Галкин Иван Ильич РОЛЬ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В РЕГУЛЯЦИИ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ОТВЕТА ЭНДОТЕЛИЯ
advertisement
На правах рукописи Галкин Иван Ильич РОЛЬ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В РЕГУЛЯЦИИ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ОТВЕТА ЭНДОТЕЛИЯ 03.03.04. – клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2015 Работа выполнена в НИИ физико-химической биологии МГУ имени М. В. Ломоносова Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, директор НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ, академик Владимир Петрович Скулачёв Оппонент: Пинелис Всеволод Григорьевич, д. м. н., профессор, главный научный сотрудник лаборатории нейробиологии и фундаментальных основ развития мозга ФГБУ «Научный центр здоровья детей» Министерства здравоохранения РФ. Оппонент: Александрова Антонина Юрьевна, д. б. н., ведущий научный сотрудник лаборатории механизмов канцерогенеза ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина» Министерства здравоохранения РФ. Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта Российской академии наук. Защита состоится 15 декабря 2015 года в 17.00 на заседании диссертационного совета Д. 501.001.52 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские горы, 1, корп. 12, биологический факультет МГУ, в аудитории М-1 С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и на сайте биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова: http://www.bio.msu.ru/dissertations/view.php?ID=707 Автореферат разослан « » _________ 2015 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Калистратова Е. Н. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ Одной из основных причин развития возрастных сердечно-сосудистых заболеваний является возрастание содержания в крови циркулирующих провоспалительных цитокинов (таких как фактор некроза опухоли (ФНО)), что приводит к хронической активации и повреждению сосудистого эндотелия. Показано, что в передаче и модуляции сигналов от воспалительных цитокинов участвуют активные формы кислорода (АФК) (Flohe, 1997; Kaltschmidt, 1999). Роль АФК в развитии сердечно-сосудистых заболеваний подтверждается большим количеством исследований, (Ozkanlar, 2012; Sugamura, 2011). Однако смертность от сердечно-сосудистых заболеваний не снижалась даже при долговременном приёме традиционных антиоксидантов (Kris-Etherton, 2004; Nunez-Cordoba, 2011). Возможно, данные соединения не достигают тех источников АФК, которые непосредственно участвуют в регуляции воспалительного ответа. Перспективной мишенью для терапевтического действия новых фармакологических препаратов представляются митохондрии эндотелиальных клеток (Rocha, 2010). Митохондрии являются одним из основных источников АФК в клетке, и их важность в воспалительном ответе клеток становится все более очевидной в последнее время (Davidson, 2007). В данной работе, используя митохондриально-направленные соединения на основе проникающих катионов и пластохинона, были получены данные, которые однозначно свидетельствуют о ключевой роли митохондрий эндотелиальных клеток в развитии возрастных изменений сосудов. Полученные результаты значительно расширят наше представление о регуляторной роли митохондрий, а также послужат хорошим фундаментом для разработки фармакологических препаратов для профилактики и терапии сердечно-сосудистых заболеваний. СТЕПЕНЬ ПРОРАБОТАННОСТИ ПРОБЛЕМЫ Митохондрии являются не единственным источником АФК в клетках. Однозначное определение генераторов АФК, участвующих в том или ином сигнальном каскаде крайне затруднено из-за проблем методического характера. Митохондриально-направленные антиоксиданты на основе проникающих катионов хорошо зарекомендовали себя как инструменты для изучения 3 сигнальных свойств митохондрий (Skulachev, 2013). Эти соединения также оказались чрезвычайно эффективны при лечении модельных заболеваний, сопровождающихся воспалением у животных (Демьяненко, 2010; Isaev, 2012; Silachev, 2012; Plotnikov, что 2010), указывает на важную роль митохондриальных АФК в регуляции воспаления. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Целью данной работы было исследование роли митохондриальных активных форм кислорода в процессах воспалительной активации клеток эндотелия и развитии провоспалительных возрастных изменений сосудов. Были поставлены следующие задачи: 1. Определить влияние митохондриально-направленных антиоксидантов на ряд возрастных провоспалительных изменений в сосудах мышей F1(CBAxC57Bl/6): уровень про-воспалительных цитокинов IL-6 и ФНО в крови, а также уровень экспрессии регуляторов адгезии лейкоцитов (ICAM1, VCAM1, ФНО, MCP-1) в аортах. 2. Исследовать механизмы действия митохондриально-направленных антиоксидантов на процесс воспалительной активации клеток эндотелия, индуцированный ФНО. 3. Изучить действие митохондриально-направленных антиоксидантов на апоптоз клеток эндотелия, вызванный высокими концентрациями ФНО. НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ Впервые было показано, что митохондриальные активные формы кислорода эндотелиальных клеток являются ключевыми элементами в развитии провоспалительных изменений аорт при старении. Было показано, что генерация АФК митохондриями под действием ФНО усиливает активацию NFκB, что приводит к чрезмерному воспалительному ответу эндотелиальных клеток на этот цитокин. Было показано, что индуцированный ФНО апоптоз эндотелиальных клеток в значительной степени зависит от митохондриальных АФК. 4 ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ Полученные в работе данные однозначно показывают, что митохондрии эндотелиальных клеток являются одними из основных регуляторов возрастных изменений сосудов. Некоторые механизмы этой регуляции нам удалось выяснить на культурах эндотелиальных клеток: (1) было показано, что митохондриальные АФК поддерживают воспалительный ответ эндотелия на ФНО за счет усиления активации NFκB, и что (2) митохондриальные АФК участвуют в передаче сигнала апоптоза от ФНО. Очевидно, что эти исследования необходимо продолжить для дальнейшего уточнения и расширения наших представлений о роли митохондрий сосудистого эндотелия в регуляции воспалительного ответа при норме, при патологиях и при старении. Полученные нами данные указывают на перспективность использования митохондриально-направленных соединений семейства SkQ, точечно воздействующих на митохондрии, для профилактики и лечения сосудистых заболеваний, и заболеваний, протекающих на фоне хронического воспаления, в том числе у пожилых людей. ЛИЧНОЕ УЧАСТИЕ АВТОРА Личное участие автора состояло в анализе литературных данных, разработке экспериментальной части, получении результатов и их обработке. Выводы сделаны на основе оригинальных данных автора. СТЕПЕНЬ ДОСТОВЕРНОСТИ РЕЗУЛЬТАТОВ И АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Достоверность результатов, полученных диссертантом, подтверждается большим объёмом воспроизводимых результатов, а также статистической обработкой всех ключевых данных. Основные результаты и положения диссертации были представлены и обсуждены на 7ой национальной научнопрактической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека». (Смоленск, 2011), Первой Всероссийской транспорт, цитоскелет» конференции «Внутриклеточная (Санкт-Петербург, 2011), 20й сигнализация, Международной конференции ECDO «From Death to Eternity» (Рим, 2012), 38й конференции FEBS (Санкт-Петербург, 2013). 5 ПУБЛИКАЦИИ По результатам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих перечню ВАК РФ – 6, тезисов докладов и материалов конференций – 5. СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложений. Текст диссертации изложен на 152 страницах, содержит 37 рисунков и 3 таблицы. Список литературы состоит из 356 цитируемых источников, из которых – 4 на русском, 352 – на иностранном языке. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и реагенты SkQ1 (10-(6’-пластохинолил) децилтрифенилфосфоний), SkQR1 (10-(6’-пластохинолил) децилродамин 19), додецилтрифенилфосфоний (C12TPP) и додецилродамин 19 (C12R1), синтезированы в НИИ ФХБ им. А. Н. Белозерского. Рекомбинантный человеческий фактор некроза опухоли (ФНО) любезно предоставлен Л. Н. Шингаровой, ИБХ РАН, Москва. Все прочие использованные в работе реагенты (если не указано иное) произведены фирмой Sigma, США. Животные 16-месячные мыши F1(CBAxC57Bl/6) были разделены на 2 группы: (1) получали SkQ1 с питьевой водой (суточная доза 100 нмоль/кг массы тела) (10 мышей); (2) не получали SkQ (12 мышей). Еще одна контрольная группа (12 мышей) состояла из молодых (6 месяцев на момент завершения эксперимента) мышей F1(CBAxC57Bl/6), не получавших SkQ1. Через 8 месяцев животных забивали и забирали сыворотку крови и аорты. Клетки. Использовались клетки линий EA.hy926, ECV304, HUVEC, HL-60. Культивировали стандартным способом (Zinovkin, 2014). Для экспериментов к клеткам добавляли антиоксиданты в концентрациях, указанных в подписях к рисункам и инкубировали 3 дня. Затем культуральную среду меняли на свежую, содержащую 0,2% эмбриональной телячьей сыворотки, и через 12-18 часов 6 добавляли ФНО (концентрации и время воздействия ФНО указаны в подписях к рисункам). Флуоресцентная микроскопия Образцы готовили стандартным способом (Zinovkin, 2014). Использовали антитела против фактора фон Виллебранда (eBioscience), VE-кадгерина (eBioscience) или p65 (Cell Signalling), и антиидиотипические антитела, меченные Oregon Green 488 (Invitrogen) или Texas Red (Molecular Probes). Для выявления ядер использовали Hoechst 33342. Образцы анализировали на флуоресцентном микроскопе Axiovert 200M (Carl Zeiss). Определение уровней экспрессии целевых генов. РНК из аорт мышей и клеточных образцов выделяли с помощью набора фирмы QIAGEN в соответствии с протоколом производителей. Обратная транскрипция проводилась с помощью набора фирмы Invitrogen в соответствии с протоколом производителей. Концентрации мРНК определяли методом ПЦР в реальном времени, как описано ранее (Zinovkin, 2014). Последовательности для праймеров представлены в тексте диссертации и в публикации (Zinovkin, 2014). Твёрдофазный иммуноферментный анализ. Концентрацию ФНО, IL-6 и IL-8 в сыворотках крови и в культуральных средах измеряли методом ELISA с помощью наборов (eBioscience) в соответствии с протоколом производителей Цитотоксическое действие ФНО определяли по восстановлению MTT (3(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромида) до МТТ- формазана, как описано ранее (Галкин, 2014). Количество клеток со сниженным содержанием ДНК оценивали по накоплению йодистого пропидия (Галкин, 2014), используя проточный цитофлуориметр Beckman Coulter FC500. Анализ адгезии лимфоцитов к монослою эндотелиальных клеток. Лимфоциты HL-60 метили флуоресцентным красителем BCECF-AM (Invitrogen) и инкубировали вместе с эндотелиальными клетками. Число прикрепившихся HL-60 подсчитывали на изображениях, полученных с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 200M (Carl Zeiss). Оценка экспрессии ICAM1 на поверхности клеток. Клетки фиксировали 2% параформальдегидом, инкубировали с антителами против ICAM1 (eBioscience), затем с антиидиотипическими антителами, коньюгированными с 7 пероксидазой хрена, и проводили пероксидазную реакцию. Оптическую плотность раствора измеряли, используя планшетный колориметр Thermo Labsystems Multiscan EX при длине волны 492 нМ. Вестерн блот проводили стандартным способом (Zinovkin, 2014), используя антитела против p65, p-p65, IκBα, p-IκBα, ERK1/2, p-ERK1/2, p-38, p-p38, JNK, pJNK (Cell Signalling). Белки ядер выделяли, как описано ранее (Zinovkin, 2014). Статистическую обработку результатов проводили в программе Statistica 6.0. Данные представлены в виде средних значений ±стандартная ошибка среднего (SE). Статистическую значимость определяли, используя t-тест Стьюдента для малых выборок. Значимыми считали различия при p<0,05. N указано в подписях к рисункам. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Митохондриально-направленный антиоксидант SkQ1 подавляет возрастное повышение экспрессии мРНК провоспалительных генов в аортах у мышей линии C57Black/CBA Используя полномасштабный анализ экспрессии генов методом микрочипа, мы обнаружили, что длительный прием SkQ1 вызывает значимые изменения в экспрессии некоторых групп генов, связанных с регуляцией межклеточной адгезии, межклеточных контактов и проницаемости эндотелия в сердцах и аортах 14 месячных мышей линии Balb/C (результаты представлены в рукописи диссертации). Для подтверждения этих данных и проверки возможного противовоспалительного действия SkQ1 на сосуды мы использовали более старых (24 месячных) мышей гибридов C57Black/CBA. В тканях аорт этих животных мы оценили экспрессию некоторых провоспалительных генов: молекул адгезии ICAM1 и VCAM1, цитокина ФНО, хемоаттрактанта MCP-1 (CCL-2). В соответствии с литературными данными (Merat, 2000; Chung, 2006) уровни экспрессии этих генов у старых мышей повышались по сравнению с уровнями экспрессии у молодых животных. SkQ1 в разной степени подавлял экспрессию этих генов. Наиболее выраженным был эффект SkQ1 на экспрессию ICAM1, которая под его действием статистически значимо снижалась до уровня контроля (рис. 1А). Экспрессия VCAM1 (рис. 1Б), ФНО (рис. 1В) и MCP-1 (рис. 1Г) так же демонстрировала тенденцию к снижению под действием SkQ1. 8 Рисунок 1. Влияние SkQ1 на уровни экспрессии маркеров воспаления в аортах мышей (А-Г) и содержание провоспалительных цитокинов в крови мышей (Д-Е). N=10, ** p < 0,01 ФНО – один из основных индукторов провоспалительного сдвига экспрессии генов в сосудах старых животных (Chung, 2009; Donato, 2009). Количество провоспалительных цитокинов ФНО и IL-6 в крови повышается при старении (Belmin, 1995; Rice, 2006). Антиоксиданты способны подавлять генерацию ФНО клетками иммунной системы в условиях острого воспаления (De la Fuente, 2001), однако в нашей модели старения мышей, для которой характерно постоянное, но значительно менее выраженное по сравнению с сепсисом повышение уровня воспалительных цитокинов в крови, приём SkQ1 не повлиял на количество ФНО и IL-6 в крови (рис. 1 Д, Е). Наши данные позволяют предположить, что при старении SkQ1 не влияет на общую генерацию воспалительных цитокинов, но подавляет их воспалительное действие на клетки-мишени в тканях аорт. В ответ на ФНО многие клетки начинают экспрессировать молекулы адгезии, воспалительные цитокины и хемокины (Tomita, 2001), но основной мишенью ФНО в сосудах являются 9 эндотелиальные клетки, воспалительная активация которых необходима для обеспечения миграции клеток иммунной системы и медиаторов воспаления в ткани. Мы использовали эндотелиальные клеточные линии для выяснения митоАФК-зависимых механизмов активации и повреждения эндотелиальных клеток под действием ФНО. Влияние митохондриально-направленных антиоксидантов на ФНО- зависимые активацию и гибель эндотелиальных клеток Выбор клеточной модели Рисунок 2. Выявление фактора фон Виллебранда (А-Б) и VE-кадгерина (В-Г) в клетках линий EA.hy926 и ECV304. Масштаб 15 мкм. Для исследований механизмов воспалительного ответа эндотелия наряду с первичными культурами часто используют клеточные линии эндотелия ECV304 (Takahashi, 1990; Suda, 2001) и EA.hy926 (Edgell, 1983; Le Tonqueze, 1996). Для выбора клеточной модели для дальнейшей работы мы оценили в этих клетках: 1) экспрессию маркеров эндотелиальных клеток, VE-кадгерина и фактора Виллебранда; 2) способность в ответ на ФНО экспрессировать молекулы адгезии и гибнуть. Было показано, что клетки обеих линий экспрессируют фактор Виллебранда (рис 2А, 2Б). VE-кадгерин детектировался в области межклеточных контактов клеток EA.hy926 (рис. 2В), в то время как клетки ECV304 (рис. 2Г) утратили способность к его экспрессии. 10 Рисунок 3. Влияние фактора некроза опухоли на активацию клеток EA.hy926 (А, В, Д) и ECV304 (Б, Г, Д). Визуализация ядер клеток культур EA.hy926 и ECV304 с помощью Hoechst 33342: А, Б – контроль, В, Г – ФНО (50 нг/мл, 24 часа). Масштаб – 30 мкм. (Д) ФНО (4 ч) стимулирует экспрессию мРНК ICAM1 в клетках культур EA.hy926 и ECV304. Клетки ECV304, в отличие от клеток EA.hy926, оказались устойчивы к токсическому действию высоких концентраций ФНО (рис. 3А-Г). В обеих клеточных линиях в ответ на ФНО повышался уровень экспрессии ICAM1, однако ответ клеток EA.hy926 был выражен значительно сильнее (рис. 3 Д), кроме того, базовый уровень экспрессии ICAM1 в этих клетках был значительно ниже, чем в ECV304. Отсутствие в клетках ECV304 VE-кадгерина и их пониженная чувствительность к ФНО может быть связана с тем, что, как было позднее обнаружено, эта культура состоит не только из спонтанно дифференцировавшиеся клеток сосудистого эндотелия, но и клеток иного происхождения – карциномы эпителия мочевого пузыря T24 (Lacroix, 2008). Для дальнейших исследований мы выбрали клеточную линию EA.hy926. 11 Митохондриально-направленные антиоксиданты предотвращают развитие ФНО-зависимого апоптоза в клетках линии EA.hy926 ФНО в высоких концентрациях (5-50 нг/мл) вызывал заметный токсический эффект, который достигал максимума (35-45% гибели) при концентрации цитокина выше 5нг/мл (Рис. 4А). Наблюдающаяся при этом гибель клеток имела морфологические признаки апоптоза: мембранный блеббинг (не показано), конденсация и фрагментация хроматина (рис. 3В). Оценка количества апоптотических клеток методом проточной цитофлуориметрии по количеству частиц, образующих пик subG1, выявила увеличение апоптотических клеток под действием ФНО с 7 до 40%. Ингибитор каспаз zVAD-FMK полностью блокировал появление пика subG1 (рис. 5Б). Рисунок 4. Влияние SkQR1 (4 дня) на токсическое действие ФНО (48 часов). Процент живых клеток определяли с помощью МТТ-теста. (А) Зависимость количества живых клеток от концентрации ФНО; * p < 0,05; *** p < 0,0002 по сравнению с контролем при соответствующей концентрации ФНО; (Б) Зависимость количества живых клеток от концентрации SkQR1 или C12R1; * p < 0,05; *** p < 0,0002 по сравнению с контролем при соответствующей концентрации ФНО. Поставлено не менее 8 опытов Предварительная инкубация с SkQR1 частично подавляла цитотоксический эффект ФНО (рис. 4), причём наибольшая эффективность наблюдалась при концентрации 0,2 нМ. Аналогичный эффект оказывала предынкубация с SkQ1 (не показано). Предынкубация с SkQR1 приводила также к снижению числа апоптотических клеток (рис. 5). При этом фрагменты SkQR1 (C12R1) (рис. 4Б, 5Б) и SkQ1 (C12TPP, не показано), лишённые антиоксидантного остатка пластохинона, не предотвращали ФНО-зависимый апоптоз. Классические антиоксиданты NAC (5 мМ, 2 часа) и Trolox (200 мкМ, 2 часа) так же предотвращали вызванную ФНО клеточную гибель (рис. 4А). 12 Рисунок 5. SkQR1 (20 нм, 4 дня) подавляет апоптоз, вызванный ФНО (10нг/мл, 48 часов). Процент апоптотических клеток определяли цитофлуориметрически по количеству частиц со сниженным содержанием ДНК (пик subG1). C12R1 (20 нМ) добавляли аналогично SkQR1, а zVADfmk (50 мкМ) – за 15 мин до добавки ФНО. (А) Цитофлуориметрический анализ клеточного цикла, результаты типичного эксперимента; (Б) Статистический анализ результатов, полученных в 9 (для SkQR1) и 7 (для C12R1) опытах. *** p < 0,0001 по сравнению с ФНО. Путь индукции апоптоза под действием ФНО начинается с активации каспазы-8 в комплексе с рецептором ФНО и адапторными белками (Martin, 1998). Активация происходит благодаря аутокаталитическому протеолизу каспазы-8. Расщепление каспазы-8 выявляется в клетках EA.hy926 через 8 часов после добавки ФНО и не меняется под действием SkQR1 (Рис. 6А, Б). Антиоксиданты также не ингибируют следующий этап, связанный с расщеплением и активацией белка Bid под действием каспазы-8 (Рис. 6А, Б). В дальнейшем активированный Bid связывается с митохондриями и инициирует выход проапоптозных белков и, прежде всего цитохрома с, из межмембранного пространства (Luo, 1998). Из данных, приведенных на рис. 6В, видно, что SkQR1 ингибирует вызванное ФНО появление цитохрома с в цитоплазме. SkQR1 также ингибирует события, происходящие после выхода цитохрома с из митохондрий: расщепление каспазы-3 и PARP (Рис. 6А, Б). 13 Рисунок 6. SkQR1 (20 нМ, 4 дня) предотвращает индуцированные ФНО (50 нг/мл, 8 часов) выход в цитоплазму цитохрома с и расщепление каспазы 3 и PARP, но не влияет на расщепление каспазы 8 и Bid. (А) Выявление продуктов протеолиза проапоптотических белков и PARP в тотальных лизатах. (Б) Результаты денситометрического анализа вестерн блотов, * p < 0,05; ** p < 0,002. (В) Выявление цитохрома с в цитоплазматической фракции. В качестве контроля нагрузки измерялось количество тубулина. Представлены результаты типичного эксперимента. Эти данные позволяют предположить, что действие митохондриальнонаправленных антиоксидантов направлено на компоненты митохондрий, ответственные за выход про-апоптозных белков в цитоплазму. Одной из наиболее вероятных мишеней антиоксидантного действия SkQ является основной липид митохондрий – кардиолипин. Было показано, что окисление этого липида необходимо для открепления про-апоптотического белка цитохрома с от внутренней мембраны митохондрий, которое предшествует его выходу из межмембранного пространства митохондрий и инициации сборки апоптосомы (Tuominen, 2002). На выделенных митохондриях было показано, что SkQ1 предотвращает окисление кардиолипина в условиях окислительного стресса (Skulachev, 2009; Skulachev, 2010). 14 Митохондриально-направленные антиоксиданты подавляют вызванную ФНО активацию эндотелия Рисунок 7. SkQ1 (0,2 нМ) подавляет вызванную ФНО (50 пг/мл, 4 часа) экспрессию ICAM1, Еселектина и VCAM1 в клетках HUVEC. N=4, * p < 0,05 Рисунок 8. Влияние предынкубации с SkQ1 на базовый (А) и стимулированный ФНО (50 пг/мл, 4 часа) (Б) уровни экспрессии мРНК ICAM1. N=13, ** p < 0,01, *** p < 0,001 В концентрации 50пг/мл ФНО не оказывал токсическое действие на эндотелиальные клетки, и в то же время вызывал значительное (10-кратное) возрастание экспрессии ICAM1 как в клетках EAhy926, так и в клетках первичной культуры эндотелия пупочной вены человека (HUVEC) (рис. 7, 8). В клетках HUVEC ФНО также вызывал возрастание экспрессии E-селектина и VCAM1 (рис. 7). SkQ1 (0,2 нМ) подавлял вызванную ФНО экспрессию мРНК ICAM1, E-селектина и VCAM1 (рис. 7). На клетках EAhy926 было показано, что эффект SkQ1 зависел от концентрации антиоксиданта, наиболее значительный эффект наблюдался при концентрации SkQ1 0,2 нМ. При концентрации ниже 0,2 15 нМ и выше 20 нМ эффект SkQ1 пропадал (рис. 8). Классические антиоксиданты NAC (5 мМ) и Trolox (200 мкМ) также подавляли действие ФНО, но в более высоких концентрациях (рис. 9). Рисунок 9. SkQ1 (0,2 нМ) и классические антиоксиданты NAC (5 мМ) и Trolox (200 мкМ) снижают как базовый, так и повышенный на фоне инкубации с ФНО (50 пг/мл, 4 часа), уровень экспрессии ICAM1. N=4, ** p < 0,01, *** p < 0,001 Для выполнения своих физиологических функций молекулы адгезии должны находиться на плазматической мембране клеток. Экспозиция ICAM1 на поверхности клеток зависит как от их синтеза, так и от рециклинга и протеолиза (Muro, 2003; Muro, 2005; Lawson, 2009) Мы показали, что ФНО (5нг/мл, 8 часов) вызывал заметное увеличение количества ICAM1 на поверхности клеток EA.hy926. SkQ1 подавлял действие ФНО (рис. 10). В эндотелиальных клетках ФНО стимулирует экспрессию провоспалительных цитокинов (ФНО, IL-6), усиливая свое действие, а также экспрессию хемокинов (MCP1, IL-8), привлекающих лейкоциты в очаг воспаления. В клетках EA.hy926 ФНО (5 нг/мл, 8 часов) стимулировал секрецию IL-6 и IL-8. SkQ1 (0,2нМ) и NAC (5мМ) ингибировали этот эффект ФНО (рис. 10). В эндотелиальных клетках основная функция ICAM1 – прикрепление лейкоцитов к поверхности эндотелия, что способствует их последующей трансмиграции в ткани (Marlin, 1987). Мы оценили способность клеток линии EA.hy926 связывать клетки-предшественники нейтрофилов линии HL-60 (рис. 11). Количество связавшихся нейтрофилов возрастала при активации клеток ФНО (5 нг/мл, 8 ч). Предынкубация клеток EA.hy926 с SkQ1 (0,2 нМ, 4 дня) снижала их способность связывать нейтрофилы при активации ФНО. 16 Рисунок 10. SkQ1 снижает содержание белка ICAM1 на поверхности клеток EA.hy926 после инкубации с ФНО (5 нг/мл, 8 ч) и снижает секрецию IL-6 и IL-8 клетками EA.hy926 после инкубации с ФНО (5 нг/мл, 15 ч). ** p < 0,01; *** p < 0,001 Рисунок 11. SkQ1 снижает уровень адгезии предшественников нейтрофилов HL-60 к монослою клеток EA.hy926. Адгезия HL-60 к монослою (А) – контрольных, (Б) стимулированных ФНО (5 нг/мл, 8 ч), (В) стимулированных ФНО после инкубации с SkQ1 (0,2 нМ, 4 дня) клеток EA.hy926. Масштаб - 15 мкм. (Г) Результаты подсчета количества прикрепившихся клеток, данные 4 независимых экспериментов, * p < 0,05. Таким образом, мы показали, что SkQ1 подавляет воспалительный ответ эндотелиальных клеток на ФНО: (1) экспрессию ICAM1, VCAM1 и Е-селектин; (2) секрецию IL-6 и IL-8 и (3) способность эндотелия связывать нейтрофилы. Более высокая эффективность митохондриально-направленного антиоксиданта по сравнению с классическими показывает важную роль митохондриальных АФК в индуцированной ФНО активации эндотелия Экспрессия молекул адгезии и интерлейкинов в эндотелиальных клетках в значительной степени регулируется NFκB (Kobuchi, 1999; Roebuck, 1999). 17 Стресс-киназы также могут стимулировать экспрессию ICAM1 за счет активации АР1. ФНО активирует как стресс-киназы (p38, JNK, ERK1/2), так и NFκB (Sabio, 2014; Ghosh , 2002). Для того чтобы определить молекулярные механизмы регуляции воспалительного ответа митохондриальными АФК, мы применили специфические ингибиторы NFκB (Bay 11-7082), p38 (SB203580) и JNK (SP600125). В соответствии с ранее опубликованными данными (Kobuchi,1999; Roebuck, 1999), в нашей системе экспрессия ICAM1 в значительной мере подавлялась ингибитором NFκB, в меньшей степени ингибитором p38; ингибитор JNK не подавлял экспрессию ICAM1. SkQ1 не влиял на степень ФНОзависимого фосфорилирования p38. Таким образом, было показано, что стресскиназы не участвуют в митохондриально-зависимом механизме регуляции экспрессии ICAM1 в нашей модели. Ключевой этап активации NFκB под действием ФНО – фосфорилирование ингибирующей субъединицы комплекса NFκB – IκBα. В нестимулированных клетках IκBα связывает транскрипционные факторы семейства NFκB, в частности, p65 (RelA), и удерживает их в цитоплазме (Hacker, 2006). Фосфорилирование IκBα, его последующие убиквитинилирование и протеасомная деградация приводит к высвобождению p65 и транслокации в ядро. SkQ1 заметно ингибировал вызванные ФНО фосфорилирование IκBα и уменьшение его количества в клетках (рис. 12А, 12В). Аналогичное действие оказывал классический антиоксидант NAC (рис. 12Б, 12В), что соответствовало ранее опубликованным данным (Paterson, 2003). Рисунок 12. SkQ1 и NAC подавляют вызванные ФНО фосфорилирование и деградацию IB. На панелях (А, Б) представлены результаты типичных экспериментов; (В) результаты денситометрического анализа пяти вестернблотов, ** p < 0,01. Кроме этого, SkQ1 подавлял вызванную ФНО транслокацию p65 в ядро (рис. 13). ФНО так же вызывает фосфорилирование p65, что предположительно 18 способствует усилению его транскрипционной активности (Vermeulen, 2002). SkQ1 не подавлял вызванное ФНО фосфорилирование p65 (рис. 12А, 12В). Таким образом, было показано, что митохондриальные АФК усиливают воспалительный ответ на ФНО за счет стимуляции фосфорилирования и протеолиза IκBα. Рисунок 13. SkQ1 подавляет вызванную ФНО (5 нг/мл, 1 ч) транслокацию p65 Распределение p65 в ядро. в (А) контрольных и (Б) обработанных ФНО клетках EA.hy926. Масштаб – 15 мкм. (В) выявление p65 в ядерной и цитоплазматической фракциях клеток методом вестернблот. Наши данные согласуются с наблюдениями, сделанными другими группами. Альфа-токоферол и BAY 11-7082 подавляли экспрессию мРНК молекул адгезии в стимулированных ФНО эндотелиальных клетках из человеческих аорт (Catalan, 2012). Резвератрол блокировал фосфорилирование р65 и его транслокацию в ядро, хотя связан ли эффект резвератрола с его антиоксидантным действием не известно (Csiszar, 2006). Другой митохондриально-направленный антиоксидант, MitoQ, подавлял вызванное ишемией-реперфузией повышение экспрессии молекул адгезии и способствовал снижению нейтрофильной инфильтрации печени (Mukhopadhyay, 2012). NFκB – редокс-чувствительный транскрипционный фактор (Schreck, 1992; Pantano, 2006; Kabe, 2005). Для него показана активация под действием пероксида водорода и ионизирующей радиации (Schreck, 1991). Такие активаторы NFκB, как ФНО или IL-1, приводят к увеличению продукции АФК в клетках (Bonizzi, 1999; Park, 2004; Ryan, 2004; Sanlioglu, 2001; Sulciner, 1996). Соединения, проявляющие антиоксидантную активность, подавляют активацию 19 NFκB. Тем не менее, имеются противоречивые данные о роли АФК в регуляции сигнального пути NFκB. В частности, сообщалось, что АФК ингибируют активность NFκB, нарушая его способность связываться с ДНК (Kabe, 2005). Многие эффекты предполагаемых антиоксидантов оказались не связаны с их антиоксидантными свойствами. Например, в модели активации NFκB под действием ФНО антиоксидант PDTC ингибировал убиквитинлигазу IκB, а антиоксидант NAC снижал сродство рецептора к ФНО (Hayakawa, 2003). Следует отметить, что в этом исследовании NAC применялся в крайне высокой концентрации 30 мМ. Результаты исследований, где разными способами модулировалась активность SOD, так же оказались неоднозначны (Schmidt, 1995; Manna, 1998). На различных клеточных линиях были получены противоположные результаты при оценке влияния пероксида водорода на активацию IKK (Pantano, 2006). Одно из возможных объяснений этого противоречия состоит в том, что уровень АФК может сильно различаться в различных моделях, и в ряде случаев может пересекать некое пороговое значение, таким образом, кардинально меняя направленность клеточной регуляции. Другое объяснение может заключаться в том, что выбор типа АФК-зависимой клеточной регуляции зависит от сайта генерации АФК в клетке (Finkel, 2000). ЗАКЛЮЧЕНИЕ В настоящей работе изучена роль митохондриальных АФК в регуляции воспалительного ответа эндотелия. Митохондриальные АФК стимулируют экспрессию провоспалительных маркеров в аортах старых животных, однако не влияют на общий уровень провоспалительных цитокинов. На клеточной модели установлено, что митохондриальные АФК активируют эндотелий посредством стимуляции сигнального пути NFκB. Кроме того, митохондриальные АФК принимают участие в регуляции апоптоза. Таким образом, полученные результаты подтверждают роль митохондриальных АФК в регуляции воспалительного ответа как in vitro, так и in vivo; и открывают новые перспективы для использования митохондриально-направленных антиоксидантов для терапии или лечения возрастных сердечно-сосудистых заболеваний. 20 ВЫВОДЫ 1. Митохондриально-направленный антиоксидант SkQ1 не влияет на содержание воспалительных цитокинов фактора некроза опухоли и интерлейкина-6 в крови старых мышей F1(CBAxC57Bl/6), но заметно подавляет экспрессию молекулы адгезии ICAM1 в их аортах. 2. Митохондриально-направленные антиоксиданты подавляют апоптоз эндотелиальных клеток, вызванный высокими концентрациями фактора некроза опухоли. Показано, что их защитное действие реализуется на этапе выхода цитохрома с из митохондрий в цитоплазму. 3. В клетках эндотелия как SkQ1, так и традиционные антиоксиданты подавляют стимулированную фактором некроза опухоли воспалительную активацию: экспрессию молекул адгезии (ICAM1, VCAM1) и E-селектина, прикрепление нейтрофилов к монослою эндотелия, а также секрецию провоспалительных цитокинов (IL-6, IL-8). Это происходит благодаря подавлению фосфорилирования и протеолиза IκBα, белка, удерживающего транскрипционный фактор NFκB в цитоплазме. 4. Активные формы кислорода, генерируемые митохондриями эндотелиальных клеток, стимулируют провоспалительные изменения экспрессии генов в аортах мышей при старении. В эндотелиальных клетках митохондриальные активные формы кислорода участвуют в ФНО-зависимой активации NFκB и воспалительном ответе клеток эндотелия, а также передаче сигнала апоптоза, вызванного ФНО. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах, соответствующих перечню ВАК РФ 1. Демьяненко И.А., Васильева Т.В., Галкин И.И., Егоров М.В., Ильинская О.П., Манских В.Н., Попова Е.Н., Федоров А.В. Новый митохондриально-направленный антиоксидант ускоряет репаративные процессы в полнослойной кожной ране у мышей C57BLKS-Leprdb/J с генетически обусловленными нарушениями углеводного и липидного обмена. Морфологические ведомости, 2011, № 4, с. 23-30. 2. Демьяненко И.А., Васильева Т.В., Галкин И.И., Егоров М.В., Ильинская О.П., Манских В.Н., Федоров А.В., Макарова О.В. Исследование репаративных процессов при заживлении полнослойных кожных ран у старых мышей на фоне длительного 21 приёма 10-(6'-пластохинонил) децилтрифенилфосфония. Морфологические ведомости, 2012, №2, с. 24-33 3. Галкин И.И., Плетюшкина О.Ю., Зиновкин Р.А., Захарова В.В., Бирюков И.С., Черняк Б.В., Попова Е.Н. Митохондриально-направленные антиоксиданты предотвращают апоптоз эндотелиальных клеток, вызванный фактором некроза опухоли. Биохимия (Москва), 2014, Т. 79, № 2, с. 169-176 4. Zinovkin R.A., Romaschenko V. P., Galkin I.I., Zakharova V.V., Pletjushkina O. Y., Chernyak B.V., Popova E. N. Role of mitochondrial reactive oxygen species in age-related inflammatory activation of endothelium. Aging (Olbany), 2014, Vol.6, No. 8, p. 661-674 5. Manskikh V.N., Gancharova O.S., Nikiforova A.I., Krasilshchikova M.S., Shabalina I.G., Egorov M.V., Karger E.M., Milanovsky G.E., Galkin I.I., Skulachev V.P., Zinovkin R.A. Age-associated murine cardiac lesions are retarded by the mitochondria-targeted antioxidant SkQ1. Histology and Histopathology, 2015, Vol. 30, No. 3, p. 353-360. 6. Ромащенко В.П., Зиновкин Р.А., Галкин И.И., Захарова В.В., Пантелеева А.А., Токарчук А.В., Лямзаев К.Г., Плетюшкина О.Ю., Черняк Б.В., Попова Е.Н. Низкие концентрации разобщителей окислительного фосфорилирования предотвращают воспалительную активацию эндотелиальных клеток, вызванную фактором некроза опухолей. Биохимия (Москва), 2015, Т. 80, № 5, с. 723-734 Тезисы докладов и материалы конференций 1. Галкин И.И., Ромащенко В. П., Попова Е.Н., Плетюшкина О.Ю., Демьяненко И.А., Федоров А. В., Черняк Б.В. Клеточные механизмы терапевтического действия митохондриально-направленных антиоксидантов при заживлении кожных ран у мышей. Сборник материалов 7ой национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека». Смоленск: «Смоленская городская типография». 2011, с. 64-65 2. Галкин И. И., Попова Е. Н., Плетюшкина О. Ю. Участие митохондриальных активных форм кислорода в регуляции барьерной функции эндотелия. Материалы Первой Всероссийской конференции «Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет». Цитология, 2011, т. 53 №9 с. 697-698 3. Popova E. N., Galkin I.I., Romashchenko V.P., Chernyak B. V., Pletjushkina O.Y. Healing of skin wounds with mitochondria-targeted oxidants: cellular mechanisms. ECDO 2011 Programme & Abstract book, p. 211 4. Galkin I.I., Popova E. N., Romashchenko V.PPletjushkina O.Y., Chernyak B. V., Zinovkin R.A. Mitochondria-targeted compounds and endothelium activation. ECDO 2012 Programme & Abstract book, p. 123 5. Galkin I.I., Pletjushkina O.Y., Zakharova V.V., Chernyak B.V., Popova E.N., Zinovkin R.A. Mitochondria-targeted antioxidants prevent TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis. FEBS Journal No 280, (Supp. 1) (2013). P. 225 22
