Клостридиозная инфекция (Шуляк Б.Ф., «ГЕМ», Москва)

CL.DIFFICILE ОПАСНОСТЬ,
КОТОРАЯ ВСЕГДА
РЯДОМ
Шуляк Б.Ф.,
научный отдел компании
«ГЕМ» (Москва)
Появление «новой» бактерии
1935 г. - Hall I.C., и O'Toole E. обнаружили ее у
грудного ребенка в США.
Сейчас ее находят у 25-70% новорожденных.
К 12-18 мес. число инфицированных детей
снижается до 5%, сохраняясь на этом уровне у
взрослых.
У пожилых людей инцидентность инфекции
возрастает.
Основные причины «скромного» поведения Cl.d.
1. Отсутствие или низкий уровень экспрессии
токсинов у многих штаммов.
Этот ребенок хорошо себя ведет,
потому, что находится под присмотром.
Так же поступает и Cl.d.
2. Контроль размножения Cl.d. другими
компонентами микрофлоры кишечника и факторами
иммунитета.
Мишень для антибиотиков - не только
патогенные бактерии
Антибиотики – одно из основных средств борьбы с
патогенными бактериями, но их частое применение
порождает немало проблем.
o
Одна из них – дисбактериоз, при котором у Cl.d.
появляется возможность колонизировать толстую
кишку.
o
Анализ микрофлоры кишечника, проведенный
чешскими специалистами (Škraban J. et al. , 2012),
показал что основным фактором, сдерживающим
колонизацию 027 риботипа Cl.d. является
Bifidobacterium longum, вариабельно значимым энтерококки .
Cl.d. – продуцент токсинов, повреждение которыми эпителия кишечника ведет
к функциональным и патоморфологическим изменениям кишечника.
Опасны все антибиотики, но в разной мере
 Колонизацию кишечника Cl.d могут вызвать
практически все антибиотики, но чаще – беталактамы, фторхинолоны, клиндамицин
 Чем длительнее курс антибиотикотерапии, тем
выше риск.
 Последствия воздействия АМП:
- дисбактериоз
- изменение свойств Cl.d.
Цефалоспорины
Фторхинолоны
Аминогликозиды
Макролиды и линкомицин
Другие
Пенициллины
Клиническое значение Cl.d.
За последние 30 лет Cl.d. стал основным
возбудителем диареи госпитализированных
пациентов (20-30%).
Токсический мегаколон.
Антибиотико-ассоциированный и
псевдомембранозный колит (с высокой
летальностью).
Некротическая перфорация толстой кишки.
Прогностические маркеры
Факторы повышенного риска летального исхода

Возраст (> 70 лет)

Концентрация лейкоцитов >20 x109/л

Сывороточный креатинин >133 мкМоль/л

Сывороточный альбумин (±) <24,5 г/л

С-реактивный протеин >220 мг/л

Низкий пик титра IgG-антител к токсину А на 12-й день болезни
Эпидемические особенности
Фекально-оральный путь заражения
Инцидентность инфекции у взрослого населения
4-5% - вне ЛПУ
20–50% - у госпитализированных пациентов
(пропорционально сроку пребывания в ЛПУ)
Причины
Регулярное поступление в стационары носителей
токсигенных штаммов Cl.d.
Длительное сохранение спор Cl.d. в ЛПУ
Ятрогенные (зонды, термометры и пр.)
Микрофлора кишечника и антитела
предотвращают развитие
симптоматики у 60% людей,
инфицированных токсигенными
штаммами.
Отличия гипервирулентных от обычных
токсигенных штаммов Cl.d.:
- Индукцией симптомов у детей
- Способностью быстро распространяться в ЛПУ и за
их пределами
- Высокими уровнями заболеваемости и
смертности (особенно пациентов старше 65 лет)
Животные – потенциальный источник инфекции
Имеются сообщения об выделении риботипов 010, 014/020,
039, 045, SLO 066. Большинство изолятов нетоксигенны.
Инцидентность – 3-25%.
В первые 2 нед инфицировано 25-100% поросят.
С возрастом инцидентность снижается.
В Сев. Америке и Европе превалирует РТ 078.
Генетическое сходство с мед. изолятами
Инфицировано от 1 до 60% цыплят. С возрастом инцидентность
снижается.
Широкое разнообразие риботипов, но нет 078 и 027.
Инфицировано от 1 до 50% телят.
Зависимость инцидентности от возраста и времени года.
027 превалирует (в Канаде-до 70%, в США-94%). Встречаются 012,
014, 017, имеющие мед. значение
027 и 078 обнаруживали в мясе в Сев. Америке –42%, в Европе ≈
3% (отдельные скрининговые исследования
Из выделяемых от животных и продуктов их убоя штаммов Cl.d.
Наибольший зооантропонозный потенциал имеют секвенстипы
ST-1 и 11
Факторы патогенности Cl.d.
Основные факторы патогенности Cl.d. - токсины:

Экзотокин А - гликозилтрансфераза, самый крупный из известных
бактериальных протеинов (308 кД).

Цитотоксин B – гликозилтрансфераза, меньше по размеру (269 кД),
но в 1000 раз токсичнее экзотоксина А.

Бинарный CDT (аналог йота-токсина Cl.perfringens и
Cl.spiroforme, проявл. АДФ-рибозилтрансферазную акт-ть)

Нестабильный энтеротоксин

Актинспецифическая АДФ-рибозил-трансфераза
Образование токсинов А и В регулируют:
-TcdR (+)
- TcdC (-)
-- SigD - недавно открытый в Ин-те Пастера (Франция)
регулятор жгутиковых Аг (+). У различающихся по его наличию
шт. Cl.d. выявили различия 103 генов, в т.ч. TcdR и TcdC.
Подвижность - перитрихиальные жгутики.
Защита: полисахаридная капсула, S-слой, субтерминальные
споры
Адгезивные факторы (в т.ч. токсин CDT)
Образование биопленки (шт. R20291)
Классификация штаммов Cl.d. по
токсигенности
Токсины А и В наиболее изучены и играют основную
роль в патогенезе синдромов, вызываемых Cl.d..
1. Непатогенные или слабопатогенные (не образуют токсины
А-В-/ А+В- / ↓А+↓В+
А и В, образуют их в небольшом количестве, образуют
только токсин А.
А+В+/ А-В+
2. Вирулентные - образуют оба токсина (85-90% шт.) или
только токсин В (4-11% шт.; тенденция ↑).
А±↑B+ CDT ±
3. Гипервирулентные (например, штаммы риботипов 027,
O17 и 078), образующие больше A/B и других токсинов.
Классификация Cl. d. по токсигенности
Фенотипы (7)
А+ B+ CDT(прототип почти всех минорных и части
мажорных ВТТ)
А+ B+ CDT+
(прототип большинства мажорных ВТТ)
A- B+ CDTA- B+ CDT+
A+ B- CDT+
А- В- CDT+
А- B- CDT-
Вариантные токсинотипы (31)
0
Минорные I,II.XII, XVIII, XIX, XX
Мажорный XXI
Мажорные типы III,IV, V,VI, VII, IX, XIV, XV, XXII, XXIII
Минорный тип XXIV
VIII
Некоторые О-подобные штаммы
Х,
XVI, XVII, некоторые 0- и V-подобные шт.
IX-подобные
XIa, XIb
Штаммы без локуса Pa
Штаммы без локусов CDT и Pa
Схематично, чем насыщеннее цвет ячеек, тем наибольшее клиническое
значение имеют штаммы с таким фенотипом.
Но из этого правила немало исключений за счет наличия вариантных
токсинотипов - групп штаммов с идентичными изменениями (включениями,
делециями и точечными мутациями) участков B1 и A3 локуса Pa,
циркулирующие на определенной территории в определенный период
времени.
Гипервирулентные штаммы
1985 г. – идентификация 1-го гипервирулентного варианта во Франции (на 1 г
позднее в Великобритании). Причина появления - широкое применение
ципрофлоксацина.
2003 г. - 2 крупные вспышки в Бельгии (смертность-12%).
2005 г. - 50 вспышек в Бельгии, затем во Франции, Германиюи Люксембурге,
Швейцарии, Дании, Австрии , Финляндии и Польше.
NAP1/BI/027
рестриктазо-эндонуклеазный анализ – BI
пульс-гель электрофорез - NAP1 (North American PFGE type 1)
ПЦР – риботип 027.
Признаки гипервирулентности
Интенсивное образование токсинов А (>16 раз) и В (>23 раза) из-за делеций
негативных регуляторов
2/3 штаммов синтезируют бинарный токсин CDT = тропизм к большему типу клеток
Интенсивное и ускоренное образование спор
Высокая подвижность
Резистентность к эритромицину (мутация генов ДНК-гиразы) и фторхинолонам.
Быстрое распространение = внутрибольничные (67%) + внебольничные (37%)
инфекции
Инцидентность заболевания подростков до 17 лет возросла (> 2 раза)
Способен поражать людей, не принимавших АМП
Рост смертности пожилых людей (> 2 раз) и рецидивы
Несмотря на все вышеизложенное – возможность бессимптомного носительства
Эпидемическая ситуация в Европе
Обследованы госпитали 32 стран Европы (Europ. Clostridium
Inf. Survey (ECDIS), 2008-2009) = выявлено 65 ПЦРриботипов Cl.d., из которых превалируют 014/020; 001 и
078. (потенциальный источник – свиньи)
Риботип 027 вызывает около 5% случаев госпитальных
инфекций (ранее до 18%)
В Британии чаще встречается риботип 106, в Нидерландах 078
(источник – свиньи, по вирулентности близок 027, часто
вызывает внебольничные инф. у детей).
Радоваться рано: di Bella S. et al (2012) – 56% госпитальных штаммов, выделенных в Италии = 027).
Растет инцидентность инфекции риботипа 078
Эпидемическая ситуация в Сев. Америке
2003 г – первые вспышки 027 в 7 провинциях Канады
2004-2007 гг. - охватил 40 штатов США (рост заболеваемости в 5 раз,
летальности – в целом в 3-4 раза (22%), у пожилых пациентов в 8 раз.
Риботип 078 широко распространен среди свиней и КРС (в Канаде 83–
94%) и в последние годы его выявляют в этой стране у 13-14%
госпитализированных пациентов с Сl.d.-ассоциированными
Ситуация в других странах
В 2009 г. риботип 027 обнаружили в Корее,
Гон-Конге и Австралии. Однако, здесь он не
вызвал больших госпитальных вспышек.
В 2012 г. зарегистрировали первый случай в
Латинской Америке (смерть 1,5-летнего
ребенка) от инфекции этого. риботипа.
В Иране на долю риботипа 078 приходится
25% госпитальных штаммов Cl.d.
В России - ?
Схема диагностики
Показания для лабораторной диагностики
Диарея (≥3 актов
дефекации в день)
Диарея > 2 дн
(после исключения
инфекций других
энтеропатогенов)
Все госпитализированные
пациенты с диареей > 72 ч
(независимо от общего
клинического состояния)
внезапное начало диареи;
водянистая консистенция и гнилостный запах фекалий
спорадически скрытая кровь (но не мелена)
боли в нижнем квадранте живота (22 %);
лихорадка (28 %);
лейкоцитоз (50 %) и гипоальбуминемия на ранних стадиях болезни
Примечание. У пациентов с параличом подвздошной кишки и получающих
обезболивающие средства после абдоминальных операций диарея и боли
могут отсутствовать.
Лабораторные методы диагностики
Cl.d. – анаэроб, его токсины
термолабильны
оптимальный срок исследования =
≤ 2 ч после дефекации
при отсутствии такой
возможности:4…8°С не более 2-3 дн
1.
Выделение и идентификация возбудителя на
питательных средах
2.
Цитотоксический тест (золотой стандарт)
3.
Иммунологические методы диагностики (обнаружение
глютамат дегидрогеназы, токсинов А и В)
4.
Молекулярно-генетическая диагностика
Отбор проб для исследований
- фекалии (только жидкие; при скрининге – только от
людей старше 50 лет, содеражащие большое кол-во
лейкоцитов)
Исключение пациенты с илеусом, у которых не бывает
диареи
Дополнительные критерии:
- Данные анамнеза и предшествующем лечении АМП
- При скрининге - первые 3 дня пребывания в ЛПУ, при
диагностике госпитальной инфекции – свыше 3 дню
- В случае прогрессирования болезни – повторный
отбор фекалий
Изоляция возбудителя
Серо-желтые, S/R,
негемолитические, слегка
приподнятые, круглые (d=2-5
мм) с выростами колонии
Обработка (30 мин/tкомн) этанолом (1:1) = споры устойчивы
Анаэробное культивирование:
Обогатительные среды (объекты внешней среды)
Неселективные или селективные среды (с
аминогликозидами/полимиксином/ циклосерином, например,
циклосерин-цефокситин-фруктозный агар) применяют для
посева клин. материала и пересева с обогатительных сред.
Замена фруктозы маннитом повышает высеваемость Cl.d.
Желчь, таурохолят и лизоцим ускоряют вегетацию спор.
Агар с витамином К и кровяной агар = желто-зеленая
флюоресценция
Агар с р-гидроксифенилуксусной к-той = запах крезола
Среды с яичным желтком (дифференциация от лецитиназо+
и липазо+ C. bifermentans, C. perfringens и C. sordelli)
Хромогенные среды (CHROMagar™C.difficile, BD;
СhromID™ C. difficile agar , Био-Мере)
Недостатки метода (из-за которых он перестает быть рутинным)
Нет различий в росте токсигенных и нетоксигенных штаммов.
Вариабельность чувствительности (в зависимости от среды)
Необходимость создания анаэробных условий)
Медленный рост (48-72 ч., на хромогенных – 24-48 ч).
Общая затрата времени на выделение и идентифи токсигенных шт. = 3-7 дн.
Большие затраты труда
Оценка подвижности
Фактор Sigma D позитивно регулирует
экспрессию жгутиков и еще более 100 генов, (в
т.ч. ответственных за токсинообразование),
обусловливая корреляцию между
токсичностью и токсинообразованием.
Тест по определению подвижности может
служить дополнительным фенотипическим
способом оценки вирулентности штаммов Cl.d.
Методика
1. Флаконы (V=30 мл) с 0,05% сердечно-мозговым агаром выдерживают 4 ч в анаэробных
условиях.
2. Переносят колонию Cl.d. на S среды.
3. Инкубируют ночь в анаэробных ус-ях.
4. Измеряют расстояние, прошедшее бактериями.
Тест проводят с контролями (подвижный и неподвижный шт. Cl.d.)
Цитотоксический метод
Интактная культура клето
Положительный рез-т - округление не менее 10% фибробластов
монослоя (при тестировании суспензии фекалий, пропущенной
через миллипоровский фильтр (в других модификациях теста эта
цифра может достигать 40…60%). Чувствительность данного метода
диагностики инфекции достигает 90% (ее порог в отношении
токсина B составляет 1 пкг).
РН с фильтратом фекалий и моноклональными антителами самый чувствительный и специфичный метод диагностики
Недостатки метода:
- VERO выявляет токсин В в концентрации 1 пкг/мл
Токсич. действие Сl.d.
(чувствительность ≤ 90%), линия HT29 – наиболее
чувствительная к токсину А.
- Не стандартизирован
- Возможно получение «ложно +» результатов
- Нужны культуры клеток и все, чем пользуются для их
выращивания, боксы, специалисты
24…48 ч (без учета времени на подготовку культуры клеток; за
рубежом доступны готовые замороженные культуры клеток)
-
Токсич. действие Сl.sordelii
--
Большие затраты труда
Молекулярные методы диагностики
ДНК-зондирование - обнаружение генома возбудителя в отпечатке
колоний
ПЦР – высоко чувствительный метод выявления генов токсинов.
Изотермическая амплификация – с 2011 г. японская компания
выпускает набора реагентов для диагностики инфекции Cl.d. методом
LAMP. На анализ экстрагированной нуклеиновой к-ты уходит всего 1 ч.
Не позволяет выявлять A-B+ штаммы.
Назначение: идентификация Cl.d. на видовом и внутривидовом
(риботипном) уровнях, обнаружение генов токсинов.
Мишени:
- 16s рРНК
- гены токсинов
Недостатки
Гены, регулирующие синтез токсинов Cl.d., весьма изменчивы, что
затрудняет подбор к ним праймеров.
При рутинном проведении не дает представления о функциональном
состоянии генов и их регуляторов
Стоимость 1 экспертизы в 2-3 раза выше, чем проводимой другими
методами
Иммунологические методы
РЛА, ИФА и ИХТ
Позволяют выявлять токсины А и В, глютамат дегидрогеназу
(специфический поверхностный белок, синтезируемый всеми
штаммами Cl.d.).
ИФА: 15% ложноположительных+ 15% ложноотрицательных
результатов. Уровень детекции токсинов = 100-1000 пкг
Vidas (Био-Мерье) = ИФА колоний - чувствительность (в
сравнении с селективными средами) = 62%, специфичность =6094% (в зависимости от интенсивности токсинообразования)
Американское об-во микробиологов в 2010 г рекомендовало
больше не применять ИФА
ИХТ и РЛА просты в проведении, не требуют аппаратуры, дают
быстрый ответ, могут быть использованы в полевых условиях

РЛА: низкая чувствительность, перекрестные реакции с
C.bifermentans/sordellii and C. glycolicum.

ИХТ: аналитическая чувствительность – 4-5 нг/мл, высокие
специфичность и чувствительность
Проблемы, возникающие при
проведении ИХТ
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Замораживание-размораживание и хранение проб при
высокой температуре или >2 ч - причины ложно «-»
результатов.
Сложно дозировать пробу, вносимую в пробирку с
эсктрагирующим раствором.
При недостаточном отстаивании фекалии могут забивать
поры тест-полоски. Для лабораторий альтернатива –
центрифугирование (500-1000 об/мин 5-10 мин.)
Вариабельная чувствительность и специфичность разных
тест-систем: отрицательный результат требует проверки
другими методами.
Наличие в фекалиях большого количества крови – причина
ложноположительных результатов.
Цвет контрольной и тестовой полосы может становиться
зеленым вместо розового при исследовании темных или
зеленых фекалий (последствие применения фумарата Fe).
Каким методы диагностики
предпочтительнее?
Метод
Цитологический, в т.ч. РН
Глютамат-дегидрогеназные
ИФА
ИХТ
РЛА
Молекулярно-генетические
Чувствительность, %
67-86
71-100
31-62
60-75
45-50
77-100
Специфичность, %
84-100
75-98
60-94
92-95
90-92
93-100
 Нельзя
«слепо» доверять ни одному из применяемых в настоящее время методов
диагноcтики инфекции Cl.d.
 Их показания
следует сопоставлять между собой и с данными анамнеза
 Иммунологические
тесты (особенно ИХТ) предоставляют наиболее значимую
диагностическую информацию.
 Предпочтительнее
пользоваться тестами, позволяющими одновременно
определять несколько параметров (токсины А и В).
Оптимальная схема лабораторной
диагностики
 В ИХТ выявляют глютамат-дегидрогеназу (экспрессируется всеми штаммами Cl.d. И
в большем чем токсины количестве)
 Синергизм действия токсинов А и В – целесообразность выявления в ИХТ обоих
токсинов. Альтернатива – токсин В (как наиболее значимый). Выпускаемы тестсистемы на токсин А – анахронизм.
 Ни 1 иммунологический тест не позволяет выявлять всех инфицированных
токсигенными шт Cl.d. Пациентов. Заключительный этап – РН в культуре клеток или
ПЦР с пробами, давшими отрицательный рез-т в ИХТ.
Профилактика
Рациональное применение антибиотиков
Мытье рук бактерицидным мылом (но не
спиртсодержащими средствами)
Дезинфекция объектов внешней среды, одежды и
пр. хлорсодержащими и др. спороцидами.
Тщательное мытье посуды, стерилизация зондов,
термометров и пр.).
Скрининг бессимтомных носителей (пациентов и
персонала)
Изолированное содержание инфицированных
токсигенными штаммами Cl.d. пациентов
стационаров.
Смена перчаток, бахил и халатов при посещении
персоналом разных палат
Мониторинг объектов внешней среды (посев
смывов на селективный бульон с тиогликолятом,
АТФ-биолюминисценция, флюоресцентная проба с
тербием).
Лечение
1.
2.
3.

Прекращение применения антибиотиков,
спровоцировавших диарею или псевдомембранозный
колит.
Симптоматическое лечение.
Восстановление нормальной микрофлоры кишечника (не
найдено эффективных пробиотиков; терапия фекалиями
здоровых людей)
При хроническом и рецидивирующем течение –
антибиотикотерия:
- Ванкомицин (125 мг 4 раза вдень /метронидазол (500 мг 3
раза в день) 10-14 дневный курс
При рецидивах курс ванкомицина = по 125 мг/кг 6-нед. с увел.
интервалом (6 ч и 12 ч = по 1 нед, 1 день = 2 нед, 3 дня = 2
нед).
Альтернативные средства: бтейкопланин/даптомицин,
бацитрацин. Рифаксимин (дерват рифамицин а)
1.
Лечебные бактериофаги (в РФ не выпускаются)
2.
Бактерицины (Турицин CD, Ирландия)
3.
Хирургическое лечение (при перфорации кишечника ,
колонэктомия при ПМК)
БЛАГОДАРЮ ЗА
ВНИМАНИЕ!
Компания ООО «ГЕМ» приглашает принять участие в
микробиологической секции, посвященной питательным
средам и рассмотрению проекта Стандартизированной
технологии по их внутрилабораторному контролю (3 октября
2013 г. в г. Москва, ВЦ «Олимпийский»)
На нашем сайте www.hemltd.ru можно оформить
бесплатную подписку на журнал «Лаборатория».
Присылайте в него свои статьи и заметки для публикации в
нем по адресу statya@hemltd.ru