2 499 043(13) C1

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
(19)
RU
(11)
2 499 043
(13)
C1
(51) МПК
C12N 5/02 (2006.01)
A61K 38/01 (2006.01)
A61K 38/16 (2006.01)
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
(12) ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
(21)(22) Заявка: 2012140939/10, 26.09.2012
(24) Дата начала отсчета срока действия патента:
26.09.2012
Приоритет(ы):
(22) Дата подачи заявки: 26.09.2012
Адрес для переписки:
193313, Санкт-Петербург, ул. Подвойского,
14, к.1, кв.741, В.А. Кузнецову
регуляторных
Т-лимфоцитов
N-концевым
фрагментом
растворимого
супрессора
иммунного ответа с Seq ID NО: 1, при введении
его в концентрации 0,1-50 мкг/мл. Изобретение
может быть использовано для размножения
регуляторных Т-лимфоцитов, полученных от
больного, страдающего от аутоиммунного
заболевания, с целью последующего введения
полученных
Т-лимфоцитов
данному
больному. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 3 пр.
R U
2 4 9 9 0 4 3
(57) Реферат:
Изобретение
относится
к
области
биохимии,
биотехнологии
и
медицины.
Предложен
N-концевой
фрагмент
растворимого супрессора иммунного ответа
длиной в 21 аминокислоту, имеющий
последовательность аминокислот по Seq ID
NО:
1,
позволяющий
стимулировать
образование регуляторных Т-лимфоцитов, а
также
способ
стимуляции
образования
Ñòð.: 1
ru
C 1
C 1
(54) СТИМУЛЯТОР ПРОЛИФЕРАЦИИ РЕГУЛЯТОРНЫХ Т-ЛИМФОЦИТОВ И СПОСОБ ИХ
СТИМУЛЯЦИИ
2 4 9 9 0 4 3
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: US 20070185030 A1, 09.08.2007. US
20030039628 A1, 27.02.2003. EA 12066 B1,
28.08.2009. RU 2436796 C2, 20.12.2011.
(73) Патентообладатель(и):
Федеральное государственное унитарное
предприятие "Государственный научноисследовательский институт особо чистых
биопрепаратов" Федерального медикобиологического агентства (RU)
R U
(45) Опубликовано: 20.11.2013 Бюл. № 32
(72) Автор(ы):
Пигарева Наталья Васильевна (RU),
Петров Александр Владимирович (RU),
Колобов Александр Александрович (RU),
Симбирцев Андрей Семенович (RU)
RUSSIAN FEDERATION
(19)
RU
(11)
2 499 043
(13)
C1
(51) Int. Cl.
C12N 5/02 (2006.01)
A61K 38/01 (2006.01)
A61K 38/16 (2006.01)
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY
(12) ABSTRACT
OF INVENTION
(21)(22) Application: 2012140939/10, 26.09.2012
(72) Inventor(s):
Pigareva Natal'ja Vasil'evna (RU),
Petrov Aleksandr Vladimirovich (RU),
Kolobov Aleksandr Aleksandrovich (RU),
Simbirtsev Andrej Semenovich (RU)
(24) Effective date for property rights:
26.09.2012
Priority:
(22) Date of filing: 26.09.2012
(45) Date of publication: 20.11.2013 Bull. 32
fragment of soluble suppressor of immune response
with Seq ID NO: 1, at its introduction with the
concentration of 0.1-50 microgram/ml.
EFFECT: invention can be used for propagation
of regulatory T-lymphocytes obtained from a patient
suffering autoimmune disease, for the purpose of
further injection of the obtained T-lymphocytes into
the body of the patient.
3 cl, 2 tbl, 3 ex
R U
2 4 9 9 0 4 3
(57) Abstract:
FIELD: biotechnologies.
SUBSTANCE: invention proposed N-end
fragment of soluble suppressor of immune response
with the length of 21 amino-acids, which has
sequence of amino-acids as per Seq ID NO: 1,
allowing to promote formation of regulatory Tlymphocytes, as well as a promotion method of
formation of regulatory T-lymphocytes with N-end
Ñòð.: 2
en
C 1
C 1
(54) PROMOTING AGENT OF PROLIFERATION OF REGULATORY T-LYMPHOCYTE, AND THEIR
PROMOTION METHOD
2 4 9 9 0 4 3
Mail address:
193313, Sankt-Peterburg, ul. Podvojskogo, 14,
k.1, kv.741, V.A. Kuznetsovu
R U
(73) Proprietor(s):
Federal'noe gosudarstvennoe unitarnoe
predprijatie "Gosudarstvennyj nauchnoissledovatel'skij institut osobo chistykh
biopreparatov" Federal'nogo medikobiologicheskogo agentstva (RU)
RU 2 499 043 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к биопрепаратам
медицинского назначения, предназначенных для воздействия на иммунную систему
организма, а именно на активность Т-лимфоцитов, а именно к стимуляторам
пролиферации регуляторных Т-лимфоцитов.
Минорная субпопуляция Т-лимфоцитов, называемая регуляторными Тлимфоцитами (Treg), способна, с помощью нескольких механизмов, ингибировать
пролиферацию обычных Т-лимфоцитов, выполняя важную функцию подавления
активности Т-клеток, направленной против собственных антигенов организма.
Фенотипически регуляторные Т-лимфоциты отличаются наличием маркеров CD4+
CD25+FoxP3+ [Aune Т.М. et al. // J. Immunol. - 1983. - v. 131. - p.2848-2852; Webb D.R.
et al. // International Immunology. - 1990. -v.2. - p.765-774].
Повышенное содержание регуляторных Т-лимфоцитов наблюдается в лимфоцитах
опухолей и дренирующих лимфоузлов опухолей, что, возможно, является одной из
причин подавления Т-клеточного иммунного ответа организма на антигены опухоли.
В связи с этим повышение активности и/или содержания Treg в организме может стать
способом лечения ряда аутоиммунных заболеваний, осложнений, связанных с
пересадкой органов и тканей, включая пересадку костного мозга, например болезни
«трансплантат против хозяина». В частности, в настоящее время предложен способ
лечения аутоиммунных и аллоиммунных заболеваний путем забора у больного,
нуждающегося в данном лечении, лейкоцитарной массы, выделении из нее клеток с
фенотипом CD4+CD25+, последующем культивировании данных клеток in vitro
продолжительностью до 4-х недель с целью их размножения и обратном введении
полученных клеток больному (WO 2005086781, 2004).
В качестве агентов, стимулирующих пролиферацию регуляторных Т-клеток
предлагается использовать азацитидин, фактор некроза опухоли-бета, ретиноевую
кислоту, трихостатин А, анти-CD3, анти-CD28, окисленный АТФ, интерлейкин-2 (WO
2009126877, 2008; WO 2009114097, 2008).
Недостатком данных стимуляторов является то, что они не являются строго
избирательными стимуляторами пролиферации регуляторных Т-лимфоцитов, что
вызывает необходимость в поиске более специфичного активатора пролиферации
таких клеток.
Наиболее близким к заявляемому изобретению является использование в качестве
стимулятора цитокинов, в частности, интерлейкина-2, который вводят в
культуральную среду в дозе 100 Ед/мл (WO 2005086781, 2004). Недостатком этого
стимулятора является недостаточная специфичность.
Задачей, стоящей перед авторами, являлось расширение арсенала стимуляторов
пролиферации регуляторных Т-клеток на пролиферацию регуляторных Т-лимфоцитов.
Технический результат был достигнут в результате синтеза пептида,
представляющего собой N-концевой фрагмент растворимого супрессора иммунного
ответа (SIRS1 ‐ 2 1), последовательность аминокислот которого представлена в
приложении 1 Seq ID NO: 1, который оказался обладающим избирательным
стимулирующим влиянием на пролиферацию регуляторных Т-клеток (Treg) в
популяциях лимфоцитов тимуса и селезенки.
Белок SIRS (soluble immune response suppressor), полная последовательность
аминокислот которого до сих пор неизвестна, представляет собой полипептид с
молекулярным весом около 10-14 кДа, который продуцируется CD8+ клетками,
активированными митогенами, антигеном или интерферонами (US 4771125, 1984) и
обладает способностью ингибировать продукцию антител и угнетать реакцию
Ñòð.: 3
DE
RU 2 499 043 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
гиперчувствительности замедленного типа in vivo [Aune T.M. et al. // J. Immunol. 1983. - v. 131. - p.2848-2852; Webb D.R. et al. // International Immunology. - 1990. - v.2. p.765-774]. Последовательность аминокислот N-концевого участка SIRS мыши,
содержащего 21 аминокислотный остаток (SIRS 1-21), установлена [Webb D.R. et al. //
International Immunology. - 1990. - v.2. - р.765-774]. Информация о возможности
использования SIRS или его фрагментов в качестве стимуляторов пролиферации
клеток Treg в просмотренной литературе не найдена.
В ходе проведенных исследований авторами было установлено, что пептид SIRS 121 при культивировании популяции клеток, содержащих Т-лимфоциты, избирательно
стимулирует пролиферацию регуляторных Т-лимфоцитов (Treg, CD4+CD25+FoxP3+
клеток), практически не оказывая влияния на пролиферацию общей популяции клеток,
что может быть связано с угнетением регуляторными Т-лимфоцитами пролиферации
обычных лимфоцитов.
Стимуляция образования регуляторных Т-лимфоцитов осуществляется путем
введения культуральную жидкость стимулятора SIRS 1-21 в концентрации 0,1-10
мкг/мл. При этом эффективность воздействия повышается при одновременном
введении в систему интерлейкина-1-бета в дозе 100-300 пг/мл.
Сущность и преимущества заявляемой группы изобретений иллюстрируются
следующими примерами.
Пример 1. Химический синтез N-концевого фрагмента SIRS (SIRS1 ‐ 2 1)
Синтез пептида SIRS1 ‐ 2 1 проводили твёрдофазным способом на синтезаторе Vega
Coupler 250 по методу in situ с использованием Nα-Boc-защищённых производных
аминокислот. В работе были использованы следующие производные аминокислот BocSer(Bzl)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Pro-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asn(Trt)-OH, Boc-Gln-OH,
Boc-Glu(OBzl)-OH, Boc-Met-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Lys(ClZ)-OH.
Исходным аминоацил-полимером служил Boc-Ser(Bzl)-PAM с удельной емкостью 0,64
мМол/грамм.
Деблокирование временной трет-бутилоксикарбонильной защиты проводили 50%
трифторуксусной кислотой (TFA) в хлористом метилене (DCM). Реакции конденсации
проводили в диметилформамиде (DMF). Нейтрализацию при первой конденсации
осуществляли путем добавления трехкратного избытка
диизопропилэтиламина (DIPEA) непосредственно в реакционную смесь на стадии
присоединения аминокислотного остатка; повторную конденсацию проводили после
дополнительной промывки пептидил-полимера 10% раствором DIPEA в DMF.
Присоединение аминокислотных остатков проводили методом активированных
эфиров, полученных из соответствующих производных аминокислот с помощью
диизопропил-карбодиимида, используя 5-кратные избытки реагентов в DMF. Смесь
производных аминокислот готовили непосредственно перед внесением в реакционный
сосуд. Контроль полноты реакции конденсации проводили с помощью
нингидринового и бромфенолового тестов.
После завершения наращивания пептидной цепи пептидил-полимер
обрабатывали 50% TFA два раза по 1 минуте, промывали DCM и диэтиловым эфиром,
извлекали из реактора и сушили до постоянного веса.
Отщепление пептида от полимера и удаление боковых защитных группировок
проводили с помощью жидкого фтористого водорода по Snl механизму в присутствии
скавенджеров.
Выделенный грубый продукт подвергался очистке методом полупрепаративной
обращено-фазовой ВЭЖХ на колонке Waters Prep Nova-Pak HR С-18, 6ц, 60Å, 19×300
Ñòð.: 4
RU 2 499 043 C1
5
10
15
20
25
mm (детекция при 220 нм).
Фракцию, соответствующую пику основного продукта, после лиофильной сушки
подвергали масс-спектральному и ВЭЖХ-анализам.
По данным MALDI-TOF-спектрометрии молекулярная масса пептида (М+Н) + 2281. Теоретическая молекулярная масса в расчете на свободный пептид - 2280,38.
Содержание основного вещества, пептида SIRS1 ‐ 2 1 составило более 95% по данным
ВЭЖХ.
Пример 2. Влияние SIRS1 ‐ 2 1 на пролиферацию спленоцитов
Пептид SIRS1 ‐ 2 1 разводили в среде RPMI-1640 с 1% эмбриональной сыворотки
теленка в концентрации 1 мг/мл, далее готовили последовательные разведения и
вносили в лунки 96-лу ночного плоскодонного планшета по 50 мкл на лунку. Далее в
лунки вносили суспензию спленоцитов в 100 мкл среды RPMI-1640, содержавшей 10%
эмбриональной сыворотки теленка (ТЭС), по 3×105 клеток на лунку. Постановка
теста осуществлялась не менее чем в 4 параллелях для каждой экспериментальной
точки.
Платы помещали в СО2-инкубатор и инкубировали при 37°С в условиях
абсолютной влажности. Через 48 ч от начала инкубации в культуры клеток вносили
3
H-тимидин (Изотоп, Санкт-Петербург) в конечной концентрации 5 мкКю/мл. Через
сутки клетки переносили на стекловолоконные фильтры с помощью
харвестера FilterMate 96 (Perkin-Elmer) и определяли интенсивность включения
тимидина на планшетном β-счетчике MicroBeta TriLux 1450 (Perkin-Elmer).
Результаты, выраженные в количестве Н3-тимидина, включенного в
кислотонерастворимый осадок (имп/мин) представлены в таблице 1.
Таблица 1
Влияние пептида SIRS1 ‐ 2 1 на пролиферацию спленоцитов мыши in vitro
30
35
40
45
50
SIRS1 ‐ 2 1, мкг/мл
Интенсивность пролиферации спленоцитов (имп/мин)
10
8319±387
1
7306±715
0,1
7019±386*
0,01
8416±1132
0 (контроль)
8305±1254
Анализ полученных результатов указывают на слабое угнетение пролиферации
спленоцитов в присутствии 0,1 мкг/мл исследуемого пептида. Более низкие и более
высокие концентрации SIRS1 ‐ 2 1 в течение исследуемого периода времени (1 сутки)
влияния на пролиферацию спленоцитов не оказывали.
Пример 3. Оценка влияния пептида SIRS1 ‐ 2 1 на пролиферацию регуляторных Тклеток in vitro.
В ходе эксперимента исходили из того, что цитофлюориметрически регуляторные Тклетки могут быть идентифицированы так CD4+ CD25+ лимфоциты, экспрессирующие
также транскрипционный фактор FoxP3.
Тимоциты или спленоциты мыши инкубировали с пептидом SIRS1 ‐ 2 1 в
присутствии 100-300 пг/мл рекомбинантного ИЛ-1β или без него в течение 3 суток.
Для определения процента регуляторных Т-клеток в суспензии тимоцитов и
спленоцитов клетки окрашивали моноклональными антителами к поверхностным
маркерам CD4, CD8 и CD25, а также к внутриклеточному маркеру FoxP3.
Использовали антитела к антигенам мыши производства eBioscience: анти-РохР3-FITC
(клон FJK-16s), анти-CD4-РЕ (клон GK1.5), анти-CD25-РЕ-Cy5 (клон РС61.5),
Ñòð.: 5
RU 2 499 043 C1
5
анти-CD8a-РЕ-Cy5 (клон 53-6.7). Для окрашивания антителами к FoxP3 пользовались
набором Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience) по инструкции
изготовителя. Анализ экспрессии соответсвующих маркеров проводили в трехцветном
режиме на цитофлюориметре EPICS-XL (Beckman-Coulter). Полученные результаты
представлены в таблице 2.
Таблица 2
Влияние SIRS1 ‐ 2 5 на содержание CD4+CD25+FoxP3+клеток в культивируемых тимоцитах и спленоцитах мыши
Содержание CD4+CD25+FoxP3+ клеток (%)
10
Тимоциты
SIRS1 ‐ 2 1, мкг/мл
Без ИЛ-1β
15
20
25
30
35
40
45
50
Спленоциты
С ИЛ-1β
3 пг/мл
100
200
300
С ИЛ-1β
3 пг/мл
100
200
300
0
0,43
0,38
0,38
0,37
2,4
2,5
2,8
2,7
0,1
0,48
0,50
0,50
0,54
3,0
3,0
3,0
3,4
16,5
0,63
0,77
0,85
0,79
7,37
5,4
5,56
5,1
40
0,48
0,83
0,92
0,88
7,39
5,52
5,58
5,55
50
0,41
0,90
0,99
0,95
7,39
5,58
5,61
5,60
Из таблицы 2 видно, что лучшие результаты достигаются при инкубации клеток в
присутствии 16,5 мкг/мл SIRS1 ‐ 2 1. При этом наблюдается 1,5-2-кратное увеличение
содержания CD4+CD25+FoxP3+ в суспензии тимоцитов и 2-3-кратное увеличение
содержания клеток этого фенотипа в суспензии спленоцитов.
Для тимоцитов эффект SIRS1 ‐ 2 1 на содержание CD4+CD25+FoxP3+клеток более
выражен на фоне ИЛ-1β, который сам на содержание данных клеток в популяции
тимоцитов практически не влияет. Таким образом, SIRS1 ‐ 2 1 стимулирует
пролиферацию Treg в популяциях тимоцитов и спленоцитов, в том числе в присутствии
в среде культивирования ИЛ-1β.
Из приведенных выше данных следует, что пептид SIRS1 ‐ 2 1 при культивировании
популяции клеток, содержащих Т-лимфоциты, избирательно стимулирует
пролиферацию регуляторных Т-лимфоцитов (Treg, CD4+CD25+FoxP3+клеток),
практически не оказывая влияния на пролиферацию общей популяции клеток.
Указанное свойство делает данный пептид перспективным для размножения ex vivo
регуляторных Т-лимфоцитов, полученных от больного, страдающего от
аутоиммунного заболевания, связанного с хроническим воспалением, например,
больного ревматоидным артритом, псориазом и псориатрическим артритом,
диабетом 1-го типа, аутоиммунным тироидитом (болезнь Хашимото), язвенным
колитом, болезнью Крона, грануломатозным васкулитом, саркоидозом,
склеродермией, множественным склерозом, системным склерозом,
гломерулонефритом аутоиммунной природы и другими подобными заболеваниями,
при отторжении трансплантата, болезни «трансплантат против хозяина», с целью
последующего введения полученных Т-регуляторных Т-лимфоцитов данному
больному для лечения вышеперечисленных заболеваний и патологических состояний.
Формула изобретения
1. N-концевой фрагмент растворимого супрессора иммунного ответа длиной в 21
аминокислоту, имеющий последовательность аминокислот по Seq ID NО: 1, в качестве
стимулятора образования регуляторных Т-лимфоцитов.
2. Способ стимуляции образования регуляторных Т-лимфоцитов путем
культивирования клеток, содержащих Т-лимфоциты, в присутствии стимулятора,
отличающийся тем, что в качестве стимулятора в культуральную среду вводят NÑòð.: 6
CL
Без ИЛ-1β
RU 2 499 043 C1
5
концевой фрагмент растворимого супрессора иммунного ответа по п.1 в
концентрации 0,1-50 мкг/мл.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в среду культивирования дополнительно
вводят интерлейкин-1-бета в дозе 100-300 пг/мл.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Ñòð.: 7
RU 2 499 043 C1
Ñòð.: 8
DR