biogenesis. Mol. Cell. Biol. 75, 1453–1462. 18. Battiste, J.L., Pestova, T. V., Hellen, C.U.T., and Wagner, G. (2000). The eIF1A solution structure reveals a large RNA-binding surface important for scanning function. Mol. Cell 5, 109– 119. 19. Benelli, D., and Londei, P. (2009). Begin at the beginning: evolution of translational initiation. Res. Microbiol. 160, 493–501. 20. Benelli, D., and Londei, P. (2011). Translation initiation in Archaea: conserved and domain-specific features. Biochem. Soc. Trans. 39, 89–93. 21. Benelli, D., Maone, E., and Londei, P. (2003). Two different mechanisms for ribosome/mRNA interaction in archaeal translation initiation. Mol. Microbiol. 50, 635–643. 22. Benelli, D., Marzi, S., Mancone, C., Alonzi, T., La Teana, A., and Londei, P. (2009). Function and ribosomal localization of aIF6, a translational regulator shared by Archaea and Eukarya. Nucleic Acids Res. 37, 256–267. 23. Berchtold, H., Reshetnikova, L., Reiser, C.O.A., Schirmer, N.K., Sprinzl, M., and Hilgenfeld, R. (1993). Crystal structure of active elongation factor Tu reveals major domain rearrangements. Nature 365, 126–132. 24. Bommer, U.A., Lutsch, G., Behlke, J., Stahl, J., Nesytova, N., Henske, A., and Bielka, H. (1988). Shape and location of eukaryotic initiation factor eIF-2 on the 40s ribosomal subunit of rat liver. Immunoelectron-microscopic and hydrodynamic investigations. Eur. J. Biochem. 172, 653–662. 25. Boni, I. V, Artamonova, V.S., Tzareva, N. V, and Dreyfus, M. (2001). Non-canonical mechanism for translational control in bacteria: synthesis of ribosomal protein S1. EMBO J. 20, 4222–4232. 26. Brenneis, M., Hering, O., Lange, C., and Soppa, J. (2007). Experimental characterization of cis-acting elements important for translation and transcription in halophilic archaea. PLoS Genet. 3, e229. 27. Bult, C.J., White, O., Olsen, G.J., Zhou, L., Fleischmann, R.D., Sutton, G.G., Blake, J.A., Fitzgerald, L.M., Clayton, R.A., Gocayne, J.D., et al. (1996). Complete genome sequence of the methanogenic archaeon, Methanococcus jannaschii. Science 273, 1058–1073. 119 28. Carrera, P., Johnstone, O., Nakamura, A., Casanova, J., Jackle, H., and Lasko, P. (2000). VASA mediates translation through interaction with a Drosophila yIF2 homolog. Mol. Cell 5, 181–187. 29. Carter, A.P., Clemons Jr., W.M., Brodersen, D.E., Morgan-Warren, R.J., Hartsch, T., Wimberly, B.T., and Ramakrishnan, V. (2001). Crystal structure of an initiation factor bound to the 30S ribosomal subunit. Science 291, 498–501. 30. Castilho-Valavicius, B., Yoon, H., and Donahue, T.F. (1990). Genetic characterization of the Saccharomyces cerevisiae translational initiation suppressors sui1, sui2 and SUI3 and their effects on HIS4 expression. Genetics 124, 483–495. 31. Castilho-Valavicius, B., Thompson, G.M., and Donahue, T.F. (1992). Mutation analysis of the Cys-X2-Cys-X19-Cys-X2-Cys motif in the beta subunit of eukaryotic translation initiation factor 2. Gene Expr. 2, 297–309. 32. Ceci, M., Gaviraghi, C., Gorrini, C., Sala, L.A., Offenhauser, N., Marchisio, P.C., and Biffo, S. (2003). Release of eIF6 (p27BBP) from the 60S subunit allows 80S ribosome assembly. Nature 426, 579–584. 33. Chakrabarti, A., and Maitra, U. (1991). Function of eukaryotic initiation factor 5 in the formation of an 80 S ribosomal polypeptide chain initiation complex. J. Biol. Chem. 266, 14039– 14045. 34. Cheung, Y.-N., Maag, D., Mitchell, S.F., Fekete, C.A., Algire, M.A., Takacs, J.E., Shirokikh, N., Pestova, T., Lorsch, J.R., and Hinnebusch, A.G. (2007). Dissociation of eIF1 from the 40S ribosomal subunit is a key step in start codon selection in vivo. Genes Dev. 21, 1217– 1230. 35. Cho, S., and Hoffman, D.W. (2002). Structure of the β subunit of translation initiation factor 2 from the Archaeon Methanococcus jannaschii: a representative of the eIF2β/eIF5 family of proteins. Biochemistry 41, 5730–5742. 36. Choi, S.K., Lee, J.H., Zoll, W.L., Merrick, W.C., and Dever, T.E. (1998). Promotion of Met-tRNAiMet binding to ribosomes by ylF2, a bacterial IF2 homolog in yeast. Science 280, 1757–1760. 37. Coleman, T.M., Wang, G., and Huang, F. (2004). Superior 5’ homogeneity of RNA from ATP-initiated transcription under the T7 φ2.5 promoter. Nucleic Acids Res. 32, e14. 38. Condò, I., Ciammaruconi, A., Benelli, D., Ruggero, D., and Londei, P. (1999). Cis-acting signals controlling translational initiation in the thermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus. Mol. Microbiol. 34, 377–384. 39. Dahlquist, K.D., and Puglisi, J.D. (2000). Interaction of translation initiation factor IF1 with the E. coli ribosomal A site. J. Mol. Biol. 299, 1–15. 40. Dar, A.C., Dever, T.E., and Sicheri, F. (2005). Higher-order substrate recognition of eIF2alpha by the RNA-dependent protein kinase PKR. Cell 122, 887–900. 41. Das, A., Bagchi, M.K., Ghosh-Dastidar, P., and Gupta, N.K. (1982). Protein synthesis in rabbit reticulocytes. A study of peptide chain initiation using native and beta-subunit-depleted eukaryotic initiation factor 2. J. Biol. Chem. 257, 1282–1288. 120 42. Das, S., Maiti, T., Das, K., and Maitra, U. (1997). Specific interaction of eukaryotic translation initiation factor 5 (eIF5) with the beta-subunit of eIF2. J. Biol. Chem. 272, 31712– 31718. 43. Das, S., Ghosh, R., and Maitra, U. (2001). Eukaryotic translation initiation factor 5 functions as a GTPase-activating protein. J. Biol. Chem. 276, 6720–6726. 44. Davies, D., and Segal, D. (1971). Protein crystallization: microtechniques involving vapor diffusion. Methods Enzym. 22, 266–269. 45. Dennis, P.P. (1997). Ancient ciphers: translation in Archaea. Cell 89, 1007–1010. 46. Dev, K., Santangelo, T.J., Rothenburg, S., Neculai, D., Dey, M., Sicheri, F., Dever, T.E., Reeve, J.N., and Hinnebusch, A.G. (2009). Archaeal aIF2B interacts with eukaryotic translation initiation factors eIF2alpha and eIF2Balpha: Implications for aIF2B function and eIF2B regulation. J. Mol. Biol. 392, 701–722. 47. Dhaliwal, S., and Hoffman, D.W. (2003). The crystal structure of the N-terminal region of the alpha subunit of translation initiation factor 2 (eIF2alpha) from Saccharomyces cerevisiae provides a view of the loop containing serine 51, the target of the eIF2alpha-specific kinases. J. Mol. Biol. 334, 187–195. 48. Dmitriev, S.E., Stolboushkina, E.A., Terenin, I.M., Andreev, D.E., Garber, M.B., and Shatsky, I.N. (2011). Archaeal translation initiation factor aIF2 can substitute for eukaryotic eIF2 in ribosomal scanning during mammalian 48S complex formation. J. Mol. Biol. 413, 106–114. 49. Donahue, T.F., Cigan, A.M., Pabich, E.K., and Valavicius, B.C. (1988). Mutations at a Zn(II) finger motif in the yeast eIF-2β gene alter ribosomal start-site selection during the scanning process. Cell 54, 621–632. 50. Drabkin, H.J., and Rajbhandary, U.L. (1998). Initiation of protein synthesis in mammalian cells with codons other than AUG and amino acids other than methionine. Mol. Cell. Biol. 18, 5140–5147. 51. Dubiez, E., Aleksandrov, A., Lazennec-Schurdevin, C., Mechulam, Y., and Schmitt, E. (2015). Identification of a second GTP-bound magnesium ion in archaeal initiation factor 2. Nucleic Acids Res. 43, 2946–2957. 52. Dubnoff, J.S., Lockwood, A.H., and Maitra, U. (1972). Studies on the role of guanosine triphosphate in polypeptide chain initiation in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 247, 2884–2894. 53. Eiler, D., Lin, J., Simonetti, A., Klaholz, B.P., and Steitz, T.A. (2013). Initiation factor 2 crystal structure reveals a different domain organization from eukaryotic initiation factor 5B and mechanism among translational GTPases. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 15662–15667. 54. Erickson, F.L., and Hannig, E.M. (1996). Ligand interactions with eukaryotic translation initiation factor 2: role of the gamma-subunit. EMBO J. 15, 6311–6320. 55. Erickson, F.L., Harding, L.D., Dorris, D.R., and Hannig, E.M. (1997). Functional analysis of homologs of translation initiation factor 2γ in yeast. Mol. Gen. Genet. 253, 711–719. 56. Fekete, C.A., Applefield, D.J., Blakely, S.A., Shirokikh, N., Pestova, T., Lorsch, J.R., and Hinnebusch, A.G. (2005). The eIF1A C-terminal domain promotes initiation complex assembly, scanning and AUG selection in vivo. EMBO J. 24, 3588–3601. 121 57. Fekete, C.A., Mitchell, S.F., Cherkasova, V.A., Applefield, D., Algire, M.A., Maag, D., Saini, A.K., Lorsch, J.R., and Hinnebusch, A.G. (2007). N- and C-terminal residues of eIF1A have opposing effects on the fidelity of start codon selection. EMBO J. 26, 1602–1614. 58. Fernández, I.S., Bai, X.-C., Hussain, T., Kelley, A.C., Lorsch, J.R., Ramakrishnan, V., and Scheres, S.H.W. (2013). Molecular architecture of a eukaryotic translational initiation complex. Science 342, 1240585. 59. Fletcher, C.M., Pestova, T. V, Hellen, C.U.T., and Wagner, G. (1999). Structure and interactions of the translation initiation factor eIF1. EMBO J. 18, 2631–2637. 60. Flynn, A., Oldfield, S., and Proud, C.G. (1993). The role of the β-subunit of initiation factor eIF-2 in initiation complex formation. Biochim. Biophys. Acta 1174, 117–121. 61. Gäbel, K., Schmitt, J., Schulz, S., Näther, D.J., and Soppa, J. (2013). A comprehensive analysis of the importance of translation initiation factors for Haloferax volcanii applying deletion and conditional depletion mutants. PLoS One 8, e77188. 62. Gallie, D.R. (1998). A tale of two termini: a functional interaction between the termini of an mRNA is a prerequisite for efficient translation initiation. Gene 216, 1–11. 63. Gandin, V., Miluzio, A., Barbieri, A.M., Beugnet, A., Kiyokawa, H., Marchisio, P.C., and Biffo, S. (2008). Eukaryotic initiation factor 6 is rate-limiting in translation, growth and transformation. Nature 455, 684–688. 64. Gartmann, M., Blau, M., Armache, J.-P., Mielke, T., Topf, M., and Beckmann, R. (2010). Mechanism of eIF6-mediated inhibition of ribosomal subunit joining. J. Biol. Chem. 285, 14848–14851. 65. Godefroy-Colburn, T., Wolfe, A.D., Dondon, J., and Grunberg-Manago, M. (1975). Lightscattering studies showing the effect of initiation factors on the reversible dissociation of Escherichia coli ribosomes. J. Mol. Biol. 94, 461–478. 66. Gonsky, R., Itamar, D., Harary, R., and Kaempfer, R. (1992). Binding of ATP and messenger RNA by the β-subunit of eukaryotic initiation factor 2. Biochimie 74, 427–434. 67. Greber, B.J., Boehringer, D., Godinic-Mikulcic, V., Crnkovic, A., Ibba, M., WeygandDurasevic, I., and Ban, N. (2012). Cryo-EM structure of the archaeal 50S ribosomal subunit in complex with initiation factor 6 and implications for ribosome evolution. J. Mol. Biol. 418, 145– 160. 68. Grill, S., Gualerzi, C.O., Londei, P., and Bläsi, U. (2000). Selective stimulation of translation of leaderless mRNA by initiation factor 2: evolutionary implications for translation. EMBO J. 19, 4101–4110. 69. Groft, C.M., Beckmann, R., Sali, A., and Burley, S.K. (2000). Crystal structures of ribosome anti-association factor IF6. Nat. Struct. Biol. 7, 1156–1164. 70. Gualerzi, C.O., and Pon, C.L. (1990). Initiation of mRNA translation in prokaryotes. Biochemistry 29, 5881–5889. 71. Guenneugues, M., Caserta, E., Brandi, L., Spurio, R., Meunier, S., Pon, C.L., Boelens, R., and Gualerzi, C.O. (2000). Mapping the fMet-tRNAfMet binding site of initiation factor IF2. EMBO J. 19, 5233–5240. 122 72. Guillon, L., Schmitt, E., Blanquet, S., and Mechulam, Y. (2005). Initiator tRNA binding by e/aIF5B, the eukaryotic/archaeal homologue of bacterial initiation factor IF2. Biochemistry 44, 15594–15601. 73. Gutiérrez, P., Coillet-Matillon, S., Arrowsmith, C., and Gehring, K. (2002). Zinc is required for structural stability of the C-terminus of archaeal translation initiation factor aIF2β. FEBS Lett. 517, 155–158. 74. Gutiérrez, P., Osborne, M.J., Siddiqui, N., Trempe, J.F., Arrowsmith, C., and Gehring, K. (2004). Structure of the archaeal translation initiation factor aIF2beta from Methanobacterium thermoautotrophicum: implications for translation initiation. Protein Sci. 13, 659–667. 75. Hasenöhrl, D., Benelli, D., Barbazza, A., Londei, P., and Bläsi, U. (2006). Sulfolobus solfataricus translation initiation factor 1 stimulates translation initiation complex formation. RNA 12, 674–682. 76. Hasenöhrl, D., Lombo, T., Kaberdin, V., Londei, P., and Bläsi, U. (2008). Translation initiation factor a/eIF2 (-γ) counteracts 5’ to 3' mRNA decay in the archaeon Sulfolobus solfataricus. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 2146–2150. 77. Hasenöhrl, D., Fabbretti, A., Londei, P., Gualerzi, C.O., and Bläsi, U. (2009). Translation initiation complex formation in the crenarchaeon Sulfolobus solfataricus. RNA 15, 2288–2298. 78. Hashem, Y., des Georges, A., Dhote, V., Langlois, R., Liao, H.Y., Grassucci, R.A., Hellen, C.U.T., Pestova, T. V, and Frank, J. (2013). Structure of the mammalian ribosomal 43S preinitiation complex bound to the scanning factor DHX29. Cell 153, 1108–1119. 79. Hatzopoulos, G.N., and Mueller-Dieckmann, J. (2010). Structure of translation initiation factor 1 from Mycobacterium tuberculosis and inferred binding to the 30S ribosomal subunit. FEBS Lett. 584, 1011–1015. 80. Hauryliuk, V., Hansson, S., and Ehrenberg, M. (2008). Cofactor dependent conformational switching of GTPases. Biophys. J. 95, 1704–1715. 81. Hering, O., Brenneis, M., Beer, J., Suess, B., and Soppa, J. (2009). A novel mechanism for translation initiation operates in haloarchaea. Mol. Microbiol. 71, 1451–1463. 82. Housman, D., Jacobs-Lorena, M., Rajbhandary, U.L., and Lodish, H.F. (1970). Initiation of haemoglobin synthesis by methionyl-tRNA. Nature 227, 913–918. 83. Huang, H., Yoon, H., Hannig, E.M., and Donahue, T.F. (1997). GTP hydrolysis controls stringent selection of the AUG start codon during translation initiation in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 11, 2396–2413. 84. Hussain, T., Llácer, J.L., Fernández, I.S., Munoz, A., Martin-Marcos, P., Savva, C.G., Lorsch, J.R., Hinnebusch, A.G., and Ramakrishnan, V. (2014). Structural changes enable start codon recognition by the eukaryotic translation initiation complex. Cell 159, 597–607. 85. Ito, T., Marintchev, A., and Wagner, G. (2004). Solution structure of human initiation factor eIF2alpha reveals homology to the elongation factor eEF1B. Structure 12, 1693–1704. 86. Janssen, J.R. (1993). Eubacterial, archaebacterial and eukaryotic genes that encode leaderless mRNAs. In Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, Washington DC: American Society for Microbiology, pp. 59–67. 123 87. Jia, M.Z., Horita, S., Nagata, K., and Tanokura, M. (2010). An archaeal Dim2-like protein, aDim2p, forms a ternary complex with a/eIF2 alpha and the 3’ end fragment of 16S rRNA. J. Mol. Biol. 398, 774–785. 88. Julián, P., Milon, P., Agirrezabala, X., Lasso, G., Gil, D., Rodnina, M. V, and Valle, M. (2011). The Cryo-EM structure of a complete 30S translation initiation complex from Escherichia coli. PLoS Biol. 9, e1001095. 89. Kaempfer, R., Hollender, R., Abrams, W.R., and Israeli, R. (1978a). Specific binding of messenger RNA and methionyl-tRNAfMet by the same initiation factor for eukaryotic protein synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 75, 209–213. 90. Kaempfer, R., Rosen, H., and Israeli, R. (1978b). Translational control: recognition of the methylated 5’ end and an internal sequence in eukaryotic mRNA by the initiation factor that binds methionyl-tRNAfMet. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 75, 650–654. 91. Kapp, L.D., and Lorsch, J.R. (2004). GTP-dependent recognition of the methionine moiety on initiator tRNA by translation factor eIF2. J. Mol. Biol. 335, 923–936. 92. Kimball, S.R., Everson, W. V, Myers, L.M., and Jefferson, L.S. (1987). Purification and characterization of eukaryotic initiation factor 2 and a guanine nucleotide exchange factor from rat liver. J. Biol. Chem. 262, 2220–2227. 93. Kjeldgaard, M., and Nyborg, J. (1992). Refined structure of elongation factor EF-Tu from Escherichia coli. J. Mol. Biol. 223, 721–742. 94. Kjeldgaard, M., Nissen, P., Thirup, S., and Nyborg, J. (1993). The crystal structure of elongation factor EF-Tu from Thermus aquaticus in the GTP conformation. Structure 1, 35–50. 95. Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Arpagaus, S., and Ban, N. (2011). Crystal structure of the eukaryotic 60S ribosomal subunit in complex with initiation factor 6. Science 334, 941–948. 96. Komarova, A. V, Tchufistova, L.S., Supina, E. V, and Boni, I. V (2002). Protein S1 counteracts the inhibitory effect of the extended Shine-Dalgarno sequence on translation. RNA 8, 1137–1147. 97. Konieczny, A., and Safer, B. (1983). Purification of the eukaryotic initiation factor 2eukaryotic initiation factor 2B complex and characterization of its guanine nucleotide exchange activity during protein synthesis initiation. J. Biol. Chem. 258, 3402–3408. 98. Kozak, M. (1989). The scanning model for translation: an update. J. Cell Biol. 108, 229– 241. 99. Kozak, M. (1999). Initiation of translation in prokaryotes and eukaryotes. Gene 234, 187– 208. 100. Kramer, P., Gäbel, K., Pfeiffer, F., and Soppa, J. (2014). Haloferax volcanii, a prokaryotic species that does not use the Shine Dalgarno mechanism for translation initiation at 5’-UTRs. PLoS One 9, e94979. 101. Kuhle, B., and Ficner, R. (2014). eIF5B employs a novel domain release mechanism to catalyze ribosomal subunit joining. EMBO J. 33, 1177–1191. 124 102. Kyrpides, N.C., and Woese, C.R. (1998a). Universally conserved translation initiation factors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 224–228. 103. Kyrpides, N.C., and Woese, C.R. (1998b). Archaeal translation initiation revisited: The initiation factor 2 and eukaryotic initiation factor 2B alpha-beta-delta subunit families. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 3726–3730. 104. Laalami, S., Putzer, H., Plumbridge, J.A., and Grunberg-Manago, M. (1991). A severely truncated form of translational initiation factor 2 supports growth of Escherichia coli. J. Mol. Biol. 220, 335–349. 105. Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680–685. 106. Lake, J.A. (1983). Evolving ribosome structure: domains in archaebacteria, eubacteria, and eucaryotes. Cell 33, 318–319. 107. Laurino, J.P., Thompson, G.M., Pacheco, E., and Castilho, B.A. (1999). The beta subunit of eukaryotic translation initiation factor 2 binds mRNA through the lysine repeats and a region comprising the C2-C2 motif. Mol. Cell. Biol. 19, 173–181. 108. Laursen, B.S., Mortensen, K.K., Sperling-Petersen, H.U., and Hoffman, D.W. (2003). A conserved structural motif at the N terminus of bacterial translation initiation factor IF2. J. Biol. Chem. 278, 16320–16328. 109. Lecompte, O., Ripp, R., Thierry, J., Moras, D., and Poch, O. (2002). Comparative analysis of ribosomal proteins in complete genomes: an example of reductive evolution at the domain scale. Nucleic Acids Res. 30, 5382–5390. 110. Lee, J.H., Choi, S.K., Roll-Mecak, A., Burley, S.K., and Dever, T.E. (1999). Universal conservation in translation initiation revealed by human and archaeal homologs of bacterial translation initiation factor IF2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 4342–4347. 111. Leipe, D.D., Wolf, Y.I., Koonin, E. V, and Aravind, L. (2002). Classification and evolution of P-loop GTPases and related ATPases. J. Mol. Biol. 317, 41–72. 112. Levin, D.H., Kyner, D., and Acs, G. (1973). Protein initiation in eukaryotes: formation and function of a ternary complex composed of a partially purified ribosomal factor, methionyl transfer RNA, and guanosine triphosphate. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 41–45. 113. Li, W., and Hoffman, D.W. (2001). Structure and dynamics of translation initiation factor aIF-1A from the archaeon Methanococcus jannaschii determined by NMR spectroscopy. Protein Sci. 10, 2426–2438. 114. Llácer, J.L., Hussain, T., Marler, L., Aitken, C.E., Thakur, A., Lorsch, J.R., Hinnebusch, A.G., and Ramakrishnan, V. (2015). Conformational differences between open and closed states of the eukaryotic translation initiation complex. Mol. Cell 59, 399–412. 115. Lomakin, I.B., and Steitz, T.A. (2013). The initiation of mammalian protein synthesis and mRNA scanning mechanism. Nature 500, 307–311. 116. Lomakin, I.B., Kolupaeva, V.G., Marintchev, A., Wagner, G., and Pestova, T. V (2003). Position of eukaryotic initiation factor eIF1 on the 40S ribosomal subunit determined by directed hydroxyl radical probing. Genes Dev. 17, 2786–2797. 125 117. Londei, P. (2005). Evolution of translational initiation: new insights from the archaea. FEMS Microbiol. Rev. 29, 185–200. 118. Maag, D., and Lorsch, J.R. (2003). Communication between eukaryotic translation initiation factors 1 and 1A on the yeast small ribosomal subunit. J. Mol. Biol. 330, 917–924. 119. Maag, D., Fekete, C.A., Gryczynski, Z., and Lorsch, J.R. (2005). A conformational change in the eukaryotic translation preinitiation complex and release of eIF1 signal recognition of the start codon. Mol. Cell 17, 265–275. 120. Mandel, M., and Higa, A. (1970). Calcium-dependent bacteriophage DNA infection. J. Mol. Biol. 53, 159–162. 121. Maone, E., Di Stefano, M., Berardi, A., Benelli, D., Marzi, S., La Teana, A., and Londei, P. (2007). Functional analysis of the translation factor aIF2/5B in the thermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus. Mol. Microbiol. 65, 700–713. 122. Marck, C., and Grosjean, H. (2002). tRNomics: Analysis of tRNA genes from 50 genomes of Eukarya, Archaea, and Bacteria reveals anticodon-sparing strategies and domain-specific features. RNA 8, 1189–1232. 123. Marintchev, A., and Wagner, G. (2004). Translation initiation: structures, mechanisms and evolution. Q. Rev. Biophys. 37, 197–284. 124. Marintchev, A., Kolupaeva, V.G., Pestova, T. V, and Wagner, G. (2003). Mapping the binding interface between human eukaryotic initiation factors 1A and 5B: a new interaction between old partners. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 1535–1540. 125. Märtens, B., Manoharadas, S., Hasenöhrl, D., Zeichen, L., and Bläsi, U. (2014). Back to translation: removal of aIF2 from the 5’-end of mRNAs by translation recovery factor in the crenarchaeon Sulfolobus solfataricus. Nucleic Acids Res. 42, 2505–2511. 126. Martínez-Salas, E., Piñeiro, D., and Fernández, N. (2012). Alternative mechanisms to initiate translation in eukaryotic mRNAs. Comp. Funct. Genomics 2012, 391546. 127. Marzi, S., Knight, W., Brandi, L., Caserta, E., Soboleva, N., Hill, W.E., Gualerzi, C.O., and Lodmell, J.S. (2003). Ribosomal localization of translation initiation factor IF2. RNA 9, 958–969. 128. Mazumder, R. (1972). Initiation factor 2-dependent ribosomal binding of Nformylmethionyl-transfer RNA without added guanosine triphosphate. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69, 2770–2773. 129. Menne, T.F., Goyenechea, B., Sánchez-Puig, N., Wong, C.C., Tonkin, L.M., Ancliff, P.J., Brost, R.L., Costanzo, M., Boone, C., and Warren, A.J. (2007). The Shwachman-BodianDiamond syndrome protein mediates translational activation of ribosomes in yeast. Nat. Genet. 39, 486–495. 130. Merrick, W.C. (1992). Mechanism and regulation of eukaryotic protein synthesis. Microbiol. Rev. 56, 291–315. 131. Meunier, S., Spurio, R., Czisch, M., Wechselberger, R., Guenneugues, M., Gualerzi, C.O., and Boelens, R. (2000). Structure of the fMet-tRNAfMet-binding domain of B. stearothermophilus initiation factor IF2. EMBO J. 19, 1918–1926. 126 132. Miller, M.J., and Wahba, A.J. (1973). Chain initiation factor 2. Purification and properties of two species from Escherichia coli MRE 600. J. Biol. Chem. Biol. 248, 1084–1090. 133. Milon, P., Carotti, M., Konevega, A.L., Wintermeyer, W., Rodnina, M. V, and Gualerzi, C.O. (2010). The ribosome-bound initiation factor 2 recruits initiator tRNA to the 30S initiation complex. EMBO Rep. 11, 312–316. 134. Milón, P., Maracci, C., Filonava, L., Gualerzi, C.O., and Rodnina, M. V (2012). Real-time assembly landscape of bacterial 30S translation initiation complex. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 609–615. 135. Moazed, D., Samaha, R.R., Gualerzi, C., and Noller, H.F. (1995). Specific protection of 16S rRNA by translational initiation factors. J. Mol. Biol. 248, 207–210. 136. Mohr, D., Wintermeyer, W., and Rodnina, M. V (2002). GTPase activation of elongation factors Tu and G on the ribosome. Biochemistry 41, 12520–12528. 137. Moll, I., Afonyushkin, T., Vytvytska, O., Kaberdin, V.R., and Bläsi, U. (2003). Coincident Hfq binding and RNase E cleavage sites on mRNA and small regulatory RNAs. RNA 9, 1308– 1314. 138. Moll, I., Hirokawa, G., Kiel, M.C., Kaji, A., and Bläsi, U. (2004). Translation initiation with 70S ribosomes: an alternative pathway for leaderless mRNAs. Nucleic Acids Res. 32, 3354–3363. 139. Moreno, J.M.P., Dyrskjøtersen, L., Kristensen, J.E., Mortensen, K.K., and SperlingPetersen, H.U. (1999). Characterization of the domains of E. coli initiation factor IF2 responsible for recognition of the ribosome. FEBS Lett. 455, 130–134. 140. Myasnikov, A.G., Marzi, S., Simonetti, A., Giuliodori, A.M., Gualerzi, C.O., Yusupova, G., Yusupov, M., and Klaholz, B.P. (2005). Conformational transition of initiation factor 2 from the GTP- to GDP-bound state visualized on the ribosome. Nat. Struct. Mol. Biol. 12, 1145–1149. 141. Naveau, M., Lazennec-Schurdevin, C., Panvert, M., Mechulam, Y., and Schmitt, E. (2010). tRNA binding properties of eukaryotic translation initiation factor 2 from Encephalitozoon cuniculi. Biochemistry 49, 8680–8688. 142. Naveau, M., Lazennec-Schurdevin, C., Panvert, M., Dubiez, E., Mechulam, Y., and Schmitt, E. (2013). Roles of yeast eIF2α and eIF2β subunits in the binding of the initiator methionyl-tRNA. Nucleic Acids Res. 41, 1047–1057. 143. Nevskaya, N., Tishchenko, S., Gabdoulkhakov, A., Nikonova, E., Nikonov, O., Nikulin, A., Platonova, O., Garber, M., Nikonov, S., and Piendl, W. (2005). Ribosomal protein L1 recognizes the same specific structural motif in its target sites on the autoregulatory mRNA and 23S rRNA. Nucleic Acids Res. 33, 478–485. 144. Nika, J., Rippel, S., and Hannig, E.M. (2001). Biochemical analysis of the eIF2beta gamma complex reveals a structural function for eIF2alpha in catalyzed nucleotide exchange. J. Biol. Chem. 276, 1051–1056. 145. Nikonov, O., Stolboushkina, E., Nikulin, A., Hasenöhrl, D., Bläsi, U., Manstein, D.J., Fedorov, R., Garber, M., and Nikonov, S. (2007). New insights into the interactions of the translation initiation factor 2 from archaea with guanine nucleotides and initiator tRNA. J. Mol. Biol. 373, 328–336. 127 146. Nissen, P., Kjeldgaard, M., Thirup, S., Palekhina, G., Reshetnikava, L., Clark, B.F.C., and Nyborg, J. (1995). Crystal structure of the ternary complex of Phe-tRNAPhe, EF-Tu, and a GTP analog. Science 270, 1464–1472. 147. Nissen, P., Thirup, S., Kjeldgaard, M., and Nyborg, J. (1999). The crystal structure of CystRNACys-EF-Tu-GDPNP reveals general and specific features in the ternary complex and in tRNA. Structure 7, 143–156. 148. Nonato, M.C., Widom, J., and Clardy, J. (2002). Crystal structure of the N-terminal segment of human eukaryotic translation initiation factor 2 alpha. J. Biol. Chem. 277, 17057– 17061. 149. Nyengaard, N.R., Mortensen, K.K., Lassen, S.F., Hershey, J.W., and Sperling-Petersen, H.U. (1991). Tandem translation of E. coli initiation factor IF2 beta: Purification and characterization in vitro of two active forms. Biochem. Biophys. Res. Commun. 181, 1572– 1579. 150. Nygard, O., Westermann, P., and Hultin, T. (1980). Met-tRNAfMet is located in close proximity to the beta subunit of eIF-2 in the eukaryotic initiation complex, eIF-2•Met-tRNAfMet• GDPCP. FEBS Lett. 113, 125–128. 151. O’Donnell, S.M., and Janssen, G.R. (2002). Leaderless mRNAs bind 70S ribosomes more strongly than 30S ribosomal subunits in Escherichia coli. J. Bacteriol. 184, 6730–6733. 152. Olsen, D.S., Savner, E.M., Mathew, A., Zhang, F., Krishnamoorthy, T., Phan, L., and Hinnebusch, A.G. (2003). Domains of eIF1A that mediate binding to eIF2 , eIF3 and eIF5B and promote ternary complex recruitment in vivo. EMBO J. 22, 193–204. 153. Panniers, R., and Henshaw, E.C. (1983). A GDP/GTP exchange factor essential for eukaryotic initiation factor 2 cycling in Ehrlich ascites tumor cells and its regulation by eukaryotic initiation factor 2 phosphorylation. J. Biol. Chem. 258, 7928–7934. 154. Passmore, L.A., Schmeing, T.M., Maag, D., Applefield, D.J., Acker, M.G., Algire, M.A., Lorsch, J.R., and Ramakrishnan, V. (2007). The eukaryotic translation initiation factors eIF1 and eIF1A induce an open conformation of the 40S ribosome. Mol. Cell 26, 41–50. 155. Paulin, F.E., Campbell, L.E., O’Brien, K., Loughlin, J., and Proud, C.G. (2001). Eukaryotic translation initiation factor 5 (eIF5) acts as a classical GTPase-activator protein. Curr. Biol. 11, 55–59. 156. Pavitt, G.D., Ramaiah, K.V.A., Kimball, S.R., and Hinnebusch, A.G. (1998). eIF2 independently binds two distinct eIF2B subcomplexes that catalyze and regulate guaninenucleotide exchange. Genes Dev. 12, 514–526. 157. Pedullà, N., Palermo, R., Hasenöhrl, D., Bläsi, U., Cammarano, P., and Londei, P. (2005). The archaeal eIF2 homologue: functional properties of an ancient translation initiation factor. Nucleic Acids Res. 33, 1804–1812. 158. Pestova, T. V, and Kolupaeva, V.G. (2002). The roles of individual eukaryotic translation initiation factors in ribosomal scanning and initiation codon selection. Genes Dev. 16, 2906– 2922. 159. Pestova, T. V, Lomakin, I.B., Lee, J.H., Choi, S.K., Dever, T.E., and Hellen, C.U.T. (2000). The joining of ribosomal subunits in eukaryotes requires eIF5B. Nature 403, 332–335. 128 160. Pestova, T. V, de Breyne, S., Pisarev, A. V, Abaeva, I.S., and Hellen, C.U.T. (2008). eIF2dependent and eIF2-independent modes of initiation on the CSFV IRES: a common role of domain II. EMBO J. 27, 1060–1072. 161. Petersen, H.U., Røll, T., Grunberg-Manago, M., and Clark, B.F.C. (1979). Specific interaction of initiator factor IF2 of E. coli with formylmethionyl-tRNAfMet. Biochem. Biophys. Res. Commun. 91, 1068–1074. 162. Pisarev, A. V, Kolupaeva, V.G., Pisareva, V.P., Merrick, W.C., Hellen, C.U.T., and Pestova, T. V (2006). Specific functional interactions of nucleotides at key -3 and +4 positions flanking the initiation codon with components of the mammalian 48S translation initiation complex. Genes Dev. 20, 624–636. 163. Pisarev, A. V., Skabkin, M.A., Pisareva, V.P., Skabkina, O. V., Rakotondrafara, A.M., Hentze, M.W., Hellen, C.U.T., and Pestova, T. V. (2010). The role of ABCE1 in eukaryotic posttermination ribosomal recycling. Mol. Cell 37, 196–210. 164. Pisareva, V.P., Hellen, C.U.T., and Pestova, T. V (2007). Kinetic analysis of the interaction of guanine nucleotides with eukaryotic translation initiation factor eIF5B. Biochemistry 46, 2622–2629. 165. Polekhina, G., Thirup, S., Kjeldgaard, M., Nissen, P., Lippmann, C., and Nyborg, J. (1996). Helix unwinding in the effector region of elongation factor EF-Tu–GDP. Structure 4, 1141–1151. 166. Price, N.T., Nakielny, S.F., Clark, S.J., and Proud, C.G. (1989). The two forms of the βsubunit of initiation factor-2 from reticulocyte lysates arise from proteolytic degradation. Biochim. Biophys. Acta 1008, 177–182. 167. Rabl, J., Leibundgut, M., Ataide, S.F., Haag, A., and Ban, N. (2011). Crystal structure of the eukaryotic 40S ribosomal subunit in complex with initiation factor 1. Science 331, 730–736. 168. RajBhandary, U.L., and Chow, C.M. (1995). Initiator tRNAs and initiation of protein synthesis. In tRNA: Structure, Biosynthesis, and Function, American Society for Microbiology, Washington, pp. 511–528. 169. Rasmussen, L.C.V., Oliveira, C.L., Jensen, J.M., Pedersen, J.S., Sperling-Petersen, H.U., and Mortensen, K.K. (2008). Solution structure of C-terminal Escherichia coli translation initiation factor IF2 by small-angle X-ray scattering. Biochemistry 47, 5590–5598. 170. Rasmussen, L.C.V., Oliveira, C.L.P., Byron, O., Jensen, J.M., Pedersen, J.S., SperlingPetersen, H.U., and Mortensen, K.K. (2011). Structure and dimerization of translation initiation factor aIF5B in solution. Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 140–145. 171. Reibarkh, M., Yamamoto, Y., Singh, C.R., del Rio, F., Fahmy, A., Lee, B., Luna, R.E., Ii, M., Wagner, G., and Asano, K. (2008). Eukaryotic initiation factor (eIF) 1 carries two distinct eIF5-binding faces important for multifactor assembly and AUG selection. J. Biol. Chem. 283, 1094–1103. 172. Roll-Mecak, A., Cao, C., Dever, T.E., and Burley, S.K. (2000). X-ray structure of the universal translation initiation factor IF2/eIF5B: conformational changes on GDP and GTP binding. Cell 103, 781–792. 129 173. Roll-Mecak, A., Alone, P., Cao, C., Dever, T.E., and Burley, S.K. (2004). X-ray structure of translation initiation factor eIF2gamma: implications for tRNA and eIF2alpha binding. J. Biol. Chem. 279, 10634–10642. 174. Russell, D.W., and Spremulli, L.L. (1979). Purification and characterization of a ribosome dissociation factor (eukaryotic initiation factor 6) from wheat germ. J. Biol. Chem. 254, 8796– 8800. 175. Saini, A.K., Nanda, J.S., Lorsch, J.R., and Hinnebusch, A.G. (2010). Regulatory elements in eIF1A control the fidelity of start codon selection by modulating tRNAiMet binding to the ribosome. Genes Dev. 24, 97–110. 176. Sanvito, F., Piatti, S., Villa, A., Bossi, M., Lucchini, G., Marchisio, P.C., and Biffo, S. (1999). The beta4 integrin interactor p27(BBP/eIF6) is an essential nuclear matrix protein involved in 60S ribosomal subunit assembly. J. Cell Biol. 144, 823–838. 177. Sartorius-Neef, S., and Pfeifer, F. (2004). In vivo studies on putative Shine-Dalgarno sequences of the halophilic archaeon Halobacterium salinarum. Mol. Microbiol. 51, 579–588. 178. Satpati, P., and Simonson, T. (2012). Conformational selection by the aIF2 GTPase: a molecular dynamics study of functional pathways. Biochemistry 51, 353–361. 179. Schmitt, E., Blanquet, S., and Mechulam, Y. (2002). The large subunit of initiation factor aIF2 is a close structural homologue of elongation factors. EMBO J. 21, 1821–1832. 180. Schmitt, E., Panvert, M., Lazennec-Schurdevin, C., Coureux, P.-D., Perez, J., Thompson, A., and Mechulam, Y. (2012). Structure of the ternary initiation complex aIF2-GDPNPmethionylated initiator tRNA. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 450–454. 181. Schreier, M.H., and Staehelin, T. (1973). Initiation of eukaryotic protein synthesis: (MettRNAf-40S ribosome) initiation complex catalysed by purified initiation factors in the absence of mRNA. Nat. New Biol. 242, 35–38. 182. Senger, B., Lafontaine, D.L.J., Graindorge, J., Gadal, O., Camasses, A., Sanni, A., Garnier, J.-M., Breitenbach, M., Hurt, E., and Fasiolo, F. (2001). The nucle(ol)ar Tif6p and Efl1p are required for a late cytoplasmic step of ribosome synthesis. Mol. Cell 8, 1363–1373. 183. Sette, M., Tilborg, P. Van, Spurio, R., Kaptein, R., Paci, M., Gualerzi, C.O., and Boelens, R. (1997). The structure of the translational initiation factor IF1 from E. coli contains an oligomer-binding motif. EMBO J. 16, 1436–1443. 184. Sharifulin, D., Babaylova, E., Kossinova, O., Bartuli, Y., Graifer, D., and Karpova, G. (2013). Ribosomal protein S5e is implicated in translation initiation through its interaction with the N-terminal domain of initiation factor eIF2α. Chembiochem 14, 2136–2143. 185. Shatsky, I.N., Dmitriev, S.E., Terenin, I.M., and Andreev, D.E. (2010). Cap- and IRESindependent scanning mechanism of translation initiation as an alternative to the concept of cellular IRESs. Mol. Cells 30, 285–293. 186. Shatsky, I.N., Dmitriev, S.E., Andreev, D.E., and Terenin, I.M. (2014). Transcriptomewide studies uncover the diversity of modes of mRNA recruitment to eukaryotic ribosomes. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 49, 164–177. 130 187. Shin, B.-S., Kim, J.-R., Walker, S.E., Dong, J., Lorsch, J.R., and Dever, T.E. (2011a). Initiation factor eIF2γ promotes eIF2-GTP-Met-tRNAi(Met) ternary complex binding to the 40S ribosome. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 1227–1234. 188. Shin, B.-S., Acker, M.G., Kim, J.-R., Maher, K.N., Arefin, S.M., Lorsch, J.R., and Dever, T.E. (2011b). Structural integrity of α-helix H12 in translation initiation factor eIF5B is critical for 80S complex stability. RNA 17, 687–696. 189. Shine, J., and Dalgarno, L. (1974). The 3’-terminal sequence of Escherichia coli 16S ribosomal RNA: complementarity to nonsense triplets and ribosome binding sites. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 71, 1342–1346. 190. Si, K., and Maitra, U. (1999). The Saccharomyces cerevisiae homologue of mammalian translation initiation factor 6 does not function as a translation initiation factor. Mol. Cell. Biol. 19, 1416–1426. 191. Simonetti, A., Marzi, S., Myasnikov, A.G., Fabbretti, A., Yusupov, M., Gualerzi, C.O., and Klaholz, B.P. (2008). Structure of the 30S translation initiation complex. Nature 455, 416–420. 192. Simonetti, A., Marzi, S., Billas, I.M.L., Tsai, A., Fabbretti, A., Myasnikov, A.G., Roblin, P., Vaiana, A.C., Hazemann, I., Eiler, D., et al. (2013a). Involvement of protein IF2 N domain in ribosomal subunit joining revealed from architecture and function of the full-length initiation factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 15656–15661. 193. Simonetti, A., Marzi, S., Fabbretti, A., Hazemann, I., Jenner, L., Urzhumtsev, A., Gualerzi, C.O., and Klaholz, B.P. (2013b). Structure of the protein core of translation initiation factor 2 in apo, GTP-bound and GDP-bound forms. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 69, 925– 933. 194. Simonson, T., and Satpati, P. (2012). Nucleotide recognition by the initiation factor aIF5B: free energy simulations of a neoclassical GTPase. Proteins 80, 2742–2757. 195. Singh, C.R., He, H., Ii, M., Yamamoto, Y., and Asano, K. (2004). Efficient incorporation of eukaryotic initiation factor 1 into the multifactor complex is critical for formation of functional ribosomal preinitiation complexes in vivo. J. Biol. Chem. 279, 31910–31920. 196. Slupska, M.M., King, A.G., Fitz-Gibbon, S., Besemer, J., Borodovsky, M., and Miller, J.H. (2001). Leaderless transcripts of the crenarchaeal hyperthermophile Pyrobaculum aerophilum. J. Mol. Biol. 309, 347–360. 197. Sokabe, M., Yao, M., Sakai, N., Toya, S., and Tanaka, I. (2006). Structure of archaeal translational initiation factor 2βγ-GDP reveals significant conformational change of the βsubunit and switch 1 region. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 13016–13021. 198. Spurio, R., Brandi, L., Caserta, E., Pon, C.L., Gualerzi, C.O., Misselwitz, R., Krafft, C., Welfle, K., and Welfle, H. (2000). The C-terminal subdomain (IF2 C-2) contains the entire fMettRNA binding site of initiation factor IF2. J. Biol. Chem. 275, 2447–2454. 199. Steffensen, S.A., Poulsen, A.B., Mortensen, K.K., and Sperling-Petersen, H.U. (1997). E. coli translation initiation factor IF2 – an extremely conserved protein. Comparative sequence analysis of the infB gene in clinical isolates of E. coli. FEBS Lett. 419, 281–284. 200. Stolboushkina, E.A., and Garber, M.B. (2011). Eukaryotic type translation initiation factor 2: Structure–functional aspects. Biochem. 76, 283–294. 131 201. Stolboushkina, E., Nikonov, S., Nikulin, A., Bläsi, U., Manstein, D.J., Fedorov, R., Garber, M., and Nikonov, O. (2008). Crystal structure of the intact archaeal translation initiation factor 2 demonstrates very high conformational flexibility in the alpha- and beta-subunits. J. Mol. Biol. 382, 680–691. 202. Stolboushkina, E., Nikonov, S., Zelinskaya, N., Arkhipova, V., Nikulin, A., Garber, M., and Nikonov, O. (2013). Crystal structure of the archaeal translation initiation factor 2 in complex with a GTP analogue and Met-tRNAf(Met.). J. Mol. Biol. 425, 989–998. 203. Studier, F.W., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J., and Dubendorff, J.W. (1990). Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. J. Methods Enzimol 185, 60–89. 204. Sundari, R.M., Stringer, E.A., Schulman, L.H., and Maitra, U. (1976). Interaction of bacterial initiation factor 2 with initiator tRNA. J. Biol. Chem. 251, 3338–3345. 205. Sussman, J.K., Simons, E.L., and Simons, R.W. (1996). Escherichia coli translation initiation factor 3 discriminates the initiation codon in vivo. Mol. Microbiol. 21, 347–360. 206. Tahara, M., Ohsawa, A., Saito, S., and Kimura, M. (2004). In vitro phosphorylation of initiation factor 2 alpha (aIF2 alpha) from hyperthermophilic archaeon Pyrococcus horikoshii OT3. J. Biochem. 135, 479–485. 207. La Teana, A., Benelli, D., Londei, P., and Bläsi, U. (2013). Translation initiation in the crenarchaeon Sulfolobus solfataricus: eukaryotic features but bacterial route. Biochem. Soc. Trans. 41, 350–355. 208. Terenin, I.M., Dmitriev, S.E., Andreev, D.E., and Shatsky, I.N. (2008). Eukaryotic translation initiation machinery can operate in a bacterial-like mode without eIF2. Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 836–841. 209. Thakor, N., and Holcik, M. (2012). IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2α-independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40, 541–552. 210. Thompson, G.M., Pacheco, E., Melo, E.O., and Castilho, B.A. (2000). Conserved sequences in the beta subunit of archaeal and eukaryal translation initiation factor 2 (eIF2), absent from eIF5, mediate interaction with eIF2gamma. J. Biochem. 347, 703–709. 211. Tishchenko, S., Nikonova, E., Nikulin, A., Nevskaya, N., Volchkov, S., Piendl, W., Garber, M., and Nikonov, S. (2006). Structure of the ribosomal protein L1-mRNA complex at 2.1 Å resolution: common features of crystal packing of L1-RNA complexes. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 62, 1545–1554. 212. Tolstrup, N., Sensen, C.W., Garrett, R.A., and Clausen, I.G. (2000). Two different and highly organized mechanisms of translation initiation in the archaeon Sulfolobus solfataricus. Extremophiles 4, 175–179. 213. Udagawa, T., Shimizu, Y., and Ueda, T. (2004). Evidence for the translation initiation of leaderless mRNAs by the intact 70 S ribosome without its dissociation into subunits in eubacteria. J. Biol. Chem. 279, 8539–8546. 214. Unbehaun, A., Marintchev, A., Lomakin, I.B., Didenko, T., Wagner, G., Hellen, C.U.T., and Pestova, T. V (2007). Position of eukaryotic initiation factor eIF5B on the 80S ribosome mapped by directed hydroxyl radical probing. EMBO J. 26, 3109–3123. 132 215. Valenzuela, D.M., Chaudhuri, A., and Maitra, U. (1982). Eukaryotic ribosomal subunit anti-association activity of calf liver is contained in a single polypeptide chain protein of Mr = 25,500 (eukaryotic initiation factor 6). J. Biol. Chem. 257, 7712–7719. 216. Vasile, F., Pechkova, E., and Nicolini, C. (2007). Solution structure of the beta-subunit of the translation initiation factor aIF2 from archaebacteria Sulfolobus solfataricus. Proteins 70, 1112–1115. 217. Vitagliano, L., Masullo, M., Sica, F., Zagari, A., and Bocchini, V. (2001). The crystal structure of Sulfolobus solfataricus elongation factor 1α in complex with GDP reveals novel features in nucleotide binding and exchange. EMBO J. 20, 5305–5311. 218. Wagner, T., Gross, M., and Sigler, P.B. (1984). Isoleucyl initiator tRNA does not initiate eucaryotic protein synthesis. J. Biol. Chem. 259, 4706–4709. 219. Walton, G.M., and Gill, G.N. (1975). Nucleotide regulation of a eukaryotic protein synthesis initiation complex. Biochim. Biophys. Acta 390, 231–245. 220. Weisser, M., Voigts-Hoffmann, F., Rabl, J., Leibundgut, M., and Ban, N. (2013). The crystal structure of the eukaryotic 40S ribosomal subunit in complex with eIF1 and eIF1A. Nat. Struct. Mol. Biol. 20, 1015–1017. 221. Wells, S.E., Hillner, P.E., Vale, R.D., and Sachs, A.B. (1998). Circularization of mRNA by eukaryotic translation initiation factors. Mol. Cell 2, 135–140. 222. Westermann, P., Nygard, O., and Bielka, H. (1980). The alpha and gamma subunits of initiation factor eIF-2 can be cross-linked to 18S ribosomal RNA within the quaternary initiation complex, eIF-2-Met-tRNAf-GDPCP-small ribosomal subunit. Nucleic Acids Res. 8, 3065–3071. 223. White, B.N., and Bayley, S.T. (1972). Methionine transfer RNAs from the extreme halophile, Halobacterium cutirubrum. Biochim. Biophys. Acta 272, 583–587. 224. Wienk, H., Tomaselli, S., Bernard, C., Spurio, R., Picone, D., Gualerzi, C.O., and Boelens, R. (2005). Solution structure of the C1-subdomain of Bacillus stearothermophilus translation initiation factor IF2. Protein Sci. 14, 2461–2468. 225. Wienk, H., Tishchenko, E., Belardinelli, R., Tomaselli, S., Dongre, R., Spurio, R., Folkers, G.E., Gualerzi, C.O., and Boelens, R. (2012). Structural dynamics of bacterial translation initiation factor IF2. J. Biol. Chem. 287, 10922–10932. 226. Wilson, S.A., Sieiro-Vazquez, C., Edwards, N.J., Iourin, O., Byles, E.D., Kotsopoulou, E., Adamson, C.S., Kingsman, S.M., Kingsman, A.J., and Martin-Rendon, E. (1999). Cloning and characterization of hIF2, a human homologue of bacterial translation initiation factor 2, and its interaction with HIV-1 matrix. Biochem. J. 342, 97–103. 227. Woese, C.R., and Fox, G.E. (1977). Phylogenetic structure of the prokaryotic domain : The primary kingdoms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5088–5090. 228. Wurtzel, O., Sapra, R., Chen, F., Zhu, Y., Simmons, B.A., and Sorek, R. (2010). A singlebase resolution map of an archaeal transcriptome. Genome Res. 20, 133–141. 229. Yamamoto, H., Unbehaun, A., Loerke, J., Behrmann, E., Collier, M., Bürger, J., Mielke, T., and Spahn, C.M.T. (2014). Structure of the mammalian 80S initiation complex with initiation factor 5B on HCV-IRES RNA. Nat. Struct. Mol. Biol. 21, 721–727. 133 230. Yatime, L., Schmitt, E., Blanquet, S., and Mechulam, Y. (2004). Functional molecular mapping of archaeal translation initiation factor 2. J. Biol. Chem. 279, 15984–15993. 231. Yatime, L., Schmitt, E., Blanquet, S., and Mechulam, Y. (2005). Structure-function relationships of the intact aIF2α subunit from the archaeon Pyrococcus abyssi. Biochemistry 44, 8749–8756. 232. Yatime, L., Mechulam, Y., Blanquet, S., and Schmitt, E. (2006). Structural switch of the γ subunit in an archaeal aIF2 αγ heterodimer. Structure 14, 119–128. 233. Yatime, L., Mechulam, Y., Blanquet, S., and Schmitt, E. (2007). Structure of an archaeal heterotrimeric initiation factor 2 reveals a nucleotide state between the GTP and the GDP states. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18445–18450. 234. Yoon, H., and Donahue, T.F. (1992). The sui1 suppressor locus in Saccharomyces cerevisiae encodes a translation factor that functions during tRNAiMet recognition of the start codon. Mol. Cell. Biol. 12, 248–260. 235. Zheng, A., Yu, J., Yamamoto, R., Ose, T., Tanaka, I., and Yao, M. (2014). X-ray structures of eIF5B and the eIF5B–eIF1A complex: the conformational flexibility of eIF5B is restricted on the ribosome by interaction with eIF1A. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 70, 3090– 3098. 236. Zubay, G. (1962). The isolation and fractionation of soluble ribonucleic acid. J. Mol. Biol. 4, 347–356. 134 БЛАГОДАРНОСТИ Выражаю искреннюю благодарность моему научному руководителю Марине Борисовне Гарбер за внимательное руководство, доброжелательность и поддержку при выполнении данной работы. Бесконечно благодарна своему наставнику Елене Столбоушкиной за то, что научила меня биохимическим методам, за помощь в планировании и проведении экспериментов, за терпение и ценные рекомендации. Особую благодарность хочу выразить Станиславу Владимировичу Никонову, Алексею Донатовичу Никулину, Олегу Никонову, Азату Габдулхакову и Олесе Кравченко, при участии которых была выполнена структурная часть работы. Очень признательна Сергею Александровичу Мошковскому и Сергею Евгеньевичу Пермякову за возможность проведения экспериментов на биосенсорах. Спасибо Анне Сычевой и Алексею Казакову за помощь в освоении метода SPR и ценные советы. Отдельно хочется поблагодарить зарубежных коллег: Удо Блэзи (Венский биоцентр, Австрия) и Уве Мюллера (Центр Гельмгольца, Берлин, Германия) за предоставленную возможность освоить новые методы и гостеприимность. Благодарю весь коллектив лаборатории структурных исследований аппарата трансляции и группы структурных исследований рибосомных белков за дружную атмосферу, способствовавшую выполнению данной работы, за ценные дискуссии и полезные замечания. Хочу выразить безмерную благодарность своим родителям, сестре и мужу за вдохновение, любовь и поддержку. 135
