Новые адгезивные биорегуляторы растительного происхождения
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЭЛЕМЕНТООРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ им. А.Н. НЕСМЕЯНОВА на правах рукописи Куликова Ольга Геннадьевна Новые адгезивные биорегуляторы растительного происхождения 03.01.02 биофизика 03.01.06 биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: Профессор, доктор химических наук Ямсков И.А. Профессор, доктор биологических наук Ямскова В.П. Москва 2012 Оглавление Введение........................................................................................................................ 5 Глава 1. Литературный обзор 1.1. Новая группа биорегуляторов – мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов……………………………………….. 9 1.1.1. Методика исследования МГТБ……………………………………………… 10 1.1.2. Биорегулятор, выделенный из сыворотки крови млекопитающих………………………………………………………............. 17 1.1.3. Биорегуляторы, выделенные из различных тканей млекопитающих.. 22 1.2. Характеристика объектов, использованных для выделения биорегуляторов…………………………………………………………………………... 26 1.3. Химический состав объектов исследования……………………………………….. 29 1.4. Известные биорегуляторы растительного происхождения……………………. 30 1.5. Действие различных препаратов растительного происхождения……………. 32 1.6. Ткани высших растений……………………………………………........................... 35 1.6.1. Меристема……………………………………………………………………… 35 1.6.2. Постоянные ткани……………………………………………………………. 36 1.7. Строение и биохимические особенности растительной клетки………………. 39 Глава 2. Материалы и методы…………………………………………………………….. 44 2.1. Получение экстрактов тканей растений……………………………………………. 45 2.2. Высаливание растительных экстрактов…………………............................... 45 2.3. Разделение супернатантов растительных экстрактов методом изоэлектрофокусирования………………………………………………………………. 45 2.4. Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография……. 46 2.5. Определение концентрации белка…………………………………………………….. 46 2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле………………………………………........ 46 2.7. Аминокислотный анализ………………………………………………………………... 47 2.8. Масс-спектрометрический анализ…………………………………………………….. 47 2 2.9. Установление С-концевой аминокислотной последовательности……………... 47 2.10. Метод динамического лазерного светорассеяния……………………………….. 47 2.11. Исследование супернатанта экстракта лука методом ядерного магнитного резонанса......................................................................................... 49 2.12. Определение влияния растворов, содержащих биорегуляторы, на вязкоупругие свойства мембран гепатоцитов мыши при кратковременном органном культивировании in vitro…………………………………………………. 49 2.13. Роллерное органное культивирование кожи тритона (Pleurodeles waltl) in vitro……………………………………………………………………………............... 50 2.14. Изучение ранозаживляющего действия биорегулятора, выделенного из подорожника, на экспериментальной модели кожной раны у мыши in vivo.. 51 2.15. Приготовление гистологических срезов…………………………………………….. 51 2.16. Получение кроличьей поликлональной антисыворотки………………………….. 51 2.17. Иммуноферментный анализ антител (Elisa)……………………………………... 52 2.18. Иммуногистохимическое окрашивание с использованием FITC-меченых вторичных антител…………………………………………………………………….. 53 2.19. Изучение специфической активности биорегуляторов…………………………. 53 2.20. Исследование растительных биорегуляторов на реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ)……………………………… 53 Глава 3. Результаты и их обсуждение……………………………………………........ 55 3.1. Выделение, очистка и изучение физико-химических свойств растительных биорегуляторов………………………………………………………………….............. 55 3.2. Исследование локализации биорегуляторов, выделенных из подорожника, чеснока и лука, в листьях и луковицах растений…………………………………… 73 3.3. Изучение специфической активности биорегуляторов, выделенных из подорожника и алоэ, на модели роллерного культивирования кожи тритона in vitro……………………………………………………………………………………….. 77 3.4. Изучение специфической активности биорегуляторов, выделенных из подорожника и алоэ, на модели кожной раны мыши in vivo…………………….. 79 3.5. Изучение специфической активности растительных биорегуляторов на модели проращивания семян……………………………………………………………. 81 3.6. Исследование растительных препаратов на реакцию ГЗТ……………………. 83 3.7. Общее обсуждение………………………………………………………………... 86 ВЫВОДЫ………………………………………………………………………………. 91 3 Список литературы…………………………………………………………………… 91 4 Введение Актуальность работы Растения являются традиционным источником получения различных биологически активных веществ и лекарственных средств, однако к настоящему времени недостаточно изучены и охарактеризованы. Во многих случаях не выявлены вещества, ответственные за проявление фармакологического действия. Поэтому поиск новых биологически активных веществ растительного происхождения остается актуальной проблемой современной науки. В этом аспекте особого внимания заслуживает выявление в растениях мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов (МГТБ), которые были обнаружены ранее в различных тканях позвоночных животных. МГТБ отличаются, прежде всего, способностью влиять на основные биологические процессы: адгезию, дифференцировку, апоптоз, миграцию и пролиферацию клеток, причем биологическая активность характеризуется наличием тканевой, но отсутствием видовой специфичности и проявляется наиболее ярко в сверхмалых дозах (СМД), соответствующих 10-8-10-15 мг белка/мл. Все члены данной группы биорегуляторов проявляют сходные физико-химические свойства. В связи с этим для их выделения и очистки применяется экспериментальный подход, включающий в себя определенную методику их экстракции из тканей и последующую очистку. Изучение МГТБ животного происхождения показало, что они имеют сложный состав, включающий в себя пептиды, белки, ионы Са2+, углеводы и липиды. Было показано, что МГТБ локализованы внеклеточно в соответствующей ткани. В настоящей работе была предпринята попытка идентификации данной группы биорегуляторов в тканях растений, изучения их биологического действия и некоторых физико-химических свойств. Целью данной работы являлись идентификация новой группы биорегуляторов в тканях растений, изучение их структуры, физико-химических свойств, мембранотропной и специфической активности, а также их локализации в растительных тканях. В качестве основных объектов исследования изучали листья подорожника большого (Plantago major L.), укропа пахучего (Anethum graveolens L.), а также луковицы лука репчатого (Allium cepa L.) и чеснока (Allium sativum L.). Отдельные исследования были проведены также с биорегуляторами, выделенными из плодов лимона (Citrus limon L.), листьев алоэ древовидного (Aloe arborescens М.), кориандра посевного (Coriandrum sativum L.), которые использовали в сравнительном аспекте в экспериментах по изучению биологического действия растительных биорегуляторов. 5 Новизна работы Впервые в тканях растений были обнаружены новые биорегуляторы, которые по характеру мембранотропного действия и ряду физико-химических свойств проявляют сходство с МГТБ животного происхождения. Было показано, что биологически активной компонентой биорегулятора, выделенного из лука, являлся пептид с молекулярной массой 4036±2 Да. Установлена 18-членная С-концевая последовательность этого пептида. С помощью соответствующей базы данных Uniprot показана уникальность данной Сконцевой последовательности, поскольку при сравнении с последовательностями известных пептидов гомологов не обнаружено. Впервые на примере исследования биорегуляторов, выделенных из подорожника и чеснока, установлен тот факт, что биорегуляторы растений локализованы внеклеточно подобно МГТБ животного происхождения. На примере исследования биорегулятора, выделенного из подорожника, в настоящей работе впервые была установлена корреляции между биологической активностью биорегулятора и лекарственным действием растения - источника его выделения, а именно, биорегулятор, выделенный из подорожника, проявлял в СМД выраженное ранозаживляющее действие. Впервые показано, что растительные биорегуляторы в СМД оказывают влияние на рост и прорастание семян. Практическая значимость На основе биорегуляторов, выделенных из подорожника, алоэ, лука, чеснока и лимона могут быть разработаны новые фармакологические препараты или БАДы, которые могут быть использованы для профилактики и коррекции работы иммунной системы, а также обладающие ранозаживляющим действием. Биорегуляторы, выделенные из лука и укропа, также могут быть практически применены в сельском хозяйстве. Структура и объем диссертации Работа имеет традиционную структуру, она состоит из 3-х основных глав: литературного обзора, в котором рассмотрены строение растительной клетки, ткани высших растений, их ботаническое описание и химический состав, а также основные результаты исследования МГТБ животного происхождения; экспериментальной части, в которой представлены основные методы исследования растительных биорегуляторов; результатов и их обсуждения, в которой рассмотрены результаты настоящего исследования и представлена их интерпретация в соответствии с имеющимися литературными данными; 6 а также из введения, заключения и выводов. Диссертационная работа содержит 105 страниц, 25 рисунков, 5 таблиц, 183 литературные ссылки. Публикации По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из которых 3 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень Высшей аттестационной комиссии, 6 в сборниках научных трудов, 5 тезисов докладов на российских и международных конференциях. 7 Список сокращений МГТБ - мембранотропные гомеостатические тканеспецифические биорегуляторы С-МГТБ - ВКМ - мембранотропный гомеостатический тканеспецифический биорегулятор, выделенный из сыворотки крови крупного рогатого скота внеклеточный матрикс СМД - сверхмалые дозы ПМ - плазматическая мембрана МК - межклеточные контакты ПЭ - пигментный эпителий ИЭФ - изоэлектрофокусирование ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография КД - круговой дихроизм АСМ - атомно-силовая микроскопия ЭДТА - этилендиаминотетрауксусная кислота ЭГТА - этиленгликольтетрауксусная кислота N-CAM - адгезивный белок, обнаруженный в тканях нейрального происхождения ПААГ - полиакриламидный гель ЯМР - ядерно-магнитный резонанс ДМСО - диметилсульфоксид РНК - рибонуклеиновая кислота MALDI-TOF - matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight MMP - матриксные металлопротеазы 8 Глава 1. Литературный обзор 1.1. Новая группа биорегуляторов – мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов Известно, что состояние межклеточных адгезионных взаимодействий является важнейшим фактором, определяющим ход и направленность основных биологических процессов [Turner, 1992; Anderson, 1990]. В настоящее время многие молекулы адгезии идентифицированы, определены гены, кодирующие их биосинтез, изучена их локализация в тканях, показана их основная функция [Ямскова, Резникова, 1991; Ямсков и др., 1999; Краснов и др., 2003а; Margasyuk et al., 2007; Krasnov et al., 2007; Borisenko et al., 2007; Yamskova et al., 2007]. Поиск адгезивных молекул производился методами иммунохимии. Новый экспериментальный подход для изучения адгезивных молекул и механизмов клеточной адгезии, был разработан на основе оригинальных адгезиометрических методов, позволяющих производить оценку мембранотропного действия молекул адгезии, определяя параметр, характеризующий вязкоупругие свойства ткани [Ямскова, Модянова и др., 1977; Ямскова и др., 1977; Ямскова, Резникова, 1991; Ямскова, Туманова и др., 1990]. С помощью данного подхода в различных тканях млекопитающих были обнаружены ранее неизученные адгезивные молекулы [Ямскова и др., 1977; Ямскова, Модянова и др., 1977; Ямскова, 1978], которые, как показали результаты дальнейших исследований, оказывали влияние не только на межклеточные адгезионные взаимодействия, но и на пролиферацию, дифференцировку, миграцию клеток и апоптоз [Краснов и др., 2003а]. Более того, было установлено, что эти молекулы адгезии стимулируют процессы репарации в поврежденных тканях [Гундорова и др., 1997; Margasyuk et al., 2007; Krasnov et al., 2007; Borisenko et al., 2007; Yamskova et al., 2007; Nazarova et al., 2007]. Полученные данные показали, что эти адгезивные молекулы проявляют свойства факторов регуляции в тканях. На основании сходства физикохимических свойств и биологического действия эти биорегуляторы животного происхождения были мембранотропных выделены гомеостатических в отдельную группу, тканеспецифичных получившую биорегуляторов название - МГТБ. Результаты проведенных исследований позволили заключить о единстве молекулярных механизмов, лежащих в основе биологического действия МГТБ, которые функционируют в организме как «тонкие настройщики» органно-тканевого гомеостаза [Ямскова и др., 2009]. В литературном обзоре рассмотрены данные, полученные при исследовании физикохимических свойств и биологического действия МГТБ. В следующем разделе будут представлены основные положения экспериментального подхода, разработанного для 9 изучения МГТБ. 1.1.1. Методика исследования МГТБ МГТБ экстрагировали из тканей млекопитающих водно-солевым раствором при низкой температуре. Полученные тканевые экстракты, содержащие соответствующие МГТБ, фракционировали путем высаливания сернокислым аммонием: при создании насыщенного раствора соли примесные белки переходили в осадок, а МГТБ оставались в надосадочной жидкости – супернатанте. Следует отметить, что данное свойство оставаться в растворенном состоянии в насыщенном растворе соли характерно и для белков S100, которые представляют собой Са+2-связываюшие, слабокислые белки с молекулярной массой 21 - 25 кДа [например, Donato, 1986]. S100 белки были обнаружены в цитоплазме клеток и межклеточном пространстве различных тканей [Moore et al., 1965; Moore, 1982; Fano et al., 1995]. Методом кругового дихроизма (КД) было показано, что вторичная структура характеризуется наличием 40% α-спиралей, 30% β-спиралей и 30% статистического клубка. Белки S100 денатурируют при нагревании до 90ºС [Schafer, Heizmann, 1996]. Физико-химические свойства, проявляемые S100 белками, весьма отличаются от свойств МГТБ. Для МГТБ животного происхождения было показано, что вторичная структура биорегуляторов представлена в основном β-структурами (60-70%) и статистическим клубком (40-30%). Следует отметить, что МГТБ тканей заднего отдела глаза (радужка, сетчатка, пигментный эпителий, стекловидное и цилиарное тела) ведут себя иначе: в условиях насыщенного раствора сернокислого аммония МГТБ переходили в осадок [Скрипникова и др., 2009]. И только после воздействия ЭДТА часть МГТБ преходила в супернатант. Полученные данные указывают на принципиальную роль ионов Са2+ в поддержании целостности МГТБ, выделенных из тканей заднего отдела глаза. Аналогичные данные были получены при изучении МГТБ, выделенных из других тканей животных, например, из крови. А именно, было показано, что ионы Са2+ играют принципиальную роль в поддержании структуры сывороточного МГТБ [Ямскова, Рыбакова и др., 2004; Yamskova, Rybakova Vecherkin et al., 2007]. Для дальнейшей очистки МГТБ использовали метод изоэлектрофокусирования (ИЭФ) и обращенно-фазовую высокоэффективную хроматографию (ВЭЖХ). При ИЭФ супернатантов, полученных из экстрактов различных тканей животных, были выделены две фракции МГТБ – фракции основных (pI>8,5) и кислых белков (pI<3,5), кроме супернатантов, выделенных из сыворотки крови и молока, в которых были обнаружены дополнительно и фракции слабокислых белков (pI 4,5-5,6) [Nazarova et al., 2007; Yamskova, Vecherkin et al., 2007; Ямскова, Рыбакова, 2004]. 10 Обычно при обращено-фазовой хроматографии супернатантов или ИЭФ-фракций, содержащих МГТБ, в градиенте вода-ацетонитрил наблюдали сходную картину разделения: элюирование гидрофильных фракций (низкое содержание ацетонитрила - до 5%) и фракций, элюируемых при более высокой концентрации ацетонитрила - более 30% [Скрипникова и др., 2009]. Методами биотестирования и масс-спектрометрией установлено, что мембранотропную активность проявляли гидрофильные фракции, и в них содержались небольшие пептиды с молекулярной массой 2000-10000 Да [Margasyuk et al., 2007; Krasnov et al., 2007; Borisenko et al., 2007; Yamskova et al., 2007; Nazarova et al., 2007]. Таким образом, было показано, что за биологическое действие МГТБ ответственны небольшие входящие в их состав пептиды. Однако, при исследовании состава МГТБ были обнаружены белки, которые оказывают влияние на активность данных пептидов, белки-модуляторы. Белки-модуляторы были исследованы: для МГТБ, полученных из сыворотки крови и пигментного эпителия (ПЭ) [Ямскова, Рыбакова и др., 2004; Скрипникова и др., 2009]. Методом аффинной хроматографии был установлен механизм взаимодействия белковмодуляторов с биологически активными пептидами, в основе которого лежит лектинуглеводное взаимодействие, причем роль лектина выполняет белок-модулятор, а углеводная компонента соответствует пептидной фракции. Образование комплекса между сывороточным пептидом и белком-модулятором было показано методом кругового дихроизма - по изменению конформации его молекулы [Ямскова, Рыбакова и др., 2004]. Результаты этих и дальнейших исследований позволили установить, что МГТБ представляют собой биологически активные комплексы, образованные пептидами, белками, углеводами и липидами [Ямскова, Рыбакова и др., 2004; Скрипникова и др., 2009], существующими в растворах в виде крупных наноразмерных частиц. Значимость наноразмерного состояния для проявления биологического действия МГТБ была продемонстрирована при исследовании биорегулятора, выделенного из ПЭ [Скрипникова и др., 2009]. Методами масс-спектрометрии и секвенированием по Эдману [Ямскова, Рыбакова и др., 2004] было установлено, что белки-модуляторы представляют собой ранее неизученные изоформы сывороточного альбумина. Необходимо отметить, что белкимодуляторы по-разному изменяют активность пептидов. В случае сывороточного МГТБ взаимодействие пептида с белком-модулятором приводило к его полному ингибированию, в то время как образование комплекса между белком-модулятором и пептидом, выделенных из ПЭ, значительно увеличивало активность последнего [Ямскова, Рыбакова и др., 2004; Скрипникова и др., 2009]. Таким образом, результаты этих исследований 11 предполагают, что белки-модуляторы входят в состав МГТБ, оказывая влияние на активность пептидов в зависимости от функции соответствующей ткани. Установление характера биологического действия белков-модуляторов в отношении пептидов МГТБ, очевидно, можно выявить не только методом оценки мембранотропной активности, но также и методами исследования специфического действия МГТБ. Следует отметить, что при разработке моделей для определения специфической активности МГТБ учитывались результаты предварительно проведенных исследований, которые показали, что биологическая активность МГТБ проявляется только в условиях сохранения структуры ткани органа, но самое главное – сохранения адгезионных межклеточных взаимодействий [Ямскова, Туманова и др., 1990]. С учетом особенностей условий проявления биологического действия МГТБ были разработаны экспериментальные модели in vitro, в основном, представляющие новые собой органные культуры тканей позвоночных животных [Margasyuk et al., 2007; Krasnov et al., 2007; Borisenko et al., 2007; Yamskova et al., 2007; Nazarova et al., 2007]. Одной из первых разработанных моделей была культура заднего отдела глазного бокала тритона, на которой успешно изучены МГТБ, выделенные из сетчатки и ПЭ быка [Краснов и др., 2003б]. В этом аспекте особенно результативным оказались исследования специфической активности МГТБ, проведенные на роллерных органных культурах in vitro. В этих экспериментах было убедительно продемонстрировано протекторное действие МГТБ в сверхмалых дозах (СМД), которое выражалось в поддержании жизнеспособности клеток, их статуса дифференцировки и пролиферации. Кроме того, в этих опытах была показана корреляция между специфической и мембранотропной активностями, которая выражалась в проявлении в СМД обоих типов биологического действия МГТБ [Nazarova, 2007; Yamskova, Rybakova, 2007; Borisenko et al., 2007; Margasyuk et al., 2007; Krasnov et al., 2007] Метод биотестирования лежит в основе разработанного экспериментального подхода при изучении МГТБ. В связи с этим рассмотрим его более подробно. Данный метод является оригинальным: разработан для выявления способности некоторых биологически активных веществ влиять на адгезионные межклеточные взаимодействия. Метод основан на определении параметра, отражающего состояние межклеточных адгезионных взаимодействий при воздействии молекул адгезии. Попытки разработать способы оценки адгезивной активности ряда веществ предпринимались ранее неоднократно. Очевидно, это связано с тем, что клеточная адгезия, как давно известно, является важнейшим фактором в регуляции важнейших биологических процессов [например, Turner 1992, Riechardt, 1993]. В этом аспекте можно привести результаты 12 наиболее выдающегося исследования, выполненного с помощью прибора, позволяющего оценивать силы механического сцепления между клетками [Coman, 1954]. Работа была выполнена на монослое эпителиальных клеток мочевого пузыря жабы in vitro: с помощью одной неподвижной иглы под микроскопическим контролем фиксировали клетку, а с помощью второй подвижной иглы отрывали соседнюю и фиксировали силу отрыва [Coman, 1954]. Данное исследование удалось провести благодаря большому размеру клеток и монослойному способу их культивирования, позволившим проводить исследования под микроскопическим контролем. В случае использования трехмерных фрагментов ткани, включающих клетки меньшего размера, использование описанного прибора было затруднено. Тем не менее, автор этого исследования предпринял попытку применить данный адгезиометрический метод при изучении биопсийного материала онкологических больных, сравнивая силу механического сцепления клеток в опухолевой и здоровой тканях [Coman, 1944]. Исследование показало, что малигнизированные клетки характеризуются значительно меньшей силой сцепленности, чем клетки нормально функционирующей ткани. Кроме того, было показано, что при злокачественном росте происходит нарушение контактных межклеточных взаимодействий, и картина нарушения межклеточных контактов в опухоли поразительно схожа с таковой, полученной в эксперименте при перфузии печени растворами, содержащими Са+2-хелатирующие агенты [Coman, 1954]. Метод Coman не получил дальнейшего распространения, возможно, из-за оригинальной конструкции прибора и сложной интерпретации полученных данных. Длительное время для оценки состояния клеточной адгезии использовали экспериментальную модель агрегации клеток в суспензионных культурах in vitro [Moscona, 1963; Kuroda, 1968]. Поиск и исследование адгезивных белков способствовали разработке этого метода, основанного на способности клеток в суспензионных кудьтурах образовывать многоклеточные агрегаты [Moscona, 1963; Hausman, Moscona. 1975; Creaser, Russell, 1971]. Адгезивную активность исследуемых белков в этой модели оценивали, подсчитывая количество одиночных клеток в суспензии или определяя размер образовавшихся клеточных агрегатов. Метод был с успехом применен при изучении адгезивных белков, выделенных из морских губок, а также сетчатки куриных эмбрионов [Hausman, Moscona, 1975; Muller, Zahn, 1973; Muller et al, 1974; 1976; Murray 1976a; 1976b; 1976c]. С помощью метода клеточной агрегации удалось не только обнаружить адгезивные белки, но и изучить влияние других физико-химических факторов на агрегацию клеток in vitro [Дольникова и др., 1985а; 1985б; 1986; 1990]. Метод агрегации обладал рядом принципиальных недостатков. Наиболее значительным из них является тотальное повреждение поверхности клеток в процессе 13 приготовления суспензионных культур: обработка тканей ферментами, хелатами, механическая дезинтеграция и т.д.. Следует отметить, что у эмбриональных клеток, дифференцировка которых была незакончена и далека от дифинитивного состояния, существует вероятность восстановления поврежденной поверхности, но для клеток взрослых особей, находящихся в дифинитивном состоянии, такая возможность практически отсутствовала. Другие адгезиометрические методы, разработанные для оценки состояния межклеточной адгезии в тканях, основывались также на определении величины параметров, характеризующих механическую сцепленность клеток в момент отрыва их друг от друга, который осуществлялся, например, с помощью фиксированных микроигл (модифицированный метод Coman) или потоков жидкости, или же при механическом диспергировании ткани [Маленков, Модянова, 1968; Модянова, 1968; Маленков, Чуич, 1979]. Основным современным методом исследования адгезионных взаимодействий клеток является иммунохимический, в основе которого лежит изучение участвующих в клеточной адгезии поверхностных антигенов [Damsky et al., 1983; Gallin et al., 1983; Ogou et al., 1983; Thiery et al., 1984; Hatta et al., 1985]. Успех данных исследований, в основном, определял способность изучаемых белков межклеточного пространства эффективно проявлять антигенные свойства. В случае же, когда белки являлись слабыми антигенами, их идентификация с помощью указанного методического подхода была трудно выполнимой. Следует также отметить метод электронной микроскопии, с помощью которого можно оценить состояние плазматической мембраны (ПМ) клетки и специализированных ультраструктур межклеточных контактов (МК) [Goodenough, Gilula, 1974; Overton, 1974; Gilula, 1978; 1985; Ушаков, Черненко, 1978; Ушаков, 1980; 1982]. С помощью указанных методов исследования в настоящее время удалось идентифицировать практически все известные ныне белки межклеточного пространства: адгезивные молекулы, локализованные в ПМ, входящие в состав ультраструктур МК и внеклеточного матрикса (ВКМ) [Anderson, 1990; Turner, 1992; Riechardt, 1993]. Таким образом, современный методический подход, применяемый для исследования молекул адгезии, позволил выявить белки, которые характеризуются высокими значениями молекулярной массы, структурной сложностью и проявляют выраженные антигенные свойства [Anderson, 1990; Turner, 1992]. В то же время можно предположить, что компоненты межклеточного пространства, проявляющие слабые антигенные свойства, данным иммунохимическим методом могли быть не идентифицированы. В пользу этого предположения свидетельствуют результаты исследования, проведенного с 14 помощью оригинального адгезиометрического метода, основанного на представлении макромолекулярных структур МК и ПМ клеток как вязкоупругих систем. Определение параметра, отражающего вязкоупругие свойства ткани, проводили на основании оценки изменения свойств ПМ и межклеточных адгезионных взаимодействий при воздействии физико-химических факторов [Ямскова, Резникова, 1991; Туманова, Ямскова, 1995]. Например, при воздействии адгезивных молекул была показана корреляция между их мембранотропным действием и влиянием на проницаемость аминокислот через ПМ [Ямскова, Нечаева и др., 1994]. В настоящее время показано, что от механических характеристик поверхности ПМ и жесткости ВКМ зависят жизнеспособность клеток и их поведение: статус дифференцировки, пролиферация, их миграция [Engler et al.,2006; Wells, 2008; Marastoni et al.,. 2008; Discher et al., 2009; Soo-Hyun Kim et al., 2011]. Установлено, что ВКМ определяет форму, объем и прочность многих тканей (базальные мембраны, кость, хрящ). В условиях in vitro большинство животных клеток способны расти только при условии прикрепления к поверхностям через ВКМ. ВКМ выполняет ряд важнейших функций: обеспечивает механическую и структурную поддержку клеток, является субстратом для миграции клеток, играет важную роль в формообразовании, а также участвует в процессе формирования ниши стволовых клеток. Важно отметить, что интегрины ВКМ с помощью системы рецепторов ростовых факторов, расположенных на поверхности клетки, принимают участие в передаче регуляторного сигнала. Помимо физической поддержки клеток белки ВКМ отвечают за проявление этими клетками различных биологических функций за счет взаимодействия с другими белками ВКМ, факторами роста, рецепторами сигнальных молекул и с молекулами адгезии. Например, фибронектин как белок ВКМ, секретируемый фибробластами, связывается с коллагеном и протеогликанами, способствуя тем самым образованию структурной основы для рецепторных систем клеточной поверхности [Soo-Hyun Kim et al., 2011]. Если на клетки ткани печени оказывать кратковременное деформационное воздействие, то отдельные структуры межклеточного пространства проявляют свойства квазиупругого тела. В случае же значительных деформаций они разрушаются, и при этом обнаруживается их определенная иерархичность [Маленков, Чуич, 1979; Ушаков, Черненко, 1978; Ушаков, 1980; 1982]. Например, зона простого соединения (зона взаимодействия плазматических мембран двух соседних клеток) нарушается первой, а плотный контакт (зона слияния плазматических мембран двух контактирующих клеток) последним. Таким образом, в условиях стандартного деформационного воздействия на ткань, которое осуществляли с помощью специального дезинтегратора, часть клеток 15 может остаться целыми, а часть - разрушаться с выделением клеточных ядер. Данный метод был разработан для исследования ткани печени взрослых особей млекопитающих. Дезинтегратор по сути представляет собой стеклянный гомогенизатор ткани с зазором 50 мкм и объемом примерно 100 мкл. Величина зазора обусловливает при дезинтеграции фрагмента ткани (0,8-1,2 мг) сохранение целостности клеток. Количества, как выделившихся целых клеток, так и клеточных ядер, будут определяться вязкоупругими свойствами ПМ клетки, ультраструктур специализированных МК, а также цитоплазмы, свойства которой, во многом, зависят от состояния цитоскелета. При увеличении вязкоупругих свойств этих макроструктур, например, при воздействии адгезивных белков, в условиях сдвиговой деформации значительное количество клеток, подобно упругим шарикам, может “проскользнуть” в пространстве зазора дезинтегратора. При этом не происходит разрыва ПМ клетки, сопровождающегося высвобождением цитоплазмы и клеточных ядер во внешнее пространство. И, наоборот, при уменьшении вязкоупругих свойств этих макроструктур клеток, после дезинтеграции фрагмента ткани целых клеток будет существенно меньше. В данном случае их количество уменьшится изза разрушения клеток, которые будут вести себя подобно жестким шарикам с жесткими оболочками и разрушаться при деформационном воздействии. Следовательно, количество выделившихся клеточных ядер значительно возрастет. В качестве примера можно привести следующее исследование диспергирования интактной ткани печени. В этом образце ткани макроструктура адгезивных белков практически не была изменена, и соответственно при ее диспергировании наблюдалось выделение практически только клеточных ядер. И, наоборот, при нарушении пространственной организации макроструктуры адгезивных белков, которое достигается, например, нарушением целостности ультраструктур МК и межклеточных адгезионных взаимодействий при дефиците ионов кальция, в основном, выделяются целые клетки [Modjanova, Malenkov, 1973]. Следует отметить, что к изменению вязкоупругих свойств ткани также может привести воздействие молекул адгезии. Такое воздействие вызывает изменение пространственной организации адгезивных белков. Согласно современной концепции организации межклеточного пространства тканей высших животных, на которой и было основано все вышесказанное, ВКМ, ПМ и цитоскелет образуют в ткани единую систему, основной функцией которой является управление процессами межклеточного узнавания, клеточной дифференцировки, а также морфогенезом [Soo-Hyun Kim et al., 2011]. Важно, что изменение свойств одной из этих макромолекулярных структур (ВКМ, ПМ, цитоскелет) приводит к изменению свойств всей интегральной системы. Предполагается, что мембранотропное действие 16 биорегуляторов данной группы приводит к изменению топографии других компонентов ПМ, в связи, с чем изменяются ее вязкоупругие свойства. Очевидно, что такие изменения можно определить в условиях деформационного воздействия, сравнивая вязкоупругие свойства ткани, клетки которой подверглись воздействию МГТБ, и ткани, на которую биорегуляторами данной группы не воздействовали. Таким образом, с помощью оценки вязкоупругих свойств ткани можно охарактеризовать состояние адгезии входящих в нее клеток. С помощью данного метода в различных тканях млекопитающих были обнаружены ранее неисследованные биорегуляторы – МГТБ. Наиболее изученным в настоящее время является МГТБ, выделенный из сыворотки крови млекопитающих. Результаты этого исследования представлены в следующем разделе. 1.1.2. Биорегулятор, выделенный из сыворотки крови млекопитающих В сыворотках крови различных позвоночных животных был обнаружен новый биорегулятор, относящийся к группе МГТБ – С-МГТБ [Ямскова, Резникова и др. 1991]. Первоначально, С-МГТБ изучали как адгезионноактивный макромолекулярный фактор. Авторы данного исследования пришли к выводу, что он является полисахаридом [Ямскова, Резникова, 1979]. В более поздних работах [Ямскова, Резникова и др., 1979; Ямсков, Виноградов и др. 2001; Ямскова, Резникова и др., 1991] показали, что биологически активной компонентой данного биорегулятора является белок со значением изоэлектрической точки в области рН 4,5-5,1. Молекулярная масса С-МГТБ, определенная методом электрофореза, составляла приблизительно 25 000 Да [Ямсков, Виноградов и др., 2001]. В этом же исследовании было показано, что С-МГТБ содержал углеводную компоненту, представленную остатками маннозы и N-ацетилглюкозамина, причем соотношение белковой и углеводной компонент по массе составило 1:1. После дегликозилирования С-МГТБ (фракция биорегулятора с pI 4,5-5,1), с помощью трифторметансульфокислоты масс-спектрометрическим методом был идентифицирован полипептид с молекулярной массой 1338±2 Да, секвенирование которого по Эдману позволило установить 12-ти членную аминокислотную последовательность, которая была проанализирована с помощью электронных баз данных для поиска гомологичных аминокислотных последовательностей. Ближайшими гомологами исследуемого аминокислотного мотива оказались предшественник препроадреномедуллина быка и предшественник адреномодуллина свиньи (50% гомологии). Следует отметить, что адреномодуллины экспрессируются эндотелиальными клетками сосудов. Их функция мало изучена, предполагается, что она связана с 17 регуляцией гомеостаза сердечно-сосудистой системы [Kitamura, Eto, 1997]. Оба адреномодуллина представляют собой 188-аминокислотные, не содержащие углеводов, белки со значением изоэлектрической точки в области рН 6,0. Однако позже при исследовании кислой ИЭФ-фракции С-МГТБ методом массспектрометрии был обнаружен пептид с молекулярной массой 1222±2 Да. Возможно, что в состав С-МГТБ входят несколько биологически активных пептидов, что и было показано масс-спектрометрией при исследовании супернатанта сыворотки крови крупного рогатого скота [Margasyuk et al., 2007; Krasnov et al., 2007; Borisenko et al., 2007; Yamskova et al., 2007; Nazarova et al., 2007]. В то же время не исключено, что проведенное химическим способом дегликозилирование привело к различной степени деградации одного гликопептида, что и отразилось в различных значениях молекулярных масс полученных фрагментов. Поэтому вопрос о количестве биологически активных пептидов, входящих в состав МГТБ, до сих пор остается открытым. Исследование состава С-МГТБ методом ЯМР-спектроскопии показало, что он содержит кроме аминокислот и углеводов также и липиды [Yamskova, Rybakova, Vecherkin et al., 2007]. Исследование вытяжки, полученной эфирной экстракцией раствора С-МГТБ, методом ЯМР-спектроскопии установило присутствие жирных кислот: декановая, линолевая, холевая, дезоксихолевая и пальмитиновая [Yamskova, Rybakova et al., 2007]. Для С-МГТБ также было установлено свойство образовывать достаточно крупные наноразмерные агрегаты. Так, например, ранее методом гель-фильтрации было показано, что С-МГТБ в водных растворах существует в виде крупных межмолекулярных ассоциатов с молекулярной массой не менее 200 000 Да [Ямскова, Резникова, 1991]. В настоящее время с помощью таких методов как метод динамического лазерного светорассеяния и атомно-силовая микроскопии удалось показать, что в водных растворах С-МГТБ присутствуют частицы размером порядка 100 нм [Yamskova, Rybakova, Vecherkin et al., 2007; Ямсков и др., 2009]. Методами иммуногистохимии исследование локализации С-МГТБ показало его расположение в межклеточном пространстве гепатоцитов, а также на поверхности кроветворных клеток печени тритона, что позволило сделать предположение о его синтезе клетками печени [Борисенко и др., 2006]. Исследования специфической биологической активности С-МГТБ осуществлялось на протяжении длительного времени. Одна из первых работ в данном направлении была посвящена изучению влияния С-МГТБ на рост фибробластов млекопитающих in vitro [Буеверова и др., 1985; Евстратов и др., 1988]. Было показано, что С-МГТБ стимулировал пролиферацию фибробластов, а также 18 способствовал увеличению их колониеобразования. На основании проведенного исследования авторы предположили, что ростстимулирующее воздействие С-МГТБ на культуру фибробластов носит «пусковой» характер, т.е. взаимодействие С-МГТБ с клетками инициирует в них развитие каскада внутриклеточных событий, обеспечивающих более высокую выживаемость клеток при клонировании in vitro, которая выражалась в изменении статуса их пролиферации. В более поздних исследованиях [Гундорова и др., 1997; 2000; Ченцова и др., 2008] было выявлено, что С-МГТБ способствует заживлению роговицы глаза после механической травмы, кератопластики, посттравматических эрозий и ожогов. Влияние СМГТБ выражалось в снижении воспалительной реакции, сокращении сроков эпителизации, уменьшении помутнения роговицы, торможении процессов грубой васкуляризации и конъюктивизации, а также в образовании тонкого, нежного рубца [Ченцова и др., 2008]. Более того, С-МГТБ весьма эффективен при пересадке роговицы. СМГТБ добавляли в качестве компонента среды при консервации роговицы донора, что способствовало сохранению гистоструктуры роговицы человека в процессе ее длительной консервации [Каспаров и др., 2000]. При пересадке таких роговичных трансплантатов больным с тяжелыми кератопатологиями отмечали протекание операционного и послеоперационноного периодов без осложнений. В пересаженной роговице наблюдали поддержание нормальной толщины и прозрачности. Поставлен также ряд экспериментов, в которых выявлено стимулирующее влияние С-МГТБ на регенерацию хрящевой ткани при различных патологиях суставов [Неверкович, 2000]. С-МГТБ также стимулировал репаративные процессы в коже после лучевого поражения, которое может возникнуть, например, после радиотерапии у онкологических больных [Ямсков, Ямскова, 1998]. Исследование протекторного действия С-МГТБ было подробно изучено на экспериментальных моделях ранозаживления кожи у позвоночных животных in vitro и in Способность vivo. поддерживать структуру ткани кожи, а также увеличивать жизнеспособность клеток были продемонстрированы на модели роллерного органного культивирования кожи амфибий [Yamskova, Rybakova, Krasnov et al., 2007]. На модели экспериментальной раны кожи у мышей in vivo было показано, что С-МГТБ не только уменьшал время ранозаживления, но, самое главное, способствовал полному восстановлению структуры кожи в области раны [Yamskova, Rybakova, Krasnov et al., 2007]. На модели роллерного культивирования регенератов хвостов амфибий было показано, что С-МГТБ проявлял протекторный эффект в СМД (10-11 мг белка/мл) на 19 хрящевую ткань, в то время как этот биорегулятор в концентрации, соответствующей 10-4 мг белка/мл, оказывал морфогенетичекое действие, которое выражалось в проявлении протекторного действиия на все ткани регенерата [Рыбакова, Краснов и др., 2009]. Суммируя полученные результаты можно заключить, что мишенью действия СМГТБ являются ткани мезенхимного происхождения. В таком случае вероятно предположение о том, что, по сути, он действует как регулятор гомеостаза соединительной ткани. Дальнейшие исследования показали, что состояния С-МГТБ в сыворотках взрослых особей теплокровных животных (птиц и млекопитающих) и эмбрионов различаются. В постнатальном периоде С-МГТБ присутствует в неактивном состоянии в сыворотке крови, вследствие его взаимодействия с белком-модулятором; в то время как в первые две трети эмбриогенеза С-МГТБ присутствует в активной форме [Ямскова, Резникова, 1991]. Согласно литературным данным, некоторые биологически активные пептиды, к примеру, цитокины, также взаимодействуют с белками сыворотки крови, что влияет на их активность, например, инсулиноподобные факторы роста связываются с сывороточными высокомолекулярными белками, и для их действия требуется создание диссоциирующих условий [Pierson et al., 1972; Uthne et al., 1973]. Было показано, что в условиях насыщенного раствора соли (сульфата аммония) СМГТБ остается в растворенном состоянии, а белок-модулятор переходит в осадок. При этом С-МГТБ становится биологически активным, но после взаимодействия с белкоммодулятором в присутствии ионов Са2+ снова переходит в неактивное состояние. Значительную роль при образовании комплекса «С-МГТБ-модулятор», кроме ионов Са2+, играет углеводная компонента С-МГТБ. Методом аффинной хроматографии установлено, что в основе взаимодействия С-МГТБ и белка-модулятора лежит белок-углеводное взаимодействие. Роль лектина, узнающего N-олигоманнозидную цепь биорегулятора, выполняет белок-модулятор [Ямскова, Рыбакова и др., 2004; Yamskova et al., 2007; Рыбакова, Виноградов и др., 2000]. В последующих работах из сыворотки крови крупного рогатого скота выделили модулятор С-МГТБ, который был очищен и охарактеризован. Модулятор С-МГТБ представлял собой кислый белок со значением изоэлектрической точки при рН 3,9 с молекулярной массой 67 000 Да. Первичная структура данного белка проявляла высокую степень гомологии с сывороточным альбумином быка. Однако по данным секвенирования, его N-концевой домен структурно отличался от такого у бычьего сывороточного альбумина. Авторами было выдвинуто предположение о том, что белокмодулятор представляет собой одну из ранее неизученных изоформ сывороточного преальбумина [Ямскова, Рыбакова и др., 2004]. Поскольку ионы Са2+ играют 20 значительную роль в образовании комплекса «С-МГТБ-модулятор» было проведено исследование влияния Са2+-хелатирующих агентов (ЭДТА, ЭГТА), а также ионной силы раствора на устойчивость комплекса [Ямскова, Резникова др., 1991]. Было показано, что оба фактора играют существенную роль в образовании комплекса. Белок-модулятор обратимо ингибирует С-МГТБ: путем взаимодействия исходных компонентов комплекс может быть восстановлен, при этом он вновь не обладал биологической активностью [Ямскова, Рыбакова и др., 2004]. Методом кругового дихроизма было установлено, что при образовании комплекса в молекуле белка-модулятора наблюдались конформационные изменения [Yamskova, Rybakova и др., 2007]. На сегодняшний день остается неизвестным механизм перехода С-МГТБ в неактивное состояние на стадии позднего плодного развития. Выдвинуто несколько предположений. Вероятно, что на поздних стадиях эмбриогенеза начитается синтез белка-модулятора, который образует комплекс с С-МГТБ. В пользу этого предположения свидетельствуют данные о том, что синтез альбуминов начинается на поздних стадиях эмбриогенеза и на протяжении всего постнатального периода они являются основными белками сыворотки. Согласно другому предположению, возможна модификация С-МГТБ на последних этапах эмбриогенеза, в результате которой находящимся в сыворотке крови он оказывается способным связываться с белком-модулятором. Данное предположение коррелирует с литературными данными, которые были получены при исследовании NCAM, участвующего в клеточной адгезии и дифференцировке в тканях нейрального происхождения. Показано, что «эмбриональная» форма N-CAM отличается от «взрослой» только количеством остатков сиаловых кислот в определенном гликозидном домене молекулы этого гликопротеина. Вероятно, что взаимодействие С-МГТБ с белкоммодулятором является своеобразным механизмом регуляции его биологической активности в развитии. Подобный механизм был установлен для некоторых цитокинов, функционирование которых в организме находится под контролем растворимых (циркулирующих в крови) рецепторов, антагонистов рецепторов, а также других связывающих цитокины белков, которые полностью могут блокировать их биологическую активность [Fernandez-Botran, 1991; Gordon, 1991]. Таким образом, в сыворотке крови различных позвоночных животных был обнаружен новый биорегулятор, который в СМД оказывал влияние на миграцию и пролиферацию клеток мезенхимного происхождения, проявлял выраженное ранозаживляющее действие, способствуя восстановлению нормальной структуры тканей (кожа, роговица глаза). Результаты исследования С-МГТБ указывают на сложный состав биорегулятора, в который входят биологически активные пептиды и белки, модулирующие их активность, 21 а также липиды и углеводы. В следующей главе литературного обзора будут представлены результаты исследования биорегуляторов, выделенных из других тканей млекопитающих. 1.1.3. Биорегуляторы, выделенные из различных тканей млекопитающих Кроме С-МГТБ также активно были изучены биорегуляторы, выделенные из тканей глаза. Ткани глаза являются уникальными объектами для изучения таких процессов как, пролиферация, миграция, дифференцировка клеток, апоптоз. Уникальность этих объектов заключается в возможности их микрохирургического выделения на любой стадии развития. Весьма перспективным представлялось изучение адгезивных молекул именно на этих объектах. В этом аспекте следует отметить результаты многолетних исследований, проведенных на тканях куриного эмбриона. Была разработана модель агрегации клеток сетчатки, а из этой ткани был впервые выделен адгезивный белок – рекогнин [Moscona et al., 1952, 1961; 1963; 1968]. Изучая агрегацию клеток куриных и мышиных эмбрионов, показано, что клеточная агрегация имеет тканеспецифичный, но не видоспецифичный характер. Кроме того, было продемонстрировано, что клеточная агрегация влияет на процессы дифференцировки, а именно клетки сетчатки в состоянии агрегатов были способны дифференцироваться в линтоиды [Hausman et al., 1975]. Позже на модели агрегации клеток сетчатки куриных эмбрионов было показано, что на первом этапе этого процесса образуются небольшие первичные агрегаты, которые затем объединяются в достаточно крупные ассоциаты, содержащие сотни клеток [Дольникова и др., 1985а; 1985б; 1986]. Выделенные из сетчатки куриных эмбрионов молекулы адгезии представляли собой кислые белки, которые ускоряли как первую, так и вторую стадии процесса агрегации. Адгезивные белки, выделенные из эмбриональной сетчатки, обладали тканевой специфичностью: они не влияли на агрегацию клеток печени куриного эмбриона. В то же время тканевая специфичность полученных фракций носила довольно относительный характер: эти белки ускоряли агрегацию клеток пигментного эпителия в суспензии. Следует отметить, что и адгезивные молекулы, обнаруженные в пигментном эпителии глаза куриного эмбриона, также ускоряли агрегацию не только клеток пигментного эпителия, но и клеток сетчатки. Авторы данного исследования объясняли полученные результаты общим происхождением исследуемых тканей глаза из общего зачатка и тесно связанных функционально [Дольникова и др., 1986; 1987; 1988; 1990]. Интересно, что для данных адгезивных белков было выявлено отсутствие возрастной специфичности. Так, например, экстракты сетчатки 8-суточных эмбрионов ускоряли агрегацию клеток сетчатки 8-ми и 15-суточных зародышей, а экстракты сетчатки 22 15-суточных эмбрионов в свою очередь также ускоряли агрегацию клеток 8-ми и 15-ти суточных зародышей [Дольникова и др., 1986]. В этих экспериментальных сериях было также продемонстрировано, что адгезивные белки, выделенные из сетчатки куриных эмбрионов, подавляли пролиферативную активность клеток сетчатки в суспензионных культурах [Дольникова и др., 1985в]. Важно отметить, что все эти исследования были проведены с использованием протеолитических ферментов, в том числе и выделение адгезивных белков. Поэтому интерпретация результатов, касающихся специфичности биологического действия адгезивных белков, выделенных из тканей куриного эмбриона, нуждается в уточнении. Следующий этап исследования данных объектов был проведен с применением экспериментального подхода, разработанного к исследованию МГТБ, а именно, при получении биорегуляторов исключалось применение ферментов [Краснов и др., 2003а]. В данных исследованиях была продемонстрирована возрастная специфичность адгезивных молекул, выделенных из сетчатки глаза куриных эмбрионов на разных стадиях развития: биологической активностью обладали только адгезивные белки, выделенные из ткани 8дневных, но не 19-дневных эмбрионов [Krasnov et al., 2003а]. Предполагалось, что в сетчатке в развитии происходит изменение адгезивных систем, которое обусловлено изменением статуса дифференцировки клеток. Модель клеточной агрегации оказалась не применима для исследования активности адгезивных молекул, выделенных из тканей взрослых особей. Ряд исследователей для идентификации адгезивных белков применяли иммунохимические методы, в основе которых лежало выделение молекул адгезии с помощью антител [Anderson, 1990; Riechardt, 1993]. Другими исследователями для изучения специфической активности адгезивных белков были разработаны новые модели, в частности, культивирование сетчатки в составе заднего отдела глазного бокала [Краснов и др., 2003а]. В данной работе удалось продемонстрировать влияние белков, выделенных из сетчатки и ПЭ глаза быка, на адгезию клеток этих тканей. Кроме того, было продемонстрировано протекторное действие данных веществ на данные ткани глаза, выражающееся в поддержании структуры тканей и увеличении жизнеспособности клеток. Также было показано наличие тканеспецифического, но отсутствие видоспецифического характера их биологического действия. Результаты этих исследований продемонстрировали влияние изучаемых веществ не только на адгезию клеток, но и на процессы регуляции. Это позволило авторам назвать изучаемые вещества «тонкими настройщиками» органно-тканевого гомеостаза [Краснов и др., 2003а]. После этого исследования адгезивные молекулы, получаемые с 23 помощью данного экспериментального подхода, были выделены в отдельную группу мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов. Биорегуляторы данной группы далее были обнаружены практически во всех структурах глаза - роговице, хрусталике, ПЭ, сетчатке, радужке, стекловидном и цилиарном теле, склере [Ямскова, Скрипникова и др., 2009; Краснов, Гурмизов и др., 2005; Маргасюк, Краснов и др., 2005; Краснов, Гурмизов и др., 2006; Краснов, Гурмизов, Ямскова и др., 2005; Krasnov et al., 2007; Margasyuk et al., 2007; Скрипникова и др., 2007]. В качестве примеров можно привести следующие данные. Отдельное крупное исследование было проведено на биорегуляторе, выделенном из роговицы глаза быка. Изучали его влияние на активацию клеточных источников регенерации в роговицах позвоночных животных (тритон и крыса) in vitro. Культивирование роговиц осуществляли двумя способами: при постоянном вращении - роллерный и на подложке – стационарный тип культивирования. Причем культивировали роговицы, как с областью лимба, так и без области лимба. Оценку состояния роговицы в данном исследовании проводили по таким параметрам как относительная толщина эпителия, количество слоев клеток эпителия, а также толщина стромы, поскольку данные параметры позволяют оценить уровень гидратации стромы, приводящей к нарушению барьерной функции эндотелия роговицы. Результаты исследования, проведенного на роговице глаза крысы, показало, что только в случае роллерного культивирования роговицы без области лимба отмечалось увеличение эпителиальных слоев клеток. Во всех остальных экспериментальных сериях при воздействии биорегулятора в роговице крысы не было обнаружено изменений, отличных от контроля. Иные результаты были получены при исследовании роговиц тритона: во всех экспериментальных сериях отмечался протекторный эффект, оказываемый на ткань биорегулятором, который выражался в поддержании адгезионных межклеточных взаимодействий между эпителием, стромой, сохранении клеток эндотелия, уменьшении толщины стромы, стимуляции пролиферации эпителиальных клеток. Особенно ярким было действие биорегулятора на роговицу тритона с областью лимба, которую культивировали роллерным способом. Полученные данные показывают, что биорегулятор, выделенный из роговицы глаза быка, проявляет протекторное действие в СМД, очевидно, дополнительно стимулируя клеточные источники регенерации в ткани. Результаты этого исследования еще раз продемонстрировали различия в способности к регенерации тканей млекопитающих и амфибий. В связи с этим модель органотипического культивирования тканей хвостатых амфибий является весьма перспективной для исследования действия биологически 24 активных веществ, активность которых характеризуется наличием тканевой, но отсутствием видовой специфичности. Также обращает внимание принципиально отличающиеся друг от друга результаты, полученные при роллерном и стационарном типах культивирования. В этом исследовании еще раз было показано, что отсутствие адгезионного сигнала со стороны подложки на ткань является фактором дополнительного активирования клеточных источников регенерации [Краснов и др., 2003б]. Выводы, сделанные по результатам данного исследования, были использованы далее при изучении МГТБ, выделенных из других тканей. Например, при исследовании биорегулятора, выделенного из склеры глаза быка, в СМД были использованы несколько экспериментальных моделей: ранее разработанная модель стационарного культивирования заднего отдела глаза тритона, а также вновь разработанные роллерные культуры целого глаза и ткани склеры тритонов. Выраженное протекторное действие биорегулятора отмечалось на модели роллерного культивирования целого глаза. В этом случае наблюдали поддержание жизнеспособности и численности фибробластов. Менее выраженный эффект биорегулятора был отмечен на модели культивирования заднего отдела глаза тритона, а также на культуре ткани склеры, в которой при действии биорегулятора отмечалось сохранение компактного пространственного расположения коллагеновых волокон [Скрипникова и др., 2009]. Модель роллерного органотипического культивирования тканей хвостатых амфибий была также использована для исследования биорегуляторов, выделенных, соответственно, из печени, желчи и сыворотки крови млекопитающих. Они были изучены как биологически активные вещества, имеющие единый источник выделения – печень млекопитающих. Биорегулятор, увеличению количества выделенный из печени, в СМД способствовал меланомакрофагов, которые в печени тритона выполняют защитную функцию подобно купферовским клеткам млекопитающих. Биорегулятор, выделенный из сыворотки крови млекопитающих, стимулировал митозы в кроветворных клетках, но не культивирования митотической оказывал влияния биорегулятора, активности на меланомакрофаги. выделенного клеток из кроветворения желчи, и Добавление в среду вызывало уменьшение уменьшение количества меланомакрофагов в печени тритона. Таким образом, несмотря на то, что все три биорегулятора были получены из одного источника – ткани печени млекопитающего, было продемонстрировано их различное специфическое действие. На модели роллерного культивирования простаты мыши было показано, что биорегулятор, выделенный из предстательной железы быка, оказывал протекторное действие на ткань железы, которое выражалось в поддержании функции секретирующих 25 желез, жизнеспособности железистых клеток и поддержании целостности структуры ткани. Полученные в проведенных исследованиях результаты показали не только способность биорегуляторов, выделенных из тканей млекопитающих, оказывать тканеспецифическое протекторное действие, но и продемонстрировали эффективность экспериментальных моделей роллерного органотипического культивирования тканей амфибий для изучения специфической активности МГТБ. Однако, использование ранее разработанных моделей, например, таких как культивирование целых хрусталиков глаз позвоночных in vitro позволило также показать биологическое действие биорегуляторов данной группы. Изучение действия биорегулятора, выделенного из хрусталика глаза быка, проводили на культурах целых хрусталиков ряда позвоночных животных. Помутнение хрусталика вызывали двумя способами: изменением в культуральной среде концентрации ионов Са2+ (модель катарактогенеза, вызванного нарушением работы Са-зависимых ферментных систем) и добавлением пероксида водорода (модель катарактогенеза, вызвынного нарушением процессов перекисного окисления липидов). Было показано, что биорегулятор, выделенный из хрусталика, в СМД оказывал протекторное действие, которое выражалось в поддержании упорядоченности волокон кортикального и ядерного слоев и сохранении прозрачности хрусталика. Результаты данного исследования демонстрируют способность биорегулятора препятствовать катарактогенезу in vitro. Таким образом, установлено, что в различных тканях млекопитающих присутствует уникальная по своим физико-химическим свойствам и биологическому действию ранее неизвестная группа биорегуляторов, действующих в СМД. В связи с вышеизложенным представлялось важным выяснение вопроса о присутствии биорегуляторов данной группы в тканях разлчных растений. Следующий раздел посвящен описанию характеристик выбранных объектов. 1.2. Характеристика объектов, использованных для выделения биорегуляторов Подорожник большой (Plantago major L.) – многолетнее травянистое растение, вид рода Подорожник, семейства Подорожниковые (Plantaginaceae). В России распространён повсеместно, кроме Крайнего Севера. Подорожник большой представляет собой многолетнее травянистое растение. Обладает коротким корневищем, усаженным тонкими нитевидными корнями. Листья собраны в прикорневую розетку, черешковые, широковальной формы. Черешки равны по длине пластинке листа, длиннее её или редко короче. Цветоносы прямостоячие, при основании восходящие, высотой 15—45 см, тонкобороздчатые, заканчивающиеся длинным цилиндрическим соцветием — колосом. 26 Цветки мелкие четырёхчленные, чашелистики по краям плёнчатые, венчик светлобуроватый. Четыре тычинки вдвое длиннее трубки венчика, их нити белые, пыльники — тёмно-лиловые. Цветёт с мая—июня (на севере) до августа—сентября. Плод представлен многосемянной коробочка [Чухно и др., 2007]. Лук репчатый (Allium cepa L.) - многолетнее травянистое растение, вид рода Лук (Allium), семейства Луковые (Alliaceae). Луковица плёнчатая, в размере достигает до 15 см в диаметре. Наружные чешуи сухие, жёлтые, реже фиолетовые или белые; внутренние — мясистые, белые, зеленоватые или фиолетовые, расположены на укороченном стебле, называемом донцем. На донце в пазухах сочных чешуек находятся почки, дающие начало дочерним луковицам, образующим «гнездо» из нескольких луковиц. Листья лука репчатого трубчатые, сизо-зелёные. Цветочная стрелка до 1,5 м высотой, полая, вздутая, оканчивается многоцветковым зонтиковым соцветием. Цветки расположены на длинных цветоножках. Околоцветник зеленовато-белый, до 1 см в диаметре, из шести листочков, тычинок; пестик с верхней трёхгнездной завязью. Иногда в соцветии кроме цветков образуются мелкие луковички. Плод представляет собой коробочку, содержащую до шести семян. Семена чёрные, трёхгранные, морщинистые, мелкие. Цветёт лук репчатый в июне—июле. Плоды созревают в августе [Чухно и др., 2007]. Чеснок (Allium sativum L.) – двулетнее травянистое растение, вид рода Лук (Allium), семейства Луковые (Alliaceae). Листья плоские, линейные, ланцетовидные, вытянутые, сантиметровой ширины, заостренные к концу, цельнокрайние, в длину достигают 30-100 см. Каждый последующий лист прорастает изнутри предыдущего, тем самым образуя ложный стебель, более прочный, чем у лука репчатого. Цветонос достигает длины до 1,5 м, до цветения на конце закручивается в спираль и заканчивается соцветием в виде зонтика. Соцветие представляет собой простой шаровидный зонтик, состоящий из стерильных белых и беловато-розовых цветков, воздушных размножающихся луковицбульбочек и плотного покрывала. Плод имеет форму коробочки, семян чеснок не образует. Корневая система чеснока мочковатая. Луковица сложная, состоит из 2-50 зубков, каждый из которых покрыт жесткой кожистой чешуей. Луковицы могут быть белые, желтоватые, розово-фиолетовые, а также темно-фиолетовые. В диком виде чеснок встречается в горах Средней Азии, на Ю. Казахстана, на Кавказе, в Индии, в странах Средиземноморья. В культуре - в Европе, Азии, Северной и Южной Америке, тропических районах Африки, Австралии; в России [Чухно и др., 2007]. Укроп пахучий (Anethum graveolens L.) - монотипный род короткоживущих однолетних травянистых растений семейства Зонтичные. Стебель одиночный, прямой, ветвистый или почти простой, высотой 40—120 см, тонко бороздчатый, неопушенный, 27 тёмно-зелёный, в верхней части ветвистый, между ветвями изогнутый. Листья триждычетырежды перистые, яйцевидные, дольки последнего порядка линейно-нитевидные или щетиновидные. Нижние листья располагаются на черешках, расширенных в продолговатое влагалище длиной 1,5—2 см; верхние листья сидячие, влагалищные. Зонтики крупные, диаметром до 15 см, 20—50-лучевые. Цветки собраны в небольшие зонтики диаметром 2-9 см. Зубцы чашечки короткие, лепестки желтые, подстолбие светло-желтое, столбики очень короткие, во время цветения прямые. Семена яйцевидные или широкоэллиптические, 3—5 мм в длину и 1,5—3,5 мм в толщину. Цветёт в июне— июле. Плоды созревают в июле—августе [Чухно и др., 2007] . Лимон (Citrus limon L.) – плод гибридного вида деревьев из рода Цитрус (Citrus), семейства Рутовые (Rutacea). Плод длиной 6-9 см, диаметром 4-6 см, овальной формы, к обоим концам суженный, с соском на верхушке, светло-желтый, с трудно отделяющейся бугорчатой или ямчатой коркой, содержащей множество железок с эфирным маслом. Внутренняя часть плода с несколькими гнездами. Семена яйцевидные, желто-зеленые или белые, в разрезе зеленоватые. Плоды созревают осенью [Чухно и др., 2007]. Алоэ древовидное (Aloe arborescens M.) - растение рода Алоэ, семейства Асфоделовые. Представляет собой низко и сильно ветвящееся деревце или кустарник, высотой 2-5 м, с мочковатым, сильно разветвленным корнем. Стебель прямостоячий, ветвистый, с толщиной ствола до 30 см. Листья голубовато-зеленого цвета, гладкие, матовые, линейно-ланцетные с шиповато-острозубчатым краем, образуют густые розетки диаметром до 80 см. В листьях и соке алоэ содержатся ферменты, витамины, фитонциды, алоин, наталоин, рабарберон, гомонаталаин, эмодин, смолистые вещества и следы эфирных масел [Чухно и др., 2007]. Кориандр посевной (Coriandrum sativum L.) – однолетнее травянистое растение семейства Зонтичные (Apiaceae). Стебель у кориандра прямостоящий, голый, высотой до 40-70 см, разветвленный в верхней части. Прикорневые листья широколопастные, крупно рассеченые, с широкими дольками и длинными черешками [Чухно и др., 2007]. На сегодняшний день, согласно литературным данным, в вышеописанных растениях были обнаружены различного класса биологически активные вещества, о которых более подробно рассказывается в следующем разделе настоящей работы. 1.3. Химический состав объектов исследования Углеводы. Луковицы лука содержат 8-14% сахаров (фруктоза, сахароза, мальтоза, полисахарид инулин). В семенах подорожника установлено наличие свободных углеводов 28 [Ahmed et al., 1965]. Внешняя оболочка семян содержит полисахариды, набухающие в присутствии воды и образующие высоковязкие слизистые растворы. Исследования свободных углеводов показали присутствие глюкозы, фруктозы, ксилозы, гиалуроновой кислоты и ее олигомеров [Chatterton et al., 1990; Оленников и др., 2006]. Исследованы фракции полисахаридов, растворимые в воде и ДМСО [Samuelsen et al., 1995]. Количественный анализ фракций после разделения последних c применением ионообменной хроматографии показал, что нейтральные компоненты представлены глюкоманнанами. Кислые фракции являются смесью арабиногалактанов и галактуронанов [Samuelsen et al., 1998]. Липиды. В укропе содержится 15—18 % жирного масла: петрозелиновая кислота, олеиновая кислота, пальмитиновая кислота и линолевая кислота. Из семян подорожника были выделены жирные кислоты, свободные и после гидролиза триглицеридов. Установлено, что около 65% жирных кислот являются ненасыщенными (олеиновая 18:1 – 37,4%, линолевая 18:2 – 25,3%) [Миронов и др., 1983; Ahmed et al., 1967; Swaitek et al., 1980]. Арахидоновая кислота, выделенная из семян этого вида, в других представителях Plantago обнаружена не была. Основное количество жирных кислот присутствует именно в семенах. Позже было показано присутствие 9-гидрокси-цис-11-октадеценоевой, являющейся изомером рицинолевой кислоты [Ahmad et al., 1980]. Из свежих листьев была выделена сумма липидов (0,18%); ненасыщенные жирные кислоты типов 18:3ω3 и 18:2ω6, а также насыщенные производные пальмитиновой кислоты, являющиеся основными компонентами (33,3, 11,2 и 15,9%, соответственно) [Guil et al., 1996]. Основные компоненты листового воска – тритерпеновые кислоты (олеаноловая – 14% и усоловая – 44%) и линейные алканы С27Н56-С33Н58 [Bakker et al., 1998]. Органические кислоты. Кислотный комплекс листьев подорожника представлен следующими компонентами: фумаровая [Pailer et al., 1969], щавелевая (31–103 мг%), винная (1,60–1,87%), лимонная (1,22–1,53%), яблочная (0,20–0,51%), малоновая (0,11– 0,35%) и янтарная кислоты (0,25–0,55%) [Оленников и др., 2005]. Суммарное содержание органических кислот составляет 10–12%, из которых до 60% приходится на связанные кислоты. Установлено, что доминирующими компонентами комплекса являются винная и лимонная кислоты. Фенольные кислоты. При изучении состава органических кислот листьев подорожника, были выделены фумаровая, сиреневая, ванилиновая, п-гидроксибензойная, феруловая, п-кумаровая, гентизиновая, салициловая, бензойная, коричная кислоты, этиловый эфиры [Bakker et al., 1998], а также хлорогеновая и неохлорогеновая кислоты. Основными соединениями этой группы являются такие фенилэтаноидные производные, 29 как изомерные плантамайозид и изоплантамайозид, а также актеозид (ацетозид, вербаскозид) [Максютина, 1971]. Флавоноиды. Из листьев подорожника большого, например, разными исследователями было выделено 15 соединений этого класса. Все они являются производными флавона. Первыми соединениями были байкалеин и скутелляреин [Ahmad et al., 1980]. Были исследованы 26 видов Plantago L. [Harborne et al., 1971] на наличие производных 6-оксилютеолина и скутелляреина, и в отличие от последнего 6оксилютеолин в подорожнике обнаружен не был. Гликозиды. В луковицах лука был идентифицирован достаточно широкий ряд моногликозидов, дигликозидов и комплекс полигликозидов [Harborne et al., 1999]. Среди них можно выделить кверцетин и его гликозилированное производное [Hollman et al., 1997]. Из подорожника выделено 8 иридоидных гликозидов, 3 из которых являются «необычными» – содержат 8,9-ненасыщенную связь, что встречается довольно редко: майорозид, 10-гидроксимайорозид и 10-ацетоксимайорозид [Taskova et al., 1999]. Основным иридоидным гликозидом листьев подорожника считается аукубин, но его содержание сильно варьирует в процессе вегетации; наибольшее его содержание отмечается в летних образцах сырья (1,3%) [Long et al., 1995]. Соединения разных классов. В листьях подорожника установлено присутствие и количественное содержание аспарагиновой кислоты, аланина, гистидина, лизина, лейцина, серина [Оленников и др., 2005]. Также было показано, что извлечения из листьев дают положительные реакции на алкалоиды [Максютин, 1972]. Установлено [Noro et al., 1991] присутствие двух веществ: индикаина и плантагонина. Общее содержание алкалоидов в растении составляет 0,1%. Выделены аллантоин и холин [Skari et al., 1999]. Эфирные масла содержатся в луковицах чеснока и лука. Основным компонентом эфирного масла укропа является D-карвон, также имеются D-лимонен, α-фелландрен, αпинен, дипентен, дигидрокарвон. Следует отметить, что растения способны вырабатывать ряд веществ, проявляющих по отношению к самому растению регуляторные функции, так называемые, фитогормоны, или биорегуляторы. Они принимают огромное участие в регуляции жизнедеятельности растения. 1.4. Известные биорегуляторы растительного происхождения Фитогормоны являются общими биорегуляторами для всех растений. К растительным гормонам, или фитогормонам, относятся, например, гиббереллины, ауксины, цитокинины, абсцизовая кислоту, этилен, брассиностероиды. Они 30 синтезируются в активно делящихся клетках меристемы (верхушке побега, кончике корня, молодых листьях и семенах) [Малиновский, 2004]. Ауксины представляют собой группу природных соединений, стимулирующих клеточное деление, корнеобразование, дыхание и синтез белка в растениях. Главным представителем ауксинов является индолилуксусная кислота, которая впервые была выделена в 1931 году Ф. Кеглем из мочи вегетарианцев, и лишь позднее была обнаружена в растениях. Сегодня ауксины и различные их синтетические аналоги широко применяются в растениеводстве [Полевой, 1989]. Гиббереллины представляют собой тетрациклические моно-, ди- и трикарбоновые кислоты дитерпеноидной природы. Их выделяют практически из всех частей растений, их запасные и траспортные формы представляют собой гликозиды и комплексы с белками. Синтезируются гиббереллины в корнях, верхушчатых стебелевых почках и в развивающихся семенах. Гибберелины применяют с целью эффективного стимулирования роста стебля, увеличения размеров плодов, изменения формы и величины цветка, ускорения прорастания семян и т.д. Следует отметить, что стимулирующий эффект гиббереллинов снимается синтетическими соединениями – ретардантами. Они нарушают биосинтез гиббереллинов, способствуя образованию короткостебельных растений. Наиболее известный представитель данного класса соединений – хлорхолинхорид (хлормекват) [Полевой, 1989;Малиновский, 2004]. Цитокины представляют собой вещества, стимулирующие клеточное деление. Первый растительный цитокин – зеатин – был выделен из кукурузы Д.С. Летамом в 1964 году. Цитокины являются N6- производными аденина. Они входят в качестве одной из составных частей в структуры некоторых транспортных РНК растений (сериновой и тирозиновой). Цитокины применяют для ускорения прорастания семян, стимуляции роста почек и плодов, задержки процессов увядания, так как они принимают участие в процессах роста и дифференциации клеток. Абсцизовая кислота является высокоспецифичным эндогенным ингибитором высших растений. Впервые выделена в 1963 году из молодых плодов хлопчатника. Позже был выделен целый ряд родственных соединений, среди которых наиболее известен ксантоксин. Абсцизовая кислота переводит растения в состояние покоя. Ее количество резко возрастает при созревании плодов, она способствует опадению листьев и плодов, увяданию. Абсцизовая кислоты обладает свойством влиять на устьичный аппарат растений, поэтому при обработке ею растений происходит закрытие устьичного аппарата, что способствует более эффективному противостоянию растения засухе. Таким образом , 31 можно заключить, что абсцизовая кислота выступает как антагонист гиббереллинов, а цитокины, в свою очередь, ослабляет ее действие [Полевой, 1989]. Этилен обладает всеми свойствами истинных фитогормонов. Он образуется во фруктах из S-аденозилметионина. Этилен регулирует старение различных органов растений, способствует ускорению опадения листьев, дозреванию плодов, тормозит рост корней, побегов. В связи с этим на практике этилен используется для ускорения дозревания фруктов и увеличения их сахаристости. Брассиностероиды содержатся в разных органах растений, но особенно много их в пыльце. Они стимулируют рост в длину и толщину проростков, усиливая как деление, так и растяжение клеток [Полевой, 1989;Малиновский, 2004]. Существует также ряд стимуляторов и ингибиторов роста растений, выделенный из них или паразитирующих на них микроорганизмов. К числу стимуляторов роста относятся, например, триаконтанол – высший спирт, обнаруженный в люцерне, дигидроконифериловый спирт и фузикокцин, обладающие действием сходным с таковым у гиббереллинов. Природные ингибиторы роста в короткий срок приводят растение в состояние покоя и сдерживают прорастание семян. Среди ингибиторов можно выделить бабатасины, выделенные из зимующих почек диоскореи, а также подолвектон. Также следует отметить, что некоторые защитные вещества синтезируются в растениях только в ответ на поражение – стрессовые метаболиты, или фитоалексины. Систему выработки алексинов растениями иногда называют иммунной системой растений. Например, фитоалексин картофеля – решетин [Малиновский, 2004]. Важно отметить, что в качестве объектов данного исследования были выбраны растения, обладающие определенными лекарственным свойствами, которые используются человечеством на протяжении многих лет. Краткий обзор того, каким же действием обладают растения – объекты исследования, приводится ниже. 1.5. Действие различных препаратов растительного происхождения Лекарственные свойства растений известны человечеству достаточно давно. Различным путем полученные из растений экстракты, а также растения в их первозданном виде применялись для лечения и профилактики различных заболеваний. Именно на основе этих знаний были подобраны растительные объекты для данной работы. Издавна известно, например, что препараты из листьев подорожника обладают многосторонним целебным действием. Прежде всего, его применяют как ранозаживляющее и противовоспалительное средство [Оленников и др., 2005]. 32 Препараты, созданные на основе лука, используют как противовирусное средство, при различных заболеваниях кишечника, а также при склерозе и склеротической форме гипертонии. Исследования показали, что водные экстракты лука (Allium cepa), проявляют противогрибковую активность в отношении Malasseziafurfur (25 видов), Candidaalbicans (18 видов) и других представителей рода Candida (12 видов), а также к 35 разновидностям дерматофита [Masoomeh et al., 2006]. В отдельном исследовании был выделен ряд полипептидов из корней лука. Были изучены меристемная ткань корня и сформировавшиеся клетки. Показано, что полипептиды, синтезирующиеся с высокой скоростью в меристемных тканях присутствуют в сформировавшихся лишь в следовых количествах. Однако вместе с тем показано, что в сформировавшихся тканях в больших количествах присутствуют свои полипептиды [Matilde et al., 1978]. Препараты, полученные на основе луковиц чеснока, оказывают противовирусное действие, помогают при борьбе с ленточными червями. Настои и спиртовые вытяжки из чеснока применяют для усиления двигательной и секреторной функции желудочнокишечного тракта. Внутреннее применение препаратов на основе чеснока также способствует подавлению процессов гниения и брожения в кишечнике (при атонии кишечника и колитах), а также при гипертонии и атеросклерозе [Aslani et al., 2006]. Препараты, полученные из чеснока, также способствовали снижению уровню холестерина в крови [Olimo, Aminov, 2011]. Некоторые исследования демонстрируют противораковое действие чесночных препаратов [Olimo, Aminov, 2011]. Весьма актуальным является вопрос о том, какое же вещество в чесноке является причиной аллергической реакции у некоторых потребляющих его людей. Были проведены исследования, которые показали, что в состав чеснока помимо всех прочих веществ входит фермент аллинлиаза. Аллинлиаза, связываясь с иммуноглобулинами G и E, образует комплекс, который является причиной аллергической реакции. Методом MALDI-TOF масс-спектрометрии было показано, что молекулярная масса аллинлиазы составила 56 000 Да. Также установлено, что фермент имеет четыре N- гликозилированных сайта и способен образовывать комплекс с лектином чеснока, специфическим по маннозе. Водные экстракты, полученные из чеснока (Allium sativum), также проявляют противогрибковую активность [Masoomeh et al., 2006]. Из экстракта чеснока также были выделены три белковых компоненты молекулярной массы порядка 13 000 Да (QR-1, QR-2, QR-3 в соотношении 7:28:1). Все три белковых компоненты проявляли митогенную активность по отношению к периферическим лимфоцитам человека, к мышиным селезеночным макрофагам и тимоцитам. Среди всех трех иммуномодуляторов наибольшую митогенную активность проявлял иммуномодулятор 33 QR-2. QR-1 и QR-3 в свою очередь же демонстрировали гемагглютитинационную и манноз-связывающую активность; QR-2 проявлял только манноз-связывающую активность [Clement et al., 2010]. Некоторые исследователи считают, что именно флавоноиды играют существенную роль в проявлении данным растением той или иной биологической активности [BenaventeGarcı´a et al., 1997]. Флавоноиды выполняют такие биологические функции, как антиоксидантная, противовоспалительная, противоаллергическая, противовирусная и ряд других. Среди флавоноидов, содержащихся в лимоне, наиболее часто выделяют геспередин, диосмин и эриоцитрин. Гесперидин представляет собой флавоноид, влияющий на сосудистую проницаемость, он способствует повышению устойчивости капилляров, а также обладает анальгетическим и противовоспалительным действием, является эффективным антиоксидантом [Berkarda et al., флавоноидом Цитрусовых является диосмин. В фармакологии 1998]. Обязательным в качестве активной компоненты, он входит в состав ряда лекарств, применяющихся при лечении различных болезней кровеносной системы. Диосмин также способствует повышению мышечного тонуса и устойчивости антиоксидантные исследованиям, свойства самыми сосудов [Berqvist сильными при et воспалительных al., 1981]. антиоксидантными процессах, Однако, проявляет согласно свойствами другим среди всех флавоноидов, представленных в лимоне, обладает эриоцитрин, который используется в многочисленных мультивитаминных комплексах [Miyake et al., 1998]. Исследования показали, что в листьях алоэ помимо полисахаридов и различных биологически активных веществ, относящихся к алкалоидам, антрахинонам, сахаридам, ферментам, аминокислотам и т.д. содержатся еще и такие вещества как алоин и алоээмодин [Vogler et al., 1999; Eshun et al., 2004]. Алоэ-эмодин является природным активным соединением, обладающим рядом биологических активностей: антивирусной, противомикробной и гепатопротекторной [Reynolds et al., 1985; Eshu et al., 2004]. Алоээмодин проявляет также противораковую активность в случае нейроэктодермальных бластом, ороговевшей клеточной карциномы легких [Pecere et al., 2000]. Более того, алоээмодин проявляет противораковую активность цисплатина посредством блокировки активации сигнал-регулируемой киназы [Acevedo-Duncan et al., 2004]. Препараты, содержащие вещества, выделенные из алоэ, способны оказывать противовоспалительное действие на рану, ускорять восстановление поврежденных тканей кожи, а также ингибировать рост ряда бактерий: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae и Pseudomonas aeruginosa [Yimei Jia et al., 2008]. 34 Весьма интересным представляется эксперимент по изучению влияния компонентов, выделенных из алоэ, на организм животных, страдающих диабетом. Для этого у 5-ти недельных мышей моделировали диабет путем введения малых доз стрептозотоцина. Результаты эксперимента показали, что фракции, полученные из алоэ, способствовали понижению уровню глюкозы в крови [Hidehiko Beppu et al., 2006]. Ряд проведенных исследований показали, что в семенах укропа содержатся пептиды с молекулярной массой 4 000-8 000 Да [Yili et al., 2006]. Было показано, что выделенные пептиды обладают фунгицидной активностью в отношении растительного патогена Verticillium dahliae. Экстракты, полученные из кориандра проявляли антимикробную активность по отношению к грам-положительным (Staphylococcus aureus, Bacillusspp.) и к грамотрицательным бактериям (Escherichia coli, Salmonella typhi, Klebsiella pneumonia), а также противофунгицидную активность к Candida albicans [Matasyoh et al., 2009] . Было показано, что листья кориандра могут быть использованы при лечении диабета. Кориандр способствует нормализации уровня глюкозы в крови, а также выработке инсулина [Gray et al., 1998]. Спиртовые экстракты кориандра обладают гепатопротекторным действием [Pandey et al., 2011]. 1.6. Ткани высших растений Клетки высших растений, также как и клетки животных дифференцированы и организованы в ткани. Простые ткани сложены из однотипных клеток, а сложные ткани состоят из резко различающихся клеток нескольких типов, располагающихся в строго определенном сочетании друг с другом [Тимонин и др., 2007]. 1.6.1. Меристема Меристема, или группа образовательных тканей, отвечают за гистологическое разнообразие тела растения. Меристемы состоят из недиференцированнных, т.е. неспециализированных, клеток [Тимонин и др., 2007; Рейвн и др., 1990а]. Меристемы растения различаются строением своих клеток, локализацией, а также особенностями клеточного деления. На ранних стадиях развития зародыш высших растений состоит целиком из меристемы. Затем меристема, носящая название апикальной, сохраняется лишь в апексах побегов и корней. У семенных растений в стеблях и корнях имеются тангенциальные прослойки латеральных меристем – камбия и/или феллогена. Апикальная меристема листа ответственна за продольное нарастание листовой оси, а маргинальнуя меристема обусловливает начало развития пластинки листа. На основании того, что маргинальная и апикальные меристемы листа функционируют недолго, их можно назвать полумеристемами без инициалей. К полумеристемам относятся также 35 производные апикальной и маргинальной меристем – протодерма, прокамбий и основная меристема. По ориентации делений меристемных клеток различают: пластинчатые меристемы, состоящие из одного слоя клеток, колончатые меристемы, клетки которых делятся перегородками, массивные меристемы, в которых клеточные деления идут в разных плоскостях. Раневая меристема, представляющая собой феллоген, образуется при поранении вблизи поврежденного участка немеристемной ткани [Рейвн и др., 1990а]. 1.6.2. Постоянные ткани Постоянными называются ткани, образованные меристемами. Различают первичные ткани, образованные первичными меристемами, и вторичные, отложенные камбием и феллогеном. В связи с полифункциональностью постоянных тканей классифицировать их довольно сложно. Различают следующие 8 групп тканей: покровные, поглощающие, ассимилирующие, проводящие, механические, выделительные и секреторные, вентиляционные, запасающие. У высших растений встречаются также ткани, которые трудно классифицировать по их функциональности, такие ткани обозначают термином «основная паренхима». Покровные ткани. Эпидерма представляет собой комплексную первичную покровную ткань, сформированную как приспособление к защите от иссушения тела вследствие транспирации в наземных условиях. Эпидерма развивается из протодермы и практически всегда представлена одним слоем клеток на поверхности побега. Таким образом, эпидерма изоляцирует апопласт от внешней среды. Основные клетки эпидермы располагаются плотно. Эпидермальные клетки различаются не только у разных видов растений, но и на разных участках одного органа. Как правило, основные клетки эпидермы однотипные, но у некоторых видов они двух или трех типов. Экзодерма является первичной покровной тканью корня, которая дифференцируется из основной меристемы. Она играет роль внутренней пограничной ткани, регулирующей прохождение веществ внутрь корня. Экзодерма состоит из одного или нескольких слоев плотно сомкнутых живых клеток. После отмирания и разрушения поверхностной поглощающей ткани экзодерма оказывается снаружи корня и становится его покровной тканью. Таким образом, экзодерма приобретает функцию покровной ткани вторично, но ее следует относить к первичным покровным тканям, так как она возникает непосредственно из основной меристемы. Фелемма, являющаяся вторичной покровной тканью, продуцируется феллогеном (вторичной меристемой) формируется на стеблях и корнях многих растений. Состоит из одного слоя таблитчатых сильно вакуолизированных клеток. Фелемма образуется также вокруг ран [Рейвн и др., 1990а; 1990б]. 36 Фотосинтезирующая ткань. Как известно, у высших растений фотосинтетическая ассимиляция углерода происходит в хлоропластах в цикле Кальвина, который представляет собой сложную последовательность физико-химических процессов. Для его нормального осуществления необходимо поступление в хлоропласты световой энергии, СО2 и воды и выведение синтезированных углеводов и О2. Фотосинтезируют различные ткани, клетки которых содержат хлоропласты, но у большинства высших растений дифференцируется специализированная фотосинтезирующая ткань, называемая хлоренхимой. Хлоренхима расположена под эпидермой, где получает достаточное количество световой энергии. У некоторых растений между эпидермой и хлоренхимой находится один, редко несколько слоев бесцветных прозрачных клеток, хорошо пропускающих свет [Васильев, 1978]. Механические ткани. Специализированные механические ткани выработались у наземных высших растений в связи с необходимостью освоения приземного пространства. Повышенная прочность механических тканей обусловлена как тургорным давлением (гидроскелет), так и прочностью стенок. Вследствие этого различают два вида механических тканей: колленхиму и склеренхиму. Колленхима представляет собой первичную ткань побегов двудольных растений и некоторых однодольных. Она образуется в период активного роста стебля или листа из основной меристемы и состоит из живых клеток. Склеренхима является первичной механической тканью, характерной большинству семенных и споровых высших растений. Склеренхима дифференцируется из основной меристемы, в стеблях двудольных растений – из остаточной, а также из дифференицированных паренхимных клеток, претерпевающих склерификацию. Клетки склеренхимы бывают двух типов: волокна – длинные веретеновидные клетки, как правило, с острыми концами, склереиды – клетки разнообразных очертаний – округлые, удлиненные, ветвистые. Основной вклад в прочность склеренхимы полностью вносят стенки образованных ею клеток. Сформированная клеточная стенка лигнифицируется, после чего протопласт обычно отмирает. Благодаря лигнификации толстых клеточных стенок склеренхима обладает большой прочностью [Рейвн и др., 1990а; 1990б]. Ткани, поглощающие растворы. Ризодерма, или эпиблема представляет собой специализированную ткань поглощения растворов у высших растений, располагается на поверхности молодых участков корней. Ризодерма состоит из одного слоя плотно сомкнутых тонкостенных клеток. Ризодерма может иметь вид ровной поверхности, но у большинства растений ее клетки образуют длинные (до 8 мм) выросты – корневые волоски [Рейвн и др., 1990а]. 37 Проводящие ткани. Перемещение веществ в тканях осуществляется по механизму ближнего и дальнего транспорта. Из-за высоких сопротивлений транспорт, эффективный на расстояниях не более 200 мкм, называется ближним. Для передачи веществ на большие расстояния (дальний транспорт) требуются специализированные ткани. Они сильно различаются соответственно по типу транспортируемых веществ, но во всех случаях их функционирование основано на использовании тех же структур и принципов, которые служат для передвижения тех же веществ по системе ближнего транспорта. Система дальнего транспорта представляет собой цепочку капилляров – разгрузка и передача воды в апопласт других тканей. Ксилема является водопроводящей тканью большинства высших растений, проводящими элементами которой служат трахеида и/или сосуды, в совокупности называемые трахеальными элементами [Васильев, 1978]. Запасающие ткани. Запасающая паренхима представляет собой запасающую ткань, которая развивается как простая первичная ткань в разных частях растения, так и как компонент сложных вторичных тканей, таких как ксилема и флоэма. Запасающая паренхима всегда состоит из живых клеток с полным набором клеточных органелл и мелкими простыми порами в стенках. Для высших растений характерна крахмалоносная паренхима, резервирующая крахмал, в форме которого растения запасают углеводы. Отдельные виды высших растений запасают в семенах углеводы в форме гемицеллюлозы, откладываемой в клеточную стенку. Поэтому клетки запасающей паренхимы имеют очень тонкие стенки с глубокими поровыми каналами [Тимонин и др., 2007]. Основная паренхима. Значительный объем тела растения занимают клетки, не имеющие какой-либо четкой функциональной специфики. Как правило, это тонкостенные неодревеснившиеся клетки. Ткань, не обладающую ярко выраженной морфологофункциональной спецификой, называют основной паренхимой [Тимонин и др., 2007]. 1.7. Строение и биохимические особенности растительной клетки Растительная клетка состоит из клеточной стенки и протопласта. Протопласт представляет собой протоплазму индивидуальной клетки, в случае растительной клетки – это протоплазма, ограниченная клеточной стенкой [Тимонин и др., 2007] Клеточная стенка, толщиной несколько микрометров, ограничивает размер протопласта и предотвращает его разрыв за счет поглощения воды вакуолью. Клеточная стенка делящихся и растущих растяжением клеток называется первичной. Затем на первичную стенку после прекращения роста клетки на нее накладываются новые слои, и образуется прочная вторичная клеточная стенка [Полевой, 1989]. Согласно современным исследованиям, клеточная стенка растений, по аналогии с клетками тканей животных, 38 рассматривается как внеклеточный матрикс (ВКМ) растений. Так же, как и у животных, ВКМ представляет собой сложный структурный комплекс. Основной функцией ВКМ является обеспечение поддержки и прочности клетки. Основными компонентами ВКМ являются полисахариды, представленные, главным образом, целлюлозой, гемицеллюлозой и пектином. Наиболее уникальной среди этих полисахаридов является целлюлоза, поскольку синтезируется непосредственно в плазматической мембране, в то время как гемицеллюлоза и пектин – в аппарате Гольджи [Ridley et al., 2001]. Целлюлоза образована длинными линейными цепями, содержащими от 300 до 10 000 остатков глюкозы, без боковых ответвлений. Нити соединены между собой водородными связями, в результате чего образуются микрофибриллы. Эти микрофибрилы затем взаимодействуют с гемицеллюлозой с образованием каркаса. Подобный каркас придает прочность и эластичность клеточной стенке. Целлюлозные микрофибриллы пронизывают гель, образованный преимущественно пектином с участием структурных белков. Пектины представляют собой самый разнообразный класс полисахаридов. В основе молекулы пектина лежит главная цепь из 1-4 связанных остатков α-D-галактуроновой кислоты, содержащей некоторое количество остатков 2-О-замещенной L-рамнопиранозы. Карбоксильные группы остатков галактуроновой кислты часто существуют в виде метиловых эфиров [Schols, Voragen, 2002]. Давно известно, что разделение клеток некоторых тканей растений возможно при использовании пектин деградирующих ферментов [Vennigerholz, Walles, 1987; Van Buren, 1991]. Соседние пектиновые цепи могут быть соединены посредством ионов Са2+ [Grant et al., 1973], что вероятно, является главным фактором при адгезионных взаимодействиях «клетка-клетка» у растений. Дополнительным фактором, который важен для придания «адгезивных» свойств пектину является наличие арабинановых и галактановых участков цепи [Iwai et al., 2001]. Ненормальное распределение пектина приводит к потере клеточной адгезии [Shevell et al., 2000]. В связи с этим возможно образование так называемых «мутантов». Например, известно, что пыльца Arapidopsis имеет вид тетрады, поскольку в период развития пыльцы микроспорам не удается разделиться. Подобные мутации возникают из-за нарушения в процессе развития регуляции уровня полигалактуроназы, необходимой для разрушения материнской клеточной стенки пыльцы [Rhee, Somerville, 1998; Rhee et al., 2003]. Считается, что клеточная стенка растений в основном состоит из полисахаридов, однако в ней присутствует также и значительная часть белковых структурных компонентов [Cassab, 1998]. Исследование молекул адгезии ВКМ показало наличие 39 сходства между молекулами ВКМ, обнаруженных в животных тканях, грибах и растениях, хотя в растениях гомология с классическими белками адгезии (интегрины, винкулин, α-актинин и др.) животных тканей проявлялась в меньшей степени [Balushka et al., 2003]. Однако для животных и растений при рассмотрении вопросов адгезии и проведения регуляторного сигнала посредством ВКМ был принят ряд общих положений. Например, добавление синтетической аргинин-глицин-аспарагиновой кислоты замедляет гравитационно-зависимое течение цитоплазмы, рост некоторых растений и оказывает влияние на разные этапы развития организма, например, эмбриогенез Daucus carota [Staves, 1997]; также с помощью методов иммуногистохимии отмечали присутствие в Arapidopsis и Chara интегрин подобных молекул – кадгеринов, которые, как предполагается, авторами исследования являются компонентами плазматической мембраны [Katembe et al., 1997]. Среди других компонентов клеточной стенки растений можно выделить гликопротеины, обогащенные гидроксипролином; белки, содержащие арабинолактан; белки богатые глицином и также пролин-обогащенные белки. Также как и полисахариды, структурные белки, упомянутые выше, в зависимости от ткани, в которой они располагаются, могут выполнять различные функции. Однако о функциях данных белков известно намного меньше, чем о функциях полисахаридов. Например, различают белки, которые принимают участие в адгезионных взаимодействиях пыльца-рыльце. Они представляют собой гликопротеины, образующиеся в рыльце, которые затем секретируются в клеточные стенки зрелых бугорков рыльца. Недостаток этих белков приводит к уменьшению адгезионных сил в пыльце. Таким образом получается, данные белки принимают участие в адгезионных взаимодействиях пыльца-рыльце. Вероятно, данное участие выражается во взаимодействии с белками, находящимися на поверхности пыльцы [Luu et al., 1999]. На примере лилии, также было показано, что в растениях существуют белки, принимающие участие в адгезионных взаимодействиях в пыльцевой трубке. Были выделены две фракции, одна из которых представляла собой белок с молекулярной массой 9 000 Да, именуемый цистеинобогащенный адгезин, выделенный из рыльца. Вторая фракция содержала пектиновый полисахарид. Авторами исследования была проведена аналогия с адгезивными молекулами клеток тканей животных. Они отметили, что крупная молекула ВКМ взаимодействовала с маленьким пептидом для необходимой ориентации нейронов ткани [Lord, 2000]. Из некоторых видов цветковых растений была выделена еще одна группа витронектин-подобных белков [Sanders et al., 1991; Zhu et al., 1993, 1994]. Они были 40 идентифицированы как иммунологические и отнесены к субстрат-адгезивной молекуле животных тканей – витронектину. Витронектин представляет собой полифункциональный гликопротеин, взаимодействует с гликозаминогликанами, коллагеном, плазминогеном, стабилизирует ингибирующую конформацию ингибитора активации плазминогена 1, регулируя деградацию матрикса. Витронектин-подобный белок растений локализован в клеточной стенке клеток кортикальной и передающей тканях рыльца пестика у опыляемых растений [Zhu et al., 1994]. Однако изучение аминокислотной последовательности данного белка не только не выявило гомологии с витронектином, а более того, показало сходство с трансляционным фактором роста 1α. Таким образом, было показано, что белки, структурно относящиеся к трансляционному фактору роста 1α, в клеточной стенке функционируют через взаимодействие с белками мембранных рецепторов. Однако, витронектин-подобный белок растений не выполняет функций, связанных с трансляцией. Белок содержит мотив, который функционально напоминает связывающий клетки мотив, аналогичный тому, что находится в вибронектин-подобных белках тканей животных [Zhu et al., 1994]. Интегрины являются поверхностными клеточными рецепторами, взаимодействующими с ВКМ и передающими межклеточные сигналы. Они представляют собой гетеродимеры, каждый из которых состоит из одной α и одной β субъединиц. Несколько гомологов интегринов были обнаружены и в растениях. Например, при помощи антител к рецептору витронектина человека они были идентифицированы в соевых бобах [Shindler et al., 1989]. Молекулярная масса белка гомолога составила 72 000 Да. Протопласт состоит из цитоплазмы и ядра. Цитоплазма содержит органеллы (рибосомы, микротрубочки, пластиды и митохондрии) и мембранные системы (эндоплазматический ретикулум и диктиосомы). Цитоплазма включает в себя также цитоплазматический матрикс, или основное вещество, в которое погружены органеллы и мембранные системы. Цитоплазма отделена от клеточной оболочки плазматической мембраной, представляющую собой элементарную мембрану. В отличие от клеток животных в растительной клетке содержатся одна или более вакуолей [Полевой, 1989]. Вакуоли представляют собой пузырьки, заполненные жидкостью – клеточным соком. В меристематических клетках содержится большое количество мелких вакуолей, которые увеличиваются в размерах и сливаются в одну вакуоль по мере старения клетки. Увеличение размера клетки в основном происходит за счет роста вакуоли [Полевой, 1989]. Таким образом, возникает тургорное давление и поддерживается упругость ткани, в чем и заключается одна из главных функций вакуоли и тонопласта. Вакуоли служат также 41 местами накопления метаболитов. В них также часто откладываются пигменты [Рейвн и др., 1990б; Тимонин и др., 2007]. Плазматическая мембрана среди многочисленных мембран клетки наиболее четко демонстрирует трехслойность структуры (темный – светлый – темный слои). Для растительных клеток характерны инвагинации (впячивания) пазматической мембраны. Основными функциями плазматической мембраны являются такие, как участие в обмене веществ между клеткой и окружающей средой, координация синтеза и сборки целлюлозных микрофибрилл клеточной оболочки, передача гормональных и внешних сигналов, контролирующих рост и дифференцировку клеток [Полевой, 1989]. Ядро является наиболее заметной структурой в цитоплазме эукариотической клетки. Ядро окружено двумя мембранами, образующими ядерную оболочку. Ядерная оболочка пронизана многочисленными порами порядка 30-100 нм. В ядре различают тонкие нити и глыбки хроматина и нуклеоплазму, или основное вещество ядра. Хроматин состоит из ДНК, связанной с большим количеством специальных белков – гистонов. В процессе клеточного деления хроматин все более уплотняется и в итоге собирается в хромосомы. В ядре также различают ядрышки, в которых синтезируются рибосомные РНК, а также ферменты и кофакторы [Рейвн и др., 1990а; Тимонин и др., 2007]. Пластиды так же, как вакуоли и клеточная оболочка, являются характерными компонентами растительной клетки. Зрелые пластиды классифицируются на основании содержащихся в них пигментов. В хлоропластах, содержащих хлорофилл и каротиноиды, протекает фотосинтез. В цитоплазме хлоропласты обычно располагаются параллельно клеточной оболочке. Хлоропласты растений часто содержат зерна крахмала и мелкие липидные капли. Хлоропласты могут считаться основными клеточными органеллами, поскольку первыми стоят в цепи преобразования солнечной энергии, в результате которого мы получаем пищу и топливо. Хлоропласты также участвуют в синтезе аминокислот и жирных кислот, служат хранилищем временных запасов крахмала. Хромопласты представляют собой пигментированные пластиды. Они не имеют хлорофилла, однако синтезируют и накапливают каротиноиды, придающие желтую, оранжевую и красную окраску цветками, старым листьям, плодам и корням. Хромопласты привлекают насекомых и других животных [Полевой, 1989]. Лейкопласты – непигментированные пластиды. Некоторые синтезируют крахмал (амилопласты), другие способны к образованию разных веществ, в том числе липидов и белков. Митохондрии также как и хлоропласты окружены двумя элементарными мембранами. В митохондриях осуществляется процесс дыхания, в результате которого органические молекулы расщепляются с высвобождением энергии и передачей ее 42 молекулам АТР (аденозинтрифосфата), основного резерва энергии клеток [Рейвн и др., 1990б; Тимонин и др., 2007]. Рибосомы – маленькие частицы размером 17-23 нм в диаметре, которые состоят из равных количеств белка и РНК. В рибосомах аминокислоты соединяются с образованием белков; они наиболее многочисленны в цитоплазме клеток с активным метаболизмом [Тимонин и др., 2007]. Эндоплазматический ретикулум представляет собой сложную трехмерную мембранную систему. Форма и протяженность эндоплазматического ретикулума зависят от типа клетки, ее метаболической активости и стадии дифференцировки. Например, в клетках, секретирующих или запасающих белки, эндоплазматический ретикулум имеет форму плоских мешочков, или цистерн, с многочисленными рибосомами, связанными с его внешней поверхностью - шероховатый эндоплазматический ретикулум. Шероховатый эндоплазматический ретикулум – одно их основных мест синтеза белка. Эндоплазматический ретикулум, не имеющий рибосом, называют гладким эндоплазматическим ретикулумом. Аппарат Гольджи - данный термин используется для обозначения всех диктиосом, или телец Гольджи, в клетке. Диктиосомы – это группы плоских, дисковидных пузырьков, или цистерн, которые по краям разветвляются в сложную систему трубочек. Диктиосомы участвуют в секреции, а у большинства высших растений – в образовании клеточных оболочек. Таким образом, в отдельные задачи исследования входили: 1. Выделение и очистка биорегуляторов новой группы из ряда растений; 2. Изучение мембранотропной активности биорегуляторов растительного происхождения; 3. Изучение некоторых физико-химических свойств растительных биорегуляторов с помощью современных методов биохимического анализа: электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ), динамического лазерного светорассеяния, MALDI-TOF масс-спектрометрии, обращенно-фазовой высокоэффективной хроматографии (ВЭЖХ), изоэлектрофокусирования (ИЭФ), аминокислотного анализа; 4. Изучение специфической активности растительных биорегуляторов на моделях органотипического культивирования тканей животных in vitro, а также в экспериментах на мышах in vivo; изучение влияния данных биорегуляторов на рост и развитие семян различных растений; 5. Изучение локализации данных биорегуляторов в тканях растений. 43 Глава 2. Материалы и методы Используемые реактивы и оборудование Для приготовления водных растворов использовалась дистиллированная, деионизованная вода (mili-Q, сопротивление 16-17 МОм). Амфолины – Serva, Германия; бычий сывороточный альбумин (БСА) – Serva, Германия, Sigma, США; Na2CO3 - Реахим, хч, Россия; тартрат натрия - Реахим, хч, Россия; NaOH - Реахим, хч, Россия; NaHCO3 Реахим, хч, Россия; CuSO4*5H2O - Реахим, хч, Россия; ацетонитрил - Реахим, хч, Россия; tris – Serva, Германия; додецилсульфат натрия – Serva, Германия; дитиотреитол – Serva, Германия; акриламид – Sigma, США; бис-акриламид – Sigma, США; персульфат аммония – Sigma, США; ТЭМЭД (тетраметилэтилендиамин) – Sigma, США; изопропанол - Реахим, хч, Россия; уксусная кислота - Реахим, хч, Россия; глицин – Serva, Германия; метиловый спирт - Реахим, хч, Россия; трифторуксусная кислота - Реахим, хч, Россия; меркаптоэтанол - Реахим, хч, Россия; кумасси G-250-Eastman, США; соляная кислота Реахим, хч, Россия; трипановый синий – Serva, Германия; этиловый спирт - Реахим, хч, Россия; ацетон - Реахим, хч, Россия; о-ксилол - Реахим, хч, Россия; KCl - Реахим, хч, Россия; KH2PO4 - Реахим, хч, Россия; NaH2PO4 - Sigma, США; Na2HPO4 - Sigma, США; сульфат аммония - Реахим, хч, Россия; твин-20 – Sigma, США; цитрат натрия - Реахим, хч, Россия; сульфат меди – Merk, Германия; США; бицинхониновая кислота - Sigma, США; таблетка ОФД (o-фенилендиамин дигидрохлорида), Sigma, CША, конъюгат антивидовых антител с пероксидазой хрена реактивы метода Elise; полный адъювант Фрейнда – Calbiochem, США; неполный адъювант Фрейнда – Sigma, США; FITC-антитела (anti-rabbit IgG FITC conjugate) – Sigma, США; Мембранные фильтры «Durapore» - Millipore, США с диаметром пор 0,45 мкм; среда 199 - Институт полиомиелита, Россия. В исследовании были использованы приборы: источник тока для электрофореза – PowerPac Basic (BioRad), США; прибор для вертикального электрофореза Mini vertical gel system EC120 (BioRad), США; спектрофотометр – Ultrospec 1100 pro, (Biochrom Ltd.), Англия; микроскоп световой Jenaval (Carl Zeiss, JENA), Германия; роллер – Assistant RM5 (Karl Hecht KG), Германия; световой микроскоп – Olympus Vanox AHBT3, Япония; цифровая камера - Olympus UPMTVC, Япония; прибор для Elisa - Microplate reader MR700 (Dynatech Laboratories), Great Britain; рН-метр Oakton 2100 series (EUTECH Instruments), Сингапур; Ультразвуковая баня – Transsonic Digital (Elma), Швейцария. 44 2.1. Получение экстрактов тканей растений Для экстракции использовали листья, луковицы и плоды растений. Для исследования были взяты 9 кг луковиц лука репчатого, 6 кг луковиц чеснока, 4 кг лимона, 800 г укропа пахучего, 850 г листьев подорожника, 800 г кориандра посевного, 900 г алоэ древовидного. Все растительное сырье было получено из Главного ботанического сада им. Н.В. Цицина РАН. Ткани растений нарезали на небольшие фрагменты, размером 1-1,5 см. Растительную массу помещали в раствор для экстрагирования (2,06х10-2 М NH4NO3, 1,88х10-2 М KNO3, 3х10-3 М CaCl2х2H2O, 1,5х10-3 М MgSO4х7H2O, 1,25х10-3 М KH2PO4) на 4-5 часов при температуре +40С. Полученный экстракт отфильтровывали через несколько слоев марли, затем центрифугировали при 3000 g в течение 30 мин. Образовавшийся осадок отделяли от основного раствора. 2.2. Высаливание растительных экстрактов К полученному растительному экстракту при постоянном перемешивании добавляли сухой сернокислый аммоний до образования насыщенного раствора соли (780 г/л), поддерживая рН раствора 7,5-8,0 путем добавления раствора гидроксида аммония. Полученную смесь оставляли на несколько недель при температуре +40С. Центрифугированием при 10 000 g в течение 30 мин отделяли образовавшийся осадок. Таким образом были получены фракции надосадочной жидкости (супернатанта) и осадка, которые подвергали диализу против воды (при соотношении фракции и воды – 1:50) через полунепроницаемую мембрану при +4˚С для удаления ионов аммония, с дальнейшим концентрированием раствора на роторном вакуумном испарителе. 2.3. Разделение супернатантов растительных экстрактов методом изоэлектрофокусирования Супернатант некоторых растительных объектов разделяли при помощи изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте сахарозы на колонке LKB-440 с использованием амфолинов Serva (Germany) диапазона pH 3,0-10,0. Изоэлектрофокусирование проводили в течение 20 часов при напряжении 500В при +4ºС и 100 часов - при 2000 В [Ямскова, Резникова, 1991]. Детекцию белковых фракций осуществляли спектрофотометрически при 280 нм. Для каждой фракции определяли область значений рН. Таким образом собирали фракции белков со значениями рН в кислой и основной областях. Каждую полученную фракцию диализовали против воды с последующим концентрированием на роторном вакуумном испарителе. 45 2.4. Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография Полученный супернатант экстракта лука анализировали с использованием хроматографа высокого давления фирмы («Kontron», США) и гидрофобной колонки (2×150 мм) Jupiter C5 («Phenomex», США). Элюцию осуществляли в градиенте концентрации ацетонитрила (0-70%) в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте (pH 2,2) со скорость 0,3 мл/мин в течение 70 мин. Детекцию проводили при 210 нм. 2.5. Определение концентрации белка Концентрацию белка определяли по методу Лоури-Фолина [Досон и др., 1991] 2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле Электрофорез в 7,5%-ном полиакриламидном геле проводили в денатурирующих условиях по методу Лэмли [Laemmli, 1970]. При этом использовали прибор для вертикального электрофореза Minivertical gel system EC120 (США) (толщина геля – 0,75 мм, размер 8х10 см). Окрашивание гелей проводили красителем Кумасси G-250 фирмы Eastman (США) [Wilson, 1983]. Разделяющий 7,5% полиакриламидный гель готовили из следующих компонентов: мономерный раствор – 3,8 мл, Трис буфер (1,5М Трис-HCl, рН 8,8) – 3,8 мл, 10% раствор додецилсульфата натрия – 0,15 мл, бидистиллированная вода – 7,4 мл, 10%-ный раствор персульфата аммония – 0,075 мл, ТЭМЭД (тетраметилэтилендиамин)- 0,005 мл. Концентрирующий 4% полиакриламидный гель содержал: мономерный раствор – 0,44 мл, раствор буфера (0,5М Трис-HCl, рН 6,8) – 0,83 мл, 10%-ный раствор додецилсульфата натрия – 0,033 мл, бидистиллированную воду – 2,03 мл, 10%-ный раствор персульфата аммония – 0,0167 мкл, ТЭМЭД – 0,0017 мл. Электродный буфер включал в себя: 0,025М Трис, 0,192 М глицин, 0,1% додецилсульфат натрия (рН 8,3). В качестве маркеров молекулярных весов использовали реактив фирмы SigmaAldrich (США), содержащий апротинин из легкого быка - 6,5 кДа, α-лактальбумин – 14,2 кДа, соевый ингибитор трипсина – 20,0 кДа, трипсиноген из поджелудочной железы быка – 24,0 кДа, карбоангидраза – 29,0 кДа, глицеральдегид – 3 – фосфатгидрогеназа – 36,0 кДа, овальбумин – 45,0 кДа, альбумин – 66,0 кДа. Для окрашивания гелей красителем Кумасси G-250, их сначала помещали на 10-15 мин в фиксирующий раствор, содержащий 25% изопропанола и 10% уксусной кислоты, а затем в раствор Кумасси (10% уксусная кислота, 0,06% Кумасси G-250) до появления окраски. Для снятия фонового окрашивания использовали фиксирующий раствор, содержащий 5% метанола и 7% уксусной кислоты. 46 С целью исследования мембранотропной активности, а также изучения специфического действия биорегуляторов электрофорез проводили в не денатурирующих условиях (без добавления додецилсульфата натрия). 2.7. Аминокислотный анализ Использовали аминокислотный анализатор «Hitachi 835» (Япония). Разделение продуктов гидролиза осуществляли в стандартном режиме на катионобменной колонке с последующей детекцией нингидриновых производных при 570 и 440 нм. Образцы раствора, содержащего пептид, гидролизовали 24 ч 5,7 М НCl при 110оС. 2.8. Масс-спектрометрический анализ Анализ молекулярной массы пептида проводили методом времяпролетной массспектрометрии с ионизацией в матрице (MALDI-TOF) на времяпролетном массспектрометре UltraFlex 2 («Bruker Daltonic», Германия). Образец для масс- спектрометрического анализа получали упариванием досуха с последующим разведением в 70%-ном ацетонитриле, содержащем 0,1%-ную трифторуксусную кислоту. В качестве матрицы в работе использовали α-циано-4-гидроксикоричную кислоту. 2.9. Установление С-концевой аминокислотной последовательности Пептид (600 пмоль) растворяли в 10 мкл натрий цитратного буфера (50 мМ, рН 6,0), затем к данному раствору добавляли карбоксипептидазу Y («Sigma Aldrich», США) в соотношении фермент:пептид 1:50 по массе. После 1, 2, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90 и 120 мин инкубации при 37 ºС отбирали аликвоты по 1 мкл, смешивали с 1,5 мкл раствора матрицы (α-циано-гидроксикоричная кислота) и наносили на плашку для дальнейшего массспектрометрического анализа продуктов реакции. 2.10. Метод динамического лазерного светорассеяния Исследование супернатантов растительных экстрактов проводили методом динамического светорассеяния. Данный метод основан на оценке времени флуктуации интенсивности рассеянного света, что позволяет рассчитать коэффициент диффузии и радиус наночастиц. Гидродинамический радиус частиц супернатантов в водном растворе определяли методом динамического светорассеяния на приборе «PhotoCorComplex» (фирма «ФотоКор», Россия), снабженном автоматическим гониометром, псевдокорреляционной системой счета фотонов PhotoCor-PС2 (характеризуется отсутствием послеимпульсов, что 47 позволяет измерять размеры наночастиц порядка 1 нм и выше), одноплатным мультивременным коррелятором рельного времени «PhotoCor-FC», использованном в логарифмической конфигурации (интервал времен задержки 0,01 – 5*105 мс, и гелийнеоновым лазером Uniphase 1135Р мощностью 20 мВт с длиной волны 633 нм. Изучаемые растворыпредварительно очищали от пыли фильтрованием через мембраны «Durapore» с диаметром пор 0,45 мкм («Millipore»). Определяли гомодинную корреляционную функцию интенсивности рассеянного света g(2)(t) под каждым углом рассеяния θ, а также интенсивность динамического светорассеяния I. По уравнению Зигерта: g(2)(t) = 1 +βg(1) (t)2 (1), в которомg(2)(t) = G(2)(t)/G(2)(∞), G(2)(∞) - экспериментально определяемый уровень отсчета, β - фактор когерентности. Если в растворе присутствуют монодисперсные частицы, полевая корреляционная функция g(1)может использоваться для перехода к коэффициенту диффузии D по уравнениям: g(1)(t) = exp(-t/τ) = exp(-Гt) = exp(-Dq2t) (2), D=limq→0(Г/q2) В приведенных уравнениях, τсреднее время релаксации для каждого пика, Г =1/τ средняя скорость релаксации, D - коэффициент диффузии, q – волновой вектор флуктуаций. Из корреляционной функции методом обратного преобразования Лапласа с использованием программ CONTIN (ALV) [Provencher, 1985] находили распределение по временам релаксации флуктуаций, среднее время релаксации для каждого пика (τ), средние коэффициенты диффузии, распределение по среднему гидродинамическому радиусу частиц (Rh) и средние значения Rh(θ) для каждого пика. Для перехода от времен релаксации (τ) к гидродинамическому радиусу (Rh) использовали следующие уравнения: D=1/q2τ (уравнение диффузии)(3), q= (4πηsin2θ/2)/λ (4) и D=kT/6πηRh (уравнение Стокса – Эйнштейна) (5), где η - вязкость растворителя, k – константа Больцмана, T – абсолютная температура, D – коэффициент диффузии, q- волновой вектор флуктуаций, λ - длина волны лазера. Поскольку характеристикой Rh является лишь коэффициент самодиффузииDap, совпадающий с суммарным коэффициентом диффузии D либо при θ = 48 0, либо в случае наличия в растворе только тонкодисперсных частиц, имеющих форму жесткой сферы, мы, используя программу Origin 7.0 строили график зависимости величины, обратной Rh, от sin2θ/2, где θ - угол рассеяния. Проведя графическую экстраполяцию, получили величину Rhпри величине угла рассеяния 0º. 2.11. Исследование супернатанта экстракта лука методом ядерного магнитного резонанса Методом ядерного магнитного резонанса был исследован супернатант экстракта лука. Спектр ЯМР 1Н был снят в водном растворе (D2O) на спектрометре Avance 600 (Brűker) при 20°С. Измерение спин-решеточных времен релаксации проводили в ампулах с диаметром равным 5 мм. Внешним стандартом являлся раствор дейтерированного ацетона, который в ампуле погружали в капилляр и центрировали специальными тефлоновыми вставками. Использовали стандартную программу инверсии- восстановления. Точность измерений времени релаксации составляла ± 5%. 2.12. Определение влияния растворов, содержащих биорегуляторы, на вязкоупругие свойства мембран гепатоцитов мыши при кратковременном органном культивировании in vitro В качестве основного теста на биологическую активность фракций, содержащих биорегуляторы данной группы, использовали ранее разработанный адгезиометрический метод [Ямскова, Резникова, 1991]. В основе данного метода лежит определение параметра, характеризующего вязкоупругие свойства ткани печени в условиях множественного кратковременного органного культивирования invitro при стандартном деформационном воздействии. В исследовании были использованы мыши-гибриды СВА/С57ВL, самцы весом 18 20 г. Из центральной части большой доли печени вырезали фрагменты весом 0,8 - 1,2 мг, при этом края большой доли и области с крупными кровеносными сосудами не использовали. Пять фрагментов ткани помещали в пенициллиновые флаконы, содержащие питательную среду следующего состава: 0,9 мл 199 среды и 0,1 мл исследуемого раствора белкового препарата в исследуемой концентрации (в контрольные флаконы вместо раствора исследуемого белка вносили 1 мл среды). Органные культуры инкубировали в течение 2 ч при 37 °С. Изменение вязкоупругих свойств ткани оценивали с помощью оригинального адгезиометрического метода: каждый фрагмент ткани после культивирования быстро осушали, взвешивали и подвергали диспергированию в специальном дезинтеграторе 49 ткани с зазором 50 мкм в 0,1 мл 0,1% раствора трипанового синего, приготовленного на 199 среде, в условиях стандартного деформационного воздействия. Полученную суспензию клеток и клеточных ядер исследовали микроскопически в камере Горяева. Подсчет клеточных ядер осуществляли в объеме камеры 0,02 мм3. Интервал активных концентраций изучаемых белковых препаратов определяли, исследуя их биологическое действие при последовательном разведении в 10, 100, 1000 и далее раз. Биологический эффект рассчитывали по формуле: Ма = 200% - (Nоп/Nк) *100%, где: Ма - биологический эффект, вызываемый биорегулятором; Nоп и Nк - количество клеточных ядер, выделившихся из 1 мг ткани, соответственно, в опыте (органные культуры в присутствии изучаемого белкового препарата) и в контроле (органные культуры без добавления препарата биорегулятора). Все исследуемые в одном эксперименте эксплантанты получали из печени одного и того же животного. В каждом отдельном эксперименте на каждую экспериментальную точку (соответствующая концентрация раствора белка) просчитывали не менее 5 фрагментов ткани. Для определения адгезионной активности каждого препарата биорегулятора проводили не менее 3-4 опытов. Статистическую обработку данных проводили методом вариационной статистики с использованием критерия Стъюдента (программа Origin 6.0 Profession). 2.13. Роллерное органное культивирование кожи тритона (Pleurodeles waltl) in vitro Тритоны были наркотизированы в 2 %-ном растворе этилуретана на физиологическом растворе для амфибий (0,65 % NaCl) или 0,1 %-ном растворе MS-222 «Sigma» (Германия). Далее животных ополаскивали в спирте, декапитировали, брали кожу с верхней части спины животного, с помощью скальпеля кожу нарезали на фрагменты размером 5×5 мм, которые помещали во флаконы для культивирования ткани. Среда для культивирования ткани кожи содержала: 70 мл среды 199, 10 мл эмбриональной сыворотки крови крупного рогатого скота, 30 мл кипячёной бидистиллированной воды, 200 мкл 4%-ного сульфата гентамицина. Среда для культивирования перед внесением в пузырьки проходила холодную стерилизацию через мембранные фильтры типа “CA” фирмы «Nalgene» (США) c размером пор 0,2 мкм. В опытных сериях культивирование проводили в среде (4 мл) с добавлением 40 мкл фракций, выделенных из подорожника большого; в контрольной серии к 4 мл культуральной среды добавляли 40 мкл дистиллированной воды. Все флаконы закрывали 50 в стерильных условиях, и далее культивировали, вращая в роллере при 22 0С в течение 7 суток. 2.14. Изучение ранозаживляющего действия биорегулятора, выделенного из подорожника, на экспериментальной модели кожной раны у мыши in vivo Животных разделяли на три группы по 5 шт. в каждой. У каждого экспериментального животного под эфирным наркозом, на спине вырезали лоскут кожи, диаметром около 1 см. Контрольную группу мышей, которым наносили травму, не подвергали никакому воздействию. Другой контрольной группе мышей после нанесения травмы ежедневно вносили в область раны 100 мкл физиологического раствора. Опытной группе мышей после нанесения травмы ежедневно вносили в область раны 100 мкл фракции, выделенной из подорожника. На 11 сутки после нанесения экспериментальной раны всех животных выводили из эксперимента в атмосфере эфира, аккуратно вырезали ткань в области травмы и приготавливали поперечные парафиновые гистологические срезы толщиной 7 мкм. Фиксацию тканей проводили в растворе Буэна, срезы толщиной 7 мкм окрашивали гематоксилин-эозином по стандартной методике. Просмотр гистологических препаратов производили с помощью световой микроскопии на микроскопе фирмы «Olympus» (Япония). 2.15. Приготовление гистологических срезов Приготовление парафиновых срезов осуществляли следующим образом. Фрагменты ткани помещали в фиксатор Буэна, фиксировали в течение 4 часов и затем в течение 12 часов трижды отмывали 70%-ным этанолом. После этого осуществляли дегидратацию фрагменты ткани и заливали в парафин. Из парафиновых блоков приготавливали серии срезов толщиной 4-5 мкм, которые после депарафинирования и гидратирования окрашивали гематоксилином и эозином и заключали в канадский бальзам под покровное стекло. В случае иммуногистохимических исследований срезы размещали на желатинизированных стерильных стеклах и не окрашивали. 2.16. Получение кроличьей поликлональной антисыворотки Эксперимент проводили на кролике породы Шиншилла, самцах в возрасте 2-х мес, массой в 1 кг. Раствор антигена вводили инъекционно подкожно в спину 0,5 мл и внутримышечно в бедро 0,5 мл. Первую инъекцию проводили смесью (1 мл), содержащей полный адъювант Фрейнда и водный раствор изучаемой фракции биорегулятора, 51 выделенной из растения (0,3 мг/мл) в соотношении 1:1. Последующие инъекции антигеном кролика проводили через 7 суток смесью (1 мл), содержащей неполный адъювант Фрейнда и водный раствор белка (0,3 мг/мл) в соотношении 1:1. Забор проб крови производили, начиная со 2 недели после первой иммунизации путем надреза ушных сосудов, и исследовали на наличие антител методом твердофазного иммуноферментного анализа ELISA с интервалом в 7 суток. 2.17. Иммуноферментный анализ антител (Elisa) Метод основан на определении количества антител, присоединившихся к сорбированному на плашке антигену, с помощью конъюгата антивидовых антител пероксидазы. Измеряемая ферментативная активность пероксидазы пропорциональна количеству присоединившихся антител. В лунки 96-луночного планшета для иммуноферментного анализа вносили по 100 мкл белка, 5 мкг белка/мл фосфатного буферного раствора (на 1 л: 0,2 г/л KCl, 1,44 г/л Na2HPO4, 0,24 г/л KH2PO4, 2 мл 5 М NaCl; рН 7,4), и инкубировали ночь при +4 0С или 1 ч при 37 0С. Избыток антигена отмывали 3 раза фосфатным буфером, содержащим 0,05 %ный Твин-20, и вносили по 100 мкл антисыворотки в концентрации от 2-3 нг/мл до 1-2 мкг/мл в растворе фосфатного буфера, содержащего 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина и 0,1 %-ный Твин-20. Титрование проводили с разведением антисыворотки 1:3. После инкубации при 37 0С в течение 1 ч, несвязавшиеся антитела отмывали 5 раз (после третьего - встряхивание) по 100-200 мкл фосфатным буфером, содержащим 0,05 %-ный Твин-20. Для выявления антител, присоединившихся к антигену (белку), в лунки вносили по 100 мкл конъюгата антивидовых антител с пероксидазой из листьев хрена в растворе фосфатного буфера, содержащего 0,1 %-ный Твин-20, инкубировали 1 ч при 37 0С и отмывали 5 раз фосфатным буфером, содержащим 0,05 %-ный Твин-20. Для измерения каталитической активности пероксидазы в лунки вносили по 100 мкл свежеприготовленной субстратной смеси следующего состава: 1 таблетка ортофенилендиамина, 10 мл буферного раствора (цитратно-фосфатный – 92 мл 0,1 M лимонной кислоты; 102 мл 0,2 М Na2HPO4x2H2O; рН 4.5-5.0), 20 мкл 30%-ной перекиси водорода. Развитие окраски происходило в течение 15-30 мин при легком перемешивании субстратной смеси при комнатной температуре. Остановку окрашивания производили путем добавления к содержимому каждой лунки по 20 мкл 3 М соляной кислоты. Спектрофотометрически при 492 нм определяли величину оптического поглощения для всех приготовленных растворов, в качестве контроля исследовали раствор, к которому не добавляли антитела. 52 2.18. Иммуногистохимическое окрашивание с использованием FITC-меченых вторичных антител Для изучения экспрессии изучаемого биорегулятора, выделенного из соответствующего растения, предварительно получали кроличью антисыворотку, которую использовали в качестве первых антител к данному биорегулятору в разведении 1:10. Применяли метод непрямого иммуноокрашивания с применением вторых, меченых FITCантител (fluorescein isothyocyanate) (IgG, полная молекула, «Sigma»), антикроличьими антителами в разведении 1:35. Для контроля использовали срезы, окрашенные только вторыми антителами, а также окрашенные антисывороткой от не иммунизированного кролика. Изучение локализации и приготовление изображений проводили с помощью микроскопа фирмы «Olympus». 2.19. Изучение специфической активности биорегуляторов В данном эксперименте в качестве объектов исследования использовали семена лука (Allium сера L.), чеснока (Allium sativumL.), укропа (Anethum graveolensL.), гороха (Pisum sativumL.), а также свеклы (Beta vulgarisL.) «Гавриш» (Россия). В каждом случае брали по 100 семян в контрольной и опытной серии. Эксперимент повторяли по 3 раза. Семена предварительно стерилизовали бидистиллированнойводой при 50-55ºС в течение 20 мин. Затем их помещали в чашки Петри на двойной слой фильтровальной бумаги. Культивирование проводили при постоянной температуре и освещении. Опытную серию семян ежедневно обрабатывали 5 мл водного раствора супернатанта исследуемого биорегулятора в биологически активной концентрации: супернатант экстракта лука брали в концентрации, соответствующей 10-14 мг белка/мл, супернатант экстракта укропа – 10-12 мг белка/мл. Контрольную серию семян ежедневно обрабатывали 5 мл воды. На 12 сутки эксперимента оценивали высоту побега (мм) и его вес (мг), а также всхожесть семян как отношение проросших к общему количеству (%), в отдельных случаях измеряли длину и вес корня. Статистическую обработку результатов проводили с использованием критерия Стьюдента. 2.20. Исследование растительных биорегуляторов на реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) Целью эксперимента являлось выявление профилактического действия растительных биорегуляторов. Для исследования были взяты супернатанты растительных экстрактов алоэ, подорожника, лука, лимона, чеснока. Эксперимент проводили на мышах 53 линии BALB. Было сформировано 7 групп, две из которых являлись контрольными. В каждой группе находилось по 7 мышей. №1 (контроль) (n=7), №2 ГЗТ (n=7), №3 Биорегулятор, выделенный из алоэ (n=7), №4 Биорегулятор, выделенный из подорожника (n=7), №5 Биорегулятор, выделенный из лука (n=7), №6 Биорегулятор, выделенный из чеснока (n=7), №7 Биорегулятор выделенный из лимона (n=7). В первый день осуществляли внутрибрюшинную иммунизацию препаратом, содержащим растительные биорегуляторы в объеме 200 мкл (препарат приготовленный на 0,1M PBS) (группы №3-№17). Группе №1 внутрибрюшинно вводили 200 мкл 0,1M PBS. Второй день - сенсибилизация KLH (гемоцианин из лимфы улитки, Sigma, Hemocyanin from Megathura crenulata). Каждая группа №1-№7 сенсибилизирована подкожной инъекцией между лопаток 100 мкг KLH (в 0,1 М PBS рН 7,4), растворенном в ПАФ в соотношении 1:1, в объеме 200 мкл/мышь. На 14-ный день после сенсибилизации - разрешающая инъекция KLH. Группе №1 внутрикожно вводили инъекцию 50 мкл 0,1 М PBS рН 7,4 в правую заднюю лапу. В левую лапу - внутрикожно 50 мкл PBS. Группам №2-№10 осуществлялась внутрикожная инъекция 20 мкг/мышь KLH в 0,1 М PBS рН 7,4 в правую заднюю лапу, в объеме 50 мкл. В левую лапу вводят внутрикожно 50 мкл PBS. Через 24 ч после разрешающей инъекции KLH, ГЗТ ответ проявлялся увеличением правой лапы, был измерен параметр, отражающий разницу в сумме толщины и ширины правой и левой лап (M), в различные временные точки после разрешающей инъекции (24, 48 и 72 ч). В эксперименте использовали микрометр МК-25. 54 Глава 3. Результаты и их обсуждение 3.1. Выделение, очистка и изучение физико-химических свойств растительных биорегуляторов С применением экспериментального подхода, разработанного для выделения и исследования МГТБ животного происхождения [Margasyuk et al., 2007; Krasnov et al., 2007; Borisenko et al., 2007; Yamskova et al., 2007; Nazarova et al., 2007], биорегуляторы данной группы были получены из лука репчатого, подорожника большого, укропа пахучего, чеснока, лимона, алоэ древовидного и кориандра посевного. Для исследования были взяты именно выше упомянутые растения, поскольку известно, что они способны оказывать различное лекарственное действие. Биологическое действие лекарственных растений находит применение при создании препаратов для профилактики и лечения различных заболеваний. Так, например, известно, что препараты из листьев подорожника весьма успешно используют в качестве ранозаживляющего средства [Оленников и др., 2005]. Препараты, полученные на основе лука, эффективно применяются при разного рода заболеваниях кишечника, водные экстракты лука обладают противогрибковыми свойствами [Masoomeh et al., 2006]. Чеснок активно используется как противовирусное средство, также помогает в борьбе с ленточными червями [Aslani et al., 2006]. Лимон, благодаря входящим в его состав флавоноидам, как отмечается, является эффективным антиоксидантом и применяется при лечении болезней кровеносной системы. Препараты, созданные на основе алоэ, проявляют противовоспалительное действие [Yimei Jia et al., 2008]. Кориандр обладает ярко выраженной противомикробной активностью [Matasyoh et al., 2009]. Следует отметить, что для изучения были взяты разные части растений (листья, луковицы и плоды), поскольку идентификация биорегуляторов в различных частях представлялась весьма актуальной. На начальном этапе выделения растительных биорегуляторов применялся метод экстракции тканей растений водно-солевым раствором определенного состава при температуре +4⁰С. Последующее высаливание растительных экстрактов насыщенным раствором сернокислого аммония так же, как и для биорегуляторов животного происхождения привело к образованию двух фракций: осадка и супернатанта, или надосадочной жидкости. Аналогично МГТБ животного происхождения происходило осаждение примесных белков, а изучаемые биорегуляторы оставались в супернатанте. Так же, как и для МГТБ животного происхождения биорегуляторы, выделенные из растений, оставались в растворенном состоянии в насыщенном растворе сернокислого аммония [Margasyuk et al., 2007; Krasnov et al., 2007; Borisenko et al., 2007; Yamskova et al., 2007; 55 Nazarova et al., 2007]. Идентификация биорегуляторов, выделенных из тканей растений, осуществлялась с помощью ранее разработанного для МГТБ метода биотестирования, или измерения мембранотропной активности [Ямскова, Резникова, 1991; Туманова, Ямскова, 1995]. Данный метод позволил установить присутствие биорегуляторов только в супернатантах растительных экстрактов, в свою очередь, фракции осадков и экстрактов биологической активностью не обладали. Рис.1. демонстрирует отсутствие мембранотропного действия экстракта чеснока. Значение эффекта при проявлении фракцией мембранотропного действия составляет свыше 125%. В случае экстракта чеснока эффект не превышал 124%. 160 Ма (%) 140 120 100 80 60 40 20 0 К 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15№ Рис.1. Мембранотропное действие экстракта чеснока. по оси ординат – величина мембранотропного эффекта, Ма (%); по оси абсцисс – степень 10кратного последовательного разведения изучаемого препарата, №; К - контроль; Исходная концентрация препарата составляла 0,1 мг белка/мл. На рис.2. в качестве примера приведена диаграмма, отражающая мембранотропное действие супернатанта чеснока. Из рисунка видно, что дозовая зависимость мембранотропного действия носит полимодальный характер с ярко выраженными экстремумами. Мембранотропный эффект, достоверно отличающийся от контроля, в биологически активных фракциях достигал 130-143%. Подобный характер зависимости мембранотропной активности аналогичен и для биологически активных фракций МГТБ животного происхождения. На рис.3. в качестве примера приведена диаграмма 56 мембранотропного действия осадка супернатанта экстракта укропа. Диаграмма демонстрирует характерное для фракций осадков супернатантов растительных экстрактов отсутствие мембранотропного действия. Из рисунка видно, что во всем диапазоне концентраций значение мембранотропного эффекта не превышало 124%, что указывает на отсутствие данного рода биологического действия. 160 Ма (%) 140 120 100 80 60 40 20 0 3 К 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 № Рис. 2. Мембранотропное действие супернатанта экстракта чеснока. по оси ординат – величина мембранотропного эффекта, Ма (%); по оси абсцисс – степень 10кратного последовательного разведения изучаемого препарата, №; К - контроль; Биологически активные разведения отмечены фиолетовым цветом; (р< 0,05); Исходная концентрация препарата составляла 0,1 мг белка/мл. 160 Ма (%) 140 120 100 80 60 40 20 0 К 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 № Рис. 3. Мембранотропное действие осадка супернатанта экстракта укропа. по оси ординат – величина мембранотропного эффекта, Ма (%); по оси абсцисс – степень 10кратного последовательного разведения изучаемого препарата, №; К - контроль; (р> 0,05); Исходная концентрация препарата составляла 0,1 мг белка/мл. 57 Биологически активные супернатанты растительных экстрактов далее разделяли методами ИЭФ, обращенно-фазовой ВЭЖХ и электрофореза в ПААГ. Для разделения супернатанта экстракта подорожника был применен метод ИЭФ. Данный метод ИЭФ был использован в настоящей работе, поскольку ранее он применялся для выделения МГТБ животного происхождения [Nazarova et al., 2007]. На рис.4. представлена изоэлектрофокусировочная кривая супернатанта растительного экстракта в градиенте плотности сахарозы. Так же, как и для супернатантов, полученных из тканей млекопитающих, было показано наличие нескольких фракций белков. В случае супернатанта экстракта подорожника ИЭФ-методом были определены три рН-фракции: 1) 1,8-3,0; 2) 3,9-4,8; 3) 8,5-9,5. Все собранные фракции исследовали методом биотестирования (рис.5,6,7). Установлено, что только при проведении ИЭФ процесса в течение 5 суток при высоком напряжении разделение происходило таким образом, что мембранотропной активностью обладала лишь фракция, собранная при рН<3,0. Эти данные полностью соответствуют данным, полученным для МГТБ животного происхождения, которые показывают, что фракция кислых белков (рН<3,0) является наиболее количественно представленной и также характеризуется проявлением мембранотропной активности Показано, что полученная ИЭФ-фракция супернатанта экстракта подорожника проявляла характерную для МГТБ мембранотропную активность, которая, также как и для биорегуляторов, выделенных из тканей животных, имела полимодальный характер. Значение мембранотропного эффекта биологически активных фракций достоверно отличалось от контроля и составляло порядка 134-160%. На рис.4. представлена ИЭФ-кривая супернатанта экстракта подорожника, на котором выделенная область соответствует фракции, собранной при рН<3,0. 58 pH D 280 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 pH D280 0,4 0,2 0 1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 N фракции Рис. 4. Картина разделения супернатанта экстракта подорожника методом ИЭФ По оси ординат 1- значения рН; по оси ординат 2- D280; по оси абсцисс - номера фракций. 180 Ма (%) 160 140 120 100 80 60 40 20 0 К 3 4 5 Рис.5. Мембранотропное подорожника рН 1,8- 3,0. 6 7 8 действие 9 10 11 12 ИЭФ-фракций 13 14 15 № супернатанта экстракта по оси ординат – величина мембранотропного эффекта, Ма (%); по оси абсцисс – степень 10кратного последовательного разведения изучаемого препарата, №; К - контроль; Биологически активные разведения отмечены фиолетовым цветом; (р<0,05); Исходная концентрация препарата составляла 0,1 мг белка/мл. 59 160 Ма (%) 140 120 100 80 60 40 20 0 К 3 4 5 Рис.6. Мембранотропное подорожника рН 3,9-4,8. 6 7 8 действие 9 10 11 12 ИЭФ-фракций 13 14 15 № супернатанта экстракта по оси ординат – величина мембранотропного эффекта, Ма (%); по оси абсцисс – степень 10кратного последовательного разведения изучаемого препарата, №; К - контроль; Исходная концентрация препарата составляла 0,1 мг белка/мл. 160 Ма (%) 140 120 100 80 60 40 20 0 К 3 4 5 Рис.7. Мембранотропное подорожника рН 8,5-9,5. 6 7 действие 8 9 10 11 ИЭФ-фракций 12 13 14 15 № супернатанта экстракта по оси ординат – величина мембранотропного эффекта, Ма (%); по оси абсцисс – степень 10кратного последовательного разведения изучаемого препарата, №; К - контроль; Исходная концентрация препарата составляла 0,1 мг белка/мл. 60 В более ранних работах по выделению и изучению МГТБ было показано, что методом обращенно-фазовой ВЭЖХ удавалось получить отдельные фракции супернатантов экстрактов тканей млекопитающих, обладающие определенными физикохимическими свойствами и оказывающие различное биологическое действие на ткань позвоночных животных [Margasyuk et al., 2007; Krasnov et al., 2007; Borisenko et al., 2007; Yamskova et al., 2007; Nazarova et al., 2007]. Таким образом, на основании ранее полученных результатов метод обращенно-фазовой ВЭЖХ был применен и для разделения растительных супернатантов. На рис.8. представлена картина разделения супернатанта экстракта лука методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в градиенте вода-ацетонитрил. Наиболее представленной является фракция, элюированнная при 9% концентрации ацетонитрила. Методом биотестирования мембранотропной также было установлено проявление активности, характерной для МГТБ данной (рис.9.) фракцией Значение мембранотропного эффекта, достоверно отличного от контроля, составило 127-163%. Рис. 8. Разделение супернатанта экстракта лука с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ Колонка Jupiter C5 (2×150 мм). Элюцию осуществляли в градиенте концентрации ацетонитрила (0-70%) в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте (pH 2,2) со скорость 0,3 мл/мин в течение 70 мин. Детекцию проводили при 210 нм. 61 180 Ма (%) 160 140 120 100 80 60 40 20 0 К 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 № Рис. 9. Мембранотропное действие ВЭЖХ-фракции супернатанта экстракта лука. по оси ординат – величина мембранотропного эффекта, Ма (%); по оси абсцисс – степень 10кратного последовательного разведения изучаемого препарата, №; К - контроль; Биологически активные разведения отмечены фиолетовым цветом; (р<0,05). Исходная концентрация препарата составляла 0,1 мг белка/мл. В табл.1. приведены характеристики основных фракций растительных биорегуляторов, полученных в ходе очистки экстрактов. Из табл.1. видно, что значение выходов биорегуляторов на 100 г влажного веса растения достаточно низкие, порядка 0,1-10%. В связи с этим можно предположить, что в растениях содержание биорегуляторов данной группы довольно низкое, что усложняет процедуру их получения. 62 Таблица 1. Характеристика фракций, полученных в ходе очистки растительных биорегуляторов Название изучаемого препарата Объем, Концентрация, мл мг белка/мл Десятикратное разведение исходного препарата, при котором наблюдался мембранотропный эффект Экстракт подорожника 850 1,2 неактивен Супернатант экстракта подорожника 20 0,8 1010, 1011, 1014 ИЭФ-фракция супернатанта экстракта подорожника 4 0,5 103- 105, 108- 1010 Осадок супернатанта экстракта подорожника 20 0,14 неактивен Экстракт укропа 3000 0,1 105, 107, 1011-1013 Супернатант экстракта укропа 10 7,1 104, 107, 109, 1010,1015 Осадок супернатанта экстракта укропа 17 0,25 неактивен Экстракт лука 5 000 0,14 неактивен Супернатант экстракта лука 40 2,6 105 , 109, 1010, 1012-1015 ВЭЖХ-фракция супернатанта экстракта лука 4 0,01 103, 104, 108, 1012-1015 Осадок супернатанта экстракта лука 30 0,77 неактивен Экстракт чеснока 4500 4,17 107 , 106 Супернатант экстракта чеснока 16 0,8 105 , 106, 1011,1015 Осадок супернатанта экстракта чеснока 25 0,37 неактивен 63 Таблица 1. Характеристика фракций, полученных в ходе очистки растительных биорегуляторов Продолжение Название изучаемого препарата Объем, Концентрация, мл мг белка/мл Десятикратное разведение исходного препарата, при котором наблюдался мембранотропный эффект Экстракт лимона 2700 2,8 неактивен Супернатант экстракта лимона 6 1,4 106 -109, 1011 ,1013 Осадок супернатанта экстракта лимона 26 0,45 неактивен Экстракт алоэ 650 3,8 неактивен Супернатант экстракта алоэ 12 0,36 105 , 108 , 1013,1014 ИЭФ-фракция супернатанта экстракта алоэ 5 0,2 105 , 107, 1010,1011 Осадок супернатанта экстракта алоэ 20 0,54 неактивен Экстракт кориандра 550 1,1 неактивен Супернатант экстракта кориандра 7 1,34 105, 1010, 1011 Осадок супернатанта экстракта кориандра 15 0,2 неактивен Полученная ВЭЖХ-фракция супернатанта экстракта лука была исследована методом MALDI-TOF масс-спектрометрии (рис.10.). Данный метод позволил установить, что в состав данной фракции входят пептиды с небольшими молекулярными массами (до 10 000 Да). Было показано наличие двух значений сигналов масс-спектров пептидов, содержащихся в исследуемой фракции: 4036±2 и 8079±2 Да. В качестве основного пептида данной ВЭЖХ-фракции был выбран пептид со значением молекулярной массы 4036±2 Да. Молекулярная масса другого обнаруженного пептида представляла собой 64 удвоенную массу основного. В связи с этим можно предположить, что вторая компонента In te n s . [a .u .] представляет собой дипептид. 4036.529 6000 4000 2000 8079.167 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 m/z Рис. 10. MALDI-TOF масс-спектр ВЭЖХ-фракции супернатанта экстракта лука. С целью дальнейших исследований полученного пептида весьма актуальным представлялось определение его первичной структуры. Следует отметить, что установление первичной структуры белка или пептида начинается с определения его молекулярной массы, аминокислотного состава, N- и С-концевых аминокислотных остатков. В табл.2. представлены результаты аминокислотного анализа супернатанта экстракта лука, содержащей пептид. Из данных таблицы видно, что общее количество аминокислотных остатков составило 44. В составе данной фракции отмечается достаточно низкое содержание ароматических аминокислот Tyr и Phe и отсутствие серосодержащих аминокислот, например, Met. Подобный аминокислотный состав является характерным для биорегуляторов данной группы [Ямсков и др., 1999] и гликопротеинов, или углеводсодержащих белков [Kreis et al., 1993]. 65 Таблица 2. Результаты аминокислотного анализа супернатанта экстракта лука Название Asp Thr Ser Glu Pro Gly Ala Val Met Ile Leu Tyr Phe Lys His Arg Всего Мол. масса Число остатков 3 2 3 6 3 7 5 2 0 1 3 2 1 2 1 2 44 4796 Для установления аминокислотной последовательности белков и пептидов используется целый ряд химических, физико-химических и ферментативных методов [Овчинников, 1987]. Одним из первых методов определения N-концевых аминокислотных остатков был динитрофенольный метод, разработанный Сэнгером Ф. в 1945 году. Метод заключается в реакции α-аминогруппы белка или пептида с 2,4-динитрофторбензолом. При этом образуется динитрофенильное производное окрашенное в желтый цвет. Последующий кислотный гидролиз 5,7 н соляной кислотой приводит к разрыву пептидных связей и образованию динитрофенильного производного N-концевой аминокислоты, которое экстрагируют эфиром и идентифицируют методом тонкослойной хроматографии. Однако в настоящее время наибольшее применение для установления N-концевых аминокислот нашел метод дансилирования, который был разработан Греем В. и Хартли Б. в 1962 году. Данный метод основан на введении в α-аминогруппу белка или пептида «флуоресцентной метки», устойчивой в условиях полного расщепления белка или пептида до аминокислот при кислотном гидролизе [Ленинджер и др., 1985]. 66 И все же, основным и самым распространенным методом определения аминокислотной последовательности с N-конца является метод, разработанный Эдманом П. в 1950-1956 годах. Данный метод является методом деградации полипептидной цепи с помощью фенилизотиоцианата (ФИТЦ), который позволяет последовательно отщеплять N-концевые остатки аминокислот в виде фенилтиогидантоинов. Каждый цикл деградации полипептидной цепи включает в себя три стадии: образование фенилтиокарбамоил – пептида, отщепление N-концевого остатка аминокислоты в форме анилинотиазолинона, а также изомеризацию тиазолинона в фенилтиогидантоин и идентификацию последнего. В 1972 году была предложена модификация метода Эдмана. Грей предложил использовать выше описанный метод в сочетании с реакцией дансилирования (ДНСЭдман). Для этого после каждого цикла отщепления по Эдману отбирается аликвота и анализируется N-концевой остаток укороченного пептида с помощью метода дансилирования. Модифицированный метод Эдмана выгодно отличается от «прямого» Эдмана, так как ДНС-аминокислоты определяются с более высокой чувствительностью и потери на каждой стадии деградации значительно меньше вследствие отсутствия стадии промывки (экстракции) для удаления избытка реагентов и побочных продуктов [Овчинников, 1987]. Определение С-концевой последовательности осуществляется с применением ряда ферментативных методов, который заключается в использовании карбоксипептидаз, представляющих собой экзопептидазы класса гидролаз. Метод заключается в том, что карбоксипептидазы в молекуле белка атакуют связи, расположенные по соседству с αкарбоксильными группами и последовательно отщепляют по одному остатку аминокислоты с С-конца полипептидной цепи. Дальнейшее изучение кинетики отщепления аминокислот позволяет получить информацию о последовательности расположения их на С-концевом участке молекулы белка или пептида. При исследовании структуры белков используют несколько типов карбоксипептидаз: A, B, C, P, Y. Карбоксипептидазы имеют различное происхождение и различаются по скорости расщепления индивидуальных аминокислот. Например, карбоксипептидаза А выделена из поджелудочной железы крупного рогатого скота и с наибольшей скоростью отщепляет аминокислоты с ароматической и длинной алифатической боковой цепью: Phe, Tyr, Trp, Leu, Ile, Met, Val, совсем не гидролизуются связи, образованные С-концевыми Pro и Arg [Овчинников, 1987]. Таким образом, с целью определения первичной последовательности выделенного пептида с N-конца мы применили метод Эдмана. Однако попытка определения аминокислотной последовательности данным способом не привела к успеху. Вероятно, 67 из-за блокировки N-конца данной полипептидной цепи реакция не прошла. Тогда был применен ферментативный метод с помощью карбоксипептидазы У, который позволил нам осуществить последовательное отщепление аминокислот с С-конца полипептидной цепи. В данном исследовании была выбрана именно карбоксипептидаза У (выделена из пекарских дрожжей), поскольку известно, что она отщепляет почти все аминокислоты, включая Pro, который, согласно аминокислотному анализу, имеется в составе пептидной цепи. Таким образом, используя ферментативный гидролиз изучаемого пептида с последующим MALDI-TOF масс-спектрометрическим анализом реакционной смеси, удалось установить его 18-членную С-концевую аминокислотную последовательность, имеющую вид: -GlyPheGlyGluGlyAlaTyrThrGlyAlaValAlaAlaGlyThrGluGlyArg. Стоит отметить, что в проведенном исследовании удалось определить лишь 18 аминокислотных остатков, что составляет почти половину от всего количества аминокислотных остатков, входящих в полипептидную цепь. Возможно, именно ограниченное время жизни фермента послужило причиной тому, что не удалось определить большее число аминокислотных остатков. В состав полученной аминокислотной последовательности входили глицин, фенилаланин, глутаминовая кислота, аланин, тирозин, треонин, валин и аргинин. Полученные данные весьма хорошо коррелируют с результатами проведенного аминокислотного анализа данной фракции. При сравнении полученной последовательности с полипептидами в частичной С-концевой аминокислотной базе данных Uniprot (http:// www.uniprot.org) гомологов обнаружено не было. Таким образом, можем заключить, что установленная аминокислотная последовательность является уникальной. Одним из основных физико-химических свойств для МГТБ животного происхождения являлась способность образовывать в водных растворах достаточно крупные наноразмерные частицы 100-150 нм [Margasyuk et al., 2007; Krasnov et al., 2007; Borisenko et al., 2007; Yamskova et al., 2007; Nazarova et al., 2007]. Согласно литературным данным, как в биологии, так и в химии вещества, способные образовывать в водных растворах межмолекулярные наноразмерные ассоциаты обладают уникальным биологическим действием [Cui et al., 2004; Engel et al., 2000; Olivier et al., 2005]. Следует отметить, что все белки способны образовывать наноразмерные частицы. В свою очередь, именно МГТБ животного происхождения в водных растворах даже при невысоких концентрациях (0,1 мг белка/мл) склонны к образованию довольно крупных (более 100 нм) наночастиц. Причем данное свойство МГТБ абсолютно не зависит от их молекулярной массы. В качестве примера можно привести фибриноген. Его молекулярная 68 масса составляет 340 000 Да, а гидродинамический радиус частиц, им образованный, достигает 10,95 нм. Миозин 1b, в свою очередь, обладая молекулярной массой 213 000 Да, образует частицы размером 27,9 нм. Исследование водных растворов супернатантов растительных экстрактов методом динамического лазерного светорассеяния, аналогично МГТБ, показало присутствие в них наноразмерных частиц. Для всех изучаемых биорегуляторов растительного происхождения было показано существование в водных растворах частиц размером 88110 нм (табл.3.). Полученные результаты показывают, что в данных фракциях, содержащих растительные биорегуляторы, не смотря на незначительное содержание белка (концентрация 0,1 мг белка/мл), образуются достаточно крупные наночастицы, размер которых соответствует размеру частиц МГТБ животного происхождения. Таблица 3. Результаты исследования методом динамического лазерного рассеяния растворов супернатантов растительных экстрактов (концентрация 0,1 мг белка/мл) Объект исследования Значение гидродинамического радиуса частиц (нм) Подорожник большой 110 ± 5,5 Лук репчатый 99,2 ± 4,9 Чеснок 101,7 ± 5,1 Укроп пахучий 88 ± 4,4 Важно отметить, что ранее для МГТБ животного происхождения было показано наличие низкомолекулярной компоненты в составе биорегуляторов данной группы [Скрипникова и др., 2009]. И действительно, методом MALDI-TOF масс-спектрометрии для всех биологически активных супернатантов растительных экстрактов было показано присутствие пептидов с невысокими значениями молекулярных масс (табл.4.). Таблица 4. Идентификация пептидов, входящих в состав супернатантов растительных экстрактов, методом MALDI-TOF масс-спектрометрии Объект исследования М (m/z) Концентрация (мг белка/мл) Подорожник большой 2374, 2963 0,064 Лук репчатый 4036, 8079 2,69 Чеснок 3061, 4367, 8743 0,79 Укроп пахучий 1100, 1391, 2229 1,37 69 Данные MALDI-TOF масс-спектрометрии подтверждаются результатами исследования, проведенного методом электрофореза в ПААГ (рис.11.). Данным методом была исследована ИЭФ-фракция, выделенная из подорожника. Исследование показало, что основным компонентом данной фракции также является пептид с молекулярной массой порядка 2 100 Да. При помощи нативного электрофореза была наработана данная фракция, и методом биотестирования было продемонстрировано проявление ею мембранотропной активности (рис. 12.). Значение мембранотропного эффекта, достоверно отличающегося от контроля, демонстрирует присутствие достигало 130-140%. Следует отметить, что рис.11. во фракции подорожника также и двух более высокомолекулярных фракций со значениями молекулярных масс около 12 400 и 69 800 Да. Однако при нативном электрофорезе наиболее выражено проявлялась именно низкомолекулярная компонента (рис.13.) Возможно, что белки, входящие в ИЭФфракцию, способны образовывать межмолекулярные ассоциаты, которые при воздействии SDS-Na и других денатурирующих агентов распадались на отдельные компоненты, обладающие различной электрофоретической подвижностью. Поэтому мы наблюдали различное распределение белковых компонент в нативных и денатурирующих условиях. 94кДа 67кДа 45кДа 30кДа 21,5кДа 14,4кДа 3,5кДа Рис.11. SDS-электрофорез в 7,5% ПААГ ИЭФ-фракции (рН<3,0) супернатанта экстракта подорожника. В качестве маркеров были использованы: окисленная В-цепь инсулина из поджелудочной железы быка - 3,5 кДа, α-лактальбумин – 14,4 кДа, соевый ингибитор трипсина – 21,5 кДа, карбоангидраза – 31 кДа, овальбумин – 45 кДа, бычий сывороточный альбумин – 66,2 кДа и фосфорилаза b – 94,6 кДа. 70 160 Ма (%) 140 120 100 80 60 40 20 0 К 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 № Рис.12. Мембранотропное действие низкомолекулярной (<3,5кДа) фракции супернатанта экстракта подорожника по оси ординат – величина мембранотропного эффекта, Ма (%); по оси абсцисс – степень 10кратного последовательного разведения изучаемого препарата, №; К - контроль; Биологически активные разведения отмечены фиолетовым цветом; (р<0,05). 94 кДа 67 кДа 45 кДа 30 кДа 21,5 кДа 14,4 кДа 3,5 кДа Рис.13. Электрофорез в 7,5% ПААГ ИЭФ-фракции (рН<3,0) супернатанта экстракта подорожника в нативных условиях. В качестве маркеров были использованы: окисленная В-цепь инсулина из поджелудочной железы быка - 3,5 кДа, α-лактальбумин – 14,4 кДа, соевый ингибитор трипсина – 21,5 кДа, карбоангидраза – 31 кДа, овальбумин – 45 кДа, бычий сывороточный альбумин – 66,2 кДа и фосфорилаза b – 94,6 кДа. 71 Методом ЯМР-спектроскопии при исследовании супернатанта экстракта лука было показано, что в состав растительного биорегулятора входит углеводная компонента, липиды, а также ряд аминокислот. 4 . 2 4 . 0 3 . 8 3 . 6 3 . 4 3 . 2 3 . 0 2 . 8 2 . 6 2 . 4 2 . 2 2 . 0 1 . 8 1 . 6 1 . 4 1 . 2 1 . 0 0 . 8 0 . 6 ( p p m) Рис.14. ЯМР1Н - спектр супернатанта экстракта лука На рис.14. приведен спектр 1Н ЯМР, который был зарегистрирован в диапазоне 0,5÷4,3 м.д. Одним из самых сильных сигналов является сигнал СН3-протонов лактата δ = 1,22 м.д., соответствующий сигнал СН-протона находится при δ = 4,02 м.д. Сигналы протонов, находящиеся в области 3,1 ÷ 3,9 м.д., можно отнести к протонам углеводных компонент: β-глюкозы (δ = 3,14 м.д.), α-глюкозы (δ = 3,48 м.д.). Сигнал со значением химического сдвига δ = 1,41 м.д. соответствует СН3-протонам аланина; также были обнаружены ацетоацетат (δ = 2,15 м.д.) и N-ацетил гликопротеина δ = 1,95; 2,05 м.д. Широкий слабый сигнал был отмечен при δ = 1,15 м.д. СН2-протоны липидной части. Сигнал со значением химического сдвига δ = 1,08 м.д. рассматривается как артефакт, поскольку отвечает сигналу СН3-протонов спирта. Полученные результаты коррелируют с данными, полученными при изучении МГТБ животного происхождение [Скрипникова и др., 2009]. Растительные биорегуляторы аналогично МГТБ имеют сложный состав, включающий в себя пептиды, углеводную компоненту и липиды. 72 Таким образом, суммируя результаты проведенного исследования можно заключить, что, в растениях присутствуют ранее неизученные биорегуляторы, сходные по физикохимическим свойствам с МГТБ животного происхождения. Так же, как и МГТБ, растительные биорегуляторы присутствуют в растворенном состоянии в насыщенном растворе соли, в водном растворе находятся в состоянии достаточно крупных наноразмерных частиц, а в их состав входят биологически активные пептиды с небольшими молекулярными массами, углеводы, а также липиды. 3.2. Исследование локализации биорегуляторов, выделенных из подорожника, чеснока и лука, в листьях и луковицах растений С помощью иммуногистохимической реакции с использованием вторичных FITCконъюгированных антител были изучены локализации биорегуляторов, выделенных из подорожника, чеснока и лука в тканях соответствующих растений. Для изучения локализации биорегуляторов в листьях подорожника, чеснока и лука были получены поликлональные антисыворотки у кроликов, которые использовали в качестве первичных антител к растительным биорегуляторам. В качестве антигенов для иммунизации использовали биологически активную ИЭФ-фракцию кислых белков подорожника, а также супернатант экстракта чеснока и лука. Установлено, что растительные биорегуляторы локализованы внеклеточно. Рис.15. демонстрирует внеклеточную локализацию в ткани листа подорожника биорегулятора, выделенного из листьев подорожника. Яркое свечение на рисунке относится к неспецифическому свечению и принадлежит хлоропластам. На рис. 16. так же приведена внеклеточная локализация в ткани луковицы лука биорегулятора, выделенного из луковицы лука. Результаты исследования биорегулятора, выделенного из луковицы чеснока, показали, что в листьях чеснока он локализован на поверхности клеток губчатого мезофилла и эпидермиса (рис.17). На рис.18. представлен гистологический срез ткани листа чеснока, который наглядно демонстрируютрасположение клеток, на поверхности которых локализован биорегулятор. На рис.19. и рис.20, соответственно, приведены внеклеточная локализация в луковице чеснока биорегулятора, выделенного из чеснока, а также гистологический срез ткани растения. Полученные данные представляются весьма важными в аспекте проводимого нами сравнения МГТБ животного происхождения и растительных биорегуляторов, поскольку и те и другие биорегуляторы локализованывнеклеточно, что позволяет предполагать об аналогии выполняемой ими функции, соответственно, в растительных и животных тканях. Следует отметить, что в отличие от тканей животного происхождения адгезивные молекулы, а также различные макромолекулы межклеточного состава тканей растений 73 мало изучены. На основании этого можно заключить, что полученные данные являются важными для понимания механизмов клеточной адгезии и проведения регуляторного сигнала в тканях растений. В этом аспекте весьма интересны результаты, полученные при изучении локализации биорегулятора, выделенного из чеснока. Была показана его локализация в области меристемы (группы образовательных тканей, отвечающих за гистологическое разнообразие тела растения), по сути, представляющей собой зону роста растения. Такая локализация растительного биорегулятора предполагает его участие в процессах роста (регенерации) растения. В связи с этим можно предположить о существовании еще одной аналогии, возможно наиболее принципиальной в плане сравнения функций растительных биорегуляторов и МГТБ животного происхождения, для которых была продемонстрирована способность влиять на клеточные источники регенерации в тканях и тем самым, стимулировать процессы восстановления и регенерации. Рис.15. Локализация биорегулятора, выделенного из листьев подорожника, в ткани листа подорожника (увеличение об. ×100, ок. ×10). Стрелками отмечена локализация биорегулятора. Наиболее яркое свечение принадлежит хлоропластам. 74 Рис. 16. Локализация биорегулятора, выделенного из луковиц лука, в ткани луковицы лука (увеличение об. ×40, ок. ×10). Стрелками отмечена локализация биорегулятора. Рис. 17. Локализация биорегулятора, выделенного из луковиц чеснока, в ткани листа чеснока (увеличение об. ×40, ок. ×10). Стрелками отмечена локализация биорегулятора. 75 Рис. 18. Гистологический срез ткани листа чеснока (увеличение об. ×40, ок. ×10). Стрелками отмечены клетки, на поверхности которых локализован биорегулятор, выделенный из луковицы чеснока. 200 µm Рис. 19. Локализация биорегулятора, выделенного из луковиц чеснока, в ткани луковицы чеснока (увеличение об. ×40, ок. ×10). Стрелками отмечена локализация биорегулятора. 76 Рис. 20. Гистологический срез ткани луковицы чеснока (увеличение об. ×40, ок. ×10). Стрелками отмечены клетки, на поверхности которых локализован биорегулятор, выделенный из луковицы чеснока. 3.3. Изучение специфической активности биорегуляторов, выделенных из подорожника и алоэ, на модели роллерного культивирования кожи тритона in vitro Для изучения специфической активности МГТБ ранее были разработаны новые модели роллерного органотипического культивирования тканей тритона (Pleurodeles waltl). Проведение этой серии экспериментов было обусловлено тканеспецифическим, но не видоспецифическим характером биологического действия МГТБ. В проведенных опытах было установлено происхождения протекторное действие биорегуляторов животного на ткань за счет дополнительной стимуляции в ней клеточных источников регенерации. Известно, что подорожник и алоэ обладают ранозаживляющим действием. В связи с этим в данном исследовании была также использована модель роллерного органотипического культивирования кожи тритона. Впервые данная модель была применена для исследования ранозаживляющего действия биорегулятора, выделенного из сыворотки крови. В эксперименте исследовали два биорегулятора, выделенные из подорожника и алоэ, соответственно, в виде ИЭФ-фракций (рН<3,0), в концентрациях, соответствующих 10-12 мг белка/мл. Результаты показали, что оба биорегулятора оказывали протекторное действие на ткань, которое после 7-суточного культивирования выражалось в поддержании структуры кожи, сохранении покровного эпителия, жизнеспособности и функций клеток желез. На данном сроке культивирования в 77 культурах контрольной серии (без добавления биорегуляторов) обнаруживались явные признаки развития деструктивных процессов: наблюдали деградацию клеток эпидермиса (рис.21б). В культурах опытных серий (при добавлении фракций изучаемых биорегуляторов) было обнаружено, что многослойный эпителий в составе активно секретируемой слизи покрывал поверхность фрагмента кожи (рис.21в,г). На границе эпителия и кориума отмечалось большое количество пигментированных клеток, число которых увеличивалось при неблагоприятных условиях в качестве защитной реакции организма. В кориуме были индентифицированы фибробласты, развитая сеть пигментных клеток, недеструктирующие железы; состояние ткани было приближено к нативному (рис.21а,в,г). Оба растительных биорегулятора способствовали усиленному образованию слизи, и, следовательно, слущиванию эпителия (рис. 21в,г). В опытной группе распределение пигмента было равномерным, в отличие от контроля, где пигмент был представлен в виде глыбок и плотных скоплений под эпидермисом, что свидетельствует о более неблагоприятных условиях в контрольной среде и нарушении распределения меланофоров в кориуме. а. в. б. г. Рис.21. Гистологические срезы кожи тритона: а - нативная кожа, б - роллерная органная культура на 7 сутки культивирования без добавления биорегулятора подорожника (контроль), в - роллерная органная культура на 7 сутки культивирования с добавлением биорегулятора подорожника (опыт), г - роллерная органная культура на 7 сутки культивирования с добавлением биорегулятора алоэ (опыт). 78 Таким образом, характер специфической активности, проявляемый растительными биорегуляторами, проявляет аналогию с активностью МГТБ животного происхождения, например, с биорегулятором, выделенным из сыворотки крови: действие в СМД, поддержание структуры ткани и сохранение межклеточных адгезионных взаимодействий, увеличение жизнеспособности клеток и сохранение их функций. 3.4. Изучение специфической активности биорегуляторов, выделенных из подорожника и алоэ, на модели кожной раны мыши in vivo Наиболее выраженное протекторное действие биорегуляторов, выделенных из подорожника и алоэ, было продемонстрировано на модели экспериментальной травмы кожи мыши in vivo. У всех экспериментальных животных на спине наносили стандартную рану. Через 11 сутки после операции у всех экспериментальных животных наблюдали практически полную реэпителизацию раневой поверхности, незначительное воспаление в субэпидермальной зоне. У мышей контрольной группы (необработанная рана) происходило образование фиброзного рубца – отмечено параллельное эпидермису расположение коллагеновых волокон в виде плотных тяжей (рис.22а). При обработке раны физиологическим раствором также наблюдали образование соединительно-тканного рубца, однако в центральной части раны отсутствовало полное заживление и реэпитализация, поскольку образовался очаг хронического воспаления. В подкожной ткани практически не наблюдали жировых клеток; волокна коллагена были более рыхлые, чем в дерме (рис.22б). У мышей опытных групп (действие биорегуляторов, выделенных соответственно из подорожника и алоэ) наблюдали восстановление субэпидермальных слоев (рис.23а,б). Следует отметить комплексный характер репаративных процессов, протекающий при воздействии растительных биорегуляторов, по сравнению с контролем: наблюдали практически полное восстановление эпителия и дермы, в которой были отмечены кровеносные сосуды, а расположение волокон в дерме было более рыхлым, чем в контроле. Помимо этого, при воздействии фракций подорожника в подкожной жировой ткани отмечали интенсивное разрастание жировой ткани и восстановление протоков желез; в контроле на месте повреждения не происходило восстановления жировой ткани, а также не было восстановления протоков желез. Восстановление протоков потовых желез говорит о возобновлении их активности в данном участке кожи, а восстановление рыхлой структуры коллагеновых волокон в дерме свидетельствует о появлении эластичности кожи. 79 а. б. Рис.22. Ранозаживление кожи мыши на 11 сутки после нанесения раны: а - без обработки раны (контроль); б - действие физиологического раствора. а. б Рис.23. Влияние ИЭФ-фракции (pH<3,0) растительных биорегуляторов на ранозаживление кожи мыши на 11 сутки после нанесения раны: а - подорожник; б - алоэ. Д 80 Полученные данные показывают, что фракции, выделенные из подорожника, в СМД стимулируют ранозаживление у мышей in vivo, способствуя восстановлению нормальной морфологии кожи, без образования рубцовой ткани (рис.23). В проведенном исследовании впервые было показано, что в тканях подорожника и алоэ присутствуют ранее неизученные биорегуляторы, которые проявляли свойственное данным лекарственным растениям биологическое действие. 3.5. Изучение специфической активности растительных биорегуляторов на модели проращивания семян Отдельной задачей исследования растительных биорегуляторов является определение их функции собственно в растениях. Результаты исследования локализации растительных биорегуляторов, приведенные выше, показали, что в сформировавшемся листе подорожника биорегулятор обнаруживается в межклеточном пространстве ткани, в то время как при интенсивном росте листьев чеснока растительный биорегулятор локализован в меристеме. В настоящей работе для оценки влияния растительных биорегуляторов на рост растений была применена модель проращивания семян. В данном исследовании нами были взяты супернатанты растворов биорегуляторов, выделенных из лука и укропа, в концентрации, соответствующей 10-14 и 10-12 мг белка/мл соответственно. Результаты эксперимента оценивали по биометрическим параметрам: высота побега, длина корня, вес побега, вес корня, всхожесть. В отдельных случаях комбинация параметров варьировалась в зависимости от возможности адекватного фиксирования того или иного параметра. Результаты данного исследования показали, что биорегулятор, выделенный из укропа, в СМД оказывал стимулирующее действие на семена фасоли, кориандра и укропа. Эффект варьировался от 3 до 86%. Как показано, в табл.5 наибольший эффект на вес стебля, вес корня и количество взошедших семян биорегулятор, выделенный из укропа, оказывал на семена фасоли и укропа; действие на семена кориандра было не столь эффективным, но оставалось достоверным (р<0,05) (табл.5). Иные результаты были получены при исследовании биорегулятора, выделенного из лука, на рост семян гороха, чеснока, укропа и лука (р<0,05). В табл.6 приведены данные, которые показывают, что при воздействии данного биорегулятора наблюдали уменьшение веса корня и количества взошедших семян гороха, всхожести семян чеснока, длины и веса стебля, всхожести семян укропа, высоты побега и всхожести семян лука (р<0,05). Из табл.6 видно, что в отдельных случаях ингибирование роста семян достигало 31%. 81 Следует отметить, что как при стимулирующем действии биорегулятора, выделенного из укропа, так и при ингибирующем влиянии биорегулятора, выделенного из лука, отмечали изменение комбинации различных биометрических параметров семян: например, изменение длины корня, веса стебля, всхожесть и т.д. Однако общая тенденция при действии растительных биорегуляторов сохранялась, которая выражалась в достоверном изменении определенных параметров. Таким образом, на основании результатов проведенного исследования можно заключить, что растительные биорегуляторы оказывают влияние на рост и всхожесть семян. Их действие может быть охарактеризовано как стимулирующее, так и ингибирующее. Очевидно, что это связано с источником выделения растительного биорегулятора и объектов его воздействия. Полученные данные указывают на актуальность более детального исследования данного вопроса. Можно предположить, что выбор пар «биорегулятор-мишень» для ряда растений позволит использовать эти знания для стимуляции одних видов растений и ингибирования других при полной экологической безопасности. Таблица 5. Результаты проращивания семян при действии биорегулятора, выделенного из укропа, в концентрации, соответствующей 10-12 мг белка/мл, на 12 сутки культивирования Семена растения Фасоль (Phaseolus L.) Кориандр (Coriandrum sativum L.) Укроп (Anethum graveolens L.) Биометрический параметр Вес стебля (мг) Вес корня (мг) Контроль Опыт 411 ± 4,73 537 ± 5,16 764 ± 4,87 725 ± 5,25 Всхожесть (шт) 13 ± 2 22 ± 3 Высота побега (см) Вес побега (мг) 5,86 ± 0,4 167 ± 3,25 6,03 ± 0,4 210 ± 3,69 Всхожесть (шт) 91 ± 2 97 ± 2 Высота побега (см) Вес побега (мг) 4,41 ± 0,5 450 ± 0,48 7,81 ± 0,6 560 ± 0,49 Всхожесть (шт) 44 ± 2 61 ± 3 Эффект (+) % 86 35 69 3 25 6 78 24 38 82 Таблица 6. Результаты проращивания семян при действии биорегулятора, выделенного из лука, в концентрации, соответствующей 10-14 мг белка/мл, на 12 сутки культивирования Семена растения Горох (Pisum sativum L.) Укроп (Anethum graveolens L.) Лук (Allium сера L.) Биометрический параметр Вес корня (мг) Контроль Опыт Эффект (-)% 127 ± 1,9 118 ± 3,6 3 Всхожесть (шт) 62 ± 2 43 ± 3 31 Высота побега (см) 5,2 ± 0,2 4,75 ± 0,2 9 Вес побега (мг) 10,2 ± 0,03 8,9 ± 0,03 13 Высота побега (см) 8,9 ± 0,2 7,8 ± 0,2 12 3.6. Исследование растительных препаратов на реакцию гиперчувствительности замеделенного типа (ГЗТ) Реакция гиперчувствительности замедленного типа является одной из форм клеточного иммунного ответа организма. В данном исследовании на реакцию ГЗТ изучали биорегуляторы, полученные из алоэ, подорожника, лука, чеснока и лимона. В ходе эксперимента наблюдали увеличение реакции ГЗТ в опытных группах. Данный факт свидетельствует о стимуляции клеточного иммунитета: происходит активация CD4 Tклеток воспаления (Th1 клеток) и макрофагов, которые продуцируют цитокины. Все эти процессы, направленные на изоляцию патогена (или какого-либо иного антигена), завершаются за 24-48 часов формированием воспалительного очага. Результаты исследования показывают, что на первый день измерения лап мышей биорегулятор, выделенный из подорожника, в данных условиях эксперимента усиливает сенсибилизацию к модельному антигену (гемоцианину), что выражается в увеличении реакции ГЗТ и воспалении примерно в 2 раза (рис.24а). Биорегуляторы, выделенные из других выше перечисленных растений имеют тенденцию к усилению реакции ГЗТ, однако, при статистической обработке оказались недостоверно отличимыми от группы с контрольной реакцией ГЗТ. На второй день измерения картина активности не менялась, биорегулятор, выделенный из подорожника, по-прежнему достоверно отличался от контрольного значения параметра (рис.24б). На рис.24в видно, что на третий день ответ иммунной системы на действие антигена нивелировался, реакция воспаления пропадала. Следует отметить, что, не смотря на то, что гиперчувствительность замедленного типа указывает на активацию T-клеток, инфекция при этом не всегда ликвидируется, т.е. защитный иммунитет и гиперчувствительность замедленного типа не обязательно 83 совпадают. Поэтому некоторые лица с гиперчувствительностью замедленного типа могут оставаться незащищенными от возможной инфекции. Таким образом, данное исследование показывает, что биорегулятор, выделенный из подорожника, достоверно усиливается реакцию ГЗТ, т.е. способствует активации клеточного иммунитета. а. 2,1 1,8 1,5 1,2 0,9 0,6 0,3 0 -0,3 №1 №2 №3 №4 №5 №6 №7 №5 №6 №7 б. 1,8 1,3 0,8 0,3 -0,2 №1 №2 №3 №4 84 в. 2,1 1,6 1,1 0,6 0,1 №1 №2 №3 №4 №5 №6 №7 -0,4 Рис.24. Диаграмма, отражающая результаты эксперимента по проведению реакции ГЗТ. По оси абсцисс отложены номера групп, №; по оси ординат - М (средняя разница суммы правой и левой лап у мышей в группе). А – первый день эксперимента, б – второй день эксперимента, в – третий день эксперимента. Обозначение групп: №1-контроль, №2- ГЗТ, №3-биорегулятор, выделенный из алоэ, №4-биорегулятор, выделенный из подорожника, №5-биорегулятор, выделенный из лука, №6-биорегулятор, выделенный из чеснока, №7-биорегулятор, выделенный из лимона; данные достоверно отличимые от контрольной группы ГЗТ отмечены зеленым цветом; (р<0,05) Анализ полученных в данном исследовании результатов позволяет заключить следующее. На примере изучения ряда растений было показано, что в их тканях присутствует новая группа биорегуляторов, проявляющая сходные физико-химические свойства с МГТБ животного происхождения. Растительные биорегуляторы проявляют биологическое действие, характер которого сходен с МГТБ животного происхождения. Так, например, было показано, что биорегуляторы, выделенные из подорожника и алоэ, в сверхмалых дозах (10-8-10-15 мг белка/мл) проявляют ранозаживляющее свойство, которое выражается в поддержании структуры ткани межклеточных адгезионных взаимодействий, увеличении жизнеспособности клеток. Таким образом, показано, что биорегуляторы отражают биологическое действие растений, из которых они были выделены. Также как и МГТБ растительные биорегуляторы, очевидно, имеют сложный состав: они содержат биологически активные пептиды (мол. масса не более 8 000 Да), углеводы, липиды, белки. Для биорегулятора, выделенного из лука, было показано, что в его состав входит биологически активный пептид с молекулярной массой 4036±2 Да. Для данного пептида была определена 18-членная С-концевая аминокислотная последовательность. Физико-химическими методами было показано, что молекулы биорегуляторов, 85 выделенных из растений, аналогично биорегуляторам животного происхождения способны образовывать в водных растворах довольно крупные агломераты размером до 110 нм. Используя экспериментальную модель проращивания семян, было продемонстрировано влияние биорегуляторы растительного происхождения могут поразному влиять на рост семян ряда культурных растений. Иммуногистохимическими методами была определена внеклеточная локализация биорегуляторов, выделенных из подорожника большого, чеснока и лука репчатого. А именно, биорегуляторы, выделенные из листьев подорожника, луковицы и листа лука, а также из луковицы чеснока, локализованы в межклеточном пространстве соответствующей ткани растения, из которого были выделены. Биорегулятор, выделенный из чеснока, был локализован в межклеточном пространстве меристемы. Полученные результаты по внеклеточной локализации совпадают с данными, полученными при изучении локализации МГТБ [Borisenko et al., 2007; Nazarova et al., 2007]. 3.7. Общее обсуждение В данной диссертационной работе показано, что в состав биорегуляторов, выделенных из тканей растений, так же, как и в случае МГТБ животного происхождения, входят биологически активные пептиды. Следует отметить, что эти пептиды имеют невысокие значения молекулярных масс (до 10 000 Да) и обладают биологической активностью. В связи с этим весьма актуальным является вопрос о происхождении данных пептидов. Являются ли они продуктами протеолиза белков ВКМ или нет? В этом аспекте стоит отметить, что протеолиз белков ВКМ немало важен, поскольку обеспечивает их биосинтез и постоянное обновление. Нарушение этих процессов приводит к возникновению серьезных патологий, так, например, для тканей глаза недостаточная экспрессия протеаз является причиной разрастания стромального слоя, а избыточная секреция ферментов, в свою очередь, приводит к нарушению целостности роговицы [Matsubara et al., 1991]. Протеолиз белков ВКМ необходим также для процесса деадгезии клеток, что является обязательным условием для их миграции. Например, активатор плазминогена урокиназного типа за счет разрушения связей между фибронектином и их рецепторами через фибронектиновый матрикс поддерживает миграцию эпителиальных клеток [Morimoto et al., 1993]. Для сетчатки глаза так же известны физиологически активные пептиды, образующиеся в результате гидролиза белков [Bringmann, Reichenbach, 2001]. 86 Имеет ли место выше описанный сценарий для тканей растений. Ответ на этот вопрос является весьма актуальным в свете описанной выше проблемы. На сегодняшний день по литературным данным известно немного. Сообщается, что лишь отдельные представители матриксных металлопротеаз (MMP) были идентифицированы в растениях, и только некоторые из них охарактеризованы. В 1979 году Ragster and Chrispeel описали первого представителя MMP (выделенный из листьев соевых бобов (Glycine max)) в высших растениях. Этот белок был очищен и охарактеризован только в 1991, и благодаря структурным и биохимическим сходством с MMP тканей животных он был назван металлоэндопротеиназой-1 соевых бобов (SMEP-1) [Graham et al. 1991, McGeehan et al., 1992, Pak et al., 1997]. Также были выделены и другие представители MMP из Arabidopsis [Maidment et al. 1999, Golldack et al. 2002], огурца [Delorme et al. 2000], люцерны (Medicago) [Combier et al. 2007], соевых бобов [Liu et al. 2001] и т.д. Функция MMP протеаз в высших растениях пока еще неясна, однако, предполагается, что так же как и в животных тканях они могут принимать участие в обновлении ВКМ в течение роста и развития растения [Pak et al., 1997; Maidment et al., 1999; Delorme et al., 2000; Liu et al., 2001; Combier et al., 2007; Flinn, 2008; Ratnaparkhe et al., 2009]. Было показано, что протеазы SMEP1/Gm1-MMP, выделенные из соевых бобов, экспрессируются только в сформировавшихся листьях [Pak et al., 1997]. Таким образом предполагается, что они играют роль в восстановлении тканей в течение развития растения. Cs1-MMP, обнаруженный в огурце, связан со старением и смертью клеток семядоли [Delorme et al., 2000]. В геноме Arabidopsis thaliana были идентифицированы пять генов, кодирующих MMP-подобные протеазы - At1/5-MMP [Maidment et al., 1999]. На двух недельных растениях было показано, что они дифференциально экспрессируются в корнях, листьях, стеблях и цветках [Maidment et al., 1999]. Для каждого At1/5-MMP характерна экспрессия строго в определенной ткани или органе [Flinn, 2008]. Для At1MMP и At4-MMP показана сходная схожая экспрессии, причем число их одинаково увеличивается в период созревания семян; At2-MMP экспрессировались в молодых и развивающихся розетках молодого цветка и зрелого стручка, в то время как уровень экспрессии протеазы At3-MMP в течение всего развития был низок. И только At5-MMP на протяжении развития всех тканей и органах экспрессируется постоянно [Flinn, 2008]. В качестве одной из функций MMP в тканях растений является их участие в ответной реакции растения на стресс [Liu et al. 2001, Golldack et al. 2002, Combier et al. 2007, Schiermeyer et al. 2009]. Например, в табаке уровень экспрессии протеазы Nt1-MMP весьма низок, однако заражение растения фитопатогенной грам-положительной палочковидной бактерией Pseudomonas syringae способствует более интенсивной 87 экспрессии протеазы [Schiermeyer et al. 2009]. Экспрессия протеазы Mt1-MMP в люцерне инициируется грам-отрицательной бактерией Sinorhizobium meliloti [Combier et al., 2007]. Согласно литературным данным, субстраты для растительных MMP на сегодняшний день пока не идентифицированы. Однако, для описания характеристик растительных MMP были использованы нативные или рекомбинантных протеазы субстратов основных животных протеаз [McGeehan et al. 1992, Maidment et al. 1999, Delorme et al. 2000, Liu et al., 2001, Ratnaparkhe et al. 2009, Schiermeyer et al. 2009, Mandal et al., 2010]. Было показано, что At1-MMP [Maidment et al. 1999], Gm2-MMP [Liu et al. 2001] и Pta1-MMP [Ratnaparkhe et al. 2009] обладают свойством деградировать миелин основные белки, в то время как Cs1-MMP [Delorme et al. 2000] и Nt1-MMP [Mandal et al. 2010] способствуют деградации желатина. Nt1-MMP является единственной растительной протеазой, обладающей казеинолитической активностью [Schiermeyer et al. 2009, Mandal et al. 2010]. Некоторые синтетические пептиды, полученные для MMP позвоночных животных, были использованы для характеристики протеазной активности рекомбинантных SMEP1/Gm1MMP [McGeehan et al., 1992], At1-MMP [Maidment et al. 1999], Cs1-MMP [Delorme et al. 2000] и Nt1-MMP [Mandal et al. 2010]. Являясь металлопротеиназами, все растительные MMP ингибируются хелатами, например, ЭДТА, ЭГТА или 1,10- фенантролин [Graham et al. 1991, Maidment et al. 1999, Delorme et al., 2000, Liu et al. 2001, Ratnaparkhe et al. 2009, Schiermeyer et al. 2009, Mandal et al. 2010]. В тканях животных активность MMP регулируется тканевыми ингибиторами металлопротеиназ (TIMP), семейством эндогенных биорегуляторов [Brew et al., 2010]. Было показано, что отдельные представители TIMP способны ингибировать активность и растительных MMP. Активность протеазы At1-MMP ингибируется TIMP-1 и TIMP-2 [Maidment et al. 1999], TIMP-1 ингибирует также SMEP1/Gm1-MMP [McGeehan et al. 1992], в то время, как активность Cs1-MMP в незначительной степени может быть подавлена лишь TIMP-1, а не TIMP-2, -3 или -4 [Delorme et al. 2000]. Гомологи TIMP были обнаружены и в клетках тканей беспозвоночных животных [Brew et al., 2010], однако они не были идентифицированы в клетках тканей растений. Таким образом, можно заключить, что способность растительных MMP взаимодействовать с TIMP предполагает присутствие сходных механизмов в растениях и позвоночных животных. 88 ВЫВОДЫ 1. Впервые было показано, что в тканях ряда растений (подорожник большой, лук репчатый, чеснок, укроп пахучий, алоэ древовидное, кориандр посевной и лимон) присутствуют биорегуляторы, физико-химические свойства которых сходны с биорегуляторами, выделенными из тканей животных: они растворимы в насыщенном растворе сернокислого аммония, в их состав входят биологически активные пептиды, в водных растворах они присутствуют в виде наноразмерных частиц (до 110 нм); 2. Биорегуляторы растительного происхождения проявляют мембранотропную активность, которая характеризуется полимодальной дозовой зависимостью и проявлением в концентрациях, соответствующих 10-4 - 10-15 мг белка/мл; 3. Показано, что в состав биорегулятора, выделенного из лука, входит биологически активный пептид с молекулярной массой 4036±2 Да, 18-членная С-концевая последовательность которого является уникальной и представляет собой: -GlyPheGlyGluGlyAlaTyrThrGlyAlaValAlaAlaGlyThrGluGlyArg; 4. Установлено, что биорегуляторы, выделенные из подорожника и алоэ, оказывают в концентрации, соответствующей 10-12 мг белка/мл, свойственное данным растениям протекторное действие на ткань кожи тритона (Pleurodeles waltl) in vitro при роллерном органном культивировании, которое выражалось в поддержании нормальной морфологии ткани кожи тритона, секреции желез, увеличение жизнеспособности клеток по сравнению с контролем; 5. Показано, что биорегуляторы, выделенные из подорожника и алоэ, в концентрации, соответствующей 10-12 мг белка/мл, оказывают ранозаживляющее действие на кожу на модели экспериментальной раны у мышей in vivo. 6. Показано, что биорегуляторы, выделенные из лука репчатого и укропа пахучего, в концентрациях, соответствующих 10-14 и 10-12 мг белка/мл, оказывают влияние на рост и развитие семян ряда растений, причем характер этого действия может быть как ингибирующим, так и стимулирующим, соответственно; 7. Методами иммуногистохимии показано, что растительные биорегуляторы локализованы внеклеточно: в листе подорожника биорегулятор, выделенный из подорожника, локализован в межклеточном пространстве ткани этого растения; биорегулятор, выделенный из луковиц чеснока, в листьях чеснока локализован на поверхности клеток губчатого мезофилла и эпидермиса; биорегуляторы, выделенные из луковиц лука и чеснока, также локализованы внеклеточно в тканях луковиц соответствующего растения; 89 8. С помощью реакции на гиперчувствительность замедленного типа показана способность биорегулятора, выделенного из подорожника большого, стимулировать клеточный иммунитет. 90 Список литературы Борисенко А.В., Благодатских И.В., Березин Б.Б., Краюхина М.А., 1. Липницкий Е.М., Лычников Д.С., Рубашникова Е.В., Ямскова В.П., Ямсков И.А. Биологически активные в сверхмалых дозах регуляторные пептиды, выделенные из печени, сыворотки крови и желчи млекопитающих Сборник // тезисов IV Международного Конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине». 2006. С.70. 2. Действие Буеверова Э.И., Брагина Е.В., Резникова М.М., Ямскова В.П., Хрущов Н.Г. адгезионного фактора сыворотки крови на пролиферацию клеток млекопитающих in vitro // ДАН СССР. 1985. Т. 281. №1. C.158-160. 3. Васильев А.Е., Воронин Н.С., Еленевский А.Г., Серебрякова М.И. Ботаника. Анатомия и морфология растений. - М.: Наука. 1978. С.95. 4. Гундорова Р.А., Хорошилова-Маслова И.П., Ченцова Е.В., Илатовская Л.В., Ямскова В.П., Романова И.Ю. Применение адгелона в лечении проникающих ранений роговицы в эксперименте // Вопросы офтальмологии. 1997. Т.113. №2. С.12-15. 5. Гундорова Р.А., Ченцова Е.В., Ямскова В.П., Романова И.Ю. Применение нового фармакологического препарата Адгелон в офтальмологии // Онтогенез. 2000. Т.31. №4. С.272-273. 6. Дольникова А.Э., Сологуб А.А., Строева О.Г., Ямскова В.П. Роль кальций- зависимого и кальций-независимого механизмов в адгезии клеток сетчатки и пигментного эпителия куриных зародышей // Онтогенез. 1985б. Т.16. №2. С.149-155. 7. Дольникова А.Э., Ямскова В.П., Сологуб А.А., Строева О.Г. Биохимическая характеристика адгезионных факторов клеток сетчатки куриных зародышей // Онтогенез. 1985а. Т.16. №5. С.497-506. 8. Дольникова А.Э., Ямскова В.П., Сологуб А.А., Строева О.Г. Исследования специфической и неспецифической адгезии в процессе агрегации клеток сетчатки куриных зародышей // Онтогенез. 1986. Т.17. №6. С.620-626. 9. Дольникова А.Э., Ямскова В.П. Молекулярные факторы адгезии клеток нейральных тканей, Са2+-независимая система адгезии // Онтогенез. 1990. Т.21. №4. C.358-367. 10. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991. С.544. 11. Евстратов А.В., Ямскова В.П., Буеверова Э.И., Брагина Е.В., Резникова М.М. Исследование аминокислотного состава высокоочищенной фракции адгезина из 91 сыворотки крови крупного рогатого скота и ее действие на пролиферацию клеток млекопитающих in vitro // Журнал общей биологии. 1988. T.49. №5. C.704-708. 12. Каспаров А.А., Розинова В.Н., Ямскова В.П. Питательная среда с Адгелоном для консервации роговицы донора // Онтогенез. 2000. Т.31. №4. С.273-274. 13. Краснов М.С., Григорян Э.Н., Ямскова В.П., Богуславский Д.В., Ямсков И.А. Регуляторные белки тканей глаза позвоночных // Радиационная биология и радиоэкология. 2003а. №3. С.265-268. 14. Краснов М.С., Григорян Э.Н, Ямскова В.П. Модель органотипического культивирования сетчатки вместе с тканями заднего сектора глаза тритона для изучения действия адгезивных гликопротеинов // Изв. Акад. Наук. серия биол. 2003б. №1. С.22-36. 15. Ленинджер А. Основы биохимии. М.: Мир. 1985. Т.1. С.367. 16. Максютина Н.П. Оксикоричные кислоты Plantago major и P. lanceolata // Химия природных соединений. 1971. №6. С.824–825. 17. Максютин Г.В. Аминокислоты в листьях Plantago major L. и соцветиях Matricaria recutita L. // Растительные ресурсы. 1972. Т.8. №1. С.110–112. 18. Маленков А.Г., Модянова Е.А. Прочность межклеточных контактов и пролиферативный пул в мышиных гепатомах // Цитология. 1968. №9. С.1087-1093. 19. Маленков А.Г., Чуич Г.А. Межклеточные контакты и реакция ткани // М.: Медицина. 1979. С.135. 20. Малиновский В.И. Физиология растений. Учеб. пособие. – Владивосток: Изд-во ДВГУ. 2004. С.106. 21. Миронов В.А., Васильев Г.С., Матросов В.С., Филиппова Т.М., Замуреенко В.А., Мищенко В.В., Майрановский В.Г., Фельдштейн М.А. Физиологически активные спирты подорожника большого // Химико-фармацевтический журнал. 1983. №11. С. 1321– 1325. 22. Модянова Е.А. Изучение контактов паренхиматозных клеток печени методом диспергирования ткани // Цитология. 1968. №9. С.1081-1086. 23. Модянова Е.А. Свойства контактов клеток гепатом с минимальными отклонениями (гепатомы Гельштейн) // Цитология. 1970. Т. XII. №1. С.35-40. 24. Неверкович А.С. Оценка препарата адгелона при лечении повреждений суставного хряща // Онтогенез. 2000. Т.31. №4. С.282-283. 25. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. М.: Просвещение. 1987. С.815. 26. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М., Михайлова Т.М., Samuelsen A.B. Органические кислоты лекарственных растений. Plantago major L. // Химия природных соединений. 2005. №4. С.354–355. 92 27. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М. Разработка технологии получения экстракта подорожника большого сухого // Химия растительного сырья. 2006. №1. С.47–52. 28. Полевой В.В. Физиология растений. М.: Высш. шк. 1989. С.464. 29. Рейвн П., Эверт Р., Айкхорн С. Современная ботаника: В 2-х т. Т. 1.: Пер. с анг. М.: Мир. 1990а. С.348. 30. Рейвн П., Эверт Р., Айкхорн С. Современная ботаника: В 2-х т. Т. 2.: Пер. с анг. М.: Мир. 1990б. С.344. 31. Рыбакова Е.Ю., Виноградов А.А., Ямскова В.П., Ямсков И.А. Белок- инактиватор сывороточного адгезивного гликопротеина // Онтогенез. 2000. Т.31. №4. С.278-279. 32. Скрипникова В.С., Ямскова В.П., Молявка А.А., Ильина А.П., Краснов М.С., Маргасюк Д.В., Борисенко А.В., Березин Б.Б., Кузнецова Е.С., Буряк А.К., Ямсков И.А. // Биохимия. 2009. Т. 74. № 9. С.1195-1203. 33. Тимонин А.К. Ботаника: в 4 т. Т. 3. Высшие растения. М.: Издательский центр «Академия». 2007. С.352. 34. Туманова Н.Б., Ямскова В.П. Нарушение молекулярных механизмов клеточной адгезии в печени мышей при генетической предрасположенности к спонтанному бластомогенезу // Извест. Акад. наук, серия биол. 1995. №.3. С.261-265. 35. Ушаков В.Ф., Черненко Ю.П. Адгезионная прочность ультраструктурных элементов контактов гепатоцитов // Биофизика. 1978. Т.23. №3. С.558-559. 36. Ушаков В.Ф. Механическая модель контакта гепатоцитов // Биофизика. 1980. Т.25. №3. С.491-493. 37. Ушаков В.Ф. Механические свойства межклеточных контактов // Киев. Здоров’я. 1982. C.33-53. 38. Хасигов П.З., Хасанбаева Г.Ш., Рубачев П.Г., Николаев А.Я., Грачев С.В. Белки базальных мембран // Биохимия. 1996 Т.61(7). С.1152-1168. 39. Ченцова Е.В., Романова И.Ю., Гундорова Р.А. «Адгелон» - глазные капли нового поколения. Перспективы применения в офтальмотравматологии // Научнопрактическая конференция «Нанотехнологии в диагностике и лечении патологии органа зрения» 23-24 апреля. Москва. 2008. С.41-44. 40. Чухно В.П., Рожко Н. Иллюстрированный энциклопедический словарь «Лекарственные растения». М.: Эксмо. 2007, С.360. 41. Ямскова В.П., Модянова Е.А., Резникова М.М., Маленков А.Г. Высокоактивные тканевоспецифические адгезионные факторы печени и легкого // Молек. биол.. 1977. Т.11. №5. C.1147-1154. 93 42. Ямскова В.П., Модянова Е.А., Левенталь В.И., Ланковская Т.П., Бочарова О.К., Маленков А.Г. Тканевоспецифические макромолекулярные факторы из печени и легкого: очистка и действие на механическую прочность ткани и клеток // Биофизика. 1977. Т.22. С.168-174. 43. Ямскова В.П. Роль ионов кальция в стабилизации адгезионного фактора печени крыс // Биофизика. 1978. Т.23. C.428-432. 44. Ямскова В.П., Резникова М.М. Роль макромолекулярных компонентов клеточной поверхности в специфической адгезии клеток // Успехи биол. химии. 1979. Т.20. C.95-112. 45. Ямскова В.П., Резникова М.М. Адгезин-фактор из сыворотки крови животных и человека // Журн. общей биологии. 1984. Т.45. №3. C.373-382. 46. Ямскова В.П., Туманова Н.Б., Логинов А.С. Сравнительное исследование действия экстрактов печени мышей линии С57Вl и СВА на адгезию гепатоцитов // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1990. №3. C.303-306. 47. Ямскова В.П., Резникова М.М. Низкомолекулярный полипептид сыворотки крови теплокровных: влияние на клеточную адгезию и пролиферацию // Журн. общей биологии. 1991. Т.52. №2. С.181-191. 48. Ямскова В.П., Нечаева Н.В., Туманова Н.Б., Юровицкий Ю.Г., Новикова Т.Е., Фатеева В.И., Гвазава И.Г. Исследование влияния макромолекулярных адгезионных факторов, выделенных из сыворотки крови и печени млекопитающих на интенсивность синтеза белка и содержание АТФ в гепатоцитах in vitro // Изв. Акад. наук, сер. биол. 1994. №2. С.190-196. 49. Ямсков И.А., Ямскова В.П. Фармакологические препараты нового поколения на основе ранее неизвестных биорегуляторов-гликопротеинов клеточного микроокружения // Рос. Хим. ж. (ЖРХО им. Д.И. Менделеева). 1998. Т.42. №3. С.85-90. 50. Ямсков И.А., Ямскова В.П., Даниленко А.Н., Клеменкова З.С., Антипов Б.Г., Черников Ф.Р., Гусынина М.М., Рыбакова Е.Ю. Экспериментальные доказательства роли физико-химических факторов в механизме биологического действия сверхмалых доз // Рос. Хим. Ж. (ЖРХО им. Д.И. Менделеева). 1999. Т.43. №5. С. 34-39. 51. Ямсков И.А., Виноградов А.А., Даниленко А.Н., Маслова Л.А., Рыбакова Е.Ю., Ямскова В.П. Низкомолекулярный гликопротеин из сыворотки крови крупного рогатого скота: структура и свойства // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т.37. №1. С.36-42. 94 52. Ямскова В.П., Рыбакова Е.Ю., Виноградов А.А., Вечеркин В.В., Ямсков И.А. Исследование белка-инактиватора адгезивного гликопротеина из сыворотки крови млекопитающих.// Прикладная биохимия и микробиология. 2004. Т.40. №4. С.407-413. 53. Ямскова В.П., Рыбакова Е.Ю., Виноградов А.А., Вечеркин В.В., Ямсков И.А. Исследование белка-инактиватора адгезивного гликопротеина из сыворотки крови млекопитающих.// Прикладная биохимия и микробиология. 2004. Т.40. №4. С.407-413. 54. Ямскова В.П., Краснов М.С., Ямсков И.А. Наноразмерные биорегуляторы тканей глаза млекопитающих как основа для фармакологических препаратов нового поколения. М.: МАКС Пресс. 2009. С.84. 55. Acevedo-Duncan M., Russell C., Patel S., Patel R.. Aloe-emodin modulates PKC isoenzymes, inhibits proliferation, and induces apoptosis in U-373MG glioma cells // Int. Immunopharmacol. 2004. V.4. P.1775–1784. 56. Ahmad M.S., Ahmad M.U., Osman S.M. A New Hydroxyolephinic Acid from Plantago major Seed Oil // Phytochemistry. 1980. V.19. P.2127–2139. 57. Ahmed Z.F., Hammouda F.M., Rizk A.M., Wassel G.M. Phytochemical Studies of Egyptian Plantago species // Planta Medica. 1967. V.4. P.404–410. 58. Ahmed Z.F., Rizk A.M., Hammouda F.M. Phytochemical Studies of Egyptian Plantago species (Glucides) // J. Pharm. Sci. 1965. V.54. P.1060–1062. 59. Anderson H. Adhesion molecules and animal development. // Experientia. 1990. V.46. P.2-13. 60. Aslani M.R., Mohri M., Chekani M. Effects of garlic (Allium sativum) and its chief compound, allicin, on acute lethality of cyanide in rats // Comp. Clinical Pathology. 2006. V.5. P.211-213. 61. Bakker M.I., Baas W.J., Sum D.T.H.M., Koloffel C. Leaf Wax of Lactuca sativa and Plantago major // Phytochemistry. 1998. V.47. P.1489–1493. 62. Balluska F., Samaj J. Worraszek P., Volkmann D., Menzel D. Cytoskeleton- plasma membrane-cell wall continuum in plants // Plant Physiology. 2003. V.133. P.482-491. 63. Benavente-Garcı´a, O., Castillo, J., Sabater, F., Del Rı´o J. A. O- Methyltransferase from Citrus. A comparative study in Citrus aurantium // Plant Physiol. Biochem. 1997b. V.40. P.785–794. 64. Berkarda, B., Koyuncu, H., Soybir, G., Baykut, F. Inhibitory effect of hesperidin on tumour initiation and promotion in mouse skin // Res. Experim. Medicine. 1998. V.198. P.93–99. 95 65. Berqvist, D., Hallbrook T., Lindblad B., Lindhagen A.. A double blind trial of O- (b-hydroxy ethyl)-rutinosides in patients with chronic venous insufficiency // Vasa. 1981. V.10. P.253–260. 66. Borisenko A.V., Yamskova V.P., Krasnov M.S., Blagodatskikh I.V., Vecherkin V.V., Yamskov I.A. “Regulatory proteins from the mammalian liver that display biological activity at ultra low doses” pp. 35-45 // In the book “Biochemical Physics Frontal Research”, Ed. by Varfolomeev S.D., Burlakova E.B., Popov A.A., Zaikov G.E. Hauppauge NY. Nova Science Publishers Inc. 2007. Р.35-46. 67. Brew H., Nagase K. (2010) The tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): An ancient family with structural and functional diversity // Biochim. Biophys. Acta. 2010. V.1803. P.55–71 68. Bringmann A., Reichenbach A. Role of Muller cells in retinal degeneration // Front. Biosci. 2001. V.6. P.372 - 392. 69. Cassab G.I. 1998. Plant cell wall proteins // Annual Review of Plant Physiology and plant molecular Biology. V 49. P.281-309. 70. Chatterton N.J., Harrison P.A., Thornly W.R., Bennett J.H. Sucrosyloligosaccharides and Cool Temperature Growth in 14 Forb Species // Plant Physiol. Biochem. 1990. V.28. P.167–172. 71. Coman D.R. Cellular adhesiveness in relation to invasioness of cancer: electron microscopy of liver perfused with a chelating agent // Cancer res. 1954. V.14. №7. P. 519521. 72. Coman D.R. Decreased mutual adhesiveness, a property of cell from squamous- cell carcinomas // Cancer res. 1944. V.4. P.625-629. 73. Combier J.-P., Vernié T., de Billy F., El Yahyaoui F., Mathis R., Gamas P. The MtMMPL1 early nodulin is a novel member of the matrix metalloendoproteinase family with a role in Medicago truncatula infection by Sinorhizobium meliloti // Plant Physiology. 2007. V.144. P.703–716. 74. Creaser E.H., Russell L.M. Further characterization of a protein promoting aggregation of retina cells // Biochem. J. 1971. V.123(1). P.127-8. 75. Cui S., Arosio D., Doherty K.M., Brosh R.M., Falaschi A., Vindigni A. Analysis of the unwinding activity of the dimeric RecQ1 helicase in the presence of human replication protein A // Nucleic Acids Res. 2004. V.32. P.2158-2170. 76. Damsky C., Richa J., Solter D., Knudsen K., Buck C. Identification and purification of a cell surface glycoprotein mediating intercellular adhesion in embryonic and adult tissue // Cell. 1983. V.34. P.455-456. 96 77. Delorme V.G.R., McCabe P.F., Kim D.-J., Leaver C.J. A matrix metalloproteinase gene is expressed at the boundary of senescence and programmed cell death in cucumber // Plant Physiology. 2000. V.123. P.917–927. 78. Discher D.E, Mooney D.J, Zandstra P.W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells // Science. 2009. V.324. P.1673-1677. 79. Donato R. S-100 proteins // Cell Calcium. 1986. V.7. P.123-145 80. Engel A., Muller D.J. // Nat. Struct. Biol. 2000. V.7. P.715-718. 81. Engler A.J, Sen S., Sweeney H.L., Discher D.E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification // Cell. 2006. V.126. P.677-689. 82. Eshun, K., He Q. Aloe Vera: a valuable ingredient for the food // Pharmaceutical and cosmetic industries—a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 2004. V.44. P.91–96. 83. Fano G., Biocca S., Fulle S., Mariggio M.A., Belia S., Calissano P. The S-100: A protein family in search of a function // Progr. Neurobiol. 1995. V.46. P.71-82. 84. Fatima C., Siddanakoppalu N., Pramod L, Yeldur P. Identity of the immunomodulatory proteins from garlic (Allium sativum) with the major garlic lectins or agglutinins // Venkatesh International Immunopharmacology. 2010. V.10. P.316–324. 85. Fernandez-Botran R. Soluble cytokine receptors: their role in immunoregulation // FASEB J. 1991. V.5 (11). P.2567-74. 86. Flinn B.S. Plant extracellular matrix metalloproteinase // Funct Plant Biol. 2008. V.35. P.1183–1193 87. Gallin W., Edelman G., Cunningham B. Characterisation of L-CAM, a major cell adhesion molecule from embryonic liver cells // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1983. V.80. P.10381042. 88. Gilula N. Structure of intercellular junctions // In: “ Intercellular Junction and Synapses: Receptor and Recognition”. Eds. Feldman J., Gilula N., Pitts J. Chapman and Hall. London. 1978. V.2. P.1-19. 89. Gilula N. Gap junctional contact between cells // In: "The cell in contact". Eds. Edelman G., Thiery J.-P.: The Neuroscieces Institute Publication John Wiley&Sons. 1985. P.395-411. 90. Golldack D., Popova O.V., Dietz K.-J. Mutation of the matrix metalloproteinase At2-MMP inhibits growth and causes late flowering and early senescence in Arabidopsis // J. Biol. Chem. 2002. V.277. P.5541–5547. 91. Goodenough D., Gilula N. The aplitting of hepatocyte gap junctions and zonula occludentes with hypertonic disaccharides // J. Cell Biol. 1974. V.61. P.575-590. 97 92. Gordon M. Hemopoietic growth factors and receptors: bound and free // Cancer Cells. 1991. V.3(4). P.127-133. 93. Graham J.S., Xiong J., Gillikin J.W. Purification and developmental analysis of a metalloendoproteinase from the leaves of Glycine max // Plant Physiology. 1991. V.9. P.786– 792. 94. Grant G.T., Morris E.R., Rees D.A., Smith P.J., Thorn D. Biological interaction between polysaccharides and divalent cations: the egg-box model // FEBS Letters. 1973. V.32. P. 195-198. 95. Gray A.M., Flatt P.R. Insulin-releasing and insulin-like activity of Agaricus campestris (mushroom) // J. Endocrinol. 1998. V.157. P.203-209. 96. Guil J.L., Torija M.E., Gimenez J.J., Rodríguez I. Identification of Fatty Acids in Edible Wild Plants by Gas Chromatography // J. Chromatogr. A. 1996. V.719. P.229–235. 97. Harborne, J.B., Baxter, H. Handbook of Natural Flavonoids. 2 Vols. John Wiley & Sons, Chichester, New York. 1999. 98. Harborne J.B., Williams C.A. 6-Hydroxyluteolin and Scutelarein as Phyletic Markers in Higher Plants // Phytochemistry. 1971. V.10. P.367–378. 99. Hatta K., Okada T., Takeichi M. A monoclonal antibody disrupting calcium- dependent cell-cell adhesionof brain tissues: possible role of its target antigen in animal pattern formation // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1985. V.82. P.2789-2793. 100. Hausman R., Moscona A. Purification and characterization of the retina specific cell-aggregating factor // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1975. V.72. P.916-919. 101. Hidehiko B., Shimpo K., Takeshi C., Takaaki K., Ikuko T., Sachiyo Y., Sayaka O., Hiroshi K., Shigeru S. Antidiabetic effects of dietary administration of Aloe arborescens Miller components on multiple low-dose streptozotocin-induced diabetes in mice: Investigation on hypoglycemic action and systemic absorption dynamics of aloe components // J. Ethnopharmacol. 2006. V.103. P.468–477. 102. Hollman, P.C.H., van Trijp, J.M.P., Buysman, M.N.C.P., Gaag, M.S.v.d., Mengelers, M.J.B., de Vries, J.H.M., Katan, M.B., 1997. Relative bioavailability of the antioxidants flavonoid quercetin from various foods in man // FEBS Lett. V.418. P.152–156. 103. Iwai H., Ishil T., Satoh S. Abscence of Arabian in the side chains of the pectic polysaccharides strongly associated with the cell walls of Nicotiana plumbaginifolla nonorganogenic callus with loosely attached constituent cells // Planta. 2001. V. 213. P. 907-915. 104. Katembe W.J., Swatzell L.J., Makaroff C.A., Kiss J.Z. Immunolocalization of integrin-like proteins in Arabidopsis and Chara // Physiologia Plantarum. 1997. V.99. P.7-14. 98 105. Krasnov M.S., Gurmizov E.P., Yamskova V.P., Yamskov I.A. Analysis of a Regulatory Peptide from the Bovine Eye Lens: Physicochemical Properties and Effect on Cataract Development in vitro and in vivo // In the book “Biochemical Physics Frontal Research”. Ed. by S.D. Varfolomeev, E.B. Burlakova, A.A. Popov, G.E. Zaikov. Hauppauge NY. Nova Science Publishers Inc. 2007. P.21-34. 106. Krasnov M.S., Yamskova V.P., Grigoryan E.N. Study of the new adhesive proteins by methods of eye tissue culture // Acta Neurobiol. Exp. 2003. V.63. №3. P.274. 107. Kreis T., Vale R. Eds. In: Guidebook to the Extracellular Matrix and Adhesion Proteins // Oxford University Press. 1993. P.176. 108. Kuroda Y. Preparation of an aggregation-promoting supernatant from embryonic chick liver cells // Exp. Cell Res. 1968. V.49. P.626-637. 109. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V.227. P.680-685. 110. Long C., Moulis C., Stanislas E., Fourasté E. L′Aucuboside et the Catalpol Dans les Feuilles the Plantago lanceolata L., Plantago major L. et Plantago media L. // Journal de Pharmacie de Belgique. 1995. V.50. P.484–488. 111. Lord E. Adhesion and cell movement during pallination: cherehez la femme // Trends Plant Science. 2000. V.5. P.368-373. 112. Liu Y., Dammann C., Bhattacharyya M.K. The matrix metalloproteinase gene GmMMP2 is activated in response to pathogenic infections in soybean // Plant Physiol. 2001. V.127. P.1788–1797. 113. Luu D.T., Marty-Mazars D., Trick M., Dumas C., Heizmann P. Pollen-stigma adhesion in Brassica spp. involves SLG and SLRI glucoproteins // Plant Cell. 1999. V.11. P.251262. 114. Maidment J.M., Moore D., Murphy G.P., Murphy G., Clark I.M. Matrix metalloproteinase homologues from Arabidopsis thaliana // J. Biol. Chem. 1999. V.274. P.34706–34710. 115. Mandal M.K., Fischer R., Schillberg S., Schiermeyer A. Biochemical properties of the matrix metalloproteinase NtMMP1 from Nicotiana tabacum cv. BY-2 suspension cells // Planta. 2010.V. 232. P.899–910. 116. Margasyuk D.V., Krasnov M.S., Blagodatskikh I.V., Grigoryan E.N., Yamskova V.P., Yamskov I.A. “Regulatory Protein from Bovine Cornea: Localization and Biological Activity”, pp. 49-56 // In the book «Biochemical Physics Frontal Research», Ed. by Varfolomeev S.D., Burlakova E.B., Popov A.A., Zaikov G.E. Hauppauge NY. Nova Science Publishers Inc. 99 2007. P.47-60 Marastoni S, Ligresti G, Lorenzon E, Colombatti A., Mongiat M. Extracellular matrix: a matter of life and death // Connect.Tissue Res. 2008. V.49. P.203-206. 117. Martin G.R., Rohrbach D.H., Terranova V.P., Liotta L.A. Structure, function and pathology of basement membranes // In Connective Tissue Diseases. Eds: Wagner B.M. and Fleischmajer R. Ed. Williams, Wilkins. Baltimore. 1983. P.57-69. 118. Masoomeh S.-G., Shokoohamiri M.-R., Amirrajab N., Behnaz M., Ali G., Farideh Z., Golnar S., Mehdi R.-A. Invitroantifungal activities of Allium cepa, Allium sativum and ketoconazole against some pathogenic yeasts and dermatophytes I // Fitoterapia. 2006. V.77. P.321–323. 119. Matasyoh J.C., Maiyo Z.C., Ngure R.M., Chepkorri R. Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oil of Coriandrum sativum // Food Chem. 2009. V.113. I.2. P.526-529. 120. Matsubara M., Zieske J.D., Fini M.E. Mechanism of basement membrane dissolution preceding corneal ulceration // Invest Ophthalmol Vis Sci. 1991. V.32. P.3221 3237. 121. McGeehan G., Burkhart W., Anderegg R., Becherer J.D., Gillikin J.W., Graham J.S. Sequencing and characterization of the soybean leaf metalloproteinase // Plant Physiol. 1992. V.99. P.1179–1183. 122. Miyake, Y., Yamamoto, K., Morimitsu, Y., Osawa, T. Characterization of antioxidative flavonoids glycosides in lemon fruit // Food Sci. Technol. Int. 1998. V.4. P.48–53. 123. Modjanova E., Malenkov A. Alteration of properties of cell contacts during progression of hepatomes // Exp. Cell. Res. 1973. V.76. P.305-314. 124. Moore B. A soluble protein characteristic of the nervous system // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1965. V.19. P.739-744. 125. Moore B.W. Chemistry and biology of the S-100 proteins // Scand. J. Immunol. (Suppl.). 1982. V.9. P.53-74. 126. Moore B.W., McGregor D. Chromatographic and electrophoretic fractionation of soluble proteins of brain and liver // J. Biol. Chem. 1965. V.240. P.1647-1653. 127. Moore B., Perez V., Gehring M. Assay and regional distribution of a soluble protein characteristic of the nervous system. // J. Neurochem. 1968. V.15. P.265-272. 128. Morimoto K., Mishima H., Nishida T., Otori T. Role of urokinase type plasminogen activator (u-PA) in corneal epithelial migration // Thromb. Haemostas. 1993. V.69. P.387 – 391. 129. Moscona A. Studies of cell aggregation: demonstration of material with selective cell-binding activity // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1963. V.49. P.743-748. 100 130. Moscona A., Moscona H. The dissociation and aggregation of cells from organ rudiments of early chick embryo // J. Anat. 1952. V.86. №3. P.287-292. 131. Muller W., Muller I., Zahn R. Two different aggregation principles in reaggregation process of dissociated sponge cell (Geodia cydonium) // Experrientia. 1974. V.30. P.899-901. 132. Muller W., Muller I., Zahn R. Species-specific aggragation factor in sponges. IV. Inactivation of the aggregation factor by mucoid cells from another species // Exp. Cell Res. 1976. V.98. P.31-40. 133. Muller W., Zahn R. Purification and characterization of a species-specific aggregation factor in sponges // Exp. Cell Res. 1973. V.80. P.95-104. 134. Murray B., Hemperly J., Prediger E. Alternativety spliced mRNAs code for different polypeptide chaines of the chicken neuralmcell adhesion molecule (N-CAM) // J. Cell Biol. 1986a. V.102. P.189-193. 135. Murray B., Owens G., Prediger E. Cell surface modulation of the neural adhesion molecule resulting from alternative mRNA splicing in a tissue-specific develomental sequence // J. Cell Biol. 1986b. V.103. P.1431-1439. 136. Nazarova P.A., Yamskova V.P., Krasnov M.S., Filatova A.G., Yamskov I.A. “Regulatory proteins biologically active in ultralow doses from mammalian glands and their secretions”, pp. 78-88 // In the book “Biochemical Physics Frontal Research”, Ed. by Varfolomeev S.D., Burlakova E.B., Popov A.A., Zaikov G.E.. Hauppauge NY. Nova Science Publishers Inc. 2007. P.73-82. 137. Navarrete H., Carmelo B. Soluble Polypeptides from Meristematic and Mature Cells of Allium cepa L. Roots // Planta. 1978. V.42. P.147-151. 138. Noro Y., Hisata Y., Okuda K. Pharmacognostical Studies of Plantaginis herba (VII) on the Phenylethanoid Contents of Plantago spp. // Japanese Journal of Pharmacognosy. 1991. V.97. P.24–28. 139. Ogou S.I., Yoshida-Noro C., Takeichi M. Calcium-dependent cell-cell adhesion molecules common to hepatocytes and teratocarcinoma stemm cells // J. Cell Biol. 1983. V.97. P.944-948. 140. Olimov N.K., Aminov S.N. Lipids from the chloroform methanol extract of Allium sativum // Chem. Nat. Compd. 2011. V.47. №2. P.37-41. 141. Olivier J.C. Drug Transport to Brain with Targeted Nanoparticles // The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2005. V.2. P.108-119. 142. Overton J. Cell junction and their development // Prog. Surf. Membr. 1974. V.8. P.161-208. 101 143. Pak J.H., Liu C.Y., Huangpu J., Graham J.S. Construction and characterization of the soybean leaf metalloproteinase cDNA // FEBS Letters. 1997. V.404. P.283–288. 144. Pailer V.M., Haschke-Hofmeister E. Inhaltstoffe aus Plantago major // Planta Medical. 1969. V.17. P.139–145. 145. Pandey A., Bigoniya P., Raj V., Patel K.K. Pharmacological screening of Coriandrum sativum Linn. for hepatoprotective activity // J. Pharm Bioallied Sci. 2011. V.3. №3. P.435-441. 146. Pecere, T., Gazzola, M.V., Mucignat, C., Parolin, C., Vecchia, F.D., Cavaggioni, A., Basso, G., Diaspro, A., Salvato, B., Carli, M., Palu, G. Aloe-emodin is a new type of anticancer agent with selective activity against neuroectodermal tumors // Cancer Res. 2000. V.60. P.2800–2804. 147. Pierson R., Temin H. The partial purification from calf serum of a fraction with multiplication-stimulating activity for chicken fibroblasts in cell culture and with nonsuppressible insulin-like activity // J. Cell Physiol. 1972. V.79. P.319-330. 148. Provencher S.W. // Makromol. Chem. 1985. V.82. №15 P.632. 149. Ragster L., Chrispeels M.J. Azocoll-digesting proteinases in soybean leaves // Plant Physiol. 1979. V.64. P.857–862. 150. Ratnaparkhe S.M., Egertsdotter E.M., Flinn B.S. Identification and characterization of a matrix metalloproteinase (Pta1-MMP) expressed during Loblolly pine (Pinus taeda) seed development, germination completion, and early seedling establishment // Planta. 2009. V.230. P.339–354 151. Reynolds T. The compounds in Aloe leaf exudates: a review // Bot. J. Linn. Soc. 1985. V.90. P.157–177. 152. Rhee S.Y., Osborne E., Poindexter P.D., Somerville C.R. Microscope separation in the quartet 3 mutants of Arabidopsis thaliana impaired by a defect in a developmentallyregulated polygalacturonase required for pollen mother cell wall degradation // Plant Physiol. 2003. V.133. P.1170-1180. 153. Rhee S.Y., Somerville C.R. Tetrad pollen formation in quartet metants of Arabidopsis thaliana is associated with persistence of pectin polysaccharides of the pollen mother cell wall // Plant Journal. 1998. V.150. P.79-88. 154. Riechardt L. Extracellular matrix molecules and their receptors // In: "Guidebook to the extracellular matrix and adhesion proteins". Eds. Kreis T., Vale R. Oxford University Press. 1993. P.3-12. 155. Ridley B. L., O’Neill, Mohnen, D. Pectins: structure, biosynthesis, and oligogalacturonide-related signaling // Phytochemistry. 2001. V. 57. P.929–967. 102 156. Samuelsen A.B., Paulsen B.S., Wold J.K., Knutsen S.H., Yamada H. Characterization of a Biologically Active Arabinogalactan from the Leaves of Plantago major L. // Carbohydr. Polym. 1998. V.35. P.145–153. 157. Samuelsen A.B., Paulsen B.S., Wold J.K., Otsuka H., Yamada H., Espevik T. Isolation and Partition Characterization of Biologically Active Polysaccharides from Plantago major L. // Phytoterapy Research. 1995. V.9. P.211–218. 158. Sanders L.C., Wang C.S., Walling L.L., Lord E.M. A homologue of the substrate adhesion molecule vitronectin occurs in 4 species of flowering plants // Plant Cell. 1991. V.3. P.629-635. 159. Schafer B., Heizmann C. The S100 family of EF-hand calcium-binding proteins: function and pathology // TIBS. 1996. V.21. P.134-140. 160. Schiermeyer A., Hartenstein H., Mandal M.K., Otte B., Wahner V., Schillberg. A membrane-bound matrix-metalloproteinase from Nicotiana tabacum cv. BY-2 is induced by bacterial pathogens // BMC Plant Biol. 2009. V.9. P.83. 161. Shevell D.E., Kunkel T., Chua N.H. Cell wall alterations in the Arabidopsis emb30 mutant // Plant Cell. 2000. V.120. P.2047-2059. 162. Shindler M., Meiners S., Cheresh D.A. RGD-dependent linkage between plant cell wall and plasma membrane: consequences for growth // J. Cell Biol. 1989.V.5. P. 9-23. 163. Schols H.A., Voragen A.G. The chemical structure of pectins // In: Pectins and their manipulation. Eds. G.B.Seymour, J.P. Knox. Blackweit. USA: CRC Press. 2002. P.250. 164. Skari K.P., Malterud K.E., Haugli T. Radical Scavengers and Ingibitors of Enzymatic Lipids Peroxydation from Plantago major // Medicinal Plant. In: Proceeding of the 2nd In: Proceeding of the 2nd International Conference on Natural Antioxidants and Anticarcinogens in Nutrition, Health and Disease. Cambridge. 1999. P.200–202. 165. Soo-Hyun Kim, Jeremy Turnbull, Scott G. Extracellular matrix and cell signalling – the dynamic cooperation of integrin, proteoglycan and growth factor receptor // J. Endocrinol. 2011. V.209. №2. P.139-151. 166. Staves M.P. Cytoplasmic streaming and gravity sensing in Chara intermodal cells // Planta. 1997. V.203. P.79-84. 167. Swaitek K., Kurowska A., Gora J. Chemical Composition of Some Plantago Species Seed Oil // Herba Polonica. 1980. V.4. P.213–217. 168. Taskova R., Handjieva N., Evstsatieva L., Popov S. Iridoid Glycosides from Plantago cornutii, Plantago major and Veronica cymbalaria // Phytochemistry. 1999. V.52. P.1443–1445. 103 169. Thiery J., Delouvee A., Gallin W., Cunningham B., Edelman G. Ontogenetic expression of cell adhesion molecules: L-CAM is found in epithelia derived from the three primary germ layers // Dev. Biol. 1984. V.102. P.61-78. 170. Turner M.L. Cell adhesion molecules: a unifying approach to topographic biology // Biol. Rev. 1992. V.67. P.359-377. 171. Uthne K. Human somatomedins. Purification and some studies on their biological action // Acta Endocrinology (Suppl.). 1973. V.175. P.1-35. 172. Van Buren J.P. Fuction of pectin in plant tissue structure and firmness // In: The chemistry and technology of pectins. Ed. R.H. Walter. 1991. P.1-23. 173. Vennigerholz F., Walles B. Cytochemical studies of pectin digestion in epidermis with specific cell-separation // Protoplasma. 1987. V.140. P.110-117. 174. Vogler, B.K., Ernst, E. Aloe Vera: a systematic reviewof its clinical effectiveness // British Journal of General Practice. 1999. V.49. P. 823–828. 175. Wells R.G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior // Hepatology. 2008. V.47. P.1394-1400. 176. Wilson C.M. Staining of proteins on gel: comparision of dyes and procedures // Methods Enzymol. 1983. V.91. P.236 - 247. 177. Yamskova V.P., Rybakova E.Yu., Vecherkin V.V., Berezin B.B., Filatova A.G., Blagodatskikh I.V., Yamskov I.A. “Analysis of regulatory proteins from bovine blood serum that display biological activity at ultra low doses: 1. Isolation, purification and physicochemical properties.”, P.57-67 // In the book “Biochemical Physics Frontal Research”, Ed. by Varfolomeev S.D., Burlakova E.B., Popov A.A., Zaikov G.E. Hauppauge NY. Nova Science Publishers Inc. 2007. P.160. 178. Yamskova V.P., Krasnov M.S., Rybakova E.Yu., Vecherkin V.V., Borisenko A.V., Yamskov I.A.“Analysis of regulatory proteins from bovine blood serum that display biological activity at ultra low doses: 2. Tissue localization and role in wound healing”, P. 68-77 // In the book “Biochemical Physics Frontal Research”, Ed. by Varfolomeev S.D., Burlakova E.B., Popov A.A., Zaikov G.E. Hauppauge NY. Nova Science Publishers Inc. 2007. P.160. 179. Yimei J., Zhaoa G., Jicheng J. Preliminary evaluation: The effects of Aloe ferox Miller and Aloe arborescens Miller on wound healing // J. Ethnopharmacol. 2008. V.120. P.181– 189. 180. Yili A., Aisa H.A., Imamu X., Maksimov V.V., Ziyavitdinov Zh. F., Veshkurova O.N., Sagdiev N. Zh, Salikhov Sh. I. Isolation of biocidal peptides from Anethum graveolens seeds // Chem. Nat. Compd.. 2006. V.42. №5. P.534-538. 104 181. Yurchenko P., O'Rear J. Basal lamina assembly // Curr. Opin. Cell Biol. 1994. V.6. P.674-681 182. Zhu J.K., Damsz B., Bressan R.A., Hasegawa P.M. A higher-plant extracellular vitronectin-like adhesion protein is related to the translational elongation factor-I-alpha // Plant Cell. 1994. V.6. P.393-404. 183. Zhu J.K., Shi J., Singh U. Enrichment of vitronectin-like and fibronectin-like proteins in NaCl-adapted plant-cells and evidence for their involvement in plasma-membrane cell-wall adhesion // Plant Journal. 1993. V.3. P.637-646. 105
